JP4351048B2 - 血液製剤及び／又はその派生物からの病原菌の濃縮及び検出装置及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、血液製剤又は派生製品中に場合により存在する病原菌の濃縮方法、並びに前記血液製剤の病原性検査を行うためにこのように濃縮された前記菌の検出を対象とする。

血液製剤とは、全血、及びその分画から生じた、細胞成分を含む、又は含まないあらゆる製剤を意味し、例として、血液製剤とは、赤血球又は血小板の濃縮物を意味するが、血漿又は血清製剤も意味する。

細菌、ウイルス、カビ、酵母又はその他のような様々な病原菌による血液製剤及び派生製品の汚染検出は、現代において、公衆衛生に責任のある官庁、並びに輸血産業が直面する大きな問題の１つである。

検出テストは存在するが、今日、それらは日常的に使用可能ではない。

血液細胞の母集団又は分集団の中で、かかる病原菌を検出する大部分のテストによって示される主要な問題は、選択的に病原菌を引き出すとみなされる大部分の処理が、同時にそれらの除去を引き起こすことにある。

この除去は、テストした血液製剤中の前記菌の存在の過小評価に、かつそれ故に衛生上の危険増大にほぼ体系的に行き着く。

従って出願人は、かかる病原菌による、血液製剤又は派生製品の汚染を検出するための迅速かつ高精度の新規方法を考え出した。

本発明による方法は、予備処理又は希釈なしに、被験者において採取された血液製剤から生じた試料に対して直接行われることにおいて注目すべきである。

出願人が発達させた病原菌の検出方法は、前記病原菌を選択的に濃縮し、次に一旦濃縮されると、当業者に公知の技術によって、それらを検出することから本質的になる。

病原菌の選択的濃縮は、血液製剤の試料中に存在する血液細胞の様々な母集団の逐次又は同時除去によって行われる。

本発明による病原菌の濃縮方法は、血液細胞の選択的凝集により血液細胞の母集団の濃度を減少させることからなり、凝縮していない濃縮した病原菌を濾液中で採集し、かつ血液細胞の凝集体をフィルタ上に留め置くための濾過が後に続く、病原菌を濃縮する第１のステップを含む。

凝集とは、本発明の意味では、細胞凝縮体の形成に至らせるあらゆる作用を意味し、かつ細胞凝集体とは、２つ以上の細胞を含み、かつ寸法が単離細胞のそれよりも大きいあらゆる細胞集合を意味する。本発明の意味で、凝集体は、血小板活性化に続く血小板凝集のような凝集、赤血球が特殊な分子の存在下である際に得られる赤血球凝着のような凝着、又は細胞膜の静電荷の変化、又は２つ以上の細胞の再集合に至らせる他の細胞接着若しくは接近メカニズムによって生じた細胞接近によって得ることができる。

好ましい実施態様によれば、血液細胞の様々な母集団の凝集は、血小板の凝集をもたらす化合物を用いて、又は赤血球の特異な凝着をもたらす化合物を用いて行われ得る。

例えば、ある種の化合物の存在下で、血小板が、凝集する能力を有することが知られている。これらの凝集体は、濾過によって病原菌から容易に分離され得る。

赤血球は、幾つかの凝着性を同様に有する。

本発明による病原菌の濃縮方法は、第１の凝集ステップの際に凝集されなかった単離細胞を溶解させることからなる血液中の多数細胞、すなわち血小板及び赤血球の母集団の濃度を減少させる第２のステップを場合により含む。

血液細胞の母集団の濃度を減少させる、この第２のステップにより、血小板濃度に関して約４ログ（１０^９から１０^５細胞／ｍｌへ）の、かつ赤血球濃度に関して約５ログ（１０^１０から１０^５へ）の減少が可能になる。

より正確には、本発明は、血液細胞を含む血液製剤中に場合により存在する汚染菌の濃縮方法であって、次のステップ：
ａ）前記血液製剤の試料に血液細胞の凝集処理を受けさせる、
ｂ）汚染菌を通すが、細胞の凝集体を通さない第１フィルタに、処理した試料を通過させることによってステップ（ａ）で形成した凝集体を除去する、
ｃ）ステップ（ｂ）で得た濾液の残留細胞を選択的に溶解させる、
ｄ）細胞片を通す第２フィルタに、ステップ（ｃ）の溶解物を通過させることによって汚染菌を回収することを含むことを特徴とする方法を対象とする。

好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、場合により留め置かれる汚染菌を検出するために第２フィルタを分析する追加のステップを含む。

好適には、本発明による検出方法は、ステップ（ａ）の凝集の際か、ステップ（ｃ）の溶解の際か、分析ステップ（ｅ）の際、第２フィルタに直接、汚染菌のマーキング剤を添加することを含む。

本発明の方法によって検出可能な病原菌のマーキング剤の例として、ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖ６のようなエステラーゼ基質を含むマーキング溶液が挙げられる。

同様に、本発明の方法によって検出可能な病原菌のマーキング剤として、マークした抗体又は核酸のマーカを含むマーキング溶液を使用することができる。好ましくは、マーカは、蛍光であるか、又は蛍光色素、若しくは蛍光にされる基質の分解を可能にする酵素に連結され、場合により蛍光は、レーザー励起によって検出される。

本発明による検出方法は、方法のステップの少なくとも１つに、ステップ（ａ）の凝集の際か、ステップ（ｃ）の溶解の際か、分析ステップ（ｅ）の際、第２フィルタに直接か、ステップの中の幾つかで、添加され得る、汚染菌の透過化処理剤の添加を同様に含む。

汚染菌の透過化処理剤の例として、ポリエチレンイミン、二酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、単独の、又はナイシンと組み合わせたエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、並びにＮ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ＳＤＳ、ツイーン、トリトン、Ｂｒｉｊ等のタイプの洗剤が挙げられる。

本発明の方法の特殊な実施態様によれば、血液製剤の血液細胞は、血小板若しくは赤血球、又はそれらの混合物である。

本発明の方法のもう１つの特殊な実施態様によれば、血液製剤の血液細胞は、血小板であり、かつステップ（ａ）の凝集処理は：
−血小板抗原の特異性抗体、
−トロンビン、ＴＲＡＰ（トロンビンレセプタ活性化ペプチド）、トリプシン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、ＰＡＦ（血小板活性化因子）、イオノホアＡ２３１８７から選択される強い血小板活性化作用薬、
−ＡＤＰ、アドレナリン、アラキドン酸、フォン・ヴィレブラント因子、セロトニン又はエピネフリンから選択される弱い血小板活性化作用薬を含む群から選択される凝集剤の少なくとも１つを含む凝集組成物と試料を接触させることを含む。

好適には、凝集組成物中の血小板抗原の特異なＣＤ９タイプの抗体の濃度は、０．５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、かつ好ましくは、５μｇ／ｍｌ〜４０μｇ／ｍｌである。

更に好適には、凝集組成物中の強い作用薬の濃度は：
−トロンビンタイプの作用薬に関して０．５ＵＩ／ｍｌ〜１００ＵＩ／ｍｌであり、かつ好ましくは、１ＵＩ／ｍｌ〜２０ＵＩ／ｍｌであり、
−ＴＲＡＰタイプの作用薬に関して５μＭ〜２００μＭであり、かつ好ましくは、１０〜１００μＭであり、
−トリプシンタイプの作用薬に関して１ｎＭ〜５００ｎＭであり、かつ好ましくは、１０ｎＭ〜３００ｎＭであり、
−コラーゲンタイプの作用薬に関して０．０５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであり、かつ好ましくは、１μｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌであり、
−トロンボキサンＡ２タイプの作用薬に関して０．０１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌであり、かつ好ましくは、０．１〜１μｇ／ｍｌであり、
−ＰＡＦタイプの作用薬に関して０．００５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、かつ好ましくは、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌであり、
−イオノホアＡ２３１８７タイプの作用薬に関して０．１μＭ〜１００μＭであり、かつ好ましくは、１μＭ〜２０μＭである。

好適には、凝集組成物中の弱い作用薬の濃度は：
−ＡＤＰタイプ、アドレナリンタイプ又はエピネフリンタイプの作用薬に関して０．５μＭ〜１００μＭであり、かつ好ましくは、１μＭ〜２０μＭであり、
−アラキドン酸タイプの作用薬に関して０．００１ｍＭ〜１０ｍＭであり、かつ好ましくは、０．０１〜５であり、
−フォン・ヴィレブラント因子タイプの作用薬に関して０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、かつ好ましくは、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌであり、
−セロトニンタイプの作用薬に関して０．０５μＭ〜１００μＭであり、かつ好ましくは、０．０１μＭ〜５０μＭである。

全く好ましくは、血小板抗原の特異性抗体は：抗ＣＤ９、ＣＤ３２、抗ＰＴＡ１、ＣＤ４２、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ又は抗ＧｐＩＶ抗体から選択される。

本発明の方法のもう１つの特殊な実施態様によれば、血液製剤は、赤血球を含み、かつステップ（ａ）の凝集処理は、レクチン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、デキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される少なくとも１つの凝着剤を含む凝着組成物と試料を接触させることを含む。

好適には、前記レクチンは、エリトロアグルチニン（ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ）活性を有する。

非常に好ましくは、レクチンは、インゲンマメ、カラスノエンドウ、ソラマメ又はエリスリナ・コラロデンドロン、レンズマメ、アメリカヤマゴボウ、小麦胚芽（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｖｕｌｇａｒｉｓ）のレクチンから選択される。

好適には、凝着組成物中のインゲンマメタイプのレクチンの濃度は、１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌである。

好適には、凝着組成物中のポリエチレンイミンの濃度は、０．１（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％である。

非常に好ましくは、前記デキストランは、デキストラン７０、デキストラン１００、デキストラン５００等から選択される。

好適には、凝着組成物中のデキストランの濃度は、０．１（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％である。

非常に好ましくは、前記ＰＥＧは、ＰＥＧ３５、ＰＥＧ等から選択される。

好適には、凝着組成物中のＰＥＧの濃度は、０．０５（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％である。

好適には、凝着組成物中のゼラチンの濃度は、０．５（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％である。

非常に好ましくは、前記ＰＶＰは、ＰＶＰ−４０、ＰＶＰ−３６０等から選択される。

好適には、凝着組成物中のＰＶＰの濃度は、０．０５（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％である。

好適には、ステップ（ｃ）の細胞溶解は：サポニン、ＳＤＳ、ツイーン２０、トリトンＸ１００、Ｂｒｉｊ９６、ポリドカノール、Ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、又は炭酸ナトリウムを含む群から選択される１つ又は幾つかの洗剤を含む溶解溶液によって行われる。

好ましくは、溶解溶液は、サポニン、トリトンＸ１００、及びツイーン２０の混合物からなり、かつ非常に好ましくは、溶解溶液は、０．００５％〜０．５％の（重量／体積％で表す）濃度を有するサポニン、０．００１％〜０．５％の（重量／体積％で表す）濃度を有するトリトンＸ１００、０．０１％〜１％の濃度を有するツイーン２０、０．１％〜０．５％の濃度を有するＮ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドを含む。

好適には、細菌の透過化処理は：（グルコン酸、二酢酸）クロルヘキシジン、ポリエチレンイミン、Ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、単独の、又はＥＤＴＡと組み合わせたナイシンを含む群から選択される１つ又は幾つかの反応体を含む溶液によって行われる。

好ましくは、透過化処理剤は、０．０００１（重量／体積）％〜０．１（重量／体積）％の濃度（重量／体積）を有するクロルヘキシジン、５μｇ／ｍｌ〜１２０μｇ／ｍＬの濃度を有するポリエチレンイミン、０．１（重量／体積）％〜０．５（重量／体積）％の濃度を有するＮ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、及び単独の、又は１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度を有するＥＤＴＡと組み合わせた、０．１μｇ／ｍＬ〜０．５μｇ／ｍＬのナイシンに使用される。

本発明の方法は、血液製剤の多数の汚染菌を濃縮及び検出するために使用され得るが、それらの中で、好気性又は嫌気性細菌、カビ、酵母、生及び／又は死細菌の胞子を挙げることができる。

好適には、本発明の方法で利用する第１フィルタの孔の寸法は、２μｍ〜２０μｍである。

好適には、本発明の方法で利用する第２フィルタの孔の寸法は、０．２μｍ〜２μｍである。

好適には、本発明の方法のステップ（ｅ）の汚染菌の検出は、密閉した装置中で行われる。

非常に好ましくは、本発明の方法により濃縮され得る汚染菌は、好気性又は嫌気性細菌、カビ、酵母、又は生及び／又は死細菌の胞子の群から選択され、第１フィルタの孔の寸法は、２μｍ〜２０μｍであり、かつ第２フィルタの孔の寸法は、０．２μｍ〜２μｍである。

本発明は：
−血液細胞の少なくとも１つの凝集剤及び場合により病原菌の少なくとも１つのマーキング剤を含む、密封かつ無菌の第１タンク（１）、
−血液細胞の少なくとも１つの溶解剤及び場合により病原菌の少なくとも１つのマーキング剤を含む、密封かつ無菌の第２タンク（２）、
−前記第１タンク中に形成された凝集体を留め置くことが可能な、第１及び第２タンクの間に置かれる第１フィルタ（３）、
−汚染病原菌となり得るものを留め置くことが可能な、第２タンクの下流に置かれる第２フィルタ（４）、
−第１タンク（１）及び第１フィルタ（３）の間、第１フィルタ（３）及び第２タンク（２）の間、並びに第２タンク（２）及び第２フィルタ（４）の間に置かれる密封かつ無菌の接続手段（５）を含む、本発明の病原菌検出方法において利用され得る、血液細胞を含む血液製剤中に場合により存在する汚染菌の濃縮及びマーキング装置も対象とする。

好ましい実施態様によれば、本発明の装置は、血液製剤を含むポケットを無菌の第１タンク（１）に連結するために、密封かつ無菌の接続手段（６）を含む。

好適には、血液製剤を含むポケットを無菌の第１タンクに連結する、密封かつ無菌の接続（６）は、逆止め弁（７）を備える。

もう１つの好ましい実施態様によれば、本発明の装置は、所定の体積の血液製剤を、前記第１タンク（１）に向かって前記製剤の貯蔵ポケットから直接試料採取する手段を含む。

好適には、本発明の装置の密封かつ無菌の第１タンク（１）は、試料吸入システム（８）を備え、かつ好ましくは、前記吸入システムは、ピストンである。

もう１つの好ましい実施態様によれば、本発明の装置の第２フィルタ（４）は、前記フィルタを回収することを可能にする、分離され得る２つの部分から構成される膜支持体中に含まれる。

好適には、本発明の装置は、密閉され、かつ無菌である。

本発明のその他の利点及び特徴は、以下に続く実施例及び添付図面を読めば、現れるであろう。

実験結果

Ｉ．凝集ステップによる病原菌の濃縮

Ｉ．１．血小板凝集

（実施例１）
強い作用薬：トロンビンによる凝集

トロンビンは、血小板凝集の強い作用薬である。

本発明の枠内で出願人が行った実験作業において、トロンビン溶液（参照Ｔ８８８５Ｓｉｇｍａ）が：１０ＵＩ／テストの割合で使用される際に、１００ＵＩ／ｍｌの濃度で、かつ１ＵＩ／テストの割合で使用される際に、希釈溶液（９００μｌのＰＢＳ緩衝液を添加した１００μｌのトロンビン原液）の形状で調製された。

トロンビンを介する血小板の凝集は、次のステップ：
−２０μｌのＰＢＳ緩衝液及び２０μｌのトロンビンを添加する、１６０μｌの血小板濃縮物を管中に置く、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−８００μｌのＰＢＳ緩衝液を前記管に添加する、
−管の中身を空隙率１１μｍのフィルタで濾過する、
−濾液から１／２０〜１／１０の一連の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で濾液の１００μｌの各希釈溶液を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−膜に場合により留め置かれる血小板を計数することを含む。

以下の表１は、得られた結果を図示し、かつ２つの異なる濃度で使用するトロンビンの存在下で得られる血小板凝集体数を示し、かつ添付の図１は、これら結果をグラフによって図示する。

（実施例２）
病原菌の存在下でのトロンビンによる血小板凝集

トロンビンの存在下での病原菌凝集を評価するために利用した実験作業は、次のステップ：
−低温球体（ｃｒｙｏｓｐｈｅｒｅ）の大腸菌を９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中に導入し、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−１６０μｌの血小板濃縮物に、２０μｌの大腸菌懸濁液及び２０μｌのトロンビンを添加する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−８００μｌのＰＢＳ緩衝液を添加する、
−空隙率１１μｍのフィルタを通して濾過する、
−一連の希釈：１／２０及び１／１０及び１／１０、を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−検出を行うことを含む。

以下の表２は、大腸菌の存在下でのトロンビンによる血小板濃縮物の凝集を示す。

トロンビン添加後、ほぼ即座に血塊が現れる。

（実施例３）
弱い作用薬：ＡＤＰの存在下での血小板凝集

ＡＤＰ（ＳＩＧＭＡ）を、蒸留水中に２００μＭの濃度で使用する。

ＡＤＰの存在下での血小板凝集を評価するために利用した実験作業は、次のステップ：
−５０μｌのＰＢＳ緩衝液及び５０μｌのＡＤＰを添加する、４００μｌの血小板濃縮物を管中に導入する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−１／２０及び１／１０及び１／１０の一連の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、及び
−検出を行うことを含む。

図１に図示した結果は、ＡＤＰの存在下で、血小板濃度が、約５０％〜約９０％減少することを示す。

（実施例４）
病原菌の存在下でのＡＤＰによる血小板凝集

ＡＤＰの存在下での血小板凝集は、次のステップ：
−低温玉（ｃｒｙｏｂｉｌｌｅ）の表皮ブドウ球菌を９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中に導入し、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−４００μｌの血小板濃縮物に対し、５０μｌの表皮ブドウ球菌懸濁液及び５０μｌのＡＤＰを添加する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う、
−１／２０及び１／１０及び１／１０の一連の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−検出を行うことを含む。

起こり得るトラッピング効果を増加させるように、病原菌を高濃度で植え付ける。ＡＤＰを１０μＭの濃度で、血小板及び細菌に添加する。

以上の表３に示す、得られた結果は、７４％の細菌が、凝集ステップ後に回収されることを示している。

（実施例５）
ＣＤ９抗体の存在下での血小板凝集

ＣＤ９抗体が血小板の活性化、及び従ってその凝集をもたらすことは、公知である。記載するテストは、２つのＣＤ９クローン、ＳＮ４クローン（Ａｎｃｅｌ、ｒｅｆ １５６−０２０、濃度１００μｇ／ｍｌ）及び６Ｂ１クローン（Ｈｅｍｏｓｙｓｔｅｍ）により行った。

このＣＤ９抗体によって利用される選択的凝集方法は、次のステップ：
−４００μｌの血小板濃縮物に対し、５０μｌのＰＢＳ緩衝液及び５０μｌのＣＤ９抗体を添加する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う、
−１／２０及び１／１０及び１／１０の一連の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−検出を行うことを含む。

ＣＤ９抗体（ＳＮ４クローン）を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で、血小板の存在下で使用した。

添付の図２は、ＣＤ９抗体（ＳＮ４クローン）の存在下で得られた血小板凝集を図示する。

血小板凝集に必要なＣＤ９抗体の最適濃度を評価するために、用量反応曲線を作成した。

方法：
−管中に置かれる４００μｌの血小板濃縮物に対し、ＣＤ９抗体の、０から２０μｇ／ｍｌに及ぶ最終濃度を有する、抗体の様々な希釈溶液を添加する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う、
−一連の希釈：１／１０の４回の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−検出を行う。

図３及び５は、漸増分量のＣＤ９抗体（ＳＮ４クローン）の存在下で凝集した血小板の算出結果及びこのようにして得られる用量反応曲線をそれぞれ示す。

残留血小板の算出は、アナライザによって行う。

凝集は、用量依存性である。凝集効果を増大させるために、ＣＤ９濃度をできるだけ増加させた。しかしながら、細菌検出のために妥協点が定められ、約１０μｇ／ｍｌのＣＤ９抗体の濃度を使用して、血小板濃度が、１から２ログに減少され得ることを決定した。

（実施例５の２）
血小板凝集に必要なＣＤ９抗体（６Ｂ１クローン）の最適濃度を評価するために、用量反応タイプの実験を確立した。

方法：
−管中に置かれる３ｍＬの血小板濃縮物に対し、ＣＤ９抗体の、２．５μｇ／ｍＬから４０μｇ／ｍＬに及ぶ最終濃度を有する、抗体の様々な希釈溶液を添加する、
−１５分間、外界温度で管を撹拌する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う、
−上記のような血小板の計算を行う。

添付の図４は、漸増分量のＣＤ９抗体（６Ｂ１クローン）の存在下で凝集した血小板の算出結果を示す。

（実施例６）
細菌の存在下でのＣＤ９抗体による血小板凝集

方法：
−低温玉の表皮ブドウ球菌を大豆トリプトンブイヨンの管中に導入し、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−管中に置かれる４００μｌの血小板濃縮物に対し、５０μｌの表皮ブドウ球菌懸濁液及び５０μｌのＣＤ９を添加する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う、
−一連の希釈：１／１０の４回の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−検出を行う。

以下の表４は、細菌の存在下でのＣＤ９による血小板凝集を図示する。

これらの結果は、表皮ブドウ球菌の細菌が、大いに回収されたことを示す。大腸菌に関し、算出は３６％減少する。

Ｉ．２．赤血球凝着

レクチンは、細胞を凝着させ、かつ／又は炭水化物複合体を沈殿させる、非免疫由来の糖タンパク質である。これらの分子は、一般に特異な炭水化物に結合される。

これらの実験作業の枠内で、次の２つのレクチンを使用した：
−ＰＨＡ−Ｅインゲンマメ
−カラスノエンドウ。

（実施例１）
レクチンによる赤血球凝着

ＰＨＡ−Ｅインゲンマメレクチン（Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。

Ｖｉｃｉａ Ａｃｔｉｖａレクチン（Ｓｉｇｍａ）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。

２つのレクチンの迅速な評価により、カラスノエンドウによる赤血球凝着がないことを確認することが可能になった。他方、インゲンマメは、急速かつ有効な凝着をもたらす。

方法：
−４００μｌの赤血球を、５０μｌのＰＢＳ及び５０μｌのインゲンマメを添加する、管中に置く、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う、
−一連の希釈：１／１０の４回の希釈を行う、
−抗グリコホリンＰＥ抗体によりマーキングを行う、
−検出を行う。

添付の図６は、インゲンマメの存在下で得られる赤血球凝着を示す。

このテストにおいて、インゲンマメは、２００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。

インゲンマメの存在下で、赤血球濃度の２ログの再現可能な減少が観察される。

（実施例２）
細菌の存在下での赤血球凝着

予備テストは、インゲンマメレクチン及び細菌の間に相互作用がないことを示している。

方法
低温玉の大腸菌を９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中に導入し、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−管中で、４００μｌのＰＢＳ、５０μｌの大腸菌（純粋培養）及び５０μｌのインゲンマメを混合する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−５００μｌのＰＢＳ緩衝液をそこに添加する、
−５μｍのフィルタで濾過を行う、
−一連の希釈：１／１０の４回の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを行う、
−検出を行う。

２００μｇ／ｍｌのインゲンマメの濃度を使用して得られた結果を、以下の表５に図示する。

これらの結果は、９１％の細菌が凝着ステップ後に検出されること、及びこの凝着ステップ後に、赤血球濃度が２ログ減少し、他方大腸菌株がなおも良く回収されることを示す。

ＩＩ．溶解ステップによる病原菌濃縮

本発明の枠内で、出願人は、分析する試料中に場合により存在する細菌の濃度に影響を及ぼすことなく血液細胞の除去を可能にする様々な選択的溶解技術の開発を行った。

幾つかの予めの調査に続き、出願人は、幾つかの細菌がトリトンＸ１００のような洗剤の存在下で耐性を有することを確認し、かつ細菌回収率が最適である、最適洗剤濃度を決定した。

（実施例１）
純粋細菌培養に対する溶解溶液の配合の効果

方法：
−株は、９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中で保存され、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−一連の希釈（１／１０）を１０^−５までＰＢＳ緩衝液中で行った、
−１ミリリットルの最終希釈溶液を、９ｍｌの溶解溶液（０．０１（重量／体積）％のサポニン、０．１（重量／体積）％のツイーン及び０．００１（重量／体積）％のトリトンＸ１００によって１５分間処理する、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼマーキングを添付書類１に掲載される情報により行う、
−検出を行う。

これら様々な試験の結果を、以下の表６に図示する。表６に、得られた様々な細菌回収率を表す。

これらの結果は、添付の図７に図示する。

大部分の株は、溶解溶液によって影響を及ぼされない：回収率は、緑膿菌及びセレウス菌を除き、所定の予測と一貫性があり、９５〜１１５％である。

（実施例２）
血小板中に植え付けた細菌に対する溶解溶液の配合の効果

汚染のシミュレーションを行うように、２つの株を血小板濃縮物中で増加するようにした。

方法
−セレウス菌及び黄色ブドウ球菌株を、２０ｍｌの血小板中の１０^５の細胞の濃度を使用して、５０ｍｌの管中の血小板中に植え付けた、
−これらの５０ｍｌの管は、血小板インキュベータ中に２２℃で数日間、保存する、
−１ミリリットルの植え付けた血小板を、９ｍｌの溶解溶液によって希釈する、
−１５分間、外界温度で溶解を行う、
−膜ＣＢ０４７で１００μｌの試料を濾過する、
−添付書類１に示すように、細菌をステアリン基質によってマークする、
−膜をアナライザで走査する。

溶解後の細菌の算出結果を以下の表７に図示する。

細菌は、５×１０^３細胞／ｍｌの最初の濃度で植え付け、かつ約１０^６〜１０^９細胞／ｍｌの濃度で数日後に検出する。

これらの実験の結果、血小板中で発育した細菌は、溶解溶液によって影響を及ぼされなかったということになる。

（実施例２ｂ）
純粋細菌培養に対する溶解溶液の配合の効果

方法
−株は、９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中で保存され、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−エステラーゼマーキングによる細菌数の決定後に、３０００の細菌を３ｍＬのＰＢＳ中に接種する、
−３ｍＬを、溶解溶液（ＮＯＧ ０．２５％〜２％）で２０分間処理する、
−膜ＣＢ０４で試料全体を濾過する、
−固相血球計算法で算出を行う。

得られた結果を添付の図１１に図示する。

（実施例３）
赤血球に対する溶解組成物の配合の効果

方法：
−１ミリリットルの赤血球を、９ｍｌの溶解溶液、又は９ｍｌのＰＢＳ中で希釈する（対照）、
−１５分間、外界温度で溶解を行う、
−細胞カウンタを用いて溶解した又は溶解しない試料を分析する。

図９は、溶解しない赤血球製剤に対する溶解した赤血球製剤で得られた結果を示す。

（実施例４）
血小板に対する溶解組成物の配合の効果

溶解溶液の効率の再現性をテストした。血小板の異なる試料を溶解し、かつ分析した。

方法：
−１ミリリットルの血小板を、９ｍｌの溶解溶液中で希釈する、
−１５分間、外界温度で溶解を行う、
−一連の希釈（１／１０）を１０^−５までＰＢＳ緩衝液中で行った、
−膜ＣＢ０４で１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼ基質によって微生物をマークする、
−膜をアナライザで走査する。

添付の図８は、様々な血小板試料によって得られた溶解の結果を図示する。

ＩＩＩ．２つの凝集及び溶解ステップによる病原菌濃縮

２つのステップでの病原菌濃縮による試料調製は：
１）血液製剤の特異な細胞凝集又は凝着、
２）血液製剤の特異な細胞溶解を含む。

（実施例１）
特異な血小板分離

方法：
−低温玉の大腸菌を９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中に導入し、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。

第１凝集ステップは、次のように行われる：
−１ｍｌの血小板濃縮物、５０μｌの大腸菌（純粋培養）及び１００μｌのＣＤ９を管中で混合する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する。

第２溶解ステップが、その次に行われる：
−９００μｌの溶解緩衝液を、凝集後に１００μｌの濾液に添加する、
−１５分間、外界温度で全体を維持する、
−一連の希釈：１／１０の４回の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４でこのようにして得た１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼ基質によって細菌及び血小板のマーキングを行う（添付書類１）、
−アナライザによって細菌及び血小板を算出する。

細菌濃縮方法を２つのステップで行って得られる結果を以下の表８に図示する。

（実施例２）
特異な赤血球分離

方法：
−低温玉の大腸菌を９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中に導入し、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。

凝着ステップは、次のように行われる：
−１ｍｌの赤血球、５０μｌの大腸菌（純粋培養）及び１２５μｌのレクチンを管中で混合する、
−５分間、外界温度で管を手動で撹拌する、
−空隙率５μｍのフィルタで濾過を行う。

第２溶解ステップが、その次に行われる：
−９００μｌの溶解緩衝液を、凝着後、１００μｌの濾液に添加する、
−１５分間、外界温度で全体を維持する、
−一連の希釈：１／１０の４回の希釈を行う、
−膜ＣＢ０４でこのようにして得た１００μｌの試料を濾過する、
−エステラーゼ基質によって細菌の、かつ抗グリコホリンＰＥ抗体によって赤血球のマーキングを行う（添付書類２）、
−アナライザによって細菌及び血小板を算出する。

以下の表９は、溶解ステップが後に続く、レクチンによる赤血球の凝着ステップ後に行われる細菌算出によって得られる結果を示す。

凝着後、赤血球濃度は、１．５ログ減少した。

この２つのステップの後に、６８％の細菌を回収した。

ＩＶ．マーキング剤

（実施例１）
エステラーゼ基質ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖ６

マーキング溶液は、次の手順に従い、エステラーゼ基質から調製され、かつ本発明の検出方法において使用され得る。
ａ）調製
−緩衝液ＣｈｅｍＳｏｌ Ｂ１６、１ミリリットル当たり１０μｌのエステラーゼ基質ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖ６（膜当り５００μｌのマーキング溶液）
−この溶液は、４℃で光を避けて最大４時間、保存する。
ｂ）使用
マーキング緩衝液を直径３３ｍｍのペトリ皿に導入する。
緩衝液に対し、５００μｌのマーキング溶液を配分する。
濾過斜面に膜ＣＢ０４を置く。分析する１００μｌの試料で濾過する。
緩衝液上に膜を置く。
１５分間３７℃でインキュベートする。

（実施例２）
マークされた抗体

同様に、マークされた抗体を含むマーキング溶液は、次の手順に従い、本発明の検出方法において使用され得る
−９０μｌの試料の希釈溶液を採取する、
−１０μｌの抗グリコホリンＰＥ抗体を添加する、
−１５分間、外界温度で光を避けて渦を作り、かつインキュベートする、
−９００μｍのＰＢＳ緩衝液を添加する、
−濾過斜面中に膜ＣＢ０４を置く、
−分析する１００μｌの溶液を真空濾過する、
−アナライザの１次及び３次ケーブルを逆にしてアナライザ中で膜を分析する。

（実施例３）
マーカの浸透を改良するための細菌透過化処理剤の添加の重要性

方法：
−株は、９ｍｌの大豆トリプトンブイヨンの管中で保存され、かつ３７℃で１８〜２４時間インキュベートする、
−エステラーゼマーキングによる細菌数の決定後に、３０００の細菌を３ｍＬの血小板濃縮物中に接種する、
−３ｍＬを、１ｍｌの凝集溶液（ＣＤ９：６Ｂ１クローン：３０μｇ／ｍＬ、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ １／２０００、ＰＥＩ ４０μｇ／ｍＬ〜８０μｇ／ｍＬ）で４０分間処理する、
−試料を空隙率５μｍのフィルタを通して濾過する、
−試料は、溶解溶液（クロルヘキシジン５×１０^−３％、ＮＯＧ ０．５％、ナイシン０．２μｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ）中で２０分間インキュベートする、
−膜ＣＢ０４で試料全体を濾過する、
−固相血球計算アナライザで算出を行う。

Ｖ．結論

最良の病原菌調製条件に到達するための技術的選択が、実験作業により定義された。

血小板濃縮物に関して、これらの技術的選択は：
１）例えばＣＤ９のような血小板活性化抗体による凝集ステップ、
２）サポニン、ツイーン２０及びトリトンＸ１００のような洗剤の組み合わせによる細胞溶解ステップを含む。

赤血球濃縮物に関して：
１）例えばインゲンマメのようなレクチンによる凝着ステップ、
２）サポニン、ツイーン２０及びトリトンＸ１００のような洗剤の組み合わせによる細胞溶解ステップを含む。

病原菌のマーキング及び透過化処理は、凝集ステップの際、溶解ステップの際、又は直接、分析前に最終フィルタ上に濃縮された菌に対して、一様に介在し得る。

血小板濃縮物を様々な濃度のトロンビンと接触させた後の血小板の算出を図示する。 ２つの血小板試料に関し、ＡＤＰの存在下での凝集後の血小板の算出を図示する。 ４つの血小板試料に関し、ＣＤ９抗体（ＳＮ４クローン）の存在下での血小板の算出を示す。 ３ｍＬの血小板濃縮物に対して使用する、漸増分量のＣＤ９抗体（６Ｂ１クローン）の存在下での血小板の算出結果を示す。 増加する濃度のＣＤ９抗体（ＳＮ４クローン）の存在下で得られる用量反応曲線を示す。 ３つの赤血球濃縮物試料に関し、２００μｇ／ｍｌの濃度で使用されるインゲンマメレクチンの存在下での赤血球の凝着を図示する。 純粋培養中の様々な病原菌の回収に対する溶解溶液の効果を示す。 ２つの血小板試料の血小板計算に対する溶解溶液の効果を示す。 赤血球濃縮物の異なる２つの試料の赤血球計算に対する溶解の効果を図示する。 マーカの浸透を増加させるための透過化処理剤としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用した、血小板試料中の大腸菌細菌の算出を図示する。 純粋細菌培養に対する溶解溶液中のＮ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドの濃度の効果を図示する。 −密封かつ無菌の第１タンク（１）、−密封かつ無菌の第２タンク（２）、−第１タンク（１）及び第２タンク（２）の間に置かれる無菌の第１フィルタ（３）、−第２タンク（２）の下流に置かれる無菌の第２フィルタ（４）、−第１タンク（１）及び第１フィルタ（３）の間、第１フィルタ（３）及び第２タンク（２）の間、並びに第２タンク（２）及び第２フィルタ（４）の間に置かれる密封かつ無菌の接続手段（５）、−血液製剤を含むポケットを第１タンク（１）に連結するための、密封かつ無菌の接続手段（６）、−血液製剤を含むポケットを第１タンク１に連結する、接続（６）中に置かれる逆止め弁（７）、−試料吸入システム（８）を含む本発明の病原菌の濃縮装置の特殊な実施を図示する。

符号の説明

１ 第１タンク
２ 第２タンク
３ 第１フィルタ
４ 第２フィルタ
５ 接続手段
６ 接続手段
７ 逆止め弁
８ 試料吸入システム

Claims (28)

1. 血液細胞を含む血液製剤中に場合により存在する汚染菌の検出方法であって、次のステップ：
   （ａ）前記血液製剤の試料に血液細胞の凝集処理を施す、
   （ｂ）汚染菌を通すが、細胞の凝集体を通さない第１フィルタに、処理した試料を通過させることによってステップ（ａ）で形成した凝集体を除去する、
   （ｃ）ステップ（ｂ）で得た濾液の残留細胞を選択的に溶解させる、
   （ｄ）細胞片を通す第２フィルタに、ステップ（ｃ）の溶解物を通過させることによって汚染菌を回収する、
   （ｅ）ステップ（ａ）の凝集の際か、ステップ（ｃ）の溶解の際に汚染菌のマーキング剤を添加する、及び
   （ｆ）場合により留め置かれる標識した汚染菌を検出するために第２フィルタを分析することを含み、
   ステップ（ａ）及び（ｃ）において、汚染菌が濃縮される、
   ことを特徴とする方法。
2. ステップ（ａ）、（ｃ）又は（ｅ）の少なくとも１つで、汚染菌の透過化処理剤の添加を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 透過化処理剤は、ポリエチレンイミン、二酢酸クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン単独であるか、或いはナイシンと組み合わせたエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、洗剤又はそれらの混合物を含む群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 洗剤は、Ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシド、ＳＤＳ、ツイーン、トリトン、Ｂｒｉｊ（登録商標）又はそれらの混合物を含む群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 病原菌のマーキング剤は、エステラーゼ基質ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ Ｖ６（商標）、標識した抗体又は核酸マーカーを含む群から選択されるマーキング溶液であることを特徴とする請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
6. マーキング剤は、蛍光マーカー、又は蛍光色素、若しくは蛍光を出す基質の分解を可能にする酵素に連結された薬剤を含むことを特徴とする請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 蛍光は、レーザー励起によって検出されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 血液製剤の血液細胞は、血小板若しくは赤血球、又はそれらの混合物であることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 血液製剤は、血小板を含むこと、及びステップ（ａ）の凝集処理は、
   −血小板抗原の特異性抗体、
   −トロンビン、ＴＲＡＰ（トロンビンレセプタ活性化ペプチド）、トリプシン、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、ＰＡＦ（血小板活性化因子）、イオノホアＡ２３１８７、免疫複合体及び補体因子から選択される強い血小板活性化作用薬、
   −ＡＤＰ、アドレナリン、アラキドン酸、フォン・ヴィレブラント因子、セロトニン又はエピネフリンから選択される弱い血小板活性化作用薬を含む群から選択される凝集剤の少なくとも１つを含む凝集組成物と試料を接触させることを含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 凝集組成物中のＣＤ９タイプの抗体の濃度は、０．５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 凝集組成物中の強い作用薬の濃度は、
    −トロンビンタイプの作用薬に関して０．５ＵＩ／ｍｌ〜１００ＵＩ／ｍｌであり、
    −ＴＲＡＰタイプの作用薬に関して５μＭ〜２００μＭであり、
    −トリプシンタイプの作用薬に関して１ｎＭ〜５００ｎＭであり、
    −コラーゲンタイプの作用薬に関して０．０５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌであり、
    −トロンボキサンＡ２タイプの作用薬に関して０．０１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌであり、
    −ＰＡＦタイプの作用薬に関して０．００５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、又は
    −イオノホアＡ２３１８７タイプの作用薬に関して０．１μＭ〜１００μＭであり、であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
12. 凝集組成物中の弱い作用薬の濃度は、
    −ＡＤＰタイプ、アドレナリンタイプ又はエピネフリンタイプの作用薬に関して０．５μＭ〜１００μＭであり、
    −アラキドン酸タイプの作用薬に関して０．００１ｍＭ〜１０ｍＭであり、
    −フォン・ヴィレブラント因子タイプの作用薬に関して０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、又は
    −セロトニンタイプの作用薬に関して０．０５μＭ〜１００μＭであり、
    であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
13. 抗体は、抗ＣＤ９、抗ＣＤ３２、抗ＰＴＡ１、抗Ｄ４２、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ又は抗ＧｐＩＶ抗体から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
14. 血液製剤は、赤血球を含むこと、及びステップ（ａ）の凝集処理は、レクチン、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、デキストラン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される少なくとも１つの凝着剤を含む凝着組成物と試料を接触させることを含むことを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. レクチンは、エリトロアグルチニン（ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｅ）活性を有することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. レクチンは、インゲンマメ、カラスノエンドウ、ソラマメ又はエリスリナ・コラロデンドロンのレクチンから選択されることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 凝着組成物中のインゲンマメのレクチンの濃度は、１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 凝着組成物中のポリエチレンイミンの濃度は、０．１（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
19. ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、ＰＶＰ−４０及びＰＶＰ−３６０を含む群から選択され、０．１（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％の濃度で使用されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
20. 凝着組成物中のゼラチンは、０．５（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％の濃度で使用されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
21. 凝着組成物中のデキストランは、デキストラン７０、デキストラン１００、デキストラン５００を含む群から選択され、０．１（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％の濃度で使用されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
22. ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ８、ＰＥＧ１７、ＰＥＧ３５を含む群から選択され、０．０５（重量／体積）％〜４０（重量／体積）％の濃度で使用されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
23. ステップ（ｃ）の細胞溶解は、サポニン、ＳＤＳ、ツイーン２０、トリトンＸ１００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６、ポリドカノール、Ｎ β−Ｄ−オクチルグルコピラノシド、又は炭酸ナトリウムを含む群から選択される１つ又は幾つかの洗剤を含む溶解溶液によって行われることを特徴とする請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 汚染菌は、好気性又は嫌気性細菌、カビ、酵母、生及び／又は死細菌の胞子であることを特徴とする請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 第１フィルタの孔の寸法は、２μｍ〜２０μｍであることを特徴とする請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 第２フィルタの孔の寸法は、０．２μｍ〜２μｍであることを特徴とする請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 汚染菌は、好気性又は嫌気性細菌、カビ、酵母、又は生及び／又は死細菌の胞子であること、第１フィルタの孔の寸法は、２μｍ〜２０μｍであること、及び第２フィルタの孔の寸法は、０．２μｍ〜２μｍであることを特徴とする請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ステップ（ｆ）の汚染菌の検出は、密閉した装置中で行われることを特徴とする請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。

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