CN111051883B - 在包合于环糊精的类固醇的脱包合中使用的处理液 - Google Patents
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Abstract
本发明人等发现,在对类固醇进行免疫学定量的方法中,通过利用表面活性剂对包含包合于环糊精的类固醇的标准溶液进行处理,可以使类固醇从环糊精脱包合,由此可抑制样本(被检试样)与标准溶液中的抗原抗体反应行为的背离,进而类固醇的定量度显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及以表面活性剂为有效成分的、用于使包合于环糊精的类固醇脱包合的处理液。另外,本发明涉及该处理液在类固醇的免疫学定量中的应用。
背景技术
在对样本(被检试样)所包含的目标物(抗原)进行免疫学定量时,通常分别测定样本的抗原抗体反应的信号强度和包含规定浓度的目标物的标准溶液的抗原抗体反应的信号强度,并对它们的测定值进行比较。为了以高精度进行该定量,需要尽量使样本和标准溶液中的抗原抗体反应的行为保持一致。
例如,在对类固醇进行免疫学定量的情况下,通常使用人血清作为样本(被检试样),但为了避免样本和标准溶液中的抗原抗体反应的行为发生背离,标准溶液的制备也大多使用血清。但是,在使用以血清为基质的标准溶液的情况下,无法排除来自原料的批次间差异、感染风险。
因此,在标准溶液的制备中,也利用包含牛血清白蛋白等蛋白质的缓冲液来代替血清,在这种情况下,标准溶液所包含的类固醇显示出随着时间而分解的趋势,在测定时其信号强度下降成为问题。另外,疏水性的类固醇容易吸附于标准溶液的构成成分、容器,这也会引起测定时的信号强度下降。
因此,为了抑制这样的信号强度下降,提出了在标准溶液中添加环糊精,从而使类固醇包合于环糊精的疏水性内部而使其稳定化的方案(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第1997/005491号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
但是,本发明人等使用包含包合于环糊精的类固醇的标准溶液尝试对样本(被检试样)中所包含的类固醇进行免疫学定量,结果明确了:样本和标准溶液中的抗原抗体反应的行为明显不同,进而准确的类固醇的定量变得困难(参照实施例1-1)。
本发明是鉴于这样的现有技术具有的问题而完成的发明,其目的在于,在使用包含包合于环糊精的类固醇的标准溶液,对类固醇进行免疫学定量的方法中,提高类固醇的定量精度。
用于解决问题的技术方案
本发明人等为了解决上述课题反复进行了深入研究,结果发现,通过将利用表面活性剂对包含包合于环糊精的类固醇的标准溶液进行处理,从而可以使类固醇从环糊精脱包合。
在具有碳原子数8的酰基或烷基的表面活性剂、和具有类固醇骨架的表面活性剂的情况下,该脱包合效果特别优异,对包合于环糊精的醛固酮、孕酮、25-羟基维生素D和雌二醇中的任一者均可确认到该脱包合效果。另外,这些表面活性剂不仅在使用缓冲液基质的标准溶液的情况下显示优异的效果,而且在使用血清基质的标准溶液的情况下也显示出优异的效果。
此外,本发明人等发现,在非竞争法和竞争法中的任意的类固醇免疫学测定体系中,通过表面活性剂的作用,样本(被检试样)和标准溶液中的抗原抗体反应行为的背离都得到抑制,进而定量精度显著提高,从而完成了本发明。
即,本发明涉及表面活性剂在用于使包合于环糊精的类固醇的脱包合中的应用,特别涉及在类固醇的免疫学定量中的应用,更详细而言提高以下发明。
[1]一种用于使包合于环糊精的类固醇脱包合的处理液,其以表面活性剂为有效成分。
[2]根据[1]记载的处理液,其中,上述表面活性剂具有碳原子数8的酰基或烷基,或者,上述表面活性剂具有具有类固醇骨架。
[3]根据[2]记载的处理液,其中,上述表面活性剂为选自下述(a)~(e)中的至少1种。
(a)具有辛酰基和葡糖胺基的表面活性剂
(b)具有辛基及聚氧乙烯基的表面活性剂
(c)具有辛基、磺酸盐基和铵基的表面活性剂
(d)具有类固醇骨架、磺酸盐基和铵基的表面活性剂
(e)具有类固醇骨架和羧酸盐基的表面活性剂
[4]根据[3]记载的处理液,其中,上述表面活性剂为选自N-辛酰基-N-甲基葡糖胺、聚(氧乙烯)辛基苯基醚、N-辛基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐(N-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propanesulfonate)和脱氧胆酸钠中的至少1种。
[5]根据[1]~[4]中任一项记载的处理液,其中,上述环糊精为选自β环糊精、羟丙基β环糊精和γ环糊精中的至少1种。
[6]根据[1]~[5]中任一项记载的处理液,其中,上述类固醇为选自醛固酮、孕酮、25-羟基维生素D和雌二醇中的至少1种。
[7]根据[1]~[6]中任一项记载的处理液,其用于在包含类固醇和环糊精的类固醇免疫学定量用标准溶液中,使包合于上述环糊精的上述类固醇脱包合。
[8]一种对类固醇进行免疫学定量的方法,其包含下述步骤:
使抗类固醇抗体分别与被检试样和包含类固醇和环糊精的标准溶液反应,分别测定上述被检试样和上述标准溶液中的抗原抗体反应的信号强度,比较上述被检试样的信号强度和上述标准溶液的信号强度,其中,
在上述标准溶液的抗原抗体反应的反应体系中,添加[7]所述的处理液。
[9]一种用于对类固醇进行免疫学定量的试剂盒,其至少包含下述(a)~(c),
(a)抗类固醇抗体
(b)包含类固醇和环糊精的标准溶液
(c)[7]记载的处理液。
发明的效果
根据本发明,通过使表面活性剂共存于类固醇的免疫学测定体系的抗原抗体反应中,从而能够抑制样本(被检试样)与标准溶液的行为的背离。由此,不仅在使用血清基质的标准溶液的情况下,而且在使用缓冲液基质的标准溶液(例如,无血清且无蛋白质的标准溶液)的情况下,也能够以高精度对类固醇进行定量。
附图说明
图1是表示对于环糊精对醛固酮的包合效果进行检验的结果的图表。作为环糊精,使用α环糊精(αCD)、β环糊精(βCD)、羟丙基β环糊精(HPβCD)和γ环糊精(γCD)。
图2是表示对于HPβCD对醛固酮的稳定化效果的进行检验的结果的图表。
图3是表示各种表面活性剂的使包合于HPβCD的醛固酮脱包合的效果的图表。使用缓冲液基质的标准溶液并利用非竞争法(两步法)进行测定。
图4是表示各种表面活性剂的使包合于HPβCD的醛固酮脱包合的效果的图表。使用血清基质的标准溶液并利用非竞争法(两步法)进行测定。
图5是表示各种表面活性剂的使包合于HPβCD的孕酮脱包合的效果的图表。使用缓冲液基质的标准溶液并利用竞争法(一步法)进行测定。
图6是表示各种表面活性剂的使包合于γCD的25-羟基维生素D脱包合的效果的图表。使用缓冲液基质的标准溶液并利用非竞争法(两步法)进行测定。
图7A是示出各种表面活性剂的使包合于HPβCD的雌二醇脱包合的效果的图表。使用缓冲液基质的标准溶液并利用竞争法(一步法)进行测定。
图7B是表示各种表面活性剂的使包合于HPβCD的雌二醇脱包合的效果的图表。使用缓冲液基质的标准溶液并利用竞争法(一步法)进行测定。
具体实施方式
本发明提供以表面活性剂为有效成分的、用于使包合于环糊精的类固醇的脱包合的处理液。
本发明中“包合”是指环糊精将分子摄入其环状结构中,“脱包合”是指包合于环糊精的分子从环糊精脱离。
本发明中的“环糊精”是多个葡萄糖键合而得到环状结构的环状寡糖。作为本发明中应用的环糊精,只要具有类固醇包合作用就没有特别限制,例如可举出α环糊精、β环糊精、羟丙基β环糊精和γ环糊精,其中优选为β环糊精、羟丙基β环糊精和γ环糊精,其中特别优选为羟丙基β环糊精。
本发明中的“类固醇”是具有类固醇骨架(环戊烷多氢菲骨架)的化合物的总称。作为类固醇,可举出类固醇激素和保持有类固醇骨架的其衍生物(例如,蛋白同化类固醇、抗雄性激素剂和抗卵胞激素剂等合成类固醇)。作为类固醇激素,例如可举出雄性激素、卵胞激素、黄体激素(例如,孕酮)、皮质类固醇(例如糖皮质激素、盐皮质激素)。作为本发明中应用的类固醇,只要包合于环糊精就没有特别限制,例如优选为醛固酮、孕酮、25-羟基维生素D和雌二醇。
醛固酮是肾上腺皮质的球状带所分泌的类固醇激素之一(盐皮质激素),主要促进肾脏的肾小管中的钠离子重吸收和与此相伴的水分吸收,以及与钠离子交换性的钾离子和氢离子的排出。
孕酮是卵巢的黄体合成的类固醇激素之一(黄体激素),具有改变子宫内膜分泌期、维持妊娠、升高体温、抑制排卵、促进乳腺发育等作用。
25-羟基维生素D是在肝脏中将维生素D羟基化而产生的激素前体物质,参与骨、矿物质代谢的维持。
雌二醇是卵巢的颗粒细胞、卵泡外膜细胞、胎盘、肾上腺皮质、睾丸间质细胞产生的类固醇激素之一(卵胞激素),具有促进乳腺细胞增殖、控制卵巢排卵、控制脂质代谢、胰岛素作用、凝血作用、使中枢神经(意识)女性化、使皮肤变薄、减少LDL和增加VLDL·HDL而抑制动脉硬化等作用。
在本发明的处理液中,为了使被包合的类固醇从环糊精脱包合而使用表面活性剂。本发明中的“表面活性剂”是在水溶液中降低表面张力的化合物,在分子内具有亲水性部分和疏水性部分。作为本发明中应用的表面活性剂,只要具有这样的脱包合作用就没有特别限制,优选为选自具有碳原子数8的酰基或烷基的表面活性剂和具有类固醇骨架的表面活性剂中的至少1种,更优选为选自上述物质中的任一种。
作为上述具有碳原子数8的酰基的表面活性剂,优选为具有疏水性的辛酰基(C8(碳原子数8,以下相同))和亲水性的葡糖胺基的表面活性剂,例如可举出N-辛酰基-N-甲基葡糖胺(非离子性,MEGA8((株)同仁化学研究所制)等),但不限定于此。作为具有碳原子数8的烷基的表面活性剂,优选为具有疏水性的辛基(C8)和亲水性的聚(氧乙烯)基的表面活性剂,例如可举出聚(氧乙烯)辛基苯基醚(非离子性,曲拉通X(TritonX705、TritonX100等(Nacalai Tesque株式会社制))等),但不限定于这些。作为具有碳原子数8的烷基的其它表面活性剂,优选为具有疏水性的辛基(C8)和包含磺酸盐基和铵基的亲水性部分的表面活性剂,例如可举出N-辛基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐(两性,C8APS(东京化成工业株式会社制)等),但不限定于此。另外,作为具有类固醇骨架的表面活性剂,优选为具有疏水性的类固醇骨架以及包含磺酸盐基和铵基的亲水性部分的表面活性剂、具有疏水性的类固醇骨架以及包含羧酸盐基的亲水性部分的表面活性剂,例如可举出3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(两性,CHAPS((株)同仁化学研究所制)等)、脱氧胆酸钠(阴离子性),但不限定于这些。
这些表面活性剂中,具有疏水性的辛酰基(C8)和亲水性的葡糖胺基的N-辛酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA8等)以及3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS等)由于不论类固醇的种类、免疫学测定方法的种类如何均显示优异的脱包合效果,故特别优选,特别优选为N-辛酰基-N-甲基葡糖胺。
本发明的处理液所包含的表面活性剂的浓度,只要添加到包含包合于环糊精的类固醇的反应体系时可以带来使该类固醇脱包合的作用就没有特别限制。可以按照将该处理液添加到反应体系后的浓度通常为0.005~5%,优选为0.01~2%的方式,适当调整该处理液中的表面活性剂的浓度。例如,如果希望添加到反应体系时稀释n倍,则可以预先制备成包含n倍浓度的表面活性剂的处理液。
本发明的处理液,例如,可以将缓冲液作为基质来制备。作为上述缓冲液,没有特别限制,例如可举出GOOD缓冲液(HEPES、MOPS等)、Tris缓冲液(Tris盐酸缓冲液、TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、Tris缓冲生理盐水等)、磷酸缓冲液(磷酸缓冲生理盐水等)。缓冲液的pH值通常为5.0~9.0,优选为6.0~8.0。
本发明的处理液另外也可以将血清作为基质来制备。作为上述血清,没有特别限制,例如可举出来自动物的血清(来自人、牛、马、绵羊、山羊、猪、美洲驼、狗、鸡、驴、猫、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等动物的血清)、脱脂血清(DDC Mass Spect Gold(株式会社Veritas制)等)。
在本发明的处理液中,根据需要例如可以包含氯化钠等盐浓度调整用分子、叠氮化钠等保存剂(防腐剂)。另外,例如可以包含牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质成分、封闭剂、蛋白质稳定剂、敏化剂、糖类、亲水性聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯醇)等。
本发明的处理液可以用于:由对类固醇进行免疫学定量的方法用标准溶液中存在的包合于环糊精的类固醇,使该类固醇脱包合。对类固醇进行免疫学定量的方法通常包含以下工序,使抗类固醇抗体分别与被检试样和标准溶液反应,分别测定该被检试样和该标准溶液的抗原抗体反应的信号强度,比较该被检试样的信号强度和该标准溶液的信号强度(工序)。
在此,在上述标准溶液中的类固醇包合于环糊精的状态下添加抗体而进行抗原抗体反应的情况下,与对包含游离类固醇的被检试样进行抗原抗体反应的情况相比,反应体系中的游离类固醇浓度不同,因此与上述抗体结合的抗原的分子数产生背离,而在本发明的对类固醇进行免疫学定量的方法中,在上述反应体系中添加本发明的处理液而使类固醇从环糊精脱包合,从而可以抑制这种与抗体结合的抗原的分子数产生背离的情况。
作为用于本发明的对类固醇进行免疫学定量的方法的“被检试样”,只要是能够存在类固醇的试样就没有特别限制。出于测定成为类固醇异常有关的疾病的诊断的基础的类固醇浓度的目的,通常使用血液样本。血液样本优选为血清或血浆。另外,作为上述被检试样,可以利用缓冲液或血清进行稀释,出于使类固醇稳定化的主要目的可以添加上述环糊精,也可以如后述那样添加本发明的处理液。应予说明,作为上述缓冲液和上述血清,可举出与作为上述处理液的基质而举出的物质相同的物质。
作为用于本发明的对类固醇进行免疫学定量的方法的“标准溶液”,只要是包含规定浓度的类固醇和上述环糊精的标准溶液就没有特别限制,可以是缓冲液基质的标准溶液,也可以是血清基质的标准溶液。作为成为这些基质的缓冲液和血清,可举出与作为上述处理液的基质而举出的物质相同的物质。缓冲液基质的标准溶液可以包含或不包含牛血清白蛋白等蛋白质成分。
在本发明的对类固醇进行免疫学定量的方法中,作为免疫学测定类固醇的方法,例如可举出使用酶作为标记(标记物)的CLEIA法(化学发光酶免疫测定法)、EIA法(酶免疫测定法);使用放射性同位素作为标记的RIA法(放射免疫测定法);使用化学发光性化合物作为标记的CLIA法(化学发光免疫测定法);胶乳凝集法;免疫色谱等免疫学方法,但不限定于这些。这些免疫学测定可以是非竞争性测定方法,也可以是竞争性测定方法。
上述免疫学方法中使用的的抗体例如可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等中的任一个同种型。另外,这样的抗体此外可以是多克隆抗体或单克隆抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体)、它们的抗体片段。抗体片段例如可举出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、单链抗体、双价抗体(diabody)等,但不限定于这些。抗体优选为单克隆抗体。单克隆抗体可以使用通过杂交瘤法、重组DNA法等公知方法制作的单克隆抗体。
作为用于上述对类固醇进行免疫学测定的方法的抗类固醇抗体,可使用结合有标记物的抗体。作为上述标记物,只要是与抗体结合且可检测的标记物就没有特别限制,例如可举出碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)、β半乳糖苷酶(β-gal)等酶;异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸罗丹明(RITC)等荧光色素;125I等放射性同位素;别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(R-PE)等荧光蛋白;亲和素;生物素;胶乳;金粒子等。
在使用酶作为上述标记物的情况下,通过添加显色底物、荧光底物、或化学发光底物等作为底物可以进行与上述底物相应的各种检测。
作为上述对类固醇进行免疫学测定的方法,除了使用上述结合有标记物的抗类固醇抗体直接检测类固醇的方法以外,还可以利用在上述抗类固醇抗体上没有结合上述标记物,利用结合有上述标记物的二次抗体等间接进行检测的方法。在此“二次抗体”是指对抗类固醇抗体显示反应性的抗体。例如,在将上述抗类固醇抗体制备成小鼠抗体的情况下,作为该二次抗体,可以使用抗小鼠IgG抗体。作为上述二次抗体,对于来自兔、山羊、小鼠等各种生物种属的抗体而言,市售有能够分别能够用于这些抗体的标记二次抗体,可以根据上述抗类固醇抗体的来源种属选择使用合适的二次抗体。另外,还可以使用结合有上述标记物的蛋白G、蛋白A等代替上述二次抗体。
可以适宜采用以往公知的方法使上述抗类固醇抗体与上述标记物、或上述二次抗体与上述标记物结合,另外还可以将生物素-亲和素系统用于上述结合。在该方法中,例如,将抗类固醇抗体生物素化,使亲和素化的标记物作用于该抗类固醇抗体,利用生物素与亲和素的相互作用使标记物结合于抗类固醇抗体。
作为上述免疫学方法的检测原理,优选为夹心法和竞争法。在上述夹心法中,利用固定于固相(固相化的)捕捉用抗体(例如抗类固醇抗体)捕捉检测对象物(例如抗原(类固醇)),使其识别结合有标记物的检测用抗体(例如结合有标记物的二次抗体等),进行与上述标记物的种类相应的检测。作为上述固相,例如可以使用磁性粒子、胶乳粒子等微粒、塑料板等平板、或硝基纤维素等纤维状物质。
上述捕捉用抗体可以直接固定于上述固相,也可以间接固定于上述固相。例如,可以将结合于上述捕捉用抗体的物质固定于上述固相,使上述捕捉用抗体与该物质结合,从而将上述捕捉用抗体间接固定于上述固相。作为上述结合于捕捉用抗体的物质,例如可举出上述二次抗体、蛋白G、蛋白A等,但不限定于这些。可以适当采用以往公知的方法来进行与上述固相的固定,另外在上述捕捉用抗体被生物素化的情况下,可以利用亲和素化的固相。
在上述夹心法中,在使用包含类固醇(检测对象物)和环糊精的标准溶液的情况下,例如优选以下方式,将上述标准溶液、本发明的处理液和固相化的上述捕捉用抗体混合而进行第一抗原抗体反应(第一反应),形成上述类固醇与上述捕捉用抗体的复合物(免疫复合物),对该免疫复合物进行分离清洗后,在其中添加结合有上述标记物的检测用抗体而进行第二抗原抗体反应(第二反应),进行与上述标记物相应的各种检测。
作为上述检测用抗体,不仅可以使用仅与类固醇结合的抗体,还可以使用与类固醇和抗体的复合物特异性结合的抗体。因此,本发明中的“抗类固醇抗体”包括这两种抗体。
作为上述夹心法,例如优选为CLIA法的一种方式即夹心CLIA法、CLEIA法的一种方式即夹心CLEIA法、RIA法的一种方式即IRMA法(免疫放射定量法)。
另一方面,作为上述竞争法,例如在第一方式中,使固相化的检测对象物和试样中的检测对象物与结合有标记物的检测用抗体竞争性地结合。在使用包含类固醇(检测对象物)和环糊精的标准溶液的情况下,例如将上述标准溶液、本发明的处理液和上述结合有标记物的检测用抗体混合而进行第一抗原抗体反应(第一反应),在其中添加固相化的上述检测对象物而进行第二次抗体原抗体反应(第二反应)。
另外,例如在上述竞争法的第二方式中,在与固相化的捕捉用抗体的结合方面,使试样中的检测对象物和结合有标记物的检测对象物竞争。在使用包含类固醇(检测对象物)和环糊精的标准溶液的情况下,例如,将上述标准溶液、本发明的处理液和上述结合有标记物的检测对象物混合,在其中添加固相化的上述捕捉用抗体,进行抗原抗体反应。
可以适宜采用以往公知的方法来进行上述竞争法中的与检测对象物、捕捉用抗体的固相的固定,上述固定与上述相同,可以是直接的固定,也可以是间接的固定。
在本发明的对类固醇进行免疫学定量方法中,本发明的处理液不仅可以对上述标准溶液添加,还可以对上述被检试样添加。由于本发明的处理液包含表面活性剂,因此通过对上述被检试样同样地添加而使其表面活性剂浓度与上述标准溶液一致,由此可以在更接近的条件下进行抗原抗体反应。另外,作为本发明的处理液,按照上述表面活性剂的浓度达到上述期望浓度的方式添加于检测对象物与其抗体的抗原抗体反应的反应体系即可,例如,也可以将上述处理液预先添加到其它用于反应体系的溶液(上述竞争法的第一方式中的结合有标记物的检测用抗体、上述竞争法的第二方式中的结合有标记物的检测对象物等)而使用,也可以向这些溶液中预先添加上述表面活性剂而兼做本发明的处理液。
通常,通过与包含各浓度的类固醇的标准溶液得到的测定值进行比较,从而进行基于上述被检试样中得到的测定值的类固醇浓度的定量。这种情况下,例如可以通过研究上述被检试样中得到的测定值在标准曲线上位于哪个位置来求出试样中的类固醇浓度,其中,上述标准曲线是基于利用标准溶液得到的测定值而制作的。
本发明的对类固醇进行免疫学定量的方法可以用于诊断(罹患、罹患风险的评价)与类固醇激素的分泌量异常有关的疾病。这里“与类固醇激素的分泌量异常有关的疾病”是指包括类固醇激素的分泌量异常引起的疾病以及作为疾病发病的结果类固醇激素的分泌量变得异常的疾病这两者。例如已知在原发性醛固酮增多症、肾血管性高血压、恶性高血压、肾素分泌瘤、巴特氏综合症、浮肿性疾病(肝硬化·心衰)等中,血液中的醛固酮浓度显示高值,在阿狄森综合征、21-羟化酶缺乏症、选择性低醛固酮过少症等中,该醛固酮浓度会显示低值。另外已知在先天性肾上腺增生、柯兴综合症、肾上腺肿瘤等中,血液中的孕酮浓度显示高值,在卵巢功能不全、黄体功能不全等中显示低值。此外已知在维生素D中毒症等中,血液中的25-羟基维生素D浓度显示高值,在佝偻病、骨软化病、骨质疏松等中显示低值。另外已知在肝病、雌激素分泌瘤、先天性肾上腺皮质增生、多胎妊娠、卵巢过度刺激综合症等中,血中雌二醇浓度会显示高值,在卵巢功能不全、卵巢早衰、促性腺激素缺乏症、希-弗二氏综合征(Chiari-Frommel Syndrome)等中显示低值。
另外,本发明提供一种用于对类固醇进行免疫学定量的试剂盒,其可以用于上述本发明的对类固醇进行免疫学定量的方法。本发明的试剂盒至少包含抗类固醇抗体(抗体标准品)、包含类固醇和环糊精的标准溶液(标准类固醇试剂)、以及本发明的处理液。此外,可以组合对照试剂、清洗液、稀释液、稀释用盒等。另外,在使用酶标记作为上述标记物的情况下,可以包含标记检测所需要的底物、反应终止液等。
在将上述夹心法作为检测原理的情况下,例如可以包含固相化的类固醇捕捉用抗体或固定有与类固醇捕捉用抗体结合的物质的固相。另一方面,在将上述竞争法作为检测原理的情况下,例如,除了上述固相以外,还可以包含固相化的检测对象物或固定有与检测对象物结合的物质的固相。
另外,在未标记一次抗体(与抗原直接结合的抗体)、二次抗体的情况下,例如,在试剂盒中可以包含经过标记的与这些抗体结合的物质。另外,在抗类固醇抗体被生物素化的情况下,例如在试剂盒中可以包含被亲和素化的标记物。本发明的试剂盒中还可以包含该试剂盒的使用说明书。
本发明的试剂盒不仅可用于研究用途,例如还可以作为体外诊断用药品,用于上述与类固醇激素的分泌量异常有关的疾病的诊断基础的类固醇浓度的定量。
实施例
以下基于实施例对本发明做更具体说明,但本发明不限定于以下实施例限定。应予说明,在以下实施例的各组成中,“%”表示“重量%”。
(实施例1)
[实施例1-1]环糊精对醛固酮的包合效果的检验
本实施例中,使用醛固酮作为抗原,使用缓冲液基质的标准溶液作为标准溶液。具体而言,首先在分别添加有0%、1%、3%浓度的环糊精(α环糊精(αCD)、β环糊精(βCD)、羟丙基β环糊精(HPβCD)、γ环糊精(γCD))的稀释液中添加醛固酮,从而制备约500pg/mL的醛固酮溶液(标准溶液)。上述稀释液的基质组成设为“50mM MOPS(pH7.2)、150mM NaCl、0.1%NaN3”。
对于各醛固酮溶液,通过使用抗醛固酮抗体结合粒子(利用以往方法制备的抗醛固酮抗体结合磁性粒子(抗体结合粒子))和碱性磷酸酶标记抗醛固酮免疫复合物抗体(利用以往方法制备的碱性磷酸酶标记抗醛固酮抗体(酶标记抗体))的两步法来实施测定。详细而言,按照以下(a)~(f)的工序来进行。
(a)在抗体结合粒子约50μL中添加试样(上述醛固酮溶液)约30μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第一反应)。
(b)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(c)添加酶标记抗体约50μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第二反应)。
(d)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(e)添加AMPPD(底物,3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)约200μL并进行搅拌,在37℃反应4分钟(酶反应)。
(f)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长463nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图1表示将使用环糊精浓度为0%的醛固酮溶液时的发光量(0%CD)设为100%时的、使用各环糊精浓度为1%或3%的醛固酮溶液时的发光量的比例(发光量比[相对于0%CD])。其结果,在添加αCD时发光量几乎不变,通过添加其它环糊精(βCD、HPβCD、γCD)发光量下降,因此可认为醛固酮被包合(图1)。由于同一浓度下的发光量下降率因环糊精的种类而不同,因此可认为包合作用按照αCD<βCD<HPβCD<γCD的顺序增强。
[实施例1-2]HPβCD对醛固酮的稳定化效果的检验
本实施例中,使用醛固酮作为抗原,使用缓冲液基质的标准溶液作为标准溶液,。具体而言,首先在添加有0.1%、1%浓度的HPβCD的稀释液中添加醛固酮,从而制备约300pg/mL醛固酮溶液(标准溶液)。上述稀释液的基质组成设为“100mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、0.5%BSA、0.1%NaN3”。
得到的各醛固酮溶液(约300pg/mL醛固酮溶液)在-80℃、4℃、25℃、37℃分别保存45天后供于测定。对于各保存后的醛固酮溶液,通过使用抗醛固酮抗体结合粒子(利用以往方法制备的抗醛固酮抗体结合磁性粒子(抗体结合粒子))和碱性磷酸酶标记抗醛固酮免疫复合物抗体(利用以往方法制备的碱性磷酸酶标记抗醛固酮抗体(酶标记抗体))的两步法实施测定。详细而言,按照以下(a)~(f)的工序来进行。
(a)在抗体结合粒子约250μL中添加试样(上述醛固酮溶液)约40μL并进行搅拌,在37℃反应10分钟(第一反应)。
(b)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(c)添加酶标记抗体约250μL并进行搅拌,在37℃反应10分钟(第二反应)。
(d)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(e)添加AMPPD(底物,3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)约200μL并进行搅拌,在37℃反应5分钟(酶反应)。
(f)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长447nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图2表示将使用在-80℃保存45天后的醛固酮溶液时的发光量设为100%时的、分别使用在4℃、25℃、37℃各保存45天后的醛固酮溶液时的发光量的比例(发光量比[相对于-80℃])。其结果,HPβCD浓度高的情形在施加温度负荷的状态下的测定值变动小,因此可认为HPβCD有助于标准溶液的稳定性(图2)。
[实施例1-3]使醛固酮从HPβCD脱包合的效果-1
本实施例中,使用醛固酮作为抗原,使用缓冲液基质的标准溶液作为标准溶液。具体而言,首先,在下述标准液稀释液(具有HPβCD)中添加醛固酮,制备约1600pg/mL醛固酮溶液(1600pg/mL CD(+)标准溶液),将下述的脱脂血清作为模拟被检试样稀释液,在其中添加醛固酮而制备约1600pg/mL醛固酮溶液(1600pg/mL样本(模拟被检试样))。作为上述标准液稀释液(具有HPβCD),使用“50mM MOPS(pH7.2)、150mM NaCl、1%HPβCD、0.1%NaN3”,作为上述脱脂血清,使用“DDC Mass Spect Gold(无类固醇系激素和胆固醇·TG的血清,株式会社Veritas制)”。
另外,制备在下述处理液的基质组成中分别添加或不添加12种表面活性剂[脱氧胆酸钠(富士胶片和光纯药工业株式会社制)、NLS(Nacalai Tesque株式会社制)、C12TAB(东京化成工业株式会社制)、C2APS(东京化成工业株式会社制)、C8APS(东京化成工业株式会社制)、C12APS(东京化成工业株式会社制)、CHAPS((株)同仁化学研究所制)、吐温20(富士胶片和光纯药工业株式会社制)、吐温80(富士胶片和光纯药工业株式会社制)、曲拉通X100(Nacalai Tesque株式会社制)、曲拉通X705(Sigma-Aldrich制)、MEGA8((株)同仁化学研究所制)]的处理液。上述处理液的基质组成设为“20mM MOPS(pH7.2)、300mM NaCl、0.1%NaN3”。各处理液中的表面活性剂的浓度,脱氧胆酸钠设为1.2%,此外分别设为2%。
对于各试样(1600pg/mL CD(+)标准溶液或1600pg/mL样本),通过使用抗醛固酮抗体结合粒子(利用以往方法制备的抗醛固酮抗体结合磁性粒子(抗体结合粒子))、碱性磷酸酶标记抗醛固酮免疫复合物抗体(利用以往方法制备的碱性磷酸酶标记抗醛固酮抗体(酶标记抗体))和上述各处理液的特殊两步法实施测定。详细而言,按照以下(a)~(f)的工序进行。
(a)在抗体结合粒子约50μL和处理液约20μL中添加试样约30μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第一反应)。
(b)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(c)添加酶标记抗体约50μL,并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第二反应)。
(d)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(e)添加AMPPD(底物,3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)约200μL并进行搅拌,在37℃反应4分钟(酶反应)。
(f)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长463nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图3表示将使用不添加表面活性剂的处理液(表面活性剂(-))作为上述处理液且使用1600pg/mL样本作为上述试样时的发光量(对照)设为100%时的、使用各处理液且使用1600pg/mL CD(+)标准溶液或1600pg/mL样本作为上述试样时的发光量的比例(发光量比[相对于对照])。其结果,可确认具有脱包合效果(1600pg/mL样本的反应性不变,且1600pg/mL CD(+)标准溶液的反应性提高的效果)的表面活性剂为具有类固醇骨架的脱氧胆酸钠和CHAPS、具有碳原子数8的烷基的曲拉通X100、曲拉通X705和C8APS、以及具有碳原子数8的酰基的MEGA8(图3中的星形符号)。
[实施例1-4]使醛固酮从HPβCD脱包合的效果-2
本实施例中,使用醛固酮作为抗原,使用血清基质的标准溶液作为标准溶液。具体而言,首先,在-HPβCD的脱脂血清(DDC Mass Spect Gold)中添加醛固酮而制备约2000pg/mL醛固酮溶液(2000pg/mL样本(模拟被检试样)),在+HPβCD的脱脂血清(在上述-HPβCD的脱脂血清中添加HPβCD以使其达到1%浓度)中添加醛固酮而制备约2000pg/mL醛固酮溶液(2000pg/mL CD(+)标准溶液)。
另外,制备在下述处理液的基质组成中分别添加或不添加实施例1-3中使用的其中5种表面活性剂(C12APS、CHAPS、吐温20、曲拉通X705、MEGA8)的处理液。上述处理液的基质组成设为“20mM MOPS(pH7.2)、300mM NaCl、0.1%NaN3”。各处理液中的表面活性剂的浓度分别设为3%。
对于各试样(2000pg/mL CD(+)标准溶液或2000pg/mL样本),通过使用抗醛固酮抗体结合粒子(利用以往方法制备的抗醛固酮抗体结合磁性粒子(抗体结合粒子))、碱性磷酸酶标记抗醛固酮免疫复合物抗体(利用以往方法制备的碱性磷酸酶标记抗醛固酮抗体(酶标记抗体))和上述各处理液的特殊两步法实施测定。详细而言,按照以下(a)~(f)的工序进行。
(a)在抗体结合粒子约50μL和处理液约30μL中添加试样约30μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第一反应)。
(b)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(c)添加酶标记抗体约50μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第二反应)。
(d)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(e)添加AMPPD(底物,3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)约200μL,并进行搅拌,在37℃反应4分钟(酶反应)。
(f)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长463nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图4表示将使用不添加表面活性剂的处理液(表面活性剂(-))作为上述处理液且使用2000pg/mL样本作为上述试样时的发光量(对照)设为100%时的、使用各处理液且使用2000pg/mL CD(+)标准溶液或2000pg/mL样本作为上述试样时的发光量的比例(发光量比[相对于对照])。其结果,可确认具有脱包合效果(2000pg/mL样本的反应性不变,2000pg/mLCD(+)标准溶液的反应性提高的效果)的表面活性剂为CHAPS、曲拉通X705、MEGA8(图4中的星形符号)。由此表明,即使是血清基质的标准溶液,也可以得到与实施例1-3所示的缓冲液基质标准溶液的结果相同的结果。
(实施例2)使孕酮从HPβCD脱包合的效果
与醛固酮的情形相同,确认通过特定种类的表面活性剂也可促进孕酮从HPβCD脱包合。
本实施例中,采用一步竞争法作为测定体系。在该竞争法中,与实施例1-1~1-4的两步法(非竞争法)相对照的是,如果通过表面活性剂的作用促进类固醇从HPβCD脱包合,则标记抗体不能结合于抗原结合粒子,从而使发光量进一步降低。
具体而言,使用孕酮作为抗原,使用缓冲液基质的标准溶液作为标准溶液,首先,制备在下述标准液稀释液(与实施例1-3的标准液稀释液组成相同)中添加孕酮20ng/mL而成的20ng/mL孕酮溶液(标准溶液)和不添加孕酮的对照溶液。作为标准液稀释液,使用“50mM MOPS(pH7.2)、150mM NaCl、1%HPβCD、0.1%NaN3”。
在不使用另外的处理液,使用表面活性剂的条件下,对下述酶标记抗体添加以下表面活性剂,使其分别达到0.2%浓度。作为上述表面活性剂,分别使用实施例1-3使用的表面活性剂中的吐温20、吐温80、C8APS、CHAPS、MEGA8、曲拉通X705和脱氧胆酸钠、以及Brij58(ICI制)和C16APS(东京化成工业株式会社制)。
对于各试样(各标准溶液(20ng/mL孕酮)和各对照溶液(0ng/mL孕酮),通过使用碱性磷酸酶标记抗孕酮抗体(利用以往方法制备的碱性磷酸酶标记抗孕酮抗体(酶标记抗体))和孕酮结合粒子(利用以往方法制备的孕酮结合磁性粒子(抗原结合粒子))的延迟一步法实施测定。详细而言,按照以下(a)~(e)的工序进行。
(a)在酶标记抗体约50μL中添加试样约10μL并进行搅拌,在37℃反应11分钟(第一反应)。
(b)添加抗原结合粒子约50μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第二反应)。
(c)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(d)添加AMPPD(底物,3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)约200μL并进行搅拌,在37℃反应4分钟(酶反应)。
(e)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长463nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图5表示将在不使用表面活性剂的条件(表面活性剂(-))下使用标准溶液时的发光量与使用对照溶液时的发光量之比(标准溶液/对照溶液;对照)设为100%时的、在使用各表面活性剂的条件下使用标准溶液时的发光量与使用对照溶液时的发光量之比的比例(发光量比[相对于对照])。其结果,使用MEGA8和CHAPS的情况下发光量特别地下降,可确认一步竞争法中的使类固醇从HPβCD脱包合的效果,MEGA8的效果特别高(图5)。应予说明,提示曲拉通X705和脱氧胆酸钠对反应体系本身产生不良影响。在孕酮测定体系中有效果的表面活性剂与在醛固酮测定体系(实施例1-3~1-4)中有效果的表面活性剂是重复的。
(实施例3)使25-羟基维生素D从γCD脱包合的效果
本实施例中,使用25-羟基维生素D作为抗原,使用缓冲液基质的标准溶液作为标准溶液,,使用γCD作为环糊精。具体而言,首先,在下述标准液稀释液(无γCD)中添加25-羟基维生素D而制备约50ng/mL 25-羟基维生素D溶液(50ng/mL CD(-)标准溶液),在上述标准液稀释液中添加γCD,使其成为0.3%浓度,在其中添加25-羟基维生素D而制备约50ng/mL 25-羟基维生素D溶液(50ng/mL CD(+)标准溶液)。作为上述标准溶液稀释液(无γCD),使用“50mM MOPS(pH7.2)、150mM NaCl、0.1%NaN3”。
另外,制备在下述处理液的基质组成中分别添加或不添加实施例1使用的表面活性剂中的8种表面活性剂(吐温80、Brij58、C8APS、C16APS、CHAPS、MEGA8、曲拉通X705、脱氧胆酸钠)的处理液。上述处理液的基质组成设为“50mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、4.5%BSA、0.1%NaN3”。各处理液中的表面活性剂的浓度分别设为0.5%。
对于各试样(50ng/mL CD(-)标准溶液或50ng/mL CD(+)标准溶液),通过使用抗25-羟基维生素D抗体结合粒子(利用以往方法制备的抗25-羟基维生素D抗体结合磁性粒子(抗体结合粒子))、碱性磷酸酶标记抗25-羟基维生素D免疫复合物抗体(利用以往方法制备的碱性磷酸酶标记抗25-羟基维生素D抗体(酶标记抗体))和上述处理液的特殊两步法实施测定。详细而言,按照以下(a)~(g)的工序进行。
(a)将试样约10μL和处理液约190μL混合而得到稀释20倍的稀释试样(前处理/稀释)。
(b)在抗体结合粒子约50μL中添加上述稀释试样约20μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第一反应)。
(c)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(d)添加酶标记抗体约50μL并进行搅拌,在37℃反应8分钟(第二反应)。
(e)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(f)添加AMPPD(底物,3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)液约200μL并进行搅拌,在37℃反应4分钟(酶反应)。
(g)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长463nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图6表示将使用不添加表面活性剂的处理液(表面活性剂(-))作为上述处理液且使用50ng/mL CD(-)标准溶液作为上述试样时的发光量(对照)设为100%时的、使用各处理液且使用50ng/mL CD(-)标准溶液或50ng/mL CD(+)标准溶液作为上述试样时的发光量的比例(发光量比[相对于对照])。其结果,特别是在使用CHAPS和MEGA8的情况下,可确认脱包合效果(50ng/mL CD(+)标准溶液的发光量(反应性)提高,与50ng/mL CD(-)标准溶液的发光量的背离得到抑制的效果)(图6中的星形符号)。另一方面,在使用Brij58、C8APS和C16APS的情况下,虽然可确认到抑制50ng/mL CD(-)标准溶液与50ng/mL CD(+)标准溶液的发光量的背离,但是提示对反应体系本身产生不良影响,一次反应受到抑制,发光量下降。
(实施例4)使雌二醇从HPβCD脱包合的效果
本实施例中,采用实施例2的一步竞争法中的另一种方法作为测定体系。在该竞争法中,如果表面活性剂的作用促进类固醇从HPβCD脱包合且试样中的类固醇的量本身相对于标记抗原的量变多时,则标记抗原不能与抗体结合粒子结合,因此发光量进一步降低。
另外,在本实施例中,使用雌二醇(E2)作为抗原,使用缓冲液基质的标准溶液作为标准溶液,使用HPβCD作为环糊精。具体而言,首先,将下述标准液稀释液(无HPβCD)作为“0pg/mL CD(-)标准溶液(对照)”,在其中添加雌二醇而制备约50pg/mL雌二醇溶液(50pg/mL CD(-)标准溶液),在上述标准溶液稀释液中添加HPβCD使其达到0.2%浓度而制备“0pg/mL CD(+)标准溶液(对照)”,在其中添加雌二醇而制备约50pg/mL雌二醇溶液(50pg/mL CD(+)标准溶液)。作为上述标准溶液稀释液(无HPβCD),使用“50mM Tris-HCl(pH7.2)、150mMNaCl、5%BSA、0.1%NaN3”。
另外,在不使用另外的处理液、使用表面活性剂的条件下,按照分别达到1.0%浓度的方式相对于下述的酶标记抗原添加下述的表面活性剂。作为上述表面活性剂,分别使用实施例1所使用的表面活性剂中的吐温20、吐温80、Brij58、C8APS、C16APS、CHAPS、MEGA8、及曲拉通X705。
对于各试样(0pg/mL CD(-)标准溶液、50pg/mL CD(-)标准溶液、0pg/mL CD(+)标准溶液、50pg/mL CD(+)标准溶液),通过使用抗E2抗体结合粒子(用以往方法制备的抗E2抗体结合磁性粒子(抗体结合粒子))及碱性磷酸酶标记E2(用以往方法制备的碱性磷酸酶标记E2(酶标记抗原))的一步法实施测定。详细而言,按照以下(a)~(d)的工序进行。
(a)依次添加抗体结合粒子约50μL、试样约20μL、酶标记抗原约50μL,并进行搅拌,在37℃反应19分钟。
(b)使用磁分离器进行B/F分离,并进行清洗。
(c)添加AMPPD(底物、3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐)液约200μL,并进行搅拌,在37℃反应4分钟(酶反应)。
(d)测定伴随上述底物的分解而放出的在波长463nm附近具有发光极大峰的光的发光量。
图7A表示将在不使用表面活性剂的条件(表面活性剂(-))下使用0pg/mL CD(-)标准溶液时的发光量(对照)设为100%时的、在使用各表面活性剂的条件下或不使用各表面活性剂的条件下使用0pg/mL CD(-)标准溶液或0pg/mL CD(+)标准溶液时的发光量的比例(发光量比[相对于对照]),图7B表示将在不使用表面活性剂的条件(表面活性剂(-))下使用50pg/mL CD(-)标准溶液时的发光量(对照)设为100%时的、在使用表面活性剂的条件下或不使用表面活性剂的条件下使用50pg/mL CD(-)标准溶液或50pg/mL CD(+)标准溶液时的发光量的比例(发光量比[相对于对照])。
其结果,图7A和图7B成为外形几乎相同的图表,另外,在使用MEGA8和CHAPS的情况下,不使用表面活性剂条件下的发光量下降得到抑制,且添加环糊精(CD(+))与不添加(CD(-))之间的发光量背离也得到抑制,可确认使类固醇从HPβCD脱包合的效果(图7A、图7B的星形符号)。另外,在使用C8APS和曲拉通X705的情况下,虽然添加环糊精与不添加环糊精之间的发光量背离得到抑制,但是提示添加表面活性剂对反应体系本身产生不良影响(图7A)。在雌二醇测定体系中具有效果的表面活性剂与在醛固酮测定体系(实施例1-3~1-4)、孕酮测定体系(实施例2)、25-羟基维生素D(实施例3)中有效果的表面活性剂是重复的。
产业上的可利用能性
如以上说明所示,根据本发明,能够抑制被检试样与标准溶液中的抗原抗体反应行为的背离,并能够以高精度定量被检试样中的类固醇浓度。由于类固醇活性与多种疾病有关,因此本发明不仅在研究方面的利用,而且在疾病诊断中也有能够给出很大帮助。
Claims (5)
1.表面活性剂在用于使包合于环糊精的类固醇脱包合的处理液的制备中的用途,其特征在于,所述处理液以所述表面活性剂为有效成分,
所述表面活性剂为选自N-辛酰基-N-甲基葡糖胺和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐中的至少一种,
所述环糊精为β环糊精或羟丙基β环糊精。
2.根据权利要求1所述的用途,其中,所述类固醇为选自醛固酮、孕酮、25-羟基维生素D和雌二醇中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其中,所述处理液用于在包含类固醇和环糊精的类固醇免疫学定量用标准溶液中,使包合于所述环糊精的所述类固醇脱包合。
4.一种对类固醇进行免疫学定量的方法,其特征在于,所述方法包含下述步骤,
使抗类固醇抗体分别与被检试样、以及包含类固醇和环糊精的标准溶液反应,分别测定所述被检试样和所述标准溶液中的抗原抗体反应的信号强度,比较所述被检试样的信号强度和所述标准溶液的信号强度,
在所述标准溶液的抗原抗体反应的反应体系中,添加包含选自N-辛酰基-N-甲基葡糖胺和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐中的至少一种的表面活性剂的处理液,
所述环糊精为β环糊精或羟丙基β环糊精。
5.一种用于对类固醇进行免疫学定量的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒至少包含下述(a)~(c),
(a)抗类固醇抗体,
(b)包含类固醇和环糊精的标准溶液,所述环糊精为β环糊精或羟丙基β环糊精,
(c)包含选自N-辛酰基-N-甲基葡糖胺和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐中的至少一种的表面活性剂的处理液。
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