CN102662067A - 一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素。所要解决的问题就是背景技术存在的：没有无氰化血红蛋白及白细胞分群测定试剂可以在血红蛋白测定的同时提供单核细胞和整个粒细胞的数量，以及采用了一定毒性或致癌的化合物做测定试剂，对环境依然有一定的污染，以及阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂在水溶液中混合容易形成沉淀的问题。解决该问题所采用技术方案要点是：试剂包括：a)至少一种足够量的溶解红细胞的阳离子表面活性剂，b)至少一种足够量的酸化剂，c)至少一种足够量的能够与释放的血红蛋白结合的配位体吡啶硫酮钠，可应用于测试血红蛋白及白细胞分群的试剂，具有无毒、无污染、测试准确等优点。
Description
技术领域：本发明涉及一种用于测定血样中总血红蛋白浓度及同时进行白细胞计数或白细胞分群计数的组合物，具体涉及一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素。
背景技术：总血红蛋白的测定是血液携氧量的重要指标。迄今为止已经在正常人和血液病患者中发现了300多种以上的血红蛋白，这些异常导致血红蛋白浓度的改变或者血红蛋白携氧能力的改变，从而出现廉状细胞性贫血、地中海贫血和血红蛋白异常等疾病。测定血样中血红蛋白的浓度是相关疾病诊断的十分重要的依据，对监控血红蛋白疾病的治疗以及其他可能影响血红蛋白水平改变的疾病的治疗也是十分重要的。在用人工或自动测定血样中总血红蛋白浓度及用于同时进行白细胞计数或白细胞亚群的分类计数的分析实验中，尽管通过标准的氰化正铁血红蛋白方法及其改良的自动方法形成的色原稳定可靠，然而，由于使用氰化钾，试剂废液会引起很大的环境污染。在过去十多年中，人们付出巨大的努力以开发不使用氰化物的自动血红蛋白测定方法。Oshiro等[临床生物化学(Clin.Biochem.)，1583(1982)]说明了用于血红蛋白分析所使用的试剂，该试剂包含十二烷基硫酸钠(SLS)和Triton X-100。SLS用于溶解红细胞，并被认为进一步产生SLS-血红蛋白复合物，它在539nm处具有最大吸光度并在572nm处有肩峰。SLS法现为世界公认的一种比较稳妥可靠的无氰化物血红蛋白测定方法。然而，使用Oshiro方法不能进行血红蛋白测定的同时分析白细胞。因为高浓度的十二烷基硫酸钠将白细胞破坏程度过高。美国专利号5,242,832(属sakata)公开了用于对血样进行白细胞计数并测定血红蛋白浓度的无氰物溶血素。该溶血素包含至少一种表面活性剂包括阳离子表面活性剂和两性表面活性剂以及至少一种选自下列化合物的血红蛋白稳定剂：Tiron、8-羟喹啉、联吡啶、1，10-临菲咯啉、酚类化合物、双酚等等。Sakata说明了白细胞分级分离或三个组(包括淋巴细胞，单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的聚集体以及中性粒细胞的聚集体)。只有通过使用至少两种适合的表面活性剂和严格控制表面活性剂的浓度才能完成。Sakata也说明了溶血剂优选的PH值是5.0-8.0。如果PH值是3.0或更小，对白细胞的破坏增加，这样增加白细胞的测定困难，如果PH值是9.0或者更大，血红蛋白的稳定性随时间的延长而变差。而且，其中的8-羟喹啉水溶性差，长期使用会残留在仪器管道中，造成仪器部件的污染，给使用带来不便；PCT/US95/02897(Kim)公开了用于测定全血样中的血红蛋白无氰化方法和试剂。该试剂包括配体(选自下列化合物：咪唑及其衍生物、N-羟乙酰胺、H-羟胺、吡啶、恶唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和异喹啉)以及一种强红细胞溶解能力的表面活性剂(选自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)。该分析方法快速，不到10秒。然而，该试剂仅在极端碱性PH值11-14条件下操作。此外，Kim没有说明计数白细胞或分别白细胞亚群的能力。上述的无氰化物血红蛋白测定中，没有一种可以在血红蛋白测定的同时提供单核细胞和整个粒细胞的数量；然而，这两个参数都是用于各种疾病临床诊断的有价值的工具。这就需要更多用途的无氰化物血红蛋白测定方法和多功能试剂以在单个自动步骤中可以完成若干诊断分析。中国专利申请号98801947属于库尔特公司，公开了一种无氰化物试剂组合物，其中含有选自下列化合物的血红蛋白配体三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4，6-二羟基-1，3，5三嗪-2-羧酸的碱金属盐、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1，3，4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、异烟酰胺、邻氨基苯甲啨、6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的碱金属和铵盐、吡嗪及其衍生物的有机配体的水溶液。还有选自季铵盐、吡啶嗡盐、有机磷酸酯和烷基磺酸的溶血性表面活性剂以溶解红细胞释放血红蛋白。然而该方法仍然采用了一定毒性或致癌的化合物，对环境依然有一定的污染。中国专利申请号03140211.9(专利权人深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)公开了一种无氰化物溶血素，提到了同时使用阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂共三种表面活性剂，不仅繁琐；而且还有一个众所周知的严重缺陷，即阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂在水溶液中混合容易形成沉淀，专利中也提到要严格控制这两种表面活性剂的量，否则容易形成沉淀，在实际应用中很不方便。
发明内容：本发明的目的就是提出一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，以解决背景技术存在：没有无氰化血红蛋白及白细胞分群测定试剂可以在血红蛋白测定的同时提供单核细胞和整个粒细胞的数量，以及采用了一定毒性或致癌的化合物做测定试剂，对环境依然有一定的污染，以及阳离子表面活性剂和阴离子表面活性剂在水溶液中混合容易形成沉淀，在实际应用中很不方便的问题。解决该技术问题所采用的技术方案是：一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，为均一的水溶液，其特征在于基本组成为：
a)至少一种溶解红细胞的阳离子表面活性剂，选自季铵盐、吡啶嗡盐、氧化胺型季铵盐，
式a 式b 式c
其中的式a、式b、式c中的R1、R5是碳原子数是8-18长链烷基、烯基或炔基，式a、式c中的R2、R3、R4都是碳原子数1-5短链烷基、烯基、炔基或者氢原子，X---是任何一种阴离子；
b)至少一种酸化剂，该酸化剂在水溶液中能够电离出足够量的氢离子，将PH值调整到≤7.0的酸性环境；
c)至少一种能够与释放的血红蛋白结合的配位体，该配位体为吡啶硫酮钠。
其中，a)至少一种溶解红细胞的阳离子表面活性剂，选自季铵盐、吡啶嗡盐、氧化胺型季铵盐，浓度为3-90g/L。b)至少一种酸化剂，浓度为0.1-5g/L。c)至少一种能够与释放的血红蛋白结合的配位体，该配位体为40％吡啶硫酮钠溶液，浓度为0.1-1.0ml/L。试剂的优选方案是：溶解红细胞的阳离子表面活性剂的浓度为16-60g/L，酸化剂的浓度为0.1-3g/L，40％配位体溶液的浓度为0.4-1ml/L。试剂的更优选方案是：阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵的浓度为26g/L，酸化剂丁二酸的浓度为0.1g/L，40％配位体吡啶硫酮钠溶液的浓度为1.0ml/L。酸化剂选取丁二酸、盐酸、草酸、甲酸、柠檬酸。此外，溶血素可以包含其他可有可无的添加剂，例如无机和有机的盐类，防腐剂，抗氧化剂以及其它所有不影响血红蛋白测定和白细胞计数或白细胞分群计数的化学成分。
使用上述一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素的方法，是将抗凝血通过合适的稀释液稀释，将合适量的上述溶血素与稀释后的样品手工或者仪器自动混合，根据仪器需要，总试剂量相对于血液的稀释比从125∶1至500∶1，然后在添加溶血素4秒后，在仪器的光度计上用特定的波长测定样品混合物的吸光度，或者通过手工引入装备有光度计和具有阻抗测定装置的血液分析仪中，测定血红蛋白浓度或者同时进行白细胞计数。其中，在进行白细胞计数时根据所获得体积大小直方图进行白细胞亚群分类，白细胞可以分成三个亚群，包括淋巴细胞、中间细胞和中性粒细胞，其中的中间细胞包含单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
本发明与背景技术比较所具有的有益效果是：本发明的溶血素提供了精确的血红蛋白测定、精确地白细胞计数及白细胞亚群的分别计数。表1说明了该溶血素在使用ABX Micros 60血细胞分析仪测定血红蛋白浓度方面和用五分类血细胞分析仪GENS的结果的高度相关性。表2说明了该溶血素在ABX Micros 60血细胞分析仪获得的血红蛋白浓度及白细胞计数和在相同仪器上用原装试剂测定结果之间具有极好的相关性。本发明的溶血素提供了不同的病人样本的精确的血红蛋白测定。在使用的样本中，有70％是来自各科的临床病人，有感染内科的、血液科、肿瘤科等，其中有的来自血液科病人的血样含有不同类型的异常血红蛋白，然而用本发明的溶血素和方法测定结果和常用的氰化物-HGB方法有高度相关性(见表1)。这表明各种临床样品的总血红蛋白浓度都可以使用本发明的溶血素组合物测定。
表1是本发明的溶血素结果和Coulter公司GENS结果的相关系数。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | |
| HGB | 0.9965 | 0.9981 | 0.9972 | 0.9977 | 0.9980 | 0.9975 |
每次试验的样本数在40-50之间。
表2是本发明的溶血素与自配稀释液配合在ABX Micros 60血细胞分析仪获得的血红蛋白浓度及白细胞计数和在相同仪器上用原装试剂测定结果之间的相关性。
| WBC | Lym％ | Gran％ | HGB | |
| r | 0.9921 | 0.9549 | 0.9542 | 0.9961 |
综上所述，本发明试剂不含氰化物、没有毒性、易于溶解、不形成沉淀、不残留管道、能够采用可靠方法测定血红蛋白的浓度，并且同时白细胞能被分成三个亚群用于分别计数。另外，本发明溶血素中所形成的血红蛋白色原能够在3-5秒内快速形成并且很稳定，使之血红蛋白的分析方法准确可靠。
附图说明：图1是稀释血加入本发明的溶血素后马上进行扫描的紫外-可见吸收光谱图，在540nm处有吸收峰。图2是本发明的溶血素在ABX Micros 60血细胞分析仪上的白细胞直方图。
具体实施方式：
实施例1：参考图1、图2，按照下列组分和含量配成溶液：
以0.22μm滤芯过滤，用适合的血细胞分析仪，或者其他粒子分析仪器监控空白计数值，使之符合空白计数要求。用稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，测定紫外-可见吸收光谱。以稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，在ABX Micros 60血细胞分析仪上所得到的白细胞直方图。
实施例2：参考图1、图2，按照下列组分和含量配成溶液：
以0.22μm滤芯过滤，用适合的血细胞分析仪，或者其他粒子分析仪器监控空白计数值，使之符合空白计数要求。用稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，测定紫外-可见吸收光谱。以稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，在ABX Micros 60血细胞分析仪上所得到的白细胞直方图。
实施例3：参考图1、图2，按照下列组分和含量配成溶液：
以0.22μm滤芯过滤，用适合的血细胞分析仪，或者其他粒子分析仪器监控空白计数值，使之符合空白计数要求。以稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，测定紫外-可见吸收光谱。用稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，在ABX Micros 60血细胞分析仪上所得到的白细胞直方图。
实施例4：参考图1、图2，按照下列组分和含量配成溶液：
以0.22μm滤芯过滤，用适合的血细胞分析仪，或者其他粒子分析仪器监控空白计数值，使之符合空白计数要求。以稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，测定紫外-可见吸收光谱。用稀释剂稀释血样，加入上述配方的溶血素，在ABX Micros 60血细胞分析仪上所得到的白细胞直方图。
Claims (8)
1.一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，为均一的水溶液，其特征在于基本组成为：
a)至少一种溶解红细胞的阳离子表面活性剂，选自季铵盐、吡啶嗡盐、氧化胺型季铵盐，
式a 式b 式c
其中的式a、式b、式c中的R1、R5是碳原子数是8-18长链烷基、烯基或炔基，式a、式c中的R2、R3、R4都是碳原子数1-5短链烷基、烯基、炔基或者氢原子，X---是任何一种阴离子；
b)至少一种酸化剂，该酸化剂在水溶液中能够电离出足够量的氢离子，将PH值调整到≤7.0的酸性环境；
c)至少一种能够与释放的血红蛋白结合的配位体，该配位体为吡啶硫酮钠。
2.根据权利要求1所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于a)至少一种溶解红细胞的阳离子表面活性剂，选自季铵盐、吡啶嗡盐、氧化胺型季铵盐，浓度为3-90g/L。
3.根据权利要求1所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于b)至少一种酸化剂，浓度为0.1-5g/L。
4.根据权利要求1所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于c)至少一种能够与释放的血红蛋白结合的配位体，该配位体为40％的吡啶硫酮钠溶液，浓度为0.1-1.0ml/L。
5.根据权利要求1所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于试剂的优选方案是：溶解红细胞的阳离子表面活性剂的浓度为16-60g/L，酸化剂的浓度为0.1-3g/L，40％的配位体溶液的浓度为0.4-1ml/L。
6.根据权利要求1或5所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于试剂的更优选方案是：阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵的浓度为26g/L，酸化剂丁二酸的浓度为0.1g/L，40％的配位体吡啶硫酮钠溶液的浓度为1.0ml/L。
7.根据权利要求1或5所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于酸化剂选取丁二酸、盐酸、草酸、甲酸、柠檬酸。
8.根据权利要求6所述的一种无氰化测定血红蛋白浓度及白细胞分群计数的溶血素，其特征在于酸化剂选取丁二酸、盐酸、草酸、甲酸、柠檬酸。
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Address after: 264003 Laishan Province, Yantai District, Bao Road, No., No. 10 Patentee after: Shandong excellence biotechnology Limited by Share Ltd Address before: 264003 Laishan Province, Yantai District, Bao Road, No., No. 10 Patentee before: Yantai Excellent Biotechnology Co., Ltd. |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Cyanide-free hemolysin for determining hemoglobin concentration and carrying out white blood cell count by groups Effective date of registration: 20170921 Granted publication date: 20140702 Pledgee: Yantai financing Company Limited by Guarantee Pledgor: Shandong excellence biotechnology Limited by Share Ltd Registration number: 2017370000144 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200918 Granted publication date: 20140702 Pledgee: Yantai financing Company Limited by Guarantee Pledgor: B&E BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: 2017370000144 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A hemolysin for measuring hemoglobin concentration and leukocyte grouping count without cyanide Effective date of registration: 20211202 Granted publication date: 20140702 Pledgee: Rizhao Bank Co.,Ltd. Yantai Zhifu sub branch Pledgor: B&E BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2021980013711 |