JP2015137891A

JP2015137891A - 試料の調製方法及びビタミン類の免疫測定方法

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Publication number: JP2015137891A
Application number: JP2014008763A
Authority: JP
Inventors: 秀樹堀田; Hideki Hotta
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2014-01-21
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2015-07-30
Anticipated expiration: 2034-01-21
Also published as: JP6331413B2

Abstract

【課題】アルカリ処理された血液試料中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法を提供する。
【解決手段】アルカリ処理された血液試料に界面活性剤（好ましくはノニデッドＰ−４０等の非イオン性界面活性剤）を混合することで、ビタミン類（好ましくは２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２等のビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸）測定用血液試料混合物を調製し、その測定用血液試料混合物を、分離や抽出を行わずにそのまま免疫学的測定法によってビタミン類を測定する。
【選択図】なし

Description

本発明は、血液中のビタミン類を免疫学的に測定する方法において、アルカリ処理された血液試料中に界面活性剤を混合することによって血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法に関するものである。

免疫測定法によって測定されるビタミン類にはビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２及び葉酸などの小分子がある。血液中のそれらの小分子は、その大部分が特異的又は非特異的に蛋白質、脂質などと結合している。そのためそれらの小分子を測定するためには、小分子を前記蛋白質等から遊離する必要がある（以下、前処理と記載することがある）。なお、ビタミン類にはそれぞれ特異的な結合蛋白質が存在し、血液中での安定性に貢献している。例えばビタミンＤバインディングプロテイン（ＤＢＰ）、ハプトコリンや内因子などが良く知られている。

従来知られているビタミン類の結合蛋白質の遊離方法として、アルカリ処理が報告されており、特にアルカリ剤として水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合が多い。特許文献１ではβ−ランダムメチル化シクロデキストリン、サリチル酸ナトリウムを含む水酸化ナトリウム水溶液、特許文献２ではＥＤＴＡ、ＤＴＴ、炭酸エチレンを含む水酸化ナトリウム水溶液が報告されている。

しかしながらアルカリ処理は血液中の蛋白質を変性させ、不溶物を発生させる。そのため中和後、免疫反応にその処理した試料を用いる場合、測定精度が悪化するといった問題を有している。

特許第４１３０９５８号公報国際公開第２０１１／１４４６６１号パンフレット

臨床検査の分野において血液中のビタミン類の測定は、アルカリ処理、免疫反応の順に実施されることが多く、アルカリ処理を含め、迅速かつ全自動とすることが求められている。アルカリ処理は血液中の蛋白質を変性させ、不溶物を発生させる。そのため中和後、免疫反応にその処理した試料を用いる場合、測定精度が悪化するといった問題を有している。変性した蛋白質を除去するために一般的な方法として分離や抽出が用いられるが、迅速な測定を実現しつつ、それらを自動化することは困難である。

そこで本発明の目的は、アルカリ処理された血液試料中に界面活性剤を混合することによって測定用試料を調製し、血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ビタミン類を免疫学的に測定する方法において、アルカリ処理された血液試料中に界面活性剤を混合することによって測定用試料を調製することにより、血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は以下のとおりである。
（１）アルカリ処理された血液試料に界面活性剤を混合することを特徴とする、ビタミン類測定用血液試料混合物の調製方法。
（２）界面活性剤が非イオン性界面活性剤である（１）に記載の調製方法。
（３）ビタミン類がビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸である、（１）又は（２）に記載の調製方法。
（４）（１）〜（３）いずれかに記載の方法で得られた血液試料混合物中のビタミン類を、免疫学的方法によって測定することを特徴とする、ビタミン類の免疫測定方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において、ビタミン類とはビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸のことをいう。ビタミンＤ代謝産物としてはビタミンＤ_３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ_２（エルゴカルシフェロール）、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_２を例示することができる。中でも、臨床検査の測定項目として注目されている、２５−ヒドロキシビタミンＤ_３、２５−ヒドロキシビタミンＤ_２、ビタミンＢ_１２及び葉酸に対して、本発明を適用すると好ましい。

血液試料のアルカリ処理に用いられるアルカリ剤としては特に限定されるものではないが、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、アンモニア等を使用することができ、中でも、水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリ処理中のアルカリ剤の濃度は、０．０１〜１０Ｍが好ましい。その時の温度、時間には特に限定はないが、３４〜４０℃で、５〜１５分間処理することが好ましい。

また、アルカリ剤と混合して使用する前処理剤として、他の種々の薬剤（水溶性溶媒、還元剤、乖離剤等）を用いても差し支えない。

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。好ましくは非イオン性界面活性剤が用いられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ノニデッドＰ−４０、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等、アニオン性界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ＳＤＳ等、カチオン性界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド等、両性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ等が用いられる。

本発明においては、非イオン性界面活性剤が好ましく用いられ、特に好ましくはノニデッドＰ−４０が用いられる。

アルカリ処理された血液試料に混合する界面活性剤の濃度としては、０．００１〜１％重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜０．１重量％であり、とりわけ０．００１〜０．０５重量％が好ましいが、測定対象物や使用する界面活性剤によって至適濃度を決定するのが好ましい。このときの温度、時間には特に限定はないが、２０〜４０℃で、１〜３０秒間処理することが好ましい。

このようにして調製された血液試料混合物は、分離や抽出を行わなくてもそのまま免疫学的測定法によってビタミン類を測定することができる。

ビタミン類の測定に適用される免疫測定方法は、その原理や検出のためのラベルの種類を問わないものである。即ち、原理としてはサンドイッチ法、競合法、凝集法等を使用することができ、ラベルとしては放射性同位元素、酵素、化学発光、又は生物化学発光等を使用することができる。中でも、酵素、蛍光物質又は化学発光基質をラベルとして用いた、競合法が好ましい。

本発明によれば、アルカリ処理された血液試料に界面活性剤を混合させるという簡便な操作で、ビタミン類測定用の試料混合物を調製することができ、その測定用試料混合物は、分離や抽出を行わなくてもそのまま免疫学的測定法によってビタミン類の濃度を精度良く測定することが可能となる。例えば、臨床検査において有効な手段であるＥＩＡ、ＲＩＡで測定されているビタミン類は、その大部分が特異的、非特異的に蛋白質や脂質などと結合しているため、アルカリ処理をする例が多数を占める。その場合、精度良くビタミン類の濃度を測定することは容易ではないため、本発明によって高精度な測定、自動化への発展に対する多くの要望を簡便に解決するものであり、その応用範囲は広い。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。

実施例１
免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−２０００、東ソー社製）と免疫測定用試薬として当該装置用２５−ヒドロキシビタミンＤ免疫反応試薬を用い、自動前処理１ステップ競合法により２５−ヒドロキシビタミンＤの測定を行った。なお、その他の測定に必要な試薬は後述したようにして調製した。

血液試料のアルカリ処理に用いるアルカリ剤は０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を調製した。

中和液として使用する界面活性剤を含む溶液は、防腐剤を含む０．２Ｍリン酸緩衝溶液に、ノニデッドＰ−４０をそれぞれ０重量％（試薬Ａ）、０．００１重量％（試薬Ｂ）、０．００５重量％（試薬Ｃ）、０．０１重量％（試薬Ｄ）、０．０２重量％（試薬Ｅ）、０．０５重量％（試薬Ｆ）、０．１重量％（試薬Ｇ）になるように添加して７種類を調製した。

測定用の血液試料として血清に２５−ヒドロキシビタミンＤ_３を８０、１６０ｎｇ／ｍＬ添加して２種類の血清サンプルを調製した。

次に、上記のように調製したアルカリ剤と中和液として試薬Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇを用い、前記自動免疫測定装置と当該装置用２５−ヒドロキシビタミンＤ免疫反応試薬で血清サンプル２種類を測定し、アルカリフォスファターゼの蛍光基質である４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度の増加速度［ｎＭ／ｓ］をそれぞれ測定した。なお、各試薬（中和液）で各血清サンプルを３回ずつ測定した。このとき血清サンプルはアルカリ剤を混合してアルカリ処理し、次いで界面活性剤を含む中和液を混合した後、分離・抽出することなく免疫測定を行った。

結果を表１，２に示す。なお表１，２に示す測定精度の指標となるＣＶ（ＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＶａｒｉａｔｉｏｎ）は、以下の式に基づき算出している。

ＣＶ［％］＝［（３回測定した蛍光強度増加速度の標準偏差）÷（３回測定した蛍光強度増加速度の平均値）］×１００

ノニデッドＰ−４０が未添加（０重量％：試薬Ａ）の場合は２サンプルのＣＶがそれぞれ９．８％、６．９％であったが、ノニデッドＰ−４０を添加した場合（試薬Ｂ〜Ｇ）は、ＣＶは１．０〜３．８％であり、明らかにＣＶが低くなる傾向が見られた。これはノニデッドＰ−４０を添加したことで測定精度が向上したことを示している。但し、ノニデッドＰ−４０を０．１重量％添加すると蛍光強度増加速度が低下し、ＣＶもわずかながら高くなったため、０．００１〜０．０５重量％が最も好ましいと考えられる。このことからノニデッドＰ−４０の濃度を上げすぎると免疫測定に影響を与えると推測される。つまり、ノニデッドＰ−４０を添加する場合、免疫測定に影響を与えるような高濃度は好ましくないが、適当な濃度を添加することで血液試料中に含まれるビタミン類を精度よく測定することができることが確認された。

Claims

アルカリ処理された血液試料に界面活性剤を混合することを特徴とする、ビタミン類測定用血液試料混合物の調製方法。
界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項１に記載の調製方法。
ビタミン類がビタミンＤ代謝産物、ビタミンＢ_１２又は葉酸である、請求項１又は２に記載の調製方法。
請求項１〜３いずれかに記載の方法で得られた血液試料混合物中のビタミン類を、免疫学的方法によって測定することを特徴とする、ビタミン類の免疫測定方法。