CN1693475A - 二肽酰肽酶iv试剂盒 - Google Patents

Abstract

Heins氏法(1984)应用Gp－pNA速率法定量测定二肽酰肽酶IV活性。该反应体系适用于含单一成分二肽酰肽酶IV的检测介质，而对于其他检测介质例如体液(血清或血浆)，由于众多干扰因素的存在，该法选择、特异性受影响。迄今为止还没有用Heins氏法原理制造的适合临床化学检检的二肽酰肽酶IV试剂盒问世。本发明应用二肽酰肽酶IV降解底物甘氨酸－脯氨酸－对硝基酰基苯胺生成产物对硝基苯胺，通过动态测量对硝基苯胺405nm处吸光度上升的速度来测算二肽酰肽酶IV的活性。本发明的二肽酰肽酶IV试剂盒适用于血清、血浆、体液或细胞学样本中测定二肽酰肽酶IV的活性。

Description

二肽酰肽酶IV试剂盒

技术领域

本发明涉及一种有生物样本中测定二肽酰肽酶IV活性的方法制造的试剂。

背景技术

Heins(1984)应用二肽酰肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV，DPP IV)降解底物甘氨酸-脯氨酸-对硝基酰基苯胺(Gly-Pro-para-nitroanilide，Gp-pNA)生成产物对硝基苯胺(para-nitroaniline)，通过动态测量对硝基苯胺405nm处吸光度上升的速度来测算DPP IV的活性。一个单位DPP IV活性定义为在在法条件下37℃每分钟消耗一个微摩儿底物Gp-pNA所需DPP IV酶量。其原理反应方程式如下：

Heins J，Neubert K，Barth A，Canizaro PC，Behal FJ.动力学研究人和猪肾二肽酰肽酶IV水解氨酰基对硝基苯胺。生化生物物理学报1984年2月28；785(1-2)：30-5。[Heins J，Neubert K，Barth A，Canizaro PC，Behal FJ.Kinetic investigation of the hydrolysisof aminoacyl p-nitroanilides by dipeptidyl peptidase IV from human and pig kidney.Biochim Biophys Acta.1984Feb 28；785(1-2)：30-5.]

Heins氏法反应体系适用于单一成分DPPIV的检测介质。对于其他检测介质例如体液(血清、血浆)，由于众多干扰因素的存在，该法选择、特异性受影响。迄今为止还没有用Heins氏法原理制造的适合临床化学检检的DPPIV试剂盒问世。

发明内容

本发明用Heins氏法原理制造了DPPIV试剂盒。本发明的DPPIV试剂配方在Heins氏法的基础上进行了改进，使其不光可应用于单一成分DPPIV的检测介质，还适用于血清、血浆、体液或细胞学样本中测定DPPIV活性。

具体实施方式

1.确定Gp-pNA Michaelis常数Km

1)试剂组成

试剂I    ATE反应液pH8.3含500U/L猪肾DPP IV

试剂II   Gp-pNA            1-200mmol/L

2)试验参数与操作步骤

温度              37℃

波长              405nm

比色杯光径        1.0cm

测试方法          速率法

反应方向          正

予孵育            2.925ml 试剂I

予孵育时间             3分钟

405nm处调零

启动反应               加0.075ml试剂II

测试时间               5分钟

测试仪                 Shimadzu UV-160

3)计算

计算出测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

4)结果

以ΔA/min作为反应速率V，用1/V作为Y轴，Gp-pNA浓度S的倒数1/S作为X轴。作Lineweaver-Burke图。求得Gp-pNA Km 3.8×10^-4mol/L。

2.确定对硝基苯胺毫摩尔消光系数ε

1)试剂组成

试剂I            ATE反应液pH 8.3含500U/L猪肾DPP IV

试剂II           Gp-pNA                   40mmol/L

2)试验参数与操作步骤

温度             37℃

波长            405nm

比色杯光径      1.0cm

测试方法        速率法

反应方向        正

予孵育          2.925ml 试剂I

予孵育时间      3分钟

405nm处调零

启动反应        加0.075ml 试剂II

延迟时间        4小时

测试仪          Shimadzu UV-160

动态观察对硝基苯胺吸光度上升，至4小时后达到峰值。也即1mmol/L Gp-pNA完全降解。然后，在405nm波长测定对硝基苯胺的吸光度

3)结果

ε：毫摩尔消光系数  在本法条件下对硝基苯胺ε＝5.744mM^-1cm^-1

3.DPPIV测定试剂盒

产品名称：二肽酰肽酶IV(DPP IV)试剂盒

型号：生化试剂

产品代码：DC-DPP IV

规格：试剂I(R1)37ml，试剂II(R2)DPPIV底物(冻干)1ml/1瓶，DPPIV正常血清(冻干)1ml/1瓶，DPPIV异常血清(冻干)1ml/1瓶，100测试/盒。

检测介质：血清、血浆、体液或细胞学样本

适用于体外诊断

用途

二肽酰肽酶IV(DPP IV)试剂盒适用于体外定量测定人血清、血浆、体液或细胞学样本中的二肽酰肽酶IV(Dipeptidyl-peptidase IV，DPP IV)活性。DPP IV测定有助于口腔癌和结肠癌的临床诊断和预后。

概述

二肽酰肽酶IV(DPP IV)是细胞表面蛋白酶，它将第二位置是脯氨酸或丙氨酸的多肽的氨基末端二肽去除。除其本身催化活性外，它和其他蛋白诸如腺苷脱氨酶，HIV gp120蛋白，纤维结合素，蚀原，化学激动受体CXCR4和酪氨酸磷酸酶CD45作用。DPP IV在T淋巴细胞亚型和多种组织内皮/表皮细胞上表达，其可溶型亦存在于血浆和体液中。DPP IV是多种疾病的诊断和预后的新指标。

·口腔癌

日本临床检测表明口腔鳞状细胞癌患者血清DPPIV活性显著下降(P＜0.001)。其活性和临床治疗的疗效有关。预后好的患者血清DPPIV活性上升，反之下降。

·结肠癌

临床检测表明结肠癌患者血清DPPIV活性显著增高(P＜0.05)。其中已转移的结肠癌患者血清DPPIV活性显著高于正常人(P＜0.01)。血清DPPIV活性检测尤其对早期结肠癌诊断和预后有益。

原理

DPP IV降解底物甘氨酸-脯氨酸-对硝基酰基苯胺(Gly-Pro-para-nitroanilide，Gp-pNA)生成产物对硝基苯胺(para-nitroaniline)，通过动态测量对硝基苯胺405nm处吸光度上升的速度来测算DPP IV的活性。一个单位DPP IV活性定义为在在法条件下37℃每分钟消耗一个微摩儿底物所需DPP IV酶量。其原理反应方程式如下：

试剂盒组份

每个DPP IV试剂盒含有：

1.试剂I(R1)                  37ml/1瓶

2.试剂II(R2)(冻干)           1ml/1瓶

3.DPP IV正常血清(冻干)       1ml/1瓶

4.DPP IV异常血清(冻干)       1ml/1瓶

5.检验证明

6.1份使用说明。

试剂组成

试剂I            ATE反应液pH 8.3

试剂II           DPP IV底物(Gp-pNA)

DPPIV质控血清    DPP IV(猪肾)和人血清

试剂配制

试剂I为液体试剂，可直接上机使用。

试剂II和DPPIV质控血清是冻干品，需要溶于1ml蒸馏水中方可使用。

试剂的稳定与贮存期

试剂避光保存2-8℃一年。配制好试剂II后，最好分装小管，-20℃冷冻可保存半年。如果保存2-8℃，也可贮存一月。配制好的DPPIV质控血清2-8℃可至少保存一月。

样本收集

用新鲜和非溶血的血清或血浆。

试验参数与操作步骤

温度                      37℃

波长                      405nm

比色杯光径                1.0cm

测试方法                  速率法

反应方向                  正

样本/试剂                 1∶19

予孵育                    0.02ml样品+0.37ml R1(或依比例混匀)

予孵育时间                3分钟

405nm处调零

启动反应                  加0.01ml R2(或依比例混匀)

空白参照                  R1

测试时间                  5分钟

总反应时间                5分钟

测试仪                    Shimadzu UV-160

计算

计算测试时间段每分钟平均吸光度的变化(ΔA/min)。

$\mathrm{\ΔA}/\min =\frac{(\mathrm{\Δ}{A}_1/\min +{\mathrm{\ΔA}}_2/\min +{\mathrm{\ΔA}}_3/\min )}{3}$

$\mathrm{DPP\; IV}(U/L)=\frac{\mathrm{\ΔA}/\min \×\mathrm{Tv}}{\mathrm{\ϵ}\×\mathrm{Sv}\×L}$

ε：微摩尔消光系数  在本法条件下对硝基苯胺(ε₄₀₅＝5744×10^-6μM^-1cm^-1)(1cm光径)

Tv：总反应体积(ml)

Sv：样品体积(ml)

L：比色杯光径(cm)

当比色杯光径1cm时DPP IV(U/L)＝ΔA/min×3482

当比色杯光径0.5cm时DPP IV(U/L)＝ΔA/min×6964

注意事项

1.试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。如果受限于分析仪只能接受单试剂，则可以在测试前依比例(详见试验参数)混合试剂I及试剂II成为一混合剂。

2.若样品DPP IV＞1,000U/L，也即用1cm比色杯光径反应吸光值变化大于0.287A/min，须用生理盐水稀释样品，结果乘以稀释倍数。

3.如保存不当，试剂发现有混浊时，应弃用。

试剂性能

DPPIV线性范围：0-1000U/L(r²＞0.998)

精密度：批内CV 4.85％和批间CV 9.8％

特异性：35mg/dL胆红素、350mg/dL血红蛋白、875mg/dL甘油三酯和12mg/dL抗坏血酸对本法无干扰。

参考值

血清正常人DPP IV活性参考值男性17.7-52.6U/L，女性17.0-50.8U/L。建议各实验室根据自身实验条件自行订定正常人血清DPP IV活性范围。

仪器

全自动、半自动生化分析仪或可见光分光光度计

产品特征

液体单试剂

特异性测定DPP IV

测定精密度高

抗干扰能力强

适合自动化快速测定

参考文献

参阅实申参考资料

Claims (1)

1.一种测定生物样本中二肽酰肽酶IV活性的产品，其特征是按Heins氏(1984)的原理，应用二肽酰肽酶IV降解底物甘氨酸-脯氨酸-对硝基酰基苯胺生成产物对硝基苯胺，通过动态测量对硝基苯胺405nm处吸光度上升的速度来测算二肽酰肽酶IV的活性。