CN104792779A - 一种重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒，包括以下含量的组分：FAPGG， 0.5mmol/L ；氯化钠，300 mmol/L；硼酸盐缓冲液，PH 8.2，80mM；AEO-9；0.1%-1% ；采用本发明提供的试剂盒检测血管紧张素转化酶克服了现有技术中重复性差的缺陷。

Description

一种重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种血管紧张素转化酶检测试剂盒。

背景技术

血管紧张素转化酶（Angiotensin-Converting Enzyme, ACE, EC 3.4.15.1，系统命名为肽酰二肽水解酶，是一种哺乳动物组织中普遍存在的，含锌离子的膜结合外肽酶（羧基端二肽），催化血管紧张素Ⅰ水解生成具有血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ或水解具有血管收缩功能的缓激肽生成苯丙-精二肽，在食品和药品行业广泛使用。自 1898 年发现肾素以来，有关肾素-血管紧张素系（renin-angiotensin system, RAS 或 renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）和激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-Kinin System, KKS）的研究已进行了一百多年，这两个系统主要通过 ACE 对血压、电解质、体液平衡和心血管系统发育等控制而间接发挥作用，为此，RAS 和 KKS 在心脏和肾脏疾病中起着至关重要的作用，它所显示的作用和功能已远远超出了人们的设想。目前 ACEI（Angiotensin-Converting Enzyme inhibitors）已经成为急性心肌梗死和心力衰竭治疗的一类标准药物（如：卡托普利captopril、依那普利 enalapril、西拉普利 cilazapril、贝拉普利 cilazapril、赖诺普利 lisinopril、雷米普利 ramipril）。然而长期使用 ACEI 药物会出现咳嗽、肾功能减退、蛋白尿、高钾血症、低血压、肝功能异常、味觉和肠胃功能紊乱、皮疹、血管神经性水肿等不良反应。

1954年，Leonard T. Skeggs博士从马血浆中首次发现ACE，并发现此酶能催化血管紧张素Ⅰ水解去掉羧基端二肽（His-Leu）生成具有血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ。Ng 和Vane发现体内的ACE催化循环系统（RAS 和 KKS）定位在肺中，此结果后来被很多研究验证。

2000年，在研究和寻找与心衰相关的新基因时，两个研究小组各自采用不同的方法从特发性扩张性心肌病病人的心脏标本和人淋巴瘤标本中克隆得到同 1 个新基因，并分别命名为ACE2和ACEH，随后统一称为 ACE2。它是迄今为止发现的ACE的第一个同类酶。在来源分布上，ACE在人体广泛分布，而ACE2 有一定的组织特异性，主要存在于心脏和肾脏的动脉、小动脉和小静脉，肾小管内皮，及肾内动脉和冠状动脉的平滑肌细胞及胃肠系统。Gembardt等报道ACE2在鼠的肺脏中也有存在。

ACE 通常以三种形式存在，它们是一个基因的不同剪接产物。异构体Ⅰ在组织中普遍存在，称为体细胞 ACE（somatic ACE, sACE），含有 1306 个氨基酸残基。异构体Ⅱ和异构体Ⅲ表达于睾丸组织和成熟的精子细胞中，称为睾丸 ACE（testic ACE, tACE），分别含有 732个氨基酸和 739 个氨基酸残基。ACE2 由 805 个氨基酸组成，表观分子量 120×103Da，其中包括 1 个由 17 个氨基酸组成的 N-末端信号肽区，1 个位于 274~378 位氨基酸的金属蛋白酶锌结合区 HEXXH 和 1 个锚定在细胞膜上的 C-末端。ACE2 与 ACE 在金属蛋白酶的催化结构域约有 42%的同源性。sACE 由 1306 个氨基酸组成，表观分子量 149×103Da，其中包括 N端信号肽30个氨基酸、两个同源的催化活性中心（N-catalytic domain）和（C-catalyticdomain）、亲脂跨膜区1257~1276位氨基酸和细胞内结构域组成。tACE由732个氨基酸组成，只含1个催化活性中心，其中异构体Ⅱ表观分子量为80×103Da，异构体Ⅱ表观分子量83×103Da。异构体Ⅱ除了信号肽和N端与sACE 稍有差异，从68个氨基酸残基开始，它们的序列完全相同。异构体Ⅲ与异构体Ⅱ的N完全相同，但第657个氨基酸开始就有所差异。

目前测定血清 ACE的方法有放射性核素法、分光光度法、荧光法、毛细管胶束电动色谱法。放射性核素法易受放射性核素的污染，不适于医院常规应用。分光光度法操作繁琐, 无法用于临床日常测定。荧光法、毛细管胶束电动色谱法由于受到设备限制, 无法广泛应用。用高效液相色谱法测定组织 ACE酶活性, 敏感性和特异性大大高于常用的紫外分光光度法。但是由于受设备限制, 推广难度较大。

血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法）检测原理为在ACE催化下，血管紧张素I转化为血管紧张素II，并使合成底物裂解为氨基酸和二肽。340nm检测裂解反应，可见吸光度相应减低。

血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法）是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法，由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的血管紧张素转化酶检测试剂由于重复性不好，会使该试剂的准确性受到影响，不利于对检测结果的判断，从而造成误诊的后果。

发明内容

针对于常规的血管紧张素转化酶检测试剂盒存在的问题，本发明提供了一种重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法），该试剂盒与常规的血管紧张素转化酶检测试剂盒相比，重复性比常规的检测试剂盒要好，但稳定性和准确度不受影响，有利于提高试剂的重复性。

本发明是通过以下措施实现的：

一种重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法），包括组分R，组分原料含量如下：

组分R：                                        

FAPGG       ( N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸)    0.5mmol/L          

氯化钠                                                    300 mmol/L

硼酸盐缓冲液（PH 8.2）                              80mM

AEO-9                                                      0.1%-1%

本发明的有益效果：

本发明提供的重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法），通过在组分中加入AEO-9，通过分子中不同部分分别对于两相的亲和，使两相均将其看作本相的成分，分子排列在两相之间，使两相的表面相当于转入分子内部。从而降低表面张力。由于两相都将其看作本相的一个组分，就相当于两个相与表面活性剂分子都没有形成界面，就相当于通过这种方式部分的消灭了两个相的界面，就降低了表面张力和表面自由能，从而解决了试剂重复性不好这一难题，却不会对试剂的稳定性和准确度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1为实施例2检测结果与实施例1检测结果相关性；

图2为实施例3检测结果与实施例1检测结果相关性；

图3为实施例4检测结果与实施例1检测结果相关性。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

实施例1

组分R：                                        

FAPGG                                    0.5mmol/L

氯化钠                                   300 mmol/L

硼酸盐缓冲液（PH 8.2）               80mM

本实施例描述的血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法），在使用时，其测定方法是采用自动生化分析仪，如东芝120自动分析仪，操作如图：

。

实施例2

组分R：                                

FAPGG                                    0.5mmol/L

氯化钠                                 300 mmol/L

硼酸盐缓冲液（PH 8.2）       80mM

AEO-9                                  0.1%

检测方法如实施例1。

实施例3

组分R：                                        

FAPGG                                    0.5mmol/L

氯化钠                                 300 mmol/L

硼酸盐缓冲液（PH 8.2）       80mM

AEO-9                                  0.5%

具体测定方法同实施例1。

实施例4                                        

组分R：                                        

FAPGG                                    0.5mmol/L

氯化钠                                 300 mmol/L

硼酸盐缓冲液（PH 8.2）        80mM

AEO-9                                  1%

具体测定方法同实施例1。

准确度验证实验：

应用实施例2、3、4的试剂盒与实施例1试剂盒进行对比，对40个样本进行检测，检测的结果相关性如图1-图3。

通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与实施例1检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9964、0.9969、0.9961，均大于要求的0.990，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与常规的血管紧张素转化酶检测试剂盒有高度一致性，证明其准确性不受影响。

线性相关性验证实验：

找到血管紧张素转化酶高值样本为150 U/L，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为150 U/L、120 U/L、90 U/L、60 U/L、30 U/L、0 U/L浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表所示：

 

检测结果显示，实施例1至实施例4检测结果相关性均大于0.990，达到产品标准要求，说明在试剂中加入AEO-9不会降低试剂检测的线性相关性。

稳定性验证实验：

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。

检测数据如下表：

 

实验结果显示，实施例1-实施例4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中能有效贮存15个月稳定，说明在试剂中加入AEO-9不会影响血管紧张素转化酶检测试剂盒的稳定性。

重复性验证实验：

在重复性条件下，用质控血清（正常值范围内）测试四种试剂（盒），重复测试10次，计算变异系数（CV）。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表所示：

 

实验结果显示，实施例1的重复性为7.80%，而实施例2-实施例4的重复性分别为3.66%、3.35%、3.85%，均比实施例1的重复性好，说明在试剂中加入AEO-9能够有效的提高血管紧张素转化酶检测试剂盒的重复性。

本发明提供的重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法），在试剂中通过加入一定量的AEO-9能够有效的提高血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法）的重复性，而对试剂的准确度和稳定性没有影响。因此，本发明提供的重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒（比色法）有利于在市场中进一步的推广使用。

Claims (1)

1.一种重复性好的血管紧张素转化酶检测试剂盒，  包括以下含量的组分：                                     

FAPGG                                           0.5mmol/L          

氯化钠                                                    300 mmol/L

硼酸盐缓冲液，PH 8.2                           80mM

AEO-9                                                      0.1%-1%    。