KR940000541B1 - 인체고유 감마-인터페론의 제조방법 및 혈액의 감마-인터페론 생산능력 검정방법 - Google Patents

인체고유 감마-인터페론의 제조방법 및 혈액의 감마-인터페론 생산능력 검정방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

인체고유 감마-인터페론의 제조방법 및 혈액의 감마-인터페론 생산능력 검정방법
본 발명은 인체 전혈(全血 : Whole blood)을 사용해서 인체고유-감마-인터페론 (이후 "HuIFN-감마"로 약칭한다)을 제조하는 방법과 인체혈액의 HuIFN-감마 생산능력을 검저하는 방법에 관한 것이다.
최근에는 혈청효소와 그 대사산물의 수준을 화학적 방법으로 측정하는 임상시험이 광범위하게 사용되고 있다.
혈액 성분의 하나인 HuIFN-감마는 극미량으로 존재하기 때문에 이같은 제안은 실현성이 희박하였다. 혈액은 그 내부에 적혈구, 백혈구 및 혈소판과 같은 구성요소가 현탁되어 있는 유체인 혈장(plasma)으로 구성된다.
성인혈액 1mm3에는 일반적으로 7.4×103개의 백혈구와 3×105개의 혈소판 이외에 남자의 경우 5.4×106개의 적혈구, 또 여자의 경우 4.8×106개의 적혈구를 포함하고 있다.
HuIFN-감마가 인체 백혈구에 의해 생산된다는 것은 공지된 사실이다. HuIFN-감마를 제조하는 종래의 방법에서는, 인체 혈액에서 분리한 생존 백혈구가 사용되었다. 예를들어, Y.K.Yip 등의 Infection and Immunity, Vol. 34.131 내지 139페이지(1981)과 T.Kasahara 등의 The Journal of Immunology, Vol.130, No.4, 1784 내지 1789페이지(1983)로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 백혈구를 전혈(全血)에 존재하는 기타 요소로부터 분리한 다음 이를 방치시켜서 HuIFN-감마를 분비시킬 수가 있다.
그러나, 이들 종래의 방법에 대한 구체적인 연구 결과로부터 이들 방법은 혈액에서 회수한 백혈구 회수율이 30 내지 50% 등으로 낮고 또 분비과정중 백혈구가 손상을 입어 그 생존율이 40 내지 60%로 떨어져서, 결과적으로 전체회수율을 약 10 내지 30%로 저하시킬 뿐만 아니라, 분리된 백혈구는 조화를 이룰 수 없는 HuIFN-감마를 생산하게 된다는 것을 확인하였다.
이는 혈액 HuIFN-감마생산능력을 측정을 매우 어렵게 만들며, 또 HuIFN-감마의 대량생산에 장애가 되고 있다.
본 발명자는 귀중한 인체혈액을 사용하는 HuIFN-감마의 대량생산방법과 공여된 혈액을 사용하는 혈액 HuIFN-감마생산능력 검정방법에 대해 장기간에 걸쳐 연구를 행한 결과, 전혈을 항응고체와 감마-인터페론 유발제(IFN-감마유발제)에 노출시키면서 용기내에서 배양해줌으로써 다량의 HuIFN-감마를 쉽게 제조할 수 있다는 사실을 발견하였다.
본 발명자는 또한 전혈을 항응고제와 HuIFN-감마유발제에 노출시키면서 용기내에서 배양하고 또 축적된 HuIFN-감마를 적정(滴定)해줌으로써 혈액 HuIFN-감마생산능력을 용이하게 또 재현성 좋게 측정할수가 있다는 사실을 발견하였다.
구체적으로 연구한 결과 IFN-감마유발제에 대한 노출은 전혈 1ml당 10 내지 10,000개의 미생물이 바람직하다는 사실이 확인되었다. 용어 "전혈"은 공혈자(供血者)로부터 수거한 신선한 혈액제제 또는 이 신선한 혈액제제로부터 혈장액을 제거한 후 잔존구성요소들을 식염수, 완충액 또는 영양배지 등의 비혈장액에 현탁시켜서 수득한 현탁액을 의미한다.
본 발명에서 사용가능한 항응고제는 전혈의 응고를 방지하고 또 HuIFN-감마생산에 영양을 미치지 않는 물질로서, 이같은 항응고제의 예로는 헤파린, 산-시트레이트-덱스트로즈(ACD) 및 시트레이트-포스페이트-덱스트로즈(CPD)를 들 수가 있다.
본 발명에서 사용가능한 IFN-감마유발제는 전혈내에서 HuIFN-감마의 생산을 유발시키는 물질들로서, 이같은 IFN-감마유발제의 예로는 식물성혈구응집소; 큰카나발린 A; 아메리카 자리콩(pokeweed) 유사 분열물질(mitogen); 포도상구균성 장독소 SEA); 지방다당류; 균체내독소; β-글루칸 및 아라비노갈락탄을 포함하는 다당류와 같은 유사분혈물질과 슈도모나스(pseudomonas)속과 코린박테리움(Corynebacterium)속을 포함하는 박테리아를 들 수 있다.
본 발명자는 특히 식물성혈구응집소가 일반적으로 10 내지 30시간의 비교적 짧은 시간내에 높은 HuIFN-감마역가(titer)를 유발시킨다는 사실을 발견하였다.
IFN-감마유발제 접종물용으로 적당한 범위는 전혈 1ml당 10 내지 10,000개의 미생물이다. 비루스 및 핵산과 같은 1개 또는 그 이상의 알파-인터페론유발제(HuIFN-알파유발제)를 HuIFN-감마유발제와 함께 사용해서 HuIFN-감마생산을 촉진시키고 또는 HuIFN-알파생산을 동시에 유발시킬 수 있다.
전혈을 항응고제와 IFN-감마유발제 존재하의 용기내에서 배양하는 단계는 이 전혈이 항응고제와 IFN-감마유발제와 용기내에서 접촉해서 HuIFN-감마를 분비시키는 방식으로 진행된다.
예를들어, 전술한 양의 항응고제와 IFN-감마유발제가 담긴 용기에 적당한 량의 전혈을 첨가해주고 또 이 혼합물을 용기내에서 배양한다.
이와는 달리, 항응고제와 전혈의 혼합물을 용기에 담고 여기에 IFN-감마유발제를 첨가한 후 용기내에서 배양할 수도 있다.
이 배양단계에서는 식염수, 등장성 완충액 또는 영양 배지등의 적당한 매질을 첨가해줄 수도 있다.
탱크, 쟈-르(jar), 플라스크, 시험관, 앰풀 및 마이크로 프레이트웰(micro plate well)은 그 형태나 용량에 상관없이 용기로 사용될 수 있다. 배양조건은 HuIFN-감마가 생산될 수 있는 조건으로서 예를들어 온도 범위 30 내지 40℃ 및 배양시간 10 내지 90시간 등이다. 필요한 경우 HuIFN-감마생산도중에 프라이밍(priming)과/또는 중복유발을 행해줄 수 있다.
이어서 HuIFN-감마를 제조하기 위해 배양한 전혈을 경우에 따라 식염수 또는 등장성 완충액으로 희석하고 또 원심분리기 또는 여과와 같은 적당한 방법으로 분리해서 혈액세포와 같은 구성용소들을 제거해준다음 HuIFN-감마를 함유하는 상청액 또는 여과액을 정제하거나 HuIFN-감마적정(滴定)을 행하여 준다.
HuIFN-감마는 염석(鹽析), 투석(透析), 여과, 농축, 이온교환수지에 의한 흡착 및 탈착, 겔여과, 항체와 같은 적당한 리간드를 사용하는 친화성 크로마토그래피, 등전점분별 및 전기영동등의 종래의 방법을 결합해서 쉽게 정제할 수 있으며, 이같이해서 고순도 HuIFN-감마를 수득할 수 있다.
이같이 해서 수득한 HuIFN-감마는 인체의 질병예방과 치료를 위한 주사제 또는 내부용 또는 외부용약제로서 유익하게 사용될 수 있다.
이는 단독 또는 항비루성 약제, 면역활성제, 항부종성약제 등의 1개 또는 그 이상물질과 결합해서 사용할 수 있다. 전혈에 의해 생상된 HuIFN-감마를 적정할 수 있는 검정방법인 한 어떤 방법이라도 본 발명에서 사용될 수 있다.
특히 적합한 검정방법으로는 생물학적 검정방법, 방사면역적 검정방법과 효소결합 이뮤노소르벤트(immunosorbent) 검정방법이 있다.
최근에, 효소결합 이뮤노소르벤트 검정방법이 안정성이 높고, 편리하며, 또 신속한 검정방법으로 개발되었다.
HuIFN-감마가 항원으로 적정될 수 있는 검정방법인 한 어떠한 효소결합 이뮤노소르벤트 검정방법이라도 사용할 수 있다.
이같은 효소결합 이뮤노소르벤트 검정방법의 예로는 2중항원 샌드위치방법과 개질된 2중항원 샌드위치방법을 들 수가 있다.
이같은 방식으로 측정된 HuIFN-감마생산능은 각개 공혈자를 임상적으로 시험하는데 유용하다는 사실이 확인되었다.
본 발명에 따른 방법에 의하여 암환자로부터 수거한 혈액이 건강한 공혈자로부터 수거한 혈액에 비해서 HuIFN-감마생산능이 크게 떨어진다는 사실을 확인하였다.
다음 실험들은 본 발명을 보다 상세하게 설명할 것이다.
실험 1 : 혈액 HuIFN-감마생산능에 대한 전처리효과;
혈액 HuIFN-감마생산능에 대한 전처리효과에 대해 조사하였다. 이 실험에서 3명의 건강한 공혈자(供血者)로부터 수거한 신선한 혈액시료를 헤파린화 시킨후 사용하였다.
본 실험에 사용된 처리된 혈액은 다음과 같았다 : 혈액을 원심분리해서 혈장액을 제거하고 또 혈액에서와 동일한 구성요소밀도를 갖도록 잔존구성 요소들을 RPMI 1640 배지에 현탁시켜서 수득한 혈장이 제거된 현탁액; 혈액을 0.75% 염화암모늄함유 트리스-HCl 완충액(pH 7.2)으로 통상의 방법에 따라 처리해서 적혈구의 응혈반응을 진행시키고, 이 혼합물을 원심분리하고 수득한 적혈구 분리구성요소들을 혈액에서와 동일한 구성요소밀도를 갖도록 RPMI 1640 배지에 현탁시켜서 수득되는 염화암모늄-처리현탁액.
헤파린화 시킨 혈액이나 또는 처리된 혈액의 1ml 분취량을 플라스틱 시험관에 넣은 다음 여기에 식물성 혈구응집소-P를 각각 O, 50 또는 500개 되는 양의 미새울을 함유하는 식염수 0.1ml 분취량을 첨가하고 37℃에서 24시간 배양하였다.
이 배양혼합물을 원심분리해서 수득한 상청액으로 HuIFN-감마역가/ml 전혈을 검정하였다. HuIFN-감마역가는 영국 버크샤 소재의 Celltech Limited가 시판하고 있는 HuIFN-감마용 방사선면역 검정키트인 "GAMMA INTERFERON IRMA KIT"를 사용해서 측정하였다.
측정결과는 다음 표 1에 수록하였다.
이들 시험결과로부터 전혈 및 혈액의 전체구성요소들을 함유하는 혈장이 제거된 현탁액은 HuIFN-감마역가가 높고 또 일정하기 때문에 혈액 HuIFN-감마생산능을 측정하기 위한 시료로서 적합하다는 사실을 명백히 확인할 수 있었다.
또한 적혈구들이 응혈반응해서 제거시킨 염화암모늄-처리 현탁액은-감마역가가 낮고 일정하지 않다는 사실도 확인되었다.
[표 1]
Figure kpo00001
실험 2 : 혈액 HuIFN-감마생산능에 대한 IFN-감마유발제 접종물의 효과
혈액 HuIFN-감마생산능에 대한 IFN-감마유발제 접종물의 효과에 대해 조사하였다. 3명의 건강한 공혈자와 간암환자 및 위암 환자 등 2명의 암환자로부터 새로이 수거한 혈액시료를 헤파린화시킨 후 사용하였다.
실험 1에서의 방법에 따라, 헤파린화시킨 혈액시료 1ml씩을 시험관에 각각 취하고, 여기에 IFN-감마유발제로서 식물성 혈구응집소-P를 각각 0, 1, 10, 100, 1,000, 10,000미크로그람 함유하는 식염수 0.1ml분취량을 첨가해서 배양한 후 혈액 1ml당 HuIFN-감마역가를 검정하였다. 혈액 1ml당 100,000미크로그람의 식물성 혈구응집소-P를 사용하는 일련의 실험을 행하였으나, 이같이 많은 양의 식물성 혈구 응집소의 용해에 실패하였기 때문에 실험결과는 생략하였다. 수득 시험결과는 다음 표 2에 수록하였다.
[표 2]
Figure kpo00002
주 : ND는 측정하지 않음, 환자 G는 간암환자 또, 환자 H는 위암환자를 의미한다. 이들 측정결과로부터 10 내지 10,000 미크로그람/ml 혈액의 IFN-감마유발제 접종물의 사용이 바람직하다는 사실을 명백히 확인할 수 있었다. 또한 암환자로부터 수거한 혈액이 건강한 공혈자로부터 수거한 혈액에 비하여 HuIFN-감마생산능이 크게 떨어진다는 사실이 확인되었다.
전혈 1ml당 100미크로그람의 IFN-감마유발제를 사용해서 20명의 건강한 공혈자와 20명의 암환자로부터 수거한 전혈시료의 HuIFN-감마생산능을 측정한 결과, 건강한 공혈자의 HuIFN-감마생산능은 420±100단위/ml 혈액임에 반하여, 암환자의 생산능을 10±10단위/ml 혈액임이 밝혀졌다.
이는 공여된 혈액의 HuIFN-감마생산능을 검정함으로서 암을 그 초기단계에서 발견할 수 있음을 제시하고 있다.
본 발명의 몇가지 실시태양을 다음에 기술하였다.
[실시예 A]
혈액 HuIFN-감마생산능의 검정
[실시예 A-1]
28세의 건강한 남자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤파린화시킨 혈액시편 1ml를 플라스틱 시험관에 넣고 또 여기에 250 미크로그람의 식물성혈구 응집소-P를 첨가해서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
이 배양혼합물을 원심분리해서 수득한 상청액으로 실험 1에서와 유사하게 방사능 면역검정 키트로서 HuIFN-감마역가를 측정하였다. HuIFN-감마생산능은 약 420단위/ml 혈액이었다.
[실시예 A-2]
33세의 건강한 여자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤라핀화시켜 수득한 혈액시료 1ml에 500미크로그람의 콘카나발린 A를 첨가하고 37℃에서 64시간 동안 배양한 다음 이 배양혼합물을 실시예 A-1에서와 유사하게 HuIFN-감마역가를 측정하였다. HuIFN-감마생산능은 약 380단위/ml 혈액이었다.
[실시예 A-3]
61세의 건강한 남자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤파린화시켜 수득한 혈액시료를 원심분리해서 혈장을 제거하였다.
이어서 이같이 수득한 구성요소들을 식염수와 함께 원심분리하여 세척을 행하고 또 원래 혈액에서와 동일한 요소밀도를 유지하도록 RPMI 1640배지에 현탁시켰다.
수득한 현탁액 1ml를 플라스틱 시험관에 넣고, 300미크로그람의 아메리카 자리콩(pokeweed) 유사분열물질을 첨가해서 37℃에서 48시간 동안 배양한 다음 수득한 혈액시편의 HuIFN-감마역가를 2중항원 샌드위치법인 효소결합 이뮤노소르벤트 검정방법으로 검정하였다.
HuIFN-감마생산능은 약 200단위/ml 혈액이었다. 효소결합 이뮤노소르벤트 검정방법으로 측정한 값은 방사능면역 검정값과 양호하게 일치하였다.
[실시예 A-4]
58세 남자 폐암환자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤파린화시킨 혈액시료를 실시예 A-1에서와 유사하게 처리해서 약 20단위/ml 혈액정도의 HuIFN-감마생산능을 수득하였다.
[실시예 A-5]
55세 여자 자궁암 환자로부터 재취한 신선한 혈액을 헤파린화시킨 혈액시료를 실시예 A-1에서와 유사하게 처리해서 약 10단위/ml 혈액정도의 HuIFN-감마생산능을 수득하였다.
[실시예 B]
HuIFN-감마의 생산
[실시예 B-1]
건강한 공혈자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤파린화시킨 혈액시료 1ml를 플라스틱 시험관에 넣고 250미크로그람의 식물성 혈구응집소-P를 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
이 배양혼합물을 원심분리해서 수득한 상청액을 사용하여 HuIFN-감마역가를 검정하였다. HuIFN-감마생산은 약 420단위/ml 혈액이었다.
[실시예 B-2]
건강한 공혈자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤파린환시켜 수득한 혈액 시료 1ml에 500미크로그람의 콘가나발린 A를 첨가하고 37℃에서 64시간 동안 배양한 후 HuIFN-감마역가를 측정하였다. HuIFN-감마생산은 약 380단위/ml 혈액이었다.
[실시예 B-3]
건강한 공혈자로부터 채취한 신선한 혈액을 헤파린화시켜 수득한 혈액시료를 원심분리해서 혈장을 제거하고 또 잔류 구성요소들을 식염수로 원심분리하여 세척하였다.
이어 구성요소들을 혈액에서와 동일한 요소밀도를 갖도록 RPMI 1640 배지에 현탁시켰다. 이어 이 현탁액을 소형 자-르(jar)에 옮기고 아메리카 자리콩 유사분열 물질을 200미크로그람 ml 현탁액의 양으로 첨가한 후 37℃에서 64시간 동안 배양하고 또 실시예 B-1에서와 유사하게 HuIFN-감마역가를 측정하였다.
HuIFN-감마생산은 약 240단위/ml 혈액이었다.
[실시예 B-4]
혈액 구성요소의 현탁액을 실시예 B-3에서와 유사하게 제조하였다. 이 현탁액을 소형 쟈-르에 옮기고 식물성 혈구 응집소-P를 500미크로그람/ml 현탁액의 양으로 첨가한 후 37℃에서 28시간 동안 배양하고, 또 실시예 B-1에서와 유사하게 HuIFN-감마역가를 측정하였다. HuIFN-감마생산은 약 600단위/ml 혈액이었다.
본 발명 기술분야에서 숙련된자라면 본 발명 범주를 벗어나지 않는 범위내에서 각종 수정과 변경이 가능하다는 사실을 명백하게 알 수 있으며, 또 본 발명은 명세서 기재내용에만 국한되는 것이 아님을 주지해야만 할 것이다.

Claims (14)

  1. 인체 전혈(全血)을 항응고제 및 감마-인터페론유발제(IFN-감마유발제)에 노출시키면서 배양하고; 또 축적된 HuIFN-감마를 회수함을 특징으로 하는 인체고유 감마-인터페론(HuIFN-감마)의 제저방법.
  2. 제1항에 있어서, IFN-감마유발제의 양이 10 내지 10,000미크로그람/ml 전혈의 범위인 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 산-시트레이트-텍스트로즈 및 시트레이트-포스페이트-덱스트로즈로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, IFN-감마유발제가 유사분열물질인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, IFN-감마유발제가 식물성 혈구 응집소 콘카나발린 A, 아메리카 자리콩 유사분열물질, 포도상구균성 장독소, 지방다당류, 균체내독소, 다당류, 박테리아 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질인 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 인체전혈을 30 내지 40℃ 온도범위에서 10 내지 90시간 동안 배양하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 공여된 혈액으로부터 혈장을 제기하고; 또 잔류구성요소들을 식염수, 등장성 완충용액, 또는 영양배지로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질에 현탁시켜서 인체 전혈을 수득하는 제조방법.
  8. 인체전혈을 항응고제 및 감마-인터페론유발제(IFN-감마유발제)에 노출시키면서 배양하고; 또 축적된 HuIFN-감마를 적정함을 특징으로 하는 인체혈액의 인체고유감마-인터페론(HuIFN-감마)생산능을 검정하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, IFN-감마의 양이 10 내지 10,000 미크로그람/ml 전혈의 범위인 검정방법.
  10. 제8항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 산-시트레이트-덱스트로즈 및 시트레이트-포스페이트-덱스트로즈로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상물질인 검정방법.
  11. 제8항에 있어서, IFN-감마유발제가 유사분열물질인 검정방법.
  12. 제8항에 있어서, IFN-감마유발제가 식물성 혈구응집소, 콘카나발린 A, 아메리카자리콩 유사분열 물질, 포도상구균성 장독소, 지방다당류, 균체내독소, 다당류, 박테리아 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 구성되는 군으로부터 선택된 물질인 검정방법.
  13. 제8항에 있어서, 인체전혈을 30 내지 40℃ 온도범위에서 10 내지 90시간 동안 배양하는 검정방법.
  14. 제8항에 있어서, 공여된 혈액으로부터 혈장을 제거하고; 또 잔류구성요소들을 식염수, 등장성 완충용액 또는 영양배지로 구성되는 군으로부터 선정된 물질에 현탁시켜서 인체전혈을 수득하는 검정방법.
KR1019850009586A 1984-12-30 1985-12-19 인체고유 감마-인터페론의 제조방법 및 혈액의 감마-인터페론 생산능력 검정방법 KR940000541B1 (ko)

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