CN110954489A

CN110954489A - 一种无氰溶血剂及其应用

Info

Publication number: CN110954489A
Application number: CN201911116978.3A
Authority: CN
Inventors: 吴文俊; 彭金燕; 李冰
Original assignee: Zhongshan Chuangyi Biochemical Engineering Co ltd
Current assignee: Zhongshan Chuangyi Biochemical Engineering Co ltd
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明公开了一种无氰溶血剂及其应用，含有以下组分：阳离子表面活性剂3～10g/L；非离子表面活性剂0.1～5g/L；螯合剂0.1～1g/L；缓冲盐；渗透压调节剂。其中，所述螯合剂包括草酸、苹果酸、乙二胺四乙酸或其二钠盐或二钾盐、8‑羟基喹啉和1，10‑邻二氮菲中的至少一种。该溶血剂不含氰化物，无毒环保，能够溶解细胞膜、稳定血红蛋白和嗜碱性粒细胞，适用于血细胞分析仪，使测定操作方便、准确度高。

Description

一种无氰溶血剂及其应用

技术领域

本发明涉及医学检测试剂技术领域，具体涉及一种无氰溶血剂及其应用。

背景技术

血红蛋白浓度的测定和白细胞计数是目前医学诊断过程中的重要指标，许多疾病通常都会引起血红蛋白浓度和白细胞数量的异常改变。例如，血红蛋白(Hgb)对于监控和治疗影响血红蛋白浓度的疾病(如镰状细胞性贫血、地中海贫血和血红蛋白异常病等)具有重要的意义；感染、发烧等情况时，白细胞的数量会发生较大改变，用于临床上的诊断。

国际血液标准化委员会(International Committee for the Standardizationof Hematology，ICSH)推荐氰化高铁血红蛋白法(也称Drabkins法)作为血红蛋白浓度测定参考方法。该方法先使用Triton X-100使红细胞膜发生溶解，释放出血红蛋白并降低红细胞膜碎片引起的浑浊度。随后血红蛋白被铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(Hi)，其中的铁离子为三价。Hi与氰离子(CN^-)结合形成稳定的化合物氰化高铁血红蛋白(HiCN)。氰化高铁血红蛋白的溶液在λ＝540nm处有特征吸收峰，用已校准的分光光度计进行测定后即可计算血红蛋白的浓度。该方法主要存在以下不足：1.使用了剧毒的化学品氰化钾，测定结束后需要使用次氯酸钠溶液进行销毁；2.铁氰化钾溶液见光逐渐分解，需要现配现用；3.反应速度慢，大约需要5min。因此，该方法无法在全自动血液分析仪中应用。

针对上述方法的不足，研究者提出使用无氰化物溶血剂来溶解红细胞并使血红蛋白显色，以实现Hgb浓度测定。Oshiro等人(Clin.Biochem.,1982,15(1),83-88)利用含有十二烷基硫酸钠(Sodium Lauryl Sulfate，SLS)和Triton X-100的溶血剂实现血红蛋白的测定。SLS的氧化性使血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白，所形成的SLS-Hgb复合物在539nm出现最大吸收峰，肩峰出现在572nm处。但该方法使用了大量的阴离子表面活性剂SLS，将会使白细胞被严重破坏而无法测定。

白细胞总数的测定及各亚群的分类通过传统的显微镜手工计数法或基于阻抗原理(WO84003771)或激光散射原理(US 3740143)来实现自动化分析。然而，由于正常人的嗜碱性粒细胞占白细胞总数比例一般为0.5％到1％，难以实现准确计数。当人体出现过敏反应时，嗜碱性粒细胞比例会增加到2％到3％。某些传染性疾病如肺结核、水痘以及新陈代谢疾病如粘液性水肿和高血脂症,都会使嗜碱性粒细胞计数增加。因此，嗜碱性粒细胞的准确计数有着重要的临床意义。

法国专利FR 90/01660描述了一种试剂可以在溶解红细胞的同时保护嗜碱性粒细胞的原始形态，从而通过阻抗法对嗜碱性粒细胞计数。但该试剂无法测定血红蛋白浓度。

专利CN103698501B公开了一种无氰化物溶血剂可实现血红蛋白浓度和白细胞计数。该试剂含有溶解剂为季铵盐阳离子表面活性剂、助溶剂非离子表面活性剂、配体稳定剂为酰胺类化合物或酰肼类化合物、缓冲液和无机盐。

此外，专利US 5840515、US 6632676、US 20040241769描述了关键组分为皂素的白细胞四分群试剂。皂素与固定剂的合适比例将可以实现红细胞完全溶解而白细胞保持原始形态。但由于皂素来自于天然植物中，不同批次或不同厂家的皂素溶血能力等理化性质会差异较大，质量控制难度较高。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种无氰溶血剂，能够溶解红细胞以及除嗜碱性粒细胞以外的白细胞。

本发明还提出一种上述无氰溶血剂的应用。

根据本发明的第一方面实施例的一种无氰溶血剂，含有以下组分：

阳离子表面活性剂3～10g/L；

非离子表面活性剂0.1～5g/L；

螯合剂0.1～1g/L；

缓冲盐；

渗透压调节剂；

其中，所述螯合剂包括草酸、苹果酸、乙二胺四乙酸或其二钠盐或二钾盐、8-羟基喹啉和1，10-邻二氮菲中的至少一种。

根据本发明实施例的一种无氰溶血剂，至少具有如下有益效果：本发明无氰化物溶血剂能够使红细胞膜被破坏、血红蛋白被释放并与溶液中的配体形成稳定的显色物质。通过分光光度法可以测定该显色物质在540nm处的吸光度并进行定量计算。此外，还能够使得除嗜碱性粒细胞以外的白细胞膜被基本溶解、细胞质被释放出来而嗜碱性粒细胞基本保持原始形态。通过阻抗法测定被处理后的白细胞从而实现白细胞的计数及嗜碱性粒细胞的计数。本发明方案的螯合剂，通过与血红蛋白形成稳定物质的配体，其含量需要足够与血红蛋白高值血液标本进行反应，可以提高溶血剂的稳定性，使测定的血红蛋白浓度更加准确。该无氰溶血剂无毒环保，准确率高。

根据本发明的一些实施例，所述阳离子表面活性剂包括如下结构式I和II所示化合物中的至少一种：

式中，所述R₁分别代表碳原子数8～15的烷基、烯基或炔基，R₂、R₃、R₄分别代表碳原子数为1～4的烷基，X^-是卤素阴离子。

根据本发明的一些实施例，所述阳离子表面活性剂包括八烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵和十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述阳离子表面活性剂优选的浓度为5g/L。

根据本发明的一些实施例，所述非离子表面活性剂包括如下结构式所示化合物中的至少一种：

式中，所述R₅、R₆、R₇分别代表碳原子数8～15的烷基或氢。

根据本发明的一些实施例，所述非离子表面活性剂包括月桂醇聚氧乙烯醚、AEO-9和AEO-3中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐和硼酸盐中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述缓冲盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、柠檬酸钠和Tris碱中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述缓冲盐用于调节缓冲体系的pH调节范围为3～8。

根据本发明的一些实施例，所述渗透压调节剂中至少含有一种碱金属氯化物。

根据本发明的一些实施例，所述渗透压调节剂包括氯化钠或氯化钾中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述渗透压调节剂用于调节所述无氰溶血剂的渗透压至400～600mOsm/kg。

根据本发明的一些实施例，所述渗透压调节剂的添加浓度为2～5g/L。

根据本发明的第二方面实施例的应用，一种血细胞分析仪用试剂，所述血细胞分析仪用试剂包括上述的无氰溶血剂。

根据本发明的一些实施例，所述血细胞分析仪用试剂为用于分析包括血红蛋白浓度、白细胞总数和嗜碱性粒细胞个数中的至少一种的试剂。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例3中溶血剂与稀释后的血液样本混合后的吸收光谱。

图2为本发明实施例3中使用溶血剂在创艺CYB-5200血细胞分析仪上获得的白细胞分布直方图。

图3为本发明实施例4中溶血剂与传统HGB溶血剂在创艺CYB-5200血细胞分析仪上对临床血液样本测定的血红蛋白浓度的线性相关性分析结果图。

图4为本发明实施例4中使用溶血剂与传统嗜碱溶血剂在创艺CYB-5200血细胞分析仪上对临床血液样本测定的白细胞计数值的线性相关性分析结果图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：提供一种无氰化物的溶血剂，该溶血剂能够稳定血红蛋白、白细胞和嗜碱性粒细胞，适用于血细胞分析仪，使测定操作方便、准确度高。

本发明的实施例一为：一种无氰溶血剂：

溶血剂的配方及配制如下：

根据本实施例的配方，本方案的无氰溶血剂包括阳离子表面活性剂，起到溶解红细胞、释放血红蛋白，使血红蛋白可以通过比色法进行测定。离子型的表面活性剂也被称为变性剂，可以使蛋白质复合物解离并使膜蛋白溶于水中。反应过程迅速，因此可以用于自动血细胞分析仪中。溶血剂中阳离子表面活性剂的用量足以溶解红细胞膜而使血红细胞从中释放，同时保留白细胞以便测定其大小和体积。

溶血剂中还包括非离子表面活性剂，其中，非离子表面活性剂用量应足以使高血脂样本中的脂质在分析体系中被溶解从而降低对血红蛋白吸光度的干扰。

溶血剂中还包括螯合剂，可以与血红蛋白形成稳定物质的配体，其含量需要足够与血红蛋白高值血液标本进行反应。

溶血剂中还包括缓冲盐，缓冲盐调节试剂的pH，不同的血液样本与溶血剂反应后体系的pH可能会发生较大变化，从而引起紫外-可见光谱发生红移或蓝移。添加缓冲盐调节pH能够消除pH变化对定量分析的干扰。

溶血剂中还包括渗透压调节剂，以保持体系渗透压，避免白细胞形态发生过度变化。

还可以在本发明的无氰化物溶血剂中加入一定浓度的防腐剂，该防腐剂与溶血剂中的关键组分相容且不干扰测定，添加剂具有抗微生物的性能，可以提高溶血剂的长期稳定性。

本发明的实施例二为：一种无氰溶血剂：

溶血剂的配方及配制如下：

本发明的实施例三为：一种无氰溶血剂的应用：

一、在测定血红蛋白浓度中的应用：

25μL新鲜血液样本用2.5mL的血细胞分析用稀释液进行稀释后，加入按上述实施例2配制的无氰化物溶血剂400μL并混合均匀，静置15秒后在紫外分光光度计上进行测定。图1所示为该样本经过上述处理步骤后所得到的紫外-可见光谱。

二、在测定血样中白细胞总数中的应用：

使用实施例1配制的溶血剂对一新鲜血液样本在创艺五分类血细胞分析仪CYB-5200上进行测定，所得到的白细胞计数直方图如图2所示。具体操作步骤为：

使用血细胞分析用稀释液对样本进行稀释；将溶血剂加入到稀释后的样本中，反应20s；在血细胞分析仪中使用直流阻抗法测定白细胞个数及大小，从而获得白细胞的直方图，根据直方图区分嗜碱性粒细胞亚群，并计算白细胞总数及嗜碱性粒细胞的个数。

从图2可以看出，红细胞由于被溶解而对直方图无干扰，该样本的嗜碱性粒细胞由于数量过低而未在图上出峰。

本发明的实施例四为：血样分析方法的准确性和相关性检验：

一、测定血红蛋白浓度的准确性和相关性检验：

使用实施例1配制的溶血剂在创艺CYB-5200血细胞分析仪器上对100个临床样本进行测定，并用传统HGB溶血剂作为参照在CYB-5200上进行分析。图3所示为使用实施例1配方及传统HGB溶血剂测得的血红蛋白浓度结果之间的线性相关关系。从图3可以看出，实施例1配方与传统HGB溶血剂在血红蛋白浓度测定中具有相当的效果。

二、白细胞计数的准确性和相关性检验：

使用实施例1配制的溶血剂在创艺CYB-5200血细胞分析仪器上对40个临床样本进行测定，并用传统嗜碱溶血剂作为参照在CYB-5200上进行分析。图4所示为使用实施例1配方及传统嗜碱溶血剂测得的白细胞计数之间的线性相关关系。从图4可以看出，实施例1配方与传统嗜碱溶血剂在白细胞计数中具有相当的效果。

综上所述，本发明提供的提供一种无氰化物的溶血剂，该溶血剂能够溶解细胞膜、稳定血红蛋白、白细胞和嗜碱性粒细胞，适用于血细胞分析仪，使测定操作方便、准确度高。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种无氰溶血剂，其特征在于，含有以下组分：

阳离子表面活性剂3～10g/L；

非离子表面活性剂0.1～5g/L；

螯合剂0.1～1g/L；

缓冲盐；

渗透压调节剂；

2.如权利要求1所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述阳离子表面活性剂包括如下结构式I和II所示化合物中的至少一种：

3.如权利要求1所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂包括如下结构式所示化合物中的至少一种：

4.如权利要求1所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐和硼酸盐中的至少一种。

5.如权利要求4所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述缓冲盐用于调节缓冲体系的pH调节范围为3～8。

6.如权利要求1所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述渗透压调节剂中至少含有一种碱金属氯化物。

7.如权利要求6所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述渗透压调节剂包括氯化钠或氯化钾中的至少一种。

8.如权利要求6所述的一种无氰溶血剂，其特征在于，所述渗透压调节剂用于调节所述无氰溶血剂的渗透压至400～600mOsm/kg。

9.一种血细胞分析仪用试剂，其特征在于：所述血细胞分析仪用试剂包括如权利要求1至8任一项所述的无氰溶血剂。

10.根据权利要求9所述血细胞分析仪用试剂，其特征在于：所述血细胞分析仪用试剂为用于分析包括血红蛋白浓度、白细胞总数和嗜碱性粒细胞个数中的至少一种的试剂。