JPH0623754B2 - 白血球保護剤を含む流動式血球計測法溶解試薬 - Google Patents

白血球保護剤を含む流動式血球計測法溶解試薬

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JPH0623754B2
JPH0623754B2 JP59171700A JP17170084A JPH0623754B2 JP H0623754 B2 JPH0623754 B2 JP H0623754B2 JP 59171700 A JP59171700 A JP 59171700A JP 17170084 A JP17170084 A JP 17170084A JP H0623754 B2 JPH0623754 B2 JP H0623754B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は赤血球溶解用試薬、特定的には流動式血球計数
型装置により標準的３部（３−part）示差式白血球計数
を行うのに有用な白血球保護剤を含む赤血球溶解用試薬
に関する。
臨床分野に自動化装置を供給する必要性が種々の型の血
球計数を行うことが出来る多種の装置の開発を促がして
来た。赤血球、血小板または白血球の自動計数は種々の
方法により行うことが出来る。例えば、ある種の装置は
流動式血球計数の原理に基く装置を含みそして一般に集
光光源により照明された部分を単一流解析のもとで個々
に通過する細胞の光散乱特性を分析することにより操作
するものとして説明することが出来る。必要な照明には
典型的なレーザーが用いられそして散乱は複数の角度で
測定される。
しばしば、一つの種類細胞に関して計数精度を保つため
に他の種類の細胞により発生する散乱効果を除去するこ
とが必要となる。これは関与する種類に対して特異的に
作用する溶解試薬を用いることにより達成することが出
来る。
現在、本発明の譲受人は赤血球及び血小板の計数並びに
五つの従来測定されている因子：ＨＧＢ、ＨＣＴ、ＭＣ
Ｖ、ＭＣＨ及びＭＣＨＣの測定を行うことが出来るＥＬ
Ｔ系列の装置を市販している。然しながら最近、同譲受
人は白血球示差計数、即ち所謂３部示差計数（３−Part
Difcounts）に対する臨床医の要求が増加して来たこと
に遭遇した。これには、三つの白血球亜集団（リンパ
球、顆粒球及び単球）を計数し得るように更に一つの装
置能力を必要とする。これを達成するために、白血球の
散乱特性に著しく且つ悪い影響を与えることなく赤血球
を選択的に溶解することが必要となる。
本発明の一つの目的は、白血球に好ましくない影響を与
えることなく赤血球を溶解することが出来、他方白血球
の光散乱測定が可能な試薬を提供することである。
更に一つの目的は、検知装置の性能が悪い影響を受けな
いように溶解試薬が十分な速度で作用するようにするこ
とである。
本発明のなお更に一つの目的は、高性能ＥＬＴ系列の装
置に用いるための、白血球保護作用を有する赤血球溶解
用試薬を提供し、それにより３部示差計数を可能にする
ことである。
本発明の原理及び目的に従えば、ＴＲＩＳ［トリス−
（ヒドロキシメチル）アミノエタン］および２−アミノ
−２−メチル−１，３−プロパンジオールからなる群か
ら選ばれた有機窒素含有緩衝剤とＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸］およびＴＡＰＳ［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチ
ル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸］からなる
群から選ばれたエタンスルホン酸緩衝剤の組合せ、並び
に１００〜７００ｍＭの濃度のメトキシエタノール、５
０〜５００ｍＭの濃度のエトキシエタノール或いはメト
キシエトキシエタノール、１０〜３００ｍＭの濃度のブ
トキシエタノール、エトキシエトキシエタノール或いは
ブトキシエトキシエタノールからなる群から選ばれた白
血球保護剤よりなる流動式血球装置に用いるための溶解
用試薬が提供される。好ましくは、緩衝剤は約ｐＨ8.1
乃至8.8の範囲のｐＨを有するように調節される。好ま
しい具体例は更にフエノキシエタノール及び／またはネ
オマイシン硫酸塩のごとき保存剤を含む。
溶解試薬が作用するｐＨの選択は二つの観点から重要で
あり、ｐＨが比較的低い場合、溶解は著しく遅い速度で
起り、その結果好ましくない遅延を招く。このような遅
延は検出性能に悪い影響を与えるであろう。他方、過度
に高いｐＨ、例えばｐＨ9.0以上の場合には、白血球の
速い劣化を起すことが見出されている。白血球の劣化は
計数の精度に好ましくない影響を与える。好ましいｐＨ
は約8.1乃至8.8の範囲にあり、最適のｐＨはｐＨ8.5の
近傍にあることが本発明の発明者により見出された。
更にまた、用いられる特定の緩衝剤が溶解試薬の適切な
作用に対して重要であることが見出された。理想的に
は、緩衝剤は最適のまたは望ましいｐＨに近いpKaを示
すものでなければならない。緩衝剤の存在はそれ自体溶
質として作用する傾向を示し、従つて浸透作用により溶
解過程を遅くするので、理想的な緩衝剤はその必要濃度
が低くそれによりその浸透効果を抑制するように高い緩
衝能を示すように選ばれるであろう。実際、第１表から
選ばれた本発明の親水性の浸透性分子と組合わせた場
合、本発明者は全緩衝剤濃度を１０ｍＭ以下に保つこと
が必須であることを見出した。
なお更に、赤血球膜中のイオン通路に対する緩衝剤の影
響のために、燐酸塩のごとき鉱酸性緩衝剤及びカルボン
酸またはカルボキシル基を含む分子は有効でないことが
見出された。むしろ、好ましい緩衝剤は有機窒素含有緩
衝剤、例えばＴＲＩＳ［トリス−（ヒドロキシメチル）
アメノエタン］または２−アミノ−２−メチル−１，３
−プロパンジオールである。これら有機塩基と組合わせ
る場合、用いるべき最も好ましい酸成分はエタンスルホ
ン酸「良好緩衝剤」例えばＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸］
またはＴＡＰＳ［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メ
チル−３−アミノプロパンスルホン酸］である。或いは
また、硼酸をそれ自体でまたはより有利にはＴＲＩＳ
（更に一つの「良好緩衝剤」）と共に用いることが出来
るが、本発明者はそれが上記の緩衝剤の組合わせより効
果が小さいことを見出した。最も好ましい緩衝剤は５ｍ
Ｍ ＴＲＩＳと2.5ｍＭ ＴＡＰＳとの組合わせであ
る。
緩衝状態中の水はそれ自体大半の生物試料中の赤血球を
速かに溶解するが、それに伴つて白血球の損失が著し
く、特にリンパ球亜類の損失が大きい。勿論、このよう
な損失は計数に悪い影響を与えるので避けることが好ま
しい。従つて、白血球の溶解速度を低くめる溶質を加え
ることが必要となる。本発明の具体例においては、これ
らの溶質は付加的に白血球を溶解しないように保護する
作用を示すであろう。実際上如何なる溶質の付加は浸透
作用により溶解を遅くすると考えられるが、本発明者は
小さい新水性の脂質複層浸透剤である溶質のみが所望の
白血球保護作用を示すことを見出した。これらの化合物
は白血球及び特にリンパ球を保護し、然しながらその作
用型式を明確にすることは困難である。然しながら、白
血球保護剤の適切な選択により、なお開発途上にある高
性能ＥＬＴ装置により著しくより高く且つより安定した
リンパ球計数が得られることは明かである。然しなが
ら、保護機構が白血球膜の安定化変質によるものか或い
はそれが白血球細胞内での溶質剤の安定強化作用に関係
しているものなのか明らかではない。
更に一つの利点として、好ましい白血球保護剤がその存
在により細胞残屑と白血球との間の優れた分割作用を示
すことが見出された。この場合も、この効果のもととな
る機構は十分明かではないが、赤血球溶解に対する直接
的効果または溶解後の残屑に対する光学的効果によるこ
とが考えられ得る。
然しながら、本発明者は、このような考え方に固執する
ことなく、第１表に記載された好ましい白血球保護剤の
各群中の白血球保護剤の効果は分子鎖の長さに関係して
いると信じている。例えば、最も好ましい白血球保護剤
であるブトキシエタノールはメトキシエタノールより効
果のあるエトキシエタノールより更に効果が大きいこと
が見出された。より長い、より脂溶性の分子と効果との
この関係は脂溶性化合物が入り込むことより起る膜の部
分的構造の変質がここに観察される残屑の減少効果に係
る機構であることを暗示していると考えられる。
然しながら、すべての場合において、白血球保護、残屑
変質剤の作用は濃度に強く依存している。極めて低濃度
では、リンパ球の一部は溶解されそして残屑が顕著にな
り得る。最適濃度では、リンパ球が保護されそして残屑
は最小となり、他方極めて高い濃度では、白血球の光散
乱が好ましくない状態に変化しそして赤血球が溶解しな
くなる。赤血球が溶解しなくなることは溶液の滲透性の
変化、または白血球において起る安定化と同様の様式で
試薬による赤血球膜の安定化に関係していると考えられ
得る。従つて、本発明者は最も好ましい具体例は白血球
保護剤ブトキシエタノールを約６０ｍＭの濃度で用いる
ことであることを見出した。
最も好ましい具体例は付加的に細菌及び菌の成長を避け
るために保存剤を含む。多くの医薬保存剤は過度の溶解
を起すかまたは滲透的に溶解を抑制するので、それらは
使用に適さない。それに対し、理想的な保存剤は非イオ
ン性でありそして極めて低濃度で効果を示し、それによ
り滲透効果を減じるであろう。本発明の溶解用試薬は作
用に対しては保存剤を必要としないが、好ましい具体例
では、４ｍＭフエノキシエタノール及び1.0mg／ｌネオ
マイシン硫酸塩が配合され、それにより棚寿命が長くな
る。
第１表は本発明で用いる白血球保護剤を示す。本発明者
により考えられる最良の型はリンパ球保護剤としてブト
キシエタノールを用いるであろう。
実施例１ ＴＲＩＳ ５ｍＭ ＨＥＰＥＳ 2.5ｍＭ、及び メトキシエタノール ２５０ｍＭ を混合し、ｐＨを8.5に調節して赤血球溶解用試薬を調
製した。
この赤血球溶解用試薬は、流動式血球計数型装置に使用
する試薬として有用であった。
実施例２ メトキシエタノールの代わりにエトキシエタノール１２
０ｍＭを用いた他は実施例１と同様にして赤血球溶解用
試薬を調製した。
実施例３ メトキシエタノールの代わりにブトキシエタノール６０
ｍＭを用いた他は実施例１と同様にして赤血球溶解用試
薬を調製した。
実施例４ メトキシエタノールの代わりにメトキシエトキシエタノ
ール１５０ｍＭを用いた他は実施例１と同様にして赤血
球溶解用試薬を調製した。
実施例５ メトキシエタノールの代わりにエトキシエトキシエタノ
ール１００ｍＭを用いた他は実施例１と同様にして赤血
球溶解用試薬を調製した。
実施例６ メトキシエタノールの代わりにブトキシエトキシエタノ
ール５０ｍＭを用いた他は実施例１と同様にして赤血球
溶解用試薬を調製した。
実施例７ ＴＲＩＳの代わりに２−アミノ−２−メチル−１，３−
プロパンジオール５ｍＭを用いた他は実施例１と同様に
して赤血球溶解用試薬を調製した。
実施例８ ＨＥＰＥＳの代わりにＴＡＰＳ2.5ｍＭを用いた他は実
施例１と同様にして赤血球溶解用試薬を調製した。
この分野に精通した人々にとつて、本発明の精神及び態
様から離れることなく種々の変形が可能であることが用
意に理解されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−81696（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−6788（ＪＰ，Ａ) 米国特許4286963（ＵＳ，Ａ)

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ＴＲＩＳ［トリス−（ヒドロキシメチル）
    アミノエタン］および２−アミノ−２−メチル−１，３
    −プロパンジオールからなる群から選ばれた有機窒素含
    有緩衝剤とＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
    ラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸］およびＴＡＰＳ
    ［Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミ
    ノプロパンスルホン酸］からなる群から選ばれたエタン
    スルホン酸緩衝剤の組合せ、並びに１００〜７００ｍＭ
    の濃度のメトキシエタノール、５０〜５００ｍＭの濃度
    のエトキシエタノール或いはメトキシエトキシエタノー
    ル、１０〜３００ｍＭの濃度のブトキシエタノール、エ
    トキシエトキシエタノール或いはブトキシエトキシエタ
    ノールからなる群から選ばれた白血球保護剤よりなる流
    動式血球装置に用いるための溶解用試薬。
  2. 【請求項２】白血球保護剤がブトキシエタノールである
    特許請求の範囲第１項記載の試薬。
  3. 【請求項３】白血球保護剤が２５０ｍＭの濃度のメトキ
    シエタノール、１２０ｍＭのエトキシエタノール、６０
    ｍＭの濃度のブトキシエタノール、１５０ｍＭの濃度の
    メトキシエトキシエタノール、１００ｍＭの濃度のエト
    キシエトキシエタノール或いは５０ｍＭの濃度のブトキ
    シエトキシエタノールである特許請求の範囲第１項記載
    の試薬。
  4. 【請求項４】６０ｍＭの濃度のブトキシエタノール、５
    ｍＭの濃度のＴＲＩＳ緩衝液および2.5ｍＭの濃度のＴ
    ＡＰＳ緩衝液よりなる特許請求の範囲第１項記載の試
    薬。
JP59171700A 1983-08-22 1984-08-20 白血球保護剤を含む流動式血球計測法溶解試薬 Expired - Lifetime JPH0623754B2 (ja)

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