CN1693878A - 一种定标测定血管紧张素转换酶的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

Buttery(1993)的FAPGG速率法定量测定血管紧张素转换酶活性在临床化学检验上应用较为普遍。但是，Buttery氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法定标的血管紧张素转换酶标准品，从而造成测试精确度下降，不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，还是血管紧张素转换酶正常参考范围数据混乱、不可比性的主要原因。本发明用Hurst氏法(1981)确定血管紧张素转换酶标准品的活性。再应用Buttery氏法以标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的血管紧张素转换酶的活性。本发明解决了Buttery氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了血管紧张素转换酶正常参考范围数据的可比性。本发明还涉及用于进行上述方法的试剂盒。

Description

一种定标测定血管紧张素转换酶的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种生物样本中测定血管紧张素转换酶活性的技术方案以及有此方案制造的试剂。特别是涉及一种将定量测定血管紧张素转换酶活性的FAPGG速率法标准化的技术方案。

背景技术

Buttery(1993)应用血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)酶解苯丙氨酰双甘氨肽类化合物(furylacryloylphenylalanylglycylglycine，FAPGG)生成苯丙氨酰类化合物(furylacryloylphenylalanine，FAP)及双甘氨肽(glycylglycine，GG)。FAPGG最大吸收峰在340nm，酶促反应造成340nm处吸光度下降。通过连续监测测定FAPGG在340nm处吸光度下降的速度可计算出ACE的活性。

一个单位ACE活性定义为在Buttery氏法条件下37℃每分钟消耗一个微摩尔(μmol)底物FAPGG所需ACE酶量。其原理反应方程式如下：

Buttery JE，Stuart S.评估和优化血浆测定血管紧张素转换酶的动力学方法。临床化学杂志。1993年2月；39(2)：312-6。[Buttery JE，Stuart S.Assessment and optimization of kineticmethods for angiotensin-converting enzyme in plasma.Clin Chem.1993Feb；39(2)：312-6.]

Buttery氏法缺点在于没能使用一种公认的标准法定标的标准品，从而造成测试精确度下降，不同实验室应用不同生化分析仪引起的仪器误差，这是ACE正常参考范围数据混乱、不可比性的主要原因。

Hurst(1981)应用ACE酶解马尿组氨酰亮氨酸(N-hippuryl-l-histidyl-l-leucine，HHL)生成马尿酸(hippuric acid)和二肽组氨酰亮氨酸(histidyl-leucine)。马尿酸和氰尿酸氯化物(2，4，6-trichloro-s-triazine，Cyanuric Chloride)/1，4-二恶烷(1，4-dioxane)反应生成有色终点产物，该产物可在382nm处定量测定。通过制定马尿酸标准曲线，可定量ACE活性。ACE活性(单位/升，U/L)定义为在Hurst氏法条件下37℃每分钟产生一个μmol马尿酸所需ACE酶量。

Paul L.Hurst和Chris J.Lovell-Smith.优化血清血管紧张素转换酶的测定。临床化学杂志。27/12，2048-2052(1981)[Paul L.Hurst and Chris J.Lovell-Smith.Optimized Assayfor Serum Angiotensin-Converting Enzyme Activity.Clin.Chem.27/12，2048-2052(1981)]

尽管Hurst氏法可定量测定ACE活性，但实验步骤复杂，不适于临床生化检验。

发明内容

本发明在Buttery氏法中加入ACE标准品。用Hurst氏法确定ACE标准品的活性。再应用Buttery氏法以ACE标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的ACE活性。本发明解决了Buttery氏法的缺陷，提高了测试精确度、减少了仪器误差和增强了ACE正常参考范围数据的可比性。

以本发明的定标测定ACE的方法配制了测定ACE的试剂盒。

具体实施方式

1.ACE标准品和其活性的确定

1)ACE标准品成分

0-200U/L人源基因重组ACE

2)ACE标准品活性的确定

参照Hurst氏法，在含0.2ml孵育缓冲液(200mM硼酸，2M氯化纳pH 8.3)试管中加入0.1ml蒸馏水和0.1ml ACE标准品(0-200U/L)，37℃孵育5分钟。加入0.1ml 20mM HHL底物溶液启动反应15分钟。加入0.5ml 1M盐酸(HCl)溶液终止反应，30秒后加入0.5ml 1M氢氧化钠(NaOH)中和反应。加入2ml 200mM磷酸钾稀释液pH 8.3，随后1.5ml显色液(3％氰尿酸氯化物溶于1，4-二恶烷)，混匀，静止5分钟，再混匀，每分3000转离心10分钟。取上清液在382nm处定量测定吸光度。用不同浓度马尿酸(μmol/L)代替底物HHL，按上述方法同样测取上清液在382nm处吸光度，以此画出标准曲线。有ACE标准品的吸光度从标准曲线上求出对应的马尿酸浓度(μmol/L)，将其除以反应时间15分钟即得出ACE标准品活性(U/L)。ACE活性(U/L)定义为在Hurst氏法条件下37℃每分钟产生一个μmol马尿酸所需ACE酶量。

2.样本ACE活性的测定

参照Buttery氏法用ACE标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的ACE活性。

1)试剂组成

ACE底物溶液：含FAPGG的硼酸盐缓冲液pH 8.2

2)生物样本

0-200U/L人源基因重组ACE。

3)试验参数与操作步骤

温度        37℃

波长        340nm

比色杯光径  1.0cm

测试方法    定时速率法

反应方向    负

反应时间    10分钟

样本/试剂   1∶10

水调零(340nm)

予孵育      ACE底物溶液和样本预温至37℃

启动反应    0.25ml ACE底物溶液+0.025ml样本读吸光值A₀(340nm)

孵育时间    10分钟

终止反应    读吸光值A₁₀(340nm)

测试仪      Shimadzu UV-160

4)计算

计算测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(A_{10}-A_0)}{10}$

样本ACE(U/L)＝(ΔAx/ΔAc)×Ec

其中：ΔAx＝样本ΔA/min

      ΔAc＝标准品ΔA/min

        Ec＝ACE标准品的活性(U/L)

5)结果

ACE线性范围0-200(U/L)

3.ACE测定试剂盒

产品名称：血管紧张素转换酶(ACE)检测试剂盒

型号：生化试剂

产品代码：DC-ACE

规格：ACE底物溶液150ml，ACE标准品(冻干)1ml/1瓶，ACE正常血清(冻干)1ml/1瓶，ACE异常血清(冻干)1ml/1瓶，600测试/盒。

检测介质：血清

适用于体外诊断

用途

血管紧张素转换酶(ACE)检测试剂盒适用于体外定量测定人血清中血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)活性。ACE测定有助于结节病的诊断、激素治疗、高血压和心衰ACE阻断剂用药疗效的监测。

概述

血管紧张素转化酶(ACE)亦称为激肽酶II是分子量为129KDa的二肽酰羧肽酶(EC3.4.15.1)。ACE在许多细胞上表达，诸如神经元细胞，近端肾小管细胞，尤其是内皮细胞。膜蛋白ACE可从膜上切除成为可溶性ACE进入血液循环。血清ACE显著增高见于节结病和高血压。

ACE连续监测法不仅适用于诊断/预后节结病，高血压和心衰ACE阻断剂用药疗效的监测，该法亦可用于筛选ACE阻断物，后者是高血压的有效治疗药物。ACE连续监测法准确性好、精密度高，适宜在临床和新药开发上推广应用。

原理

应用ACE酶解苯丙氨酰双甘氨肽类化合物(furylacryloylphenylalanylglycylglycine，FAPGG)生成苯丙氨酰类化合物(furylacryloylphenylalanine，FAP)及双甘氨肽(glycylglycine，GG)。FAPGG最大吸收峰在340nm，酶促反应造成340nm处吸光度下降。通过连续监测测定FAPGG在340nm处吸光度下降的速度，再以ACE标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的ACE活性。

一个单位ACE活性定义为在本法条件下37℃每分钟消耗一个微摩尔底物FAPGG所需ACE酶量。其原理反应方程式如下：

试剂盒组份

每个ACE试剂盒含有：

1.ACE底物溶液            150ml/1瓶

2.ACE标准品(冻干)        1ml/1瓶

3.ACE正常血清(冻干)      1ml/1瓶

4.ACE异常血清(冻干)      1ml/1瓶

5.检验证明

6.1份使用说明。

试剂组成

ACE底物溶液              FAPGG缓冲液pH8.2

ACE标准品                人源基因重组蛋白

ACE质控血清              人源基因重组蛋白和人血清

试剂配制

ACE底物溶液为液体试剂，可直接上机使用。

ACE标准品和ACE质控血清是冻干品，需要溶于1ml蒸馏水中方可使用。

试剂的稳定与贮存期

试剂避光保存2-8℃一年。配制好的ACE标准品和ACE质控血清2-8℃可至少保存一月，-20℃冷冻可保存半年。

样本收集

仅用非溶血的血清。抗凝血浆含EDTA，它抑制ACE活性。血清中ACE活性2-8℃稳定7天，-20℃中半年。

试验参数与操作步骤

温度        37℃

波长        340nm

比色杯光径  1.0cm

测试方法    定时速率法

反应方向    负

反应时间    10分钟

样本/试剂   1∶10

水调零(340nm)

予孵育      ACE底物溶液和样本预温至37℃

启动反应    0.25ml ACE底物溶液+0.025ml样本读吸光值A₀(340nm)

孵育时间    10分钟

终止反应         读吸光值A₁₀(340nm)

计算

计算测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(A_{10}-A_0)}{10}$

样本ACE(U/L)＝(ΔAx/ΔAc)×Ec

其中：ΔAx＝样本ΔA/min

      ΔAc＝标准品ΔA/min

        Ec＝ACE标准品的活性(U/L)

注意事项

1.试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。

2.若样品ACE＞200U/L，也即用1cm比色杯光径反应吸光值变化(A₀-A₁₀)大于0.1，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。

3.如保存不当，试剂发现有混浊时，应弃用。

试剂性能

线性范围：0-200U/L(r²＞0.998)

精密度：  批内CV 2.9％和批间CV 5.2％

特异性：  1.32mM Angiotensin I、4.68mM EDTA和15.6mM H-val-Trp-OH*2H₂O分别抑制ACE活性82％、94％和93％。

稳定性：  ACE底物溶液置于37℃下72小时对其效力无影响。

参考值

正常人血清ACE活性参考值37-110U/L。建议各实验室根据自身实验条件自行订定正常人血清ACE活性范围。

仪器

全自动、半自动生化分析仪或可见光分光光度计

产品特征

液体单试剂

特异性测定ACE

测定精密度高

抗干扰能力强

适合自动化快速测定

参考文献

参阅实申参考资料。

Claims (2)

1.一种测定生物样本中血管紧张素转换酶活性的方法，其特征是借助Hurst氏法(1981)确定血管紧张素转换酶标准品的活性，再应用Buttery氏法(1993)通过血管紧张素转换酶酶解FAPGG生成FAP和GG，以连续监测测定FAPGG在340nm处吸光度下降的速度结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的血管紧张素转换酶的活性。

2.一种按权利要求1制造的测定生物样本中血管紧张素转换酶活性的产品，其特征是借助Hurst氏法(1981)确定血管紧张素转换酶标准品的活性，再应用Buttery氏法(1993)通过血管紧张素转换酶酶解FAPGG生成FAP和GG，以连续监测测定FAPGG在340nm处吸光度下降的速度结合标准品的活性为参照，定量测定生物样本中的血管紧张素转换酶的活性。