CN114480596A - 一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，包括以下步骤：(1)模拟细菌污染血液标本的制备；(2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取：提取上述细菌污染模拟血液标本的DNA，并对提取的DNA进行核酸浓度检测，选取浓度达标的DNA，保存备用；(3)微流控芯片FQ‑PCR反应：设计FQ‑PCR引物及Tagman探针，在微流控芯片中进行PCR反应并收集荧光数据。本发明将FQ‑PCR技术与微流控芯片相结合来检测样本中的细菌16srDNA，通过检测结果来评价样品的细菌污染情况，实现对血液及血制品的快速、高灵敏以及高精度的实时检测。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其中该血液及血制品尤其为血小板制品。
背景技术
血液和血液制品的微生物污染是影响输血安全的重要因素之一，近年来，虽然随着检测试剂及检测技术的发展，经输血途径感染乙肝、艾滋、梅毒等常规血液传染病的风险已明显降低，但是血液细菌污染仍然无法避免。血液及血制品细菌污染主要因素有：静脉采血不当、献血员为无症状菌血症、保存不当等。其中，血小板更易受到细菌的污染，并且造成的临床危害也更严重，此外，血小板必须在22℃振荡培养的条件下以保持其活性，这也为大部分病原菌的生存提供了条件。
目前，可通过多种方法或工具来对血液及血制品的细菌污染进行检测，例如，申请号为CN201410781842.5(公开号为CN104502589A)的中国发明专利《一种检测血小板制品细菌污染的层析试纸条及检测方法》、申请号为CN201910589644.1(公开号为CN110456049A)的中国发明专利《一种血小板制品细菌污染检测的方法》等。其中，基于血培养的BacT/ALERT 3D自动化系统是目前最常用检测血液及血制品细菌污染的方法，但是该方法存在以下问题：成本高，耗时长，在诊断时效性上存在明显欠缺，还可能因此而降低血液制品的治疗效用；此外，敏感性不高，对于某些难以培养的细菌容易产生假阴性结果。近年来，随着实时荧光定量PCR技术的成熟，逐渐有取代传统方法的趋势，例如，申请号为CN201410363658.9(公开号为CN104372072A)的中国发明专利《一种通用型检测血小板细菌污染的荧光定量PCR方法》等。然而，将PCR技术应用于血液及血制品细菌污染检测时，核酸扩增反应需要提取、扩增及检测等步骤，既费时又费力，因此还需要进一步改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种检测效率高、检测敏感性高且检测结果准确率高的微流控血液及血制品细菌污染检测方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于包括以下步骤，
(1)模拟细菌污染血液标本的制备：挑取污染模拟细菌进行培养，培养至一定浓度后与备用的无菌血小板浓缩液混合，混合液经稀释后获得所需的细菌污染模拟血液标本；
(2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取：提取上述细菌污染模拟血液标本的DNA，并对提取的DNA进行核酸浓度检测，选取浓度达标的DNA，保存备用；
(3)微流控芯片FQ-PCR反应：设计FQ-PCR引物及Tagman探针，利用微流控芯片中进行PCR反应并收集荧光数据。
进一步，所述步骤(1)中的污染模拟细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。血液及血制品的自然细菌污染源(主要为人体皮肤表面细菌)包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，本发明中的污染模拟细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌能更好地模拟自然细菌污染源。
进一步，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌单菌。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌单菌均为人体皮肤表面的常见致病菌，其中，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌的代表菌，而铜绿假单胞菌单菌为革兰氏阴性菌的代表菌。
进一步，所述步骤(1)中的细菌污染模拟血液标本中的细菌浓度为100～108CFU/mL。
进一步，所述步骤(2)中提取的DNA的浓度标准为：A260/A280值在1.8～2.0之间，A230/A260值小于0.7，从而避免假阴性结果，提高检测的灵敏度，有利于保证检测结果的可靠性。
进一步，所述步骤(3)中的FQ-PCR引物的序列为：
上游5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，如SEQ ID NO.1所示。
下游5’-CTTTACGCCCARTAATTCCG-3’，如SEQ ID NO.2所示。本发明中的引物特异性高，能有效避免假阴性或假阳性问题的发生，进一步提高检测结果的准确性。
进一步，所述步骤(3)中所用的探针为Tagman探针，并且该Tagman探针序列为：5’FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGCAC-TAMRA 3'，如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述步骤(3)中的FQ-PCR反应的反应条件为：7℃预变性8s，以97℃7s、60℃14s、扩增40循环，在60℃进行单点荧光检测。
进一步，所述步骤(3)微流控芯片包括16条U型毛细管道状的通道，各通道能分别进行FQ-PCR反应，从而能同时检测16个PCR反应，进一步提升本发明的检测效率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明将FQ-PCR技术与微流控芯片相结合来检测样本中的细菌16srDNA，通过检测结果来评价样品的细菌污染情况，与普通的培养法相比，具有高效、高灵敏以及高精度的优点，能实现对血液及血制品细菌污染的快速、高灵敏以及高可靠性的实时检测，且不会降低血液及血制品的治疗效用。可见，本发明能为血液及血制品(尤其是血小板制品)的细菌污染检测技术的发展提供理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例3中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌基因组浓度梯度标准曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：试验材料及仪器
(1)菌毒株与血液标本
金黄色葡萄球菌(Staphylococeucus aurs,ATCC 25293)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,2265)均由本实验室保存。
机采血小板标本采自健康献血者，志愿者需满足以下条件：
(1)年龄在18至55岁之间；(2)体重大于等于50公斤；(3)未孕；(4)没有严重的疲劳、贫血、胰岛素依赖型糖尿病或传染病；(5)排除正在接受某些医学治疗(例如抗生素，全身性皮质类固醇或抗癫痫治疗)的志愿者；(6)献血前均未使用抗生素等药物。
(2)仪器与试剂
恒温摇床(上海，一恒科学仪器)；
生物安全柜(上海，力申科学仪器)；
分光光度计(德国，Eppendorf公司)；
超微量分光光度计(美国，DeNovix公司)核酸提取仪(西安，天隆科技)；
微流控芯片检测平台(杭州，比芯生物)；
细菌DNA提取试剂盒(西安，天隆科技)；
Real-time FQ-PCR反应预混体系(杭州，比芯生物)。
(3)微流控芯片设计
本发明所用的微流控芯片是由聚碳酸酯(PC)和聚乙烯(PE)材料制作而成，左右分为2列，每列8通道，每通道包含一条U型毛细管道，体积为8uL，可同时检测16个PCR反应。
实施例2：血液及血制品细菌污染检测
(1)模拟细菌污染血液标本的制备
分别挑取金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌单菌落接种于LB液体培养基中，在含氧条件下37℃，180转/min顺时针水平旋转培养。增菌至A600＝0.5后，分别吸取5mL一定浓度的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液标本，3000rpm离心5min后与1mL无菌机采血小板浓缩液混合，以此作为细菌污染初始浓度。接着以无菌机采血小板浓缩液进行10倍梯度稀释，模拟成细菌浓度为100-108CFU/mL细菌污染的血液标本。
(2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取
取上述获得的血液标本的10-5～10-8浓度梯度稀释液涂布细菌计数平板，每个浓度设3个重复，每板各涂布100ul，37℃培养48h后计算菌落形成单位(CFU)。
将上述模拟各细菌污染初始浓度标本分别进行细菌基因组DNA的提取，同时另取1mL未接入细菌的机采血小板浓缩液进行细菌基因组DNA的提取，作为空白对照。使用超微量分光光度计测定核酸浓度，留取质量达标的DNA(A260/A280值在1.8～2.0之间、A230/A260值小于0.7)于-20℃保存备用。
(3)FQ-PCR引物及探针(见表1)
表1 16srDNA探针和引物序列
(4)微流控芯片FQ-PCR反应
FQ-PCR反应体系为8ul，组成如下：2×mix 4ul，上下游引物(10uM)各0.4ul，Taqman探针(10uM)0.4ul，去离子水2.4ul，DNA模板0.4ul。
将配置好的检测体系灌入芯片的反应槽中，用硅胶垫封闭进口和出口，放置于微流控芯片检测平台，进行PCR反应和荧光数据收集。条件设置如下：97℃预变性8s；以97℃7s，60℃14s，扩增40循环，在60℃进行单点荧光检测。
实施例3：检测结果评价
(1)灵敏度评价
将已提取的细菌基因组DNA进行10倍梯度稀释至10-5，并以浓度10-1～10-5分别进行荧光定量PCR反应。每个梯度重复8次实验，7次以上阳性的为有效检测浓度，以最低有效检测浓度作为灵敏度极限。
根据细菌计数实验，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液的起始浓度分别为8.65×106CFU/mL和8.85×107CFU/mL。通过连续稀释两种细菌的基因组DNA，并进行微流控FQ-PCR反应，根据各反应管所测得Ct值(x)与菌液浓度对数值(y)之间的对应关系，得到所检测细菌(金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)的标准曲线：Y1＝-0.2843X+13.467(R2＝0.9954)，Y2＝-0.3217X+13.747(R2＝0.9937)，见图1。
如图1所示，对于血小板的金黄色葡萄球菌污染，该方法的检测灵敏度为865CFU/mL，而对铜绿假单胞菌的检测灵敏度为885CFU/mL。
(2)特异性评价
为了评估16sDNA引物和探针的特异性，选取金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表，且所有标本均混合含有人类基因组DNA，利用空白对照可直接评价体系的特异性，当空白对照与细菌灵敏度极限浓度的CT值之差越大，特异性越好。
根据上述获得的灵敏度数据，选择两个菌种的灵敏度极限浓度进行检测，同时设置空白对照和以无菌水作模板的阴性对照，每个菌种均统计10个空白对照的CT值，并计算与该细菌灵敏度极限浓度的CT值之差。
分别以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为阳性参照评估该体系中16sDNA引物和探针的特异性，此探针和引物对阳性参照均有反应，与空白对照(人类基因组)无反应(CT值均>38)。
当金黄色葡萄球菌含菌量为865CFU/mL，铜绿假单胞菌含菌量为885CFU/mL时，各统计10个空白对照的CT值(阴性结果CT值按40计算)，并计算与细菌阳性标本的差，结果如表2。
表2微流控FQ-PCR芯片体系的特异性评价
(3)重复性试验
将已提取的细菌基因组DNA进行10倍梯度稀释至10-5，，选取10-1～10-5浓度做重复性试验，每个稀释度做15次重复，通过计算Ct值的差异来验证荧光定量PCR反应系统的准确率与稳定性。
重复性指数公式为：
(n为测量次数，xi为每次测试的结果，x为多次测试的平均值)。
根据重复性计算公式，以各浓度菌液提取的DNA进行FQ-PCR扩增后的CT值计算重复性指数，如表3所示。
(4)统计学分析
采用GraphPad Prism 6.01软件统计作图，实验结果以“均数±标准差(x±s)”表示，用成组t检验统计学方法比较实验组(灵敏度极限浓度)和空白对照组的检测结果差异，P＜0.05代表有统计学意义。
表3微流控FQ-PCR芯片体系的重复性评价
序列表
<110> 宁波市中心血站
<120> 一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctacgggng gcwgcag 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctttacgccc artaattccg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtattaccg cggctgctgc ac 22
Claims (10)
1.一种微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于包括以下步骤，
(1)模拟细菌污染血液标本的制备：挑取污染模拟细菌进行培养，培养至一定浓度后与备用的无菌血小板浓缩液混合，混合液经稀释后获得所需的细菌污染模拟血液标本；
(2)细菌计数及细菌基因组DNA的提取：提取上述细菌污染模拟血液标本的DNA，并对提取的DNA进行核酸浓度检测，选取浓度达标的DNA，保存备用；
(3)微流控芯片FQ-PCR反应：设计FQ-PCR引物及Tagman探针，利用微流控芯片进行PCR反应并收集荧光数据。
2.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的污染模拟细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
3.如权利要求2所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，而所述革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌单菌。
4.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的细菌污染模拟血液标本中的细菌浓度为100～108CFU/mL。
5.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取的DNA的浓度标准为：A260/A280值在1.8～2.0之间，A230/A260值小于0.7。
6.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的FQ-PCR引物的序列为：
上游5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，
下游5’-CTTTACGCCCARTAATTCCG-3’。
7.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中所用的探针为Tagman探针。
8.如权利要求7所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述Tagman探针序列为：5’FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGCAC-TAMRA 3'。
9.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的FQ-PCR反应的反应条件为：97℃预变性8s，以97℃7s、60℃14s、扩增40循环，在60℃进行单点荧光检测。
10.如权利要求1所述的微流控血液及血制品细菌污染检测方法，其特征在于，所述步骤(3)微流控芯片包括16条U型毛细管道状的通道，各通道能分别进行FQ-PCR反应。
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