JPH047198B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はグルコース等の還元糖の存在を検出す
る試験試料の分析の分野に関し、さらに詳しく
は、糖の存在により検出可能な応答を生ずること
ができる組成物に関する。還元糖に加えて、この
組成物は過酸化水素、ペルオキシダーゼ、過酸化
酵素的に活性な物質、次亜塩素酸塩および他の分
析対象物に役立つ。 糖の存在を検出する試験試料の分析が多くの関
連しない技術において有用性を示している。この
ように本発明は、醸造業、生化学的研究および医
学的診断等の種々の研究に関係している。醸造業
においては、例えば、実際に発酵させる前にデン
プンをマルトース等の糖に変換する。そのため殻
粒出発物質から確実に高収量で得るためにマルト
ースの存在が注意深く監視される。多くの生化学
系では、その細胞エネルギー源として注意深く制
御された濃度のグルコースが要求され、このよう
な系の研究では濃度を注意深く監視することが要
求される。医学の専門家は、血液および尿中に異
常に高濃度で存在するグルコースによつて微候の
現われる糖尿病等の疾患の診断、管理に糖分析を
大いに利用している。 同様に尿、糞便懸濁液および胃腸内含有物等の
試料中に存在する過酸化酵素的に活性な物質を検
出するために多くの分析法が現在利用可能であ
る。ヘモグロビンおよびその誘導体は、酵素ペル
オキシダーゼの挙動と同様に挙動するので、この
ような“過酸化酵素的に活性な”物質の代表であ
る。このような物質は、ここでは偽ペルオキシダ
ーゼ（pseudoperoxidase）とも呼ぶ。過酸化酵
素的に活性な物質は、それらが過酸化物と、ベン
ジジン、ｏ−トリドン、３，3′，５，5′−テトラ
メチルベンジジン、２，７−ジアミノフルオレン
または同様のベンジジン型指示薬物質との間のレ
ドツクス反応を触媒しこれによつて色の変化等の
検出可能な応答を生ずるという点で酵素と同様で
ある。試験試料中の潜血の存在を測定する大部分
の方法がこの偽ペルオキシダーゼ活性に依存して
いる。 従つて、本発明の分野は種々の分類の研究にわ
たつている。これにより醸造業、食品工業、科学
的研究または医療におけるにせよ、糖分析が重要
となるところではどこでもその応用が見出され
る。さらにペルオキシダーゼまたは偽ペルオキシ
ダーゼの存在を測定するための種々の技術に役立
つ。実際、本発明は、検出可能な応答を示すその
新奇な傾向が適用可能な分野において有用性を見
出している。反応生成物として最終的にH₂O₂を
与えることができるかまたはペルオキシダーゼま
たは偽ペルオキシダーゼを含有するあらゆる系
は、次亜塩素酸塩を含有している水泳プールの水
および他の強力な酸化系等の他の系と同様に、本
発明の応用に好適である。 糖分析の歴史は、ここ数年間にそれが利用され
る基本的な化学分野およびその形式の両者におい
て劇的な変化を受けているため、おそらく最も注
目すべきものである。主としてこれらの分析を、
酸化系として特徴づけることができ、この酸化系
は、還元時色の変化またはその系によつて吸収ま
たは反射される紫外線の波長の変化等の検出可能
な応答を導く反応条件を創始する。このように還
元糖は酸化銀を金属銀に変換し、また糖溶液を酸
化銀を含浸したロ紙片に作用させる場合に黒点が
現われる〔エフ・フエイグル著「ケム・インダ」
57巻1161頁、ロンドン、1938年（F.Feigl、
Chem.Ind.、Vol.57p.1161、London（1938）〕。同
様にｏ−ジニトロベンゼンとジニトロフタル酸の
３，４−および３，５−異性体は、Na₂CO₃中で
還元糖と共に加熱するとき、感度の高い呈色反応
（バイオレツト色を形成）を与える〔テイー・モ
モセ他著「ケム・フアーム・ブル」、東京12巻、
14頁、1964年（T.Momose et.al、Chem、
Pham.Bull.Tokyo、Vol.12、p.14（1964））；エ
フ・フエイグル著「スポツト・テスト・イン・オ
ルガニツク・アナリシス」７版、338〜339頁、エ
ルスビエール・パブル・カムパニー、ニユーヨー
ク、1966年（F.Feigl.Spot Tests in Organic
Analysis、7th Edition、p.338〜339、Elsevier
Publ.Co.、New York（1966））〕。 しかしながら、1849年初期において早くも、還
元糖がCuSO₄のアルカリ溶液より黄色〜赤色の酸
化第一銅（オキシハイドレイト）を沈殿させるこ
とが知られていた〔エイチ・フエーリング著「ア
ン」72巻、1849年（H.Fehling、Ann、Vol.72
（1849））〕。またビー・ヘルシユタイン著「ジエ
イ・アム・ケム・ソス」32巻、779頁、1910年
（B.Herstein、J.Am.Chem.Soc.、Vol.32、p.779
（1910））を参照されたい。フエーリング試験とし
て知られているこの初期の道標はさらに感度の高
い試験の発展に刺激を与えた。その試験は、いわ
ゆるトレンス試薬と称されているアンモニア中の
酸化銀を利用するものでその試薬は容易に還元剤
と反応して金属銀の黒色沈澱物を生じ、またしば
しばガラス反応容器の内壁に鏡面を形成する〔ビ
ー・トレンス著「ベル」14巻、1950頁、1881年、
15巻、1635頁、1828頁、1882年（B.Tollens、
Ber.、Vol.14、p.1950（1881）；Vol.15、p.1635、
1828（1882））〕。 糖尿病の比較的高い発生とそれに付随した重大
な臨床結果のために生物学や医学の専門家の高い
関心が尿や血清中のグルコースレベルを分析する
新しい技術に集まつた。この強い関心が、その従
来の溶液化学から劇的に逸脱する数種の方法の発
展を導いた。これらの技術は、溶液または懸濁液
技術に用いられるかまたは分光光度計または他の
装置と共に用いられる、乾燥、浸漬−読取り具に
包含できる複雑な生化学系を利用する。 これらの新技術の中で特に良好に糖分析に貢献
する一つは、分析対象物、例えばグルコースが特
別の酵素の基質であり、その反応生成物が“ベン
ジジン型指示薬”として当業界でばく然と知られ
ている指示薬化合物の同族体から検出可能な応答
を引き出すことができる酵素系である。これらの
化合物は過酸化水素および酵素ペルオキシダーゼ
の存在下色の変化を受けることができる。このグ
ルコース／グルコースオキシダーゼ系は従来技術
を具体化し、ここでは次式： ※ 補酵素−フラビンアデニンジヌクレオチド ※※ 上記物質の還元型 に従つてグルコースは、H₂O₂を同時に形成しな
がらグルコン酸に酸化される。 観察可能な色の形成または他の検出可能な応答
を導く連続した指示薬関連工程を容易にするのは
この同時に形成される過酸化水素である。このよ
うにベンジジン型指示薬はその光吸収能の変化に
よつて過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下で
応答する。 実際には、この技術は、登録商標CLINISTIX
その他の下でエームズ・デイビジヨン・オブ・
マイルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテツ
ド（Ames Division of Miles Laboratories
Inc.）により市販されているような浸漬−読取り
試薬片の形でグルコース分析に現在利用されてい
る。広汎には、これらはプラスチツク片よりな
り、その一端には、主有効成分として適正な酵
素、指示薬化合物および緩衝剤を含浸した吸収紙
部が取付けられている。これらは、試験試料中に
試薬担持端部を浸漬し、それを取出してロ紙に生
じた色を、種々のグルコース濃度に対して目盛り
を付された標準色標を有する紙に形成された色と
比較することによつて用いられる。 グルコース分析への応用に関して本発明に関係
があると思われる数件の特許が発行されている。
アルフレツド・エイチ・フリー（Alfred H.
Free）に対して付与された米国特許第2848308号
はグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼお
よびベンジジン型指示薬を試薬細片中に用いて尿
または他の体液中のグルコースを測定する。基本
的な酵素化学を開示、請求している。スペツク
（Speck）に与えられた米国特許第3753863号はベ
ンジジン型の指示薬溶液を“安定”させるために
低級アルカンポリオールを使用することを開示し
ている。ラム（Lam）に与えられた米国特許第
4071317号は、組成物の調製時、希釈剤としてあ
る特定のスルホン、スルホキシドおよびアミド化
合物の使用によつて潜血感応性組成物を安定化す
ることを開示している。この後者の組成物は有機
過酸化水素化合物およびベンジジン型等の指示薬
化合物よりなる。 最終的に本件譲受人に譲渡された米国特許第
4336330号および同第4318985号は広範囲のグルコ
ース濃度の測定を扱う。この広範囲の能力は試薬
−支持担体マトリツクス中にある重合体を用いる
ことによつて得られる。一方、後者の特許は架橋
された尿素ホルムアルデヒド樹脂の使用を特に教
示し、前者はポリスチレンの使用を教示する。こ
れらの特許においてもあるいは上述された他の特
許においてもグルコース測定用指示薬としてここ
に請求された混合物を使用することについての記
載はまつたくなく、またアスコルビン酸塩に対す
るその耐性の記載もない。 糖分析の場合のように、過酸化水素の存在下で
色を形成する指示薬の酸化についての酵素様触媒
作用を基礎とするペルオキシダーゼまたは偽ペル
オキシダーゼ分析のためのいくつかの方法が長年
にわたつて発展している。第一に、これらの方法
は湿式化学的方法および“浸漬−読取り”型試薬
−担持細片を包含する。前者については代表的な
例がリチヤード・エム・ヘンリー他著「クリニカ
ル・ケミストリー・プリンシプルズ・アンド・テ
クニクス」、ヘイガータウン、メアリーランド：
ハーパー・アンド・ロウ1974年、1124−1125頁
（Richard M.Henry、et.al、Clinical Chemistry
Principles and Techniques、Hagertown、
Maryland：Harpar and Row（1974）、pp.1124
−1125）に述べられている。この方法では、氷酢
酸（緩衝液）、ジフエニルアミン（指示薬）およ
び過酸化水素が用いられる。このような湿式法は
分析能力を示す一方、それにもかかわらず試薬安
定性が乏しく、感度が適当でないものが少なから
ずある等の明白な欠点を伴なう。このような試薬
溶液に固有なこととして安定性（エルゴ感度）が
急激に減少するので、新鮮な試薬溶液を数日間の
保存後には調製しなければならず、分析者が多大
な時間を必要とし、また高価な試薬を浪費しなけ
ればならないため経済性に乏しい。 過酸化酵素的に活性な物質を測定するための第
二の方法すなわち大部分の臨床試験者や分析者に
よつて現在好まれている方法は“浸漬−読取り”
試験細片を利用している。このような試験具の代
表例として、エームズ・デイビジヨン・オブ・マ
イルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテツド
によつて製造され、商品名HEMASTIX （登
録商標）の下で市販されている試薬細片がある。
これらの試薬細片はプラスチツク細片または把持
片に固着された本質的に多孔性ベーパーマトリツ
クスよりなる。このマトリツクスは有機性過酸化
水素およびｏ−トリジンの緩衝混合物で含浸され
る。ヘモグロビン、ミオグロビン、赤血球または
他の偽ペルオキシダーゼを含有する液体に浸漬す
ると、マトリツクス中に青色が生じ、その色の強
さが試料中の過酸化酵素的に活性な物質の濃度に
比例する。かくしてマトリツクス中に生じた色を
標準色標と比較することによつて、分析者は半定
量的ベースで試料中に存在する未知の量を測定で
きる。湿式化学法に比べて試薬細片は、優に二重
の利点を有する。すなわち試薬の調製およびその
関連用具のいずれも必要でないため容易に細片を
用いることができること、また試薬の安定性がよ
り大きく、結果としてより大きな正確さ、感度お
よび経済性が得られることである。 前述のことから判るように、この文献は水性系
におけるグルコースの存在および／または濃度を
測定する系を多く包含する。しかしながら、それ
らの系を不都合なものとし、また最悪の場合、不
正確で信用できないものとする、これらの系の多
くに固有の、１つの重大な問題がある。この問題
の根源は試験試料中のアスコルビン酸塩の存在で
ある。例えば、行われるべき分析が尿中のグルコ
ース分析であり、かつ患者の食物のビタミンＣ
（アスコルビン酸）が多い場合、従来技術の多く
のグルコース試験の結果は不当にネガテイブとな
るかまたは実際のグルコース濃度より低くなる。
この問題はアスコルビン酸が、指示薬が酸化され
た途端にそれを還元し、それによつて色形成が遅
延される時間を延ばす傾向があることによつて引
き起こされる。従つてグルコース試験が特別な速
度での色の形成に依存する場合、アスコルビン酸
の存在がこのような速度を減少させ、これによつ
て不当に低くなつた結果が得られる。一方、本発
明は従来技術の系に比べ２重の利点を与える。本
発明は、通常考えられない広範囲の濃度、すなわ
ち０〜約5000mg／dlにわたつてグルコース分析を
可能にする。同時に、この系はアスコルビン酸の
妨害作用に対して耐性を有することが驚くべきこ
とに判明している。 本発明に関係する従来技術の別の態様があり、
これは４−アミノアンチピリン（以下４−AAP
という）とフエノール化合物との間の反応に関係
する。青色発色反応が４−AAPとクロモトロー
プ酸の酸化結合から生ずることが知られている
〔オン他著、「インター・ジエイ・オブ・バイオケ
ム」13巻、159〜163頁、1981年（Wong et.al.、
Inter.J.of Biochem.、13、159〜163（1981））〕。
このように４−AAPは過酸化物の存在下クロモ
トロープ酸と結合して青色を形成できる。また４
−AAPを用いて紫色を生ずるカテコールの検出
も知られている〔ラルー他著、「アナル・シム・
アクタ」31巻、400−403頁、1964年（LeRue et.
al.、Anal.Chim.Acta.31、400−403（1964））〕。４
−AAPを用いるsmolの測定に関係する最均の文
献は系中のあるオキシダントの存在によつて生ず
る妨害について引用している。 多くの酸化性イオンの中では、不当にネガテイ
ブな結果を導くものとしてH₂O₂が記載されてい
る〔ノルウイツツ他著「アナリテイカル・ケミス
トリー」51巻、1632−1637頁、1979年（Norwitz
et al.Analytical Chemistry、51、1632−1637
（1979））〕。最終的に、尿酸の直接の酵素試験にお
いては４−AAPと３，５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホン酸を用いる系が記載され
ている〔フオサチ他著「クリニカル・ケミストリ
ー」26巻、227−231頁、1980年（Fossati et al.
Clinical Chemistry、26、227−231（1980））〕。 先述された４件の参考文献は４−AAPとフエ
ノール系結合剤に関係し、広範囲の濃度が検出可
能であるグルコースの分析の記述はない。さら
に、アスコルビン酸塩の妨害の問題の記述も全く
ない。本発明は明白に両方の様相に関係し、最終
的な結果は、劇的に微少のアスコルビン酸塩感度
を有する広範囲のグルコース試験である。さらに
は、先に引用されたノルウイツツの文献は４−
AAP分析法が酸化剤の存在によつて誤りを受け
易いことを示している。これはフエノールの酸化
分解によつて生ずることがこの記載で推測され
る。 本発明に対する従来技術の状態を要約すると、
糖感応性化学は、19世紀の中期には早くもフエー
リング溶液とトレンス試薬の出現と共に分析分野
に出現し始めた。それ以来出現していた“純粋に
化学的”な系は、生化学的系、特に糖オキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、およびベンジジン型の過
酸化物感応性指示薬からなる系に大きくとつて代
られてきた。拡大された濃度範囲にわたつてグル
コースまたは他の分析物を測定できることが望ま
しいばかりでなく、測定された結果が試験試料中
のアスコルビン酸（ビタミンＣ）の存在による不
正確さを包含しないことが等しく必要である。こ
の発見によりこれらの両方の望ましい特性の実現
が可能となる。 簡単に述べれば、本発明は液体試験試料中のグ
ルコースの存在を検出するかおよび／または濃度
を測定する組成物、試験具および方法よりなる。
この組成物は、広範囲にわたるグルコース濃度、
例えば０〜約5000ミリグラム（mg）グルコース／
dl試験試料を測定できる。さらに、この組成物は
試料中のアスコルビン酸塩の存在による妨害に対
して耐性がある。この組成物はグルコースオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼおよびペルオキシダー
ゼとH₂O₂の存在下で検出可能な応答を生ずるこ
とができる指示薬としての２個の化合物の混合物
よりなる。すなわち、４−アミノアンチピリンと
４−メチルカテコールとの混合物からなる。 この組成物は指示薬の他に酵素、すなわちグル
コースオキシダーゼとペルオキシダーゼからな
る。好ましいペルオキシダーゼ酵素は西洋ワサビ
（horseradish）ペルオキシダーゼであるが、他の
ペルオキシダーゼも本発明において効果的であ
る。グルコースオキシダーゼは、種々の市販商品
と同様アスペリギリ（Aspergilli）およびペニシ
リア（Penicillia）等の真菌の菌糸体より得るこ
とができる。 指示薬は、広範囲の濃度の検出能力を与える点
及び一方では同時に試験結果に逆効果を与えるア
スコルビン酸塩に対して強い耐性を示すという点
で本発明の重要事項である。この指示薬は、一方
が４−AAP、他方が４−メチルカテコールであ
る化合物の混合物よりなる。 本発明の試験具は、本組成物を包含した担体マ
トリツクスからなり、グルコース分析における迅
速な信頼性が高い結果を得るための用具を与え
る。担体マトリツクスは通常ロ紙等の多孔性物質
である。担体マトリツクスとして有用な他の物質
は、フエルト、多孔性セラミツク細片、ガラス繊
維織物またはマツト状ガラス繊維、木材、布スポ
ンジ物質および粘土物質である。他の代替物は、
組成物を好適な結合剤を用いて塗布できるポリス
チレンフイルム等のプラスチツク面である。他の
物質のように、すべてのこのような担体マトリツ
クスは本発明に使用可能である。ロ紙が特に好ま
しいことが判明している。 試験具を形成するに当つては、この組成物を以
下の実施例に示すように調製し、次いで適正な担
体マトリツクスに包含させる。例えば好ましいマ
トリツクス材料であるロ紙を用いる場合には、ロ
紙を組成物溶液中に浸漬し、取出しかつ乾燥す
る。他の好ましい実施態様では、組成物−担持ロ
紙をポリスチレン細片の一端に固着し、他端をつ
まみとして働かせる。 本発明の方法を行なうに当つては、この試験具
をグルコースを含有すると推定される試験試料と
接触させることによつて使用する。この試験具の
細片を取付けた特別の形では、ロ紙支持端部を試
験試料（例えば尿）中に浸漬し、取出し、次いで
色の変化または特定の波長における光吸収パーセ
ント（または光反射率）等の応答について観察す
る。色の現出または変化が検出可能な応答である
場合には、比較用色票を用いてその試験具に生じ
た色を色票ブロツクと比較することによつてグル
コース濃度の半定量的分析を行なうことができ
る。尚、色票ブロツクの各々は種々の既知の濃度
のグルコース標準溶液を用いた試験具に生じた色
である。 従来技術の“浸漬−読取り”グルコース試験具
の大部分が０〜500mg／dlの濃度範囲で分析可能
な試薬を用いている。本発明はそれ以上の規模の
範囲、すなわち０〜5000mg／dlで分析できる。さ
らには、従来技術の試験具はアスコルビン酸塩の
存在に感応性があり、しばしば不当な誤つた結果
を生ずるが、ここに請求された組成物および試験
具はアスコルビン酸塩に対して予期されない耐性
を示す。これらの利点は試験試料中のアスコルビ
ン酸塩の存在にもかかわらず信頼できる広範囲の
半定量的結果を可能にする。 含漬されたロ紙をポリスチレン細片等の支持体
に固着する好ましい方法は、両面接着テープを用
いることであり、特にスリー・エム・カンパニー
（3M Company）によつて市販されている製品、
Double Stickが特に好適である。このロ紙をテ
ープの片側に固着し、このラミネートを適当な寸
法に裁断し、次いでテープの第２の接着側を介し
てプラスチツク細片の一端に取付けることができ
る。 以下の実施例は、本発明の製造法および使用法
をさらに教示するために与えられる。好ましい実
施態様が記載され、適切な結果のデータが示さ
れ、分析される。しかしながら、実施例は説明と
してだけの意味を有するものであり、ここに記載
し、請求した本発明の範囲を限定するよう意図す
るものではない。 実施例 １ 種々の試験具 本発明の指示薬を含む種々の指示薬について、
(a)過酸化物−触媒酸化におけるアスコルビン酸塩
の影響および(b)発色の相対速度を測定するために
実験を行なつた。実験によつて得られたデータ
は、本発明の指示薬である４−アミノアンチピリ
ンと４−メチルカテコールが両方の観点において
アニリンとｍ−アニシジンより数倍優れているこ
とを示している。これらの結果は第１図において
非常に明らかである。 等モル量の指示薬を別々の指薬溶液に用い、等
モル量の４−AAPと４−メチルカテコール（４
−MC）よりなる本発明の指示薬の全体量を他の
指示薬の各々のモル量と等しくした。このように
調製した各組成物は指示薬を除いて同一の指薬を
含有し、すべての組成物が等モル量の各々の指示
薬を含有する。用いる指示薬は４−AAP／４−
MC、アニリンおよびｍ−アニシジンであつた。 ３個の1.0mlキユベツトに以下の成分を入れ、
蒸留水に溶かして以下の濃度の1.25ml溶液を調製
した。 成 分 濃 度 ペルオキシダーゼ（PH5.5に緩衝） 30μｇ／ml 指示薬 2.0mM 上記成分を含有する３個の溶液を調製した。す
なわち指示薬として４−AAPと４−MCを含有す
る第１溶液（各化合物は1.0mMの濃度で存在す
る）、2.0mMのアニリンを含有する第２溶液、お
よび2.0mMのｍ−アニシジンを含有する第３溶
液。 H₂O₂の2.0mM溶液を調製するために充分な
H₂O₂を添加して、各溶液を分光光度計で観察し、
発色の各速度を２分間に亘つて単位時間当り観察
した。 過酸化物の添加に続いて発色の観察を２分間行
なつた後アスコルビン酸塩を充分加えてアスコル
ビン酸塩の0.5mM溶液を調製した。次いで、得
られた混合物をアスコルビン酸塩による指示薬の
減少に基づく褪色速度を分光光度計により観察し
た。このμmol／secで示される速度のデータは以
下の通りである。指示薬 発色速度 褪色速度 ４−AAP／４−MC 28 ５ アニリン 14 20 ｍ−アニシジン ５ 50 このデータを第１図にプロツトする。これから
判るように、４−AAP／４−MC指示薬系はアニ
リンまたはｍ−アニシジンの両方より速い発色速
度とアスコルビン酸塩による遅い褪色速度を示し
た。 この明白な結果は、４−AAP／４−MCはアス
コルビン酸塩の妨害にさらに大きい耐性を有し、
信頼性がある広濃度域のグルコース試験を提供す
ることである。 実施例 ２ 種々のフエノール性錯塩 H₂O₂とペルオキシダーゼの存在下における４
−AAPに対するフエノール化合物の影響を比較
するために実験を行なつた。得られたデータを第
２図にプロツトした。このデータは、本発明の化
合物である４−MCが、４−AAPと協働して他の
フエノール誘導体より、発色速度が速く、アスコ
ルビン酸塩の妨害効果による褪色が遅い点で優れ
ていることを示す。 このように４−AAPは、H₂O₂とペルオキシダ
ーゼにより単独または種々のフエノール化合物、
特にフエノール、クロモトロープ酸（CTA）、４
−メチルカテコール（本発明）および３，５−ジ
クロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸
（DHSA）と共に酸化される。発色速度は、特定
の、酸化された指示薬が最強の光吸収を示す波長
で、分光光度計を用いて調べた。色の形成速度を
測定し、フエノール化合物の不存在下の色の形成
速度と比較した。４−AAPのみの場合の色の形
成速度を1.00に等しいと仮定して、得られたデー
タを標準化した。 ５個のキユベツトの各々に10mMの４−アミノ
アンチピリンを含有する水溶液を添加した。これ
らのキユベツトの４個に充分なフエノール化合物
を添加して濃度を10mMとした。各溶液をクエン
酸で0.311MとしPH5.0とした。西洋ワサビペルオ
キシダーゼを添加して酵素活性に応じて50mg／μ
〜1μｇ／mlの濃度を得た。次いでH₂O₂を添加
して10mMの最終濃度を得た。この発色相対速度
を測定し、得られたデータを同一の酵素濃度に標
準化した。 各分析において、光学密度が0.6に達するとき
アスコルビン酸を迅速に添加して、キユベツト濃
度を200μMとして光吸収変化を測定した。実験
からのデータを以下の表に示し、第２図にプロツ
トした。

【表】 上記のことから、４−メチルカテコールが検討
した他のカプラーより何倍も速くアミノアンチピ
リンと色を形成し、酸化された指示薬の色がアス
コルビン酸による漂白に対してさらに耐性がある
ことが明らかである。 実施例 ３ ４−AAP／４−MCを有する試験具と２−アミ
ノ−８−ナフトール−３，６−ジスルホン酸を
有する試験具の調製 グルコース測定用試験具を調製して実験を行な
つた。１組の試験具は指示薬として４−AAPと
４−MCを含有し、他方は２−アミノ−８−ナフ
トール−３，６−ジスルホン酸を含有する。両方
の指示薬系は約同一の吸光係数を有する。 浸漬溶液を下記成分を有するように調製した。 ポリビニルピロリドン（15ｇ／ml水溶液） 2.0ml ポリオキシエチル化オレイルアルコール〔ジー・
エイ・エフ・カンパニー（GAF Co.）ON.870、
５ｇ／ml水溶液〕 1.0ml グルコースオキシダーゼ（5000U／ml） 1.6ml ペルオキシダーゼ（PH5.5の1.0Mクエン酸塩緩衝
液中３mg／ml） 2.0ml ４−メチルカテコール（1.0Mエタノール溶液）
1.0ml ４−アミノアンチピリン（1.0Mエタノール溶液）
1.0ml 脱イオン水 1.4ml 全容量 10.0ml Whatman 31ETロ紙片をこの溶液中に浸漬し、
60℃で15分間乾燥した。 ４−AAPと４−MCに代えて1Mの２−アミノ
−８−ナフトール−３，６−ジスルホン酸エタノ
ール溶液2.0mlを用いた以外は同様に試験紙（具）
を同一の溶液から調製した。 両方の試験具を既知の濃度のグルコース溶液中
に手短かに浸漬し、60秒間インキユベートした。
50mg／dlのアスコルビン酸を含有する第２のグル
コース溶液を用いてアスコルビン酸塩の影響を測
定した。 両方の試験具を、アスコルビン酸塩が存在しな
いグルコース溶液に浸漬し、60秒間インキユベー
トし、次いで色の形成を観察して目盛を付した。
次に、同一の方法を用いてアスコルビン酸塩含有
グルコース溶液について試験具を検討した。結果
を以下に掲げ、第３図にプロツトした。

【表】

【表】 この結果は、アミノアンチピリン／メチルカテ
コール試薬細片によりアスコルビン酸塩耐性が改
良されたことを明確に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第３図は実施例１〜３より得られた
データのグラフであり、第１図および第２図は著
しく高められた色形成速度と共に、本発明によつ
て実現されたアスコルビン酸塩の減少作用を弱め
る指示薬の著しい軽減効果を示し、第３図はグル
コースを測定するに当つて上述の指示薬による本
発明の正確さを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験試料中のグルコースの存在を検出およ
   び／または濃度を測定するための組成物であつ
   て、前記組成物が前記試験試料１dl当り０〜約
   5000mgのグルコースの範囲にわたつて濃度を検出
   可能であり、また前記試料中のアスコルビン酸塩
   の存在による妨害に耐性があり、そして前記組成
   物がグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
   および指示薬としての４−アミノアンチピリンと
   ４−メチルカテコールとの混合物よりなることを
   特徴とする組成物。 ２ グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
   および４−アミノアンチピリンと４−メチルカテ
   コールとの混合物を包含する担体マトリツクスよ
   りなる試験試料中のグルコースの存在を検出およ
   び／または濃度を測定するための試験具。 ３ 担体マトリツクスが紙である特許請求の範囲
   第２項記載の試験具。 ４ 試験試料を、グルコースオキシダーゼ、ペル
   オキシダーゼおよび４−アミノアンチピリンと４
   −メチルカテコールとの混合物を包含する担体マ
   トリツクスに接触させ、検出可能な応答を観察す
   ることからなる試験試料中のグルコースの存在を
   検出および／または濃度を測定する方法。