CN104388530A - 一种稳定性强的乳酸检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定性强的乳酸检测试剂，属于临床体外检测技术领域。本发明试剂包括试剂R1和试剂R2两种组分，各组分中物质合理搭配使用，使整个试剂体系处于一种稳定状态，与常规乳酸检测试剂相比，本发明试剂具有更加优异的稳定性效果，利于临床的推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种稳定性强的乳酸检测试剂，属于临床体外检测技术领域。
背景技术
血乳酸（LAC）是体内糖代谢的中间产物，主要由红细胞、横纹肌和脑组织产生，血液中的乳酸浓度主要取决于肝脏及肾脏的合成速度和代谢率。在某些病理情况下（如呼吸衰竭或循环衰竭时），可引起组织缺氧，由于缺氧可引起体内乳酸升高。另外，体内葡萄糖代谢过程中，如糖酵解速度增加，剧烈运动、脱水时，也可引起体内乳酸升高，体内乳酸升高可引起乳酸中毒。
乳酸中毒分为A、B 两种类型：A 型(有组织低氧血症的临床证据)，包括休克(心源性、脓毒性、低血容量性)、严重低氧血症、Co 中毒及严重哮喘；B 型(无组织低氧症的临床证据)，其中包括糖尿病、肝病脓毒症等与基础病症有关的乳酸中毒，另外还包括乙醇、甲醇、硝普钠等药物和毒素引起的乳酸中毒。因此检查体内血乳酸水平至关重要，可提示潜在疾病的严重程度。
乳酸检测方法较多，目前应用的测试方法有YSI血乳酸分析仪测试法、分光光度法，比色法和酶学测定法等。但是由于YSI血乳酸分析仪测试法、分光光度法和比色法三种方法分析灵敏度不是很高，容易受其他成分的干扰，因此现在医院和科研机构多使用酶法进行检测，这种方法试剂分析灵敏度高，结合全自动生化分析仪器操作方便，成本合理，多为人们所接受。但是液态试剂中需要加入部分酶参与反应，其中加入的过氧化物酶对底物的专一性差，干扰反应严重，分析准确度差。此外，试剂中的乳酸氧化酶，在液体状态下不稳定，在温度偏高的情况下容易失活，若果增加乳酸氧化酶的量，必然会增加成本，为产品的推广带来很大的影响。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种稳定性强的乳酸检测试剂。
本发明所采用的技术方案是：
一种稳定性强的乳酸检测试剂，其特征在于，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 10mmol/L -100mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 10μmol/L-100μmol/L
过氧化物酶 2KU/L-20KU/L
抗坏血酸酶 2KU/L-8KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 2.5g/L-10g/L
叠氮钠 1g/L-5g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L；
所述试剂R2各组分为：
PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 10mmol/L-100 mmol/L
纳米粒子 5-30mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 1g/L- 10g/L
明胶 1g/L-10g/L
乳酸氧化酶D 2KU/L-8KU/L
氯化钠 2.5g/L-10 g/L
叠氮钠 1g/L-5 g/L。
所述纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，粒径为5-30nm。
作为本发明的一种优选组分，所述试剂R1各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 50mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 60μmol/L
过氧化物酶 10KU/L
抗坏血酸酶 6KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 6g/L
叠氮钠 3g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L。
作为本发明的另一种优选组分，所述试剂R2中各组分：
1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 50 mmol/L
纳米粒子 20mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 6g/L
明胶 6g/L
乳酸氧化酶D 6KU/L
氯化钠 8 g/L
叠氮钠 3 g/L。
本发明所述的γ-Fe2O3纳米粒子是采用常规微乳-水热法或超声沉淀法合成。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用对羟基苯甲酸作为反应的新型色原，其本身不易分解，在试剂中的稳定性强，检测效果好，且成本低廉。试剂R1中添加了具有氧化性的乙酸锰（Ⅲ），该物质可有效出去胆红素、头孢类、维生素C等还原性物质的干扰。
2、在试剂R2中通过加入γ-Fe2O3纳米粒子增强了过氧化物酶的活性以及对底物的专一性，减少了抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽及胆红素等还原性物质的干扰，同时γ-Fe2O3纳米粒子还作为反应的催化剂，与过氧化物酶共同作用催化Trinder反应，使得反应进行的更彻底，提高了检测准确度及灵敏度。
3、本发明配方中试剂R1选用Tris- EDTA.Na2(pH=7.4)缓冲液，试剂R2中选用PIPES- EDTA.Na2生物缓冲液 (pH=7.4)，两种缓冲液缓冲能力强，配合使用效果好，对反应体系不会产生任何干扰且对反应的酶的活性也没有任何抑制作用，因而构成了一种稳定的缓冲体系。
4、本发明在试剂R2中同时加入明胶和脂肪醇聚氧乙烯醚两种表面活性剂，明胶主要为氨基酸组成相同而分子量分布很宽的多肽分子混合物，具有优良的胶体保护性、表面活性、稳定性和水易溶性，而脂肪醇聚氧乙烯醚则是一种长链的非离子表面活性剂，能够有效的包裹和保护乳酸氧化酶的活性基团，从而减缓乳酸氧化酶的失活，这两种表面活性剂的加入为乳酸氧化酶的存在提供了良好的稳定空间，尤其是在抵抗温度相对偏高的环境下，效果较好。
附图说明
图1是本发明实施例1-4所得试剂7天37℃热稳定性验证结果；
图2是本发明实施例1-4所得试剂15天开瓶稳定性验证结果；
图3是本发明实施例1所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；
图4是本发明实施例2所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；
图5是本发明实施例3所得试剂与对照组试剂检测结果线性相关图；
其中，图1中1-4分别为实施例1-4低值质控结果，5-8分别为实施例1-4高值质控结果；图2中1-4分别为实施例1-4低值质控结果，5-8分别为实施例1-4高值质控结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
一种稳定性强的乳酸检测试剂，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1中各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 10mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 10μmol/L
过氧化物酶 2KU/L
抗坏血酸酶 2KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 2.5g/L
叠氮钠 1g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L；
所述试剂R2各组分为：
PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 10mmol/L
纳米粒子 5mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 1g/L
明胶 1g/L
乳酸氧化酶D 2KU/L
氯化钠 2.5g/L
叠氮钠 1g/L。
上述纳米粒子为采用常规微乳-水热法合成的粒径为5-20nm的γ-Fe2O3纳米粒子。
实施例2
一种稳定性强的乳酸检测试剂，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1中各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 100mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 100μmol/L
过氧化物酶 20KU/L
抗坏血酸酶 8KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 10g/L
叠氮钠 5g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L；
所述试剂R2各组分为：
PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 100 mmol/L
纳米粒子 30mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 10g/L
明胶 10g/L
乳酸氧化酶D 8KU/L
氯化钠 10 g/L
叠氮钠 5 g/L。
上述纳米粒子为采用常规超声沉淀法合成的粒径为20-30nm的γ-Fe2O3纳米粒子。
实施例3
一种稳定性强的乳酸检测试剂，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1中各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 50mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 60μmol/L
过氧化物酶 10KU/L
抗坏血酸酶 6KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 6g/L
叠氮钠 3g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L。
所述试剂R2中各组分为：
1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 50 mmol/L
纳米粒子 20mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 6g/L
明胶 6g/L
乳酸氧化酶D 6KU/L
氯化钠 8 g/L
叠氮钠 3 g/L。
上述纳米粒子为采用常规超声沉淀法合成的粒径为10-20nm的γ-Fe2O3纳米粒子。
实施例4
一种市场上现有的乳酸检测试剂配方，其试剂组成为：
试剂R1：
Tris缓冲液 （pH8.5） 100mmol/L
乳酸氧化酶D 10KU/L
抗坏血酸酶 8KU/L
TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐) 1mol/L
氯化钠 2.5g/L-10g/L
叠氮钠 1g/L-5g/L；
试剂R2：
Tris缓冲液 （pH8.5） 100mmol/L
4-氨基安替比林 0.75mmol/L
过氧化物酶 20U/ml
氯化钠 2.5g/L-10g/L
叠氮钠 1g/L-5g/L。
稳定性试验验证：
将实施例1-4制得的试剂进行稳定性试验验证。试剂稳定性验证的具体操作方法为：对于试剂的稳定性验证，将分为试剂的15天开瓶稳定性和7天37℃热稳定性验证。验证试验所用校准品和质控品分别为：
校准品：朗道复合标准（846UN）其中LAC的含量为15.3mg/dl
质控品：朗道复合高值质控：620UE(靶值：49.3 mg/dl，靶值范围：40.5-58.1 mg/dl)；朗道复合低值质控：897UN(靶值：14.0 mg/dl，靶值范围：11.4-16.6 mg/dl)。
首先将实施例1-4中的检测试剂，按照配方配置好，实施例1-3为本发明试验组，实施例4为对照组；每一个实施例配方中分别取相同的两组，一组做15天开瓶稳定性试验，将试剂开瓶放置在仪器的2-8℃冷藏箱中（15天不取出），作为15天开瓶稳定性检测；另一组做37℃热稳定性，封闭放置在37℃恒温水浴锅中（每天仅在检测的时候取出，检测完毕后，依然封口放回37℃水浴锅中，连续7天），作为7天37℃热稳定性验证。
将试剂同时在东芝-120全自动生化分析仪器上，按照如下表1方法进行检测，并在仪器上建立标准曲线。分别取朗道的高、低值冻干粉质控品，溶解均匀后，各自平均分成15份，-20℃储存，每天高、低值质控各取一个，并且跟踪检测结果，其跟踪监测趋势如图1，2。
表1 乳酸检测试剂检测方法
计算乳酸含量（μmol/L）＝（?A测定/min÷?A标准/min）×C标准。
通过上述图1和2不难看出对照组试剂无论是7天37℃热稳定性还是15天试剂开瓶稳定性，试剂的稳定性都比较差，试剂衰减比较快，而实施例1-3所制得的试剂，其7天37℃热稳定性和15天试剂开瓶稳定性，都很稳定。这主要是由于本发明在R1和R2中分别建立起以Tris-EDTA.Na2和PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）-EDTA.Na2为基础的缓冲体系，本缓冲体系在要求的缓冲范围内，缓冲能力强，不参加不干扰整个生化反应，并且对酶的活性不产生任何的抑制作用使整个反应体系稳定；同时本发明R1中加入了抗坏血酸氧化酶和乙酸锰（Ⅲ）去除还原性物质对生化反应的干扰，选取对羟基苯甲酸作为反应的色原，提高试剂的抗干扰能力和解决色原易分解的问题，提高色原在试剂中自身的稳定性；另外还在R2试剂中加入了加入明胶和AEO-9(脂肪醇聚氧乙烯醚)两种表面活性剂，来增强R2试剂中酶的稳定性。
相关性试验验证：
对实施例1-3制得的试剂与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的乳酸测定试剂进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表2所示。试验还研究了本发明实施例1-3所得的试剂与对照组试剂检测的相关性曲线，如图3-5所示。
表2 实施例1-3试剂与市场常见并得到认可的乳酸测定试剂对比检测结果
如图3-5的检测结果显示，本发明试剂与对照组试剂的相关性较好，相关系数最高可达0.9968，说明了本发明的乳酸检测试剂具有较好的准确度及灵敏度，符合国家食品药品监督管理局的要求。
Claims (4)
1.一种稳定性强的乳酸检测试剂，其特征在于，它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 10mmol/L -100mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 10μmol/L-100μmol/L
过氧化物酶 2KU/L-20KU/L
抗坏血酸酶 2KU/L-8KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 2.5g/L-10g/L
叠氮钠 1g/L-5g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L；
所述试剂R2各组分为：
PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 10mmol/L-100 mmol/L
纳米粒子 5-30mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 1g/L- 10g/L
明胶 1g/L-10g/L
乳酸氧化酶D 2KU/L-8KU/L
氯化钠 2.5g/L-10 g/L
叠氮钠 1g/L-5 g/L。
2.根据权利要求1所述的乳酸检测试剂，其特征在于，所述纳米粒子为γ-Fe2O3纳米粒子，粒径为5-30nm。
3.根据权利要求1所述的乳酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R1各组分为：
Tris缓冲液(pH=7.4) 100mmol/L
EDTA.Na2 50mmol/L
乙酸锰（Ⅲ） 60μmol/L
过氧化物酶 10KU/L
抗坏血酸酶 6KU/L
对羟基苯甲酸 1mol/L
氯化钠 6g/L
叠氮钠 3g/L
4-氨基安替比林 0.25mmol/L。
4.根据权利要求1所述的乳酸检测试剂，其特征在于，所述试剂R2中各组分：
1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液(pH=7.4) 50mmol/L
EDTA.Na2 50 mmol/L
纳米粒子 20mmol/L
脂肪醇聚氧乙烯醚 6g/L
明胶 6g/L
乳酸氧化酶D 6KU/L
氯化钠 8 g/L
叠氮钠 3 g/L。
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Effective date of registration: 20160805 Address after: 250200, Shandong, Ji'nan province Zhangqiu fifth middle school 17 classes Applicant after: Meng Yiran Address before: 250200 Shandong city of Ji'nan province Zhangqiu City Economic Development Zone Mingshui Shandong brocade Industrial Park Applicant before: BIOBASE BIODUSTRY (SHANDONG) Co.,Ltd. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Effective date of registration: 20221222 Address after: Class 17, Senior 2, No. 5 Middle School, Zhangqiu, Jinan City, Shandong Province, 250200 Patentee after: Meng Yiran Patentee after: BIOBASE BIODUSTRY (SHANDONG) Co.,Ltd. Address before: Class 17, Senior 2, No. 5 Middle School, Zhangqiu, Jinan City, Shandong Province, 250200 Patentee before: Meng Yiran |