ES2302855T3 - Dispositivo y procedimiento de concentracion y de deteccion de germenes patogenos a partir de productos sanguineos y/o de sus derivados. - Google Patents
Dispositivo y procedimiento de concentracion y de deteccion de germenes patogenos a partir de productos sanguineos y/o de sus derivados. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de detección de gérmenes contaminantes eventualmente presentes en un producto sanguíneo que comprende células sanguíneas, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) se somete una muestra de dicho producto sanguíneo a un tratamiento de agregación de las células sanguíneas, b) se eliminan los agregados formados en la etapa (a) por pasada de la muestra tratada sobre un primer filtro que deja pasar los gérmenes contaminantes pero no los agregados de células, c) se lisaron selectivamente las células residuales del filtrado obtenido en la etapa (b), d) se recuperan los gérmenes contaminantes por pasada del lisato de la etapa (c) sobre un segundo filtro que deja pasar las restos celulares, e) se añade un agente de marcado de los gérmenes contaminantes, bien sea durante la agregación de la etapa (a), o bien durante la lisis de la etapa (c), y f) se analiza el segundo filtro para detectar los gérmenes contaminantes marcados eventualmente retenidos.
Description
Dispositivo y procedimiento de concentración y
de detección de gérmenes patógenos a partir de productos sanguíneos
y/o de sus derivados.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento de concentración de gérmenes patógenos eventualmente
presentes en los productos sanguíneos o derivados, así como la
detección de dichos gérmenes así concentrados para efectuar un
control de la patogenicidad de dichos productos sanguíneos.
Se entiende por producto sanguíneo tanto la
sangre total, como cualquier preparación procedente del
fraccionamiento de éste, que comprende o no componentes celulares,
como ejemplo, se entiende por producto sanguíneo los concentrados
de los glóbulos rojos o de plaquetas, y también las preparaciones
plasmáticas o serosas.
La detección de contaminaciones de los productos
sanguíneos y derivados por diferentes gérmenes patógenos, tales
como bacterias, virus, mohos, levaduras u otros, es una de las
grandes dificultades a las cuales se enfrentan hoy día las
autoridades responsables de la salud pública, así como las
industrias de la transfusión sanguínea.
Existen ensayos de detección, pero no son
utilizables en rutinas hasta ahora.
La patente de EE.UU. nº 3.635.798 describe un
procedimiento de concentración de microorganismos presentes en la
sangre caracterizada por las siguientes etapas: adición de un agente
de agregación para agregar células sanguíneas resultantes en su
sedimentación, filtración de líquido sobrenadante para eliminar las
células sanguíneas residuales, filtración de este filtrado para
aislar las bacterias y detección de las bacterias.
La solicitud de patente alemana nº 19.801.090
describe un procedimiento de detección de microorganismos presentes
en la sangre que comprende: lisis específico de las células
sanguíneas, filtración para aislar las bacterias, detección de los
microorganismos eventualmente después del marcado.
Las principales dificultades presentadas por la
mayoría de las ensayos de detección de dichos gérmenes patógenos,
entre una población o una subpoblación de células sanguíneas, reside
en el hecho de que la mayoría de tratamientos considerados de
extraer selectivamente los gérmenes patógenos, causan
simultáneamente una eliminación de éstos.
Esta eliminación conduce casi sistemáticamente a
una sub-evaluación de la presencia de dichos
gérmenes en el producto sanguíneo ensayado, y en consecuencia a un
aumento del riesgo sanitario.
Por lo tanto, la firma solicitante concibió un
nuevo método rápido y sensible para detectar una contaminación de
un producto sanguíneo o derivado, por tales gérmenes patógenos.
El procedimiento según la invención es notable
porque se realiza directamente sobre una muestra procedente de un
producto sanguíneo tomado de un sujeto, sin tratamiento o dilución
preliminar.
El procedimiento de detección de gérmenes
patógenos desarrollado por la firma solicitante consiste
esencialmente en concentrar selectivamente dichos gérmenes
patógenos, luego en detectarlos, una vez concentrados, por técnicas
conocidas del experto en la técnica.
La concentración selectiva de los gérmenes
patógenos se efectúa por eliminación secuencial o simultánea de las
diferentes poblaciones de células sanguíneas presentes en una
muestra de un producto sanguíneo.
El procedimiento de concentración de gérmenes
patógenos según la invención incluye una primera etapa de
concentración de los gérmenes patógenos que consiste en reducir la
concentración de las poblaciones de las células sanguíneas por
medio de una agregación selectiva de éstas, seguida de una
filtración con el fin de recoger en el filtrado los gérmenes
patógenos concentrados no agregados y en retener sobre el filtro los
agregados de células sanguíneas.
Se entiende por agregación, en el sentido de la
presente invención, cualquier acción que conduce a la formación de
agregados celulares, y se entiende por agregado celular cualquier
grupo de células que incluyen más de dos células y cuyo tamaño es
superior al de una célula aislada. En el sentido de la presente
invención, un agregado se puede obtener bien sea por agregación,
tal como la agregación de las plaquetas subsecuentes a su
activación, una aglutinación, tal como la aglutinación de los
glóbulos rojos obtenida en cuanto éstos se encuentran en presencia
de moléculas particulares, o bien una aproximación de las células
induce por un cambio de la carga electrostática de sus membranas o
también de otros mecanismos de adhesión o aproximación celular que
conducen a la reagrupamiento de más de dos células.
Según modos de empleo preferidos, la agregación
de las diferentes poblaciones de células sanguíneas se puede
efectuar con la ayuda de compuestos que inducen la agregación
plaquetaria, o con la ayuda de compuestos que inducen la
aglutinación específica de los glóbulos rojos.
Se conoce por ejemplo que, en presencia de
algunos compuestos, las plaquetas tienen la capacidad de agregarse.
Estos agregados se pueden separar fácilmente de los gérmenes
patógenos por filtración.
Los glóbulos rojos presentan igualmente algunas
propiedades de aglutinación.
El procedimiento de concentración de gérmenes
patógenos según la invención incluye una segunda etapa de reducción
de la concentración de las poblaciones de las células mayoritarias
en la sangre, a saber las plaquetas y los glóbulos rojos, que
consiste en lisar las células aisladas no agregadas durante la
primera etapa de agregación.
Esta segunda etapa de reducción de la
concentración de las poblaciones de las células sanguíneas permite
una reducción del orden de 4 log (desde 10^{9} a 10^{5}
células/ml) por lo que se refiere a la concentración de las
plaquetas y del orden de 5 log (desde 10^{10} a 10^{5}) por lo
que se refiere a la concentración de los glóbulos rojos.
Más precisamente la invención tiene por objeto
un procedimiento de concentración de gérmenes contaminantes
eventualmente presentes en un producto sanguíneo que comprende
células sanguíneas, caracterizado porque comprende las siguientes
etapas:
- a)
- se somete una muestra de dicho producto sanguíneo a un tratamiento de agregación de las células sanguíneas,
- b)
- se eliminan los agregados formados en la etapa (a) por pasada de la muestra tratada sobre un primer filtro que deja pasar los gérmenes contaminantes pero no los agregados de células,
- c)
- se lisan selectivamente las células residuales del filtrado obtenido en la etapa (b),
- d)
- se recuperan los gérmenes contaminantes por pasada del lisato de la etapa (c) sobre un segundo filtro que deja pasar restos celulares.
- e)
- se añade un agente de marcado de los gérmenes contaminantes, bien sea en la agregación de la etapa (a), o bien en la lisis de la etapa (c), y
- f)
- se analiza el segundo filtro para detectar los gérmenes contaminantes marcados eventualmente retenidos.
Como ejemplo de agente de marcado de los
gérmenes patógenos detectables por el procedimiento de la invención,
se puede citar una solución de marcado que comprende un substrato
esterásico tal como el ChemChrome V6.
También, como agente de marcado de los gérmenes
patógenos detectables por el procedimiento de la invención, se
puede utilizar una solución de marcado que comprende un anticuerpo
marcado o un marcador de ácidos nucléicos. Preferentemente, el
marcador será fluorescente o acoplado a un fluorocromo o a una
enzima que permitirá la degradación
de un substrato que se vuelve así fluorescente, eventualmente la fluorescencia será detectada por una excitación láser.
de un substrato que se vuelve así fluorescente, eventualmente la fluorescencia será detectada por una excitación láser.
El procedimiento de detección según la invención
comprende igualmente la adición de un agente de permeabilización de
los gérmenes contaminantes, que se puede añadir a al menos una de
las etapas del procedimiento, bien sea durante la agregación de la
etapa (a), bien en la lisis de la etapa (c), bien directamente sobre
el segundo filtro durante la etapa (e) de análisis, o bien en
varios de entre ellas.
Como ejemplo de agente de permeabilización de
los gérmenes contaminantes, se pueden citar la polietilenimina, el
diacetato de clorhexidina, el digluconato de clorhexidina, el ácido
de etileno diamina tetracetato (EDTA) solo o en combinación con la
nisina así como los detergentes de tipo N-Octil
\beta-D-glucopiranósido, SDS,
Tween, tritón, Brij, etc.
Según un modo particular de empleo del
procedimiento de la invención, las células sanguíneas del producto
sanguíneo son plaquetas o glóbulos rojos o una mezcla de éstos.
Según otro modo particular de empleo del
procedimiento de la invención, las células sanguíneas del producto
sanguíneo son plaquetas y el tratamiento de agregación de la etapa
(a) comprende la puesta en contacto de la muestra con una
composición de agregación que comprende al menos uno de los agentes
de agregación elegidos del grupo que comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Ventajosamente la concentración de anticuerpos
de tipo CD9 específico de un antígeno plaquetario en la composición
de agregación está comprendida entre 0,5 \mug/ml y 100 \mug/ml,
y preferentemente está comprendida entre 5 \mug/ml y 40
\mug/ml.
Aún ventajosamente, la concentración de agonista
fuerte en la composición de agregación está comprendida entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Ventajosamente la concentración de agonista
débil en la composición de agregación esta comprendida entre:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
De una manera totalmente preferente el
anticuerpo específico de un antígeno plaquetario, se elige entre:
un anticuerpo anti-CD9, CD32,
anti-PTA1, CD42, anti-GpIIb/IIIa o
anti-GpIV.
Según otro modo particular de empleo del
procedimiento de la invención, el producto sanguíneo comprende
glóbulos rojos y el tratamiento de agregación de la etapa (a)
comprende la puesta en contacto de la muestra con una composición
de aglutinación que comprende al menos un agente de aglutinación
elegido entre las lecitinas, la polietilenimina, la
polivinilpirrolidona (PVP), las gelatinas, los dextranos o los
polietilenglicoles (PEG).
Ventajosamente dichas lecitinas presentan una
actividad eritroaglutinina.
Preferentemente las lecitinas se eligen entre
las lecitinas de Phaseolus vulgaris, Vicia sativa, Vicia faba o
Eritrina corallodendron., Lens culinaris, Phytolacca Americana y
Triticum vulgaris.
Ventajosamente la concentración de lecitina de
tipo Phaseolus vulgaris en la composición de aglutinación
está comprendida entre 10 \mug/ml y 200 \mug/ml.
Ventajosamente la concentración de
polietilenimina en la composición de aglutinación, está comprendida
entre 0,1% (peso/volumen) y 40% (peso/volumen)
Muy preferentemente dichos dextranos se eligen
entre el Dextrano 70, Dextrano 100, Dextrano 500, etc.
Ventajosamente la concentración de dextrano en la composición de
aglutinación está comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40%
(peso/volumen).
Preferentemente dichos PEG se eligen entre los
PEG35, PEG, etc
Ventajosamente la concentración de PEG en la
composición de aglutinación está comprendida entre 0,05%
(peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Ventajosamente la concentración de gelatina en
la composición de aglutinación está comprendida entre 0,5%
(peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Preferentemente dichas PVP elegirse entre los
PVP-40, PVP-360, etc
Ventajosamente la concentración de PVP en la
composición de aglutinación está comprendida entre 0,05%
(peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
Ventajosamente, la lisis de las células de la
etapa (c) se realiza con una solución de lisis que comprende uno o
varios detergentes elegidos del grupo que comprende: saponina, SDS,
Tween 20, Tritón X100, Brij 96, Polidocanol,
N-Octil
\beta-D-glucopiranósido o
Carbonato de sodio.
Preferentemente, la solución de lisis está
constituida por una mezcla de saponina, de Tritón X100 y de Tween
20, y muy preferentemente la solución de lisis comprende saponina
con una concentración (expresada en % peso/volumen) comprendida
entre 0,005% y 0,5%, del Tritón X100 en una concentración (expresada
en % peso/volumen) comprendida entre 0,001% y un 0,5% del Tween 20
en una concentración comprendida entre 0,01% y 1%, del
N-Octil
\beta-D-glucopiranósido en una
concentración comprendida entre 0,1% y 0,5%.
Ventajosamente, la permeabilización de las
bacterias se realiza con una solución que comprende uno o varios
reactivos elegidos del grupo que comprende: Clorhexidina
(digluconato, diacetato), Polietilenimina, N-Octil
\beta-D-glucopiranósido, Nisina
sola o en combinación con EDTA.
Preferentemente, se utilizan los agentes
permeabilizantes para la clorhexidina en una concentración
(peso/volumen) comprendida entre 0,0001% (peso/volumen) y 0,1%
(peso/volumen), para la polietilenimina una concentración
comprendida entre 5 \mug/ml y 120 \mug/ml, para el
N-Octil
\beta-D-glucopiranósido en una
concentración comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 0,5%
(peso/volumen) y para la Nisina entre 0,1 \mug/ml y 0,5 \mug/ml
sola o en combinación con el EDTA en una concentración comprendida
entre 1 mM y 10 mM
El procedimiento de la invención se puede
utilizar para concentrar y detectar numerosos gérmenes contaminantes
de los productos sanguíneos, entre los cuales se pueden citar
bacterias aerobias o anaerobias, mohos, levaduras, esporas de
bacterias vivas y/o muertas.
Ventajosamente el tamaño de los poros del primer
filtro empleado en el procedimiento de la invención está
comprendido entre 2 \mum y 20 \mum.
Ventajosamente el tamaño de los poros del
segundo filtro empleado en el procedimiento de la invención está
comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
Ventajosamente la detección de los gérmenes
contaminantes de la etapa (e) del procedimiento de la invención se
realiza en un dispositivo cerrado.
Preferentemente, los gérmenes contaminantes
capaces de ser concentrados según el procedimiento de la invención,
se eligen entre el grupo de las bacterias aerobias o anaerobios, de
los mohos, de las levaduras o las esporas de bacterias vivas y/o
muertas, el tamaño de los poros del primer filtro está comprendido
entre 2 \mum y 20 \mum, y el tamaño de los poros del segundo
filtro está comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen y de las
figuras en anexos en las cuales:
- la figura 1 ilustra el recuento de las
plaquetas después de haber puesto en contacto los concentrados
plaquetarios con diferentes concentraciones de trombina.
- La figura 2 ilustra el recuento de las
plaquetas después de la agregación en presencia de ADP para 2
muestras plaquetarias.
- La figura 3 muestra el recuento de las
plaquetas en presencia de anticuerpos CD9 (clon SN4) para 4
muestras plaquetarias.
- La figura 4 muestra los resultados del
recuento de las plaquetas en presencia de dosis crecientes de
anticuerpos CD9 (clon 6B1) utilizados sobre 3 ml de concentrado
plaquetario.
- La figura 5 muestra la curva dosis respuesta
obtenida en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpos
CD9 (clon SN4).
- La figura 6 ilustra la aglutinación de
glóbulos rojos en presencia de la lecitina Phaseolus
vulgaris utilizada en una concentración de 200 \mug/ml para 3
muestras de concentrados de glóbulos rojos.
- La figura 7 muestra los efectos de la solución
de lisis sobre la recuperación de diferentes gérmenes patógenos en
cultivos puros.
- La figura 8 muestra el efecto de la solución
de lisis sobre la numeración plaquetaria de dos muestras de
plaquetas.
- La figura 9 ilustra el efecto de la lisis
sobre la numeración eritrocitaria de dos muestras diferentes de
concentrados de glóbulos rojos.
- La figura 10 ilustra el recuento de las
bacterias Escherichia coli en una muestra plaquetaria
utilizando la polietilenimina (PEI) como agente permeabilizante
para aumentar la penetración del marcador.
- La figura 11 ilustra el efecto de la
concentración en N-octil
\beta-D-glucopiranósido en la
solución de lisis sobre cultivos de bacterias puras.
- La figura 12 ilustra un empleo particular del
dispositivo de concentración de los gérmenes patógenos, que
comprende:
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
La trombina es un agonista fuerte de la
agregación plaquetaria.
En los trabajos experimentales realizados por la
firma solicitante en el marco de la presente invención, se
prepararon algunas soluciones de trombina (referencia T8885 Sigma):
en una concentración de 100 UI/ml cuando se utiliza a razón de 10
UI/ensayo y en forma de solución diluida (100 \mul de solución
madre de trombina añadida de 900 \mul de tampón PBS), cuando se
utiliza a razón de 1 UI/ensayo.
La agregación de las plaquetas por medio de la
trombina incluye las siguientes etapas:
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
La tabla 1 siguiente ilustra los resultados
obtenidos y representa el número de agregados plaquetarios obtenidos
en presencia de trombina utilizada en dos concentraciones
diferentes y la figura 1 anexa ilustra gráficamente estos
resultados.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los trabajos experimentales empleados con el fin
de evaluar la agregación de los gérmenes patógenos en presencia de
trombina incluyen las siguientes etapas:
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
La tabla 2 siguiente muestra la agregación de
los concentrados plaquetarios con trombina en presencia de E.
coli.
Después de adición de la trombina, aparece casi
instantáneamente un coágulo.
Se utiliza ADP (SIGMA) en una concentración de
200 \mum en agua destilada.
Los trabajos experimentales empleados con el fin
de evaluar la agregación de las plaquetas en presencia de ADP
incluyen las siguientes etapas:
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
\global\parskip1.000000\baselineskip
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Los resultados ilustrados en la figura 1 ponen
de manifiesto que, en presencia de ADP, la concentración de
plaquetas se reduce de aproximadamente 50% a aproximadamente
90%.
La agregación de las plaquetas en presencia de
ADP incluye las siguientes etapas:
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
Se siembran los gérmenes patógenos en una
elevada concentración para aumentar un posible efecto de
atrapamiento. El ADP se añade a las plaquetas y a las bacterias en
una concentración de 10 \mum.
Los resultados obtenidos, representados en la
tabla 3 mostrada más arriba ponen de manifiesto que 74% de bacterias
se recuperan después de la etapa de agregación.
Se conoce que el anticuerpo CD9 induce la
activación de las plaquetas y por lo tanto su agregación. Los
ensayos descritos se realizaron con dos clones CD9, el clon SN4
(Ancel, ref 156-020, concentración 100 \mug/ml) y
el clon 6B1 (Hemosystem).
\global\parskip0.900000\baselineskip
El procedimiento de agregación selectiva
empleado con este anticuerpo CD9 incluye las siguientes etapas:
- -
-
\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
Se utilizó el anticuerpo CD9 (clon SN4) en
presencia de las plaquetas en una concentración final de 10
\mug/ml.
La figura 2 adjunta ilustra la agregación de las
plaquetas obtenida en presencia de anticuerpo CD9 (clon SN4). Con
el fin de evaluar la concentración óptima del anticuerpo CD9
necesario para la agregación plaquetaria, se estableció una curva
dosis respuesta.
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
Las figuras 3 y 5 muestran respectivamente los
resultados del recuento de las plaquetas agregadas en presencia de
dosis crecientes de anticuerpos CD9 (clon SN4) y la curva dosis
respuesta así obtenida.
El recuento de las plaquetas residuales se
efectúa con el analizador.
La agregación es
dosis-dependiente. Para aumentar el efecto de
agregación, la concentración en CD9 se aumentó en la medida de lo
posible. Sin embargo se estableció un compromiso para la detección
de las bacterias, y se determinó que se puede reducir la
concentración plaquetaria de 1 a 2 Log utilizando una concentración
de aproximadamente 10 \mug/ml de anticuerpos CD9.
Ejemplo 5
bis
Con el fin de evaluar la concentración óptima
del anticuerpo CD9 (clon 6B1) necesario para la agregación
plaquetaria, se estableció una experimento del tipo
dosis-respuesta
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La figura 4 adjunta muestra los resultados del
recuento de las plaquetas agregadas en presencia de dosis crecientes
de anticuerpo CD9 (clon 6B1).
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
La tabla 4 siguiente ilustra la agregación de
las plaquetas con el CD9 en presencia de bacterias.
Estos resultados ponen de manifiesto que las
bacterias Staph epidermidis se recuperaron bien. Para E.
coli se reduce el recuento un 36%.
Las lecitinas son glicoproteínas de origen no
inmune que aglutinan las células y/o precipitan complejos
carbohidratos. Estas moléculas se vinculan generalmente con
carbohidratos específicos.
En el marco de estos trabajos experimentales, se
utilizaron dos lecitinas:
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\vtcortauna
La lecitina Phaseolus vulgaris PHA- E
(Sigma) se utilizó en una concentración de 2 mg/ml en el PBS.
La lecitina Vicia Activa (Sigma) se utilizó en
la concentración de 1 mg/ml.
Una evaluación rápida de las dos lecitinas
permitió comprobar que no hay aglutinación de los glóbulos rojos
con Vicia sativa. Por otra parte Phaseolus vulgaris
induce una aglutinación rápida y eficaz.
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\vtcortauna
La figura 6 adjunta muestra la aglutinación de
los glóbulos rojos obtenida en presencia de Phaseolus
vulgaris.
En esta ensayo, se utilizó Phaseolus
vulgaris en una concentración de 200 \mug/ml.
Se observa una disminución reproductible de dos
logs de la concentración en glóbulos rojos en presencia de
Phaseolus vulgaris.
Las ensayos preliminares pusieron de manifiesto
que no hay interacción entre la lecitina Phaseolus y las
bacterias.
Se introduce una crioesfera de E.coli en
un tubo de 9 ml de caldo triptona soja y se incuba a 37ºC durante
18-24 horas.
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Los resultados obtenidos, al utilizar una
concentración Phaseolus vulgaris de 200 \mug/ml se
ilustran en la tabla 5 siguiente.
Estos resultados ponen de manifiesto que 91% de
las bacterias se detectan después de la etapa de aglutinación y que
después de esta etapa de aglutinación, se reduce la concentración de
glóbulos rojos de dos logs mientras que la cepa E. coli
sigue siendo bien recuperada.
En el marco de la presente invención, la firma
solicitante efectuó una puesta a punto de las diferentes técnicas
de lisis selectiva que permitían la eliminación de las células
sanguíneas sin afectar a la concentración de las bacterias
eventualmente presentes en las muestras que se deben analizar.
A raíz de algunos estudios previos, la firma
solicitante constató que algunas bacterias son resistentes en
presencia de detergentes tal como el Tritón X100 y determinó la
concentración óptima de detergentes con la cual el porcentaje de
recuperación de bacterias es óptimo.
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\vtcortauna
Los resultados de estos diferentes ensayos se
ilustran en la tabla 6 siguiente, en la cual se expresan los
diferentes porcentajes de recuperación de las bacterias
obtenidas.
Estos resultados se ilustran en la figura 7
anexa.
La mayoría de las cepas no son afectadas por la
solución de lisis: los porcentajes de recuperación son coherentes
con las previsiones predefinidas, entre 95 y 115%, excepto para Ps.
aeruginosa y Bacillus cereus.
Para simular una contaminación, se adaptaron dos
cepas para el crecimiento en concentrados plaquetarios.
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\vtcortauna
Los resultados del recuento de las bacterias
después de la lisis se ilustran en la tabla 7 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron las bacterias en una concentración
inicial de 5.10^{3} células/ml y se detectan varios días más
tarde concentraciones del orden de 10^{6} a 10^{9}
células/ml.
Se desprende de estas experiencias, que las
bacterias que se desarrollaron en las plaquetas no han sido
afectadas por la solución de lisis.
Ejemplo
2b
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-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
Los resultados obtenidos se ilustran figura 11
en anexo.
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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-
\vtcortauna
La figura 9 muestra los resultados obtenidos
sobre la preparación de glóbulos rojos lisada con respecto a una
preparación de glóbulos rojos no lisada.
Se ensayó la reproductividad de la eficacia de
la solución de lisis. Se lisaron y se analizaron algunas muestras
diferentes de plaquetas.
\newpage
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
La figura 8 en anexo ilustra los resultados de
la lisis obtenida con diferentes muestras de plaquetas.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de la muestra por concentración
de los gérmenes patógenos en dos etapas comprende:
1) Agregación o aglutinación específica de las
células del producto sanguíneo.
2) La Lisis específica de las células del
producto sanguíneo.
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- La primera etapa de agregación se efectúa del siguiente modo:
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- \quad
- La segunda etapa de lisis se efectúa entonces:
- -
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- -
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\vtcortauna
Los resultados obtenidos al efectuar el
procedimiento de concentración de las bacterias en dos etapas se
ilustran en la tabla 8 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
- \quad
- La etapa de aglutinación se efectúa del siguiente modo:
- -
-
\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- \quad
- La segunda etapa de lisis se efectúa entonces:
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
La tabla 9 siguiente muestra los resultados
obtenidos con el recuento de las bacterias efectuada después de la
etapa de aglutinación de los glóbulos rojos con la lecitina seguida
de la etapa de lisis.
Después de la aglutinación la concentración en
glóbulos rojos se redujo en 1,5 log.
Sesenta y ocho (68) % de las bacterias se
recuperan después de estas dos etapas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden preparar soluciones de marcado a
partir de un substrato esterásico y se utilizan en el procedimiento
de detección de la invención según el protocolo siguiente:
a) Preparación
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
b) Utilización
- \quad
- Introducir un tampón de marcado en una caja de Pétri de 33 mm de diámetro.
- \quad
- Distribuir 500 \mul de la solución de marcado sobre el tampón.
- \quad
- Colocar la membrana CB04 sobre la rampa de filtración. Filtrar 100 \mul de la muestra que se debe analizar.
- \quad
- Colocar la membrana sobre el tampón.
- \quad
- Incubar durante 15 minutos a 37ºC.
También, se puede utilizar una solución de
marcado que comprende un anticuerpo marcado en el procedimiento de
detección de la invención según el protocolo siguiente:
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
Las opciones técnicas para alcanzar las mejores
condiciones de preparación de los gérmenes patógenos se definieron
con la ayuda de sus trabajos experimentales.
Por lo que se refiere a los concentrados
plaquetarios estas opciones técnicas incluyen:
1) Etapa de agregación con, por ejemplo, un
anticuerpo activador plaquetario tal como CD9,
2) Etapa de lisis celular con una combinación de
los detergentes tal como saponina, Tween 20 y Tritón X 100.
Por lo que se refiere a los concentrados de
glóbulos rojos:
1) Etapa de aglutinación con una lecitina tal
como por ejemplo Phaseolus vulgaris,
2) Etapa de lisis celular con una combinación de
detergentes tal como saponina, Tween 20 y Tritón X 100.
El marcado y la permeabilización de los gérmenes
patógenos pueden intervenir indiferentemente durante la etapa de
agregación o durante etapa de lisis.
Claims (29)
1. Procedimiento de detección de gérmenes
contaminantes eventualmente presentes en un producto sanguíneo que
comprende células sanguíneas, caracterizado porque comprende
las siguientes etapas:
- a)
- se somete una muestra de dicho producto sanguíneo a un tratamiento de agregación de las células sanguíneas,
- b)
- se eliminan los agregados formados en la etapa (a) por pasada de la muestra tratada sobre un primer filtro que deja pasar los gérmenes contaminantes pero no los agregados de células,
- c)
- se lisaron selectivamente las células residuales del filtrado obtenido en la etapa (b),
- d)
- se recuperan los gérmenes contaminantes por pasada del lisato de la etapa (c) sobre un segundo filtro que deja pasar las restos celulares,
- e)
- se añade un agente de marcado de los gérmenes contaminantes, bien sea durante la agregación de la etapa (a), o bien durante la lisis de la etapa (c), y
- f)
- se analiza el segundo filtro para detectar los gérmenes contaminantes marcados eventualmente retenidos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende la adición de un agente de
permeabilización de los gérmenes contaminantes, en al menos una de
las etapas (a), (c), o (e).
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el agente de permeabilización se elige
del grupo que comprende: la polietilenimina, el diacetato de
clorhexidina, el digluconato de clorexhidina, el ácido de etileno
diamina tetracetato (EDTA) solo o en combinación con la nisina, un
detergente o una mezcla de éstos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el detergente se elige entre el grupo
que comprende: N-Octil
\beta-D-glucopiranósido, SDS,
Tween, tritón, Brij, o una mezcla de éstos.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque el agente de
marcado de los gérmenes patógenos es una solución de marcado
elegida entre el grupo que comprende un substrato esterásico tal
como el ChemCromo V6, un anticuerpo marcado o un marcador de ácidos
nucléicos.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque el agente de marcado de los gérmenes
patógenos es un marcador de ácidos nucléicos.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque el agente de
marcado comprende un marcador fluorescente o un agente acoplado a
un fluorocromo o a una enzima que permite la degradación de un
substrato que se vuelve así fluorescente.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la fluorescencia se detecta por medio de
una excitación láser.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células
sanguíneas del producto sanguíneo son plaquetas o glóbulos rojos o
una mezcla de éstos.
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el producto
sanguíneo comprende plaquetas y porque el tratamiento de agregación
de la etapa (a) comprende la puesta en contacto de la muestra con
una composición de agregación que comprende al menos uno de los
agentes de agregación elegidos del grupo que comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la concentración en anticuerpo de tipo
CD9 en la composición de agregación está comprendida entre 0,5
\mug/ml y 50 \mug/ml, y preferentemente entre 5 \mug/ml y 40
\mug/ml.
\newpage
12. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la concentración en agonista fuerte en
la composición de agregación está comprendida entre:
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
13. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque la concentración en agonista débil en la
composición de agregación está comprendida entre:
- -
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\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
14. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el anticuerpo se elige entre: un
anticuerpo anti-CD9, anti-CD32,
anti-PTA1, anti-CD42, anti-
GpIIb/IIIa o anti-GpIV.
15. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el producto
sanguíneo comprende glóbulos rojos y porque el tratamiento de
agregación de la etapa (a) comprende la puesta en contacto de la
muestra con una composición de aglutinación que comprende al menos
un agente de aglutinación elegido entre las lecitinas, la
polietilenimina, la polivinilpirrolidona (PVP), las gelatinas, los
dextranos o los polietilenglicoles
(PEG).
(PEG).
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque las lecitinas presentan una actividad
eritroaglutinina.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó
16, caracterizado porque las lecitinas se eligen entre las
lecitinas de Phaseolus vulgaris, Vicia sativa,
Vicia faba o Erythrina corallodendron.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque la concentración de lecitina de tipo
Phaseolus vulgaris en la composición de aglutinación está
comprendida entre 10 \mug/ml y 200 \mug/ml.
19. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque la concentración de polietilenimina en
la composición de aglutinación está comprendida entre 0,1%
(peso/volumen) y 40% (peso/volumen), preferentemente entre 20%
(peso/volumen) y 40% (peso/volumen).
20. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque la polivinilpirrolidona (PVP) se elige
entre el grupo que comprende PVP-40 y
PVP-360 y preferentemente se utiliza en una
concentración comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40%
(peso/volumen), y muy preferentemente entre 4% (peso/volumen) y 20%
(peso/volumen).
21. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque se utiliza la gelatina en la composición
de aglutinación en una concentración comprendida entre 0,5%
(peso/volumen) y 40% (peso/volumen), preferentemente entre 4%
(peso/volumen) y 20% (peso/volumen).
22. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque el dextrano que está en la composición
de aglutinación se elige entre el grupo que comprende: Dextrano 70,
Dextrano 100, y Dextrano 500, se utiliza preferentemente en una
concentración comprendida entre 0,1% (peso/volumen) y 40%
(peso/volumen), y muy preferentemente entre 4% (peso/volumen) y 20%
(peso/volumen).
\newpage
23. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque el polietilenglicol se elige entre el
grupo que comprende: PEG8, PEG17, PEG35, utilizado preferentemente
en una concentración comprendida entre 0,05% (peso/volumen) y 40%
(peso/volumen), y muy preferentemente entre 20% (peso/volumen) y 40%
(peso/volumen).
24. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la lisis
de las células de la etapa (c) se realiza con una solución de lisis
que comprende uno o varios detergentes elegidos del grupo que
comprende: saponina, SDS, Tween 20, Tritón X100, Brij 96,
Polidocanol, o Carbonato de sodio.
25. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
gérmenes contaminantes son bacterias aerobias o anaerobias, mohos,
levaduras, esporas de bacterias vivas y/o muertas.
26. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tamaño
de los poros del primer filtro está comprendido entre 2 \mum y 20
\mum.
27. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tamaño
de los poros del segundo filtro está comprendido entre 0,2 \mum y
2 \mum.
28. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los
gérmenes contaminantes son bacterias aerobias o anaerobias, mohos,
levaduras o esporas de bacterias vivas y/o muertas, porque el
tamaño de los poros del primer filtro está comprendido entre 2
\mum y 20 \mum, y porque el tamaño de los poros del segundo
filtro está comprendido entre 0,2 \mum y 2 \mum.
29. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 28, caracterizado porque la detección
de los gérmenes contaminantes de la etapa (f) se realiza en un
dispositivo cerrado.
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