JPH022103B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に診断試験の分野に関する。さ
らに詳しくは、グルコースおよび尿酸等の生物学
的成分の定性的及び定量的測定に有用な試験組成
物に関する。この試験組成物を使用した試験で
は、このような成分は過酸化物等の酸化性物質に
変換される。 グルコース酸化酵素はグルコースをグルコン酸
と過酸化水素に酵素的に変換する。かくして生成
した過酸化水素は、酸化されて色の変化等の応答
を生ずる指示薬系の存在下過酸化活性物質によつ
て水に還元される。 発色性指示薬であるｏ−トリジンがグルコース
試験系にしばしば用いられているが、ｏ−トリジ
ンを指示薬として用いると、アスコルビン酸等の
妨害物質によつて、酸化された指示薬が還元され
るという結果を与える。さらには、ｏ−トリジン
は安全性に疑問がある。 同様に、ウリカーゼは尿酸をアラントインと過
酸化水素に酵素的に変換する。生成した過酸化水
素は、指示薬系、歴史的にはｏ−ジアニシジンの
存在下過酸化活性物質によつて水に還元される。
ごく最近では、ゴツホマンとシユミツツ
（Gochman and Schmitz）は３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾンの塩酸塩をＮ，Ｎ
−ジメチルアニリンと共に用いて尿酸測定用のア
ゾ色素系指示薬を生成することを、クリニカル・
ケミストリー（Clin.Chem.）17巻、1154頁
（1971）に、同じ指示薬系を用いてグルコースの
測定を行なうことをクリニカル・ケミストリー、
18巻、943頁（1972）に報告している。そこでは、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンとの混合物がｏ−トリ
ジンより抵抗力があることが報告されてはいる
が、妨害物質であるアスコルビン酸に対する感受
性が報告された尿酸とグルコースの濃度に重大な
誤差を生じさせた。 古典的なアゾカツプリング反応におけるフエノ
ール、芳香族アミンその他の化合物によるヘテロ
環ヒドラゾン類の酸化的カツプリングの機構は、
ゾリンガー、「アゾ・アンド・ジアゾ・ケミスト
リー」、インターサイエンス、ニユーヨーク
（Zolinger、“Azo and Diazo Chemistry”、
Interscience、New York）、215〜217頁（1961）
に詳細に報告されている。西独のヒユニツヒ
（Hu″nig）と共同研究者による酸化性カツプリン
グによるアゾ色素の形成に向けられている本来の
研究の要約は、バエル著、カチオニツク・ダイ
ズ・フオー・シンセテイツク・フアイバーズ、ベ
ンカタラマン（編者）、ザ・ケミストリー・オ
ブ・シンセテイツク・ダイズ、vol.4、アカデミ
ツプ・プレス、ニユーヨーク（Baer、Cationic
Dyes for Synthetic Fibers、Venkataraman、
The Chemistry of Synthetic Dyes、Vol.4、
Academic Press、N.Y.、）188〜193頁（1971）
に包含されている。 ハンジカー（Hunziker）の米国特許第3979262
号は、上記ゴツホマン等の混合物にクエン酸およ
びマロン酸緩衝液を加えており、他の芳香族アミ
ンを、オルトとパラ位の両方で置換されない限り
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンと共に用いることがで
きることを開示している。この緩衝液は、また臨
界的であり、尿酸を測定するに当つては3.2〜
4.7、グルコースまたはコレステロールを測定す
るためには4.7〜5.5の所定のPH範囲を維持する。 過酸化水素を分析する際にヒドラゾン指示薬を
用いることを教示している限りでは、従来技術は
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
（MBTH）とジメチルアニリンとの間の反応が試
料中還元物質の効果に抵抗力があることを示唆し
ている。ｏ−トリジンのようなヒドラゾン系指示
薬に関しては、このことは真実であるかも知れな
いが、かかる指示薬系の使用はアスコルビン酸塩
の存在下では極めて不充分な指示（応答）しかも
たらさない。 故に、これらの先行の研究者による努力は、妨
害物質の作用が実質的にないかまたはそれらの安
全性が確認された指示薬を用いる指示薬系を提供
するには至らなかつた。 最近発行された米国特許第4119405号は４，５
−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン
酸と１−ヒドロキシ−２−ナフタレンジスルホン
酸をヒドラゾンカプラーとして開示している。ハ
ンジカーのカプラーとは異なつてこれらの化合物
はアミンではない。これらは従来のカプラーより
は格段優れているが、アスコルベートへの感受性
の点で今だに改良の余地を残している。 それゆえ、本発明の第１の目的は、体液中の過
酸化水素検出用の改良された試験組成物を提供す
ることである。 本発明の第２の目的は、他の臨床的に重要な体
液成分から酵素的に変換される過酸化水素を検出
するための改良された試験組成物を提供すること
である。 本発明の第３の目的は、妨害還元物質に非常に
抵抗力がある体液中の過酸化水素検出用の改良さ
れた試験組成物を提供することである。 本発明の第４の目的は、上述した利用がヒドラ
ゾンと８−アミノ−１−ナフトール−５，７−ジ
スルホン酸（シカゴ酸）よりなる新規な指示薬系
によつて達成される過酸化水素検出用の改良され
た試験組成物を提供することである。 本発明の他の目的および充分な理解は、添付図
面と共に与えられる好ましい具体例によつて導か
れる以下の記載と特許請求の範囲を参照すること
によつて得られるであろう。 本発明に従えば、過酸化水素測定用試験組成物
並びにこれを使用した試験具等の試験手段、試験
具の製造方法、過酸化水素の測定方法が提供され
る。さらに詳しくは、意図された試験手段はヒド
ラゾン類及び８−アミノ−１−ナフトール−５，
７−ジスルホン酸（シカゴ酸）からなる。さらに
は、試料中成分の測定用試験系であつて、該試料
中成分の存在に応答して少なくとも１の酸化性物
質を生成する手段並びにヒドラゾン類及び８−ア
ミノ−１−ナフトール−５，７−ジスルホン酸
（シカゴ酸）からなり、上記少なくとも１の酸化
性物質を測定するための組成物を有するものが提
供される。この試験系は、生理学的液体中の構成
成分の酵素的変換により生成される過酸化物を測
定するタイプであることが好ましい。組成物の形
の場合には、試験手段を錠剤またはマトリツクス
等の担体に包含させて試験具を作製してもよい。
この試験系は低濃度の検出すべき体液中成分に対
し、高い感受性がある一方、体液中にしばしば存
在するアスコルビン酸等の還元力を有する妨害物
質に対して非常に抵抗力がある。 この試験系において、試料中に存在する構成成
分に応答して少なくとも１つの酸化性物質を生成
する手段としては、グルコース測定用にはグルコ
ース酸化酵素又は尿酸測定用にはウリカーゼ及び
過酸化活性物質が挙げられる。このような過酸化
活性物質の代表としてはペルオキシダーゼまたは
ヘモグロビン等が挙げられる。これらは、過酸化
水素が酸化性物質である場合に用いられる。 従来技術の組成物とは対照的に、本発明の組成
物は低濃度の検出すべき体液構成成分に高い感受
性を有する一方、競争的還元物質、特に尿中のア
スコルビン酸の作用に非常に抵抗力を有する。検
出される過酸化水素の濃度に依存して特色のある
呈色反応が起こるのでグルコースや尿酸のような
体液成分の定量的検出が可能である。 以下の記載では、明確にするために、特定の用
語が用いられているが、これらの用語は、具体的
な例示のために選ばれた本発明の特別な具体例の
みに言及せんとするものであり、本発明の範囲を
限定あるいは制限するものではない。 本発明の試験組成物を使用した試験手段は多く
の物理的形態を採ることができ、採られるべき形
態に関係なくシカゴ酸とカツプリングするための
多くの特定のヒドラゾン類を含むことができる。
安定剤等の他の添加物を用いることができる。試
験手段は、試験系と同様、液体および固体の両方
の形で用いることができ、以下に記載された方法
および具体例によつて例示される試験手段の組成
物を包含する。 本発明の試験組成物を使用した試験手段に有用
なヒドラゾン類は、ヒドラジンのアルデヒドまた
はケトンとの縮合生成物であり、Ｃ＝NNH₂
基を含むものである。多くのヒドラゾン類は、ヒ
ドロキシナフタレンスルホネート類と酸化的にカ
ツプリングして着色物質を生成することができ
る。このようなものとしては、とりわけ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾ
ン 、 １−メチル−２−キノリノンヒドラゾン 、 Ｎ−メチル−ピリドン−４−ヒドラゾン 、 Ｎ−メチル−１−ピリドン−２−ヒドラゾン 、 １−メチル−キノリノン−４−ヒドラゾン 、 Ｎ−メチル−チアゾリノン−２−ヒドラゾン 、 Ｎ−メチル−１−オキサゾリン−２−ヒドラゾ
ン 、 Ｎ−メチル−ベンズオキサゾリンヒドラゾン 、 １，３−ジメチルベンズイミダゾリノン−２−
ヒドラゾン が挙げられる。この組成物の好ましい実施例とし
ては、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾン（MBTH）等の３−（C₁−C₄アルキル）−
２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン色原体が挙げ
られる。このようなヒドラゾン類は強力な還元剤
である。 ここに用いられているような“ヒドラゾン”と
いう表現はその酸付加塩を包含する。塩化水素
酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸等から形成された酸
付加塩等のあらゆる従来の酸付加塩を用いること
ができる。これらの酸付加塩は単独でも又は対応
するヒドラゾンと共に用いることができる。 ヒドラゾンとカプラーのモル比は約17：１〜約
１：17の範囲にあり、ほぼ等モル比であること
が、検出感度と妨害に対する抵抗性が最高になる
組合せとなるので好ましい。 この組成物は、さらに安定剤を含んでもよく、
カルボキシメチルセルロースおよび脂肪族アルコ
ールのポリオキシエチレンエーテル〔BRIJ（登録
商標）：アイシーアイ・ユナイテド・ステーツ・
インコーポレーテツド、ウイルミントン、デラウ
エア（ICI United States Inc.、Wilmington、
Delaware）19897により製造〕を選択することが
有利である。 本発明の試験組成物を使用した試験手段および
試験系は、やや低いPHでも性能を維持できるが、
一般的に中性あるいはわずかにアルカリ性のPH範
囲で用いることが好ましい。従来技術の示唆とは
対照的に、一般的に中性またはアルカリ性のPHに
維持することにより速度の面で反応性が改善さ
れ、妨害物質に対する抵抗性が改善される。 この試験系は、本発明の組成物と共に、試料中
に存在する検出すべき構成成分に応答してその組
成物によつて測定される過酸化水素を生成する手
段を含有する。このような手段は実際には酵素的
であることが好ましい。例えばグルコースを測定
せんとする場合には、グルコース酸化酵素とペル
オキシダーゼが構成成分への応答手段である。同
様に尿酸を検出せんとする場合には、ウリカーゼ
とペルオキシダーゼが構成成分への応答手段を構
成する。本願発明における構成成分の応答手段に
おいて有用な試薬の濃度やタイプは公知のものを
含んでいる。 本発明の試験組成物は、試料中の酸化性物質測
定用溶液として用いることができる。さらには、
組成物の形の試験手段を含有し、かかる酸化性物
質に変換される構成成分を測定するための試験系
を液体の形態で用いることができる。この試験系
は、尿、血清、骨髄液、組織培養上澄液等に試験
手段を添加して体液成分等の生物学的構成成分を
検出するために用いることができる。液体の形の
試験系を用いて分析するに当つては、ペルオキシ
ダーゼ及び／又は酸化酵素は使用直前まで他の試
薬から分離しておくべきである。 この測定はペルオキシダーゼ等の分離しておい
た試薬を入れることによつて進められる。 試験手段自体であろうとあるいは試験系の組成
物としてであろうと、溶液で用いる場合には、こ
の８−アミノ−１−ナフトール−５，７−ジスル
ホン酸（シカゴ酸）は、約10^-5M（Molar）〜約
10^-3Mの濃度で用いることが好ましい。同様に、
ヒドラゾン類は約10^-5M〜約10^-3Mの濃度で用い
ることが好ましい。１またはそれ以上の安定剤が
含まれる場合には、それらの安定剤は総濃度が約
0.5mg／dl〜約5.0mg／dlで存在することが好まし
い。ペルオキシダーゼが試験系の構成成分応答手
段よりなる少なくとも１つの試薬である場合に
は、ペルオキシダーゼの濃度は約10μｇ／〜約
500μｇ／であることが好ましい。溶液を調製
する際に用いる溶媒は水、生理学的溶液、メタノ
ール等の有機溶媒、あるいはそれらの混合物でよ
い。 本発明の試験組成物を包含する試験具及びかか
る試薬試験具の製造方法も又、本発明によつて提
供される。この製造方法はマトリツクスまたは錠
剤等の担体に試験手段または試験系をそれぞれ包
含させることからなる。この包含は、試験系を含
む本発明の組成物の溶液を担体に含浸し、次い
で、かくして含浸した担体を乾燥することによつ
てなされる。含浸法による他、基質またはマトリ
ツクス上に組成物を印刷または噴霧する等の他の
好適な技術によつて本発明の試験組成物を使用し
た試験具を調製することができる。 試験具は多重浸漬法によつて調製することが好
ましい。含浸用溶液に用いられる試薬の濃度は約
10^-3M〜飽和までの範囲である。ヒドラゾン類と
カプラーの一般的に最も有用な濃度はそれぞれ約
0.02Mである。ペルオキシダーゼの濃度は約
0.015mg／ml〜約２mg／mlである。固形物は細片
形状の担体マトリツクスに包含されていることが
好ましい。担体マトリツクスという用語は、水ま
たは生理学的液体にさらされる場合に不溶性でか
つ全体の構造を維持する吸収性および非吸収性の
マトリツクスを意味する。用いることができる好
適な吸収性マトリツクスとしては、紙、セルロー
ス、木、合成樹脂製フリース、ガラス繊維、織布
および不織布等が挙げられる。非吸収性マトリツ
クスとしてはポリプロピレン等の有機プラスチツ
ク材料が挙げられる。吸収性マトリツクスを用い
る場合には、使い易くするために両面接着テープ
等の好適な手段によつてこのマトリツクスを例え
ばポリスチレン等の有機プラスチツク細片等の不
溶性支持部材に固着することが有利である。 別の方法として、従来の担体材料を含有する圧
縮成形された錠剤の形を採る担体に本発明の組成
物を含ませることもできる。 この試験具は、試験試料中に瞬間的に浸漬する
かまたは別の方法で担体マトリツクスと試験試料
を接触させることによつて用いることが有利であ
る。この結果、酸化性成分が試料中に存在する場
合に検出可能な色の変化が生ずる。血漿、血清ま
たは他の体液試料を試験する場合、この試験具を
同様の方法で用いることができる。 いくつかの実例で報告されているＫ（試料の吸
収係数）と吸収種（尿酸またはグルコース等）の
濃度の関係は、コルツミ・ジー著、「反射分光
学」、スプリンゲル・フエアラーク・インコーポ
レーテツド、ニユーヨーク、1969（Kortumi、G.、
Reflectance Spectroscopy、Springer Verlag
Inc.、New York、1969）に、反射分光学の論議
と共に与えられているクベルカ−モンクの式
（Kubelka−Monk equation）によつて得られ
る。Ｋは、伝播測定法（transmission
measurements）で単位道程長さ当りの吸光度の
２倍（2A／ｂ）と定義される。本願の目的のた
めには、Ｋは、生成した着色指示薬のモル濃度に
比例すると仮定される。クベルカ−モンクの式に
よつて定義された関係では、検出される酸化性物
質の濃度が増加するに従つて反射百分率（％Ｒ）
は減少し、逆に濃度が減少するに従つて反射百分
率は増加する。かくして得られた表示は、その式
に従えば検出される吸収種の濃度と反比例の関係
にある。実施例においては、表示は示された一定
の波長（λ）に於て得られる。 反射率の表示は、ベツクマン・DK−２反射分
光光度計〔ベツクマン・インストルメント・イン
コーポレーテツド、フユラートン、カリホルニア
（Beckman Instruments、Inc.、Fullerton、
California）92634〕または反射比色計SCF−１
〔イスラエル・エレクトロ−オプテイカル・イン
ダストリー、リミテツド（Israel Electro−
Optical Industry Ltd.）、米国において、ブルー
マー・リサーチ・コーポレーシヨン、プレインウ
エル、ロング・アイランド、ニユーヨーク
（Broomer Research Corporation、Plainwell、
Long Island、N.Y.11803）より市販〕等の市販
の反射分光光度計より得ることができる。 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼおよびグルコー
ス酸化酵素は、マイルス・リサーチ・プロダク
ツ、マイルス・ラボラトリーズ、エルクハート、
インヂアナ（Miles Research Products、Miles
Laboratories、Elkhart Indiana46515）より入
手された。メチルビニルエーテルと無水マレイン
酸の共重合体（Gantrez AN−139）およびポリ
ビニルピロリジン（PVP）は、GAF・コーポレ
ーシヨン、ケミカル・プロダクツ、ニユーヨー
ク、ニユーヨーク（GAF Corporation、
Chemical Products、N.Y.、N.Y.）10020より入
手された。３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン
ヒドラゾン塩酸塩の１水和物、他のヒドラゾン
類、１−ヒドロキシ−３−ナフタレンスルホン
酸、１−ヒドロキシ−５−ナフタレンスルホン
酸、３−ジメチルアミノ安息香酸およびバイオレ
ツト酸（１−ナフトール−３，６−ジスルホン
酸）はアルドリツチ・ケミカル・カンパニー・イ
ンコーポレーテツド、ミルウオーキー、ウイスコ
ンシン（Aldrich Chemical Co.、Inc.、
Milwaukee、Wisconsin）53233より得られた。
シカゴ酸は、フアルツ・アンド・バウエル、イン
コーポレーテツド、スタンフオード、コネテイカ
ツト（Pfaltz＆Bauer Inc.、Stamford、Conn.）
06902より入手された。標準試薬等級の溶媒およ
び試薬が用いられた。 示される実施例は、単に例示であり、本発明を
限定し、制限しようとするものではない。当業者
は、望ましいと思われる成分およびパラメーター
の変換、置換、変形を行なうことができるであろ
う。 実施例 １ この実施例に記載された実験では、種々の
MBTH−カプラー系およびｏ−トリジンとの相
対的なアスコルビン酸塩抵抗性が示される。 第１の含浸用溶液を下記のものを含有するよう
に調製した。 蒸留水 40ml エタノール 40ml 蒸留水に溶かした５％ｗ／ｖのGantrez AN−
139溶液 52ml トリスマロン酸塩緩衝液〔2.8Mのトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、1.4Mのマロン酸、
1.4Mのマロン酸ナトリウム〕 32ml 蒸留水に溶かした10％ｗ／ｖのポリビニルピロリ
ドン 28ml 4.3mlのグルコース酸化酵素（1000U／ml）と19.3
mlの蒸留水の混合物に溶かした200mgのペルオキ
シダーゼ イートン−ダイクマン（Eaton−Dikeman）
204紙（Ｅ＆Ｄ）に上記調製溶液を飽和するま
で含浸し、次いで80℃で乾燥した。この乾燥した
紙の第１のグループをｏ−トリジンの0.02Mの
クロロホルム溶液で飽和し、50℃で乾燥して、用
いられるｏ−トリジン試験具を形成した。上記の
乾燥した紙の残りのグループすなわち第２組
に、250mgMBTH塩酸塩の１水和物を有する50ml
のメタノール溶液を飽和するまで含浸し、60℃で
乾燥した。 第３の含浸では、上記第２の紙に、以下の潜
在的カプラーの１つの示された溶液を飽和するま
でそれぞれ含浸した。 シカゴ酸 200mgを40mlのメタノールに溶かした。 バイオレツト酸 350mgを40mlのメタノールと10
mlの水の混合液に溶かした。 ジエチルアニリン 186mgを50mlのメタノールに
溶かした。 このように含浸した紙を60℃で乾燥して試験
具を調製した。 この試験具をアスコルビン酸もしくはアスコル
ビン酸塩（アスコルベート）を含まない100mg／
dlの水性グルコース溶液と50mg／dlのアスコルベ
ートを含む100mg／dlの水性グルコース溶液でそ
れぞれ試験し、生じた色の変化を記録式反射分光
光度計を用いて読み取つた。特定の波長における
波長の反射値を、前述のクベルカ−モンクの式に
より等価吸光度(K)に変換した。 50mg／dlのアスコルベートの存在下１分で得た
Ｋをアスコルベートの不存在下１分で得たＫで割
つたＫの比を用いた。１の値はアスコルベートの
妨害がないことを意味し、０の値はアスコルベー
トによつて完全に妨害されていることを意味す
る。 結果を表−１に示す。 【表】 ツト酸
MBTH〓ジエチル 600 0.12
アニリン(DEA)
このデータは、MBTH／シカゴ酸がｏ−トリ
ジンよりはるかに高いアスコルベート抵抗性を有
することを示し、MBTH／ジエチルアニリンに
基づく従来技術の組成よりはるかに高いアスコル
ベート抵抗性を有することを示す。 実施例 ２ この実施例によつて報告される実験では、
MBTH／シカゴ酸試験具を実施例１のように調
製し、いずれも100mg／dlのグルコースを含むが
一方はアスコルベートを含まない尿と他方は50
mg／dlのアスコルベートを含む尿試料を用いてそ
れぞれ試験した。試験具で観察した反射値を等価
吸光度(K)に変換し、実施例１のようにＫ値の比を
得た。アスコルベートを含有しない試験の活性に
比較したアスコルベートの存在下の活性の比は
0.89であつた。 この結果を実施例１の表−１で得た結果と比較
すると、尿を試験するために用いる場合には、
MBTH／シカゴ酸試験具はアスコルベート抵抗
性は２倍であつた。 実施例 ３ 本発明の組成物を用いて下記のように調製した
溶液を、アスコルベートを含む溶液と含まない溶
液のPHおよび緩衝液の変化の効果に関して従来技
術のものと比較した。 これらの試験は、先に報告したものと同様に、
ヒドラゾン類と、酸化性物質に応答する種々のカ
プラーとの反応を比較した。先の実施例では、組
成物は分析対象物すなわち被検物質と反応して酸
化性物質である過酸化水素を生成するオキシダー
ゼを含んでいた。 ペルオキシダーゼは、他の成分と共に組成物に
含有され、反応は分析対象物を含む試料に接触さ
せると進行した。対照的に、この実施例の試験組
成物は、分析対象物応答性酸化酵素よりむしろ過
酸化水素を含むように調製され、ペルオキシダー
ゼは、試験を進める時まで与えることを差し控え
た。 PH5.0の試験溶液を0.311Mのクエン酸緩衝液で
調製した。PH7.0の試験溶液は、0.093Mのマロン
酸塩と共に0.093Mのトリス〔トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕で調製した。各緩衝系
では、試験溶液は100μMのMBTH、100μMのカ
プラー、および333μMの過酸化水素の濃度に調
製した。各カプラー用に調製した試験溶液を２個
に分けた。一方の試験溶液には56.8μM（１mg／
dl）のアスコルビン酸を添加した。 上記の溶液を３mlの標準のガラス製または石英
製キユベツト中に入れた。各々の場合、125n
ｇ／mlの濃度になるまでペルオキシダーゼを注入
して反応を進めた。先の実施例のように、発色性
のカツプリングしたヒドラゾン／カプラーの形成
により光学密度が変化する。光学密度の変化
（ΔOD）は、標準記録式吸収分光光度計によつて
記録した。結果を表−２、表−３に示す。 【表】 〓ナフタレンス
ルホン酸
【表】 〓ナフタレンス
ルホン酸
PH７のトリスマロネート緩衝系中で、シカゴ酸
について観察された結果は、ジメチルアニリンと
ヒドロキシナフタレンスルホネートの結果より優
れていた。シカゴ酸はアスコルベートの存在下、
不存在下のいずれにおいてもより高い反応性を示
した。１分当りの発色（ΔOD）で表わした約PH
7.0における活性は、アスコルベートを含有しな
いPH5.0のクエン酸中の活性の３〜４倍であり、
アスコルベートを含有する場合にも大きな相違が
見られる。トリスマロン酸塩（PH７）およびクエ
ン酸（PH５）系のMBTH／シカゴ酸に対して、
種々の時間における56.8μmol／1.0mg／dlのアス
コルビン酸の存在下で得られた結果と各吸光度
（光学密度）値を第１図（Fig.１）にグラフで示
す。トリスマロン酸塩（PH７）系に対して、
56.8μmol／1.0mg／dlのアスコルビン酸の欄存在
下種々のカプラーを用いて得られた結果を、１つ
の注目すべき例外と共に第２図（Fig.２）にグラ
フで示す。従来技術のカプラー、ジメチルアニリ
ンはこれらのパラメーターの下でさえ反応しない
ので、その曲線はクエン酸（PH５）のデータより
得た。 このようにシカゴ酸は、好ましい生理学的PH範
囲において、任意に、しかも最も有効に働き、特
に酵素分析において重要である。 本発明はある程度特定して記載されているが、
本記載が実施例によつてのみなされたものであつ
て、本発明の範囲から逸脱することなく、細部に
わたつては多くの変化がなされることは理解され
よう。

【図面の簡単な説明】

第１図（Fig.１）は、異なつたPHレベルにおい
てアスコルビン酸の存在下で試験された本発明に
従つたMBTH／シカゴ酸に対して実施例３で報
告されたデータを示し、光学密度対時間をプロツ
トして得られたグラフである。第２図（Fig.２）
は、ジメチルアニリンの曲線がクエン酸緩衝液
（PH５）で観察されたものであるという例外を伴
ない、トリスマロン酸塩緩衝液（PH７）中でアス
コルビン酸の存在下で試験された種々のMBTH
カプラーに対して実施例３で報告されたデータを
示すグラフである。

【特許請求の範囲】

１ 式〔ホルモン〕−〔Ａ〕−〔蛋白質又はポリペプ
チドキヤリア〕−〔フルオロクローム〕で示される
分子複合体を主成分とするものであつて、(a)上記
〔ホルモン〕は、−Ａ−へ共有結合したステロイド
分子単位であり、(b)上記−Ａ−は、共有結合した
化学的鎖であり、(c)上記キヤリアーは、それぞれ
１以上の〔ホルモン〕−Ａ−物質、及び１以上の
フルオロクローム染料物質へ共有結合しうる多機
能親水性分子単位であり、(d)上記〔フルオロクロ
ーム〕は、上述のキヤリアーと共有結合した少く
とも１つの染色単位であり、又ライトを当てると
目視観察できる色を出すことができるものであ
り、かつ上記フルオロクローム染料の上記ホルモ
ンに対する平均分子比率は約２：１と１：50の間
であり、そして、上記複合体の上記〔ホルモン〕
成分は生理的PHの水溶液中で少くとも10^-2Mから
10^-5Mの濃度をもつことを特徴とするステロイド
ホルモン受容体特性をもつ癌組織細胞の検出に有