JPH1026620A - 網状赤血球測定用試薬及び測定方法 - Google Patents

網状赤血球測定用試薬及び測定方法

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JPH1026620A
JPH1026620A JP8848197A JP8848197A JPH1026620A JP H1026620 A JPH1026620 A JP H1026620A JP 8848197 A JP8848197 A JP 8848197A JP 8848197 A JP8848197 A JP 8848197A JP H1026620 A JPH1026620 A JP H1026620A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 少なくとも１つの網状赤血球を特異的に
染色する色素と、少なくとも１つの白血球を特異的に染
色する色素とからなる網状赤血球測定用試薬。 【効果】 安価で小型の光源を用いるフローサイトメー
タ法を用いて、異常リンパ球等が出現している特殊検体
においても網状赤血球が正確かつ迅速に測定することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、網状赤血球測定用
試薬及び測定方法に関し、より詳細には、臨床検査分野
において、血液中の網状赤血球及び網状赤血球成熟指数
を測定するための試薬及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】網状赤
血球は、骨髄中の赤芽球系細胞が脱核し、末梢血液中に
放出された直後の若い赤血球である。網状赤血球は、細
胞成熟過程の名残として、成熟赤血球には含まれていな
い少量のＲＮＡあるいはリボソーム、ミトコンドリア等
の細胞小器官をその細胞内に有していることがその特徴
として挙げられる。
【０００３】臨床検査分野において、網状赤血球を分類
計数することは、患者の骨髄内の造血状態を把握する上
で極めて重要である。骨髄造血が正常である健常人にお
いては、網状赤血球数は全赤血球の０．５〜３．０％を
占めているのに対して、骨髄造血に異常をきたしている
状態、例えば骨髄造血が抑制された状態では網状赤血球
数は減少し、骨髄造血が亢進した状態では増加する。具
体的には、再生不良性貧血、悪性腫瘍の化学療法時等で
は減少し、溶血性貧血等では増加する。
【０００４】従来の網状赤血球を計数する方法として、
血液試料とニューメチレンブルー（ＮＭＢ）、ブリリア
ントクレシルブルー（ＢＣＢ）等の塩基性色素を含有す
る染色液とを混合させることによって、網状赤血球中に
含まれる上記残存物質を析出、染色し、個々の細胞を顕
微鏡で観察し、成熟赤血球と網状赤血球とを弁別する用
手法がある。
【０００５】しかしながら、用手法は試料作製操作が煩
雑であり、検査技師間で細胞判別の個人差が生ずること
や細胞計数数が少ないゆえの統計学的誤差が大きいこと
が問題とされる。これらの問題を解決するために、上記
の塩基性色素のかわりに、蛍光性の塩基性色素で網状赤
血球を蛍光染色し、フローサイトメータで細胞の前方散
乱光強度と蛍光強度とを測定し、主に蛍光強度の差で成
熟赤血球と網状赤血球とを弁別、分類計数する方法（フ
ローサイトメータ法）が行われている。この方法に用い
られる色素としては、アクリジンオレンジ、チアゾール
オレンジ、オーラミンＯ等がよく知られている。
【０００６】またこの方法は、網状赤血球の蛍光強度に
よって、網状赤血球をその成熟度別に分類計数し、網状
赤血球成熟指数を算出することも可能であり、蛍光強度
の強い網状赤血球の比率、すなわち最も若い網状赤血球
の比率が骨髄造血能の回復の指標として有用であること
が知られていることから、その利用が期待されている。
【０００７】しかしその一方で、蛍光色素を励起するた
めの光源として、非常に高価かつ大型であるアルゴンレ
ーザーを必要とするため、装置自身も高価で大型になっ
てしまうという問題がある。また、フローサイトメータ
法に使用できるオーラミンＯ以外の上述の色素は、網状
赤血球を染色するために５分以上の染色時間が必要とな
る。特にチアゾールオレンジは６０分以上の染色時間が
必要であることがLeeL. G. et al:Cytometry;7:508-517
(1986)に報告されているため、試料調製を全自動化す
ることが困難であり、省力化の観点から問題がある。よ
って、試料調製が人によって行われるため、その手技あ
るいは調製者によってデータがばらつく、特に網状赤血
球成熟指数では大きなデータの乖離が存在するという欠
点がある。
【０００８】米国特許第5,360,739号には比較的安価な
光源としてＨｅ／Ｎｅレーザーを、色素としてオキサジ
ン７５０を用いて散乱光強度と吸光度あるいは蛍光強度
を測定することによって網状赤血球を測定するフローサ
イトメータ法が開示されている。しかしながら後述する
異常リンパ球の問題については触れられていない。ま
た、本出願人においても、安価で小型の光源を用いるフ
ローサイトメータ法に使用できる網状赤血球及び網状赤
血球成熟指数を、正確かつ迅速に測定する試薬及び測定
方法について鋭意、検討がなされているが、白血球の
数、タイプにおいて、特に異常リンパ球が出現している
特殊な患者検体においては、リンパ球の蛍光強度が網状
赤血球の蛍光強度と同程度の大きさになるため、その弁
別が困難になるという問題を有する。このため、白血球
と網状赤血球の弁別が困難になる場合については、正確
かつ迅速に測定する試薬及び測定方法は、未だ確立され
ていないのが現状である。なお、白血球の数に関する異
常については、現在市販されているアルゴンレーザを光
源とするフローサイトメータ用網状赤血球測定キットレ
チック−カウント(Retic-COUNTTM)の取扱い説明書にお
いても示唆されており、このキットでは白血球数が異常
に増加した患者検体を測定する場合、他法による確認が
必要であることが記載されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、少なく
とも１つの網状赤血球を特異的に染色する色素と、少な
くとも１つの白血球を特異的に染色する色素とからなる
網状赤血球測定用試薬が提供される。また、上記試薬を
使用して網状赤血球を測定する方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、上述したような特殊な
患者検体、特に、異常リンパ球が多数出現した患者検体
においても正確かつ迅速に網状赤血球を測定することが
できる試薬ならびに測定方法を実現するためのものであ
る。特に、本発明の試薬は、フローサイトメータ法に好
適に使用できる。つまり、異常リンパ球が多数出現した
患者検体において、本願発明の試薬を用いることによ
り、成熟赤血球や網状赤血球の蛍光強度を変化させるこ
となく、白血球の蛍光強度のみを強くすることができる
ため、網状赤血球を精度よく分類計数することができる
ものである。
【００１１】本発明の試薬は、網状赤血球を特異的に染
色する色素と白血球を特異的に染色する色素とからな
る。網状赤血球を特異的に染色する色素とは、網状赤血
球を他の血球と識別可能な程度に染色することができる
色素を意味し、例えば、式（Ｉ）の化合物が挙げられ
る。
【００１２】
【化５】
【００１３】式中、Ｒ1は水素原子又は低級アルキル
基；Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、水素原子、低級ア
ルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシ
ル基又は低級アルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されて
もよい低級アルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低
級アルキル基が置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ
-はアニオンである。式（Ｉ）のＲ1 における低級アル
キル基とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝のアルキル基
を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチ
ル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、
ペンチル又はヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基と
エチル基が好ましい。
【００１４】Ｒ2 及びＲ3 における低級アルキル基は上
記と同様であり、低級アルコキシ基としては、炭素数１
〜６のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エト
キシ又はプロポキシ基が挙げられ、中でもメトキシ基と
エトキシ基が好ましく、オルト、メタ、パラ位のいずれ
に置換されていてもよい。なお、Ｒ2 及びＲ3 は、水素
原子であることがより好ましい。Ｒ4 におけるアシル基
とは、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ま
しく、例えば、アセチル基とプロピオニル基が挙げら
れ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル
基は上記と同様である。
【００１５】Ｒ5 における低級アルキル基は上記と同様
であり、置換されていてもよい低級アルキル基とは、１
〜３個の水酸基又はハロゲン原子（例、フッ素、塩素、
臭素、ヨウ素）等で置換されていてもよい低級アルキル
基を示し、なかでも、ヒドロキシメチル基とヒドロキシ
エチル基が好ましい。Ｚにおける低級アルキル基とは上
記と同様であり、Ｚとしては硫黄原子であることが好ま
しい。
【００１６】Ｘ- におけるアニオンは、ハロゲンイオン
（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化
ホウ素イオン（ＢＦ4 - 、ＢＣｌ4 - 、ＢＢｒ
4 - 等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、
フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、フェニル環に
ハロゲン原子あるいはハロアルキル基を置換基として有
するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられ
る。中でも、臭素イオンとＢＦ4 -が好ましい。
【００１７】式（Ｉ）の具体的な化合物の例を、以下に
示す。
【００１８】
【化６】
【００１９】上記式（Ｉ）の化合物のうち、ｎ＝１の化
合物は、例えば下記式
【００２０】
【化７】
【００２１】で表される化合物と、Ｎ，Ｎ−ジ置換ホル
ムアミジンとを反応させ、その生成物に下記式
【００２２】
【化８】
【００２３】で表されるキノリン誘導体を反応させ、次
いで、ホウフッ化ナトリウムと処理することにより合成
することができる。なお、この際のＲ2及びＲ3はオル
ト、メタ、パラ位のいずれに置換されていてもよいが、
いずれも水素原子であることがより好ましい。また、式
（Ｉ）の化合物のうち、ｎ＝２の化合物は、上記反応で
Ｎ，Ｎ−ジ置換ホルムアミジンを用いる代わりに、例え
ばマロンジアルデヒド ビス（フェニルイミン）塩を反
応させることにより合成することができる。
【００２４】他に使用可能な色素の例としては、以下の
構造式、
【００２５】
【化９】 Ｒ'1、Ｒ'2、Ｒ'3、Ｒ'4、Ｒ'5、Ｒ'6又はＲ'7は同一又
は異なって、低級アルキル基、低級アルケニル基又はハ
ロゲン化低級アルキル基である］
【００２６】が挙げられ、例えば、 （１）１，１’，３，３，３’，３’−ヘキサメチルイ
ンドジカルボシアニンアイオダイド（ＨＩＤＣＩ，ＬＡ
ＭＢＤＡ ＰＨＹＳＩＫ社より入手可能）
【００２７】
【化１０】
【００２８】（２）１，１’−ジエチル−２，４’−キ
ノカルボシアニン アイオダイド（ＮＫ−１３８、日本
感光色素研究所より入手可能）
【００２９】
【化１１】
【００３０】（３）ピナシアノール クロライド
【００３１】
【化１２】
【００３２】（４）１，３’−ジエチル−２，２’−キ
ノチアカルボシアニン アイオダイド
【００３３】
【化１３】
【００３４】が挙げられる。さらに、網状赤血球検出用
色素として公知の色素、例えばオキサジン７５０も使用
することができる。本発明における試薬中の上記色素の
量は、網状赤血球を染色するのに十分な量であり、色素
の種類、試薬組成によって適宜調整することができる。
例えば０．１〜１００ｍｇ／リットル程度、より好まし
くは０．３〜３０ｍｇ／リットル程度、さらに好ましく
は０．３〜３ｍｇ／リットルである。
【００３５】また、白血球を特異的に染色する色素とし
ては、例えば、式（II）及び式（III)の色素が挙げられ
る。
【００３６】
【化１４】
【００３７】式中、Ｒ6及びＲ7は同一又は異なって、水
素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はフェニ
ル基；Ｒ8〜Ｒ11は同一又は異なって、水素原子又は低
級アルキル基；Ｘ-はアニオンである。
【００３８】
【化１５】
【００３９】式中、Ｒ12及びＲ13は同一又は異なって、
水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、又は低
級アルキル基で置換されたアミノ基；Ｒ14及びＲ15は同
一又は異なって水素原子又は低級アルキル基；Ｘ-はア
ニオンである。なお、上記式（II）及び（III)における
低級アルキル及び低級アルコキシ基は上記と同様であ
る。またＸ-のアニオンとしては上記と同様であるが、
なかでも塩素イオンが好ましい。
【００４０】本発明における試薬中の上記色素の量は、
白血球を染色するのに十分な濃度、かつ網状赤血球測定
用色素が網状赤血球を染色することを妨げることのない
濃度であり、色素の種類、試薬組成によって適宜調整す
ることができる。例えば０．００１〜２００ｍｇ／リッ
トル程度、より好ましくは０．００３〜３ｍｇ／リット
ル程度、さらに好ましくは０．００３〜０．０３ｍｇ／
リットルである。
【００４１】網状赤血球を特異的に染色する色素は、本
発明試薬の組成中では赤血球中へ速やかに浸透し、細胞
内のＲＮＡを染色することができる。このため網状赤血
球を特異的に染色する色素のみの使用でも、網状赤血球
を分類計数することは可能である。しかし急性リンパ性
白血病等で、リンパ球系の異常細胞が多数出現した場合
等の特別な場合においては、リンパ球と未熟な網状赤血
球の蛍光強度がほぼ同等になるために、両者を弁別する
ことが困難になる。
【００４２】一方、本発明による試薬において、白血球
を特異的に染色する色素は、上記の濃度で、白血球のみ
を特異的に染色することが可能である。白血球を特異的
に染色する色素は、色素の種類によって異なるが、おそ
らく白血球中の、網状赤血球に含まれない顆粒成分や核
を特異的に染色することができ、それにより白血球蛍光
強度を強くすると考えられる。この結果、網状赤血球と
白血球の蛍光強度に明瞭な差が生じ、すなわち、白血球
の蛍光強度が網状赤血球の蛍光強度に比べて強くなる一
方、網状赤血球の蛍光強度は変化しないため、上記のよ
うな場合でも両者の弁別が可能となる。
【００４３】なお、ここでは、赤色波長で励起可能な色
素の例を示したが、本発明ではこれらに制限されず、青
色波長のような他の波長で励起可能な色素をくみあわせ
て用いることもでき、その場合でも、網状赤血球と白血
球との弁別向上を実現することができる。本発明の試薬
中には、さらに、赤血球の非特異染色を抑制するための
多価アニオン、緩衝剤、浸透圧補償剤及び／又は染色促
進剤を含有させることができる。
【００４４】本発明者らは、試薬組成の検討において、
一般に使用されている染色液中の浸透圧補償剤の主成分
がNaCl（特にCl- ）の場合、赤血球の非特異蛍光が大き
く、かつ、網状赤血球の特異蛍光が小さく、結果として
赤血球と網状赤血球との弁別が困難になることを見い出
した。また、一方で、染色液中のCl- を多価アニオンに
置換した場合には、著しく成熟赤血球の非特異蛍光が抑
制され、赤血球と網状赤血球との弁別が容易になること
を見い出した。従って、本発明の試薬において、多価ア
ニオンを含有させるのが好ましい。多価アニオンとして
は、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン及び多価カ
ルボン酸イオンが特に好適であり、これらを供給し得る
化合物としては、たとえば、クエン酸、硫酸、リン酸、
ＥＤＴＡやこれらのアルカリ金属塩等が挙げられる。な
お、多価アニオンは異なる種類のものをくみあわせて使
用してもよい。多価アニオンの含有濃度は、試薬中の全
アニオン成分に占める割合が５０％以上、好ましくは７
０％以上が好適である。
【００４５】さらに本発明の試薬には、ｐＨを一定に保
つための緩衝剤を含有することができる。緩衝剤はｐＨ
を一定に保ことにより、網状赤血球の安定した染色結果
を保つために使用され、数ｍＭ〜１００ｍＭ程度の濃度
で使用される。緩衝剤の種類は、通常使用されるもので
あれば特に限定されるものではないが、例えば、カルボ
ン酸塩類、リン酸塩、グッドの緩衝剤、タウリン、トリ
エタノールアミン等を、所望のｐＨに応じて適宜使用す
ることができる。本発明における試薬の好適なｐＨは用
いる色素によって異なるが、６．０〜１１．０の範囲、
好ましくは７．０〜１０．０、より好ましくは８．０〜
９．５の範囲である。ｐＨが上記の範囲より低すぎる場
合は、赤血球が脆弱化し、溶血しやすくなるため、正確
な網状赤血球の測定が困難になる。さらに、ｐＨが高す
ぎる場合、赤血球膜上の酸性官能基が解離するため、カ
チオン性である色素と結合し易くなり、赤血球の非特異
蛍光が増加する。これにより成熟赤血球と網状赤血球の
弁別が困難になる傾向があり好ましくない。なお、上述
の多価アニオンが、ｐＨを好適なｐＨ範囲に調整する緩
衝能を持つ場合には、緩衝剤と兼用することが可能であ
る。
【００４６】また、本発明の試薬には浸透圧補償剤を含
有することができる。浸透圧は赤血球の低張溶血を防止
するために生理学的浸透圧に調整されていることが望ま
しく、通常１５０〜６００mOsm/kgの範囲に調整され
る。浸透圧補償剤は特に制限されるものではないが、例
えばプロピオン酸等のアルカリ金属塩、グルコース、マ
ンノース等の糖類が好適である。また試薬中の全アニオ
ン成分に占める割合が５０％未満であるならば、ＮａＣ
ｌのようなアルカリ金属ハロゲン化物やアルカリ土類金
属ハロゲン化物も使用できる。なお浸透圧補償剤は、異
なる種類のものをくみあわせて用いてもよい。また、上
述の多価アニオン及び緩衝剤で浸透圧を適当な範囲に調
整することができる場合には、浸透圧補償剤を含有する
必要はない。
【００４７】本発明の試薬においては、さらに染色促進
剤として式（IV）のカチオン性界面活性剤を含有するこ
とができる。
【００４８】
【化１６】 式中、Ｒ16は炭素数８〜１２のアルキル基；Ｒ17、Ｒ18
及びＲ19は同一又は異なって、低級アルキル基；Ｙ-は
ハロゲンイオンである。式中、炭素数８〜１２のアルキ
ル基としては、直鎖又は分枝のアルキル基が包含され、
例えば、オクチル基、デシル基又はラウリル基が挙げら
れる。なかでもオクチル基とデシル基が好ましい。
【００４９】また、低級アルキル基としては、上記と同
様である。Ｙ-としては塩素又は臭素イオンが好まし
い。カチオン性界面活性剤の具体例としては、たとえ
ば、オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＯＴ
ＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｄ
ＴＡＢ）、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド
（ＬＴＡＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロライ
ド（ＣＴＡＣ）及びミリスチルトリメチルアンモニウム
ブロマイド（ＭＴＡＢ）等が挙げられる。
【００５０】染色促進剤であるカチオン性界面活性剤の
濃度は、総炭素数が増えるごとに少量で有効になる。従
って、総炭素数等に応じて、その濃度を適宜調整して使
用することができる。例えば、ＯＴＡＢでは３００〜２
００００ｍｇ／リットル，ＤＴＡＢでは５００〜３００
０ｍｇ／リットル，ＬＴＡＣでは５０〜２５０ｍｇ／リ
ットルが好適である。なお、染色促進剤は異なる種類の
ものをくみあわせて用いてもよい。カチオン性界面活性
剤の作用機序は明確ではないが、赤血球細胞膜と何らか
の相互作用を起こすことによって、色素透過性を亢進す
るものと考えられる。そのため染色促進剤を多量に使用
すると赤血球に傷害を与え、場合によっては溶血を引き
起こすため好ましくない。
【００５１】さらにカチオン性界面活性剤は赤血球細胞
を球状化する作用があるため、赤血球集団の前方散乱光
強度分布を収束させる。この結果、血小板と赤血球系細
胞との弁別が容易になる。さらに小球性赤血球症、例え
ば鉄欠乏性貧血等の治療中には、血液中に疾患由来の小
球性赤血球と正球性赤血球が混在するが、本発明の試薬
では前方散乱光強度によりこの両者の弁別も可能とな
る。また少量出現する楕円赤血球も同様に弁別すること
ができる。このようにカチオン性界面活性剤の赤血球球
状化作用により、網状赤血球を測定すると同時に、小球
性赤血球や楕円赤血球等の赤血球の形態異常を検出する
ことができる。
【００５２】本発明の試薬には、上記構成成分以外に
も、例えば、２−ピリジルチオ−１−オキシドナトリウ
ムあるいはβ−フェネチルアルコール等の防腐剤を含有
することもできる。さらに本発明の試薬で使用する色素
が、水溶液中で不安定な場合には、色素を適当な水溶性
の非水溶媒、例えばエタノール、ジメチルスルホキシ
ド、エチレングリコール等に溶解して保存し、使用時に
他の成分を含有する水溶液と混合して使用することがで
きる。各色素は同一の非水溶媒に溶解することも可能で
あり、また別の非水溶媒に溶解することも可能である。
【００５３】本発明の試薬は、フローサイトメータを使
用することにより網状赤血球を測定する場合に特に有効
である。まず、工程において、本発明の網状赤血球測
定試薬と血液学的試料を混合して測定用試料を調製す
る。血液学的試料とは、測定対象となる血液成分を含有
する試料の何れであってもよい。例えば抗凝固剤処理を
行った末梢血液あるいは骨髄液である。測定試料の調製
は、網状赤血球測定用試薬と血液学的試料を１００：１
〜１０００：１の比で混合し反応させることが好まし
い。この時の反応温度は２５〜５０℃程度が好適であ
り、さらには３５〜４５℃が好適である。また好適な反
応時間は、試薬中に含有される色素により異なるが、１
０秒〜５分程度が好ましく、より好ましくは２０秒〜２
分程度であり、さらに好ましくは２０〜６０秒程度であ
る。
【００５４】工程において、工程で得られた測定用
試料を赤色波長の光源を有するフローサイトメータの流
体系に導入する。赤色波長の光源としては、使用する色
素（蛍光色素）の励起波長付近の光、例えば６００〜６
８０ｎｍ程度の波長の光を発する光源であれば特に限定
されるものではない。この例としてＨｅ／Ｎｅレーザ、
赤色波長領域の半導体レーザ等があげられる。ここで使
用する赤色波長の光源を有するフローサイトメータの光
学部分を図１に示す。半導体レーザ１の前方に集光レン
ズ系２を介してフローセルが配置しており、フローセル
の前方にビームストッパー４を介して前方散乱光用受光
レンズ５及びフォトダイオード６が配置している。ま
た、フローセル３の側方には側方蛍光用の受光レンズ７
を介してバンドパスフィルタ８及び光電子増幅管９が配
置されている。なお、流体部、データ処理部等の他の装
置構成部は、公知の構成等を改良して用いることができ
る。
【００５５】工程において、シースフロー中を流れる
細胞に上述した赤色波長の光を照射し、工程において
細胞から発する散乱光と蛍光を測定する。この場合の散
乱光は、前方散乱光又は側方散乱光のいずれでもよく、
さらに前方散乱光は前方低角散乱光（１〜５°）あるい
は前方高角散乱光（６〜２０°）のいずれでもよい。散
乱光は細胞の大きさ情報を反映するパラメータである
が、他に細胞の大きさ情報を測定する方法として電気抵
抗法が挙げられる。場合によっては散乱光の測定の代わ
りに電気抵抗法による電気抵抗信号を測定することも可
能である。
【００５６】工程において、散乱光強度あるいは散乱
光強度と蛍光強度とのスキャッタグラムにより血小板と
その他の細胞とを弁別し、工程において、蛍光強度あ
るいは蛍光強度と散乱光強度とのスキャッタグラムによ
って赤血球、網状赤血球及び白血球を弁別し、工程に
おいて赤血球及び網状赤血球を分類計数して、それらの
細胞数及び細胞比率を算出する。
【００５７】さらに網状赤血球をその成熟度別に、具体
的には蛍光強度の違いによって分類計数し、全網状赤血
球に占める割合を算出することも可能である。
【００５８】
【実施例】
実施例１ 以下の組成の網状赤血球測定用試薬を調製した。 網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ ３mg 白血球を特異的に染色する色素Ｂ 0.03mg トリシン（緩衝剤） 1.79ｇ クエン酸３ナトリウム２水和物（多価アニオン） 29.4ｇ ＬＴＡＣ（カチオン性界面活性剤、染色促進剤） 150mg 精製水 １リットル （水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調製）
【００５９】
【化１７】
【００６０】
【化１８】
【００６１】試薬２ｍｌに抗凝固剤処理を行った健常人
血液１０μｌを加え、４０℃で１２０秒間インキュベー
トした測定用試料を、図１に示した光学部を用いて前方
散乱光強度及び蛍光強度を測定した。図２に示したスキ
ャッタグラムにおいて網状赤血球比率は２．０％であっ
た。なお対照法として東亞医用電子製Ｒ−２０００で測
定したところ２．０％であった。
【００６２】同様にリンパ系の異常細胞が出現した血液
を測定したところ、図３のスキャッタグラムが得られ
た。このスキャッタグラムでは、網状赤血球の集団と白
血球の集団を明瞭に弁別することができた。
【００６３】実施例２ 以下の組成の網状赤血球測定用試薬を調製した。
【００６４】 網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ ３mg 白血球を特異的に染色する色素Ｃ 30mg トリシン 1.79ｇ クエン酸３ナトリウム２水和物 29.4ｇ ＬＴＡＣ 150mg 精製水 １リットル （水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調製）
【００６５】
【化１９】
【００６６】試薬２mlに抗凝固剤処理を行った健常人血
液１０μｌを加え、４０℃で１２０秒間インキュベート
した測定用試料を、図１に示した光学部を用いて前方散
乱光強度及び蛍光強度を測定した。図４に示したスキャ
ッタグラムにおいて網状赤血球比率は１．８％であっ
た。なお対照法として東亞医用電子製Ｒ−２０００で測
定したところ１．７％であった。
【００６７】比較例１ 以下の組成の網状赤血球測定用試薬を調製した。
【００６８】 網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ ３mg トリシン 1.79ｇ クエン酸３ナトリウム２水和物 29.4ｇ ＬＴＡＣ 150ml 精製水 １リットル （水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調製） 試薬２ｍｌに抗凝固処理を行った健常人血液１０μｌを
加え、４０℃で１２０秒間インキュベートした測定用試
料を、図１に示した光学部を用いて前方散乱光強度及び
蛍光強度を測定した。図５に示したスキャッタグラムに
おいて網状赤血球比率は２．１％であった。なお対照法
として東亞医用電子製Ｒ−２０００で測定したところ
２．０％であった。
【００６９】同様にリンパ系の異常細胞が出現した血液
を測定したところ図６のスキャッタグラムが得られた。
このスキャッタグラムでは、網状赤血球の集団と白血球
の集団を明瞭に弁別することはできなかった。
【００７０】
【発明の効果】本発明の試薬及び測定方法によれば、安
価で小型の光源を用いるフローサイトメータ法を用い
て、異常リンパ球等が出現している特殊検体においても
網状赤血球が正確かつ迅速に測定することができる。つ
まり、本発明の試薬及び測定方法によれば、異常リンパ
球等が出現した患者検体において、成熟赤血球や網状赤
血球の蛍光強度を変化させることなく、白血球の蛍光強
度のみを強くすることができるため、網状赤血球を精度
よく分類計数することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の測定方法において使用する赤色波長の
光源を有するフローサイトメータの光学部分を示す概略
図である。
【図２】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ
と白血球を特異的に染色する色素Ｂとを含む網状赤血球
測定用試薬を用いて、健常人の末梢血液試料の前方散乱
光強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャッタグラム
である。
【図３】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ
と白血球を特異的に染色する色素Ｂを含む網状赤血球測
定用試薬を用いて、異常リンパ球の出現している患者の
末梢血液試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した
場合のスキャッタグラムである。
【図４】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ
と白血球を特異的に染色する色素Ｃを含む網状赤血球測
定用試薬を用いて、健常人の末梢血液試料の前方散乱光
強度及び蛍光強度を測定した場合のスキャッタグラムで
ある。
【図５】本発明の網状赤血球を特異的に染色する色素Ａ
のみを含む網状赤血球測定用試薬を用いて、健常人の末
梢血液試料の前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した場
合のスキャッタグラムである。
【図６】網状赤血球を特異的に染色する色素Ａのみを含
む網状赤血球測定用試薬を用いて、異常リンパ球の出現
している患者の末梢血液試料の前方散乱光強度及び蛍光
強度を測定した場合のスキャッタグラムである。
【符号の説明】
１ 半導体レーザ ２ 集光レンズ系 ３ フローセル ４ ビームストッパー ５ 前方散乱光用受光レンズ ６ フォトダイオード ７ 側方蛍光用受光レンズ ８ バンドパスフィルタ ９ 光電子増倍管
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坂田 孝 神戸市中央区港島中町７丁目２番地の１ 東亞医用電子株式会社内

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも１つの網状赤血球を特異的に
    染色する色素と、 少なくとも１つの白血球を特異的に染色する色素とから
    なる網状赤血球測定用試薬。
  2. 【請求項２】 網状赤血球を特異的に染色する色素が、
    式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒ1は水素原子又は低級アルキル基；Ｒ2及びＲ
    3は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基又は
    低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は低級
    アルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されてもよい低級ア
    ルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は低級アルキル基
    が置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ -はアニオン
    である）である請求項１記載の網状赤血球測定用試薬。
  3. 【請求項３】 白血球を特異的に染色する色素が、式
    （II） 【化２】 （式中、Ｒ6及びＲ7は同一又は異なって、水素原子、低
    級アルキル基、低級アルコキシ基又はフェニル基；Ｒ8
    〜Ｒ11は同一又は異なって、水素原子又は低級アルキル
    基；Ｘ-はアニオンである）又は式（III) 【化３】 （式中、Ｒ12及びＲ13は同一又は異なって、水素原子、
    低級アルキル基、アルコキシ基及び低級アルキル基で置
    換されたアミノ基；Ｒ14及びＲ15は同一又は異なって、
    水素原子又は低級アルキル基；Ｘ-はアニオンである）
    で示される請求項１又は２のいずれかに記載の網状赤血
    球測定用試薬。
  4. 【請求項４】 さらに、赤血球の非特異蛍光を抑制する
    ための多価アニオンを含有する請求項１〜３のいずれか
    に記載の網状赤血球測定用試薬。
  5. 【請求項５】 さらに、ｐＨを一定に保つための緩衝剤
    を含有する請求項１〜４のいずれかに記載の網状赤血球
    測定用試薬。
  6. 【請求項６】 さらに、浸透圧を生理学的浸透圧にする
    ための浸透圧補償剤を含有する請求項１〜５のいずれか
    に記載の網状赤血球測定用試薬。
  7. 【請求項７】 さらに、染色促進剤を含む請求項１〜６
    のいずれかに記載の網状赤血球測定用試薬。
  8. 【請求項８】 染色促進剤がカチオン性界面活性剤であ
    る請求項７記載の網状赤血球測定用試薬。
  9. 【請求項９】 カチオン性界面活性剤が、式（IV） 【化４】 （式中、Ｒ16は炭素数８〜１２のアルキル基；Ｒ17、Ｒ
    18及びＲ19は同一又は異なって、低級アルキル基；Ｙ-
    はハロゲンイオンである）で示される請求項８記載の網
    状赤血球測定用試薬。
  10. 【請求項１０】 カチオン性界面活性剤が、ラウリルト
    リメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルア
    ンモニウムブロマイド、オクチルトリメチルアンモニウ
    ムブロマイドのうち少なくとも１つである請求項９記載
    の網状赤血球測定用試薬。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０に記載のいずれかの試
    薬を使用して網状赤血球を測定する方法。
  12. 【請求項１２】 フローサイトメータを使用する請求項
    １１に記載の方法。
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JP2008134062A (ja) * 2006-11-27 2008-06-12 Sysmex Corp 血液学的試料の測定方法および測定装置

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