ES2302855T3 - Dispositivo y procedimiento de concentracion y de deteccion de germenes patogenos a partir de productos sanguineos y/o de sus derivados. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de detección de gérmenes contaminantes eventualmente presentes en un producto sanguíneo que comprende células sanguíneas, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) se somete una muestra de dicho producto sanguíneo a un tratamiento de agregación de las células sanguíneas, b) se eliminan los agregados formados en la etapa (a) por pasada de la muestra tratada sobre un primer filtro que deja pasar los gérmenes contaminantes pero no los agregados de células, c) se lisaron selectivamente las células residuales del filtrado obtenido en la etapa (b), d) se recuperan los gérmenes contaminantes por pasada del lisato de la etapa (c) sobre un segundo filtro que deja pasar las restos celulares, e) se añade un agente de marcado de los gérmenes contaminantes, bien sea durante la agregación de la etapa (a), o bien durante la lisis de la etapa (c), y f) se analiza el segundo filtro para detectar los gérmenes contaminantes marcados eventualmente retenidos.

Description

Dispositivo y procedimiento de concentración y de detección de gérmenes patógenos a partir de productos sanguíneos y/o de sus derivados.
La presente invención tiene por objeto un procedimiento de concentración de gérmenes patógenos eventualmente presentes en los productos sanguíneos o derivados, así como la detección de dichos gérmenes así concentrados para efectuar un control de la patogenicidad de dichos productos sanguíneos.
Se entiende por producto sanguíneo tanto la sangre total, como cualquier preparación procedente del fraccionamiento de éste, que comprende o no componentes celulares, como ejemplo, se entiende por producto sanguíneo los concentrados de los glóbulos rojos o de plaquetas, y también las preparaciones plasmáticas o serosas.
La detección de contaminaciones de los productos sanguíneos y derivados por diferentes gérmenes patógenos, tales como bacterias, virus, mohos, levaduras u otros, es una de las grandes dificultades a las cuales se enfrentan hoy día las autoridades responsables de la salud pública, así como las industrias de la transfusión sanguínea.
Existen ensayos de detección, pero no son utilizables en rutinas hasta ahora.
La patente de EE.UU. nº 3.635.798 describe un procedimiento de concentración de microorganismos presentes en la sangre caracterizada por las siguientes etapas: adición de un agente de agregación para agregar células sanguíneas resultantes en su sedimentación, filtración de líquido sobrenadante para eliminar las células sanguíneas residuales, filtración de este filtrado para aislar las bacterias y detección de las bacterias.
La solicitud de patente alemana nº 19.801.090 describe un procedimiento de detección de microorganismos presentes en la sangre que comprende: lisis específico de las células sanguíneas, filtración para aislar las bacterias, detección de los microorganismos eventualmente después del marcado.
Las principales dificultades presentadas por la mayoría de las ensayos de detección de dichos gérmenes patógenos, entre una población o una subpoblación de células sanguíneas, reside en el hecho de que la mayoría de tratamientos considerados de extraer selectivamente los gérmenes patógenos, causan simultáneamente una eliminación de éstos.
Esta eliminación conduce casi sistemáticamente a una sub-evaluación de la presencia de dichos gérmenes en el producto sanguíneo ensayado, y en consecuencia a un aumento del riesgo sanitario.
Por lo tanto, la firma solicitante concibió un nuevo método rápido y sensible para detectar una contaminación de un producto sanguíneo o derivado, por tales gérmenes patógenos.
El procedimiento según la invención es notable porque se realiza directamente sobre una muestra procedente de un producto sanguíneo tomado de un sujeto, sin tratamiento o dilución preliminar.
El procedimiento de detección de gérmenes patógenos desarrollado por la firma solicitante consiste esencialmente en concentrar selectivamente dichos gérmenes patógenos, luego en detectarlos, una vez concentrados, por técnicas conocidas del experto en la técnica.
La concentración selectiva de los gérmenes patógenos se efectúa por eliminación secuencial o simultánea de las diferentes poblaciones de células sanguíneas presentes en una muestra de un producto sanguíneo.
El procedimiento de concentración de gérmenes patógenos según la invención incluye una primera etapa de concentración de los gérmenes patógenos que consiste en reducir la concentración de las poblaciones de las células sanguíneas por medio de una agregación selectiva de éstas, seguida de una filtración con el fin de recoger en el filtrado los gérmenes patógenos concentrados no agregados y en retener sobre el filtro los agregados de células sanguíneas.
Se entiende por agregación, en el sentido de la presente invención, cualquier acción que conduce a la formación de agregados celulares, y se entiende por agregado celular cualquier grupo de células que incluyen más de dos células y cuyo tamaño es superior al de una célula aislada. En el sentido de la presente invención, un agregado se puede obtener bien sea por agregación, tal como la agregación de las plaquetas subsecuentes a su activación, una aglutinación, tal como la aglutinación de los glóbulos rojos obtenida en cuanto éstos se encuentran en presencia de moléculas particulares, o bien una aproximación de las células induce por un cambio de la carga electrostática de sus membranas o también de otros mecanismos de adhesión o aproximación celular que conducen a la reagrupamiento de más de dos células.
Según modos de empleo preferidos, la agregación de las diferentes poblaciones de células sanguíneas se puede efectuar con la ayuda de compuestos que inducen la agregación plaquetaria, o con la ayuda de compuestos que inducen la aglutinación específica de los glóbulos rojos.
Se conoce por ejemplo que, en presencia de algunos compuestos, las plaquetas tienen la capacidad de agregarse. Estos agregados se pueden separar fácilmente de los gérmenes patógenos por filtración.
Los glóbulos rojos presentan igualmente algunas propiedades de aglutinación.
El procedimiento de concentración de gérmenes patógenos según la invención incluye una segunda etapa de reducción de la concentración de las poblaciones de las células mayoritarias en la sangre, a saber las plaquetas y los glóbulos rojos, que consiste en lisar las células aisladas no agregadas durante la primera etapa de agregación.
Esta segunda etapa de reducción de la concentración de las poblaciones de las células sanguíneas permite una reducción del orden de 4 log (desde 10^{9} a 10^{5} células/ml) por lo que se refiere a la concentración de las plaquetas y del orden de 5 log (desde 10^{10} a 10^{5}) por lo que se refiere a la concentración de los glóbulos rojos.
Más precisamente la invención tiene por objeto un procedimiento de concentración de gérmenes contaminantes eventualmente presentes en un producto sanguíneo que comprende células sanguíneas, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
a)
se somete una muestra de dicho producto sanguíneo a un tratamiento de agregación de las células sanguíneas,
b)
se eliminan los agregados formados en la etapa (a) por pasada de la muestra tratada sobre un primer filtro que deja pasar los gérmenes contaminantes pero no los agregados de células,
c)
se lisan selectivamente las células residuales del filtrado obtenido en la etapa (b),
d)
se recuperan los gérmenes contaminantes por pasada del lisato de la etapa (c) sobre un segundo filtro que deja pasar restos celulares.
e)
se añade un agente de marcado de los gérmenes contaminantes, bien sea en la agregación de la etapa (a), o bien en la lisis de la etapa (c), y
f)
se analiza el segundo filtro para detectar los gérmenes contaminantes marcados eventualmente retenidos.
Como ejemplo de agente de marcado de los gérmenes patógenos detectables por el procedimiento de la invención, se puede citar una solución de marcado que comprende un substrato esterásico tal como el ChemChrome V6.
También, como agente de marcado de los gérmenes patógenos detectables por el procedimiento de la invención, se puede utilizar una solución de marcado que comprende un anticuerpo marcado o un marcador de ácidos nucléicos. Preferentemente, el marcador será fluorescente o acoplado a un fluorocromo o a una enzima que permitirá la degradación
de un substrato que se vuelve así fluorescente, eventualmente la fluorescencia será detectada por una excitación láser.
El procedimiento de detección según la invención comprende igualmente la adición de un agente de permeabilización de los gérmenes contaminantes, que se puede añadir a al menos una de las etapas del procedimiento, bien sea durante la agregación de la etapa (a), bien en la lisis de la etapa (c), bien directamente sobre el segundo filtro durante la etapa (e) de análisis, o bien en varios de entre ellas.
Como ejemplo de agente de permeabilización de los gérmenes contaminantes, se pueden citar la polietilenimina, el diacetato de clorhexidina, el digluconato de clorhexidina, el ácido de etileno diamina tetracetato (EDTA) solo o en combinación con la nisina así como los detergentes de tipo N-Octil \beta-D-glucopiranósido, SDS, Tween, tritón, Brij, etc.
Según un modo particular de empleo del procedimiento de la invención, las células sanguíneas del producto sanguíneo son plaquetas o glóbulos rojos o una mezcla de éstos.
Según otro modo particular de empleo del procedimiento de la invención, las células sanguíneas del producto sanguíneo son plaquetas y el tratamiento de agregación de la etapa (a) comprende la puesta en contacto de la muestra con una composición de agregación que comprende al menos uno de los agentes de agregación elegidos del grupo que comprende:
-
\vtcortauna un anticuerpo específico de un antígeno plaquetario,
-
\vtcortauna un agonista fuerte de la activación plaquetaria, elegida entre: la trombina, el TRAP (Thrombin Receptor Activating Peptide), la tripsina, el colágeno, el tromboxano A2, el PAF (Platelet Activating Factor), el ionóforo A23187.
-
\vtcortauna un agonista débil de la activación plaquetaria, elegido entre ADP, adrenalina, ácido araquidónico, factor Von Willebrand, serotonina o epinefrina.
Ventajosamente la concentración de anticuerpos de tipo CD9 específico de un antígeno plaquetario en la composición de agregación está comprendida entre 0,5 \mug/ml y 100 \mug/ml, y preferentemente está comprendida entre 5 \mug/ml y 40 \mug/ml.
Aún ventajosamente, la concentración de agonista fuerte en la composición de agregación está comprendida entre:
-
\vtcortauna 0,5 UI/ml y 100 UI/ml y preferentemente entre 1 UI/ml y 20 UI/ml para un agonista de tipo trombina,
-
\vtcortauna 5 \mum y 200 \mum y preferentemente entre 10 y 100 \mum para un agonista de tipo TRAP,
-
\vtcortauna 1 nM y 500 nM y preferentemente entre 10 nM y 300 nM para un agonista de tipo tripsina,
-
\vtcortauna 0,05 \mug/ml y 50 \mug/ml y preferentemente entre 1 \mug/ml y 20 \mug/ml para un agonista de tipo colágeno,
-
\vtcortauna 0,01 \mug/ml y 5 \mug/ml y preferentemente entre 0,1 y 1 \mug/ml para un agonista del tipo tromboxano A2,
-
\vtcortauna 0,005 mg/ml y 1 mg/ml y preferentemente entre 0,05 y 0,5 mg/ml para un agonista del tipo PAF,
-
\vtcortauna 0,1 \mum y 100 \mum y preferentemente entre 1 \mum y 20 \mum para un agonista del tipo ionóforo A23187.
Ventajosamente la concentración de agonista débil en la composición de agregación esta comprendida entre:
-
\vtcortauna 0,5 \mum y 100 \mum y preferentemente entre 1 \mum y 20 \mum para un agonista del tipo ADP, del tipo adrenalina o del tipo epinefrina.
-
\vtcortauna 0,001 mM y 10 mM y preferentemente entre 0,01 y 5 para un agonista del tipo ácido araquidónico,
-
\vtcortauna 0,001 mg/ml y 1 mg/ml y preferentemente entre 0,01 mg/ml y 0,5 mg/ml para un agonista del tipo factor Von Willebrand,
-
\vtcortauna 0,05 \mum y 100 \mum y preferentemente entre 0,01 \mum y 50 \mum para un agonista del tipo serotonina.
De una manera totalmente preferente el anticuerpo específico de un antígeno plaquetario, se elige entre: un anticuerpo anti-CD9, CD32, anti-PTA1, CD42, anti-GpIIb/IIIa o anti-GpIV.
Según otro modo particular de empleo del procedimiento de la invención, el producto sanguíneo comprende glóbulos rojos y el tratamiento de agregación de la etapa (a) comprende la puesta en contacto de la muestra con una composición de aglutinación que comprende al menos un agente de aglutinación elegido entre las lecitinas, la polietilenimina, la polivinilpirrolidona (PVP), las gelatinas, los dextranos o los polietilenglicoles (PEG).
Ventajosamente dichas lecitinas presentan una actividad eritroaglutinina.
Preferentemente las lecitinas se eligen entre las lecitinas de Phaseolus vulgaris, Vicia sativa, Vicia faba o Eritrina corallodendron., Lens culinaris, Phytolacca Americana y Triticum vulgaris.
Ventajosamente la concentración de lecitina de tipo Phaseolus vulgaris en la composición de aglutinación está comprendida entre 10 \mug/ml y 200 \mug/ml.
Ventajosamente la concentración de polietilenimina en la composición de aglutinación, está comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen)
Muy preferentemente dichos dextranos se eligen entre el Dextrano 70, Dextrano 100, Dextrano 500, etc. Ventajosamente la concentración de dextrano en la composición de aglutinación está comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Preferentemente dichos PEG se eligen entre los PEG35, PEG, etc
Ventajosamente la concentración de PEG en la composición de aglutinación está comprendida entre 0,05% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Ventajosamente la concentración de gelatina en la composición de aglutinación está comprendida entre 0,5% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Preferentemente dichas PVP elegirse entre los PVP-40, PVP-360, etc
Ventajosamente la concentración de PVP en la composición de aglutinación está comprendida entre 0,05% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Ventajosamente, la lisis de las células de la etapa (c) se realiza con una solución de lisis que comprende uno o varios detergentes elegidos del grupo que comprende: saponina, SDS, Tween 20, Tritón X100, Brij 96, Polidocanol, N-Octil \beta-D-glucopiranósido o Carbonato de sodio.
Preferentemente, la solución de lisis está constituida por una mezcla de saponina, de Tritón X100 y de Tween 20, y muy preferentemente la solución de lisis comprende saponina con una concentración (expresada en % peso/volumen) comprendida entre 0,005% y 0,5%, del Tritón X100 en una concentración (expresada en % peso/volumen) comprendida entre 0,001% y un 0,5% del Tween 20 en una concentración comprendida entre 0,01% y 1%, del N-Octil \beta-D-glucopiranósido en una concentración comprendida entre 0,1% y 0,5%.
Ventajosamente, la permeabilización de las bacterias se realiza con una solución que comprende uno o varios reactivos elegidos del grupo que comprende: Clorhexidina (digluconato, diacetato), Polietilenimina, N-Octil \beta-D-glucopiranósido, Nisina sola o en combinación con EDTA.
Preferentemente, se utilizan los agentes permeabilizantes para la clorhexidina en una concentración (peso/volumen) comprendida entre 0,0001% (peso/volumen) y 0,1% (peso/volumen), para la polietilenimina una concentración comprendida entre 5 \mug/ml y 120 \mug/ml, para el N-Octil \beta-D-glucopiranósido en una concentración comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 0,5% (peso/volumen) y para la Nisina entre 0,1 \mug/ml y 0,5 \mug/ml sola o en combinación con el EDTA en una concentración comprendida entre 1 mM y 10 mM
El procedimiento de la invención se puede utilizar para concentrar y detectar numerosos gérmenes contaminantes de los productos sanguíneos, entre los cuales se pueden citar bacterias aerobias o anaerobias, mohos, levaduras, esporas de bacterias vivas y/o muertas.
Ventajosamente el tamaño de los poros del primer filtro empleado en el procedimiento de la invención está comprendido entre 2 \mum y 20 \mum.
Ventajosamente el tamaño de los poros del segundo filtro empleado en el procedimiento de la invención está comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
Ventajosamente la detección de los gérmenes contaminantes de la etapa (e) del procedimiento de la invención se realiza en un dispositivo cerrado.
Preferentemente, los gérmenes contaminantes capaces de ser concentrados según el procedimiento de la invención, se eligen entre el grupo de las bacterias aerobias o anaerobios, de los mohos, de las levaduras o las esporas de bacterias vivas y/o muertas, el tamaño de los poros del primer filtro está comprendido entre 2 \mum y 20 \mum, y el tamaño de los poros del segundo filtro está comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
Otras ventajas y características de la invención aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen y de las figuras en anexos en las cuales:
- la figura 1 ilustra el recuento de las plaquetas después de haber puesto en contacto los concentrados plaquetarios con diferentes concentraciones de trombina.
- La figura 2 ilustra el recuento de las plaquetas después de la agregación en presencia de ADP para 2 muestras plaquetarias.
- La figura 3 muestra el recuento de las plaquetas en presencia de anticuerpos CD9 (clon SN4) para 4 muestras plaquetarias.
- La figura 4 muestra los resultados del recuento de las plaquetas en presencia de dosis crecientes de anticuerpos CD9 (clon 6B1) utilizados sobre 3 ml de concentrado plaquetario.
- La figura 5 muestra la curva dosis respuesta obtenida en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos CD9 (clon SN4).
- La figura 6 ilustra la aglutinación de glóbulos rojos en presencia de la lecitina Phaseolus vulgaris utilizada en una concentración de 200 \mug/ml para 3 muestras de concentrados de glóbulos rojos.
- La figura 7 muestra los efectos de la solución de lisis sobre la recuperación de diferentes gérmenes patógenos en cultivos puros.
- La figura 8 muestra el efecto de la solución de lisis sobre la numeración plaquetaria de dos muestras de plaquetas.
- La figura 9 ilustra el efecto de la lisis sobre la numeración eritrocitaria de dos muestras diferentes de concentrados de glóbulos rojos.
- La figura 10 ilustra el recuento de las bacterias Escherichia coli en una muestra plaquetaria utilizando la polietilenimina (PEI) como agente permeabilizante para aumentar la penetración del marcador.
- La figura 11 ilustra el efecto de la concentración en N-octil \beta-D-glucopiranósido en la solución de lisis sobre cultivos de bacterias puras.
- La figura 12 ilustra un empleo particular del dispositivo de concentración de los gérmenes patógenos, que comprende:
-
\vtcortauna un primer depósito (1) estanco y estéril,
-
\vtcortauna un segundo depósito (2) estanco y estéril,
-
\vtcortauna un primer filtro estéril (3) colocado entre el primer depósito (1) y el segundo depósito (2),
-
\vtcortauna un segundo filtro estéril (4) colocado aguas abajo del segundo depósito (2)
-
\vtcortauna medios de unión (5) estancos y estériles colocados entre el primer depósito (1) y el primer filtro (3), entre el primer filtro (3) y el segundo depósito (2) y entre el segundo depósito (2) y el segundo filtro (4).
-
\vtcortauna medios de unión (6) estancos y estériles para conectar la bolsa que contiene el producto sanguíneo al primer depósito (1).
-
\vtcortauna una válvula antirretorno (7) colocada en la unión (6) que conecta la bolsa que contiene el producto sanguíneo al primer depósito 1.
-
\vtcortauna un sistema de aspiración de la muestra (8).
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados experimentales I. Concentración de gérmenes patógenos por medio de una etapa de agregación I. 1 Agregación de las plaquetas Ejemplo 1 Agregación con un agonista fuerte: la trombina
La trombina es un agonista fuerte de la agregación plaquetaria.
En los trabajos experimentales realizados por la firma solicitante en el marco de la presente invención, se prepararon algunas soluciones de trombina (referencia T8885 Sigma): en una concentración de 100 UI/ml cuando se utiliza a razón de 10 UI/ensayo y en forma de solución diluida (100 \mul de solución madre de trombina añadida de 900 \mul de tampón PBS), cuando se utiliza a razón de 1 UI/ensayo.
La agregación de las plaquetas por medio de la trombina incluye las siguientes etapas:
-
\vtcortauna Se coloca en un tubo 160 \mul de concentrado plaquetario al cual se añaden 20 \mul de tampón PBS y 20 \mul de trombina
-
\vtcortauna se agitan manualmente los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente.
-
\vtcortauna Se añaden a dichos tubos 800 \mul de tampón PBS.
-
\vtcortauna Se filtra el contenido de los tubos sobre un filtro de porosidad 11 \mum.
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie 1/20 a 1/10 a partir de los filtrados.
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de cada dilución del filtrado sobre una membrana CB04.
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico.
-
\vtcortauna Se cuentan las plaquetas eventualmente retenidas con la membrana.
La tabla 1 siguiente ilustra los resultados obtenidos y representa el número de agregados plaquetarios obtenidos en presencia de trombina utilizada en dos concentraciones diferentes y la figura 1 anexa ilustra gráficamente estos resultados.
\global\parskip0.900000\baselineskip
TABLA 1
1
Ejemplo 2 Agregación de las plaquetas con trombina en presencia de gérmenes patógenos
Los trabajos experimentales empleados con el fin de evaluar la agregación de los gérmenes patógenos en presencia de trombina incluyen las siguientes etapas:
-
\vtcortauna Se introduce una crioesfera de E. coli en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Se añaden a 160 \mul de concentrado plaquetario 20 \mul de la suspensión de E.coli y 20 \mul de trombina.
-
\vtcortauna Se agita manualmente el tubo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
-
\vtcortauna Se añaden 800 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se filtra a través de un filtro de porosidad 11 \mum,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 1/20 y 1/10 y 1/10,
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra, sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico
-
\vtcortauna Se efectúa la detección.
La tabla 2 siguiente muestra la agregación de los concentrados plaquetarios con trombina en presencia de E. coli.
TABLA 2
2
Después de adición de la trombina, aparece casi instantáneamente un coágulo.
Ejemplo 3 Agregación de las plaquetas en presencia de un agonista débil: el ADP
Se utiliza ADP (SIGMA) en una concentración de 200 \mum en agua destilada.
Los trabajos experimentales empleados con el fin de evaluar la agregación de las plaquetas en presencia de ADP incluyen las siguientes etapas:
-
\vtcortauna Se introduce en un tubo 400 \mul de concentrado plaquetario, al cual se añaden 50 \mul de tampón PBS y 50 \mul de ADP,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente,
\global\parskip1.000000\baselineskip
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampones PBS,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie de 1/20 y 1/10 y 1/10
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04,
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico, y
-
\vtcortauna Se efectúa la detección.
Los resultados ilustrados en la figura 1 ponen de manifiesto que, en presencia de ADP, la concentración de plaquetas se reduce de aproximadamente 50% a aproximadamente 90%.
Ejemplo 4 Agregación plaquetaria con el ADP en presencia de gérmenes patógenos
La agregación de las plaquetas en presencia de ADP incluye las siguientes etapas:
-
\vtcortauna Se introduce una crioesfera de Staph epidermidis en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Sobre 400 \mul de concentrado plaquetario se añaden 50 \mul de la suspensión de Staph epidermidis y de 50 \mul de ADP,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie 1/20 y 1/10 y 1/10,
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico,
-
\vtcortauna Se efectúa la detección.
Se siembran los gérmenes patógenos en una elevada concentración para aumentar un posible efecto de atrapamiento. El ADP se añade a las plaquetas y a las bacterias en una concentración de 10 \mum.
TABLA 3
3
Los resultados obtenidos, representados en la tabla 3 mostrada más arriba ponen de manifiesto que 74% de bacterias se recuperan después de la etapa de agregación.
Ejemplo 5 Agregación de las plaquetas en presencia de un anticuerpo CD9
Se conoce que el anticuerpo CD9 induce la activación de las plaquetas y por lo tanto su agregación. Los ensayos descritos se realizaron con dos clones CD9, el clon SN4 (Ancel, ref 156-020, concentración 100 \mug/ml) y el clon 6B1 (Hemosystem).
\global\parskip0.900000\baselineskip
El procedimiento de agregación selectiva empleado con este anticuerpo CD9 incluye las siguientes etapas:
-
\vtcortauna Sobre 400 \mul de concentrado plaquetario se añaden 50 \mul de tampón PBS y 50 \mul de anticuerpo CD9,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie 1/20 y 1/10 y 1/10,
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04,
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico,
-
\vtcortauna Se efectúa la detección
Se utilizó el anticuerpo CD9 (clon SN4) en presencia de las plaquetas en una concentración final de 10 \mug/ml.
La figura 2 adjunta ilustra la agregación de las plaquetas obtenida en presencia de anticuerpo CD9 (clon SN4). Con el fin de evaluar la concentración óptima del anticuerpo CD9 necesario para la agregación plaquetaria, se estableció una curva dosis respuesta.
Método
-
\vtcortauna Sobre 400 \mul de concentrado plaquetario colocados en tubos se añaden diferentes diluciones de anticuerpos, con concentraciones finales que van de 0 a 20 \mug/ml de anticuerpos CD9.
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 4 diluciones 1/10
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico,
-
\vtcortauna Se efectúa la detección
Las figuras 3 y 5 muestran respectivamente los resultados del recuento de las plaquetas agregadas en presencia de dosis crecientes de anticuerpos CD9 (clon SN4) y la curva dosis respuesta así obtenida.
El recuento de las plaquetas residuales se efectúa con el analizador.
La agregación es dosis-dependiente. Para aumentar el efecto de agregación, la concentración en CD9 se aumentó en la medida de lo posible. Sin embargo se estableció un compromiso para la detección de las bacterias, y se determinó que se puede reducir la concentración plaquetaria de 1 a 2 Log utilizando una concentración de aproximadamente 10 \mug/ml de anticuerpos CD9.
Ejemplo 5 bis
Con el fin de evaluar la concentración óptima del anticuerpo CD9 (clon 6B1) necesario para la agregación plaquetaria, se estableció una experimento del tipo dosis-respuesta
Método
-
\vtcortauna Sobre 3 ml de concentrado plaquetario colocados en tubos se añaden diferentes diluciones de anticuerpo, con concentraciones finales que van de 2,5 \mug/ml a 40 \mug/ml de anticuerpo CD9.
-
\vtcortauna Se agitan los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum
-
\vtcortauna Se efectúa la numeración de las plaquetas tal como se describe más arriba.
La figura 4 adjunta muestra los resultados del recuento de las plaquetas agregadas en presencia de dosis crecientes de anticuerpo CD9 (clon 6B1).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Agregación plaquetaria con el anticuerpo CD9 en presencia de bacterias Método
-
\vtcortauna Se introduce una crioesfera de Staph epidermidis en un tubo de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Sobre 400 \mul de concentrado plaquetario colocados en tubos se añaden 50 \mul de la suspensión de Staph epidermidis y 50 \mul de CD 9,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 4 diluciones 1/10
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico.
-
\vtcortauna Se efectúa la detección
La tabla 4 siguiente ilustra la agregación de las plaquetas con el CD9 en presencia de bacterias.
TABLA 4
4
Estos resultados ponen de manifiesto que las bacterias Staph epidermidis se recuperaron bien. Para E. coli se reduce el recuento un 36%.
I. 2. Aglutinación de glóbulos rojos
Las lecitinas son glicoproteínas de origen no inmune que aglutinan las células y/o precipitan complejos carbohidratos. Estas moléculas se vinculan generalmente con carbohidratos específicos.
En el marco de estos trabajos experimentales, se utilizaron dos lecitinas:
-
\vtcortauna Phaseolus vulgaris PHA- E
-
\vtcortauna Vicia sativa
Ejemplo 1 Aglutinación de glóbulos rojos con lecitinas
La lecitina Phaseolus vulgaris PHA- E (Sigma) se utilizó en una concentración de 2 mg/ml en el PBS.
La lecitina Vicia Activa (Sigma) se utilizó en la concentración de 1 mg/ml.
Una evaluación rápida de las dos lecitinas permitió comprobar que no hay aglutinación de los glóbulos rojos con Vicia sativa. Por otra parte Phaseolus vulgaris induce una aglutinación rápida y eficaz.
Método
-
\vtcortauna 400 \mul de glóbulos rojos se colocan en tubos a los cuales se añaden 50 \mul de PBS y 50 \mul de Phaseolus vulgaris,
-
\vtcortauna Se agitan manualmente los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 4 diluciones 1/10
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado con un anticuerpo anti glicoforina-PE.
-
\vtcortauna Se efectúa la detección
La figura 6 adjunta muestra la aglutinación de los glóbulos rojos obtenida en presencia de Phaseolus vulgaris.
En esta ensayo, se utilizó Phaseolus vulgaris en una concentración de 200 \mug/ml.
Se observa una disminución reproductible de dos logs de la concentración en glóbulos rojos en presencia de Phaseolus vulgaris.
Ejemplo 2 Aglutinación de glóbulos rojos en presencia de bacterias
Las ensayos preliminares pusieron de manifiesto que no hay interacción entre la lecitina Phaseolus y las bacterias.
Método
Se introduce una crioesfera de E.coli en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Se mezcla en tubos, 400 \mul de PBS, 50 \mul de E.coli (cultivo puro) y 50 \mul de Phaseolus vulgaris,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se le añaden 500 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de 5 \mum,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 4 diluciones 1/10,
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04,
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico,
-
\vtcortauna Se efectúa la detección.
Los resultados obtenidos, al utilizar una concentración Phaseolus vulgaris de 200 \mug/ml se ilustran en la tabla 5 siguiente.
TABLA 5
5
Estos resultados ponen de manifiesto que 91% de las bacterias se detectan después de la etapa de aglutinación y que después de esta etapa de aglutinación, se reduce la concentración de glóbulos rojos de dos logs mientras que la cepa E. coli sigue siendo bien recuperada.
II. Concentración de gérmenes patógenos por medio de una etapa de lisis
En el marco de la presente invención, la firma solicitante efectuó una puesta a punto de las diferentes técnicas de lisis selectiva que permitían la eliminación de las células sanguíneas sin afectar a la concentración de las bacterias eventualmente presentes en las muestras que se deben analizar.
A raíz de algunos estudios previos, la firma solicitante constató que algunas bacterias son resistentes en presencia de detergentes tal como el Tritón X100 y determinó la concentración óptima de detergentes con la cual el porcentaje de recuperación de bacterias es óptimo.
Ejemplo 1 Efecto de la formulación de la solución de lisis sobre cultivos de bacterias puras Método
-
\vtcortauna Se conservan las cepas en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuban a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Se efectuaron algunos diluciones en serie (1/10) en el tampón PBS hasta 10^{-5}
-
\vtcortauna Se trata un mililitro de la última dilución con 9 ml de la solución de lisis (0,01% (peso/volumen) de saponina, 0,1% (peso/volumen) de Tween y 0,001% (peso/volumen) de Tritón X 100 durante 15 minutos
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado esterásico según las indicaciones que figuran en el anexo 1
-
\vtcortauna Se efectúa la detección.
Los resultados de estos diferentes ensayos se ilustran en la tabla 6 siguiente, en la cual se expresan los diferentes porcentajes de recuperación de las bacterias obtenidas.
TABLA 6
6
TABLA 6 (continuación)
7
Estos resultados se ilustran en la figura 7 anexa.
La mayoría de las cepas no son afectadas por la solución de lisis: los porcentajes de recuperación son coherentes con las previsiones predefinidas, entre 95 y 115%, excepto para Ps. aeruginosa y Bacillus cereus.
Ejemplo 2 Efecto de la formulación de la solución de lisis sobre las bacterias sembradas en plaquetas
Para simular una contaminación, se adaptaron dos cepas para el crecimiento en concentrados plaquetarios.
Método
-
\vtcortauna Se sembraron las cepas Bacillus cereus y Staph. aureus en plaquetas en tubos de 50 ml utilizando una concentración de 10^{5} células en 20 ml de plaquetas.
-
\vtcortauna Estos tubos de 50 ml se conservan en la incubadora de plaquetas a 22ºC durante varios días,
-
\vtcortauna Se diluye un mililitro de plaquetas sembradas con 9 ml de la solución de lisis,
-
\vtcortauna Se efectúa la lisis durante 15 minutos a temperatura ambiente,
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB047,
-
\vtcortauna Las bacterias se marcan con un substrato esteárico tal como se indica en anexo 1,
-
\vtcortauna Se somete la membrana a un barrido con el analizador.
Los resultados del recuento de las bacterias después de la lisis se ilustran en la tabla 7 siguiente.
TABLA 7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron las bacterias en una concentración inicial de 5.10^{3} células/ml y se detectan varios días más tarde concentraciones del orden de 10^{6} a 10^{9} células/ml.
Se desprende de estas experiencias, que las bacterias que se desarrollaron en las plaquetas no han sido afectadas por la solución de lisis.
Ejemplo 2b
Efecto de la formulación de la solución de lisis sobre cultivos de bacterias puras Método
-
\vtcortauna Se conservan las cepas en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuban a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Después de la determinación del número de bacterias por marcado esterásico, se inoculan 3000 bacterias en 3 ml de PBS
-
\vtcortauna Se tratan los 3 ml con la solución de lisis (NOG 0,25% a 2%) durante 20 minutos
-
\vtcortauna La totalidad de la muestra se filtra sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna El recuento se efectúa en citometría en fase sólida
Los resultados obtenidos se ilustran figura 11 en anexo.
Ejemplo 3 Efecto de la formulación de la composición de lisis sobre los glóbulos rojos Método
-
\vtcortauna Se diluye un mililitro de glóbulos rojos en 9 ml de solución de lisis o 9 ml de PBS (control).
-
\vtcortauna Se efectúa la lisis durante 15 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se analizan las muestras lisadas o no con la ayuda de un contador celular.
La figura 9 muestra los resultados obtenidos sobre la preparación de glóbulos rojos lisada con respecto a una preparación de glóbulos rojos no lisada.
Ejemplo 4 Efecto de la formulación de la composición de lisis sobre las plaquetas
Se ensayó la reproductividad de la eficacia de la solución de lisis. Se lisaron y se analizaron algunas muestras diferentes de plaquetas.
\newpage
Método
-
\vtcortauna Se diluye un mililitro de plaquetas en 9 ml de solución de lisis
-
\vtcortauna Se efectúa la lisis durante 15 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se efectuaron algunas diluciones en serie (1/10) en el tampón PBS hasta 10^{-5}
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra sobre una membrana CB04.
-
\vtcortauna Se marcan los microorganismos con un substrato esterásico
-
\vtcortauna Se somete la membrana a un barrido con el analizador.
La figura 8 en anexo ilustra los resultados de la lisis obtenida con diferentes muestras de plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
III. Concentración de gérmenes patógenos por medio de dos etapas de agregación y lisis
La preparación de la muestra por concentración de los gérmenes patógenos en dos etapas comprende:
1) Agregación o aglutinación específica de las células del producto sanguíneo.
2) La Lisis específica de las células del producto sanguíneo.
Ejemplo 1 Separación específica de las plaquetas Método
-
\vtcortauna Se introduce una crioesfera de E.coli en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
\quad
La primera etapa de agregación se efectúa del siguiente modo:
-
\vtcortauna Se mezclan en tubos, 1 ml de concentrado plaquetario, 50 \mul de E.coli (cultivo puro) y 100 \mul de CD 9,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente.
\quad
La segunda etapa de lisis se efectúa entonces:
-
\vtcortauna Se añaden 900 \mul de tampón de lisis a 100 \mul del filtrado después de la agregación,
-
\vtcortauna Se mantiene el conjunto durante 15 minutos a temperatura ambiente,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 4 diluciones 1/10
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra así obtenida sobre una membrana CB04,
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado de las bacterias y plaquetas con un substrato esterásico (anexo 1)
-
\vtcortauna Se cuentan las bacterias y las plaquetas con el analizador.
Los resultados obtenidos al efectuar el procedimiento de concentración de las bacterias en dos etapas se ilustran en la tabla 8 siguiente.
TABLA 8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Separación específica de los glóbulos rojos Método
-
\vtcortauna Se introduce una crioesfera de E.coli en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante 18-24 horas.
\quad
La etapa de aglutinación se efectúa del siguiente modo:
-
\vtcortauna Se mezclan en tubos, 1 ml glóbulos rojos, 50 \mul de E.coli (cultivo puro) y 125 \mul de lecitina,
-
\vtcortauna Se agitan los tubos manualmente durante 5 minutos a temperatura ambiente
-
\vtcortauna Se efectúa una filtración sobre un filtro de porosidad 5 \mum.
\quad
La segunda etapa de lisis se efectúa entonces:
-
\vtcortauna Se añaden a 900 \mul de tampón de lisis a 100 \mul del filtrado después de aglutinación,
-
\vtcortauna Se mantiene el conjunto durante 15 minutos a temperatura ambiente,
-
\vtcortauna Se efectúan diluciones en serie: 4 diluciones 1/10
-
\vtcortauna Se filtran 100 \mul de la muestra así obtenida sobre una membrana CB04,
-
\vtcortauna Se efectúa un marcado de las bacterias con un substrato esterásico y de los glóbulos rojos con un anticuerpo anti-Glicoforina-PE (anexo 2)
-
\vtcortauna Se cuentan las bacterias y los glóbulos rojos con el analizador.
La tabla 9 siguiente muestra los resultados obtenidos con el recuento de las bacterias efectuada después de la etapa de aglutinación de los glóbulos rojos con la lecitina seguida de la etapa de lisis.
TABLA 9
10
Después de la aglutinación la concentración en glóbulos rojos se redujo en 1,5 log.
Sesenta y ocho (68) % de las bacterias se recuperan después de estas dos etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
IV. Agentes de marcado Ejemplo 1 Sustrato esterásico ChemCromo V6
Se pueden preparar soluciones de marcado a partir de un substrato esterásico y se utilizan en el procedimiento de detección de la invención según el protocolo siguiente:
a) Preparación
-
\vtcortauna 10 \mul del substrato esterásico ChemCromo V6 por mililitro de tampón ChemSol B16 (500 \mul de solución de marcado por membrana)
-
\vtcortauna Se conserva esta solución a 4ºC al abrigo de la luz como máximo durante 4 horas.
b) Utilización
\quad
Introducir un tampón de marcado en una caja de Pétri de 33 mm de diámetro.
\quad
Distribuir 500 \mul de la solución de marcado sobre el tampón.
\quad
Colocar la membrana CB04 sobre la rampa de filtración. Filtrar 100 \mul de la muestra que se debe analizar.
\quad
Colocar la membrana sobre el tampón.
\quad
Incubar durante 15 minutos a 37ºC.
Ejemplo 2 Anticuerpo marcado
También, se puede utilizar una solución de marcado que comprende un anticuerpo marcado en el procedimiento de detección de la invención según el protocolo siguiente:
-
\vtcortauna Tomar 90 \mul de una dilución de la muestra,
-
\vtcortauna Añadir 10 \mul del anticuerpo anti glicoforina-PE,
-
\vtcortauna Mezclar (con Vortex) e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente al abrigo de la luz,
-
\vtcortauna Añadir 900 \mul de tampón PBS,
-
\vtcortauna Colocar la membrana CB04 en la rampa de filtración,
-
\vtcortauna Filtrar al vacío 100 \mul de la solución que se debe analizar,
-
\vtcortauna Analizar la membrana en el analizador invirtiendo los cables primario y terciario del analizador.
Ejemplo 3 Interés de la adición de un agente de permeabilización de las bacterias para mejorar la penetración del marcador Método
-
\vtcortauna Se conservan las cepas en un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuban a 37ºC durante 18-24 horas.
-
\vtcortauna Después de la determinación del número de bacterias por marcado esterásico, se inoculan 3000 bacterias en 3 ml de concentrado plaquetario
-
\vtcortauna Se tratan los 3 ml con 1 ml de la solución de agregación (CD9: clon 6B1: 30 \mug/ml, Picogreen 1/2000, PEI 40 \mug/ml a 80 \mug/ml) durante 40 minutos
-
\vtcortauna Se filtra la muestra a través de un filtro de porosidad de 5 \mum
-
\vtcortauna Se incuba la muestra en la solución de lisis (Clorhexidina 5.10^{-3}%, NOG 0,5%, Nisina 0,2 \mug/ml, EDTA 5 mM)) durante 20 minutos
-
\vtcortauna Se filtra la totalidad de la muestra sobre una membrana CB04
-
\vtcortauna Se efectúa el recuento por medio de un analizador de citometría en fase sólida
V. Conclusiones
Las opciones técnicas para alcanzar las mejores condiciones de preparación de los gérmenes patógenos se definieron con la ayuda de sus trabajos experimentales.
Por lo que se refiere a los concentrados plaquetarios estas opciones técnicas incluyen:
1) Etapa de agregación con, por ejemplo, un anticuerpo activador plaquetario tal como CD9,
2) Etapa de lisis celular con una combinación de los detergentes tal como saponina, Tween 20 y Tritón X 100.
Por lo que se refiere a los concentrados de glóbulos rojos:
1) Etapa de aglutinación con una lecitina tal como por ejemplo Phaseolus vulgaris,
2) Etapa de lisis celular con una combinación de detergentes tal como saponina, Tween 20 y Tritón X 100.
El marcado y la permeabilización de los gérmenes patógenos pueden intervenir indiferentemente durante la etapa de agregación o durante etapa de lisis.

Claims (29)

1. Procedimiento de detección de gérmenes contaminantes eventualmente presentes en un producto sanguíneo que comprende células sanguíneas, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
a)
se somete una muestra de dicho producto sanguíneo a un tratamiento de agregación de las células sanguíneas,
b)
se eliminan los agregados formados en la etapa (a) por pasada de la muestra tratada sobre un primer filtro que deja pasar los gérmenes contaminantes pero no los agregados de células,
c)
se lisaron selectivamente las células residuales del filtrado obtenido en la etapa (b),
d)
se recuperan los gérmenes contaminantes por pasada del lisato de la etapa (c) sobre un segundo filtro que deja pasar las restos celulares,
e)
se añade un agente de marcado de los gérmenes contaminantes, bien sea durante la agregación de la etapa (a), o bien durante la lisis de la etapa (c), y
f)
se analiza el segundo filtro para detectar los gérmenes contaminantes marcados eventualmente retenidos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la adición de un agente de permeabilización de los gérmenes contaminantes, en al menos una de las etapas (a), (c), o (e).
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de permeabilización se elige del grupo que comprende: la polietilenimina, el diacetato de clorhexidina, el digluconato de clorexhidina, el ácido de etileno diamina tetracetato (EDTA) solo o en combinación con la nisina, un detergente o una mezcla de éstos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el detergente se elige entre el grupo que comprende: N-Octil \beta-D-glucopiranósido, SDS, Tween, tritón, Brij, o una mezcla de éstos.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el agente de marcado de los gérmenes patógenos es una solución de marcado elegida entre el grupo que comprende un substrato esterásico tal como el ChemCromo V6, un anticuerpo marcado o un marcador de ácidos nucléicos.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque el agente de marcado de los gérmenes patógenos es un marcador de ácidos nucléicos.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque el agente de marcado comprende un marcador fluorescente o un agente acoplado a un fluorocromo o a una enzima que permite la degradación de un substrato que se vuelve así fluorescente.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la fluorescencia se detecta por medio de una excitación láser.
9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células sanguíneas del producto sanguíneo son plaquetas o glóbulos rojos o una mezcla de éstos.
10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el producto sanguíneo comprende plaquetas y porque el tratamiento de agregación de la etapa (a) comprende la puesta en contacto de la muestra con una composición de agregación que comprende al menos uno de los agentes de agregación elegidos del grupo que comprende:
-
\vtcortauna un anticuerpo específico de un antígeno plaquetario,
-
\vtcortauna un agonista fuerte de la activación plaquetaria elegido entre: la trombina, el TRAP (Thrombin Receptor Activating Peptide), la tripsina, el colágeno, el tromboxano A2, el PAF (Platelet Activating Factor), el ionóforo A23187, los complejos inmunes y factores del complemento.
-
\vtcortauna un agonista débil de la activación plaquetaria elegido entre ADP, adrenalina, ácido araquidónico, factor Von Willebrand, serotonina o epinefrina.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración en anticuerpo de tipo CD9 en la composición de agregación está comprendida entre 0,5 \mug/ml y 50 \mug/ml, y preferentemente entre 5 \mug/ml y 40 \mug/ml.
\newpage
12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración en agonista fuerte en la composición de agregación está comprendida entre:
-
\vtcortauna 0,5 UI/ml y 100 UI/ml y preferentemente entre 1 UI/ml y 20 UI/ml para un agonista de tipo trombina,
-
\vtcortauna 5 \mum y 200 \mum y preferentemente entre 10 \mum y 100 \mum para un agonista de tipo TRAP,
-
\vtcortauna 1 nM y 500 nM y preferentemente entre 10 nM y 300 nM para un agonista de tipo tripsina,
-
\vtcortauna 0,05 \mug/ml y 50 \mug/ml y preferentemente entre 1 \mug/ml y 20 \mug/ml para un agonista de tipo colágeno,
-
\vtcortauna 0,01 \mug/ml y 5 \mug/ml y preferentemente entre 0,1 \mug/ml y 1 \mug/ml para un agonista de tipo tromboxano A2,
-
\vtcortauna 0,005 mg/ml y 1 mg/ml y preferentemente entre 0,05 mg/ml y 0,5 mg/ml para un agonista de tipo PAF,
-
\vtcortauna 0,1 \mum y 100 \mum y preferentemente entre 1 \mum y 20 \mum para un agonista de tipo ionóforo A23187.
13. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración en agonista débil en la composición de agregación está comprendida entre:
-
\vtcortauna 0,5 \mum y 100 \mum y preferentemente entre 1 \mum y 20 \mum para un agonista del tipo ADP, de tipo adrenalina o de tipo epinefrina,
-
\vtcortauna 0,001 mM y 10 mM y preferentemente entre 0,01 mM y 5 mM para un agonista de tipo ácido araquidónico,
-
\vtcortauna 0,001 mg/ml y 1 mg/ml y preferentemente entre 0,01 mg/ml y 0,5 mg/ml para un agonista de tipo factor Von Willerbrand, o
-
\vtcortauna 0,05 \mum y 100 \mum y preferentemente entre 0,01 \mum y 50 \mum para un agonista de tipo serotonina.
14. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el anticuerpo se elige entre: un anticuerpo anti-CD9, anti-CD32, anti-PTA1, anti-CD42, anti- GpIIb/IIIa o anti-GpIV.
15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el producto sanguíneo comprende glóbulos rojos y porque el tratamiento de agregación de la etapa (a) comprende la puesta en contacto de la muestra con una composición de aglutinación que comprende al menos un agente de aglutinación elegido entre las lecitinas, la polietilenimina, la polivinilpirrolidona (PVP), las gelatinas, los dextranos o los polietilenglicoles
(PEG).
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque las lecitinas presentan una actividad eritroaglutinina.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque las lecitinas se eligen entre las lecitinas de Phaseolus vulgaris, Vicia sativa, Vicia faba o Erythrina corallodendron.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la concentración de lecitina de tipo Phaseolus vulgaris en la composición de aglutinación está comprendida entre 10 \mug/ml y 200 \mug/ml.
19. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la concentración de polietilenimina en la composición de aglutinación está comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen), preferentemente entre 20% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
20. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la polivinilpirrolidona (PVP) se elige entre el grupo que comprende PVP-40 y PVP-360 y preferentemente se utiliza en una concentración comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen), y muy preferentemente entre 4% (peso/volumen) y 20% (peso/volumen).
21. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque se utiliza la gelatina en la composición de aglutinación en una concentración comprendida entre 0,5% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen), preferentemente entre 4% (peso/volumen) y 20% (peso/volumen).
22. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el dextrano que está en la composición de aglutinación se elige entre el grupo que comprende: Dextrano 70, Dextrano 100, y Dextrano 500, se utiliza preferentemente en una concentración comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen), y muy preferentemente entre 4% (peso/volumen) y 20% (peso/volumen).
\newpage
23. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el polietilenglicol se elige entre el grupo que comprende: PEG8, PEG17, PEG35, utilizado preferentemente en una concentración comprendida entre 0,05% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen), y muy preferentemente entre 20% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lisis de las células de la etapa (c) se realiza con una solución de lisis que comprende uno o varios detergentes elegidos del grupo que comprende: saponina, SDS, Tween 20, Tritón X100, Brij 96, Polidocanol, o Carbonato de sodio.
25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los gérmenes contaminantes son bacterias aerobias o anaerobias, mohos, levaduras, esporas de bacterias vivas y/o muertas.
26. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tamaño de los poros del primer filtro está comprendido entre 2 \mum y 20 \mum.
27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tamaño de los poros del segundo filtro está comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los gérmenes contaminantes son bacterias aerobias o anaerobias, mohos, levaduras o esporas de bacterias vivas y/o muertas, porque el tamaño de los poros del primer filtro está comprendido entre 2 \mum y 20 \mum, y porque el tamaño de los poros del segundo filtro está comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
29. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 28, caracterizado porque la detección de los gérmenes contaminantes de la etapa (f) se realiza en un dispositivo cerrado.
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