JP3997539B2 - 赤血球溶血剤、白血球分類用試薬および試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液試料中のヘモグロビン量（濃度等）の測定の血液試料中の赤血球を溶血させる溶血剤および白血球を分類するための白血球分類用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、血液中の血球をその粒径によって赤血球、白血球、血小板等に識別して、各血球数を測定するための自動血球計数器が知られている。粒径が近いものがある赤血球と白血球を識別するために、溶血剤を用いて赤血球を溶血させている。赤血球を溶血させるとヘモグロビンが溶出するために白血球数とヘモグロビン濃度の測定が可能となる。
【０００３】
例えば、特公平３−５８０６７号（アメリカ特許第４，３４６，０１８号）では、第４級アンモニウム塩とシアン化合物を含有する試薬が開示されている。第４級アンモニウム塩は赤血球を溶解し白血球ヒストグラムを作成するのに有効な成分であり、シアン化合物はヘモグロビンを安定化させる作用があり安定してヘモグロビン濃度を測定するのに有効な成分であることはよく知られている。
【０００４】
しかし、シアンメトヘモグロビン法で用いられるシアン化合物は、循環器系症状・呼吸器症状等の中毒症状をもたらす毒性の強い毒物である。したがって、シアン化合物を生産および使用する際の取り扱いには十分注意が必要である。また、シアンメトヘモグロビン法による測定後に排出される廃液中のシアン化合物を無害な化合物に分解する必要がある。そのために、取り扱い上の問題や、処理コストの問題があった。さらにシアン化合物であるので長期保存ができない等保存性の問題があった。
【０００５】
この問題を解決するために、シアン化合物を含有しない溶血剤が開発されてきている。
特表平１１−５０７７３３号（アメリカ特許第５，６８６，３０８号）は、血液中の白血球の鑑別式決定のための試薬および方法が開示されている。この試薬はエトキシル化長鎖アミン化合物とｐＨを調整する酸および高張アルカリ安定化試薬を含有しているので、ｐＨが２．０〜３．６に限定され、白血球の膨張を抑制するためのアルカリ安定化試薬を添加して中和しなければならないという制約がある。
【０００６】
特許第２８３６８６５号にもシアン化合物を含有しない試薬が開示されている。
ここでは、血液中の赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変成させうる濃度の第四級アンモニウム塩、ヘモグロビン中のヘムを酸化させうる酸化剤等を含有する試薬が開示されている。しかしながら、この試薬では、メトヘモグロビンを安定化する成分を含まないために、試料作成後、ヘモグロビン値が経時的に変化するという問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、自然環境、人体への影響を有する化学物質の抑制を図ることにより、赤血球溶血剤、白血球分類用試薬の生産、使用における危険性を低減し、効率かつ安全な作業環境を創造することにある。
さらに本発明の目的は、血液試料への試薬添加後、測定中の白血球、ヘモグロビンの経時的変化を抑制し、白血球数の測定、ヘモグロビン濃度の測定を安定かつ再現性よく行うことができ、かつ保存性のよい赤血球溶血剤、白血球分類用試薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するため、血液中の赤血球を溶血させ、溶血後のヘモグロビンを安定化する赤血球溶血剤において、第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする（請求項１）。
【００１１】
さらに、赤血球溶血剤のジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項２）。
【００１２】
また、赤血球溶血剤の各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項３）。
【００１３】
さらに、ヘモグロビンを安定化し血液中の白血球を分類するための白血球分類用試薬において、第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする（請求項４）。
【００１６】
さらに、白血球分類用試薬のジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項５）。
【００１７】
白血球分類用試薬の各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項６）
【００１８】
また、血液中の赤血球を溶血させ、溶血後のヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分類するための試薬において、第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする（請求項７）。
【００２１】
さらに、試薬のジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項８）。
【００２２】
さらに、試薬の各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項９）。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、血液を、塩化ナトリウム等により血液と等張であるリン酸緩衝液（希釈液）で希釈し、下記の複数の実施の態様、比較例の試薬（成分）それぞれに添加した場合の希釈血液に試薬を混合した後の試薬各成分の検査血液（希釈前血液）１μＬに対する重量とヘモグロビン吸光変化率の実験データを示す。
なお、実験は、血液希釈液に試薬を添加して２０秒から１３０秒まで１０秒おきに吸光度を計測した。ヘモグロビン吸光度変化率は、添加２０秒後の吸光度を基準としており、３回行ったデータの平均値である。ヘモグロビン吸光度を計測するために使用した波長は、５４０ｎｍと５５５ｎｍである。
赤血球溶血剤はリン酸緩衝液によりｐＨ５〜９の範囲で調整される。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
血液中のヘモグロビン濃度を測定するにあたり、計測誤差を最小限にするためには、血液希釈液に溶血剤を添加した後に測定されるヘモグロビン吸光度の時間経過による変化が最小限であることが必要である。そして、ヘモグロビン吸光度の時間経過による変化は、溶血剤添加後約１３０秒の間で、約±１．０％の範囲であることが望ましい。
【００３１】
この点、ジメチロールジメチルヒダントインを含まない比較例１、２の結果は、溶血剤添加後１３０秒の間でのヘモグロビン吸光度は±１．０％を越えている。一方、ジメチロールジメチルヒダントインを含む実施の態様１〜４では、吸光度変化はほぼ±１．０％の範囲であり、良好な結果が得られていることがわかる。
【００３２】
さらには、上記実施の態様１〜４のいずれについても、インピーダンス法による白血球分類を行ったところ良好に白血球が分類された。図１に、実施の態様１の試薬によるインピーダンス法のヒストグラムを示す。上記実施の態様２〜４の結果は図１とほぼ同様、白血球を３分類（リンパ球、単球、顆粒球）することが可能な分布となった。
このように、実施態様１〜４に示す試薬は、赤血球溶血剤として用い、ヘモグロビン量（濃度等）を測定するのに用いることもでき、また白血球分類用試薬としても用いることができる。
【００３３】
本願発明者はこのような多くの実験を行った結果、ヘモグロビン吸光度の時間経過による変化が少ない結果が得られる適切な成分の濃度範囲は次のような範囲であることを見出すに至った。すなわち、
【００３４】
【表７】
【００３５】
の範囲である。このような溶血剤を塩化ナトリウム等を用いて血液と等張に調整されたリン酸緩衝液ないしトリス緩衝液により血液を希釈した血液希釈剤に添加すれば安定したヘモグロビン濃度測定を行うことができるのである。
これは検査血液１μＬの対し次の重量の割合で混合することに相当するものである。
【００３６】
【表８】
【００３７】
なお、検査血液は、先にリン酸緩衝液と混合し次に試薬と混合するようにしてもよい。結果として検査血液は適切なｐＨ範囲に調整されることになる。あるいは検査血液を、リン酸緩衝液により予め希釈された試薬に混合するようにしてもよい。予め希釈された試薬であれば、その状態でｐＨが調整されていることになる。なお、ｐＨは５〜９の範囲で測定可能である。
【００３８】
【発明の効果】
以上、詳述したように本発明に係る試薬によれば、赤血球から溶出したヘモグロビンを安定化させ、ヘモグロビン量（濃度等）を測定することができるとともに、白血球分類用試薬としても良好に白血球を分類することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の態様１の試薬を用いたインピーダンス法による白血球分類の結果を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液試料中のヘモグロビン量（濃度等）の測定の血液試料中の赤血球を溶血させる溶血剤および白血球を分類するための白血球分類用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、血液中の血球をその粒径によって赤血球、白血球、血小板等に識別して、各血球数を測定するための自動血球計数器が知られている。粒径が近いものがある赤血球と白血球を識別するために、溶血剤を用いて赤血球を溶血させている。赤血球を溶血させるとヘモグロビンが溶出するために白血球数とヘモグロビン濃度の測定が可能となる。
【０００３】
例えば、特公平３−５８０６７号（アメリカ特許第４，３４６，０１８号）では、第４級アンモニウム塩とシアン化合物を含有する試薬が開示されている。第４級アンモニウム塩は赤血球を溶解し白血球ヒストグラムを作成するのに有効な成分であり、シアン化合物はヘモグロビンを安定化させる作用があり安定してヘモグロビン濃度を測定するのに有効な成分であることはよく知られている。
【０００４】
しかし、シアンメトヘモグロビン法で用いられるシアン化合物は、循環器系症状・呼吸器症状等の中毒症状をもたらす毒性の強い毒物である。したがって、シアン化合物を生産および使用する際の取り扱いには十分注意が必要である。また、シアンメトヘモグロビン法による測定後に排出される廃液中のシアン化合物を無害な化合物に分解する必要がある。そのために、取り扱い上の問題や、処理コストの問題があった。さらにシアン化合物であるので長期保存ができない等保存性の問題があった。
【０００５】
この問題を解決するために、シアン化合物を含有しない溶血剤が開発されてきている。
特表平１１−５０７７３３号（アメリカ特許第５，６８６，３０８号）は、血液中の白血球の鑑別式決定のための試薬および方法が開示されている。この試薬はエトキシル化長鎖アミン化合物とｐＨを調整する酸および高張アルカリ安定化試薬を含有しているので、ｐＨが２．０〜３．６に限定され、白血球の膨張を抑制するためのアルカリ安定化試薬を添加して中和しなければならないという制約がある。
【０００６】
特許第２８３６８６５号にもシアン化合物を含有しない試薬が開示されている。
ここでは、血液中の赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変成させうる濃度の第四級アンモニウム塩、ヘモグロビン中のヘムを酸化させうる酸化剤等を含有する試薬が開示されている。しかしながら、この試薬では、メトヘモグロビンを安定化する成分を含まないために、試料作成後、ヘモグロビン値が経時的に変化するという問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、自然環境、人体への影響を有する化学物質の抑制を図ることにより、赤血球溶血剤、白血球分類用試薬の生産、使用における危険性を低減し、効率かつ安全な作業環境を創造することにある。
さらに本発明の目的は、血液試料への試薬添加後、測定中の白血球、ヘモグロビンの経時的変化を抑制し、白血球数の測定、ヘモグロビン濃度の測定を安定かつ再現性よく行うことができ、かつ保存性のよい赤血球溶血剤、白血球分類用試薬を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するため、血液中の赤血球を溶血させ、溶血後のヘモグロビンを安定化する赤血球溶血剤において、第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする（請求項１）。
【００１１】
さらに、赤血球溶血剤のジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項２）。
【００１２】
また、赤血球溶血剤の各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項３）。
【００１３】
さらに、ヘモグロビンを安定化し血液中の白血球を分類するための白血球分類用試薬において、第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする（請求項４）。
【００１６】
さらに、白血球分類用試薬のジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項５）。
【００１７】
白血球分類用試薬の各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項６）
【００１８】
また、血液中の赤血球を溶血させ、溶血後のヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分類するための試薬において、第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする（請求項７）。
【００２１】
さらに、試薬のジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項８）。
【００２２】
さらに、試薬の各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項９）。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、血液を、塩化ナトリウム等により血液と等張であるリン酸緩衝液（希釈液）で希釈し、下記の複数の実施の態様、比較例の試薬（成分）それぞれに添加した場合の希釈血液に試薬を混合した後の試薬各成分の検査血液（希釈前血液）１μＬに対する重量とヘモグロビン吸光変化率の実験データを示す。
なお、実験は、血液希釈液に試薬を添加して２０秒から１３０秒まで１０秒おきに吸光度を計測した。ヘモグロビン吸光度変化率は、添加２０秒後の吸光度を基準としており、３回行ったデータの平均値である。ヘモグロビン吸光度を計測するために使用した波長は、５４０ｎｍと５５５ｎｍである。
赤血球溶血剤はリン酸緩衝液によりｐＨ５〜９の範囲で調整される。
【００２４】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
血液中のヘモグロビン濃度を測定するにあたり、計測誤差を最小限にするためには、血液希釈液に溶血剤を添加した後に測定されるヘモグロビン吸光度の時間経過による変化が最小限であることが必要である。そして、ヘモグロビン吸光度の時間経過による変化は、溶血剤添加後約１３０秒の間で、約±１．０％の範囲であることが望ましい。
【００３１】
この点、ジメチロールジメチルヒダントインを含まない比較例１、２の結果は、溶血剤添加後１３０秒の間でのヘモグロビン吸光度は±１．０％を越えている。一方、ジメチロールジメチルヒダントインを含む実施の態様１〜４では、吸光度変化はほぼ±１．０％の範囲であり、良好な結果が得られていることがわかる。
【００３２】
さらには、上記実施の態様１〜４のいずれについても、インピーダンス法による白血球分類を行ったところ良好に白血球が分類された。図１に、実施の態様１の試薬によるインピーダンス法のヒストグラムを示す。上記実施の態様２〜４の結果は図１とほぼ同様、白血球を３分類（リンパ球、単球、顆粒球）することが可能な分布となった。
このように、実施態様１〜４に示す試薬は、赤血球溶血剤として用い、ヘモグロビン量（濃度等）を測定するのに用いることもでき、また白血球分類用試薬としても用いることができる。
【００３３】
本願発明者はこのような多くの実験を行った結果、ヘモグロビン吸光度の時間経過による変化が少ない結果が得られる適切な成分の濃度範囲は次のような範囲であることを見出すに至った。すなわち、
【００３４】
【表７】
の範囲である。このような溶血剤を塩化ナトリウム等を用いて血液と等張に調整されたリン酸緩衝液ないしトリス緩衝液により血液を希釈した血液希釈剤に添加すれば安定したヘモグロビン濃度測定を行うことができるのである。
これは検査血液１μＬの対し次の重量の割合で混合することに相当するものである。
【００３６】
【表８】
なお、検査血液は、先にリン酸緩衝液と混合し次に試薬と混合するようにしてもよい。結果として検査血液は適切なｐＨ範囲に調整されることになる。あるいは検査血液を、リン酸緩衝液により予め希釈された試薬に混合するようにしてもよい。予め希釈された試薬であれば、その状態でｐＨが調整されていることになる。なお、ｐＨは５〜９の範囲で測定可能である。
【００３８】
【発明の効果】
以上、詳述したように本発明に係る試薬によれば、赤血球から溶出したヘモグロビンを安定化させ、ヘモグロビン量（濃度等）を測定することができるとともに、白血球分類用試薬としても良好に白血球を分類することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の態様１の試薬を用いたインピーダンス法による白血球分類の結果を示す図。
Claims (9)
- 血液中の赤血球を溶血させ、溶血後のヘモグロビンを安定化する赤血球溶血剤において、
第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする赤血球溶血剤。 - 前記ジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする請求項１に記載の赤血球溶血剤。
- 前記各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする請求項１に記載の赤血球溶血剤。
- ヘモグロビンを安定化し血液中の白血球を分類するための白血球分類用試薬において、
第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする白血球分類用試薬。 - 前記ジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする請求項４に記載の白血球分類用試薬。
- 前記各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする請求項４に記載の白血球分類用試薬。
- 血液中の赤血球を溶血させ、溶血後のヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分類するための試薬において、
第４級アンモニウム塩であるラウリルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれか一方と、ジメチロールジメチルヒダントインとを含むことを特徴とする試薬。 - 前記ジメチロールジメチルヒダントインは、検査血液１μＬに対し、０．００２〜０．２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする請求項７に記載の試薬。
- 前記各第４級アンモニウム塩は、検査血液１μＬに対し、それぞれ０．０２〜１．８ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする請求項７に記載の白血球分類用試薬。
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- 2002-05-24 JP JP2002150114A patent/JP3997539B2/ja not_active Expired - Fee Related
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