WO2019098314A1 - シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液 - Google Patents

シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液 Download PDF

Info

Publication number
WO2019098314A1
WO2019098314A1 PCT/JP2018/042415 JP2018042415W WO2019098314A1 WO 2019098314 A1 WO2019098314 A1 WO 2019098314A1 JP 2018042415 W JP2018042415 W JP 2018042415W WO 2019098314 A1 WO2019098314 A1 WO 2019098314A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
steroid
antibody
cyclodextrin
surfactant
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/042415
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
達成 吉見
杏子 照山
Original Assignee
富士レビオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士レビオ株式会社 filed Critical 富士レビオ株式会社
Priority to EP18878307.0A priority Critical patent/EP3712614B1/en
Priority to US16/765,018 priority patent/US11604199B2/en
Priority to JP2019554301A priority patent/JP7194114B2/ja
Priority to CN201880051452.9A priority patent/CN111051883B/zh
Publication of WO2019098314A1 publication Critical patent/WO2019098314A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G01N2400/14—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar alpha-D-Glucans, i.e. having alpha 1,n (n=3,4,6) linkages between saccharide units, e.g. pullulan
    • G01N2400/18—Cyclodextrin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2496/00—Reference solutions for assays of biological material
    • G01N2496/25—Reference solutions for assays of biological material containing added polymers to stabilise biological material against degradation or mantain viscosity or density, e.g. gelatin, polyacrylamides, polyvinyl alcohol

Definitions

  • the present invention relates to a treatment solution for use in the de-exclusion of steroids clathrated with cyclodextrin, which comprises a surfactant as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of the treatment solution in the immunological determination of steroids.
  • the antigen-antibody reaction When immunologically quantifying the target substance (antigen) contained in a sample (test sample), generally, the antigen-antibody reaction in a standard solution containing the signal strength of the antigen-antibody reaction in the sample and the target substance of a predetermined concentration The signal intensity of each is measured and the measured values are compared. In order to perform this quantification with high accuracy, it is necessary to make the behavior of the antigen-antibody reaction in the sample and the standard solution as consistent as possible.
  • human serum when quantifying a steroid immunologically, human serum is usually used as a sample (test sample), but for preparation of a standard solution so that the behavior of the antigen-antibody reaction between the sample and the standard solution does not deviate. Serum is often used. However, when using a serum-based standard solution, it is not possible to eliminate lot differences and infection risks derived from raw materials.
  • a buffer solution containing a protein such as bovine serum albumin is also used in the preparation of the standard solution, but in this case, the steroid contained in the standard solution tends to be degraded over time, At the time of measurement, it is a problem that the signal intensity decreases.
  • steroids that are hydrophobic tend to be adsorbed to components of standard solutions and containers, which also causes a decrease in signal intensity at the time of measurement.
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art, and its object is to immunologically determine a steroid using a standard solution containing a steroid clathrated with cyclodextrin. To improve the accuracy of the determination of steroids.
  • the present inventors have treated steroid with a standard solution containing a steroid that has been included in cyclodextrin with a surfactant, to thereby detoxify the steroid from cyclodextrin. I found that I could do it.
  • This declination effect is particularly excellent in surfactants having an acyl group or an alkyl group having 8 carbon atoms and surfactants having a steroid skeleton, and aldosterone, progesterone, 25-, which are enclosed in cyclodextrin. It was observed for both hydroxyvitamin D and estradiol. Moreover, these surfactants showed excellent effects not only when using buffer-based standard solutions but also when using serum-based standard solutions.
  • the behavior of the antigen-antibody reaction between the sample (test sample) and the standard solution is determined by the action of the surfactant. It has been found that the deviation is suppressed and the accuracy of quantification is significantly improved, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the use of a surfactant for use in the decapsulation of a steroid clathrated with cyclodextrin, in particular to the use in the immunological determination of a steroid, more specifically, It is provided.
  • the surfactant is N-octanoyl-N-methylglucamine, poly (oxyethylene) Octylphenylether, N-octyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propa
  • the treatment liquid as described in any one.
  • a method for immunologically quantifying a steroid An anti-steroid antibody is reacted with each of a test sample and a standard solution containing a steroid and cyclodextrin, and the signal intensity of the antigen-antibody reaction in the test sample and the standard solution is measured, and the signal in the test sample is measured.
  • a kit for immunologically quantifying a steroid comprising at least the following (a) to (c): (A) Anti-steroid antibody (b) Treatment solution of standard solution (c) [7] containing steroid and cyclodextrin
  • the coexistence of a surfactant in the antigen-antibody reaction in the immunological measurement system of steroid makes it possible to suppress the deviation of the behavior of the sample (test sample) and the standard solution.
  • the This makes it possible to quantify steroids with high accuracy not only when using serum-based standard solutions but also when using buffer-based standard solutions (eg, serum-free and protein-free standard solutions).
  • the present invention provides a treatment liquid for use in the de-exclusion of a steroid that has been included in cyclodextrin, which contains a surfactant as an active ingredient.
  • inclusion means that cyclodextrin incorporates a molecule into its cyclic structure
  • exclusion means that a molecule enclosed in cyclodextrin is detached from cyclodextrin. It means to do.
  • Cyclodextrin in the present invention is a cyclic oligosaccharide in which a plurality of glucose are combined to form a cyclic structure.
  • the cyclodextrin applied to the present invention is not particularly limited as long as it has an inclusion effect of steroids, and includes, for example, alpha cyclodextrin, beta cyclodextrin, hydroxypropyl beta cyclodextrin, and gamma cyclodextrin.
  • ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -cyclodextrin are preferable, and among them, hydroxypropyl ⁇ -cyclodextrin is particularly preferable.
  • the "steroid" in the present invention is a generic term for compounds having a steroid skeleton (cyclopentanohydrophenanthrene skeleton).
  • Steroids include steroid hormones and their derivatives (eg, protein anabolic steroids, synthetic steroids such as anti-androgenic agents and anti-oval hormone agents) that retain the steroid skeleton.
  • Steroid hormones include, for example, androgen, follicle hormone, luteinizing hormone (eg, progesterone), corticoid (eg, glucocorticoid, mineralocorticoid).
  • the steroid applied to the present invention is not particularly limited as long as it is included in cyclodextrin, but for example, aldosterone, progesterone, 25-hydroxyvitamin D, and estradiol are preferable.
  • Aldosterone is a type of steroid hormone (minorocorticoid) secreted from the spherical zone of the adrenal cortex, mainly sodium ion reabsorption and its associated water absorption in renal tubules, and potassium exchangeable with sodium ion Promote the discharge of ions and hydrogen ions.
  • Progesterone is a type of steroid hormone (luteum hormone) synthesized in the corpus luteum of the ovary, and has effects such as endometrial secretory period change, pregnancy maintenance, rise in body temperature, ovulation suppression, and mammary gland development.
  • 25-hydroxyvitamin D is a hormone precursor produced by hydroxylation of vitamin D in the liver, and is involved in the maintenance of bone and mineral metabolism.
  • Estradiol is a type of steroid hormone (ovarian hormone) produced by granulosa cells of the ovaries, extravesicular membrane cells, placenta, adrenal cortex, testicular stromal cells, promoting proliferation of mammary cells, ovarian ovulation control, lipid metabolism control It has effects such as insulin action, blood clotting action, central nervous (consciousness) feminization, skin thinning, reduction of LDL and increase of VLDL / HDL to suppress arteriosclerosis.
  • ovarian hormone ovarian hormone
  • a surfactant is used to cause the inclusion steroid to be released from cyclodextrin.
  • the "surfactant” in the present invention is a compound that reduces the surface tension in an aqueous solution, and has a hydrophilic portion and a hydrophobic portion in the molecule.
  • the surfactant applied to the present invention is not particularly limited as long as there is such a declination effect, but a surfactant having an acyl group or an alkyl group having 8 carbon atoms, and an interface having a steroid skeleton It is preferably at least one selected from the group consisting of active agents, and more preferably any one selected from the above group.
  • the surfactant having an acyl group having 8 carbon atoms is preferably one having a hydrophobic octanoyl group (C8 (having 8 carbon atoms, the same applies hereinafter)) and a hydrophilic glucamine group, for example, N-octanoyl- Examples include N-methylglucamine (non-ionic, MEGA 8 (manufactured by Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.), etc.), but not limited thereto.
  • the surfactant having an alkyl group having 8 carbon atoms one having a hydrophobic octyl group (C8) and a hydrophilic poly (oxyethylene) group is preferable.
  • poly (oxyethylene) octyl phenyl ether Nonionic, Triton X (Triton X 705, Triton X 100, etc. (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.), etc.), etc. may be mentioned, but not limited thereto.
  • surfactant having an alkyl group having 8 carbon atoms one having a hydrophobic octyl group (C8) and a hydrophilic portion containing a sulfonate group and an ammonium group is preferable, for example, N-octyl-N And N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate (amphoteric, C8APS (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and the like), but not limited thereto.
  • C8APS manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • a surfactant having a steroid skeleton one having a hydrophobic steroid skeleton and a hydrophilic moiety containing a sulfonate group and an ammonium group, or a hydrophobic steroid skeleton and a hydrophilic moiety containing a carboxylate group
  • a surfactant having a steroid skeleton one having a hydrophobic steroid skeleton and a hydrophilic moiety containing a sulfonate group and an ammonium group, or a hydrophobic steroid skeleton and a hydrophilic moiety containing a carboxylate group
  • 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate amphoteric, CHAPS (manufactured by Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.), etc.
  • deoxycholic acid Sodium (anionic) is included, but is not limited thereto.
  • N-octanoyl-N-methylglucamine such as MEGA 8 having hydrophobic octanoyl group (C8) and hydrophilic glucamine group (such as MEGA 8) and 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -Propanesulfonate (CHAPS etc.) is particularly preferred because it exhibits excellent declination effect regardless of the type of steroid and the type of immunological assay, and N-octanoyl-N-methylglucamine is particularly preferred .
  • the concentration of the surfactant contained in the treatment liquid of the present invention is not particularly limited as long as it can bring about the effect of de-exclusion of the steroid when added to the reaction system containing the steroid encapsulated in cyclodextrin. There is no.
  • the concentration of the surfactant in the treatment solution is appropriately adjusted so that the concentration after the treatment solution is added to the reaction system is usually 0.005 to 5%, preferably 0.01 to 2%. can do.
  • it may be prepared in advance as a treatment liquid containing an n-fold concentration of surfactant.
  • the treatment liquid of the present invention can be prepared, for example, based on a buffer.
  • the buffer is not particularly limited, and, for example, GOOD buffer (HEPES, MOPS, etc.), Tris buffer (Tris hydrochloric acid buffer, TE buffer, TAE buffer, TBE buffer, Tris buffered saline, etc.) And phosphate buffers (phosphate buffered saline and the like).
  • the pH value of the buffer is usually 5.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0.
  • the treatment solution of the present invention can also be prepared based on serum.
  • the serum is not particularly limited, and for example, animal-derived serum (human, bovine, horse, sheep, goat, pig, llama, dog, chicken, donkey, cat, rabbit, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc. Serum derived from), defatted serum (DDC Mass Spect Gold (manufactured by Veritas Co., Ltd.), etc.).
  • the treatment liquid of the present invention may optionally contain, for example, a molecule for adjusting the salt concentration such as sodium chloride, and a preservative (preservative) such as sodium azide.
  • a preservative such as sodium azide.
  • protein components such as bovine serum albumin (BSA), blocking agents, protein stabilizers, sensitizers, saccharides, hydrophilic polymers (eg, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol) and the like may be included.
  • the treatment liquid of the present invention may be used to decapsulate the steroid from a cyclodextrin-cladded steroid which is present in a standard solution for use in a method for immunologically quantifying the steroid. it can.
  • the method of immunologically quantifying a steroid is carried out by reacting an anti-steroid antibody to each of the test sample and the standard solution, and measuring the signal intensity of the antigen-antibody reaction in the test sample and the standard solution, respectively. And (step) comparing the signal intensity in the test sample with the signal intensity in the standard solution.
  • the antigen-antibody reaction is performed on a test sample containing free steroid.
  • concentration of free steroid in the reaction system is different as compared to the case where the number of molecules of the antigen binding to the antibody deviates, in the method of immunologically quantifying the steroid of the present invention, the reaction
  • the treatment solution of the present invention is added to the system to cause the steroid to be decapsulated from cyclodextrin, which can prevent the occurrence of a deviation in the number of molecules of the antigen bound to such an antibody.
  • test sample used in the method of immunologically quantifying the steroid of the present invention is not particularly limited as long as the steroid can be present.
  • Blood samples are generally used for the purpose of measuring the steroid concentration that is the basis of the diagnosis of diseases associated with steroid abnormalities.
  • the blood sample is preferably serum or plasma.
  • the test sample may be diluted with a buffer solution or serum, and the cyclodextrin may be added for the purpose of stabilization of a steroid as a main purpose, and the treatment liquid of the present invention as described later May be added.
  • the buffer solution and the serum the same as those mentioned as the base of the treatment solution can be mentioned.
  • the “standard solution” used in the method of immunologically quantifying the steroid of the present invention is not particularly limited as long as it contains a predetermined concentration of steroid and the cyclodextrin described above, and is buffer-based. It may also be serum based. As these base buffers and serum, those similar to the ones mentioned as the base of the treatment solution can be mentioned.
  • the buffer base may or may not contain protein components such as bovine serum albumin.
  • a method of immunologically assaying a steroid for example, a CLEIA method (chemiluminescence enzyme immunoassay) using an enzyme as a label (labeling substance) or an EIA method (Enzyme immunoassay); RIA method using radioisotope as label (radioimmunoassay); CLIA method using chemiluminescent compound as label (chemiluminescence immunoassay); latex agglutination method; immunity such as immunochromatography Methods, but are not limited to these.
  • CLEIA method chemiluminescence enzyme immunoassay
  • EIA method Enzyme immunoassay
  • RIA method using radioisotope as label radioisotope as label
  • CLIA method using chemiluminescent compound as label chemiluminescence immunoassay
  • latex agglutination method immunity such as immunochromatography Methods, but are not limited to these.
  • the antibody used in the immunological technique may be, for example, any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY and the like.
  • Such antibodies may also be polyclonal or monoclonal antibodies (eg, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies), antibody fragments thereof.
  • antibody fragments include, but are not limited to, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv, single chain antibodies, diabodies and the like.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • monoclonal antibodies those produced by known methods such as hybridoma method and recombinant DNA method can be used.
  • an antibody conjugated with a labeling substance can be used as the anti-steroid antibody used in the method of immunologically measuring the above-mentioned steroid.
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it can be detected by binding to an antibody, for example, enzymes such as alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal) and the like; fluorescein Fluorescent dyes such as isothiocyanate (FITC) and rhodamine isothiocyanate (RITC); radioactive isotopes such as 125 I; fluorescent proteins such as allophycocyanin (APC) and phycoerythrin (R-PE); avidin; biotin; latex; Gold particle etc. are mentioned.
  • enzymes such as alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal) and
  • the labeling substance When an enzyme is used as the labeling substance, various detections can be performed depending on the substrate by adding a chromogenic substrate, a fluorescent substrate, a chemiluminescent substrate or the like as a substrate.
  • the above-mentioned labeling substance is bound to the above-mentioned anti-steroid antibody
  • a method of indirectly detecting using a secondary antibody or the like to which the labeling substance is bound can also be used.
  • the "secondary antibody” is an antibody showing reactivity to an anti-steroid antibody.
  • an anti-mouse IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • a labeled secondary antibody usable for each of antibodies derived from various species such as rabbit, goat and mouse is commercially available, and an organism from which the anti-steroid antibody is derived Depending on the species, appropriate secondary antibodies can be selected and used. Further, instead of the secondary antibody, it is also possible to use protein G, protein A or the like to which the labeling substance is bound.
  • a conventionally known method can be appropriately adopted for binding the anti-steroid antibody and the labeling substance, or the secondary antibody and the labeling substance, and the biotin-avidin system is used for the binding. It can also be done.
  • an anti-steroid antibody is biotinylated, to which an avidinated labeling substance is allowed to act, and the labeling substance is bound to the anti-steroid antibody by utilizing the interaction between biotin and avidin.
  • a sandwich method and a competition method are suitable.
  • a detection antibody e.g., an antigen (steroid)
  • a capture antibody e.g., an anti-steroid antibody
  • immobilized immobilized on a solid phase and used for detection with a label attached thereto.
  • An antibody for example, a secondary antibody to which a labeling substance is bound
  • detection is performed according to the type of the labeling substance.
  • the solid phase for example, microparticles such as magnetic particles and latex particles, plates such as plastic plates, and fibrous materials such as nitrocellulose can be used.
  • the capture antibody may be immobilized directly to the solid phase, but may be immobilized indirectly.
  • the substance for binding to the capture antibody is immobilized on the solid phase, and the antibody for capture is indirectly immobilized on the solid phase by binding the capture antibody to the substance.
  • the substance that binds to the capture antibody include, but are not limited to, the above-described secondary antibody, protein G, protein A, and the like.
  • immobilization on the solid phase conventionally known methods can be appropriately adopted, and in the case where the capture antibody is biotinylated, an avidinated solid phase can be used.
  • the standard solution, the treatment solution of the present invention, and the immobilized capture antibody are mixed.
  • a first antigen-antibody reaction (first reaction) to form a complex (immune complex) of the steroid and the antibody for complementation (immune complex), and the immunocomplex is separated and washed, and then the labeled substance is bound thereto
  • second reaction second antigen-antibody reaction
  • the detection antibody not only an antibody that binds only to a steroid, but also an antibody that specifically binds to a complex of a steroid and an antibody can be used. Therefore, the "antisteroid antibody” in the present invention includes both of these antibodies.
  • sandwich method for example, a sandwich CLIA method which is an aspect of the CLIA method, a sandwich CLEIA method which is an aspect of the CLEIA method, and an IRMA method (immunoradiometric assay) which is an aspect of the RIA method are preferable.
  • the immobilized detection target substance and the detection target substance in the sample compete for binding to the detection antibody to which the labeling substance is bound.
  • the standard solution containing a steroid (substance to be detected) and cyclodextrin for example, the standard solution, the treatment solution of the present invention, and the detection antibody bound to the labeling substance are mixed to obtain the first antigen
  • An antibody reaction (first reaction) is performed, to which the immobilized target substance to be detected is added, and a second antigen-antibody reaction (second reaction) is performed.
  • the detection target substance in the sample and the detection target substance to which the labeling substance is bound are allowed to compete for binding to the immobilized capture antibody.
  • a standard solution containing a steroid (substance to be detected) and cyclodextrin for example, the standard solution, the treatment solution of the present invention, and the substance to be detected to which the labeling substance is bound are mixed,
  • the above-described capture antibody is added to carry out an antigen-antibody reaction.
  • a conventionally known method can be appropriately adopted to immobilize the substance to be detected and the antibody for capture on the solid phase in the competitive method, and such immobilization may be direct as described above, but indirectly It may be
  • the treatment liquid of the present invention may be added not only to the standard solution but also to the test sample. Since the treatment liquid of the present invention contains a surfactant, the concentration of the surfactant is made to coincide with the standard solution by similarly adding it to the test sample, thereby making the condition more similar. Antigen-antibody reaction can be performed.
  • the treatment liquid of the present invention may be added to the reaction system of the antigen-antibody reaction between the substance to be detected and its antibody so that the concentration of the surfactant becomes the above-mentioned desired concentration, for example,
  • the treatment solution is added to a solution used for another reaction system (a detection antibody to which the labeling substance is bound in the first aspect of the competition method, a detection target substance to which the labeling substance in the second aspect of the competition method is bound)
  • the surfactant may be previously added and used, or the surfactant may be previously added to these solutions to also serve as the treatment liquid of the present invention.
  • the quantification of the steroid concentration from the measurement values obtained in the test sample is generally performed by comparison with the measurement value with a standard solution containing each concentration of steroid.
  • the steroid concentration in the sample is determined by examining at which position on the standard curve created based on the measurement value with the standard solution the measurement value obtained in the test sample is located. be able to.
  • the method for immunologically quantifying the steroid of the present invention can be used for diagnosis (evaluation of morbidity and risk thereof) of a disease associated with abnormal secretion of steroid hormone.
  • a disease associated with abnormal secretion of steroid hormone includes both a disease caused by abnormal secretion of steroid hormone and a disease in which the amount of secreted steroid hormone is abnormal as a result of the onset of the disease. is there.
  • the aldosterone concentration in the blood is high, and Addison's disease, 21-hydroxylase It is known that the same aldosterone concentration shows a low value in a deficiency disorder, selective hypoaldosteronism and the like.
  • progesterone concentration in blood shows high value in congenital adrenal hyperplasia, Cushing's syndrome, adrenal tumor and the like, and low value in ovarian dysfunction, luteal dysfunction and the like.
  • the concentration of 25-hydroxyvitamin D in blood is high in vitamin D intoxication and the like, and low in rickets, osteomalacia, osteoporosis and the like.
  • the estradiol concentration in blood shows high levels, ovarian dysfunction, premature ovarian failure, hypogonadotropinosis, Chiari -It is known to show a low value in, for example, Frommel syndrome.
  • the present invention also provides a kit for immunologically quantifying a steroid, which can be used in the method of immunologically quantifying the above-mentioned steroid of the present invention.
  • the kit of the present invention contains at least an anti-steroid antibody (antibody preparation), a standard solution containing steroid and cyclodextrin (standard steroid reagent), and the treatment liquid of the present invention.
  • control reagents, washing solutions, dilution solutions, dilution cartridges, etc. can be combined.
  • marker, reaction stop solution, etc. can be included.
  • the sandwich method for example, a solid phase immobilized antibody for capturing a steroid or a solid phase on which a substance that binds to the antibody for capturing a steroid can be included.
  • a solid phase to which a detection target substance immobilized or a substance to be bound to the detection target substance is immobilized can be included.
  • the primary antibody the antibody that directly binds to the antigen
  • the secondary antibody is not labeled
  • one labeled with a substance that binds to these antibodies can be included in the kit.
  • the anti-steroid antibody is biotinylated, for example, an avidinated labeling substance can be included in the kit.
  • the kit of the present invention can further include instructions for use of the kit.
  • the kit of the present invention can be used not only for research purposes, but also, for example, as a pharmaceutical for in vitro diagnosis, for quantifying the steroid concentration that is the basis of diagnosis of diseases associated with abnormal secretion of the steroid hormone.
  • Example 1 Verification of Inclusion Effect of Cyclodextrin on Aldosterone
  • aldosterone was used as an antigen
  • a buffer-based one was used as a standard solution.
  • %, 1%, 3% cyclodextrin ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ CD), ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ CD), hydroxypropyl ⁇ -cyclodextrin (HP ⁇ CD), ⁇ -cyclodextrin ( ⁇ CD)
  • ⁇ CD ⁇ -cyclodextrin
  • the base composition of the dilution was "50 mM MOPS (pH 7.2), 150 mM NaCl, 0.1% NaN 3 ".
  • aldosterone antibody-bound particles anti-aldosterone antibody-bound magnetic particles (antibody-bound particles) prepared by the conventional method
  • alkaline phosphatase-labeled anti-aldosterone immunoconjugate antibodies alkaline phosphatase-labeled antibody prepared by the conventional method
  • steps (a) to (f) were performed.
  • (A) About 30 ⁇ L of a sample (the aldosterone solution) is added to about 50 ⁇ L of antibody-bound particles, the mixture is stirred, and reacted at 37 ° C.
  • Example 1-2 Verification of Stabilizing Effect of HP ⁇ CD on Aldosterone
  • aldosterone was used as an antigen
  • a buffer based one was used as a standard solution.
  • aldosterone solution standard solution
  • the base composition of the diluted solution was “100 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5% BSA, 0.1% NaN 3 ”.
  • the resulting aldosterone solutions (about 300 pg / mL aldosterone solution) were subjected to measurement after storage at -80 ° C, 4 ° C, 25 ° C, and 37 ° C for 45 days, respectively.
  • the measurement was performed using anti-aldosterone antibody-bound particles (anti-aldosterone antibody-bound magnetic particles (antibody-bound particles) prepared by the conventional method) and alkaline phosphatase-labeled anti-aldosterone immunoconjugate antibodies (conventional method) It carried out by a two-step method using an alkaline phosphatase labeled anti-aldosterone antibody (enzyme labeled antibody).
  • steps (a) to (f) were performed.
  • A About 40 ⁇ L of a sample (the aldosterone solution) is added to about 250 ⁇ L of antibody-bound particles, the mixture is stirred, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes (first reaction).
  • B B / F separation using a magnetic separator and washing.
  • C About 250 ⁇ L of enzyme-labeled antibody is added and stirred, and reacted at 37 ° C. for 10 minutes (second reaction).
  • D B / F separation using a magnetic separator and washing.
  • the aldosterone solution after storage for 45 days at 4 ° C., 25 ° C. and 37 ° C., respectively, when the luminescence amount when using the aldosterone solution after storage for 45 days at ⁇ 80 ° C. is 100%
  • the ratio of luminescence at the time of firing (luminosity ratio [to -80 ° C]) is shown.
  • HP ⁇ CD contributes to the stability of the standard solution because the measured value fluctuation under the temperature loaded condition is smaller as the concentration of HP ⁇ CD is higher (FIG. 2).
  • Example 1-3 Dissection effect of aldosterone from HP ⁇ CD-1
  • aldosterone was used as an antigen, and a buffer based one was used as a standard solution.
  • aldosterone is added to the following standard solution dilution solution (with HP ⁇ CD), and approximately 1600 pg / mL aldosterone solution (1600 pg / mL CD (+) standard solution) is simulated.
  • Sample dilutions were used, to which aldosterone was added to prepare about 1600 pg / mL aldosterone solution (1600 pg / mL sample (simulated test sample)).
  • anti-aldosterone antibody conjugated particles for each sample (1600pg / mL CD (+) standard solution or 1600pg / mL sample), anti-aldosterone antibody conjugated particles (antialdosterone antibody conjugated magnetic particles (antibody conjugated particles prepared by the conventional method)), alkaline phosphatase labeled Anti-aldosterone immune complex antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-aldosterone antibody (enzyme-labeled antibody) prepared by the conventional method) and a special two-step method using each of the above-mentioned treatment solutions. Specifically, the following steps (a) to (f) were performed.
  • the treatment solution (surfactant (-)) to which no surfactant was added was used as the treatment solution, and the light emission amount (control) when using a 1600 pg / mL sample as the sample was 100%.
  • the ratio of luminescence when using each treatment solution and when using a 1600 pg / mL CD (+) standard solution or a 1600 pg / mL sample as the sample is shown (the luminescence ratio [vs control)].
  • a surfactant with a de-clathion effect (the effect of increasing the reactivity of the 1600 pg / mL CD (+) standard solution without changing the reactivity of the 1600 pg / mL sample) is sodium deoxycholate having a steroid skeleton.
  • Example 1-4 Exfoliation effect of aldosterone from HP ⁇ CD-2
  • aldosterone was used as an antigen
  • serum-based one was used as a standard solution.
  • aldosterone was used as an antigen
  • serum-based one was used as a standard solution.
  • aldosterone was added to delipidated serum (DDC Mass Spect Gold) of -HP ⁇ CD, and approximately 2000 pg / mL aldosterone solution (2000 pg / mL sample (simulated test sample)), + delipidated serum of HP ⁇ CD
  • An aldosterone was added to the above-described HP ⁇ CD delipidated serum to which HP ⁇ CD was added to a concentration of 1% to prepare approximately 2000 pg / mL aldosterone solution (2000 pg / mL CD (+) standard solution).
  • a treatment solution was prepared by adding or not adding each of the five surfactants (C12APS, CHAPS, Tween 20, Triton X 705, MEGA 8) of the types used in Example 1-3 to the base composition of the treatment solution described below. did.
  • the base composition of the treatment solution was “20 mM MOPS (pH 7.2), 300 mM NaCl, 0.1% NaN 3 ”.
  • the concentration of surfactant in each treatment solution was 3%.
  • anti-aldosterone antibody conjugated particles for each sample (2000 pg / mL CD (+) standard solution or 2000 pg / mL sample), anti-aldosterone antibody conjugated particles (anti-aldosterone antibody conjugated magnetic particles (antibody conjugated particles prepared by the conventional method)), alkaline phosphatase labeled Anti-aldosterone immune complex antibody (alkaline phosphatase-labeled anti-aldosterone antibody (enzyme-labeled antibody) prepared by the conventional method) and a special two-step method using each of the above-mentioned treatment solutions. Specifically, the following steps (a) to (f) were performed.
  • the treatment solution (surfactant ( ⁇ )) to which no surfactant is added is used as the treatment solution, and the luminescence amount (control) when using a 2000 pg / mL sample as the sample is set to 100%.
  • the ratio of luminescence when using each treatment solution and using a 2000 pg / mL CD (+) standard solution or a 2000 pg / mL sample as the sample is shown (the luminescence ratio [to control)].
  • CHAPS, Triton X 705, and MEGA 8 are surfactants that have the effect of de-encapsulation (the effect of raising the reactivity of the 2000 pg / mL CD (+) standard solution without changing the reactivity of the 2000 pg / mL sample).
  • the serum-based standard solution gave similar results to the buffer-based standard solution shown in Example 1-3.
  • Example 2 De-exclusion effect of progesterone from HP ⁇ CD As in the case of aldosterone, it was confirmed that progesterone promotes the de-exclusion from HP ⁇ CD by a specific surfactant species.
  • a one-step competition method was adopted as a measurement system.
  • the action of the surfactant promotes the de-exclusion of steroid from HP ⁇ CD. Because the labeled antibody can not bind to the antigen-binding particle, the amount of luminescence is further reduced.
  • progesterone as an antigen and using a buffer solution as a standard solution
  • 20 ng / mL of progesterone in the following standard solution dilution (the same composition as the standard solution dilution of Example 1-3)
  • a control solution was prepared in which the added 20 ng / mL progesterone solution (standard solution) and no progesterone were added.
  • 50 mM MOPS (pH 7.2) 150 mM NaCl, 1% HP ⁇ CD, 0.1% NaN 3 " was used.
  • the following surfactant was added to the following enzyme-labeled antibody so as to have a concentration of 0.2%, respectively, under the conditions using a surfactant, without using a separate treatment liquid.
  • a surfactant used in Example 1-3, Tween 20, Tween 80, C8 APS, CHAPS, MEGA 8, Triton X 705, and sodium deoxycholate, and Brij 58 (manufactured by ICI) and C16 APS (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) Made) were used respectively.
  • alkaline phosphatase-labeled anti-progesterone antibody alkaline phosphatase-labeled anti-progesterone antibody (enzyme-labeled antibody) prepared by the conventional method) for each sample (each standard solution (20 ng / mL progesterone) and each control solution (0 ng / mL progesterone)
  • progesterone-bound particles progesterone-bound magnetic particles prepared by the conventional method (antigen-bound particles)
  • A About 50 ⁇ L of an enzyme-labeled antibody is added with about 10 ⁇ L of a sample and stirred, and reacted at 37 ° C. for 11 minutes (first reaction).
  • B About 50 microliters of antigen binding particles are added, and it stirs, and makes it react at 37 degreeC for 8 minutes (2nd reaction).
  • C B / F separation and washing are performed using a magnetic separator.
  • D About 200 ⁇ L of AMPPD (substrate, 3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ′ ′-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt) is added and stirred, The reaction is carried out at 37 ° C. for 4 minutes (enzyme reaction).
  • E The amount of luminescence of light having a luminescence maximum peak near the wavelength of 463 nm, which is emitted with the decomposition of the substrate, is measured.
  • FIG. 5 shows the ratio of the amount of luminescence when using a standard solution under conditions (surfactant (-)) without surfactant to the amount of luminescence when using a control solution (standard solution / control solution; Ratio of the ratio of the amount of luminescence when using the standard solution under the conditions using each surfactant to the amount of luminescence when using the control solution (the ratio of luminescence amount Control] is shown.
  • the ratio of luminescence amount Control is shown in the case of MEGA8 and CHAPS.
  • Triton X 705 and sodium deoxycholate had an adverse effect on the reaction system itself.
  • the surfactants that were effective in the progesterone measurement system overlapped with those that were effective in the aldosterone measurement system (Examples 1-3 to 1-4).
  • Example 3 Decapsulation Effect of 25-Hydroxyvitamin D from ⁇ CD
  • 25-hydroxyvitamin D as an antigen
  • buffer-based one as a standard solution
  • ⁇ CD as cyclodextrin
  • Example 1 Eight kinds of surfactants (Tween 80, Brij 58, C8 APS, C16 APS, CHAPS, MEGA 8, Triton X 705, sodium deoxycholate) of the types used in Example 1 were added to the base composition of the treatment solution described below. Or the treatment liquid which is not added was prepared.
  • the base composition of the treatment solution was “50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 150 mM NaCl, 4.5% BSA, 0.1% NaN 3 ”.
  • the concentration of surfactant in each treatment solution was 0.5%.
  • anti-25-hydroxyvitamin D antibody-bound particles anti-25-hydroxyvitamin D antibody prepared by the conventional method
  • Bound magnetic particles antibody-bound particles
  • alkaline phosphatase-labeled anti-25-hydroxyvitamin D immunoconjugate antibody alkaline phosphatase-labeled anti-25-hydroxyvitamin D antibody (enzyme-labeled antibody) prepared by a conventional method
  • the above-mentioned treatment solution In a special two-step method using Specifically, the following steps (a) to (g) were performed.
  • A About 10 ⁇ L of sample and about 190 ⁇ L of treatment solution are mixed to obtain a diluted sample 20-fold diluted (pretreatment / dilution).
  • B About 50 ⁇ L of antibody-bound particles is added with about 20 ⁇ L of the diluted sample and stirred, and reacted at 37 ° C. for 8 minutes (first reaction).
  • C B / F separation using a magnetic separator and washing.
  • D About 50 ⁇ L of enzyme-labeled antibody is added and stirred, and reacted at 37 ° C. for 8 minutes (second reaction).
  • E B / F separation using a magnetic separator and washing.
  • FIG. 6 shows the amount of luminescence when using a treatment solution (surfactant (-)) to which no surfactant is added as the treatment solution and using a 50 ng / mL CD (-) standard solution as the sample (control) Ratio of luminescence when using each treatment solution when using 100% as the sample, and using 50 ng / mL CD (-) standard solution or 50 ng / mL CD (+) standard solution as the sample (emission quantity ratio [Vs. control] is shown.
  • the light emission amount (reactivity) of the 50 ng / mL CD (+) standard solution is increased and the light emission amount of the 50 ng / mL CD (-) standard solution is increased.
  • Example 4 De-Inclusion Effect of Estradiol from HP ⁇ CD
  • an alternative method of the one-step competition method of Example 2 was adopted as a measurement system.
  • the action of the surfactant promotes the de-exclusion of steroid from HP ⁇ CD, and when the amount of steroid itself in the sample relative to the amount of labeled antigen itself increases, the labeled antigen becomes an antibody-bound particle. Since the coupling can not be performed, the light emission amount is further reduced.
  • estradiol (E2) was used as an antigen, buffer-based one as a standard solution, and HP ⁇ CD as cyclodextrin. Specifically, first, the following standard solution dilution solution (without HP ⁇ CD) is used as “0 pg / mL CD ( ⁇ ) standard solution (control)”, to which estradiol is added to obtain about 50 pg / mL estradiol solution (50 pg / mL).
  • a solution obtained by adding mL CD (-) standard solution) to the standard solution dilution solution to a 0.2% concentration of HP ⁇ CD is referred to as "0 pg / mL CD (+) standard solution (control)", which is an estradiol Was added to prepare about 50 pg / mL estradiol solution (50 pg / mL CD (+) standard solution).
  • “50 mM Tris-HCl (pH 7.2), 150 mM NaCl, 5% BSA, 0.1% NaN 3 ” was used as the standard solution dilution solution (without HP ⁇ CD).
  • the following surfactant was added so that it might become 1.0% concentration with respect to the following enzyme labeled antigen, respectively on the conditions using surfactant, without using a separate process liquid.
  • the surfactants used in Example 1 Tween 20, Tween 80, Brij 58, C8 APS, C16 APS, CHAPS, MEGA 8 and Triton X 705 were used respectively.
  • each sample (0 pg / mL CD (-) standard solution, 50 pg / mL CD (-) standard solution, 0 pg / mL CD (+) standard solution, 50 pg / mL CD (+) standard solution)
  • antibody-bound particles anti-E2 antibody-bound magnetic particles (antibody-bound particles prepared by the conventional method)
  • alkaline phosphatase-labeled E2 alkaline phosphatase labeled E2 (enzyme-labeled antigen) prepared by the conventional method
  • A About 50 ⁇ L of antibody-bound particles, about 20 ⁇ L of sample, and about 50 ⁇ L of enzyme-labeled antigen are sequentially added and stirred, and reacted at 37 ° C. for 19 minutes.
  • B B / F separation using a magnetic separator and washing.
  • C About 200 ⁇ L of AMPPD (substrate, 3- (2′-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3 ′ ′-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane disodium salt) was added and stirred. The reaction is carried out at 37 ° C. for 4 minutes (enzyme reaction).
  • D The amount of luminescence of light having a luminescence maximum peak near the wavelength of 463 nm, which is emitted with the decomposition of the substrate, is measured.
  • each surface activity when the luminescence amount (control) at the time of using a 0 pg / mL CD (-) standard solution in the condition (surfactant (-)) which does not use a surfactant is 100%.
  • Ratio of luminescence when using 0pg / mL CD (-) standard solution or 0pg / mL CD (+) standard solution under the condition with or without agent the ratio of luminescence amount [to control]
  • the surfactant when the light emission amount (control) at the time of using a 50 pg / mL CD (-) standard solution under the condition (surfactant (-)) without using a surfactant is 100%.
  • the ratio of luminescence when using 50 pg / mL CD ( ⁇ ) standard solution or 50 pg / mL CD (+) standard solution under the condition of using or not is shown (the ratio of luminescence to the control).
  • the graphs in FIG. 7A and FIG. 7B have almost the same external shape, and in MEGA 8 and CHAPS, the decrease in light emission from the condition without using a surfactant is suppressed, and cyclodextrin addition (CD (+ Deviation of the light emission amount between)) and no addition (CD (-)) was also suppressed, and the effect of de-clathration of steroid from HP ⁇ CD was observed (Fig. 7A, asterisk in Fig. 7B).
  • C8APS and Triton X 705 the divergence of the light emission amount between cyclodextrin addition and non addition was suppressed, but it was suggested that the reaction system itself was adversely affected by the addition of surfactant (FIG.
  • the present invention it is possible to suppress the deviation of the behavior of the antigen-antibody reaction between the test sample and the standard solution, and to quantify the steroid concentration in the test sample with high accuracy. Since steroid activity is associated with various diseases, the present invention is not limited to research applications, and can greatly contribute to the diagnosis of diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

ステロイドを免疫学的に定量する方法において、シクロデキストリンに包接されたステロイドを含む標準溶液を界面活性剤で処理することにより、シクロデキストリンからステロイドを脱包接させることができ、これにより検体（被検試料）と標準溶液とにおける抗原抗体反応の挙動の乖離が抑制され、引いてはステロイドの定量の精度が顕著に向上することを見出した。

Description

シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液
　本発明は、界面活性剤を有効成分とする、シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液に関する。また、本発明は、ステロイドの免疫学的な定量における当該処理液の利用に関する。
　検体（被検試料）に含まれる目的物（抗原）を免疫学的に定量する場合、一般的に、検体における抗原抗体反応のシグナル強度と所定濃度の目的物が含まれる標準溶液における抗原抗体反応のシグナル強度とをそれぞれ測定し、それら測定値の比較を行う。この定量を高い精度で行うためには、検体と標準溶液とにおける抗原抗体反応の挙動を極力一致させることが必要となる。
　例えば、ステロイドを免疫学的に定量する場合、検体（被検試料）として、通常、ヒト血清が用いられるが、検体と標準溶液とにおける抗原抗体反応の挙動が乖離しないよう、標準溶液の調製にも血清が用いられることが多い。しかしながら、血清をベースとした標準溶液を用いる場合、原料由来のロット差や感染リスクを排除することができない。
　このため、標準溶液の調製においては、血清の代わりに、ウシ血清アルブミンなどの蛋白質を含む緩衝液も利用されているが、この場合、標準溶液に含まれるステロイドが時間とともに分解する傾向を示し、測定時に、そのシグナル強度が低下することが問題となる。また、疎水性であるステロイドは、標準溶液の構成成分や容器へ吸着し易く、これも測定時におけるシグナル強度の低下を引き起こす。
　そこで、このようなシグナル強度の低下を抑制するために、標準溶液にシクロデキストリンを添加し、シクロデキストリンの疎水性内部に、ステロイドを包接させて安定化させることが提案されている（特許文献１）。
国際公開第１９９７／００５４９１号公報
　ところが、本発明者らが、シクロデキストリンに包接されたステロイドを含む標準溶液を用いて、検体（被検試料）に含まれるステロイドの免疫学的な定量を試みたところ、検体と標準溶液とにおける抗原抗体反応の挙動が大きく異なり、引いては、正確なステロイドの定量が困難となることが判明した（実施例１－１を参照のこと）。
　本発明は、このような従来技術の有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、シクロデキストリンに包接されたステロイドを含む標準溶液を用いて、ステロイドを免疫学的に定量する方法において、ステロイドの定量の精度を向上させることにある。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シクロデキストリンに包接されたステロイドを含む標準溶液を界面活性剤で処理することにより、シクロデキストリンからステロイドを脱包接させることができることを見出した。
　この脱包接効果は、特に、炭素数８のアシル基もしくはアルキル基を有する界面活性剤、およびステロイド骨格を有する界面活性剤において優れており、シクロデキストリンに包接されたアルドステロン、プロゲステロン、２５－ヒドロキシビタミンＤ、およびエストラジオールのいずれに対しても認められた。また、これら界面活性剤は、緩衝液ベースの標準溶液を用いた場合のみならず、血清ベースの標準溶液を用いた場合でも、優れた効果を示した。
　さらに、本発明者らは、非競合法および競合法のいずれのステロイドの免疫学的測定系でも、界面活性剤の作用により、検体（被検試料）と標準溶液とにおける抗原抗体反応の挙動の乖離が抑制され、引いては定量の精度が顕著に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための界面活性剤の利用、特に、ステロイドの免疫学的な定量における利用に関するものであり、より詳しくは、以下を提供するものである。
［１］界面活性剤を有効成分とする、シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液。
［２］前記界面活性剤が、炭素数８のアシル基もしくはアルキル基を有するか、またはステロイド骨格を有する、［１］に記載の処理液。
［３］前記界面活性剤が、下記（ａ）から（ｅ）からなる群より選択される少なくとも１つである、［２］に記載の処理液。
（ａ）オクタノイル基およびグルカミン基を有する界面活性剤
（ｂ）オクチル基およびポリオキシエチレン基を有する界面活性剤
（ｃ）オクチル基、スルホネート基、およびアンモニウム基を有する界面活性剤
（ｄ）ステロイド骨格、スルホネート基、およびアンモニウム基を有する界面活性剤
（ｅ）ステロイド骨格およびカルボキシレート基を有する界面活性剤
［４］前記界面活性剤が、Ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミン、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、Ｎ－オクチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルフォネート、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルフォネート、およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つである、［３］に記載の処理液。
［５］前記シクロデキストリンが、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、およびγシクロデキストリンからなる群より選択される少なくとも１つである、［１］～［４］のいずれかに記載の処理液。
［６］前記ステロイドが、アルドステロン、プロゲステロン、２５－ヒドロキシビタミンＤ、およびエストラジオールからなる群より選択される少なくとも１つである、［１］～［５］のいずれかに記載の処理液。
［７］ステロイドおよびシクロデキストリンを含むステロイドの免疫学的な定量のための標準溶液において、前記シクロデキストリンに包接された前記ステロイドの脱包接に用いるための、［１］～［６］のいずれかに記載の処理液。
［８］ステロイドを免疫学的に定量する方法であって、
　被検試料、およびステロイドとシクロデキストリンとを含む標準溶液のそれぞれに抗ステロイド抗体を反応させ、前記被検試料および前記標準溶液における抗原抗体反応のシグナル強度をそれぞれ測定し、前記被検試料におけるシグナル強度と前記標準溶液におけるシグナル強度とを比較することを含み、
　前記標準溶液における抗原抗体反応の反応系に、［７］に記載の処理液が添加されている方法。
［９］ステロイドを免疫学的に定量するためのキットであって、少なくとも下記（ａ）～（ｃ）を含むキット。
（ａ）抗ステロイド抗体
（ｂ）ステロイドおよびシクロデキストリンを含む標準溶液
（ｃ）［７］の処理液
　本発明によれば、ステロイドの免疫学的測定系における抗原抗体反応中に界面活性剤を共存させることで、検体（被検試料）と標準溶液との挙動の乖離を抑制することが可能となった。これにより、血清ベースの標準溶液を用いる場合のみならず、緩衝液ベースの標準溶液（例えば、無血清かつ無タンパク質の標準溶液）を用いる場合でも、高い精度でステロイドを定量することが可能となった。
アルドステロンに対するシクロデキストリンの包接効果の検証を行った結果を示すグラフである。シクロデキストリンとしては、αシクロデキストリン（αＣＤ）、βシクロデキストリン（βＣＤ）、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、およびγシクロデキストリン（γＣＤ）を用いた。 アルドステロンに対するＨＰβＣＤの安定化効果の検証を行った結果を示すグラフである。 各種界面活性剤における、ＨＰβＣＤに包接されたアルドステロンの脱包接効果を示すグラフである。緩衝液ベースの標準溶液を用い、非競合法（２ステップ法）により測定した。 各種界面活性剤における、ＨＰβＣＤに包接されたアルドステロンの脱包接効果を示すグラフである。血清ベースの標準溶液を用い、非競合法（２ステップ法）により測定した。 各種界面活性剤における、ＨＰβＣＤに包接されたプロゲステロンの脱包接効果を示すグラフである。緩衝液ベースの標準溶液を用い、競合法（１ステップ法）により測定した。 各種界面活性剤における、γＣＤに包接された２５－ヒドロキシビタミンＤの脱包接効果を示すグラフである。緩衝液ベースの標準溶液を用い、非競合法（２ステップ法）により測定した。 各種界面活性剤における、ＨＰβＣＤに包接されたエストラジオールの脱包接効果を示すグラフである。緩衝液ベースの標準溶液を用い、競合法（１ステップ法）により測定した。 各種界面活性剤における、ＨＰβＣＤに包接されたエストラジオールの脱包接効果を示すグラフである。緩衝液ベースの標準溶液を用い、競合法（１ステップ法）により測定した。
　本発明は、界面活性剤を有効成分とする、シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液を提供する。
　本発明において「包接」とは、シクロデキストリンが、その環状構造の中に分子を取り込むことを意味し、「脱包接」とは、シクロデキストリンに包接された分子がシクロデキストリンから脱離することを意味する。
　本発明における「シクロデキストリン」は、複数のグルコースが結合して環状構造をとった環状オリゴ糖である。本発明に適用されるシクロデキストリンとしては、ステロイドの包接作用がある限り、特に制限はないが、例えば、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、およびγシクロデキストリンが挙げられ、これらの中でも、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、およびγシクロデキストリンが好ましく、中でもヒドロキシプロピルβシクロデキストリンが特に好ましい。
　本発明における「ステロイド」は、ステロイド骨格（シクロペンタノヒドロフェナントレン骨格）を持つ化合物の総称である。ステロイドとしては、ステロイドホルモン、およびステロイド骨格を保持するその誘導体（例、タンパク質同化ステロイド、抗男性ホルモン剤および抗卵胞ホルモン剤等の合成ステロイド）が挙げられる。ステロイドホルモンとしては、例えば、男性ホルモン、卵胞ホルモン、黄体ホルモン（例、プロゲステロン）、コルチコイド（例、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド）が挙げられる。本発明に適用されるステロイドとしては、シクロデキストリンに包接される限り、特に制限はないが、例えば、アルドステロン、プロゲステロン、２５－ヒドロキシビタミンＤ、およびエストラジオールが好ましい。
　アルドステロンは、副腎皮質の球状帯から分泌されるステロイドホルモンの一種（鉱質コルチコイド）であり、主に腎臓の尿細管でのナトリウムイオン再吸収とそれに伴う水分吸収、およびナトリウムイオンと交換的なカリウムイオンと水素イオンの排出を促進する。
　プロゲステロンは、卵巣の黄体で合成されるステロイドホルモンの一種（黄体ホルモン）であり、子宮内膜分泌期変化、妊娠維持、体温の上昇、排卵抑制、乳腺発育などの作用がある。
　２５－ヒドロキシビタミンＤは、肝臓でビタミンＤをヒドロキシ化して作られるホルモン前駆物質であり、骨やミネラル代謝の維持に関与する。
　エストラジオールは、卵巣の顆粒膜細胞、外卵胞膜細胞、胎盤、副腎皮質、精巣間質細胞で作られるステロイドホルモンの一種（卵胞ホルモン）であり、乳腺細胞の増殖促進、卵巣排卵制御、脂質代謝制御、インスリン作用、血液凝固作用、中枢神経（意識）女性化、皮膚薄化、ＬＤＬの減少とＶＬＤＬ・ＨＤＬの増加とによる動脈硬化抑制などの作用がある。
　本発明の処理液においては、包接されたステロイドをシクロデキストリンから脱包接させるために、界面活性剤を用いる。本発明における「界面活性剤」は、水溶液中で表面張力を低下させる化合物であり、分子内に親水性部分と疎水性部分をもつ。本発明に適用される界面活性剤としては、このような脱包接作用がある限り、特に制限はないが、炭素数８のアシル基もしくはアルキル基を有する界面活性剤、およびステロイド骨格を有する界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましく、前記群から選択されるいずれか１つであることがより好ましい。
　前記炭素数８のアシル基を有する界面活性剤としては、疎水性のオクタノイル基（Ｃ８（炭素数８、以下同様））と親水性のグルカミン基とを有するものが好ましく、例えば、Ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミン（非イオン性、ＭＥＧＡ８（（株）同仁化学研究所製）等）が挙げられるが、これに制限されない。炭素数８のアルキル基を有する界面活性剤としては、疎水性のオクチル基（Ｃ８）と親水性のポリ（オキシエチレン）基とを有するものが好ましく、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（非イオン性、ＴｒｉｔｏｎＸ（ＴｒｉｔｏｎＸ７０５、ＴｒｉｔｏｎＸ１００など（ナカライテスク株式会社製））等）が挙げられるが、これらに制限されない。炭素数８のアルキル基を有する他の界面活性剤としては、疎水性のオクチル基（Ｃ８）と、スルホネート基およびアンモニウム基を含む親水性部分とを有するものが好ましく、例えば、Ｎ－オクチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルフォネート（両性、Ｃ８ＡＰＳ（東京化成工業株式会社製）等）が挙げられるが、これに制限されない。また、ステロイド骨格を有する界面活性剤としては、疎水性のステロイド骨格と、スルホネート基およびアンモニウム基を含む親水性部分とを有するものや、疎水性のステロイド骨格と、カルボキシレート基を含む親水性部分とを有するものが好ましく、例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルフォネート（両性、ＣＨＡＰＳ（（株）同仁化学研究所製）等）やデオキシコール酸ナトリウム（陰イオン性）が挙げられるが、これらに制限されない。
　これらの中でも、疎水性のオクタノイル基（Ｃ８）と親水性のグルカミン基を有するＮ－オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミン（ＭＥＧＡ８等）および３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ等）は、ステロイドの種類や免疫学的測定法の種類を問わず優れた脱包接効果を示すことから特に好ましく、Ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミンは特に好ましい。
　本発明の処理液に含まれる界面活性剤の濃度は、シクロデキストリンに包接されたステロイドを含む反応系に添加された際に、当該ステロイドの脱包接作用をもたらすことができる限り、特に制限はない。当該処理液が反応系に添加された後の濃度が、通常、０．００５～５％、好ましくは０．０１～２％となるように、当該処理液における界面活性剤の濃度は、適宜調整することができる。例えば、反応系に添加された際にｎ倍に希釈されることを意図しているのであれば、予め、ｎ倍の濃度の界面活性剤を含む処理液として調製すればよい。
　本発明の処理液は、例えば、緩衝液をベースに調製することができる。前記緩衝液としては特に制限はなく、例えば、ＧＯＯＤ緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳなど）、トリス緩衝液（Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、トリス緩衝生理食塩水など）、リン酸緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水など）が挙げられる。緩衝液のｐＨ値は、通常、５．０～９．０、好ましくは、６．０～８．０である。
　本発明の処理液はまた、血清をベースにしても調製することができる。前記血清としては特に制限はなく、例えば、動物由来の血清（ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラマ、イヌ、ニワトリ、ロバ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等の動物由来の血清）、脱脂血清（ＤＤＣ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔ　Ｇｏｌｄ（株式会社ベリタス製）等）が挙げられる。
　本発明の処理液には、必要に応じて、例えば、塩化ナトリウムなどの塩濃度調整用分子、アジ化ナトリウムなどの保存剤（防腐剤）を含んでもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質成分、ブロッキング剤、タンパク質安定化剤、増感剤、糖類、親水性ポリマー（例、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール）などを含んでもよい。
　本発明の処理液は、ステロイドを免疫学的に定量する方法に用いるための標準溶液中に存在する、シクロデキストリンに包接されたステロイドから、当該ステロイドを脱包接させるために利用することができる。ステロイドを免疫学的に定量する方法は、一般に、被検試料および標準溶液のそれぞれに抗ステロイド抗体を反応させ、当該被検試料および当該標準溶液における抗原抗体反応のシグナル強度をそれぞれ測定し、当該被検試料におけるシグナル強度と当該標準溶液におけるシグナル強度とを比較すること（工程）を含む。
　ここで、前記標準溶液中のステロイドがシクロデキストリンに包接された状態で抗体を添加して抗原抗体反応を行った場合には、遊離のステロイドを含む被検試料に対して抗原抗体反応を行った場合と比べて、反応系における遊離ステロイド濃度が異なるため、前記抗体に結合する抗原の分子数に乖離が生じてしまうが、本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法においては、前記反応系に本発明の処理液を添加して、シクロデキストリンからステロイドを脱包接させることにより、このような抗体に結合する抗原の分子数に乖離が生じることを抑制することができる。
　本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法に用いられる「被検試料」としては、ステロイドが存在し得る試料である限り特に制限はない。ステロイドの異常が関連する疾患の診断の基礎となるステロイド濃度を測定する目的においては、一般的には、血液検体が用いられる。血液検体は、好ましくは血清または血漿である。また、前記被検試料としては、緩衝液または血清で希釈されていてもよく、ステロイドの安定化を主な目的として前記シクロデキストリンが添加されていてもよく、後述するように本発明の処理液が添加されていてもよい。なお、前記緩衝液および前記血清としては、前記処理液のベースとして挙げたものと同様のものが挙げられる。
　本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法に用いられる「標準溶液」としては、既定濃度のステロイド、および前記シクロデキストリンを含むものであれば特に制限はなく、緩衝液ベースのものであっても、血清ベースのものであってもよい。これらのベースとなる緩衝液および血清としては、前記処理液のベースとして挙げたものと同様のものが挙げられる。緩衝液ベースのものは、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質成分が含まれていてもいなくてもよい。
　本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法において、ステロイドを免疫学的に測定する方法としては、例えば、標識（標識物質）として酵素を用いるＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）やＥＩＡ法（酵素免疫測定法）；標識として放射性同位元素を用いるＲＩＡ法（放射免疫測定法）；標識として化学発光性化合物を用いるＣＬＩＡ法（化学発光免疫測定法）；ラテックス凝集法；イムノクロマトグラフィーなどの免疫学的手法が挙げられるが、これらに制限されない。これらの免疫学的な測定は、非競合的測定法であっても、競合的測定法であってもよい。
　前記免疫学的手法において使用する抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等のいずれのアイソタイプであってもよい。このような抗体はまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（例、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体）、それらの抗体断片であってもよい。抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディーなどが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法など公知の方法によって作製したものを用いることができる。
　上記のステロイドを免疫学的に測定する方法に用いられる抗ステロイド抗体としては、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。前記標識物質としては、抗体に結合させて検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）などの酵素；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光色素；１２５Ｉなどの放射性同位元素；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）などの蛍光蛋白質；アビジン；ビオチン；ラテックス；金粒子などが挙げられる。
　前記標識物質として酵素を用いた場合には、基質として、発色基質、蛍光基質、あるいは化学発光基質などを添加することにより、前記基質に応じて種々の検出を行うことができる。
　上記のステロイドを免疫学的に測定する方法としては、前記標識物質を結合させた抗ステロイド抗体を用いてステロイドを直接的に検出する方法以外に、前記抗ステロイド抗体には前記標識物質を結合させず、前記標識物質が結合した二次抗体などを利用して間接的に検出する方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、抗ステロイド抗体に対して反応性を示す抗体である。例えば、前記抗ステロイド抗体をマウス抗体として調製した場合には、当該二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を使用することができる。前記二次抗体としては、ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、これらにそれぞれ使用可能な標識二次抗体が市販されており、前記抗ステロイド抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択して使用することができる。また、前記二次抗体に代えて、前記標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
　前記抗ステロイド抗体と前記標識物質、あるいは前記二次抗体と前記標識物質との結合には、従来公知の方法を適宜採用することができ、また、かかる結合には、ビオチン－アビジン系を利用することもできる。この方法においては、例えば、抗ステロイド抗体をビオチン化し、これに、アビジン化した標識物質を作用させ、ビオチンとアビジンとの相互作用を利用して、抗ステロイド抗体に標識物質を結合させる。
　前記免疫学的手法の検出原理としては、サンドイッチ法および競合法が好適である。前記サンドイッチ法においては、固相に固定した（固相化した）捕捉用抗体（例えば抗ステロイド抗体）で検出対象物質（例えば抗原（ステロイド））を捕捉し、それを標識物質が結合した検出用抗体（例えば標識物質が結合した二次抗体等）に認識させ、前記標識物質の種類に応じた検出を行う。前記固相としては、例えば、磁性粒子やラテックス粒子などの微小粒子、プラスチックプレートなどのプレート、あるいはニトロセルロースなどの繊維状物質を用いることができる。
　前記捕捉用抗体は前記固相に直接固定してもよいが、間接的に固定してもよい。例えば、前記捕捉用抗体に結合する物質を前記固相に固定し、当該物質に前記捕捉用抗体を結合させることにより、前記補足用抗体を前記固相に間接的に固定することができる。前記捕捉用抗体に結合する物質としては、例えば、上記の二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなどが挙げられるが、これらに制限されない。前記固相への固定には、従来公知の方法を適宜採用することができ、また、前記捕捉用抗体がビオチン化されている場合には、アビジン化した固相を利用することができる。
　前記サンドイッチ法において、ステロイド（検出対象物質）とシクロデキストリンとを含む標準溶液を用いる場合には、例えば、前記標準溶液、本発明の処理液、および固相化した前記捕捉用抗体を混合して、第一抗原抗体反応（第一反応）を行い、前記ステロイドと前記補足用抗体との複合体（免疫複合体）を形成させ、この免疫複合体を分離洗浄後、これに前記標識物質が結合した検出用抗体を添加して、第二抗原抗体反応（第二反応）を行い、前記標識物質に応じて種々の検出を行うことが好ましい。
　前記検出用抗体としては、ステロイドのみに結合する抗体のみならず、ステロイドと抗体の複合体に特異的に結合する抗体を用いることもできる。従って、本発明における「抗ステロイド抗体」には、これら双方の抗体が含まれる。
　前記サンドイッチ法としては、例えば、ＣＬＩＡ法の一態様であるサンドイッチＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法の一態様であるサンドイッチＣＬＥＩＡ法、ＲＩＡ法の一態様であるＩＲＭＡ法（免疫放射定量法）が好適である。
　一方、前記競合法としては、例えば、第一の態様においては、固相化した検出対象物質と試料中の検出対象物質とで、標識物質が結合した検出用抗体への結合を競合させる。ステロイド（検出対象物質）とシクロデキストリンとを含む標準溶液を用いる場合には、例えば、前記標準溶液、本発明の処理液、および前記標識物質が結合した検出用抗体を混合して、第一抗原抗体反応（第一反応）を行い、これに、固相化した前記検出対象物質を添加して、第二抗原抗体反応（第二反応）を行う。
　また、例えば、前記競合法の第二の態様においては、固相化した捕捉用抗体への結合に関して、試料中の検出対象物質と標識物質が結合した検出対象物質とを競合させる。ステロイド（検出対象物質）とシクロデキストリンとを含む標準溶液を用いる場合には、例えば、前記標準溶液、本発明の処理液、および前記標識物質が結合した検出対象物質を混合し、これに固相化した前記捕捉用抗体を添加して、抗原抗体反応を行う。
　前記競合法における検出対象物質や捕捉用抗体の固相への固定には、従来公知の方法を適宜採用することができ、かかる固定は、上記同様、直接的であってもよいが、間接的であってもよい。
　本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法において、本発明の処理液は、前記標準溶液のみならず、前記被検試料に対して添加してもよい。本発明の処理液は、界面活性剤を含むことから、前記被検試料に対しても同様に添加することにより、前記標準溶液と界面活性剤濃度を一致させ、これにより、より近似した条件で抗原抗体反応を行うことができる。また、本発明の処理液としては、検出対象物質とその抗体との抗原抗体反応の反応系に前記界面活性剤の濃度が上記の所望の濃度となるように添加されていればよく、例えば、他の反応系に用いる溶液（前記競合法の第一の態様における標識物質が結合した検出用抗体、前記競合法の第二の態様における標識物質が結合した検出対象物質等）に前記処理液を予め添加して用いてもよく、これらの溶液に前記界面活性剤を予め添加して本発明の処理液を兼ねさせてもよい。
　前記被検試料において得られた測定値からのステロイド濃度の定量は、一般的に、各濃度のステロイドを含む標準溶液による測定値との比較により行う。この場合、例えば、標準溶液による測定値に基づいて作成された標準曲線上のどの位置に、前記被検試料において得られた測定値が位置づけられるかを調べることにより、試料中のステロイド濃度を求めることができる。
　本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法は、ステロイドホルモンの分泌量異常に関連する疾患の診断（罹患やそのリスクの評価）に利用することができる。ここで「ステロイドホルモンの分泌量異常に関連する疾患」には、ステロイドホルモンの分泌量異常に起因する疾患および疾患の発症の結果としてステロイドホルモンの分泌量が異常となる疾患の双方を含む意である。例えば、原発性アルドステロン症、腎血管性高血圧、悪性高血圧、レニン産生腫瘍、バーター症候群、浮腫性疾患（肝硬変・心不全）などでは、血液中のアルドステロン濃度が高値を示し、アジソン病、２１－ヒドロキシラーゼ欠損症、選択的低アルドステロン症などでは、同アルドステロン濃度が低値を示すことが知られている。また、先天性副腎過形成、クッシング症候群、副腎腫瘍などでは、血液中のプロゲステロン濃度が高値を示し、卵巣機能不全、黄体機能不全などでは低値を示すことが知られている。さらに、ビタミンＤ中毒症などでは、血液中の２５－ヒドロキシビタミンＤ濃度が高値を示し、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症などでは低値を示すことが知られている。また、肝疾患、エストロゲン産生腫瘍、先天性副腎皮質過形成、多胎妊娠、卵巣過剰刺激症候群などでは、血液中のエストラジオール濃度が高値を示し、卵巣機能不全、早発卵巣不全、低ゴナドトロピン症、Ｃｈｉａｒｉ－Ｆｒｏｍｍｅｌ症候群などでは、低値を示すことが知られている。
　また、本発明は、上記の本発明のステロイドを免疫学的に定量する方法に用いることができる、ステロイドを免疫学的に定量するためのキットを提供する。本発明のキットは、少なくとも、抗ステロイド抗体（抗体標品）、ステロイドおよびシクロデキストリンを含む標準溶液（標準ステロイド試薬）、および本発明の処理液を含む。さらに、対照試薬、洗浄液、希釈液、希釈用カートリッジなどを組み合わせることができる。また、前記標識物質として酵素標識を利用する場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液などを含めることができる。
　前記サンドイッチ法を検出原理とする場合には、例えば、固相化したステロイド捕捉用抗体、あるいはステロイド捕捉用抗体に結合する物質を固定した固相を含めることができる。一方、前記競合法を検出原理とする場合には、例えば、これら固相の他、固相化した検出対象物質、あるいは検出対象物質に結合する物質を固定した固相を含めることができる。
　また、一次抗体（抗原に直接結合する抗体）や二次抗体を標識しない場合には、例えば、これらの抗体に結合する物質を標識したものをキットに含めることができる。また、抗ステロイド抗体がビオチン化されている場合には、例えば、アビジン化された標識物質をキットに含めることができる。本発明のキットには、さらに、当該キットの使用説明書を含めることができる。
　本発明のキットは、研究用としてのみならず、例えば、体外診断用医薬品として、上記ステロイドホルモンの分泌量異常に関連する疾患の診断の基礎となるステロイド濃度の定量に利用することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例の各組成において、「％」は「重量％」を示す。
　（実施例１）
　［実施例１－１］　アルドステロンに対するシクロデキストリンの包接効果の検証
　本実施例では、抗原としてアルドステロンを、標準溶液として緩衝液ベースのものを用いた。具体的には、まず、０％、１％、３％濃度のシクロデキストリン（αシクロデキストリン（αＣＤ）、βシクロデキストリン（βＣＤ）、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、γシクロデキストリン（γＣＤ））をそれぞれ添加した希釈液にアルドステロンを添加した約５００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液（標準溶液）を調製した。前記希釈液のベース組成は、「５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＮａＮ３」とした。
　測定は、各アルドステロン溶液について、抗アルドステロン抗体結合粒子（従来法で調製した抗アルドステロン抗体結合磁性粒子（抗体結合粒子））およびアルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン免疫複合体抗体（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン抗体（酵素標識抗体））を用いた２ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｆ）の工程で行った。
（ａ）抗体結合粒子約５０μＬに試料（前記アルドステロン溶液）約３０μＬを加えて攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第一反応）。
（ｂ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｃ）酵素標識抗体約５０μＬを加え攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第二反応）。
（ｄ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｅ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で４分間反応させる（酵素反応）。
（ｆ）前記基質の分解に伴って放出される波長４６３ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図１に、シクロデキストリン濃度が０％のアルドステロン溶液を用いた際の発光量（０％　ＣＤ）を１００％としたときの、各シクロデキストリン濃度が１％または３％のアルドステロン溶液を用いた際の発光量の割合（発光量比［対０％　ＣＤ］）を示す。その結果、αＣＤの添加では発光量がほぼ変わらなかったが、他のシクロデキストリン（βＣＤ、ＨＰβＣＤ、γＣＤ）の添加により発光量が低下したことから、アルドステロンが包接されたと考えられた（図１）。シクロデキストリンの種類により、同一濃度において発光量低下率が異なることから、αＣＤ＜βＣＤ＜ＨＰβＣＤ＜γＣＤの順で包接作用が強いと考えられた。
　［実施例１－２］　アルドステロンに対するＨＰβＣＤの安定化効果の検証
　本実施例では、抗原としてアルドステロンを、標準溶液として緩衝液ベースのものを用いた。具体的には、まず、０．１％、１％濃度のＨＰβＣＤを添加した希釈液にアルドステロンを添加した約３００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液（標準溶液）を調製した。前記希釈液のベース組成は、「１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％　ＢＳＡ、０．１％　ＮａＮ３」とした。
　得られた各アルドステロン溶液（約３００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液）は、－８０℃、４℃、２５℃、３７℃でそれぞれ４５日間保存後に測定に供した。測定は、各保存後のアルドステロン溶液について、抗アルドステロン抗体結合粒子（従来法で調製した抗アルドステロン抗体結合磁性粒子（抗体結合粒子））およびアルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン免疫複合体抗体（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン抗体（酵素標識抗体））を用いた２ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｆ）の工程で行った。
（ａ）抗体結合粒子約２５０μＬに試料（前記アルドステロン溶液）約４０μＬを加えて攪拌し、３７℃で１０分間反応させる（第一反応）。
（ｂ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｃ）酵素標識抗体約２５０μＬを加え攪拌し、３７℃で１０分間反応させる（第二反応）。
（ｄ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｅ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で５分間反応させる（酵素反応）。
（ｆ）前記基質の分解に伴って放出される波長４４７ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図２に、－８０℃で４５日間保存後のアルドステロン溶液を用いた際の発光量を１００％としたときの、４℃、２５℃、３７℃で各４５日間保存後のアルドステロン溶液をそれぞれ用いた際の発光量の割合（発光量比［対－８０℃］）を示す。その結果、ＨＰβＣＤ濃度が高い方が、温度負荷のかかった状態での測定値変動が小さいことから、ＨＰβＣＤは標準溶液の安定性に寄与すると考えられた（図２）。
　［実施例１－３］　ＨＰβＣＤからのアルドステロンの脱包接効果－１
　本実施例では、抗原としてアルドステロンを、標準溶液として緩衝液ベースのものを用いた。具体的には、まず、下記の標準液希釈液（ＨＰβＣＤあり）にアルドステロンを添加して約１６００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液（１６００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液）を、下記の脱脂血清を擬似被検試料希釈液とし、これにアルドステロンを添加して約１６００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液（１６００ｐｇ／ｍＬ検体（擬似被検試料））を、それぞれ調製した。前記標準液希釈液（ＨＰβＣＤあり）としては、「５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＨＰβＣＤ、０．１％　ＮａＮ３」を用い、前記脱脂血清としては、「ＤＤＣ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔ　Ｇｏｌｄ（ステロイド系ホルモンおよびコレステロール・ＴＧがフリーな血清、株式会社ベリタス製）」を用いた。
　また、下記の処理液のベース組成に、１２種類の界面活性剤［デオキシコール酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬工業株式会社製）、ＮＬＳ（ナカライテスク株式会社製）、Ｃ１２ＴＡＢ（東京化成工業株式会社製）、Ｃ２ＡＰＳ（東京化成工業株式会社製）、Ｃ８ＡＰＳ（東京化成工業株式会社製）、Ｃ１２ＡＰＳ（東京化成工業株式会社製）、ＣＨＡＰＳ（（株）同仁化学研究所製）、Ｔｗｅｅｎ２０（富士フイルム和光純薬工業株式会社製）、Ｔｗｅｅｎ８０（富士フイルム和光純薬工業株式会社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（ナカライテスク株式会社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ＭＥＧＡ８（（株）同仁化学研究所製）］をそれぞれ添加した、または添加しない処理液を調製した。前記処理液のベース組成は、「２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＮａＮ３」とした。各処理液における界面活性剤の濃度は、デオキシコール酸ナトリウムは１．２％、それ以外はそれぞれ２％とした。
　測定は、各試料（１６００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液または１６００ｐｇ／ｍＬ検体）について、抗アルドステロン抗体結合粒子（従来法で調製した抗アルドステロン抗体結合磁性粒子（抗体結合粒子））、アルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン免疫複合体抗体（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン抗体（酵素標識抗体））、および前記各処理液を用いた特殊２ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｆ）の工程で行った。
（ａ）抗体結合粒子約５０μＬおよび処理液約２０μＬに試料約３０μＬを加えて攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第一反応）。
（ｂ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｃ）酵素標識抗体約５０μＬを加え攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第二反応）。
（ｄ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｅ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で４分間反応させる（酵素反応）。
（ｆ）前記基質の分解に伴って放出される波長４６３ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図３に、前記処理液として界面活性剤を添加しない処理液（界面活性剤（－））を用い、かつ前記試料として１６００ｐｇ／ｍＬ検体を用いた際の発光量（対照）を１００％としたときの、各処理液を用い、かつ前記試料として１６００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液または１６００ｐｇ／ｍＬ検体を用いた際の発光量の割合（発光量比［対対照］）を示す。その結果、脱包接効果（１６００ｐｇ／ｍＬ検体の反応性は変えず、１６００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液の反応性を上げる効果）のある界面活性剤は、ステロイド骨格を有するデオキシコール酸ナトリウムおよびＣＨＡＰＳ、炭素数８のアルキル基を有するＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５、およびＣ８ＡＰＳ、ならびに炭素数８のアシル基を有するＭＥＧＡ８であることが確認された（図３中の星印）。
　［実施例１－４］　ＨＰβＣＤからのアルドステロンの脱包接効果－２
　本実施例では、抗原としてアルドステロンを、標準溶液として血清ベースのものを用いた。具体的には、まず、－ＨＰβＣＤの脱脂血清（ＤＤＣ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔ　Ｇｏｌｄ）にアルドステロンを添加して約２０００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液（２０００ｐｇ／ｍＬ検体（擬似被検試料））を、および＋ＨＰβＣＤの脱脂血清（前記－ＨＰβＣＤの脱脂血清にＨＰβＣＤを１％濃度となるように添加したもの）にアルドステロンを添加して約２０００ｐｇ／ｍＬアルドステロン溶液（２０００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液）を、それぞれ調製した。
　また、下記の処理液のベース組成に、実施例１－３で用いたうちの５種類の界面活性剤（Ｃ１２ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５、ＭＥＧＡ８）をそれぞれ添加した、または添加しない処理液を調製した。前記処理液のベース組成は、「２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＮａＮ３」とした。各処理液における界面活性剤の濃度は、それぞれ３％とした。
　測定は、各試料（２０００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液または２０００ｐｇ／ｍＬ検体）について、抗アルドステロン抗体結合粒子（従来法で調製した抗アルドステロン抗体結合磁性粒子（抗体結合粒子））、アルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン免疫複合体抗体（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識抗アルドステロン抗体（酵素標識抗体））、および前記各処理液を用いた特殊２ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｆ）の工程で行った。
（ａ）抗体結合粒子約５０μＬおよび処理液約３０μＬに試料約３０μＬを加えて攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第一反応）。
（ｂ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｃ）酵素標識抗体約５０μＬを加え攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第二反応）。
（ｄ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｅ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で４分間反応させる（酵素反応）。
（ｆ）前記基質の分解に伴って放出される波長４６３ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図４に、前記処理液として界面活性剤を添加しない処理液（界面活性剤（－））を用い、かつ前記試料として２０００ｐｇ／ｍＬ検体を用いた際の発光量（対照）を１００％としたときの、各処理液を用い、かつ前記試料として２０００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液または２０００ｐｇ／ｍＬ検体を用いた際の発光量の割合（発光量比［対対照］）を示す。その結果、脱包接効果（２０００ｐｇ／ｍＬ検体の反応性は変えず、２０００ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液の反応性を上げる効果）のある界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５、ＭＥＧＡ８であることが確認された（図４中の星印）。これにより、血清ベースの標準溶液でも、実施例１－３で示した緩衝液ベース標準溶液における結果と同様の結果が得られることが示された。
　（実施例２）　ＨＰβＣＤからのプロゲステロンの脱包接効果
　アルドステロンの場合と同様に、プロゲステロンでも特定の界面活性剤種によってＨＰβＣＤからの脱包接が促進されることの確認を行った。
　本実施例においては、測定系として、１ステップ競合法を採用した。当該競合法においては、実施例１－１～１－４の２ステップ法（非競合法）とは対照的に、界面活性剤の作用により、ＨＰβＣＤからのステロイドの脱包接が促進されると、標識抗体が抗原結合粒子に結合できなくなるため、より発光量が下がることになる。
　具体的には、抗原としてプロゲステロンを、標準溶液として緩衝液ベースのものを用い、まず、下記の標準液希釈液（実施例１－３の標準液希釈液と同一組成）にプロゲステロンを２０ｎｇ／ｍＬ添加した２０ｎｇ／ｍＬプロゲステロン溶液（標準溶液）およびプロゲステロンを添加しないコントロール溶液を調製した。標準液希釈液としては、「５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ＨＰβＣＤ、０．１％　ＮａＮ３」を用いた。
　別途の処理液は用いず、界面活性剤を用いた条件では、下記の酵素標識抗体に対し、次の界面活性剤をそれぞれ０．２％濃度となるように添加した。前記界面活性剤としては、実施例１－３で用いたうちのＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｃ８ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＥＧＡ８、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５、およびデオキシコール酸ナトリウム、ならびに、Ｂｒｉｊ５８（ＩＣＩ製）およびＣ１６ＡＰＳ（東京化成工業株式会社製）をそれぞれ用いた。
　測定は、各試料（各標準溶液（２０ｎｇ／ｍＬプロゲステロン）および各コントロール溶液（０ｎｇ／ｍＬプロゲステロン）について、アルカリホスファターゼ標識抗プロゲステロン抗体（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識抗プロゲステロン抗体（酵素標識抗体））、およびプロゲステロン結合粒子（従来法で調製したプロゲステロン結合磁性粒子（抗原結合粒子））を用いたディレイ１ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｆ）の工程で行った。
（ａ）酵素標識抗体約５０μＬに試料約１０μＬを加えて攪拌し、３７℃で１１分間反応させる（第一反応）。
（ｂ）抗原結合粒子約５０μＬを加え攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第二反応）。
（ｃ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離、洗浄を行う。       
（ｄ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で４分間反応させる（酵素反応）。
（ｅ）前記基質の分解に伴って放出される波長４６３ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図５に、界面活性剤を用いない条件（界面活性剤（－））での標準溶液を用いた際の発光量とコントロール溶液を用いた際の発光量との比（標準溶液／コントロール溶液；対照）を１００％としたときの、各界面活性剤を用いた条件での標準溶液を用いた際の発光量とコントロール溶液を用いた際の発光量との比の割合（発光量比［対対照］）を示す。その結果、ＭＥＧＡ８およびＣＨＡＰＳでは特に発光量が下がり、１ステップ競合法におけるＨＰβＣＤからのステロイドの脱包接の効果が認められ、特にＭＥＧＡ８の効果が高かった（図５）。なお、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５およびデオキシコール酸ナトリウムは反応系そのものに悪影響を及ぼしたことが示唆された。プロゲステロン測定系で効果のあった界面活性剤は、アルドステロン測定系（実施例１－３～１－４）で効果があったものと重複していた。
　（実施例３）　γＣＤからの２５－ヒドロキシビタミンＤの脱包接効果
　本実施例では、抗原として２５－ヒドロキシビタミンＤを、標準溶液として緩衝液ベースのものを、シクロデキストリンとしてγＣＤを、それぞれ用いた。具体的には、まず、下記の標準液希釈液（γＣＤなし）に２５－ヒドロキシビタミンＤを添加して約５０ｎｇ／ｍＬ　２５－ヒドロキシビタミンＤ溶液（５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液）を、前記標準液希釈液にγＣＤを０．３％濃度となるように添加したものに２５－ヒドロキシビタミンＤを添加して約５０ｎｇ／ｍＬ　２５－ヒドロキシビタミンＤ溶液（５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液）を、それぞれ調製した。前記標準液希釈液（γＣＤなし）としては、「５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　ＮａＮ３」を用いた。
　また、下記の処理液のベース組成に、実施例１で用いたうちの８種類の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０、Ｂｒｉｊ５８、Ｃ８ＡＰＳ、Ｃ１６ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＥＧＡ８、ＴｒｉｔｏｎＸ７０５、デオキシコール酸ナトリウム）をそれぞれ添加した、または添加しない処理液を調製した。前記処理液のベース組成は、「５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、４．５％　ＢＳＡ、０．１％　ＮａＮ３」とした。各処理液における界面活性剤の濃度は、それぞれ０．５％とした。
　測定は、各試料（５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液または５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液）について、抗２５－ヒドロキシビタミンＤ抗体結合粒子（従来法で調製した抗２５－ヒドロキシビタミンＤ抗体結合磁性粒子（抗体結合粒子））、アルカリホスファターゼ標識抗２５－ヒドロキシビタミンＤ免疫複合体抗体（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識抗２５－ヒドロキシビタミンＤ抗体（酵素標識抗体））、および前記処理液を用いた特殊２ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｇ）の工程で行った。
（ａ）試料約１０μＬと処理液約１９０μＬとを混合して２０倍に希釈した希釈試料を得る（前処理／希釈）。
（ｂ）抗体結合粒子約５０μＬに前記希釈試料約２０μＬを加えて攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第一反応）。
（ｃ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｄ）酵素標識抗体約５０μＬを加え攪拌し、３７℃で８分間反応させる（第二反応）。
（ｅ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｆ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）液約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で４分間反応させる（酵素反応）。
（ｇ）前記基質の分解に伴って放出される波長４６３ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図６に、前記処理液として界面活性剤を添加しない処理液（界面活性剤（－））を用い、かつ前記試料として５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液を用いた際の発光量（対照）を１００％としたときの、各処理液を用い、かつ前記試料として５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液または５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液を用いた際の発光量の割合（発光量比［対対照］）を示す。その結果、ＣＨＡＰＳおよびＭＥＧＡ８には特に、脱包接効果（５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液の発光量（反応性）を上げ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液の発光量のとの乖離を抑制する効果）が認められた（図６中の星印）。他方、Ｂｒｉｊ５８、Ｃ８ＡＰＳ、およびＣ１６ＡＰＳでは、５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液と５０ｎｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液との発光量の乖離を抑制することが確認されたが、反応系そのものに悪影響を及ぼし、一次反応が阻害されて発光量が低下してしまうことが示唆された。
　（実施例４）　ＨＰβＣＤからのエストラジオールの脱包接効果
　本実施例においては、測定系として、実施例２の１ステップ競合法の別法を採用した。当該競合法においては、界面活性剤の作用により、ＨＰβＣＤからのステロイドの脱包接が促進され、かつ、標識抗原の量に対する試料中のステロイドの量自体が多くなると、標識抗原が抗体結合粒子に結合できなくなるため、より発光量が下がることになる。
　また、本実施例では、抗原としてエストラジオール（Ｅ２）を、標準溶液として緩衝液ベースのものを、シクロデキストリンとしてＨＰβＣＤを、それぞれ用いた。具体的には、まず、下記の標準液希釈液（ＨＰβＣＤなし）を「０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液（コントロール）」とし、これにエストラジオールを添加して約５０ｐｇ／ｍＬエストラジオール溶液（５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液）を、前記標準液希釈液にＨＰβＣＤを０．２％濃度となるように添加したものを「０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液（コントロール）」とし、これにエストラジオールを添加して約５０ｐｇ／ｍＬエストラジオール溶液（５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液）を、それぞれ調製した。前記標準液希釈液（ＨＰβＣＤなし）としては、「５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５％　ＢＳＡ、０．１％　ＮａＮ３」を用いた。
　また、別途の処理液は用いず、界面活性剤を用いた条件では、下記の酵素標識抗原に対し、次の界面活性剤をそれぞれ１．０％濃度となるように添加した。前記界面活性剤としては、実施例１で用いたうちのＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｂｒｉｊ５８、Ｃ８ＡＰＳ、Ｃ１６ＡＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＭＥＧＡ８、およびＴｒｉｔｏｎＸ７０５をそれぞれ用いた。
　測定は、各試料（０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液、５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液、０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液、５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液）について、抗Ｅ２抗体結合粒子（従来法で調製した抗Ｅ２抗体結合磁性粒子（抗体結合粒子））およびアルカリホスファターゼ標識Ｅ２（従来法で調製したアルカリホスファターゼ標識Ｅ２（酵素標識抗原））を用いた１ステップ法で実施した。詳しくは、以下の（ａ）～（ｄ）の工程で行った。
（ａ）抗体結合粒子約５０μＬ、試料約２０μＬ、酵素標識抗原約５０μＬを順次加えて攪拌し、３７℃で１９分間反応させる。
（ｂ）磁気分離器を使用してＢ／Ｆ分離し、洗浄を行う。
（ｃ）ＡＭＰＰＤ（基質、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１、２－ジオキセタン・２ナトリウム塩）液約２００μＬを加え攪拌し、３７℃で４分間反応させる（酵素反応）。
（ｄ）前記基質の分解に伴って放出される波長４６３ｎｍ付近に発光極大ピークをもつ光の発光量を測定する。
　図７Ａに、界面活性剤を用いない条件（界面活性剤（－））で０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液を用いた際の発光量（対照）を１００％としたときの、各界面活性剤を用いた条件または用いない条件で０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液または０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液を用いた際の発光量の割合（発光量比［対対照］）を示し、図７Ｂに、界面活性剤を用いない条件（界面活性剤（－））で５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液を用いた際の発光量（対照）を１００％としたときの、界面活性剤を用いた条件または用いない条件で５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（－）標準溶液または５０ｐｇ／ｍＬ　ＣＤ（＋）標準溶液を用いた際の発光量の割合（発光量比［対対照］）を示す。
　その結果、図７Ａと図７Ｂとではほぼ同様の外形のグラフとなり、また、ＭＥＧＡ８およびＣＨＡＰＳでは界面活性剤を用いない条件からの発光量の低下が抑制され、かつ、シクロデキストリン添加（ＣＤ（＋））と無添加（ＣＤ（－））との間の発光量の乖離も抑制され、ＨＰβＣＤからのステロイドの脱包接の効果が認められた（図７Ａ、図７Ｂの星印）。また、Ｃ８ＡＰＳおよびＴｒｉｔｏｎＸ７０５では、シクロデキストリン添加と無添加との間の発光量の乖離は抑制されたが、界面活性剤の添加により反応系そのものに悪影響を及ぼしたことが示唆された（図７Ａ）。エストラジオール測定系で効果のあった界面活性剤は、アルドステロン測定系（実施例１－３～１－４）、プロゲステロン測定系（実施例２）、２５－ヒドロキシビタミンＤ（実施例３）で効果があったものと重複していた。
　以上説明したように、本発明によれば、被検試料と標準溶液とにおける抗原抗体反応の挙動の乖離を抑制し、被検試料中のステロイド濃度を高い精度で定量することが可能となる。ステロイド活性は、様々な疾患と関連することから、本発明は、研究上の利用にとどまらず、疾患の診断においても大きく貢献しうるものである。

Claims (9)

  1. 　界面活性剤を有効成分とする、シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液。
  2. 　前記界面活性剤が、炭素数８のアシル基もしくはアルキル基を有するか、またはステロイド骨格を有する、請求項１に記載の処理液。
  3. 　前記界面活性剤が、下記（ａ）から（ｅ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の処理液。
    （ａ）オクタノイル基およびグルカミン基を有する界面活性剤
    （ｂ）オクチル基およびポリオキシエチレン基を有する界面活性剤
    （ｃ）オクチル基、スルホネート基、およびアンモニウム基を有する界面活性剤
    （ｄ）ステロイド骨格、スルホネート基、およびアンモニウム基を有する界面活性剤
    （ｅ）ステロイド骨格およびカルボキシレート基を有する界面活性剤
  4. 　前記界面活性剤が、Ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチルグルカミン、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、Ｎ－オクチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルフォネート、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルフォネート、およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項３に記載の処理液。
  5. 　前記シクロデキストリンが、βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、およびγシクロデキストリンからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１～４のいずれかに記載の処理液。
  6. 　前記ステロイドが、アルドステロン、プロゲステロン、２５－ヒドロキシビタミンＤ、およびエストラジオールからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１～５のいずれかに記載の処理液。
  7. 　ステロイドおよびシクロデキストリンを含むステロイドの免疫学的な定量のための標準溶液において、前記シクロデキストリンに包接された前記ステロイドの脱包接に用いるための、請求項１～７のいずれかに記載の処理液。
  8. 　ステロイドを免疫学的に定量する方法であって、
    　被検試料、およびステロイドとシクロデキストリンとを含む標準溶液のそれぞれに抗ステロイド抗体を反応させ、前記被検試料および前記標準溶液における抗原抗体反応のシグナル強度をそれぞれ測定し、前記被検試料におけるシグナル強度と前記標準溶液におけるシグナル強度とを比較することを含み、
    　前記標準溶液における抗原抗体反応の反応系に、請求項７に記載の処理液が添加されている方法。
  9. 　ステロイドを免疫学的に定量するためのキットであって、少なくとも下記（ａ）～（ｃ）を含むキット。
    （ａ）抗ステロイド抗体
    （ｂ）ステロイドおよびシクロデキストリンを含む標準溶液
    （ｃ）請求項７の処理液
PCT/JP2018/042415 2017-11-17 2018-11-16 シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液 WO2019098314A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18878307.0A EP3712614B1 (en) 2017-11-17 2018-11-16 Treatment liquid for use in desorption of steroid included in cyclodextrin
US16/765,018 US11604199B2 (en) 2017-11-17 2018-11-16 Treatment liquid for exclusion of steroid included in cyclodextrin
JP2019554301A JP7194114B2 (ja) 2017-11-17 2018-11-16 シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液
CN201880051452.9A CN111051883B (zh) 2017-11-17 2018-11-16 在包合于环糊精的类固醇的脱包合中使用的处理液

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017222240 2017-11-17
JP2017-222240 2017-11-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019098314A1 true WO2019098314A1 (ja) 2019-05-23

Family

ID=66539607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/042415 WO2019098314A1 (ja) 2017-11-17 2018-11-16 シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11604199B2 (ja)
EP (1) EP3712614B1 (ja)
JP (1) JP7194114B2 (ja)
CN (1) CN111051883B (ja)
WO (1) WO2019098314A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021085617A1 (ja) 2019-11-01 2021-05-06 富士レビオ株式会社 尿検体中ステロイド測定方法、並びに、それに用いるための尿検体中ステロイド測定用キット及び中和液
WO2021100459A1 (ja) * 2019-11-20 2021-05-27 東ソー株式会社 抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定法
WO2021182555A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 アルドステロン検出用抗体及びアルドステロンの免疫測定方法
WO2021182558A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 試料中の対象物質を免疫測定するための方法及びキット
JP7434824B2 (ja) 2019-11-20 2024-02-21 東ソー株式会社 抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6485081A (en) * 1987-04-06 1989-03-30 Microgenics Corp Stabilization of reagent in enzyme-supplier and receiver assay
JPH04326046A (ja) * 1991-04-25 1992-11-16 Iatron Lab Inc 生体成分測定方法及び測定用試薬キット
WO1997005491A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Abbott Laboratories Stabilized aqueous steroid immunoassay standards with cyclodextrins
JP2005503534A (ja) * 2001-01-16 2005-02-03 クエスト ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ビタミンｄアッセイ
US20080194784A1 (en) * 2006-11-29 2008-08-14 Man Ho Choi Entrapped Beta-Cyclodextrin Polymer and a Method of Preparing the Same
JP2011117779A (ja) * 2009-12-01 2011-06-16 Tosoh Corp 血液中のステロイドホルモン又はビタミン類の測定法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4454885B2 (ja) * 2001-05-21 2010-04-21 アルフレッサファーマ株式会社 免疫測定方法およびそのための試薬
JP4879067B2 (ja) * 2007-03-30 2012-02-15 シスメックス株式会社 免疫測定用検体前処理液、免疫測定用試薬キット及び免疫測定方法
BR112013027242A2 (pt) * 2011-05-10 2016-11-29 Danisco Us Inc anidrases carbônicas termoestáveis e métodos de uso das mesmas
JP6040595B2 (ja) * 2012-07-02 2016-12-07 東ソー株式会社 ハプテン標準液およびそれを含むハプテン定量試薬
JP6331413B2 (ja) * 2014-01-21 2018-05-30 東ソー株式会社 試料の調製方法及びビタミン類の免疫測定方法
JP6026595B2 (ja) * 2015-06-08 2016-11-16 積水メディカル株式会社 ＨｂＡ１ｃの免疫学的測定方法
JP6934587B2 (ja) 2016-02-05 2021-09-15 ミナリスメディカル株式会社 検体中のステロイドホルモンの測定方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6485081A (en) * 1987-04-06 1989-03-30 Microgenics Corp Stabilization of reagent in enzyme-supplier and receiver assay
JPH04326046A (ja) * 1991-04-25 1992-11-16 Iatron Lab Inc 生体成分測定方法及び測定用試薬キット
WO1997005491A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Abbott Laboratories Stabilized aqueous steroid immunoassay standards with cyclodextrins
JPH11510598A (ja) * 1995-07-27 1999-09-14 アボツト・ラボラトリーズ シクロデキストリン類を用い安定化した水性ステロイド免疫検定スタンダード
JP2005503534A (ja) * 2001-01-16 2005-02-03 クエスト ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ビタミンｄアッセイ
US20080194784A1 (en) * 2006-11-29 2008-08-14 Man Ho Choi Entrapped Beta-Cyclodextrin Polymer and a Method of Preparing the Same
JP2011117779A (ja) * 2009-12-01 2011-06-16 Tosoh Corp 血液中のステロイドホルモン又はビタミン類の測定法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3712614A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021085617A1 (ja) 2019-11-01 2021-05-06 富士レビオ株式会社 尿検体中ステロイド測定方法、並びに、それに用いるための尿検体中ステロイド測定用キット及び中和液
WO2021100459A1 (ja) * 2019-11-20 2021-05-27 東ソー株式会社 抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定法
EP4063514A4 (en) * 2019-11-20 2023-11-01 Tosoh Corporation MEASUREMENT METHOD USING AN ANTI-IMMUNOCOMPLEX ANTIBODY
JP7434824B2 (ja) 2019-11-20 2024-02-21 東ソー株式会社 抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定方法
WO2021182555A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 アルドステロン検出用抗体及びアルドステロンの免疫測定方法
WO2021182558A1 (ja) * 2020-03-12 2021-09-16 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 試料中の対象物質を免疫測定するための方法及びキット

Also Published As

Publication number Publication date
US20200355705A1 (en) 2020-11-12
JPWO2019098314A1 (ja) 2020-10-01
US11604199B2 (en) 2023-03-14
EP3712614B1 (en) 2024-03-06
JP7194114B2 (ja) 2022-12-21
CN111051883A (zh) 2020-04-21
EP3712614A1 (en) 2020-09-23
EP3712614A4 (en) 2020-12-23
CN111051883B (zh) 2024-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019098314A1 (ja) シクロデキストリンに包接されたステロイドの脱包接に用いるための処理液
US10948484B2 (en) Sample depletion and enrichment to improve the quality of diagnostic test results
JP6750066B2 (ja) ビタミンｄ結合タンパク質からビタミンｄを解離するための溶液、その関連検出法及び使用
KR101840525B1 (ko) 비타민 d 의 측정 방법 및 측정용 키트
JP7177767B2 (ja) ビタミンｄをアッセイするための方法および組成物
EP3514539A1 (en) Cardiac troponin assay method and assay reagent
JPH01254868A (ja) 超高感度抗原物質の測定法
Liu et al. Development and evaluation of a rapid lateral flow immunochromatographic strip assay for screening 19‐nortestosterone
IL95083A (en) Determination of a protein receptor of 1,52-dihydroxy vitamin D.
CN109324194B (zh) 测定糖类抗原72-4的试剂组合
JP5332011B2 (ja) Ｂ型肝炎ウイルスの高感度免疫学的分析方法及び免疫学的分析用試薬
CN110133271B (zh) 一种将抗体或其抗原结合片段共价结合至颗粒表面的方法
JP6934587B2 (ja) 検体中のステロイドホルモンの測定方法
EP4053555A1 (en) Method for measuring steroid in urine sample, and kit for measuring steroid in urine sample and neutralization solution both for use in said method
JP2020076668A (ja) Ｃａ１９−９測定方法及びｃａ１９−９測定キット、並びに、これらに用いる抗体固定化担体及びその製造方法
JPH0727764A (ja) Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬
JPH0829420A (ja) 免疫反応干渉作用の除去方法
JP3451942B2 (ja) 標準液及び免疫測定方法
JP3175822B2 (ja) ハプテンの免疫学的測定法
JP6210568B2 (ja) 高精度な免疫学的測定法
JP2017173266A (ja) 抗サイログロブリン抗体測定免疫反応試薬の製造方法
JPH06102275A (ja) ステロイドホルモンの測定方法
NAMBARA et al. A Simple Radioimmunoassay for Estrone Sulfate in Unextracted Plasma without Deconjugation 1
Wheeler et al. Immunoassay of steroids
JPH11194127A (ja) ハプテン抗原結合固相及びそれを用いた免疫測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18878307

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019554301

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018878307

Country of ref document: EP

Effective date: 20200617