JPS6339599A - 過酸化物量又はペルオキシダ−ゼ様作用を示す関与物の活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）　産業上の利用分野 本発明はペルオキシダーゼ様作用を示す関与物の活性又
はこの基質である過酸化物を定性的もしくは定量的に測
定するための方法である。

更に詳しくは、本発明はペルオキシダーゼ様作用を示す
関与物の活性又はこの基質である過酸化物の量を測定す
る際、ペルオキシダーゼ様作用を示す関与物の基質とな
る還元剤の添加により、ペルオキシダーゼ様作用を示す
関与物の活性を増大させる事に関するものである。

本発明における「ペルオキシダーゼ様作用を示す関与物
」とは過酸化物の存在下に被酸化性呈色試薬と反応せし
めた時に発色体を生成させるものを意味する。この関与
物としてペルオキシダーゼ、シトクロム、ヘモグロビン
、ミオグロビン等のヘム蛋白質及びこれらの補欠分子族
等がある。これらの中でもペルオキシダーゼは動物、植
物、微生物界に広く分布しており、それぞれの性質が異
なるたくさんの種類がある０例えば、西洋ワサビ及びそ
の他の植物由来のペルオキシダーゼ、酵母由来のシトク
ロムペルオキシダーゼ、塩化物ペルオキシダーゼ、唾液
ペルオキシダーゼ、ヨウ化物ペルオキシダーゼ、牛乳由
来のラクトペルオキシダーゼ、白血球由来のミエロペル
オキシダーゼ、赤血球由来のグルタチオンペルオキシダ
ーゼ等がペルオキシダーゼに含まれる。

又本発明における「被酸化性呈色試薬」とはペルオキシ
ダーゼ様作用を示す関与物の存在下に過酸化物と反応せ
しめた時に色素を生成する試薬をいう。

臨床検査に於いては、酵素学的分析方法が急速に普及し
ており、それらの中でも目的物を定量する際、酸化酵素
を作用させて最終的に過酸化水素を生成させ、この生成
した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下に被酸化性
呈色試薬と反応せしめ発色させてから、可視部において
吸光度を測定する方法が盛んに用いられている。

また尿あるいは糞便中の潜血の測定では、血球のペルオ
キシダーゼ様作用を示すヘモグロビンに過酸化水素及び
被酸化性呈色試薬を共存させた状態で行なわれている。

その他に最近では、生体試料中に微量しか存在しないホ
ルモンや各種生物活性物質を測定したり感染症迅速診断
のために、高感度かつ定量的であるが特殊な施設を必要
とするラジオイムノアッセイの代わりに、酵素免疫測定
法が開発され普及してきており、その際に標識酵素の１
つとしてペルオキシダーゼが多く利用されている。この
様に、本発明は用途及び応用範囲が非常に広いものであ
る。

（ロ）　従来の技術 従来、ペルオキシダーゼ活性を測定するための発色試薬
としてグヤコール、Ｏ−ジアニシジン等の酸化還元指示
薬類が使われていたが、試料中の還元性物質の影響を受
ける等の欠点があった。

その後、４−アミノアンチピリンとフェノール類による
酸化縮合系が利用されるようになり、除タンパクが不要
になると共に還元性物質の妨害が少なくなった。このフ
ェノール類は広いｐＨ領域にわたって呈色は安定してい
るが、発色感度が低いことやビリルビンの影響を大きく
受は負誤差を与えるなどの欠点がある。他に、この試薬
では溶血の色調が重なり正誤差を与える。

最近では、改良の進んだアニリン類が開発されており、
吸収極大波長が長波長側にあるため溶血の影響が少なく
、フェノール類に比べて発色感度は高く又ビリルビンの
影響を受けにくい、しかしながらペルオキシダーゼ活性
を測定する場合、これらのアニリン類はフェノール類よ
りターンオーバー数が非常に小さいため、見かけ上の発
色感度はかなり小さくなる。

（ハ）　発明が解決しようとする問題点本発明は前述の
生体試料中の還元性物質、溶血及びビリルビンの影響を
受けず、吸収極大波長は長波長側にあり、発色感度も高
く且つペルオキシダーゼ様作用を示す関与物の反応速度
が速いというような長所を兼ね合わせた方法及び試薬系
を開発することを目的とする。

（ニ）　問題点を解決するための手段 本発明は過酸化物とペルオキシダーゼ様作用を示す関与
物の存在下、その関与物の基質となりうる還元剤と発色
に関与する被酸化性呈色試薬とを含む試薬系にて、ペル
オキシダーゼ様作用を示す関与物の活性又は過酸化物の
量の測定を行なうことを特徴とする。

（ホ）　作用 上記の試薬系にて、ペルオキシダーゼ様作用を示す関与
物の活性又は過酸化物の量を測定する際、基質となリラ
る還元剤自体は、条件によっては何ら発色に参加するこ
となく、又被酸化性呈色試薬の発色を妨害することもな
い、しかしながら、この還元剤はペルオキシダーゼ様作
用を示す関与物の活性を増大させる働きがある。

本発明に用いる過酸化物としては過酸化水素に限らず例
えば過酸化尿素、クメンヒドロペルオキシド、ベンゾイ
ルペルオキシド或いは２．５−ジメチルヘキサン−２，
５−ジヒドロペルオキシド等でも可能であることは言う
迄もない。

この方法で用いられる還元剤は数百種類以上あるが、効
果のある還元剤の例として一部列記すると、ジクロルフ
ェノール、クロルフェノール、フルオルフェノール、ブ
ロムラエノール、ヨードフェノール等のハロゲノフェノ
ール、アルキルフェノール、０−メトキシフェノール、
ピロガロール、カテコール、フェノール、ナフトール、
４−クロル−１−ナフトール等のフェノール類、０−フ
ェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン等の芳香族
アミン等がある。

実施例には本発明方法における効果がはっきりわかる様
に被酸化性呈色試薬としては、生体試料中の溶血及びビ
リルビンの影響を殆んど受けずかつ吸収極大波長が長波
長側にあるアニリン類と４−アミノアンチピリンの酸化
縮合剤の組合わせを用いた。

本発明方法において、一般的に還元剤の濃度が増すにつ
れ、それに比例してペルオキシダーゼ活性は増大してい
く。

実施例１゜ 発色試液 ０．０５Ｍビロリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）　　１００
ｍｕにＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン０．１ｍｍｏｌ、４−７ミ
ノアンチピリン０，０５ｍｍｏ　１、ペルオキシダーゼ
３０単位を溶解した試液を発色試液（１）とする。この
発色試液（１）に２．４−ジクロルフェノールが０．２
ｍＭになるように添加された試液を発色試液（２）とす
る。

測定方法 発色試薬（１）及び発色試薬（２）３ｍＱに０．５ｍＭ
の過酸化水素水ｏ、Ｉ５＋ｎＱ加え３７°Ｃの恒温槽中
で反応させ、蒸溜水を対照として５５５　ｎｍの吸光度
を測定する。その時の呈色反応のタイムコースを第１図
に示す。

発明効果 第１図から明らかなように、発色試液（１）では呈色反
応が約１．２分で完了するが発色試液（２）では呈色反
応が約０．４分で完了する。このことから２，４−ジク
ロルフェノールがペルオキシダーゼを活性化しているこ
とが解る。

実施例２．　　　・ ペルオキシダーゼ活性における還元剤の効果発色試液 ０．０５Ｍ　　酢酸ＵＷ液（ｐＨ＝　５．２）　で４０
ｍＭ　　過酸化水素、０．２ｍＭ４−７ミノアンチビリ
ン。

０．７ｍＭＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３゜５−
ジメトキシアニリンになるように発色試液（１）を作る
。この発色試液（１）に還元剤グヤコールを３ｍＭにな
るように添加したものを発色試液（２）とし、同様な操
作により２０ｍＭ　　フェノールの場合には発色試液（
３）　、１ｍＭ　　２．４−ジクロルフェノールの場合
には発色試液（４）、１ｍＭ１−ナフトールの場合には
発色試液（５）、１ｍＭ　　ｏ−フェニレンジアミンの
場合には発色試液（６）とする。

測定方法 これらの発色試液１　ｍＱにペルオキシダーゼ（２単位
／ＩＩＩＱ）を各０．０２１１１Ｑ加えてから混合し、
３７°Ｃにて５９０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度
変化を測定する。試薬盲検としてペルオキシダーゼ溶液
の代わりに蒸溜水をもちいて同様な操作をし、１分間当
たりの吸光度変化を測定する。ペルオキシダーゼ活性値
は各々の実測値から試薬盲検値を差し引いた１分間当た
りの吸光度変化で表す。その結果を表−１に示す。　　
　　表−１ 発明の効果 表−１から明らかなように発色試液（１）に、還元剤を
添加するとペルオキシダーゼ活性が増大する。又、還元
剤の種類により活性化の効率は異なるが、数百倍にも活
性化できるものもある。

実施例３゜ 発色試液 ０．０５Ｍ　　ｋ酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝５．２　）　テ４
０　ｍＭ過酸化水素、０．２ｍＭ４−アミノアンチピリ
ン。

０．７ｍＭ　　Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキ
シアニリンになるよう、に発色試液（１）を作る。

この４色試液（１）のＮ−スルホプロピル−３，５−ジ
メトキシアニリンを２０ｍＭ　　フェノールと取り替え
たものを発色試液（２）とする、また発色試液（１）に
さらに２０ｍＭフェノールを添加したものを発色試液（
３）とする。

発色試液（１）１ｎ＋Ｑには、ペルオキシダーゼ（２０
０単位／ｎ＋Ｑ）を０．０２ｍＱ加え、発色試液（２）
、（３）１ｍＱにはペルオキシダーゼ（２単位／ｍＱ）
を０．０２１１ＩＱ加えて反応させ、３７°Ｃで１０分
間加温した後０．１Ｍ　アジ化ナトリウム溶液を添加し
て反応を止める。その時の各々の発色試液の吸収スペク
トルを第２図に示す。

発明効果 ４−７ミノアンチビリンとフェノールとの酸化縮合物の
吸収極大波長は４９０ｎｍ近傍に有り、４−７ミノアン
チビリンとＮ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシア
ニリンとの酸化縮合物の吸収極大波長は５８０ｎｍ近傍
に有る。４−アミノアンチピリンとフェノール及びＮ−
スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリンとの共存
下での酸化縮合物の吸収極大波長は５８０ｎｍ近傍に有
る。この結果から明らかなように４−アミノアンチピリ
ンはフェノールよりもＮ−スルホプロピル−３，５−ジ
メトキシアニリンとの酸化縮合物を優先的に生成する。

しかしながらペルオキシダーゼの反応速度はＮ−スルホ
プロピル−３，５−ジメトキシアニリンの場合とは異な
り、フェノールと同様の速さになっている。即ちフェノ
ールの添加によりペルオキシダーゼの活性が増大してい
ることがわかる。

実施例４゜ ０．０５Ｍ　　酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ＝５．２　）　テ４
０　ｍＭ過酸化水素、０．２ｍＭ４−アミノアンチピリ
ン。

０．７ｍＭ　　Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３゜
５−ジメトキシアニリン、２０ｍＭフェノールになるよ
うに発色試液を作る。この発色試液１　ｒｎＱに異なる
濃度のペルオキシダーゼを０．０２ｍＱ加え、以下実施
例２．と同様な操作により測定を行なった。

得られた結果をペルオキシダーゼの検量線として第３図
に示す。

発明効果 還元剤としての高濃度のフェノールの存在下で、酵素の
濃度に比例した直線性の検量線が得られた。

これによりフェノール類を含まないアニリン系だけの発
色試液よりも、微量のペルオキシダーゼを定量すること
が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１．に記載した発色試液（１）、発色試
液（２）の呈色反応のタイムコースな示す。 縦軸は波長５５５ｎｍでの吸光度、横軸は時間（分）を
表す。 第２図は本発明方法と対照発色剤を用いた方法によるペ
ルオキシダーゼ活性測定の際、発色試液（１）、（２）
、（３）から生成した各々の酸化縮合物の吸収スペクト
ルを示す。凄軸は吸光度、横軸は４５０ｎｍから６５０
ｎｍまでの測定波長を表す。 第３図は本発明方法によるペルオキシダーゼ測定の検量
線を示す。縦軸は波長５９０ｎｍでの１分間当たりの吸
光度変化を表し、横軸はペルオキシダーゼの濃度（単位
／ｄＱ）を表す。 特許出願人　　株式会社　イムツバイオン手続補正書（
方式） １．事件の表示　昭和６１年特許願第１８１５６１号２
、発明の名称　過酸化物量又はペルオキシダーゼ様作用
を示す関与物の活性の測定方法 ３、補正をする人 ４、代理人 住所（居所） 氏名 ５、補正命令の日付（発進口）昭和６１年１０月２８日
６、補正の対象　願書正副の「発明の名称」と「図面」
７、補正の内容 「適正な願書正副」は別紙のとおり。 「図面」は別紙のとおり、　図中に記載した図の番号（
第１図、第２図、第３図）を図中から外に出した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ペルオキシダーゼ様作用を示す関与物と過酸化物の
   存在下で、ペルオキシダーゼ様作用を示す関与物の活性
   又はこの基質である過酸化物の量を測定する際、反応混
   液中にペルオキシダーゼ様作用を示す関与物の基質であ
   る還元剤及び最終的に発色体を形成させるための被酸化
   性呈色試薬を共存させることを特徴とする方法。 ２　過酸化物が過酸化水素又は過酸化尿素より成る群か
   ら選ばれたものである特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３　ペルオキシダーゼ様作用を示す関与物がペルオキシ
   ダーゼ、ヘムタンパク質又はそれらの補欠分子族より成
   る群から選ばれたものである特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載の方法。 ４　ペルオキシダーゼが動物、植物又は微生物源から選
   ばれたものである特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５　ペルオキシダーゼが西洋わさび由来のものである特
   許請求の範囲第４項記載の方法。 ６　ヘムタンパク質がシトクロム、ヘモグロビンまたは
   ミオグロビンより成る群から選ばれたものである特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ７　還元剤となるものがフェノール類である特許請求の
   範囲第１項から第６項のいずれかの１項に記載の方法。 ８　フェノール類がフェノール、ハロゲノフェノール、
   グヤコール、アルキルフェノール又はナフトールより成
   る群から選ばれたものである特許請求の範囲第７項記載
   の方法。 ９　ハロゲノフェノールがジクロルフェノール、クロル
   フェノール、フルオルフェノール、ブロムラエノール又
   はヨードフェノールより成る群から選ばれたものである
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０　還元剤となるものが芳香族アミン類である特許請
   求の範囲第１項から第６項のいずれかの１項に記載の方
   法。 １１　芳香族アミン類がｏ−フェニレンジアミン又はｐ
   −フェニレンジアミンより成る群から選ばれたものであ
   る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２　発色体を形成させる為の被酸化性呈色試薬がアニ
   リン系化合物とそれと酸化縮合する試薬からなる特許請
   求の範囲第１項から第１１項のいずれかの１項に記載の
   方法。 １３　アニリン系化合物がＮ−エチル−Ｎ−スルホプロ
   ピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピ
   ル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキ
   シ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリ
   ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
   ロピル）−ｍ−トルイジンより成る群から選ばれたもの
   である特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４　アニリン系化合物と酸化縮合する試薬が４−アミ
   ノアンチピリンである特許請求の範囲第１２項記載の方
   法。