CN107541543A - 检测细菌性阴道病的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测细菌性阴道病的试剂盒，包括检测装置、显色液和样本稀释液，所述检测装置中包括pH值反应垫、过氧化氢反应垫、白细胞酯酶反应垫和唾液酸苷酶反应垫。本发明检测细菌性阴道病的试剂盒，具有可在室温条件下反应、操作简单、指标客观等特点，可作为妇科阴道内微生态环境评价的指标，用于临床辅助诊断BV。

Description

检测细菌性阴道病的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测细菌性阴道病的试剂盒。
背景技术
细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)是由于阴道内微生态平衡失调，正常乳酸杆菌减少而阴道加特纳菌(Gardnerella vaginalis,GV)、普雷沃菌(Prevotellaspp)、拟杆菌(Bacteroides)、动弯杆菌(Mobiluncus spp)人型支原体(Mycoplasmahominis)等兼性厌氧菌数量异常增加，所引起的一种无阴道粘膜炎症表现的综合症。以前对它的认识有限，曾命名为嗜血杆菌阴道炎(Haemophilus vaginitis)、棒状杆菌阴道炎(Gardnerellavaginalis vaginitis)、非特异性阴道炎(NO-specific vaginitis)和加特纳菌阴道炎(Gardnerella vaginits)等，皆因在不同时期对其病原体认识不同而命名不同。1955年Gardner和Dukes从特异性阴道炎患者的阴道分泌物中分离出阴道嗜血杆菌，认为是本病的病原菌，因而称此病为阴道嗜血杆菌阴道炎(Corynebacterium vaginitis)。1980年Greenwood和Pickett通过DNA-DNA杂交试验，电镜观察及细菌外膜生化分析证实此菌是一独立新菌种，并命名为阴道加特纳菌(GV)，改称此病为加特纳菌阴道炎。但由于GV并不是导致该病的唯一病原体，还有其他厌氧菌和支原体等存在，特别是此病的炎性表现并不明显，分泌物中白细胞稀少，也无脓细胞存在，因此，在1984年的瑞典国际会议上被正式命名为“细菌性阴道病”。BV患者约10％～50％无临床症状，主要依靠实验室诊断。BV的诊断方法大致分为三类即临床诊断、微生物学诊断、生物化学诊断。临床诊断即传统的Amsel法，是传统诊断BV的金标准，简单易行，但易受人为因素及BV感染无头的因素影响，主观性强，操作费时，已逐渐被其他方法所取代。微生物学检查操作繁琐，效率低，已很少使用。随着对BV病原学研究的深入，发现BV与阴道微生物中的某些代谢产物有关，因此可以通过检测这些微生物的代谢产物来诊断BV，目前主要通过检测与BV相关的酶来诊断BV，如唾液酸苷酶。
唾液酸酶又称神经氨酸酶，是一种存在于溶酶体、细胞质和细胞膜上的酶蛋白，该酶活性与毒力因子很相似，能够水解非还原性的终端为唾液酸的多种底物，如糖蛋白、糖脂类、神经节苷脂以及多聚糖类，破坏粘蛋白，增强细菌黏附性，而且通过损害IgA的免疫反应性来对抗其他毒力因子。唾液酸苷酶由阴道菌群中的厌氧菌如普雷沃菌和拟杆菌等产生，其活性被认为与BV感染水平呈正相关。唾液酸苷酶的活性在BV时(1.35±1.87nmol/mlmin)明显高于无BV的妇女(0.03±0.14nmol/ml min)该法的检测原理是，人工合成唾液酸酶底物，并以其酶与底物反应后显示颜色的不同来诊断BV。
近年来利用致病菌特异的酶催化机理，结合发色底物形成的酶快速检测技术，已成为BV快速诊断发展的主导方向。如BV BLUE试剂盒，以其简便、快速、准确的优点在欧美许多国家广泛应用。为了对阴道内环境做进一点的了解，目前国外大多将唾液酸苷酶、过氧化氢、白细胞酯酶、pH值等几项进行联合检测。
过氧化氢是阴道内乳酸杆菌产生的一种重要的杀菌物质，对防止致病菌的加剧增值和维持阴道微生态平衡具有重要的作用，一般情况下，阴道分泌物中过氧化氢浓度与乳酸杆菌的数量成正比，过氧化氢浓度的测定是分析阴道微生态是否正常的良好指标。正常人阴道分泌物中的过氧化氢浓度一般在2，如检测过氧化氢浓度≤2时，则意味着阴道内微生态菌遭到到破坏，已经引起了厌氧菌的生长，导致了阴道内菌群的失衡。
白细胞酯酶(Leukocyte esterase，LE)是白细胞膜上的一种蛋白质，炎症感染时白细胞特别是粒细胞由于趋化作用通道上皮细胞粘膜渗透到分泌物中，当粒细胞受到破坏以后释放出LE，其活性与受损的粒细胞数量成正比，而与完整的粒细胞数量不一定成比例。白细胞和吞噬细胞是阴道中主要的防御性细胞。细菌感染时，白细胞被其吞噬的细菌释放的水解酶和内毒素分解，胞内的LE释放出来，造成分泌物中LE活性增高。其他微生物如滴虫、念珠菌和加特纳菌等对白细胞的毒性较低，因此滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎和BV患者阴道分泌物中的LE可能正常。LE作为检测指标最早用于尿道感染的检测，后来人们发现支原体、衣原体或淋球菌感染时LE的活性明显升高后，才把此指标用于女性的泌尿生殖感染的检测诊断。LE属于广泛的非特异性指标，较敏感，阳性提示受检者阴道内感染了能合成分解阴道细胞内毒素的病原体，结合清洁度结果，可以帮助临床医生了解患者阴道壁有无实质性粘膜损伤。
正常阴道分泌物pH值为4.0～4.5，阴道内的乳酸杆菌利用阴道上皮细胞的糖原产生乳酸和过氧化氢，使阴道分泌物保持酸性，酸性环境对维持阴道菌群非常重要，可阻止外界微生物的入侵和有害微生物的过度繁殖，是阴道的天然屏障。患者有BV时，由于细菌自产和分解阴道细胞产生的胺类化合物，阴道pH普遍上升。
常规的细菌性阴道病检查方法为镜检，检测项目包括清洁度(评估微生态状况)，霉菌(霉菌感染指标)，滴虫(滴虫感染指标)，pH(酸碱环境指标)，胺试验(BV感染指标)，线索细胞(BV感染指标)。常规镜检已经普及使用，但人为主观因素强，判断标准不一致，需要经验积累，误判率高。作为阴道病检查的干化学酶法，检测项目包括pH(酸碱环境指标)，H2O2(有益菌数量及杀菌强弱)，白细胞酯酶(炎症指标)，唾液酸苷酶(厌氧菌感染指标)，脯氨酸氨基肽酶(厌氧菌及念珠菌感染指标)，乙酰氨基葡萄糖苷酶(白色念珠菌及滴虫感染指标)，检测标准统一，结果直观，无需经验积累，检出率和准确性高于镜检法，且标本量大，效率高。
细菌性阴道病是妇产科最常见的一种阴道非特异性炎性疾病，国内外报道其感染率约为15％～50％，且常易复发，它的炎症反应常常是隐性的，具有比较弱的炎症反应特点。
目前，诊断BV主要采用临床诊断标准Amsel法，同时结合革兰氏染色，该方法操作繁琐，且不易掌握，易受人为影响，不利于患者及时治疗.
Amsel诊断标准：以下4项中符合3项即可诊断BV：①分泌物为均匀一致的稀薄白带；②阴道pH>4.5；③氨试验阳性,取少量阴道分泌物于玻璃片上,10％氢氧化钾溶液1～2滴,产生烂鱼样腥臭味即为阳性；④线索细胞阳性,高倍显微镜下线索细胞超过20％。
细菌性阴道病联合检测试剂盒，具有快速、操作简单、指标客观等特点，可作为妇科阴道内微生态环境评价的指标，用于临床辅助诊断BV。
对比市面的存在的三个公司的干化学法检测细菌性阴道病试剂盒，存在以下问题：1、过氧化氢孔假阳性高；2、室温反应颜色弱，需要恒温加热器；3、检测指标过多，使用中容易混淆。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种检测细菌性阴道病的试剂盒，所述检测细菌性阴道病的试剂盒具有快速、操作简单、指标客观等特点，可作为妇科阴道内微生态环境评价的指标，用于临床辅助诊断BV。
为实现上述技术目的，具体技术方案如下：
一种检测细菌性阴道病的试剂盒，包括检测装置、显色液和样本稀释液，所述检测装置中包括pH值反应垫、过氧化氢反应垫、白细胞酯酶反应垫和唾液酸苷酶反应垫；
其中，所述过氧化氢反应垫为载体经过氧化氢反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括以下组分：
所述样本稀释液以质量百分比计，包括以下组分：
所述等渗调节剂为氯化钠或葡萄糖，当所述等渗调节剂为氯化钠时，质量百分比为0.5％～1.1％，当所述等渗调节剂为葡萄糖时，质量百分比为3％～6％。
在其中一些实施例中，所述pH值反应垫为载体经pH值反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述pH值反应液包括溶液A和氢氧化钠溶液，所述溶液A以质量百分比计，包括以下组分：
用氢氧化钠溶液调节所述溶液A颜色为绿色至蓝色；
所述唾液酸苷酶反应垫为载体经唾液酸苷酶反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
唾液酸苷酶底物 0.01％～5％，
海藻糖 0.01％～10％，
硫酸钠 0.01％～2％，
生物缓冲液 余量；
所述唾液酸苷酶底物为5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸、5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐和4-甲基伞形酮-α-N-乙酰基神经氨酸苷钠盐中的一种或一种以上；
所述白细胞酯酶反应垫为载体经白细胞酯酶反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
白细胞酯酶底物 0.001％～2％，
咪唑 0％～5％，
无水乙醇 余量；
所述白细胞酯酶底物为5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯、5-溴-4-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚乙酯、5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、吲哚酯、吡咯酯和2-甲氧基-4-吗啉基重氮苯氯化锌盐中的一种或一种以上；
所述显色液以质量百分比计，包括以下组分：
重氮盐 0.01％～5％，
表面活性剂 0.001％～1％，
离子保护剂 0.01％～10％，
pH值为3.0～10.0的盐酸溶液、醋酸溶液、生物缓冲液中的一种余量，
所述重氮盐为固紫B盐、固红B盐、固蓝B盐和1-重氮基-2-萘酚-4-磺酸中一种或一种以上；所述表面活性剂为曲拉通100、吐温-20和吐温-80中的一种或一种以上；所述离子保护剂为氯化镁。
在其中一些实施例中，所述pH值反应液中的溶液A包括以下组分：
所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括以下组分：
所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
唾液酸苷酶底物 0.01％～2％，
海藻糖 0.1％～5％，
硫酸钠 0.01％～1％，
生物缓冲液 余量；
所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
白细胞酯酶底物 0.01％～1％，
咪唑 0％～2％，
无水乙醇 余量；
所述显色液以质量百分比计，包括以下组分：
重氮盐 0.02％～2％，
表面活性剂 0.01％～0.1％，
离子保护剂 0.1％～5％，
pH值为3.0～10.0的盐酸溶液、醋酸溶液、生物缓冲液中的一种余量；
所述样本稀释液以质量百分比计，包括以下组分：
所述等渗调节剂为氯化钠或葡萄糖，当所述等渗调节剂为氯化钠时，质量百分比为0.8％～1.0％，当所述等渗调节剂为葡萄糖时，质量百分比为4.5％～5.5％；
所述防腐剂为叠氮钠、多聚赖氨酸、ProClin300中的一种或一种以上。
所述过氧化氢反应液中的抗氧化剂的质量百分比含量进一步优选为0.01～0.1％，四甲基联苯胺的质量百分比含量进一步优选为0.4％～0.6％。
所述唾液酸苷酶反应液中的唾液酸苷酶底物的质量百分比含量进一步优选为0.1～2％，海藻糖的质量百分比含量进一步优选为1～5％。
在其中一些实施例中，所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括5％～10％的3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，0.04％～0.1％的4-氨基安替比林，0.01％～1％的辣根过氧化物酶，0.07％～0.08％的抗氧化剂，余量为生物缓冲液。
所述过氧化氢反应液以质量百分比计，进一步优选为包括7～8％的3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，0.04～0.06％的4-氨基安替比林，0.4～0.6％的辣根过氧化物酶，0.07～0.08％的抗氧化剂，余量为生物缓冲液。
在其中一些实施例中，所述样本稀释液以质量百分比计，包括以下组分：
在其中一些实施例中，所述pH值反应液中的溶液A包括以下组分：
溴甲酚绿 0.1％～0.2％，
茜素红S 0.005％～0.01％，
无水乙醇 余量。
在其中一些实施例中，所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括0.1％～1％5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐，2％～5％海藻糖，0.5％～1％硫酸钠，余量为生物缓冲液。
所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，进一步优选为包括0.1～0.2％5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐，2～3％海藻糖，0.5～0.6％硫酸钠，余量为生物缓冲液。
在其中一些实施例中，所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括0.09％～1％5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯，0.5％～1％咪唑，余量为无水乙醇。
所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，进一步优选为包括0.9～1％5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯，0.5～0.6％咪唑，余量为无水乙醇。
在其中一些实施例中，所述显色液以质量百分比计，包括0.02％～1％固紫B盐，0.08％～0.1％曲拉通100，0.4％～5％氯化镁，余量为pH值为3.0～10.0的生物缓冲液。
所述显色液以质量百分比计，进一步优选为包括0.1～0.2％固紫B盐，0.08～0.1％曲拉通100，4～5％氯化镁，余量为pH值为3.0～10.0的生物缓冲液。
在其中一些实施例中，所述生物缓冲液为磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和TRIS缓冲液中的一种或一种以上，所述生物缓冲液的浓度为0.01mol/L～2mol/L；所述抗氧化剂为维生素C、多酚和生育酚中的一种或一种以上。
本发明中所述载体为玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、滤纸和层析滤纸中的一种。上述载体优选滤纸、吸水纸。
本发明相较现有技术的优点以及有益效果为：
本发明针对现在技术的不足，通过改进过氧化氢反应液和样本稀释液的配方，可以改善过氧化氢孔假阳性高以及在室温条件下反应，进一步的，通过改进pH值反应液、白细胞酯酶反应液、唾液酸苷酶反应液、显色液的配方，使本试剂盒在室温条件下也能反应且检查结果直观准确；本发明检测细菌性阴道病的试剂盒，具有可在室温条件下反应、操作简单、指标客观等特点，可作为妇科阴道内微生态环境评价的指标，用于临床辅助诊断BV。
附图说明
图1为本发明实施例中的pH值反应液的检测效果对比图；
图2为本发明实施例中的过氧化氢反应液的检测效果对比图；
图3为本发明实施例中的唾液酸苷酶反应液的检测效果对比图；
图4为本发明实施例中的白细胞酯酶反应液的检测效果对比图；
图5为本发明实施例中的显色液的检测效果对比图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
本发明中所用原料均为市售普通原料。
实施例
一种检测细菌性阴道病的试剂盒，该试剂盒由试剂盒体，检测装置、显色液和样本稀释液组成。检测装置中包括四种反应垫，分别是pH值反应垫、过氧化氢反应垫、白细胞酯酶反应垫、唾液酸苷酶反应垫，所述的四种反应垫的载体均为3MM滤纸，试剂盒体上分别设置有pH值反应孔、过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔以及唾液酸苷酶反应孔，每个反应孔中填入对应的反应垫；
(1)pH值反应垫为载体经pH值反应液浸泡后干燥所得的反应垫，pH值反应液的具体配方如下：
配方1：
溶液A：溴甲酚绿：0.1wt％，
其余为无水乙醇；
用氢氧化钠溶液调上述溶液A颜色为绿色至蓝色。
配方2：
溶液A：溴甲酚绿：0.02wt％，
溴酚蓝：0.01wt％，
其余为无水乙醇；
用氢氧化钠溶液调上述溶液A颜色为绿色至蓝色。
配方3：
溶液A：溴甲酚绿：0.2wt％，
茜素红S：0.01wt％，
其余为无水乙醇；
用氢氧化钠溶液调上述溶液A颜色为绿色至蓝色。
对以上三个配方的pH值反应液所处理的反应垫进行了检测结果对比试验，具体步骤如下：
向以上三种配方pH值反应液的处理的反应垫中加入35μL pH值分别为3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4的醋酸缓冲液，立即观察结果。
结果请见图1(图1中从左至右分别为配方1、2、3所得结果)，从图1可知本发明配方处理的反应垫，各个浓度颜色变化分明，效果好，而其中配方3处理的反应垫可达到最佳的检测效果。
(2)过氧化氢反应垫为将载体经过氧化氢反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括以下组分：
配方1：
3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠：7.5％；
4-氨基安替比林：0.05％；
辣根过氧化物酶：0.5％；
维生素C：0.075％；
其余为0.2mol/L的醋酸缓冲液。
配方2：
四甲基联苯胺：0.5％；
辣根过氧化物酶：0.5％；
维生素C：0.075％；
其余为无水乙醇。
对以上两个配方的过氧化氢反应液进行了检测结果对比试验，具体步骤如下：向在以上两种配方过氧化氢反应液处理后的反应垫中加入35μL的浓度分别为0μmol/L(纯水)、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L、128μmol/L过氧化氢溶液(上述过氧化氢溶液使用浓度为30％的过氧化氢溶液采取本发明样本稀释液进行稀释，样本稀释液的具体配方为5wt％阿拉伯树胶，0.001wt％ProClin300，0.9wt％氯化钠，盐酸添加量为调样本稀释液的pH值至3.5，余量为纯化水)，在室温(10℃～30℃)中，反应30分种，观察结果。
结果请见图2(图2-A为配方1的结果，图2-B为配方2的结果)，从图2可知本发明配方处理的反应垫反应灵敏，可检测初始浓度为2μmol/L，且各个浓度颜色变化分明，效果好，而其中采用配方1的反应垫效果最好，可达到最佳的检测效果。本发明样本稀释液可使过氧化氢更为稳定，防止样本中的过氧化氢在送检或检测过程中分解，从而减少了过氧化氢假阳性高的问题。
(3)唾液酸苷酶反应垫为载体经唾液酸苷酶反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
配方1：
5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸：1％；
海藻糖：5％；
硫酸钠：1％；
其余为0.2mol/L的醋酸缓冲液。
配方2：
5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐：0.1％；
海藻糖：2.5％；
硫酸钠：0.52％；
其余为0.2mol/L的磷酸缓冲液。
配方3：
4-甲基伞形酮-α-N-乙酰基神经氨酸苷钠盐：0.1％；
海藻糖：2.5％；
硫酸钠：0.52％；
其余为0.2mol/L的柠檬酸缓冲液。
配方4：
5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸：0.01％；
5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐：2％；
4-甲基伞形酮-α-N-乙酰基神经氨酸苷钠盐：2％；
海藻糖：1％；
硫酸钠：1％；
其余为0.2mol/L TRIS缓冲液。
对以上四个配方的唾液酸苷酶反应液所制备的反应垫进行了检测结果对比试验，具体步骤如下：向在以上4种配方唾液酸苷酶反应液处理后的反应垫中加入35μL的浓度分别为0.00375U/mL、0.0075U/mL、0.015U/mL、0.03U/mL唾液酸苷酶溶液(上述唾液酸苷酶溶液采取本发明样本稀释液进行稀释，样本稀释液的具体配方为5wt％阿拉伯树胶，0.001wt％ProClin300，0.9wt％氯化钠，盐酸添加量为调样本稀释液的pH值至3.5，余量为纯化水)以及本发明的显色液(具体配方为0.2％固紫B盐，0.1％曲拉通100，5％氯化镁，余量为pH3.0的盐酸溶液)进行检测，在室温(10℃～30℃)中，反应30分种，观察结果。从配方1和配方4的结果可以看到0.03U/mL的唾液酸苷酶浓度已经达到了设计要求，结果与0.06U/mL相差不大，因此在配方2和配方3中设置最高检测浓度为0.03U/ML，不再设置0.06U/mL浓度。
结果请见图3(图3-A为配方1的结果，图3-B为配方2的结果，图3-C为配方3的结果，图3-D为配方4的结果)，从图3可知本发明配方处理的反应垫反应灵敏，可检测初始浓度为0.00375U/mL，且各个浓度颜色变化分明，效果好，而其中采用配方2的反应垫效果最好，可达到最佳的检测效果。
(4)所述白细胞酯酶反应垫为载体经白细胞酯酶反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
配方1：
5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯：1％；
咪唑：0.5％；
其余为无水乙醇。
配方2：
5-溴-4-氯-3-吲哚辛酯：1％；
咪唑：5％；
其余为无水乙醇。
配方3：
5-溴-6-氯-3-吲哚乙酯：0.5％；
咪唑：0；
其余为无水乙醇。
配方4：
5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯：0.1％；
咪唑：1％；
其余为无水乙醇。
配方5：
吲哚酯：0.1％；
咪唑：0.1％；
其余为无水乙醇。
配方6：
吡咯酯：1％；
咪唑：5％；
其余为无水乙醇。
配方7：
2-甲氧基-4-吗啉基重氮苯氯化锌盐：1％；
咪唑：5％；
其余为无水乙醇。
配方8：
5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯：0.2％；
5-溴-4-氯-3-吲哚辛酯：0.2％；
5-溴-6-氯-3-吲哚乙酯：0.2％；
5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯：0.2％；
吲哚酯：0.2％；
吡咯酯：0.2％；
2-甲氧基-4-吗啉基重氮苯氯化锌盐：0.2％；
咪唑：2.5％；
其余为无水乙醇。
对以上8个配方的白细胞酯酶反应液进行了检测结果对比试验，具体步骤如下：向在以上8种配方白细胞酯酶反应液处理后的反应垫中加入35μL的浓度分别为0.1094U/mL、0.2188U/mL、0.4375U/mL、0.875U/mL、1.75U/mL白细胞酯酶溶液(上述白细胞酯酶溶液采取本发明样本稀释液进行稀释，样本稀释液的具体配方为5wt％阿拉伯树胶，0.001wt％ProClin300，0.9wt％氯化钠，盐酸添加量为调样本稀释液的pH值至3.5，余量为纯化水)以及本发明的显色液(具体配方为0.2％固紫B盐，0.1％曲拉通100，5％氯化镁，余量为pH3.0的盐酸溶液。)进行检测，在室温(10℃～30℃)中，反应30分种，观察结果。
结果请见图4(图4-A为配方1的结果，图4-B为配方2的结果，图4-C为配方3的结果，图4-D为配方4的结果，图4-E为配方5的结果，图4-F为配方6的结果，图4-G为配方7的结果，图4-H为配方8的结果)，从图4可知本发明配方处理的反应垫反应灵敏，可检测初始浓度为0.1094U/mL，且各个浓度颜色变化分明，效果好，而其中采用配方1的反应垫效果最好，可达到最佳的检测效果。
(5)显色液以质量百分比计，具体配方如下：
配方1：
固紫B盐：0.2％；
曲拉通100：0.1％；
氯化镁：5％；
pH值为3.0的盐酸溶液余量。
配方2：
固红B盐：0.02％；
曲拉通100：0.01％；
氯化镁：0.1％；
pH值为3.0的盐酸溶液余量。
配方3：
固蓝B盐：0.02％；
曲拉通100：0.01％；
氯化镁：0.1％；
pH值为9.0的0.2mol/L TRIS缓冲液余量。
配方4：
1-重氮基-2-萘酚-4-磺酸：0.01％；
曲拉通100：0.01％；
氯化镁：1％；
pH值为7.0的0.2mol/L TRIS缓冲液余量。
对以上四个配方的显色液进行了检测结果对比试验，具体步骤如下：
取本发明配方1的白细胞酯酶反应液制备反应垫，加入35μL的浓度分别为0.1094U/mL、0.2188U/mL、0.4375U/mL、0.875U/mL、1.75U/mL白细胞酯酶，并同时加入上述4个配方的显色液行检测，在室温(10℃～30℃)中，反应30分种，观察结果。
结果请见图5(图5-A为配方1的结果，图5-B为配方2的结果，图5-C为配方3的结果，图5-D为配方4的结果)，从图5可知，本发明配方的显色液各个浓度颜色变化分明，效果好，其中配方1效果最理想，能达到最佳的检测效果。
本发明显色液用于唾液酸苷酶反应垫以及白细胞酯酶反应垫，上述两反应垫可分别使用不同配方的显色液或同一种配方的显色液。
上述检测细菌性阴道病的试剂盒的制备方法：
反应垫的制备：
pH值反应垫为将载体经pH值反应液浸泡后，在10℃～50℃的环境下进行干燥处理得到完全干燥的pH值反应垫；
过氧化氢反应垫为将载体经过氧化氢反应液经浸泡后，在10℃～50℃的环境下进行干燥处理得到完全干燥的过氧化氢反应垫；
白细胞酯酶反应垫为将载体经白细胞酯酶反应液经浸泡后，在10℃～50℃的环境下进行干燥处理得到完全干燥的白细胞酯酶反应垫；
唾液酸苷酶反应垫为将载体经唾液酸苷酶反应液经浸泡后，在10℃～50℃的环境下进行干燥处理得到完全干燥的唾液酸苷酶反应垫；
按照本发明配方配置样本稀释液和显色液；
采用常规制备试剂盒体，在试剂盒体上设置pH值反应孔、过氧化氢反应孔、白细胞酯酶反应孔以及唾液酸苷酶反应孔，每个反应孔中填入对应的反应垫，即得。
本发明检测细菌性阴道病的试剂盒原理：
1、过氧化氢浓度测定：用于表示分泌物中有益菌如乳酸杆菌的多少，阴性表明乳酸杆菌正常，阳性则表明乳酸杆菌偏少或没有，提示阴道菌群失调，受检者可能处于病变或亚健康状态。在样本液中的过氧化氢存在条件下，耦联色原底物4-氨基安替吡啉、DHBS(3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)和TMB(四甲基联苯胺)在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下缩合形成红色、紫红色或蓝色的物质，且呈色深浅与过氧化氢的浓度成正比。
2、白细胞酯酶活性测定：用于表示样本液中的白细胞酯酶的催化活性，提示受检者是否有阴道病。样本液中的白细胞酯酶能崔化水解白细胞酯酶底物，释放出溴吲哚基，遇重氮盐起反呈红色、黄色、紫红色或蓝色，呈色深浅与白细胞酯酶的活性成正比。
3、唾液酸苷酶活性测定：用于表示唾液酸苷酶的催化活性，提示受检者是否有细菌性阴道病。唾液酸苷酶水解唾液酸苷酶底物，释放出溴吲哚基，遇重氮盐起反应呈红色、黄色、紫红色或蓝色，呈色程度与唾液酸苷酶活性成正比。
4、pH值反应垫：正常阴道pH一般为4.0-4.5，pH反应垫的检测范围是3.6-5.4，随着pH值的升高，pH值反应垫颜色从黄色到蓝色过渡。
本发明检测细菌性阴道病的试剂盒操作流程
将取样棉签取样后先在本发明试剂盒上的pH值反应孔中点印一下，立即观察结果；然后将取样棉签放入试管中，加入400微升样本稀释液于试管中，反复挤压管壁，使目的物充分释出。
在本发明试剂盒上的白细胞酶反应孔、唾液酸苷酶孔、过氧化氢反应孔滴加一滴(约35微升)的样品，然后在白细胞酯酶反应孔和唾液酸苷酶反应孔中各滴加一滴显色液。
把本发明试剂盒在室温(10℃～30℃)中，反应30分种，立即判断结果，或置于恒温37℃的水浴或干浴中，温浴15分钟，立即判断结果。
结果判断：
过氧化氢反应孔：呈红色或紫红色或蓝色为阴性，指示阴道菌群可能正常，不变色为阳性，指示阴道菌群可能失调；
白细胞酯酶反应孔：不变色为阴性；蓝绿色、蓝色或红色为阳性，指示阴道内有不同程度的炎症反应。
唾液酸苷酶反应孔：不变色为阴性；蓝绿色、蓝色或红色为阳性，指示可能感染细菌性阴道病；
pH值反应孔：pH值反应孔显黄色或黄绿色表示样品pH≤4.5，pH值反应孔显蓝绿色、蓝色表明样品pH＞4.5；
临床对比实验
采用本发明检测细菌性阴道病的试剂盒采用三甲医院100例有效样本进行检测，金标准法(镜检)确认细菌性阴道病阳性病例为41例，本发明检测细菌性阴道病的试剂盒确认细菌性阴道病阳性病例42例，符合率达85％；金标准法确认细菌性阴道病阴性病例为59例，本发明检测细菌性阴道病的试剂盒确认细菌性阴道病阴性病例58例，符合率达88％；本发明检测细菌性阴道病的试剂盒与医院金标准法的结果对比如下
可见，采用本发明检测细菌性阴道病的试剂盒与临床镜检效果高度一致。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，包括检测装置、显色液和样本稀释液，所述检测装置中包括pH值反应垫、过氧化氢反应垫、白细胞酯酶反应垫和唾液酸苷酶反应垫；
其中，所述过氧化氢反应垫为载体经过氧化氢反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括以下组分：
所述样本稀释液以质量百分比计，包括以下组分：
所述等渗调节剂为氯化钠或葡萄糖，当所述等渗调节剂为氯化钠时，质量百分比为0.5％～1.1％，当所述等渗调节剂为葡萄糖时，质量百分比为3％～6％。
2.根据权利要求1所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述pH值反应垫为载体经pH值反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述pH值反应液包括溶液A和氢氧化钠溶液，所述溶液A以质量百分比计，包括以下组分：
用氢氧化钠溶液调节所述溶液A颜色为绿色至蓝色；
所述唾液酸苷酶反应垫为载体经唾液酸苷酶反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
唾液酸苷酶底物 0.01％～5％，
海藻糖 0.01％～10％，
硫酸钠 0.01％～2％，
生物缓冲液 余量；
所述唾液酸苷酶底物为5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸、5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐和4-甲基伞形酮-α-N-乙酰基神经氨酸苷钠盐中的一种或一种以上；
所述白细胞酯酶反应垫为载体经白细胞酯酶反应液浸泡后干燥所得的反应垫，所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
白细胞酯酶底物 0.001％～2％，
咪唑 0％～5％，
无水乙醇 余量；
所述白细胞酯酶底物为5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯、5-溴-4-氯-3-吲哚辛酯、5-溴-6-氯-3-吲哚乙酯、5-溴-6-氯-3-吲哚辛酯、吲哚酯、吡咯酯和2-甲氧基-4-吗啉基重氮苯氯化锌盐中的一种或一种以上；
所述显色液以质量百分比计，包括以下组分：
重氮盐 0.01％～5％，
表面活性剂 0.001％～1％，
离子保护剂 0.01％～10％，
pH值为3.0～10.0的盐酸溶液、醋酸溶液、生物缓冲液中的一种余量，
所述重氮盐为固紫B盐、固红B盐、固蓝B盐和1-重氮基-2-萘酚-4-磺酸中一种或一种以上；所述表面活性剂为曲拉通100、吐温-20和吐温-80中的一种或一种以上；所述离子保护剂为氯化镁。
3.根据权利要求2所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述pH值反应液中的溶液A包括以下组分：
所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括以下组分：
所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
唾液酸苷酶底物 0.01％～2％，
海藻糖 0.1％～5％，
硫酸钠 0.01％～1％，
生物缓冲液 余量；
所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括以下组分：
白细胞酯酶底物 0.01％～1％，
咪唑 0％～2％，
无水乙醇 余量；
所述显色液以质量百分比计，包括以下组分：
重氮盐 0.02％～2％，
表面活性剂 0.01％～0.1％，
离子保护剂 0.1％～5％，
pH值为3.0～10.0的盐酸溶液、醋酸溶液、生物缓冲液中的一种余量；
所述样本稀释液以质量百分比计，包括以下组分：
所述等渗调节剂为氯化钠或葡萄糖，当所述等渗调节剂为氯化钠时，质量百分比为0.8％～1.0％，当所述等渗调节剂为葡萄糖时，质量百分比为4.5％～5.5％；
所述防腐剂为叠氮钠、多聚赖氨酸、ProClin300中的一种或一种以上。
4.根据权利要求3所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述过氧化氢反应液以质量百分比计，包括5％～10％的3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，0.04％～0.1％的4-氨基安替比林，0.01％～1％的辣根过氧化物酶，0.07％～0.08％的抗氧化剂，余量为生物缓冲液。
5.根据权利要求3所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液以质量百分比计，包括以下组分：
6.根据权利要求3所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述pH值反应液中的溶液A包括以下组分：
溴甲酚绿 0.1％～0.2％，
茜素红S 0.005％～0.01％，
无水乙醇 余量。
7.根据权利要求3所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述唾液酸苷酶反应液以质量百分比计，包括0.1％～1％5-溴-4-氯-3-吲哚神经氨酸钠盐，2％～5％海藻糖，0.5％～1％硫酸钠，余量为生物缓冲液。
8.根据权利要求3所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述白细胞酯酶反应液以质量百分比计，包括0.09％～1％5-溴-4-氯-3-吲哚乙酯，0.5％～1％咪唑，余量为无水乙醇。
9.根据权利要求3所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述显色液以质量百分比计，包括0.02％～1％固紫B盐，0.08％～0.1％曲拉通100，0.4％～5％氯化镁，余量为pH值为3.0～10.0的生物缓冲液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的检测细菌性阴道病的试剂盒，其特征在于，所述生物缓冲液为磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和TRIS缓冲液中的一种或一种以上，所述生物缓冲液的浓度为0.01mol/L～2mol/L；所述抗氧化剂为维生素C、多酚和生育酚中的一种或一种以上。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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CB02 Change of applicant information
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Address after: 510530 No. 79 Ruihe Road, Luogang District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: Reboo (Guangzhou) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 510530 No. 79 Ruihe Road, Luogang District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant before: RAYBIOTECH, Inc.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
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Application publication date: 20180105