CN110734953B - 一种l-乳酸盐检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种L‑乳酸盐检测试剂盒。本申请的试剂盒包括20mmol/L至300mmol/L，pH＝6至9的缓冲液、乳酸氧化酶0.1至2.0ku/L、过氧化物酶0.1ku/L至10ku/L、4‑氨基安替比林0.1至30mmol/L、色原0.1mmol/L至30mmol/L、防腐剂0.01％‑5％、非离子表面活性剂、两性表面活性剂和蛋白类稳定剂。本申请的试剂盒具有抗Vc干扰，开盖存放1个月不用定标，有效期内试剂外观变化不明显，非干粉液体试剂等优点。

Description

一种L-乳酸盐检测试剂盒
技术领域
本申请涉及临床检验领域。具体而言，本申请涉及一种用于测定L-乳酸盐含量的试剂。
背景技术
乳酸是糖代谢(糖酵解)的中间产物，由乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成。乳酸主要来源于骨骼肌、脑、皮肤、肾髓质和红细胞。
乳酸循环是指葡萄糖在外周组织转化为乳酸，而乳酸在肝脏中又转化为葡萄糖。肝外乳酸通过骨骼肌和肾皮质的氧化作用清除。乳酸产物增加会促进肝对乳酸的清除，但当乳酸浓度超过2mmol/L时，肝脏对其的摄取就会达到饱和，发生乳酸酸中毒情况。
在肌肉细胞中，乳酸浓度升高表明代谢性酸中毒可能是乳酸中毒。与剧烈活动有关的组织缺氧会提高血清乳酸浓度。由呼吸衰竭或低灌注状态引起的组织缺氧，则可见到危及生命的乳酸中毒。严重的脱水也会导致肌肉细胞的氧传送的减少。乳酸中毒可能经常伴随糖尿病酮中毒。组织氧耗量的加大，如在败血症和恶性肿瘤中所见，也会导致乳酸中毒。乳酸酸血症的严重程度可以帮助揭示潜在疾病的严重性。
目前临床检测乳酸的诊断技术包括化学比色法、酶促反应-分光光度法、乳酸氧化酶电极测定方法、液相色谱法等。其中化学比色法准确性差，手续烦复，不能自动化。酶法有乳酸脱氢酶法和乳酸氧化酶法。乳酸脱氢酶法有紫外法和偶联四氮唑盐的比色法。乳酸氧化酶法的检测原理为：
Figure BDA0002208909110000011
Figure BDA0002208909110000012
与脱氢酶法相比，氧化酶法具有更多的优点，其特异性及灵敏度好，方法可靠、灵敏，结果准确，重复性好；既适用于手工操作，又适用于全自动生化分析仪，在市场上占主导地位。
目前市售的L-乳酸盐试剂盒为干粉状态，不方便医院使用，且复溶后试剂稳定性差，不能长期放置。鉴于此，本领域仍然需要一种稳定的L-乳酸盐检测产品。
发明内容
本申请提供了一种L-乳酸盐检测试剂盒，其包含：
Figure BDA0002208909110000021
在一些实施方式中，缓冲液选自：Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液、Pipes缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液及其组合。
在一些实施方式中，缓冲液浓度为20mmol/L至300mmol/L(mM)，例如，20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、200、220、250、300mmol/L，或其任意之间的范围；例如20至50mmol/L；20至100mmol/L；30至80mmol/L。
在一些实施方式中，缓冲液的pH在6至9之间，优选pH为6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0、8.2、8.5、9.0；优选pH为6至8、6.5至8、6.5至7.5、6.5至7、7.0至9.0、7.0至8.0、7.0至7.5、7.5至9.0、7.5至8.5、7.5至8.0、8.0至9.0、8.0至8.5、或者8.5至9.0；更优选7.0至9.0、7.5至9.0；最优选8.0至9.0或者8.5至9.0。
在一些具体的实施方式中，缓冲液pH为8.5至9.0的Tris缓冲液。
在一些实施方式中，乳酸氧化酶在试剂中的浓度为0.1ku/L至2.0ku/L；优选0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0ku/L；更优选0.5至1.5ku/L、0.75至1.5ku/L、0.8至1.5ku/L、1.0至1.5ku/L、1.2至1.5ku/L、0.8至1.2ku/L、1.0至1.2ku/L、或者0.8至1.0ku/L；最优选0.8至1.2ku/L。
在一些具体的实施方式中，乳酸氧化酶在试剂中的浓度为1.0ku/L。
在一些实施方式中，过氧化物酶在试剂中的浓度为0.1至10ku/L；优选0.5、0.75、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、8.0、10ku/L；优选浓度为0.5至1.2ku/L、0.75至1.2ku/L、0.8至1.2ku/L、1.0至1.2ku/L；0.75至1.0ku/L、0.8至1.0ku/L；0.5至2.0ku/L、1.0至2.0ku/L；最优选0.75至1.0ku/L。
在一些具体的实施方式中，过氧化物酶在试剂中的浓度为0.8ku/L。
在一些实施方式中，4-氨基安替比林在试剂中的浓度为0.1mmol/L至30mmol/L；优选0.5mmol/L至5mmol/L、0.5mmol/L至2mmol/L、0.75mmol/L至2.0mmol/L、0.8mmol/L至1.2mmol/L；优选0.5、0.75、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0mmol/L；更优选0.75mmol/L至2.0mmol/L、0.8mmol/L至1.2mmol/L；最优选0.8mmol/L至1.2mmol/L。
在一些具体的实施方式中，4-氨基安替比林在试剂中的浓度为1mmol/L。
在一些实施方式中，色原选自：苯酚、3,5-二氯-2羟基苯磺酸钠、2-氨基-4-羟基苯磺酸和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐。
在一些实施方式中，色原在试剂中的浓度为0.1mmol/L至30mmol/L；优选0.5mmol/L至10mmol/L、1.0mmol/L至5mmol/L、2.0mmol/L至5.0mmol/L、3.0mmol/L至5.0mmol/L；优选0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5mmol/L；更优选2.0mmol/L至5.0mmol/L；最优选3.0mmol/L至5.0mmol/L。
在一些具体的实施方式中，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐在试剂中的浓度为4.0mmol/L。
在一些实施方式中，防腐剂在试剂中的浓度为按重量计0.01％至5.0％；优选0.01％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、1.0％、2.0％、3.0％；更优选0.1至1.0％、0.2至1.0％、0.3至0.8％、0.4至0.6％；0.2至2.0％、0.5至1.0％；最优选0.2至1.0％。在一些实施方式中，防腐剂选自：叠氮钠，叠氮锂、PC300、烷基糖苷、甲基异噻唑啉酮(也作MIT)及其组合。
在一些具体的实施方式中，叠氮钠在试剂中的浓度为0.5％。
在一些实施方式中，本申请中使用的非离子表面活性剂选自：Triton X-100、月桂醇、胆酸钠、正辛基葡萄糖苷、聚乙二醇单十二醚、聚氧乙烯烷基醚及其组合。非离子表面活性剂在试剂中的浓度按重量计为0.1％-10％；优选0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％；更优选0.1至1.0％、0.2至1.0％、0.3至0.8％、0.4至0.6％；0.2至2.0％、0.5至1.0％；最优选0.2至1.0％。
在一些具体的实施方式中，聚乙二醇单十二醚在试剂中的浓度为0.5％。在一些实施方式中，本申请中使用的两性表面活性剂选自：烷基二甲基胺醋酸甜菜碱、烷基羟磺基甜菜碱、月桂酸酰胺丙基甜菜碱、烷基羧甲基乙基咪唑甜菜碱及其组合。两性表面活性剂在试剂中的浓度按重量计为0.01％-5％；优选0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％；更优选0.1至2.0％、0.2至2.0％、0.2至1.5％、0.2至1.0％、0.3至1.0％、0.4至1.0％；0.5至1.0％；最优选0.2至1.0％。
在一些具体的实施方式中，烷基二甲基胺醋酸甜菜碱在试剂中的浓度为0.5％。
在一些实施方式中，本申请中使用的蛋白类稳定剂选自：谷氨酸盐、甘氨酸盐、牛血清白蛋白、卵清蛋白、多聚赖氨酸、脱脂奶粉及其组合。蛋白类稳定剂在试剂中的浓度按重量计为0.1％-10％；优选0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％；更优选0.1至0.5％、0.5至5.0％、1.0至5.0％、2.0至5.0％；0.5至4.0％、1.0至4.0％、2.0至4.0％；0.5至3.0％、1.0至3.0％、2.0至3.0％；最优选1.0至5.0％。
在一些具体的实施方式中，谷氨酸盐在试剂中的浓度为2.0％。
在一些具体的实施方式中，BSA在试剂中的浓度为0.1％。
在一些实施方式中，本申请提供的L-乳酸盐检测试剂盒是单试剂的形式；优选液体单试剂。
在一些实施方式中，本申请的L-乳酸盐检测试剂盒还含有1ku/L至100ku/L的抗坏血酸氧化酶。优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30ku/L；优选1至10ku/L、2至10ku/L、3至10ku/L、4至10ku/L、5至10ku/L；1至8ku/L、2至8ku/L、3至8ku/L、4至8ku/L、5至8ku/L；1至6ku/L、2至6ku/L、3至6ku/L、4至6ku/L、5至6ku/L；1至5ku/L、2至5ku/L、3至5ku/L、4至5ku/L；更优选2至10ku/L，最优选2至6ku/L。
在一些具体的实施方式中，抗坏血酸氧化酶的浓度为5ku/L。
在一些实施方式中，本申请的L-乳酸盐检测试剂盒还含有选自以下的试剂：校准品、质控品及其组合。校准品含有已知浓度的L-乳酸盐。可以自行配制校准品，也可以使用市售的校准品，包括但不限于例如C.f.a.s.校准品(货号10759350 190；10759350 360，美国罗氏)；Precinorm U货号10171743 122或Precinorm U plus货号12149435 122、12149435 160；Precipath U货号10171778 122或Precipath U plus货号12149443 122、12149443 160。可以自行配制质控品，也可以使用市售的质控品，包括但不限于例如英国Randox提供的质控品。
本申请提供一种L-乳酸盐检测试剂盒，其包含：
Figure BDA0002208909110000051
并且，所述试剂盒是液体单试剂的形式。
本申请提供一种L-乳酸盐检测试剂盒，其包含：
Figure BDA0002208909110000052
Figure BDA0002208909110000061
所述BSA选自：牛血清白蛋白第五组分、牛血清白蛋白(无必须脂肪酸级别)、牛血清白蛋白(无蛋白酶级)、牛血清白蛋白(细胞培养级)、金标级牛血清白蛋白、交联牛血清白蛋白；
优选地，所述BSA是牛血清白蛋白第五组分。
本申请的上述试剂盒不是干粉；本申请的试剂盒不是冻干粉。
具体实施方式
实施例1.L-乳酸盐检测试剂盒的制备
按照如下组成配制试剂盒：
Figure BDA0002208909110000062
该试剂为无色或淡黄色透明溶液。
实施例2.L-乳酸盐检测试剂盒的制备
按照如下组成配制试剂盒：
Figure BDA0002208909110000071
该试剂为无色或淡黄色透明溶液。
对比例1.
和实施例2的试剂盒相比，区别在于不含蛋白类稳定剂(如BSA)。
对比例2.
和实施例2的试剂盒相比，区别在于不含非离子表面活性剂。
对比例3.
和实施例2的试剂盒相比，区别在于：
(1)不含非离子表面活性剂，
(2)将Merck的BSA替换为Amresco的BSA(生物技术级)。
对比例4.
和实施例2的试剂盒相比，区别在于将Merck的BSA替换为Amresco的BSA(生物技术级)。
测试例1.L-乳酸盐的测定方式
检测工具：Olympus全自动生化分析仪；
分析方法：终点法；
主波长：540nm，副波长：700nm；
样本量：2.0μl；R1：200μl；
校准方式：线性Y＝AX+B；反应方向：上升；测定稳定：37℃；
样本与试剂混匀后，在37℃保温500秒后，以试剂+水空白调零，记录吸光度A。
计算方法：样本中L-乳酸盐浓度＝(A样本/A校准品)×校准品浓度；
参考范围(正常值)：血清(或血浆)4.5至20mg/dl。
测试例2.本申请的L-乳酸盐检测试剂盒的抗干扰性能检测
实施例1制备的试剂盒测定含有4种不同维生素C(VC)含量的L-乳酸盐样本。每个样本测3次，通过计算均值和回收率，得到试剂检测的抗干扰结果。
结果表明，Vc干扰浓度高达20mg/dl时，对本申请检测试剂的检测性能没有统计学意义上的显著影响。然而，对于对照试剂盒(朗道干粉试剂盒)而言，抗干扰能力仅为8mg/dl(见表1和表2)。
表1.本申请试剂盒(实施例1)的抗干扰性能检测
Figure BDA0002208909110000081
表2.对照试剂盒的抗干扰性能检测
Figure BDA0002208909110000082
测试例3.实施例1试剂盒的稳定性性能检测
(1)37℃加速稳定性
实施例1制备的试剂盒分别在4℃放置和37℃放置1、3、7、9、10天后检测空白和定标吸光度及血清样本。通过计算变化率和样本平均值，得到稳定性结果。
结果表明，与上述朗道干粉试剂盒相比，本申请的检测试剂盒以液体形态存在，空白吸光度变化小，定标吸光度变化率小于2％，测值稳定。
表3.本申请L-乳酸盐检测试剂盒的稳定性
Figure BDA0002208909110000091
R-1：空白第一点吸光度；
R-2：空白第二点吸光度；和
A：校准品吸光度。
表4.本申请L-乳酸盐检测试剂盒的稳定性
mg/dl 4℃ 37℃1天 37℃3天 37℃7天 37℃9天 37℃10天
1 13.22 13.60 13.30 13.23 13.09 13.42
2 13.39 13.60 13.09 13.00 13.19 13.42
3 13.39 13.35 13.12 13.23 13.38 13.29
4 50.38 52.58 49.30 51.42 50.85 50.36
5 50.83 51.97 50.62 50.86 50.65 52.47
6 51.29 51.60 50.33 51.84 50.67 51.84
7 35.50 36.46 35.31 35.62 35.53 35.45
8 22.74 22.78 22.60 22.80 22.33 23.15
9 20.08 20.18 19.60 20.14 19.50 19.97
10 32.66 33.48 32.87 32.77 32.92 33.27
11 25.24 25.67 25.37 25.41 25.15 25.51
12 20.44 20.64 19.97 20.55 20.16 20.58
13 18.92 18.82 18.25 18.45 18.37 18.47
14 32.89 33.23 32.65 32.79 32.33 33.03
15 8.43 8.44 8.28 8.26 8.21 8.42
平均值 27.29 27.76 26.98 27.36 27.09 27.51
(2)开盖稳定性
用实施例1制备的试剂盒在试剂仓内开盖放置1个月，检测高和低值质控，计算CV。
结果显示，本申请的检测试剂盒开盖1个月后质控测值良好，CV变化小于1％。
表5.本申请的检测试剂盒的开盖稳定性
Figure BDA0002208909110000101
测试例4.实施例2的试剂盒和对比例1-4的稳定性比较
表6.实施例2的试剂盒和对比例1-4的稳定性比较
Figure BDA0002208909110000102
Figure BDA0002208909110000111
现有技术中的酶法试剂基本不使用阴离子、阳离子以及两性表面活性剂，认为这些对试剂中的部分酶有影响，会影响酶活，导致测值不准。
然而，本发明人发现在试剂盒中采用非离子表面活性剂+两性表面活性剂(或稳定剂+两性表面活性剂)，稳定性不如非离子表面活性剂和两性表面活性剂的组合再配合稳定剂(即，非离子+两性+蛋白类稳定剂)。
随放置时间的增加，Trinder试剂会从无色逐渐变红。从表6的结果可见，实施例2的试剂盒在37℃放置7天后空白变化最小，表明试剂的颜色变化更不明显；校准吸光度变化最小，表明该试剂稳定性最好。BSA根据加工方法和组成可以分为多个级别，例如牛血清白蛋白第五组分、牛血清白蛋白(无必须脂肪酸)、牛血清白蛋白(无蛋白酶)、牛血清白蛋白(细胞培养级)等。发明人出乎意料地发现，不同BSA级别对试剂稳定性的影响是不同的。
本申请的试剂使得可以以稳定的液体状态使用，并且以液体形态保存，方便医生上机使用。试剂盒中还可以任选添加抗坏血酸氧化酶，提供抗Vc效果。

Claims (2)

1.一种L-乳酸盐检测试剂盒，其包含：
Figure FDA0003549720740000011
所述试剂盒是液体形式。
2.一种L-乳酸盐检测试剂盒，其包含：
Figure FDA0003549720740000012
所述试剂盒是液体形式。
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