CN112143775A - 一种血管紧张素ⅱ转换酶活性检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血管紧张素Ⅱ转换酶活性检测试剂盒和检测方法，所述检测试剂盒包括体系缓冲液、ACE2提取液、样本稀释液、底物应用液和pNA标准品，所述底物应用液中含有pNA基肽。本发明利用血管紧张素Ⅱ转换酶可以裂解合成的pNA基肽底物以释放黄色物质pNA的能力，并通过普通酶标仪或分光光度计在波长405nm检测吸光度来量化血管紧张素Ⅱ转换酶的活性；本发明检测时间短，检出限更低，且大大降低了检测成本。

Description

一种血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒和检测方法。
背景技术
血管紧张素II转换酶(ACE2,EC 3.4.17.23)，一种锌基金属蛋白酶，是肾素-血管紧张素系统(RAS)的一部分，通过切割血管紧张素II的c末端二肽将其转化为血管紧张素1-7来控制血压的调节。ACE2是人冠状病毒的受体，如SARS和SARS-CoV-2，它表达在肺、肾和心脏的血管内皮细胞上；而且ACE2是心血管和冠状病毒引起的疾病的潜在治疗靶点。ACE2活性检测试剂盒将有助于这一领域的研究进展。
现有市面上销售的血管紧张素II转换酶(ACE2)活性检测试剂盒多采用的是荧光法，需要荧光酶标仪检测，仪器昂贵，全球普及率比较低，客户检测该指标受限制于实验室条件。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒和检测方法，利用血管紧张素II转换酶裂解合成的pNA基肽底物以释放黄色物质的能力，释放的pNA可以通过酶标仪或分光光度计在波长405nm检测吸光度来量化。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，所述试剂盒包含以下试剂：体系缓冲液，ACE2提取液，样本稀释液，底物应用液，pNA标准品；所述底物应用液中含有pNA基肽，所述pNA基肽具体为由ACE2特异性底物多肽与pNA偶联合成的物质，所述pNA基肽中ACE2特异性底物多肽的羧基端与pNA通过肽键偶联。
优选的，所述ACE2特异性多肽为血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)、血管紧张素II(AngII)、孤儿G蛋白耦联受体(apelin)-13、内啡肽及神经加压素中的一种。ACE2是单肽酶，能从上述特异性多肽的羧基端解离一个氨基酸，pNA基肽中的ACE2特异性底物多肽的羧基端又与pNA通过肽键连接，因此ACE2能够从pNA基肽裂解出来pNA。
优选的，所述体系缓冲液中含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和牛血清蛋白，pH为7.8～8.4，所述磷酸氢二钠的含量为15.0～22.5g/L，所述磷酸二氢钾的含量为2.5～3.5g/L，所述牛血清蛋白的含量为0.1～0.5g/L。
优选的，所述ACE2提取液中含有三(羟甲基)氨基甲烷、盐酸、曲拉通X-100、去氧胆酸钠、氯化钠、EDTA、抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂、十二烷基硫酸钠和焦磷酸钠；其中，所述三(羟甲基)氨基甲烷的含量为48～75g/L，所述盐酸的含量为0.1～0.5mmol/L，所述曲拉通X-100的含量为0.1～0.5％，所述去氧胆酸钠的含量为0.2～1.0mmol/L，所述氯化钠的含量为180～240mmol/L，所述EDTA的含量为0.2～1.5mmol/L，所述抑蛋白酶肽的含量为0.01～0.1mmol/L，所述亮抑酶肽的含量为0.005～0.05mmol/L，所述胃蛋白酶抑制剂的含量为0.005～0.05mmol/L，所述十二烷基硫酸钠的含量为0.1～0.5％，所述焦磷酸钠的含量为0.05～0.1mmol/L。
优选的，所述样本稀释液中含有三(羟甲基)氨基甲烷、盐酸、曲拉通X-100、氯化钠，其中，所述三(羟甲基)氨基甲烷的含量为48～75g/L，所述盐酸的含量为0.05～0.5mmol/L，所述曲拉通X-100的含量为0.1～0.5％，所述氯化钠的含量为180～240mmol/L。
优选的，所述底物应用液中还含有PBS和牛血清蛋白，所述pNA基肽的含量为5～30mmol/L，所述PBS缓冲液的浓度为50mM且其pH为7.8～8.4，所述牛血清蛋白的含量为0.2-1.0％。
优选的，所述pNA标准品中pNA的含量25mmol/L，所述pNA标准品的溶剂为乙醇和水的混合溶剂；更加优选的，所述乙醇和水的体积比为1:1。
本发明第二方面提供了一种检测样品血管紧张素II转换酶活力的方法，所述方法使用上述试剂盒进行检测，具体步骤如下：
S1、取组织样品或细胞样品，加入ACE2提取液，冰水浴条件下，放入匀浆容器中进行匀浆，离心后取上清液并取其部分上清液检测蛋白含量，采用样本稀释液稀释剩余的上清液，并记稀释倍数为f，将稀释后的上清液置于冰上待测；
S2、酶标板上设置标准孔、样本孔、样本空白孔，其中，标准孔加入一系列不同浓度的标准品，样本孔加入步骤S1中稀释后的上清液，样本空白孔中加入ACE2提取液；
S3、向标准孔中加入体系缓冲液，向样本孔和样本空白孔中加入底物应用液，振荡混匀，恒温T下孵育一段时间后，用酶标仪405nm测定各孔的OD值；再继续孵育一段时间h后，用酶标仪405nm测定各孔的第二个OD值；
S4、根据步骤S3中标准孔的数据，以pNA浓度为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线；
S5、计算酶活力：
Figure BDA0002645474520000031
其中：ΔA1：步骤S3中第一次测量时的样本OD值-样本空白OD值，
ΔA2：步骤S3中第二次测量时的样本OD值-样本空白OD值，
a：标准曲线的斜率，
V样：加入体系的样本体积，
h：第二次孵育的时间，
f：步骤S1中上清液的稀释倍数，
Cpr：待测样本的蛋白浓度gprot/L；
U定义为：在反应体系中，在固定温度T下，每克蛋白每分钟催化产生1μmol pNA为一个活力单位。
优选的，步骤S1中所述组织样品的量10～50mg，所述细胞样品为1～2×106个，所述ACE2提取液的提取液为200～400μL。
本发明的有益效果为：本发明提供的pNA基肽，不仅具有特异性，而且可以在ACE2的作用下生成黄色物质pNA，很容易通过比色法测定，进而计算ACE2的活性；而且，使用普通酶标仪和分光光度计检测，降低了仪器检测成本。本发明的方法与荧光法相比还具有以下优点：批间差：CV≤5.0％，回收率：95-105％，反应时间由原来的30min降为15min，最低检出限达到了0.28mU。
附图说明
图1为实施例3中的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种血管紧张素II转换酶(ACE2)活性检测试剂盒，包含以下试剂：
体系缓冲液：称取1.75g磷酸氢二钠、0.28g磷酸二氢钾和0.04g BSA，用0.1M KOH调pH值至8.0后，用双蒸水定容至100mL，制备体系缓冲液100mL，1瓶×40mL，4℃保存。
ACE2提取液：称取5.6g三(羟甲基)氨基甲烷、0.2mL曲拉通X-100、17.5mg去氧胆酸钠、1.2g氯化钠、13.5mg EDTA、2.2mg抑蛋白酶肽、1.5mg亮抑酶肽、1.8mg胃蛋白酶抑制剂、0.1g十二烷基硫酸钠、2.2mg焦磷酸钠，用0.1M HCl调pH值至8.0后，用双蒸水定容至100mL，制备ACE2提取液，2瓶×50mL，4℃避光保存。
样本稀释液：称取5.6g三(羟甲基)氨基甲烷、0.2mL曲拉通X-100、1.2g氯化钠，用0.1M HCl调pH值至8.0后，用双蒸水定容至100mL，制备样本稀释液100mL，2瓶×50mL，4℃保存。
底物应用液：称取1g pNA基肽(AngⅠ-pNA)、80mLPBS(50mM，pH为8.0)、0.04g牛血清蛋白，用双蒸水定容至100mL，制备底物应用液100mL，1瓶×40mL，4℃保存。
pNA标准品：称取34.5mg pNA、5mL乙醇、5mL水，定容至10mL，1瓶，4℃避光保存。
实施例2
使用实施例1提供的试剂盒，检测血管紧张素II转换酶(ACE2)的活性，具体步骤如下：
(1)样本的处理
组织样本：
取组织样品，加入400μL ACE2提取液，冰水浴条件下，放入匀浆容器中，进行匀浆，4℃，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，取部分上清液用BCA法蛋白检测试剂盒检测蛋白含量。组织匀浆上清需用样本稀释液稀释成不同浓度进行预实验。
细胞样本：
取细胞样品，加入400μL ACE2提取液，冰水浴条件下，放入匀浆容器中，进行匀浆，4℃，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，取部分上清液用BCA法蛋白检测试剂盒检测蛋白含量。细胞匀浆上清需用样本稀释液稀释成不同浓度进行预实验。
(2)测定
检测环境室内温度25-30℃，最佳检测波长405nm，最终反应体积300μL。
酶标板可参照表1设置：
表1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A A A S0 S8 S16 S24 S32 S40 S48 S56 S64 S72
B B B S1 S9 S17 S25 S33 S41 S49 S57 S65 S73
C C C S2 S10 S18 S26 S34 S42 S50 S58 S66 S74
D D D S3 S11 S19 S27 S35 S43 S51 S59 S67 S75
E E E S4 S12 S20 S28 S36 S44 S52 S60 S68 S76
F F F S5 S13 S21 S29 S37 S45 S53 S61 S69 S77
G G G S6 S14 S22 S30 S38 S46 S54 S62 S70 S78
H H H S7 S15 S23 S31 S39 S47 S55 S63 S71 S79
注：A-H：标准孔；S0：样本空白孔；S1-S79：测定孔。
操作步骤
①标准孔：加20μL 0、2、4、6、8、10、12、14mmol/L的标准品；
测定孔：加20μL待测样本；
样本空白孔：加20μL ACE2。
②用多道移液器向步骤①中样本空白孔和测定孔加280μL底物应用液，向步骤①中标准孔加280μL体系缓冲液，振荡混匀，37℃孵育10min，酶标仪405nm测OD值为A1。
③37℃再孵育5min，酶标仪405nm测OD值为A2。另外，需要说明的是，第一次孵育的时间和第二次孵育的时间可以相同也可以不同，但每次孵育的时间均为5～20min。
注：待测样本和标准品加入酶标孔时，应触酶标板底加入；加样要慢，避免产生气泡。(气泡影响测定结果)
需要注意的是：
1.一般情况下，样本空白每批次只需做1-2孔。
2.若是大批量的样本，在正式检测前，需挑取1-2例预期差异大的样本。
3.请用多道移液器加底物应用液以缩短时间，减少各孔间的误差；并要充分混匀，保证样本与试剂充分接触。
(3)ACE2活力的计算
Figure BDA0002645474520000061
其中，ΔA1：10min时的样本OD值-样本空白OD值，ΔA2：15min时的样本OD值-样本空白OD值，a：标准曲线的斜率，V样：加入体系的样本体积，10：第二次孵育时间5min，f：样本加入体系前的稀释倍数，Cpr：待测样本的蛋白浓度gprot/L；
U的定义为：在反应体系中，在37℃下，每克蛋白每分钟催化产生1μmolpNA为一个活力单位。
实施例3
采用实施例1中的试剂盒和实施例2中的检测方法，取如下四个样品：大鼠肾组织、大鼠肺组织、小鼠心脏组织和肾小管内皮细胞进行检测。
标曲数据如表2所示，并绘制标准曲线如图1所示。
表2
Figure BDA0002645474520000062
样本检测结果如表3所示，从检测结果中，可以发现测量的结果复孔差比较小；测定更加简便快捷，可用于高通量的检测。
表3
Figure BDA0002645474520000071
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，包含以下试剂：体系缓冲液，ACE2提取液，样本稀释液，底物应用液，pNA标准品；所述底物应用液中含有pNA基肽，所述pNA基肽为由ACE2特异性底物多肽与pNA偶联合成的物质，所述pNA基肽中ACE2特异性底物多肽的羧基端与pNA通过肽键偶联。
2.根据权利要求1所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述ACE2特异性底物多肽为AngⅠ、AngII、孤儿G蛋白耦联受体-13、内啡肽及神经加压素中的一种。
3.根据权利要求1所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述体系缓冲液中含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和牛血清蛋白，且pH为7.8～8.4，所述磷酸氢二钠的含量为15.0～22.5g/L，所述磷酸二氢钾的含量为2.5～3.5g/L，所述牛血清蛋白的含量为0.1～0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述ACE2提取液中含有三(羟甲基)氨基甲烷、盐酸、曲拉通X-100、去氧胆酸钠、氯化钠、EDTA、抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂、十二烷基硫酸钠和焦磷酸钠；其中，所述三(羟甲基)氨基甲烷的含量为48～75g/L，所述盐酸的含量为0.1～0.5mmol/L，所述曲拉通X-100的含量为0.1～0.5％，所述去氧胆酸钠的含量为0.2～1.0mmol/L，所述氯化钠的含量为180～240mmol/L，所述EDTA的含量为0.2～1.5mmol/L，所述抑蛋白酶肽的含量为0.01～0.1mmol/L，所述亮抑酶肽的含量为0.005～0.05mmol/L，所述胃蛋白酶抑制剂的含量为0.005～0.05mmol/L，所述十二烷基硫酸钠的含量为0.1～0.5％，所述焦磷酸钠的含量为0.05～0.1mmol/L。
5.根据权利要求3所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液中含有三(羟甲基)氨基甲烷、盐酸、曲拉通X-100和氯化钠，其中，所述三(羟甲基)氨基甲烷的含量为48～75g/L，所述盐酸的含量为0.05～0.5mmol/L，所述曲拉通X-100的含量为0.1～0.5％，所述氯化钠的含量为180～240mmol/L。
6.根据权利要求1所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述底物应用液中还包括PBS缓冲液和牛血清蛋白，所述pNA基肽的含量为5～30mmol/L，所述PBS缓冲液的浓度为50mM且其pH为7.8～8.4，所述牛血清蛋白的含量为0.2-1.0％。
7.根据权利要求1所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述pNA标准品中pNA的含量25mmol/L，所述pNA标准品的溶剂为乙醇和水的混合溶剂。
8.根据权利要求7所述的血管紧张素II转换酶活性检测试剂盒，其特征在于，所述乙醇和水的体积比为1:1。
9.一种检测样品血管紧张素II转换酶活力的方法，其特征在于，使用权利要求1～8任一权利要求所述的试剂盒，具体步骤如下：
S1、取组织样品或细胞样品，加入ACE2提取液，冰水浴条件下，放入匀浆容器中进行匀浆，离心后取上清液并检测该上清液的蛋白含量，采用样本稀释液稀释离心后的上清液，并记稀释倍数为f，将稀释后的上清液置于冰上待测；
S2、酶标板上设置标准孔、样本孔、样本空白孔，其中，标准孔加入一系列不同浓度的标准品，样本孔加入步骤S1制备的上清液稀释液，样本空白孔中加入ACE2提取液；
S3、向标准孔中加入体系缓冲液，向样本孔和样本空白孔中加入底物应用液，振荡混匀，恒温T下孵育一段时间后，用酶标仪405nm测定各孔的OD值；继续孵育时间h后，再次用酶标仪405nm测定各孔的OD值；
S4、根据步骤S3的数据，以pNA的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
S5、计算酶活力：
Figure FDA0002645474510000021
其中：ΔA1：第一次测量时的样本OD值-样本空白OD值，
ΔA2：第二次测量时的样本OD值-样本空白OD值，
a：标准曲线的斜率，
V样：加入体系的样本体积，
h：第二次孵育的时间，
f：样本加入体系前的稀释倍数，
Cpr：待测样本的蛋白浓度gprot/L，
U定义为：在反应体系中，在固定温度T下，每克蛋白每分钟催化产生1μmol pNA为一个活力单位。
10.根据权利要求1所述检测样品血管紧张素II转换酶活力的方法，其特征在于，步骤S1中所述组织样品的量10～50mg，所述细胞样品为1～2×106个，所述ACE2提取液的提取液为200～400μL。
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