JPH1026620A - 網状赤血球測定用試薬及び測定方法 - Google Patents

網状赤血球測定用試薬及び測定方法

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JPH1026620A
JPH1026620A JP8848197A JP8848197A JPH1026620A JP H1026620 A JPH1026620 A JP H1026620A JP 8848197 A JP8848197 A JP 8848197A JP 8848197 A JP8848197 A JP 8848197A JP H1026620 A JPH1026620 A JP H1026620A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 少なくとも1つの網状赤血球を特異的に
染色する色素と、少なくとも1つの白血球を特異的に染
色する色素とからなる網状赤血球測定用試薬。 【効果】 安価で小型の光源を用いるフローサイトメー
タ法を用いて、異常リンパ球等が出現している特殊検体
においても網状赤血球が正確かつ迅速に測定することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、網状赤血球測定用
試薬及び測定方法に関し、より詳細には、臨床検査分野
において、血液中の網状赤血球及び網状赤血球成熟指数
を測定するための試薬及び測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】網状赤
血球は、骨髄中の赤芽球系細胞が脱核し、末梢血液中に
放出された直後の若い赤血球である。網状赤血球は、細
胞成熟過程の名残として、成熟赤血球には含まれていな
い少量のRNAあるいはリボソーム、ミトコンドリア等
の細胞小器官をその細胞内に有していることがその特徴
として挙げられる。
【0003】臨床検査分野において、網状赤血球を分類
計数することは、患者の骨髄内の造血状態を把握する上
で極めて重要である。骨髄造血が正常である健常人にお
いては、網状赤血球数は全赤血球の0.5〜3.0%を
占めているのに対して、骨髄造血に異常をきたしている
状態、例えば骨髄造血が抑制された状態では網状赤血球
数は減少し、骨髄造血が亢進した状態では増加する。具
体的には、再生不良性貧血、悪性腫瘍の化学療法時等で
は減少し、溶血性貧血等では増加する。
【0004】従来の網状赤血球を計数する方法として、
血液試料とニューメチレンブルー(NMB)、ブリリア
ントクレシルブルー(BCB)等の塩基性色素を含有す
る染色液とを混合させることによって、網状赤血球中に
含まれる上記残存物質を析出、染色し、個々の細胞を顕
微鏡で観察し、成熟赤血球と網状赤血球とを弁別する用
手法がある。
【0005】しかしながら、用手法は試料作製操作が煩
雑であり、検査技師間で細胞判別の個人差が生ずること
や細胞計数数が少ないゆえの統計学的誤差が大きいこと
が問題とされる。これらの問題を解決するために、上記
の塩基性色素のかわりに、蛍光性の塩基性色素で網状赤
血球を蛍光染色し、フローサイトメータで細胞の前方散
乱光強度と蛍光強度とを測定し、主に蛍光強度の差で成
熟赤血球と網状赤血球とを弁別、分類計数する方法(フ
ローサイトメータ法)が行われている。この方法に用い
られる色素としては、アクリジンオレンジ、チアゾール
オレンジ、オーラミンO等がよく知られている。
【0006】またこの方法は、網状赤血球の蛍光強度に
よって、網状赤血球をその成熟度別に分類計数し、網状
赤血球成熟指数を算出することも可能であり、蛍光強度
の強い網状赤血球の比率、すなわち最も若い網状赤血球
の比率が骨髄造血能の回復の指標として有用であること
が知られていることから、その利用が期待されている。
【0007】しかしその一方で、蛍光色素を励起するた
めの光源として、非常に高価かつ大型であるアルゴンレ
ーザーを必要とするため、装置自身も高価で大型になっ
てしまうという問題がある。また、フローサイトメータ
法に使用できるオーラミンO以外の上述の色素は、網状
赤血球を染色するために5分以上の染色時間が必要とな
る。特にチアゾールオレンジは60分以上の染色時間が
必要であることがLeeL. G. et al:Cytometry;7:508-517
(1986)に報告されているため、試料調製を全自動化す
ることが困難であり、省力化の観点から問題がある。よ
って、試料調製が人によって行われるため、その手技あ
るいは調製者によってデータがばらつく、特に網状赤血
球成熟指数では大きなデータの乖離が存在するという欠
点がある。
【0008】米国特許第5,360,739号には比較的安価な
光源としてHe/Neレーザーを、色素としてオキサジ
ン750を用いて散乱光強度と吸光度あるいは蛍光強度
を測定することによって網状赤血球を測定するフローサ
イトメータ法が開示されている。しかしながら後述する
異常リンパ球の問題については触れられていない。ま
た、本出願人においても、安価で小型の光源を用いるフ
ローサイトメータ法に使用できる網状赤血球及び網状赤
血球成熟指数を、正確かつ迅速に測定する試薬及び測定
方法について鋭意、検討がなされているが、白血球の
数、タイプにおいて、特に異常リンパ球が出現している
特殊な患者検体においては、リンパ球の蛍光強度が網状
赤血球の蛍光強度と同程度の大きさになるため、その弁
別が困難になるという問題を有する。このため、白血球
と網状赤血球の弁別が困難になる場合については、正確
かつ迅速に測定する試薬及び測定方法は、未だ確立され
ていないのが現状である。なお、白血球の数に関する異
常については、現在市販されているアルゴンレーザを光
源とするフローサイトメータ用網状赤血球測定キットレ
チック−カウント(Retic-COUNTTM)の取扱い説明書にお
いても示唆されており、このキットでは白血球数が異常
に増加した患者検体を測定する場合、他法による確認が
必要であることが記載されている。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、少なく
とも1つの網状赤血球を特異的に染色する色素と、少な
くとも1つの白血球を特異的に染色する色素とからなる
網状赤血球測定用試薬が提供される。また、上記試薬を
使用して網状赤血球を測定する方法が提供される。
【0010】
【発明の実施の形態】本発明は、上述したような特殊な
患者検体、特に、異常リンパ球が多数出現した患者検体
においても正確かつ迅速に網状赤血球を測定することが
できる試薬ならびに測定方法を実現するためのものであ
る。特に、本発明の試薬は、フローサイトメータ法に好
適に使用できる。つまり、異常リンパ球が多数出現した
患者検体において、本願発明の試薬を用いることによ
り、成熟赤血球や網状赤血球の蛍光強度を変化させるこ
となく、白血球の蛍光強度のみを強くすることができる
ため、網状赤血球を精度よく分類計数することができる
ものである。
【0011】本発明の試薬は、網状赤血球を特異的に染
色する色素と白血球を特異的に染色する色素とからな
る。網状赤血球を特異的に染色する色素とは、網状赤血
球を他の血球と識別可能な程度に染色することができる
色素を意味し、例えば、式(I)の化合物が挙げられ
る。
【0012】
【化5】
【0013】式中、R1は水素原子又は低級アルキル
基;R2及びR3は同一又は異なって、水素原子、低級ア
ルキル基又は低級アルコキシ基;R4は水素原子、アシ
ル基又は低級アルキル基;R5は水素原子、置換されて
もよい低級アルキル基;Zは硫黄原子、酸素原子又は低
級アルキル基が置換された炭素原子;nは1又は2;X
-はアニオンである。式(I)のR1 における低級アル
キル基とは、炭素数1〜6の直鎖又は分枝のアルキル基
を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、
ペンチル又はヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基と
エチル基が好ましい。
【0014】R2 及びR3 における低級アルキル基は上
記と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数1
〜6のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エト
キシ又はプロポキシ基が挙げられ、中でもメトキシ基と
エトキシ基が好ましく、オルト、メタ、パラ位のいずれ
に置換されていてもよい。なお、R2 及びR3 は、水素
原子であることがより好ましい。R4 におけるアシル基
とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ま
しく、例えば、アセチル基とプロピオニル基が挙げら
れ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル
基は上記と同様である。
【0015】R5 における低級アルキル基は上記と同様
であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、1
〜3個の水酸基又はハロゲン原子(例、フッ素、塩素、
臭素、ヨウ素)等で置換されていてもよい低級アルキル
基を示し、なかでも、ヒドロキシメチル基とヒドロキシ
エチル基が好ましい。Zにおける低級アルキル基とは上
記と同様であり、Zとしては硫黄原子であることが好ま
しい。
【0016】X- におけるアニオンは、ハロゲンイオン
(フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン)、ハロゲン化
ホウ素イオン(BF4 - 、BCl4 - 、BBr
4 - 等)、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、
フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、フェニル環に
ハロゲン原子あるいはハロアルキル基を置換基として有
するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられ
る。中でも、臭素イオンとBF4 -が好ましい。
【0017】式(I)の具体的な化合物の例を、以下に
示す。
【0018】
【化6】
【0019】上記式(I)の化合物のうち、n=1の化
合物は、例えば下記式
【0020】
【化7】
【0021】で表される化合物と、N,N−ジ置換ホル
ムアミジンとを反応させ、その生成物に下記式
【0022】
【化8】
【0023】で表されるキノリン誘導体を反応させ、次
いで、ホウフッ化ナトリウムと処理することにより合成
することができる。なお、この際のR2及びR3はオル
ト、メタ、パラ位のいずれに置換されていてもよいが、
いずれも水素原子であることがより好ましい。また、式
(I)の化合物のうち、n=2の化合物は、上記反応で
N,N−ジ置換ホルムアミジンを用いる代わりに、例え
ばマロンジアルデヒド ビス(フェニルイミン)塩を反
応させることにより合成することができる。
【0024】他に使用可能な色素の例としては、以下の
構造式、
【0025】
【化9】 R'1、R'2、R'3、R'4、R'5、R'6又はR'7は同一又
は異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基又はハ
ロゲン化低級アルキル基である]
【0026】が挙げられ、例えば、 (1)1,1’,3,3,3’,3’−ヘキサメチルイ
ンドジカルボシアニンアイオダイド(HIDCI,LA
MBDA PHYSIK社より入手可能)
【0027】
【化10】
【0028】(2)1,1’−ジエチル−2,4’−キ
ノカルボシアニン アイオダイド(NK−138、日本
感光色素研究所より入手可能)
【0029】
【化11】
【0030】(3)ピナシアノール クロライド
【0031】
【化12】
【0032】(4)1,3’−ジエチル−2,2’−キ
ノチアカルボシアニン アイオダイド
【0033】
【化13】
【0034】が挙げられる。さらに、網状赤血球検出用
色素として公知の色素、例えばオキサジン750も使用
することができる。本発明における試薬中の上記色素の
量は、網状赤血球を染色するのに十分な量であり、色素
の種類、試薬組成によって適宜調整することができる。
例えば0.1〜100mg/リットル程度、より好まし
くは0.3〜30mg/リットル程度、さらに好ましく
は0.3〜3mg/リットルである。
【0035】また、白血球を特異的に染色する色素とし
ては、例えば、式(II)及び式(III)の色素が挙げられ
る。
【0036】
【化14】
【0037】式中、R6及びR7は同一又は異なって、水
素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はフェニ
ル基;R8〜R11は同一又は異なって、水素原子又は低
級アルキル基;X-はアニオンである。
【0038】
【化15】
【0039】式中、R12及びR13は同一又は異なって、
水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、又は低
級アルキル基で置換されたアミノ基;R14及びR15は同
一又は異なって水素原子又は低級アルキル基;X-はア
ニオンである。なお、上記式(II)及び(III)における
低級アルキル及び低級アルコキシ基は上記と同様であ
る。またX-のアニオンとしては上記と同様であるが、
なかでも塩素イオンが好ましい。
【0040】本発明における試薬中の上記色素の量は、
白血球を染色するのに十分な濃度、かつ網状赤血球測定
用色素が網状赤血球を染色することを妨げることのない
濃度であり、色素の種類、試薬組成によって適宜調整す
ることができる。例えば0.001〜200mg/リッ
トル程度、より好ましくは0.003〜3mg/リット
ル程度、さらに好ましくは0.003〜0.03mg/
リットルである。
【0041】網状赤血球を特異的に染色する色素は、本
発明試薬の組成中では赤血球中へ速やかに浸透し、細胞
内のRNAを染色することができる。このため網状赤血
球を特異的に染色する色素のみの使用でも、網状赤血球
を分類計数することは可能である。しかし急性リンパ性
白血病等で、リンパ球系の異常細胞が多数出現した場合
等の特別な場合においては、リンパ球と未熟な網状赤血
球の蛍光強度がほぼ同等になるために、両者を弁別する
ことが困難になる。
【0042】一方、本発明による試薬において、白血球
を特異的に染色する色素は、上記の濃度で、白血球のみ
を特異的に染色することが可能である。白血球を特異的
に染色する色素は、色素の種類によって異なるが、おそ
らく白血球中の、網状赤血球に含まれない顆粒成分や核
を特異的に染色することができ、それにより白血球蛍光
強度を強くすると考えられる。この結果、網状赤血球と
白血球の蛍光強度に明瞭な差が生じ、すなわち、白血球
の蛍光強度が網状赤血球の蛍光強度に比べて強くなる一
方、網状赤血球の蛍光強度は変化しないため、上記のよ
うな場合でも両者の弁別が可能となる。
【0043】なお、ここでは、赤色波長で励起可能な色
素の例を示したが、本発明ではこれらに制限されず、青
色波長のような他の波長で励起可能な色素をくみあわせ
て用いることもでき、その場合でも、網状赤血球と白血
球との弁別向上を実現することができる。本発明の試薬
中には、さらに、赤血球の非特異染色を抑制するための
多価アニオン、緩衝剤、浸透圧補償剤及び/又は染色促
進剤を含有させることができる。
【0044】本発明者らは、試薬組成の検討において、
一般に使用されている染色液中の浸透圧補償剤の主成分
がNaCl(特にCl- )の場合、赤血球の非特異蛍光が大き
く、かつ、網状赤血球の特異蛍光が小さく、結果として
赤血球と網状赤血球との弁別が困難になることを見い出
した。また、一方で、染色液中のCl- を多価アニオンに
置換した場合には、著しく成熟赤血球の非特異蛍光が抑
制され、赤血球と網状赤血球との弁別が容易になること
を見い出した。従って、本発明の試薬において、多価ア
ニオンを含有させるのが好ましい。多価アニオンとして
は、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン及び多価カ
ルボン酸イオンが特に好適であり、これらを供給し得る
化合物としては、たとえば、クエン酸、硫酸、リン酸、
EDTAやこれらのアルカリ金属塩等が挙げられる。な
お、多価アニオンは異なる種類のものをくみあわせて使
用してもよい。多価アニオンの含有濃度は、試薬中の全
アニオン成分に占める割合が50%以上、好ましくは7
0%以上が好適である。
【0045】さらに本発明の試薬には、pHを一定に保
つための緩衝剤を含有することができる。緩衝剤はpH
を一定に保ことにより、網状赤血球の安定した染色結果
を保つために使用され、数mM〜100mM程度の濃度
で使用される。緩衝剤の種類は、通常使用されるもので
あれば特に限定されるものではないが、例えば、カルボ
ン酸塩類、リン酸塩、グッドの緩衝剤、タウリン、トリ
エタノールアミン等を、所望のpHに応じて適宜使用す
ることができる。本発明における試薬の好適なpHは用
いる色素によって異なるが、6.0〜11.0の範囲、
好ましくは7.0〜10.0、より好ましくは8.0〜
9.5の範囲である。pHが上記の範囲より低すぎる場
合は、赤血球が脆弱化し、溶血しやすくなるため、正確
な網状赤血球の測定が困難になる。さらに、pHが高す
ぎる場合、赤血球膜上の酸性官能基が解離するため、カ
チオン性である色素と結合し易くなり、赤血球の非特異
蛍光が増加する。これにより成熟赤血球と網状赤血球の
弁別が困難になる傾向があり好ましくない。なお、上述
の多価アニオンが、pHを好適なpH範囲に調整する緩
衝能を持つ場合には、緩衝剤と兼用することが可能であ
る。
【0046】また、本発明の試薬には浸透圧補償剤を含
有することができる。浸透圧は赤血球の低張溶血を防止
するために生理学的浸透圧に調整されていることが望ま
しく、通常150〜600mOsm/kgの範囲に調整され
る。浸透圧補償剤は特に制限されるものではないが、例
えばプロピオン酸等のアルカリ金属塩、グルコース、マ
ンノース等の糖類が好適である。また試薬中の全アニオ
ン成分に占める割合が50%未満であるならば、NaC
lのようなアルカリ金属ハロゲン化物やアルカリ土類金
属ハロゲン化物も使用できる。なお浸透圧補償剤は、異
なる種類のものをくみあわせて用いてもよい。また、上
述の多価アニオン及び緩衝剤で浸透圧を適当な範囲に調
整することができる場合には、浸透圧補償剤を含有する
必要はない。
【0047】本発明の試薬においては、さらに染色促進
剤として式(IV)のカチオン性界面活性剤を含有するこ
とができる。
【0048】
【化16】 式中、R16は炭素数8〜12のアルキル基;R17、R18
及びR19は同一又は異なって、低級アルキル基;Y-
ハロゲンイオンである。式中、炭素数8〜12のアルキ
ル基としては、直鎖又は分枝のアルキル基が包含され、
例えば、オクチル基、デシル基又はラウリル基が挙げら
れる。なかでもオクチル基とデシル基が好ましい。
【0049】また、低級アルキル基としては、上記と同
様である。Y-としては塩素又は臭素イオンが好まし
い。カチオン性界面活性剤の具体例としては、たとえ
ば、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド(OT
AB)、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド(D
TAB)、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド
(LTAC)、セチルトリメチルアンモニウムクロライ
ド(CTAC)及びミリスチルトリメチルアンモニウム
ブロマイド(MTAB)等が挙げられる。
【0050】染色促進剤であるカチオン性界面活性剤の
濃度は、総炭素数が増えるごとに少量で有効になる。従
って、総炭素数等に応じて、その濃度を適宜調整して使
用することができる。例えば、OTABでは300〜2
0000mg/リットル,DTABでは500〜300
0mg/リットル,LTACでは50〜250mg/リ
ットルが好適である。なお、染色促進剤は異なる種類の
ものをくみあわせて用いてもよい。カチオン性界面活性
剤の作用機序は明確ではないが、赤血球細胞膜と何らか
の相互作用を起こすことによって、色素透過性を亢進す
るものと考えられる。そのため染色促進剤を多量に使用
すると赤血球に傷害を与え、場合によっては溶血を引き
起こすため好ましくない。
【0051】さらにカチオン性界面活性剤は赤血球細胞
を球状化する作用があるため、赤血球集団の前方散乱光
強度分布を収束させる。この結果、血小板と赤血球系細
胞との弁別が容易になる。さらに小球性赤血球症、例え
ば鉄欠乏性貧血等の治療中には、血液中に疾患由来の小
球性赤血球と正球性赤血球が混在するが、本発明の試薬
では前方散乱光強度によりこの両者の弁別も可能とな
る。また少量出現する楕円赤血球も同様に弁別すること
ができる。このようにカチオン性界面活性剤の赤血球球
状化作用により、網状赤血球を測定すると同時に、小球
性赤血球や楕円赤血球等の赤血球の形態異常を検出する
ことができる。
【0052】本発明の試薬には、上記構成成分以外に
も、例えば、2−ピリジルチオ−1−オキシドナトリウ
ムあるいはβ−フェネチルアルコール等の防腐剤を含有
することもできる。さらに本発明の試薬で使用する色素
が、水溶液中で不安定な場合には、色素を適当な水溶性
の非水溶媒、例えばエタノール、ジメチルスルホキシ
ド、エチレングリコール等に溶解して保存し、使用時に
他の成分を含有する水溶液と混合して使用することがで
きる。各色素は同一の非水溶媒に溶解することも可能で
あり、また別の非水溶媒に溶解することも可能である。
【0053】本発明の試薬は、フローサイトメータを使
用することにより網状赤血球を測定する場合に特に有効
である。まず、工程において、本発明の網状赤血球測
定試薬と血液学的試料を混合して測定用試料を調製す
る。血液学的試料とは、測定対象となる血液成分を含有
する試料の何れであってもよい。例えば抗凝固剤処理を
行った末梢血液あるいは骨髄液である。測定試料の調製
は、網状赤血球測定用試薬と血液学的試料を100:1
〜1000:1の比で混合し反応させることが好まし
い。この時の反応温度は25〜50℃程度が好適であ
り、さらには35〜45℃が好適である。また好適な反
応時間は、試薬中に含有される色素により異なるが、1
0秒〜5分程度が好ましく、より好ましくは20秒〜2
分程度であり、さらに好ましくは20〜60秒程度であ
る。
【0054】工程において、工程で得られた測定用
試料を赤色波長の光源を有するフローサイトメータの流
体系に導入する。赤色波長の光源としては、使用する色
素(蛍光色素)の励起波長付近の光、例えば600〜6
80nm程度の波長の光を発する光源であれば特に限定
されるものではない。この例としてHe/Neレーザ、
赤色波長領域の半導体レーザ等があげられる。ここで使
用する赤色波長の光源を有するフローサイトメータの光
学部分を図1に示す。半導体レーザ1の前方に集光レン
ズ系2を介してフローセルが配置しており、フローセル
の前方にビームストッパー4を介して前方散乱光用受光
レンズ5及びフォトダイオード6が配置している。ま
た、フローセル3の側方には側方蛍光用の受光レンズ7
を介してバンドパスフィルタ8及び光電子増幅管9が配
置されている。なお、流体部、データ処理部等の他の装
置構成部は、公知の構成等を改良して用いることができ
る。
【0055】工程において、シースフロー中を流れる
細胞に上述した赤色波長の光を照射し、工程において
細胞から発する散乱光と蛍光を測定する。この場合の散
乱光は、前方散乱光又は側方散乱光のいずれでもよく、
さらに前方散乱光は前方低角散乱光(1〜5°)あるい
は前方高角散乱光(6〜20°)のいずれでもよい。散
乱光は細胞の大きさ情報を反映するパラメータである
が、他に細胞の大きさ情報を測定する方法として電気抵
抗法が挙げられる。場合によっては散乱光の測定の代わ
りに電気抵抗法による電気抵抗信号を測定することも可
能である。
【0056】工程において、散乱光強度あるいは散乱
光強度と蛍光強度とのスキャッタグラムにより血小板と
その他の細胞とを弁別し、工程において、蛍光強度あ
るいは蛍光強度と散乱光強度とのスキャッタグラムによ
って赤血球、網状赤血球及び白血球を弁別し、工程に
おいて赤血球及び網状赤血球を分類計数して、それらの
細胞数及び細胞比率を算出する。
【0057】さらに網状赤血球をその成熟度別に、具体
的には蛍光強度の違いによって分類計数し、全網状赤血
球に占める割合を算出することも可能である。
【0058】
【実施例】
実施例1 以下の組成の網状赤血球測定用試薬を調製した。 網状赤血球を特異的に染色する色素A 3mg 白血球を特異的に染色する色素B 0.03mg トリシン(緩衝剤) 1.79g クエン酸3ナトリウム2水和物(多価アニオン) 29.4g LTAC(カチオン性界面活性剤、染色促進剤) 150mg 精製水 1リットル (水酸化ナトリウムでpH9.0に調製)
【0059】
【化17】
【0060】
【化18】
【0061】試薬2mlに抗凝固剤処理を行った健常人
血液10μlを加え、40℃で120秒間インキュベー
トした測定用試料を、図1に示した光学部を用いて前方
散乱光強度及び蛍光強度を測定した。図2に示したスキ
ャッタグラムにおいて網状赤血球比率は2.0%であっ
た。なお対照法として東亞医用電子製R−2000で測
定したところ2.0%であった。
【0062】同様にリンパ系の異常細胞が出現した血液
を測定したところ、図3のスキャッタグラムが得られ
た。このスキャッタグラムでは、網状赤血球の集団と白
血球の集団を明瞭に弁別することができた。
【0063】実施例2 以下の組成の網状赤血球測定用試薬を調製した。
【0064】 網状赤血球を特異的に染色する色素A 3mg 白血球を特異的に染色する色素C 30mg トリシン 1.79g クエン酸3ナトリウム2水和物 29.4g LTAC 150mg 精製水 1リットル (水酸化ナトリウムでpH9.0に調製)
【0065】
【化19】
【0066】試薬2mlに抗凝固剤処理を行った健常人血
液10μlを加え、40℃で120秒間インキュベート
した測定用試料を、図1に示した光学部を用いて前方散
乱光強度及び蛍光強度を測定した。図4に示したスキャ
ッタグラムにおいて網状赤血球比率は1.8%であっ
た。なお対照法として東亞医用電子製R−2000で測
定したところ1.7%であった。
【0067】比較例1 以下の組成の網状赤血球測定用試薬を調製した。
【0068】 網状赤血球を特異的に染色する色素A 3mg トリシン 1.79g クエン酸3ナトリウム2水和物 29.4g LTAC 150ml 精製水 1リットル (水酸化ナトリウムでpH9.0に調製) 試薬2mlに抗凝固処理を行った健常人血液10μlを
加え、40℃で120秒間インキュベートした測定用試
料を、図1に示した光学部を用いて前方散乱光強度及び
蛍光強度を測定した。図5に示したスキャッタグラムに
おいて網状赤血球比率は2.1%であった。なお対照法
として東亞医用電子製R−2000で測定したところ
2.0%であった。
【0069】同様にリンパ系の異常細胞が出現した血液
を測定したところ図6のスキャッタグラムが得られた。
このスキャッタグラムでは、網状赤血球の集団と白血球
の集団を明瞭に弁別することはできなかった。
【0070】
【発明の効果】本発明の試薬及び測定方法によれば、安
価で小型の光源を用いるフローサイトメータ法を用い
て、異常リンパ球等が出現している特殊検体においても
網状赤血球が正確かつ迅速に測定することができる。つ
まり、本発明の試薬及び測定方法によれば、異常リンパ
球等が出現した患者検体において、成熟赤血球や網状赤
血球の蛍光強度を変化させることなく、白血球の蛍光強
度のみを強くすることができるため、網状赤血球を精度
よく分類計数することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の測定方法において使用する赤色波長の
光源を有するフローサイトメータの光学部分を示す概略
図である。
【図2】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素A
と白血球を特異的に染色する色素Bとを含む網状赤血球
測定用試薬を用いて、健常人の末梢血液試料の前方散乱
光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャッタグラム
である。
【図3】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素A
と白血球を特異的に染色する色素Bを含む網状赤血球測
定用試薬を用いて、異常リンパ球の出現している患者の
末梢血液試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した
場合のスキャッタグラムである。
【図4】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素A
と白血球を特異的に染色する色素Cを含む網状赤血球測
定用試薬を用いて、健常人の末梢血液試料の前方散乱光
強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャッタグラムで
ある。
【図5】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素A
のみを含む網状赤血球測定用試薬を用いて、健常人の末
梢血液試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場
合のスキャッタグラムである。
【図6】網状赤血球を特異的に染色する色素Aのみを含
む網状赤血球測定用試薬を用いて、異常リンパ球の出現
している患者の末梢血液試料の前方散乱光強度及び蛍光
強度を測定した場合のスキャッタグラムである。
【符号の説明】
1 半導体レーザ 2 集光レンズ系 3 フローセル 4 ビームストッパー 5 前方散乱光用受光レンズ 6 フォトダイオード 7 側方蛍光用受光レンズ 8 バンドパスフィルタ 9 光電子増倍管
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂田 孝 神戸市中央区港島中町7丁目2番地の1 東亞医用電子株式会社内

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 少なくとも1つの網状赤血球を特異的に
    染色する色素と、 少なくとも1つの白血球を特異的に染色する色素とから
    なる網状赤血球測定用試薬。
  2. 【請求項2】 網状赤血球を特異的に染色する色素が、
    式(I) 【化1】 (式中、R1は水素原子又は低級アルキル基;R2及びR
    3は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基又は
    低級アルコキシ基;R4は水素原子、アシル基又は低級
    アルキル基;R5は水素原子、置換されてもよい低級ア
    ルキル基;Zは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基
    が置換された炭素原子;nは1又は2;X -はアニオン
    である)である請求項1記載の網状赤血球測定用試薬。
  3. 【請求項3】 白血球を特異的に染色する色素が、式
    (II) 【化2】 (式中、R6及びR7は同一又は異なって、水素原子、低
    級アルキル基、低級アルコキシ基又はフェニル基;R8
    〜R11は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル
    基;X-はアニオンである)又は式(III) 【化3】 (式中、R12及びR13は同一又は異なって、水素原子、
    低級アルキル基、アルコキシ基及び低級アルキル基で置
    換されたアミノ基;R14及びR15は同一又は異なって、
    水素原子又は低級アルキル基;X-はアニオンである)
    で示される請求項1又は2のいずれかに記載の網状赤血
    球測定用試薬。
  4. 【請求項4】 さらに、赤血球の非特異蛍光を抑制する
    ための多価アニオンを含有する請求項1〜3のいずれか
    に記載の網状赤血球測定用試薬。
  5. 【請求項5】 さらに、pHを一定に保つための緩衝剤
    を含有する請求項1〜4のいずれかに記載の網状赤血球
    測定用試薬。
  6. 【請求項6】 さらに、浸透圧を生理学的浸透圧にする
    ための浸透圧補償剤を含有する請求項1〜5のいずれか
    に記載の網状赤血球測定用試薬。
  7. 【請求項7】 さらに、染色促進剤を含む請求項1〜6
    のいずれかに記載の網状赤血球測定用試薬。
  8. 【請求項8】 染色促進剤がカチオン性界面活性剤であ
    る請求項7記載の網状赤血球測定用試薬。
  9. 【請求項9】 カチオン性界面活性剤が、式(IV) 【化4】 (式中、R16は炭素数8〜12のアルキル基;R17、R
    18及びR19は同一又は異なって、低級アルキル基;Y-
    はハロゲンイオンである)で示される請求項8記載の網
    状赤血球測定用試薬。
  10. 【請求項10】 カチオン性界面活性剤が、ラウリルト
    リメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルア
    ンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウ
    ムブロマイドのうち少なくとも1つである請求項9記載
    の網状赤血球測定用試薬。
  11. 【請求項11】 請求項1〜10に記載のいずれかの試
    薬を使用して網状赤血球を測定する方法。
  12. 【請求項12】 フローサイトメータを使用する請求項
    11に記載の方法。
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JP2008134062A (ja) * 2006-11-27 2008-06-12 Sysmex Corp 血液学的試料の測定方法および測定装置

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