CN103403179A - 检测良好健康的生物标记物的阴道指示剂 - Google Patents

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Abstract

描述了一种针对有益于阴道健康的生物标记物的诊断试剂盒。所述试剂盒包括第一检测区域，在所述第一检测区域内能够生成D-乳酸检测信号，其中D-乳酸的存在或量是可通过D-乳酸检测信号来测定的。所述试剂盒包括第二检测区域，在所述第二检测区域内能够生成过氧化氢检测信号，其中过氧化氢的存在或量是可通过过氧化氢检测信号来测定的。

Description

检测良好健康的生物标记物的阴道指示剂
背景
女性阴道天然地被各种细菌、酵母菌和微生物定殖。例如，在正常的阴道中，每毫升的阴道流体中通常含有多于约104个乳酸杆菌（lactobacilli）。在正常条件下，阴道菌群提供了温和的酸性环境，有助于防止病原微生物的入侵。不幸的是，这种阴道平衡可以容易地被各种外部因素扰乱，最终导致阴道感染。
例如，细菌性阴道病是一种多微生物阴道感染，被认为是由阴道中厌氧生物体的量升高和伴随的乳酸杆菌的降低引起的。阴道中乳酸杆菌的量降低具有降低对营养的竞争和降低存在的乳酸的量（即，使pH升高）的双重影响。这允许机会致病菌在阴道内增殖，在正常情况下所述机会致病菌的生长是被阴道的乳酸杆菌和酸性pH抑制的。阴道阿托波氏菌（Atopobium vaginae）、拟杆菌属（Bacteroides spp.）、阴道加德纳氏菌（Gardnerella vaginalis）、动弯杆菌属（Mobiluncus）、巨球形菌属（Megasphera）、人型支原体（Mycoplasma hominis）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）和普雷沃氏菌属（Prevotella）是一些在BV感染期间流行的种类。
细菌性阴道病的症状一般包括难闻的气味、高于约5.0的升高的阴道pH、稀薄的均质分泌物、和线索细胞（即，被革兰染色不定的小杆菌包覆的阴道上皮细胞）的存在。
当前阴道细菌感染的治疗方案涉及多种广谱抗生素如甲硝唑的使用。然而，由于抗生素可以杀灭阴道内的广范围的正常菌群，包括有益的乳酸杆菌，因此抗生素通常是不适合的。由于乳酸杆菌能够抑制阴道中的各种机会致病菌，因此这可能导致继发性并发症。治疗可能随后需要进一步的治疗方案，如摄入发酵乳制品来代替体内的乳酸杆菌，以及通过抗真菌剂治疗。由于缺少乳酸杆菌而导致的厌氧菌的水平上升可以进一步使感染复杂化。当在阴道内频繁使用抗生素时，抗生素可能通过从阴道吸收而导致全身毒性。此外，治疗的相对容易不应被误解为不具有临床意义。妊娠是细菌性阴道病能够导致严重问题的特别的时期。细菌性阴道病越来越多地被认为是早产的影响因素，并且使分娩过程中发病率和死亡率升高。
先前对细菌性阴道病检验的努力一直局限于检测与感染特异性相关的生物标记物。这些方法的明显缺点在于，对于检测细菌性阴道病感染的检验，细菌性阴道病感染必然已经存在。迄今为止，能够提供频繁的阴道健康评估以促进更好的卫生行为并可能地改变行为以避免细菌性阴道病感染以及其它感染的检验是不存在的。具体而言，能够在健康的时候使女性显著放心和在不健康的时候提供适当阴道护理指导的检验是不存在的。
因此，目前需要快速、廉价和易于使用的检验，所述检验能够告知女性其阴道健康的情况。利用这样检验的方法也将是有益的。
概述
根据本发明的一个实施方案，描述了一种针对有益于阴道健康的生物标记物的诊断试剂盒。所述试剂盒包括第一检测区域，在所述第一检测区域内能够生成D-乳酸检测信号，其中D-乳酸的存在或量是可通过D-乳酸检测信号测定的。所述试剂盒还包括第二检测区域，在所述第二检测区域内能够生成过氧化氢检测信号，其中过氧化氢的存在或量是可通过过氧化氢检测信号测定的。
在本公开的又一个实施方案中，描述了一种用于检测有益于阴道健康的生物标记物的方法。所述方法包括将检验样品与检验试剂盒接触，所述检验试剂盒包括第一检测区域，在所述第一检测区域内能够生成D-乳酸检测信号。D-乳酸的存在或量是可以由D-乳酸检测信号测定的。所述检验试剂盒还包括第二检测区域，在所述第二检测区域内能够生成过氧化氢检测信号，其中过氧化氢的存在或量是可以由过氧化氢检测信号测定的。所述方法还包括由D-乳酸检测信号检测D-乳酸的存在或量，以及由过氧化氢检测信号测定过氧化氢的存在或量。
以下将更详细地讨论本发明的其它特征和方面。
附图的简要说明
参照附图，在说明书的其余部分更加具体地阐述了针对一个本领域普通技术人员的本发明的完整的和可行的公开，包括其最佳模式，其中：
图1是可以用于本发明的诊断检验试剂盒的化验装置的一个实施方案的透视图。
在本说明书和附图中引用标记的重复使用意图代表本发明的相同或类似的特征或要素。
代表性实施方案的详细描述
定义
如本文所使用，术语“阴道（vagina）”一般是指女性生殖系统从子宫颈延伸到前庭的内部结构。术语也试图包括外生殖器（例如，大阴唇、小阴唇和阴蒂）。
如本文所使用，术语“检验样品（test sample）”一般是指针对能够指示阴道健康状态的某些生物标记物进行检验的材料。例如，检验样品可以从生物来源获得或来自生物来源，如生理流体。此外，固体材料可以用作检验样品。检验样品可以从来源获得后直接使用，或在预处理以改变样品的特征后使用。例如，这样的预处理可以包括由血液制备血浆、稀释粘性流体等。预处理的方法还可以涉及过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、对干扰组分进行灭活、加入试剂等。此外，修饰固体检验样品以形成液体介质也可能是有益的。
详述
现在将详细参照本发明的各实施方案，所述实施方案的一个或多个实施例阐述如下。每个实施例以解释本发明而不是限制本发明的方式被提供。事实上，对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的范围或精神的情况下，可以在本发明中作出各种修改和变化。例如，作为一个实施方案的部分说明或描述的特征可以用于另一个实施方案中以产生又一个实施方案。因此，本发明的目的在于涵盖落入所附权利要求及其等同的范围的这样的修改和变化。
一般地，本发明针对用于检测指示阴道健康状态的生物标记物的存在和/或量的技术。例如，在某些实施方案中采用诊断检验试剂盒，所述试剂盒能够用于分别指示检验样品中的乳酸和过氧化氢的存在和/或量。
在这方面，阴道和乳酸杆菌形成共生关系，其中阴道上皮细胞以糖原的形式提供维持乳酸杆菌群体的营养，乳酸杆菌菌群提供对其它病原体的防御。具体而言，乳酸杆菌产生酸化阴道的乳酸（在本文中也可替换地称为乳酸（lactate）），以及防止病原体增长的过氧化氢（在本文中也可替换地称为过氧化物）。健康阴道的乳酸杆菌群体能够大量产生乳酸和过氧化氢。
乳酸具有两种异构形式，L-乳酸和D-乳酸。L-乳酸是由人体和细菌两者产生的，而D-乳酸仅由细菌产生。在阴道菌群中，已知乳酸杆菌是显著量地产生D-乳酸的唯一的细菌种。虽然阴道上皮细胞产生一些D-乳酸，但是认为大部分阴道D-乳酸是由乳酸杆菌菌群产生的。因此，D-乳酸的量是阴道健康状态的准确指示。已确定的是，检验样品的阴道中存在的D-乳酸的量高于约10mg/mL时，指示健康的状态。例如，在某些实施方案中，阴道中存在的D-乳酸的量高于约12mg/mL时，指示健康的状态。在某些实施方案中，阴道中存在的D-乳酸的量高于约15mg/mL时，指示健康的状态，在其它实施方案中，阴道中存在的D-乳酸的量高于约20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL或200mg/mL时，指示健康的状态。
D-乳酸的检测可以通过基于酶的化验来完成，所述基于酶的化验如利用D-乳酸脱氢酶或D-乳酸氧化酶的化验。D-乳酸脱氢酶产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的还原形式，而D-乳酸氧化酶产生过氧化氢。
例如，在某些实施方案中，D-乳酸的定量可以包括多个酶反应。在由D-乳酸脱氢酶（D-LDH）催化的一级反应中，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的存在下，D-乳酸（D-乳酸（lactate））被氧化成丙酮酸（1）。
然而，由于反应（1）的平衡倾向于D-乳酸和NAD+，因此可以利用进一步的反应来“捕获”丙酮酸产物。这是在大量过剩的D-谷氨酸存在下，通过使用D-谷氨酸-丙酮酸转氨酶（D-GPT），将丙酮酸转化为D-丙氨酸和2-酮戊二酸来实现的（2）。
在上述（1）中形成的NADH的量与D-乳酸的量是成化学当量的。在心肌黄酶的存在下，可以利用适合的显色剂对存在于检验样品中的D-乳酸进行定量（3）。
适合的显色剂可以包括四氮唑试剂，所述四氮唑试剂包括以下：pABT（对甲氧基苄基氯化四氮唑蓝（p-Anisyl Blue Tetrazolium Chloride））；pApNBT，对甲氧基苄基-对硝基氯化四氮唑蓝（p-Anisyl-p-Nitro BlueTetrazolium Chloride）；BSPT，噻唑蓝（2-2′-苯并噻唑基-5-苯乙烯基-3-(4′-邻苯二甲酰肼基)氯化四氮唑)；B T，氯化四氮唑蓝；BTSPT，2-(2′-苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4′-邻苯二甲酰肼基)-氯化四氮唑；CTC，(5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四氮唑)；DMDPT，[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基]溴化四氮唑，1-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑；DSNBT，二苯乙烯基硝基蓝氯化四氮唑；(1H)-四唑；IDNTT，碘硝基氯化四氮唑；INT，碘硝基氯化四氮唑紫，对碘硝基四氮唑紫（(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基氯化四氮唑；INpT，2-(对碘苯基)-对硝基苯基-5-苯基氯化四氮唑；mNBT，间硝基蓝氯化四氮唑；mNNT，间硝基氯化新四氮唑；MNSTC，2,2-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-羧酰苯胺；MTS：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑盐；MTT，溴化四氮唑，噻唑蓝溴化四氮唑，（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑）；NBMT，硝基蓝氯化单四氮唑；NBT，对硝基蓝氯化四氮唑，硝基蓝氯化四氮唑（2,2′-二-硝基苯基-5,5′-二苯基-3,3′-(3,3′-二甲氧基-4,4′-二亚苯基)-氯化二四氮唑）；NT，氯化新四氮唑（2,2′,5,5′-四苯基-3,3′(对二亚苯基)-氯化二四氮唑；NTV，硝基四氮唑紫；噻唑蓝；TB，氯化四氮唑蓝（3,3′-[3,3′-二甲氧基(1,1′-二苯基)-4,4′-二基]-双(2,5-二苯基-2H-四氮唑)二氯化物）；NBT，硝基蓝氯化四氮唑；oTTR，邻甲苯基四氮唑红；PCTMB，sodium3′-[1-[(苯基氨基)-羰基]-3,4-四氮唑]-双(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠水合物；PNBT，对硝基蓝氯化四氮唑；PTB，胡椒基四氮唑蓝；pTTR，对甲苯基四氮唑红；TC-NBT，硫代氨基甲酰基硝基蓝氯化四氮唑（2,2′-二对硝基苯基-5,5′-二对硫代氨基甲酰基苯基-3,3′[3,3′-二甲氧基-4-,4′-二亚苯基]-氯化二四氮唑；TNBT，四硝基蓝氯化四氮唑；TPTT，1,3,5-三苯基四氮唑；TR，TTC，TPT，四氮唑红（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）；TV，四氮唑紫（Tetrazolium violet），四氮唑紫（VioletTetrazolium），2,3,5-三苯基-2-H-氯化四氮唑，2,5-二苯基-3-[α-萘基]-氯化四氮唑，2,5-二苯基-3-[1-萘基]-2H-氯化四氮唑；VTB，黎芦基四氮唑蓝；WST-1：4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四氮唑基]-1,3-苯二磺酸盐；XTT，2,2-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-羧酰苯胺，以及本领域已知的其它显色剂。
通过将显影的颜色与比色表进行比较，可以测定存在于检验样品中的D-乳酸（以mg/mL计）的水平，其中所述比色表可以由本公开文本的诊断检验试剂盒提供的。如果检验样品的颜色介于两个色卡之间，对于检验样品的D-乳酸水平可以选择中间值。
如上所述，乳酸氧化酶也能够在氧气的存在下，催化D-乳酸转化为丙酮酸和过氧化氢，以定量测定检验样品中D-乳酸的水平。本领域已知的各种乳酸氧化酶可以用于这样的目的。一种这样的能够将D-乳酸转化为丙酮酸和过氧化氢的乳酸氧化酶是由粪链球菌（Streptococcus faecalis）ATCC12755产生的。
当使用乳酸氧化酶化验含有未知量的D-乳酸的检验样品时，产生的过氧化氢与检验样品中D-乳酸的量成比例。可以通过任何已知的方法检测过氧化氢，从而可以测定未知量的D-乳酸。
在化验中用于检测和/或定量过氧化氢的已知方法一般使用含有具有过氧化活性的物质的组合物，所述物质例如过氧化酶和过氧化酶样物质，以及在过氧化氢和过氧化物质的存在下发生可检测的变化（通常是可见的变化）的材料。
在过氧化氢的存在下，过氧化酶或过氧化酶样物质与引起颜色变化的相容材料（如氧化还原染料）的组合产生颜色，所述颜色的强度可以与过氧化氢的浓度成比例，从而与D-乳酸的浓度成比例。通过将显影的颜色与比色表进行比较，可以测定检验样品中的D-乳酸水平（以mg/mL计），其中所述比色表可以由本公开文本的诊断检验试剂盒提供。
描述了能够与过氧化氢联合使用的材料的代表性的专利包括：第2,912,309号、第2,981,606号、第3,349,006号、第3,092,465号、第3,558,435号、第3,595,755号、第3,627,697号、第3,627,698号、第3,630,847号、第3,654,179号、第3,654,180号、和第3,853,470号美国专利，将其引入本文作为参考。其中，在现有技术中提出的过氧化酶和过氧化酶样物质的各种生色底物的实例包括必要时具有偶联剂的以下物质：
（1）单胺类，如苯胺及其衍生物邻甲苯胺、对甲苯胺等；
（2）二胺类，如邻苯二胺、N,N′-二甲基对苯二胺、N,N′-二乙基苯二胺、联苯胺（产生蓝色或褐色）、联茴香胺（变成绿色或褐色）等；
（3）酚类，如苯酚（产生黄色）、百里酚、邻甲酚、间甲酚和对甲酚（分别产生黄绿色、粉色和乳白色混悬液）、α-萘酚（产生洋红色）、β-萘酚（产生白色沉淀）等；
（4）多酚类，如儿茶酚、愈创木酚（形成橙色）、苔黑酚、联苯三酚（产生红色或黄色）、p,p-二羟基二苯基和间苯三酚；
（5）芳香酸，如水杨酸、焦儿茶酸和没食子酸；
（6）隐色染料，如隐色孔雀石绿（产生孔雀石绿）、四甲基联苯胺（TMB）、和隐色酚酞（希望地在碱性介质中使用）；
（7）有色染料，如2,6-二氯酚靛酚；
（8）各种生物物质，如肾上腺素、黄酮、酪氨酸二羟基苯丙氨酸（产生橙红色）和色氨酸；
（9）其它物质，如钼酸铵、愈创木脂、愈创木酯酸、钾、淀粉、碘化钾、钠（如N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-双(二甲基氨基)-二苯胺钠盐）、和其它水溶性碘化物、和胆红素（产生绿色）；和
（10）特定染料，如2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和3,3′-二氨基联苯胺。
过氧化酶是一种催化反应的酶，在所述反应中过氧化氢氧化另一种物质。过氧化酶通常缀合于含有铁卟啉的蛋白。过氧化酶出现在辣根、马铃薯、无花果树汁液和芜菁中（植物过氧化酶）；牛奶中（乳过氧化酶）；以及白血球中（绿过氧化酶（verdo peroxidase））；它还出现在微生物中，并且可以由发酵产生。某些合成的过氧化酶在用于过氧化氢检测系统时也是令人满意的。同样令人满意是这样的物质，如血红素、高铁血红蛋白、氧合血红蛋白、血红蛋白、血色原、碱性血红素、血红素衍生物和某些其它化合物，所述物质显示过氧化活性或过氧化酶样活性，即，借助过氧化氢和其它过氧化物催化另一种物质氧化的能力。
不是酶却显示过氧化活性的其它物质为：硫氰酸铁、丹宁酸铁、亚氰铁化亚铁、吸附在硅胶上的铬盐（如硫酸铬钾）等。
再次参照指示良好阴道健康的生物标记物，根据本公开文本，可以考虑的另一种生物标记物为过氧化氢。乳酸杆菌负责在阴道中产生杀微生物的化合物，如乳酸、细菌素、和过氧化氢。后者被认为在阻止阴道中病原体增长中发挥特别重要的作用。乳酸杆菌利用黄素蛋白，所述黄素蛋白将氧转化为过氧化氢。过氧化氢可以抑制细菌、真菌、病毒和哺乳动物细胞，这是由于许多细菌缺乏被称为过氧化氢酶的酶，所述过氧化氢酶能够分解过氧化氢并保护所述细菌免受过氧化氢的氧化。通过体外研究证明了单独的过氧化氢或其与存在于阴道分泌物中的卤化物和过氧化酶结合时，也可以显示毒性，表现为对HIV1、阴道加德纳氏菌（Gardnerella vaginalis）、拟杆菌属（Bacterioides sp.）、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonohorreae）和白色念珠菌（Candida albicans）的杀害。
据信，患有细菌性阴道病的女性的阴道中具有显著更低浓度的过氧化物。因此，过氧化氢的水平也可以用作健康状态指示剂。此外，动弯杆菌物种（Mobiliuncus species）和阴道加德纳氏菌的存在，伴随低浓度的产生过氧化物的乳酸杆菌物种，与患有细菌性阴道病的孕妇的早产是相关的。已确定的是，阴道中存在的过氧化氢的量高于约1微摩尔每升试验样品指示健康的状态。例如，在某些实施方案中，阴道中存在的过氧化氢的量高于约5微摩尔每升指示健康的状态。在某些实施方案中，阴道中存在的过氧化氢的量高于约10微摩尔每升指示健康的状态，在其它实施方案中，阴道中存在的过氧化氢的量高于约15微摩尔每升、20微摩尔每升、50微摩尔每升或100微摩尔每升指示健康的状态。
在化验中用于检测和/或定量过氧化氢的已知方法如上所述，与所述方法相关的是：当使用乳酸氧化酶化验D-乳酸时，产生的过氧化氢与检验样品中D-乳酸的量成比例。也可以使用其它适合的方法来检测和/或定量存在于检验样品中的过氧化氢。
例如，本公开文本的诊断试剂盒可以采用发色团，所述发色团能够在过氧化氢的存在下发生可检测的颜色变化。不期望受到理论的限制，据信发色团的氧化诱导最大吸收值向光谱的红端迁移（“红移”）或向光谱的蓝端迁移（“蓝移”）。吸收迁移提供了可见的或通过仪器的可检测的色差，以指示检验样品中过氧化氢的存在。例如，在与检验样品接触之前，发色团可以是无色的，或其具有某种颜色。然后，在与检验样品接触并与过氧化氢反应后，发色团显示与其初始颜色不同的颜色。因此，颜色变化可以容易地与检验样品中过氧化氢的存在相互关联。
发色团可以是在氧化后能够显示可检测的颜色变化的隐色碱，或其衍生物。例如，芳基甲烷隐色碱（例如，二芳基甲烷和三芳基甲烷）是特别适合用于本公开文本的可氧化的发色团。例如，三芳基甲烷隐色碱具有以下通式：
Figure BDA00003180867700091
其中R、R′和R″独立地选自取代和非取代的芳基，如苯基、萘基、蒽基等。所述芳基基团可以取代官能团，如氨基、羟基、羰基、羧基、磺酸基、烷基和/或其它已知官能团。这样的三芳基甲烷隐色碱的实例包括隐色孔雀石绿、副品红碱、结晶紫内酯、隐色结晶紫、CI碱性紫1、CI碱性紫2、CI碱性蓝、CI维多利亚蓝、N-苯甲酰基隐色亚甲基等。同样适合的二芳基甲烷隐色碱可以包括4,4′-双(二甲基氨基)二苯基甲醇（也称为“米氏醇”）、米氏醇隐色苯并三唑、米氏醇隐色吗啡啉、米氏醇隐色苯磺酰胺等。在Bruschi的第4,089,747号美国专利中，描述了除芳基甲烷隐色碱外，在过氧化氢的存在下可以显示可检测的颜色变化的其它发色团，出于全部目的将其整体引入本文作为参考。
在一个特定的实施方案中，发色团为隐色孔雀石绿（或其类似物），所述隐色孔雀石绿通常是无色的，并具有以下结构：
Figure BDA00003180867700092
一旦使用过氧化氢氧化，隐色孔雀石绿形成孔雀石绿甲醇（溶剂绿1），其具有以下结构：
隐色孔雀石绿的甲醇形式也是无色的。然而，在酸性条件下，隐色孔雀石绿甲醇形式的一个或多个游离氨基可以被质子化以形成孔雀石绿（也称为苯胺绿、碱性绿4、钻石绿B、或维多利亚绿B），所述孔雀石绿为绿色并具有以下结构：
Figure BDA00003180867700101
如上所述，被分析物的酶催化氧化释放的过氧化氢可以直接诱导发色团的颜色变化。由于过氧化氢对某些发色团具有相对低的氧化电位，然而，当过氧化物以低浓度（例如，低于检验样品的5wt.%）释放时，有时难以检测颜色变化（例如，视觉上地）。在这方面，可以任选地采用电子供体与过氧化氢反应并产生中间化合物，所述中间化合物对发色团的氧化电位比过氧化氢更高。出于该目的，可以采用各种已知的电子供体。例如，在一个实施方案中，水溶液中的过量碘离子（I-）可以与过氧化氢反应以形成三碘阴离子（I3 -），所述三碘阴离子的氧化电位远高于过氧化氢。示例性的离子型碘的来源包括碘化氢（HI）和水溶性碘化物盐，如碱金属碘化物盐（例如，碘化钾（KI））、碘化钠（NaI）、碘化锂、碘化铵（NH4I）、碘化钙（CaI2）等）。其它适合的电子供体可以包括硫氰酸根离子来源，如硫氰酸钠、硫氰酸钾、硫氰酸铵、和其它硫氰酸盐。金属，如铁（II），也可以用作电子供体。例如，芬顿试剂（Fenton′s reagent）是由铁（II）和过氧化氢反应形成的溶液。也就是说，铁（II）被过氧化氢氧化成铁（III）以形成羟基和羟基阴离子。然后铁（III）被相同的过氧化氢还原成铁（II），产生过氧化物基团和质子。所产生的试剂对发色团具有强氧化电位。Johansen的第2002/0119136号美国专利申请公开中描述了其它适合的电子供体，出于全部目的将其整体引入本文作为参考。
虽然电子供体可以提供具有高氧化电位的中间化合物，然而，在某些情况下，这样的化合物的浓度可能太低而不能在发色团中产生期望的颜色变化。例如，高浓度的三碘阴离子可以产生人眼可见的颜色（例如，金褐色）。然而，随着其浓度降低，颜色变得不明显。因此，可以采用络合于中间化合物（例如，三碘阴离子）的显色剂以形成更强的颜色。这样的显色剂的一个具体的实例是淀粉，所述淀粉包括天然淀粉和改性的衍生物，如糊精化的、水解的、烷基化的、羟烷基化的、乙酰化的或分馏淀粉。淀粉通常由两种结构不同的多糖形成，即，α-直链淀粉和支链淀粉，这两种淀粉均由α-D-吡喃葡萄糖单元组成。淀粉可以是或来自任何来源，如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、西米淀粉、大米淀粉、糯玉米淀粉或高直链玉米淀粉。当与例如上述的碘化物来源缀合时，淀粉的α-直链部分可以捕获或结合于三碘阴离子以形成具有水溶性并且具有强烈蓝色的线性三碘离子复合物。
电子供体和/或显色剂促进期望的颜色变化的程度部分地取决于其浓度。也就是说，一种或多种这些组分的浓度过大可能会覆盖发色团并抑制氧化反应。另一方面，浓度过低可能不能将氧化电位提高至期望的程度。在这方面，可以采用电子供体（例如，碘化物来源），所述电子供体的量为约0.01至约2000毫摩尔（“mM”），。在某些实施方案中为约0.1至约1000mM，在某些实施方案中，为约1至约100mM每升检验样品。同样地，可以采用显色剂（例如，淀粉），所述显色剂的量可以为基于检验样品重量的约0.001至约10wt.%，在某些实施方案中为约0.01至约5wt.%，在某些实施方案中为约0.1至约2wt.%。
为了实现根据本公开的期望的颜色变化，在一定程度上将发色团施加到反应介质中，以使所述发色团基本上不通过介质的基体扩散（即，非扩散性地固定化）。这使得使用者可以容易地检测到基于发色团氧化发生的颜色变化。例如，最初可以将含有发色团的溶液施加到检测区域内的反应介质中。根据用于形成层析介质的材料，发色溶液可以含有水性和/或非水性溶剂。适合的非水性溶剂可以包括二醇类（例如，丙二醇、丁二醇、甲二醇、己二醇、聚乙二醇、乙氧基二甘醇和二丙二醇）、醇类（例如，甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇）、甘油三酯、乙酸乙酯、丙酮、三乙酸甘油酯、乙腈、四氢呋喃、二甲苯、甲醛（例如，二甲基甲酰胺）等。一般地，溶液中的溶剂和发色团的量可以根据期望的灵敏度的水平变化。例如，在一些实施方案中，存在的发色团的浓度为约0.1至约100毫克每毫升溶剂，在一些实施方案中为约0.5至约60毫克每毫升溶剂，在一些实施方案中为约1至约40毫克每毫升溶剂。
无论如何，可以干燥溶液以除去溶剂并在介质上留下剩余的发色团。发色团通常会留在检测区域内，直到与流体的检验样品接触。由于发色团是水溶性的，无论如何，它通常将会溶解并随着检验样品流动，除非以其他方式被固定。因此，根据本发明，发色团基本上是非扩散性地连同阴离子化合物一起被固定在检测区域中的，所述阴离子化合物即含有一种或多种阴离子的化合物，或能够在溶液中形成一种或多种离子的化合物。这样的阴离子化合物可以有助于以各种方式固定发色团。例如，阴离子化合物还可以提高发色团的电荷，从而与一个或多个存在于层析介质表面上的官能团形成离子键。此外，某些阴离子化合物（例如，酸）与隐色碱或其衍生物（例如，质子化的隐色碱）反应时可以形成基本不溶于水的沉淀。当然，阴离子型化合物还可以提供各种其它的益处。例如，如果留在空气中或其它氧化环境中的时间太长，少量的发色团可能发生氧化反应。这可以导致颜色变化，对半定量或定量测定过氧化氢的存在产生不利影响。阴离子型化合物可以有助于保护发色团避免因疏忽造成的氧化。
阴离子化合物的选择取决于多种因素，包括发色团的性质及其浓度。用于本公开的适合的阴离子化合物可以包括，例如，无机酸，如盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、多磷酸、硼酸、硼酸（boronic acid）等；有机酸，包括羧酸，如丙烯酸、甲基丙烯酸、丙二酸、琥珀酸、水杨酸、磺基水杨酸、己二酸、马来酸、苹果酸、油酸、没食子酸、酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙醇酸、草酸、丙酸、邻苯二甲酸、异酞酸、戊二酸、葡糖酸、乳酸、天冬氨酸、谷氨酸、衣康酸、、三氟乙酸、巴比妥酸、肉桂酸、苯甲酸、4-羟基苯甲酸、氨基苯甲酸等；磺酸，如甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、三氟甲磺酸、苯乙烯磺酸、萘二磺酸、羟基苯磺酸等；聚合酸，如聚(丙烯)酸或聚(甲基丙烯)酸及其共聚物（例如，马来酸-丙烯酸共聚物、磺酸-丙烯酸共聚物和苯乙烯-丙烯酸共聚物）、角叉菜酸（carageenic acid）、羧甲基纤维素、藻酸等；等等。还可以采用上述酸的酸酐（例如，马来酸酐）和盐。盐可以是金属盐的形式，如钠盐、钾盐、钙盐、铯盐、锌盐、铜盐、铁盐、铝盐、锆盐、镧盐、钇盐、镁盐、锶盐、铈盐），或将所述酸与胺（例如，氨、三乙胺、三丁胺、哌嗪、2-甲基哌嗪、聚烯丙基胺）反应制备的盐。
发色团固定的程度可以取决于阴离子化合物的浓度。例如，发色溶液中的阴离子化合物的浓度可以为约0.1至约20毫摩尔每升（“mM”），在某些实施方案中，为约1mM至约10mM，在某些实施方案中为约2mM至约8mM。
根据本公开，试剂（例如，酶、过氧化氢、电子供体、显色剂等）之间的期望反应时间可以通过选择性地控制反应所发生的介质来实现。也就是说，反应介质本质上是层析的，以允许过氧化氢和/或其它试剂以一致并且可控的方式横向流动。在横向流经介质时，过氧化氢氧化发色团，所述发色团包含在不连续的检测区域内以用于分析。由于可控的流体流动的性质，任何未反应的试剂迁移至反应介质的末端，以使其不能够不利地干扰对检测区域内的发色团的观察。
例如，参照图1，将更加详细地描述用于本发明的化验装置20的一个实施方案。如图所示，化验装置20包括层析介质23，所述层析介质23任选地承载于支承件21上。层析介质23可以由流体能够通过的任意多种材料制备，所述材料如流体通道、多孔膜等。例如，层析介质23可以是由以下材料形成的多孔膜，所述材料包括但不限于天然的、合成的或经合成改性的天然存在的材料，如多糖类（例如，纤维素材料如纸，和纤维素衍生物，如醋酸纤维素和硝化纤维素）；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏二氟乙烯（PVDF）；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；无机材料，如失活的氧化铝、硅藻土、MgSO4、或其它均匀地分散于多孔聚合物基体中的无机细微材料，所述聚合物如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物，和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；布，天然存在的（例如，棉花）和合成的（例如，尼龙或人造丝）；多孔凝胶，如硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合物膜，如聚丙烯酰胺；等等。在一个特定的实施方案中，层析介质是由硝化纤维素和/或聚醚砜材料形成的。应当理解的是，术语“硝化纤维素”是指纤维素的硝酸酯，其可以仅为硝化纤维素，或可以是硝酸和其它酸的混合酯，所述其它酸如具有1至7个碳原子的脂肪羧酸。
支承件21可以由任何能够承载层析介质23的材料形成。虽然不是必需的，支承件21可以是透明的以使光线容易地通过。此外，也通常地期望支承件21是不渗液的，以使流经介质的流体不会通过支承件21渗漏。用于支承件的适合的材料实例包括但不限于，玻璃；聚合材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯（Mylar
Figure BDA00003180867700131
膜）、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧化物、甲基丙烯酸酯、聚三聚氰胺（polymelamine）；等等。如本领域所熟知的，层析介质23可以浇铸到支承件21上，其中所产生的层压物可以模切成期望的尺寸和形状。供选择地，可以使用例如粘合剂将层析介质23简单地层压到支承件21上。在一些实施方案中，将硝化纤维素或尼龙多孔膜粘附到Mylar
Figure BDA00003180867700132
膜上。粘合剂用于将多孔膜与Mylar
Figure BDA00003180867700133
膜粘合，所述粘合剂如压敏粘合剂。据信该类型的层压结构可以购自Bedford,Massachusetts的Millipore Corp.。在Durley,III等人的第5,075,077号美国专利中描述了适合的层压结构的其它实例，出于所有目的将其整体引入本文作为参考。
化验装置20也可以含有吸收材料28。吸收材料28通常接收已经迁移通过整个层析介质23的流体。如本领域所熟知的，吸收材料28可以协助促进毛细作用和通过介质23的流体流动。化验装置20也可以包括样品垫22或其它与层析介质23流体连通的材料。可以用于形成样品垫22的一些适合的材料包括但不限于，硝化纤维素、纤维素、多孔聚乙烯垫和玻璃纤维滤纸。如果需要的话，样品垫22可以包含一种或多种化验预处理试剂，所述预处理试剂扩散性地或非扩散性地附着于样品垫22上。
一般来说，化验装置20作用的方式可以取决于针对反应复合物选择的种类的类型。在这方面，将更加详细地描述使用化验装置20的各种技术。例如，如上所述，通常允许反应复合物与检验样品孵育一定的时间。该孵育过程可以在将检验样品施加于层析介质23之前进行，或可以将其合并为化验程序的一部分（即，孵育发生在将检验样品施加到例如孵化孔中后）。例如，孵育混合物可以直接施加到层析介质23的一部分，然后所述孵育混合物沿着图1中的箭头“L”所示的方向迁移通过所述层析介质23。供选择地，混合物可以首先被施加到样品垫22上。
无论如何，层析介质23确定了第一检测区域31，在所述第一检测区域31内可以测定D-乳酸的存在和量。通常地，第一检测区域31可以提供任意数量的不同检测区域，以使使用者可以更好地测定检验样品中D-乳酸的浓度。每个区域可以含有相同或不同的接收材料。例如，第一检测区域31可以包括两个或多个不同的检测区域（例如，线、点，等）。两个或多个不同检测区域的使用可以提供某些益处，例如有助于半定量。可以在基本上与通过层析介质23的检验样品的流体垂直的方向上，以线的形式设置检测区域。同样地，在某些实施方案中，可以在基本上与通过层析介质23的检验样品的流体垂直的方向上，以线的形式设置检测区域。可以理解的是，第一检测区域31的一个或多个不同的区域可以显示上述的信号强度和D-乳酸浓度之间的关系；然而，每个不同的区域不需要显示这样的关系。
在第二检测区域35中，可以测定过氧化氢的存在和量。除了能够检测过氧化氢外，第二检测区域35可以与第一检测区域31相似。然而，如上所述，在第一检测区域31内D-乳酸的检测可以通过利用D-乳酸氧化酶的化验来实现，所述检测也产生过氧化氢。在这样的实施方案中，检测区域可以保持分离，以允许各生物标记物的精确计算。
如果需要的话，可以存在第三检测区域61，所述第三检测区域61可以作为针对一个或多个先前区域和被检测的生物标记物的对照。
在化验程序后，可以定性地（例如，目视观察）、或半定量地或定量地（例如，使用仪器）对第一检测区域31和第二检测区域35各信号的存在或强度进行分析。根据报告（reporter）的性质和所利用的化学有色（chemichromic）染料，可以对第一检测区域31和第二检测区域35采用相同或不同的检测技术。
在某些实施方案中，本装置的检测区域具有允许检测相对低浓度的被检测生物标记物的灵敏度。例如，在某些实施方案中，对第一检测区域31进行构建，使其具有能够检测至少约1毫摩尔每升D-乳酸的灵敏度。在其它实施方案中，对第一检测区域31进行构建，使其具有能够检测至少约5毫摩尔每升D-乳酸的灵敏度，在其它实施方案中，具有能够检测至少约10毫摩尔每升D-乳酸的灵敏度。在某些实施方案中，对第一检测区域31进行构建，使其具有能够检测至少约1毫摩尔每升到至少约100毫摩尔每升D-乳酸的灵敏度。
类似地，在某些实施方案中，对第二检测区域35进行构建，使其具有能够检测至少约0.5微摩尔每升过氧化氢的灵敏度。在其它实施方案中，对第二检测区域35进行构建，使其具有能够检测至少约1微摩尔每升过氧化氢的灵敏度，在其它实施方案中，具有能够检测至少约5微摩尔每升过氧化氢的灵敏度。在某些实施方案中，对第二检测区域35进行构建，使其具有能够检测至少约1微摩尔每升到至少约100微摩尔每升过氧化氢的灵敏度。
本发明提供了相对简单、简洁且具有成本效益的装置，所述装置用于准确地检测检验样品（例如，阴道流体）中的D-乳酸和/或过氧化氢。例如，以这种方式可以针对良好阴道健康的生物标记物以单一步骤来检测阴道流体。检测结果可以是可见的，从而便于进行检测的人员以快速的方式容易地观察到并且在检测条件下，有助于高度可靠和一致的检测结果。在检验指示阴道健康低于最佳状态的情况下，检验可以任选地提供步骤，女性可以采取所述步骤来改善阴道健康。然后，当测试结束后，装置可以作为一个单元被丢弃。这样的单一步骤检测技术具有多种益处。例如，如上所述，经常检测阴道健康可以有助于预防细菌性阴道病或至少提醒女性细菌性阴道病的发作。
根据本公开，本文描述的一种或多种装置可以整合到吸收制品中。“吸收制品”一般是指任何能够吸收流体的制品。一些吸收制品的实例包括但不限于，一次性吸收制品，如卫生棉、月经垫、成人失禁服装、尿布，医用绷带和卫生棉条，如用于医疗用途的那些，其中反复检测阴道健康是有益的。如本文所使用，短语“吸收制品”一般地是指吸收和容纳体液的装置，更具体地，是指抵靠皮肤或靠近皮肤放置以吸收并容纳身体排出的各种流体的装置。本文使用术语“一次性的”以描述吸收制品，所述吸收制品在单次使用后不能洗涤或恢复或作为吸收制品重复使用。
适用于本发明的卫生棉条通常由吸收纤维制成，所述纤维包括天然和合成纤维，将所述纤维压缩成可以容易地插入阴道腔内的一定尺寸的整体。适合的纤维包括，例如纤维素纤维，如棉和人造丝。纤维可以是100%棉、100%人造丝、棉和人造丝的共混物、或已知适用于棉条用途的其它材料。
卫生棉条通常制成细长的圆柱形，以使其具有足够大的材料体积来提供所需的吸收能力，但也可制成多种形状。虽然目前一般优选压缩的类型，但是棉条可以是压缩的或不压缩的。棉条可以由各种纤维共混物制成，包括有吸收性的和无吸收性的纤维，所述棉条可以具有或不具有适合的遮盖或裹包材。适当地，用于制备棉条的方法和材料对于本领域技术人员是熟知的。
适合形成本文所述的吸收制品的材料和过程对于本领域技术人员是熟知的。通常地，吸收制品包括基本上不透液的层（例如，外罩）、透液层（例如，身体侧衬垫、波浪层（surge layer）等）和吸收芯。
虽然根据具体实施方案对发明进行了详细描述，但应懂得的是，本领域技术人员在获得对前述内容的理解后，可以容易地想到这些实施方案的改变、变化或等同物。因此，本发明的范围应当被评估为所附权利要求及其任何等同物的范围。

Claims (20)

1.一种针对有益于阴道健康的生物标记物的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括：
第一检测区域，在所述第一检测区域内能够生成D-乳酸检测信号，其中D-乳酸的存在或量是可通过所述D-乳酸检测信号来测定的；和
第二检测区域，在所述第二检测区域内能够生成过氧化氢检测信号，其中过氧化氢的存在或量是可通过所述过氧化氢检测信号来测定的。
2.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述D-乳酸检测信号是颜色变化。
3.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述过氧化氢检测信号是颜色变化。
4.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第一检测区域存在于层析介质上。
5.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第二检测区域存在于层析介质上。
6.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第一检测区域包含D-乳酸脱氢酶。
7.根据权利要求6所述的诊断检验试剂盒，其中所述第一检测区域还包含心肌黄酶。
8.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第一检测区域包含D-乳酸氧化酶。
9.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第一检测区域包含氧化还原染料。
10.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第二检测区域包含过氧化物酶。
11.根据权利要求1所述的诊断检验试剂盒，其中所述第二检测区域包含氧化还原染料。
12.根据权利要求1所述的诊断检检验剂盒，其中所述诊断检验试剂盒是放置在吸收制品中的。
13.一种用于检测有益于阴道健康的生物标记物的方法，所述方法包括：
i）将检验样品与检验试剂盒接触，所述检验试剂盒包括第一检测区域，在所述第一检测区域内能够生成D-乳酸检测信号，其中D-乳酸的存在或量是可通过D-乳酸检测信号来测定的，和第二检测区域，在所述第二检测区域内能够生成过氧化氢检测信号，其中过氧化氢的存在或量是可通过过氧化氢检测信号来测定的；
ii）通过D-乳酸检测信号测定D-乳酸的存在或量；和
iii）通过过氧化氢检测信号测定过氧化氢的存在或量。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述D-乳酸检测信号是颜色变化。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述过氧化氢检测信号是颜色变化。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一检测区域存在于层析介质上。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二检测区域存在于层析介质上。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一检测区域包含D-乳酸脱氢酶。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一检测区域还包含心肌黄酶。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一检测区域包含D-乳酸氧化酶。
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PB01 Publication
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