WO2021100459A1 - 抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定法 - Google Patents

抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定法 Download PDF

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WO2021100459A1
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hapten
monoclonal antibody
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immunocomplex
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武藤悠
三澤孝一
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東ソー株式会社
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    • G01N2470/06—Second binding partner specifically binding complex of analyte with first binding partner

Definitions

  • the present invention relates to a measurement method using an anti-immunocomplex antibody.
  • Hapten which is a low molecular weight compound, is usually measured by an immunoassay method called a competitive method.
  • the competitive method is a method in which a hapten contained in a sample and a labeled hapten labeled with a radioisotope or an enzyme are competitively reacted with a certain amount of anti-hapten antibody. As the amount of hapten contained in the sample increases, the amount of labeled hapten binding to the anti-hapten antibody decreases. From this, the amount of hapten contained in the sample can be estimated based on the ratio of the labeled hapten binding to the anti-hapten antibody.
  • the measurement sensitivity in the competitive method depends on the affinity constant of the anti-hapten antibody used. However, it is difficult to obtain an anti-hapten antibody having a high affinity constant, and therefore it is extremely difficult to measure a very small amount of hapten (Non-Patent Document 1).
  • a non-competitive immunoassay method using an anti-immunocomplex antibody has been proposed as a measurement method that can solve the problem of immunoassay by such a competitive method.
  • the hapten measurement system using the anti-immunocomplex antibody is carried out by, for example, the method shown below, and the hapten contained in the sample can be measured without competing methods.
  • the sample containing the target hapten and the enzyme-labeled anti-hapten antibody are mixed and then added to (1).
  • Excessive amount of labeled anti-hapten antibody is washed and separated.
  • a substrate for the labeling enzyme is added, and a signal derived from the reaction between the enzyme and the substrate is detected. Since the anti-immunocomplex antibody selectively binds to an immune complex consisting of a hapten and an anti-hapten antibody, an increase in signal is observed as the amount of hapten contained in the sample increases.
  • the estradiol (E2) measurement system as shown in Patent Document 1 can be mentioned.
  • the technique disclosed in Patent Document 1 is a method in which an enzyme-labeled anti-E2 antibody and a solution to be measured containing E2 are mixed in advance by a conventional method, and then the anti-immunocomplex antibody is reacted with an immobilized carrier.
  • an anti-immunocomplex mouse monoclonal antibody is immobilized on a solid-phase carrier. Since the reaction between the antibody immobilized on the solid phase and the antigen proceeds in a heterogeneous system called the solid-liquid interface, the reaction efficiency is low (Non-Patent Document 2).
  • a mouse monoclonal antibody having a low affinity is used as a solid phase, the reaction at the solid-liquid interface becomes a bottleneck, and it is considered that the overall reaction efficiency is lowered.
  • Non-Patent Document 1 measurement in which a labeled anti-hapten antibody and a measurement target are first mixed, and then the immune complex is reacted with an anti-immunocomplex antibody immobilized on a solid phase carrier.
  • the system is a 1-STEP measurement in which the cleaning step is one step.
  • 1STEP measurement there is an example in which a false high value or a false low value due to the presence of a coexisting substance in the liquid to be measured is reported.
  • An object of the present invention is to provide a measuring method capable of increasing the reaction efficiency in a measuring system using an anti-immunocomplex antibody.
  • the present invention made in view of the above problems includes the following aspects.
  • a method including the following steps (i) to (iii): (I) A step of reacting an anti-hapten rabbit monoclonal antibody immobilized on a water-insoluble carrier with a hapten in a solution to be measured. (Ii) A step of reacting a labeled anti-immunocomplex antibody with an immune complex of a hapten-anti-hapten rabbit monoclonal antibody. (Iii) A step of detecting a signal derived from a label.
  • Steps (i), (ii) and (iii) are performed in this order, and a cleaning step is performed between steps (i) and (ii) and between steps (ii) and (iii), respectively.
  • (3) The method according to (1) or (2), wherein the anti-immunocomplex antibody is a mouse monoclonal antibody.
  • (4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the label is alkaline phosphatase.
  • the method according to any one of (1) to (4), wherein the hapten is estradiol, thyroxine or digoxin.
  • step (i) is carried out in the presence of an absorbing antibody.
  • the hapten in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance having a small molecular weight as usually measured by a competitive method.
  • triiodothyronine, thyroxine, 3,5-diiodo-L- Examples thereof include thyroid hormones such as tyronine, steroid hormones such as estron, estradiol (E2), estriol, progesterone and cortisol, and steroid glycosides such as thyroxine (Dig).
  • steroid hormones and steroid glycosides are preferable, and among them, E2 and Dig are more preferable.
  • the thyroid hormones thyroxine is preferable.
  • the solution to be measured is not particularly limited as long as it contains a hapten to be measured.
  • human blood whole blood, plasma, serum, etc.
  • body fluids such as urine are preferable.
  • Anti-immunocomplex antibody is neither an antibody against a hapten nor an antibody against an antibody against a hapten, but an antibody against a complex of a hapten and an antibody against it.
  • the anti-immunocomplex antibody is preferably obtained from an animal species other than rabbit from the viewpoint of obtaining a specific antibody against a complex of an anti-hapten rabbit monoclonal antibody and a hapten. Examples of animal species include mice, rats, goats, and sheep. In the present invention, it is particularly preferable to obtain an anti-immunocomplex monoclonal antibody from a mouse.
  • a rabbit monoclonal antibody is used as the anti-hapten antibody.
  • the reason is that a rabbit monoclonal antibody can be obtained having a high affinity for a hapten as compared with a mouse monoclonal antibody.
  • the affinity dissociation constant (KD) is 10 -10 (M) or less, more is preferably 10 -11 (M) or less.
  • an anti-hapten antibody is used as a solid phase antibody, it is essential to use a rabbit monoclonal antibody having a high affinity for the antibody.
  • a solid-phase surface antibody As described in Non-Patent Document 4, even if an antigen once bound to a solid-phase surface antibody is temporarily dissociated by a washing operation or the like, if it is a protein (polymer) having a slow diffusion rate, it is a solid substance in the vicinity. It is possible to recombine with a phase antibody.
  • the antigen in the present invention is a low-molecular-weight hapten, once dissociated from the antibody by a washing operation or the like, the diffusion rate is high and recombination with the antibody on the solid phase surface is unlikely to occur.
  • in the present invention in order to prevent the hapten from dissociating from the solid phase antibody, it is essential to use a high affinity rabbit monoclonal antibody as the solid phase antibody.
  • the water-insoluble carrier is not particularly limited, and for example, fine particles such as resin, glass, and polystyrene, particles, beads, and a plate are used.
  • the water-insoluble carrier is immobilized with an anti-hapten rabbit monoclonal antibody.
  • the method of immobilization is not particularly limited, and may be immobilized directly or indirectly (for example, via an avidin-biotin bond or the like).
  • labeling is not particularly limited, but for example, enzymes, radioisotopes, dyes and the like are used.
  • enzymes alkaline phosphatase or the like can be preferably used.
  • the label is bound to an anti-immunocomplex antibody.
  • the labeling method is not particularly limited, and may be labeled directly or indirectly (for example, via an avidin-biotin bond).
  • Steps (i) to (iii) are preferably performed in this order, but steps (i) and (ii) may be performed at the same time. Further, another step may exist between the steps (i) and (ii) or between the steps (ii) and (iii). For example, the measurement sensitivity can be increased by having a cleaning step described later in between.
  • the cleaning step is a step of cleaning the components non-specifically adsorbed on the water-insoluble carrier.
  • a solution to be measured containing a large amount of impurities such as blood is measured, the antigen-antibody reaction may be inhibited by coexisting substances.
  • the influence of coexisting substances can be reduced by performing the cleaning step.
  • a cleaning step is provided between steps (i) and (ii) and between steps (ii) and (iii), that is, a two-step method having a total of two cleaning steps is used.
  • the measurement is particularly effective (Non-Patent Document 3).
  • the solution to be measured containing hapten is dispensed into the cells on the water-insoluble carrier side of the reagent cup and reacted.
  • the unadsorbed components are washed on a water-insoluble carrier on which an anti-hapten antibody is immobilized.
  • the unadsorbed components are washed on a water-insoluble carrier on which an anti-hapten antibody is immobilized.
  • cross-reactivity is a reaction in which a substance similar to a substance to be measured (cross-reactive substance) reacts with an antibody against the substance to be measured.
  • cross-reactive substance a substance similar to a substance to be measured (cross-reactive substance) reacts with an antibody against the substance to be measured.
  • the measurement result becomes a false high value due to the cross-reactivity.
  • the present inventors have stated that when a hapten usually measured by a competitive method is subjected to a sandwich-type assay using an anti-immunocomplex antibody, the sandwich-type assay may have higher cross-reactivity. Found.
  • An absorbing antibody is an antibody that hardly reacts with the hapten to be measured and specifically reacts with a cross-reactive substance. It is preferable that there is no reactivity with the hapten to be measured, but there is no problem even if it has a weak reactivity within a range that does not affect the measurement sensitivity. Specifically, the reactivity of the absorbed antibody to the hapten to be measured is preferably about 1/100 or less of the reactivity to the cross-reactive substance.
  • a highly sensitive measurement system is desired.
  • a water-insoluble carrier in which a high-affinity anti-hapten rabbit monoclonal antibody is immobilized on a solid phase carrier is used. This makes it possible to reduce the decrease in reaction efficiency at the solid-liquid interface, which is considered to be low in efficiency.
  • an anti-hapten antibody as the solid phase antibody, it is possible to perform two or more washing steps as necessary after the reaction with the hapten contained in the solution to be measured, and the influence of coexisting substances is affected. It is possible to provide a measurement system in which reduction is achieved.
  • an absorbing antibody coexists during the reaction between the anti-hapten antibody and the hapten to be measured, it is possible to provide a measurement system in which the crossover reaction is suppressed.
  • Example 1 Hereinafter, examples of the present invention will be described in detail with respect to a method of carrying out using a rabbit monoclonal antibody against estradiol (E2) and an anti-immunoplex mouse monoclonal antibody against their immune complex, but the present invention is limited thereto. It is not something that is done.
  • the anti-E2 rabbit monoclonal antibody was obtained by the method described in JP-A-2009-240300.
  • a reagent cup used for automatic analysis was prepared using a cup having two cells shown in FIG. (Hereinafter, according to the contents, one cell of the cup is referred to as a cell on the fine particle side, and the other cell is referred to as a cell on the conjugate side.)
  • a solution containing the fine particles on which the anti-E2 rabbit monoclonal antibody was immobilized was dispensed into the cells on the fine particle side.
  • AIA-CL2400 fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay device
  • the reagent (50 ⁇ L) of the cell on the conjugate side dissolved in the diluted solution was transferred to the cell on the fine particle side and reacted (secondary reaction, 3 minutes). After the completion of the secondary reaction, washing with a second washing solution was performed. Then, the substrate of the enzyme was added, and the luminescence intensity was measured.
  • the measurement results are shown in Table 1 and FIG. It was confirmed that the luminescence intensity increased according to the concentration of E2, and it was confirmed that an E2 measurement system using an anti-immunocomplex antibody could be constructed.
  • E2 can be detected with high sensitivity in a measurement system using an anti-hapten rabbit monoclonal antibody as a solid phase antibody and an anti-immunocomplex antibody as a labeled antibody.
  • Example 2 Hereinafter, examples of the present invention will be described in detail with respect to a method of carrying out using a rabbit monoclonal antibody against thyroxine (FT4) and an anti-immunoplex mouse monoclonal antibody against their immune complex, but the present invention is limited thereto. It is not something that is done.
  • FT4 rabbit monoclonal antibody against thyroxine
  • FT4 anti-immunoplex mouse monoclonal antibody against their immune complex
  • the anti-FT4 rabbit monoclonal antibody was obtained by the method described in JP-A-2009-240300.
  • a reagent cup used for automatic analysis was prepared using a cup having two cells shown in FIG.
  • a solution containing the fine particles on which the anti-FT4 rabbit monoclonal antibody was immobilized was dispensed in 50 ⁇ L into the cells on the fine particle side.
  • 75 ⁇ L of a solution containing an alkaline phosphatase-labeled anti-immunocomplex mouse monoclonal antibody was dispensed into the conjugate-side cell. It was sealed with aluminum and used as a reagent cup for FT4 measurement.
  • the reagent (50 ⁇ L) of the cell on the conjugate side was transferred to the cell on the fine particle side and reacted (secondary reaction, 3 minutes). After the completion of the secondary reaction, washing with a second washing solution was performed. Then, the substrate of the enzyme was added, and the luminescence intensity was measured. The measurement results are shown in Table 2 and FIG. It was confirmed that the luminescence intensity increased according to the concentration of FT4, and it was confirmed that the FT4 measurement system using the anti-immunocomplex antibody could be constructed.
  • FT4 can be detected with high sensitivity in a measurement system using an anti-hapten rabbit monoclonal antibody as a solid phase antibody and an anti-immunocomplex antibody as a labeled antibody.
  • Example 3 Hereinafter, an example of the present invention will be described in detail regarding a method of carrying out on a 96-well ELISA plate using a rabbit monoclonal antibody against estradiol (E2) and an anti-immunoplex mouse monoclonal antibody against their immune complex.
  • E2 estradiol
  • E2 anti-immunoplex mouse monoclonal antibody against their immune complex.
  • the invention is not limited to this.
  • Anti-E2 Rabbit Monoclonal Antibody As the anti-E2 rabbit monoclonal antibody, the same antibody as the antibody described in Example 1 was used.
  • Anti-Immuno Complex Mouse Monoclonal Antibody As the anti-immuno complex mouse monoclonal antibody, the same antibody as the antibody described in Example 1 was used.
  • Measurement E2 was measured by the following method using a plate reader (TECAN, infinite F500).
  • An anti-E2 rabbit monoclonal antibody was immobilized on a 96-well microplate (Black, Greener) at 0.25 ⁇ g / mL (Carbonate Buffer (0.05 M pH 9.6)). Then, blocking treatment was performed with 1% skim milk / PBS solution. Using another plate, a dilution series of E2 (diluted 2-fold from 5,000 pg / mL) was prepared and dispensed at 100 ⁇ L / well into 96-well microplates immobilized with anti-E2 rabbit monoclonal antibody. After incubating for 5 minutes, a washing operation using a plate washer was performed.
  • the anti-immunocomplex mouse monoclonal antibody labeled with alkaline phosphatase was adjusted to have an absorbance at 280 nm of 1 mA, dispensed at 100 ⁇ L / well, and then incubated for 5 minutes. Then, a washing operation using a plate washer was performed, 4-MUP (4-Methyllumbelliferyl phosphate, MERCK), which is an enzyme substrate, was added, and the fluorescence intensity was measured 30 minutes later.
  • Anti-E2 Rabbit Monoclonal Antibody As the anti-E2 rabbit monoclonal antibody, the same antibody as the antibody described in Example 1 was used.
  • Anti-Immuno Complex Mouse Monoclonal Antibody As the anti-immuno complex mouse monoclonal antibody, the same antibody as the antibody described in Example 1 was used.
  • Measurement E2 was measured by the following method using a plate reader (TECAN, infinite F500).
  • An anti-immunocomplex mouse monoclonal antibody was immobilized on a 96-well microplate (Black, Greener) at 0.25 ⁇ g / mL (Carbonate Buffer (0.05 M pH 9.6)). Then, blocking treatment was performed with 1% skim milk / PBS solution. Using another plate, a dilution series of E2 (diluted 2-fold from a final concentration of 5,000 pg / mL) was prepared, and an anti-E2 rabbit monoclonal antibody labeled with alkaline phosphatase was added thereto at a final concentration of 1 mA (absorbance at 280 nm).
  • Table 3 shows the fluorescence intensity measurement results of Example 3 and Comparative Example 1.
  • Tables 4 and 4 show the results of calculating the signal-to-noise ratio (signal / noise) so as to facilitate comparison.
  • Example 3 the anti-E2 rabbit monoclonal antibody is a solid phase antibody
  • S / N the anti-E2 rabbit monoclonal antibody
  • the anti-E2 rabbit monoclonal antibody is used as the solid phase antibody. It was confirmed that the measurement sensitivity was higher when used.
  • Example 4 Hereinafter, examples of the present invention will be described in detail with respect to a method of carrying out using a rabbit monoclonal antibody against digoxin (Dig) and an anti-immunoplex mouse monoclonal antibody against their immune complex, but the present invention is limited thereto. It is not something that is done.
  • the anti-Dig rabbit monoclonal antibody was obtained by the method described in JP-A-2009-240300.
  • a reagent cup used for automatic analysis was prepared using a cup having two cells shown in FIG.
  • a solution containing the fine particles on which the anti-Dig rabbit monoclonal antibody was immobilized was dispensed in 50 ⁇ L into the cells on the fine particle side.
  • 75 ⁇ L of a solution containing an alkaline phosphatase-labeled anti-immunocomplex mouse monoclonal antibody was dispensed into the conjugate-side cell. It was sealed with aluminum and used as a reagent cup for dig measurement.
  • the reagent (50 ⁇ L) of the cell on the conjugate side was transferred to the cell on the fine particle side and reacted (secondary reaction, 3 minutes). After the completion of the secondary reaction, washing with a second washing solution was performed. Then, the substrate of the enzyme was added, and the luminescence intensity was measured. The measurement results are shown in Table 5 and FIG. It was confirmed that the luminescence intensity increased according to the concentration of Dig, and it was confirmed that a dig measurement system using an anti-immunocomplex antibody could be constructed.
  • the hybridoma suspension after fusion is suspended in an E-RDF medium (manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% FCS (fetal calf serum) and 1 ⁇ HAT (manufactured by siguma), and then placed on a microtiter plate. The cells were cultivated for 8 days to obtain a culture supernatant.
  • E-RDF medium manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.
  • FCS fetal calf serum
  • 1 ⁇ HAT manufactured by siguma
  • Absorbent antibody preferably reacts strongly with EE2 and has low reactivity with E2. Therefore, in the screening of the absorbed antibody in the present invention, an antibody that selectively reacts with EE2 even in the presence of E2 may be selected. Specifically, screening was performed by the ELISA shown below. (3-4-1) KLH-EE2 was immobilized on an ELISA plate at 1 ⁇ g / mL and then blocked with 1% skim milk solution. (3-4-2) The culture supernatant was reacted with KLH-EE2 immobilized on an ELISA plate in the presence or absence of E2, respectively.
  • the automatic analysis was performed by the following method using a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay (AIA-CL2400, manufactured by Tosoh Corporation).
  • reagent cup used for automatic analysis was prepared using a cup having two cells.
  • Absorbent antibody (EE2B-18) was added to a solution containing fine particles immobilized with an anti-E2 rabbit monoclonal antibody at a concentration of 10 ⁇ g / mL, and the mixture was dispensed into cells on the fine particle side.
  • a solution containing an alkaline phosphatase-labeled anti-immunocomplex antibody and ⁇ -estradiol-6-on6- (O-carboxymethyloxime) was dispensed into the conjugate-side cell with reference to Patent Document 1.
  • the solution was lyophilized, sealed with aluminum, and used as a reagent cup for E2 measurement.
  • Example 6 Hereinafter, the case where the absorbing antibody (EE2B-18) is not contained in the reagent cup for measuring E2 prepared in Example 5 will be described as Example 6.
  • the anti-E2 rabbit monoclonal antibody was obtained by the method described in JP-A-2009-240300.
  • the automatic analysis was performed by the following method using a fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay (AIA-CL2400, manufactured by Tosoh Corporation).
  • reagent cup used for automatic analysis was prepared using a cup having two cells.
  • the absorbed antibody was added to a solution containing the fine particles on which the anti-E2 rabbit monoclonal antibody was immobilized at 10 ⁇ g / mL, and the antibody was dispensed into the cells on the fine particle side.
  • a solution containing an alkaline phosphatase-labeled anti-immunocomplex antibody and ⁇ -estradiol-6-on6- (O-carboxymethyloxime) was dispensed into the conjugate-side cell with reference to Patent Document 1.
  • the solution was lyophilized, sealed with aluminum, and used as a reagent cup for E2 measurement.
  • AIA-CL2400 fully automatic chemiluminescent enzyme immunoassay device
  • Example 8 Hereinafter, the case where the absorbing antibody is not contained in the reagent cup for measuring E2 prepared in Example 7 will be described as Example 8.

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Abstract

抗イムノコンプレックス抗体を用いる測定系において、反応効率を上昇させ得る測定方法を提供する。 ・水不溶性担体に固定化された抗ハプテンウサギモノクローナル抗体、及び ・標識された抗イムノコンプレックス抗体、 を用いた免疫測定法であって、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む方法： （ｉ）水不溶性担体に固定化された抗ハプテンウサギモノクローナル抗体と測定対象溶液中のハプテンとを反応させる工程、 （ｉｉ）標識された抗イムノコンプレックス抗体を、ハプテン－抗ハプテンウサギモノクローナル抗体の免疫複合体と反応させる工程、 （ｉｉｉ）標識に由来するシグナルを検出する工程。

Description

抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定法
　本発明は、抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定法に関するものである。
　低分子化合物であるハプテンは、通常、競合法とよばれる免疫測定方法によって測定される。競合法は、試料中に含まれるハプテンと、放射性同位元素や酵素などで標識した標識ハプテンとを、一定量の抗ハプテン抗体に対して競合的に反応させる方法である。試料中に含まれるハプテン量が多くなると、標識ハプテンが抗ハプテン抗体へ結合する量が低下する。このことから、標識ハプテンが抗ハプテン抗体へ結合する割合を基にして、試料中に含まれるハプテン量を推定することができる。競合法における測定感度は、用いられる抗ハプテン抗体の親和定数に依存する。しかし親和定数の高い抗ハプテン抗体を得ることは困難であり、そのため、ごく微量のハプテンを測定することは極めて困難であった（非特許文献１）。
　このような競合法による免疫測定の課題を解決し得る測定方法として、抗イムノコンプレックス抗体を用いた非競合型の免疫測定法が提案されている。抗イムノコンプレックス抗体を用いたハプテン測定系は、例えば以下に示す方法で行なわれ、試料中に含まれるハプテンを競合法によらず測定することができる。
（１）プレート等に抗イムノコンプレックス抗体を固定化する。
（２）標的ハプテンを含む試料と、酵素で標識した抗ハプテン抗体を混合した後、（１）に添加する。
（３）過剰量の標識抗ハプテン抗体を洗浄し分離する。
（４）標識酵素に対する基質を添加し、酵素と基質の反応に由来するシグナルを検出する。
抗イムノコンプレックス抗体は、ハプテンと抗ハプテン抗体からなる免疫複合体に選択的に結合するため、試料中に含まれるハプテン量の増加に伴って、シグナルの増加が観測される。
　抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定系の具体例として特許文献１に示すようなエストラジオール（Ｅ２）測定系が上げられる。特許文献１に開示された技術では、用手法により酵素標識抗Ｅ２抗体とＥ２を含む測定対象液を事前に混合した後、抗イムノコンプレックス抗体が固定化された担体と反応させる方法であった。
　特許文献１に記載の方法では、抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体が固相担体に固定化されている。固相に固定化された抗体と抗原の反応は、固液界面という不均一系で進行するため、反応効率が低い（非特許文献２）。親和性の低いマウスモノクローナル抗体を固相として用いた場合、固液界面の反応がボトルネックとなり、全体の反応効率が低下する事が考えられる。
　また、非特許文献１に記載のように、先に標識抗ハプテン抗体と測定対象とを混合し、次に、その免疫複合体を固相担体に固定化された抗イムノコンプレックス抗体と反応させる測定系は、洗浄の工程が１工程となる１ＳＴＥＰ測定である。非特許文献３に記載のように、１ＳＴＥＰ測定では測定対象液中の共存物質の存在による偽高値または偽低値が報告される例がある。
ぶんせき、５５１－５５２；２００４ 宗伸明、石田祐也、久米正志、今任稔彦　日本分析化学会第５３回年会要旨（２００４）　迅速・簡便な抗原－抗体反応測定法の開発［Ｐ３０９３］ 安達保輝、小川帆貴、土佐岡奈未、向山健一　第６７回日本医学検査学会要旨（２０１８年５月） 高木淳一、タンパク質の分子間相互作用の解析、タンパク質のはたらきを知る－分子機能と生体作用、化学同人、２００９、ｐ．２９－５１
日本国特許第６２２１４６６号
　本発明の目的は、抗イムノコンプレックス抗体を用いる測定系において、反応効率を上昇させ得る測定法を提供することである。
　上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）・水不溶性担体に固定化された抗ハプテンウサギモノクローナル抗体、及び
・標識された抗イムノコンプレックス抗体、
を用いた免疫測定法であって、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む方法：
（ｉ）水不溶性担体に固定化された抗ハプテンウサギモノクローナル抗体と測定対象溶液中のハプテンとを反応させる工程、
（ｉｉ）標識された抗イムノコンプレックス抗体を、ハプテン－抗ハプテンウサギモノクローナル抗体の免疫複合体と反応させる工程、
（ｉｉｉ）標識に由来するシグナルを検出する工程。
（２）工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）がこの順に行われ、かつ、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間、及び工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に、それぞれ洗浄工程を有する、（１）に記載の方法。
（３）抗イムノコンプレックス抗体がマウスモノクローナル抗体である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）標識がアルカリホスファターゼである、（１）～（３）いずれかに記載の方法。
（５）ハプテンがエストラジオール、チロキシン又はジゴキシンである、（１）～（４）いずれかに記載の方法。
（６）工程（ｉ）を吸収抗体の存在下で行う、（１）～（５）いずれかに記載の方法。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　（１）ハプテン
　本発明におけるハプテンは、通常は競合法により測定されるような分子量の小さい物質であれば特に限定はなく、一例として、トリヨードサイロニン、チロキシン、３，５－ジヨード－Ｌ－チロニン等の甲状腺ホルモンや、エストロン、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール、プロゲステロン、コルチゾール等のステロイドホルモンや、ジゴキシン（Ｄｉｇ）等のステロイド配糖体があげられる。特に本発明ではステロイドホルモンやステロイド配糖体が好ましく、その中でもＥ２やＤｉｇが更に好ましい。また甲状腺ホルモンの中ではチロキシンが好ましい。
　（２）測定対象溶液
　測定対象溶液としては、測定対象のハプテンを含有するものであれば特に限定されるものではない。例えば人の血液（全血、血漿、血清等）、尿などの体液が好ましい。
　（３）抗イムノコンプレックス抗体
　抗イムノコンプレックス抗体は、ハプテンに対する抗体ではなく、ハプテンに対する抗体への抗体でもなく、ハプテンとそれに対する抗体との複合体に対する抗体である。本発明においては、抗イムノコンプレックス抗体は、抗ハプテンウサギモノクローナル抗体とハプテンとの複合体に対する特異的な抗体を取得する観点から、ウサギ以外の動物種から得ることが好ましい。動物種としてはマウス、ラット、ヤギ、ヒツジなどを例示できる。本発明においては特にマウスから抗イムノコンプレックスモノクローナル抗体を取得することが好ましい。
　（４）抗ハプテンウサギモノクローナル抗体
　本発明では、抗ハプテン抗体としてウサギモノクローナル抗体を用いる。その理由は、ウサギモノクローナル抗体は、マウスモノクローナル抗体と比較して、ハプテンに対して高い親和性を有するものが得られるからである。親和性としては解離定数（ＫＤ）が１０－１０（Ｍ）以下であることが好ましく、更には１０－１１（Ｍ）以下であることが好ましい。
　特に本発明においては、抗ハプテン抗体を固相抗体として用いるため、当該抗体は親和性が高いウサギモノクローナル抗体を用いることが必須である。非特許文献４に記載のように、固相表面抗体と一度結合した抗原は、洗浄操作等により一時的に解離が起きても、拡散速度の遅いタンパク質（高分子）であれば、近傍の固相抗体と再結合することが可能である。しかし、本発明における抗原は低分子のハプテンであるため、洗浄操作等により、ひとたび抗体から解離すると、拡散速度が速く、固相表面における抗体との再結合が起こり難い。このように本発明では、ハプテンが固相抗体から解離することを抑えるために、高親和性のウサギモノクローナル抗体を固相抗体として用いることが必須である。
　（５）水不溶性担体
　本発明において水不溶性担体は特に限定されるものではないが、例えば、樹脂、ガラス、ポリスチレンなどの微粒子、粒子、ビーズ、プレート等が用いられる。水不溶性担体は、抗ハプテンウサギモノクローナル抗体が固定化される。固定化の方法には特に限定はなく、また直接固定化してもよく又は間接的に（例えばアビジン－ビオチン結合等を介して）固定化してもよい。
　（６）標識
　本発明において標識は特に限定されるものではないが、例えば酵素、放射性同位元素、色素等が用いられる。酵素としては、好ましくはアルカリホスファターゼ等が使用できる。標識は、抗イムノコンプレックス抗体に結合される。標識の方法には特に限定はなく、また直接標識してもよく又は間接的に（例えばアビジン－ビオチン結合等を介して）標識してもよい。
　（７）工程（ｉ）～（ｉｉｉ）
　上述の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）は、この順に行われることが好ましいが、工程（ｉ）（ｉｉ）を同時に行ってもよい。また工程（ｉ）と（ｉｉ）の間や、工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に他の工程が存在してもよい。例えば間に後述の洗浄工程を有することにより、測定感度を高めることができる。
　（８）洗浄工程
　洗浄工程は水不溶性担体に非特異的に吸着した成分を洗浄する工程である。血液などの夾雑物を多く含む測定対象溶液を測定した際、共存物質によって抗原抗体反応が阻害される場合がある。また共存物質の存在によって測定系が正しく機能しない例が報告されている。このような場合であっても、洗浄工程を行うことにより、共存物質の影響を低減することができる。共存物質の影響の低減には、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間、及び工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間にそれぞれ洗浄工程を有する、即ち合計２回の洗浄工程を有する２ＳＴＥＰ法による測定が特に有効である（非特許文献３）。
　（９）測定方法
　本発明の方法では、例えば生物試料分析　Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ４（２０１６）に示されるような、全自動免疫測定装置を用いることが好ましい。例えば図１に示すような２つのセルを有する試薬カップを用いて以下のような自動測定を行うことが好ましい。
（９－１）２セルカップの一方のセルに抗ハプテン抗体を固定化した水不溶性担体を分注し、他方のセルに酵素標識抗イムノコンプレックス抗体を分注し、試薬カップとする。
（９－２）試薬カップ、測定対象溶液を自動免疫測定装置にセットする。
（９－３）自動免疫測定装置において、ハプテンを含む測定対象溶液を試薬カップの水不溶性担体側のセルに分注し、反応させる。
（９－４）反応終了後、抗ハプテン抗体を固定化した水不溶性担体に未吸着の成分を洗浄する。
（９－５）試薬カップの酵素標識抗イムノコンプレックス抗体を、水不溶性担体側のセルへ移す。
（９－６）反応終了後、抗ハプテン抗体を固定化した水不溶性担体に未吸着の成分を洗浄する。
（９－７）酵素の基質を添加して、酵素反応に由来する生成物の発光強度などを測定する。
（１０）交叉反応
　交叉反応は、測定対象物質の類似物質（交叉反応性物質）が測定対象物質に対する抗体と反応することである。免疫測定試薬において交叉反応性の大きな測定系を使用した場合、交叉反応により測定結果が偽高値となる。通常競合法を用いて測定するハプテンを、抗イムノコンプレックス抗体を用いてサンドイッチ型のアッセイを行った場合、サンドイッチ型アッセイの方が、交叉反応性が大きくなる場合があることを、本発明者らは見出した。そしてこの点について本発明者らが検討した結果、サンドイッチ型アッセイを行う場合、競合法に比べて多くの抗ハプテン抗体を用いることが一因と考えられた。また、抗ハプテン抗体とハプテンとの免疫複合体、抗ハプテン抗体と交叉反応性物質との複合体の表面構造が同一であり、抗イムノコンプレックス抗体がどちらも認識してしまうことも原因として考えられた。
　（１１）吸収抗体
　吸収抗体は、測定対象のハプテンにはほとんど反応せず、交叉反応性物質に特異的に反応する抗体である。測定対象ハプテンへの反応性は全くないことが好ましいが、測定感度に影響のでない範囲の弱い反応性を有していても問題ない。具体的には、吸収抗体の測定対象ハプテンへの反応性は、交叉反応性物質への反応性の約１／１００以下であることが好ましい。
　抗イムノコンプレックス抗体を用いて対象ハプテンを測定する際、高感度の測定系が望まれる。本発明の測定法では、固相担体に高親和性の抗ハプテンウサギモノクローナル抗体を固定化した水不溶性担体を使用する。これにより効率が低いとされる固液界面の反応効率の低下を低減することが可能である。また、固相抗体として抗ハプテン抗体を用いたことにより、測定対象溶液に含有されるハプテンとの反応後に、必要に応じて２回以上の洗浄工程を行うことが可能となり、共存物質の影響の低減が達成された測定系を提供可能である。さらに、抗ハプテン抗体と測定対象ハプテンとの反応の際に、吸収抗体を共存させる場合には、交叉反応を抑えた測定系が提供可能である。　
本発明で使用できる試薬カップの一例を示す図である。 実施例１（３－２）の検量線の結果を示す図である。 実施例２（３－２）の検量線の結果を示す図である。 実施例３および比較例１のＳ／Ｎ比を示す図である。 実施例４（３－２）の検量線の結果を示す図である。 実施例５（４－２）の検量線の結果を示す図である。 実施例６（２）の検量線の結果を示す図である。 実施例７（４－２）の検量線の結果を示す図である。 実施例８（２）の検量線の結果を示す図である。
　［実施例１］
　以下、本発明の実施例をエストラジオール（Ｅ２）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体とを用いて実施する方法に関して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　（１）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体
　抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は特開２００９－２４０３００号公報に記載の方法で取得した。
　（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　Ｅ２と抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の免疫複合体に対する抗体（抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体）は特許第６０３１９４４号公報に記載の方法で取得した。
　（３）測定
　自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
　（３－１）試薬カップの作製
　図１に示す２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。（以下、中身に即して、カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ。）
　抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液を、微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識した抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体と、特許文献１を参考に、β－エストラジオール－６－オン－６－（Ｏ－カルボキシメチルオキシム）を含む溶液を分注した。溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、Ｅ２測定用試薬カップとした。
　（３－２）測定
　全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（３－１）で作製したＥ２測定用試薬カップをセットし、Ｅ２濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は５０μＬの濃度既知サンプルと５０μＬの希釈液をＥ２測定用試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次に希釈液で溶解したコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄液による洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。測定結果を表１及び図２に示す。
Ｅ２の濃度に応じて発光強度が大きくなることが確認され、抗イムノコンプレックス抗体を用いたＥ２の測定系を構築できたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上の結果から、抗ハプテンウサギモノクローナル抗体を固相抗体として用い、抗イムノコンプレックス抗体を標識抗体として用いる測定系において、Ｅ２を高感度で検出可能であることが確認された。
　［実施例２］
　以下、本発明の実施例をチロキシン（ＦＴ４）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体とを用いて実施する方法に関して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　（１）抗ＦＴ４ウサギモノクローナル抗体
　抗ＦＴ４ウサギモノクローナル抗体は特開２００９－２４０３００号公報に記載の方法で取得した。
　（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　ＦＴ４と抗ＦＴ４ウサギモノクローナル抗体の免疫複合体に対する抗体（抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体）は特許第６０３１９４４号公報に記載の方法で取得した。
　（３）測定
　自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
　（３－１）試薬カップの作製
　図１に示す２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。抗ＦＴ４ウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液を、微粒子側のセルに５０μＬ分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識した抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体を含む溶液を７５μＬ分注した。アルミシールをし、ＦＴ４測定用試薬カップとした。
　（３－２）測定
　全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（３－１）で作製したＦＴ４測定用試薬カップをセットし、ＦＴ４濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は５μＬの濃度既知サンプルと５μＬの希釈液をＦＴ４測定用試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次にコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄液による洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。測定結果を表２及び図３に示す。
ＦＴ４の濃度に応じて発光強度が大きくなることが確認され、抗イムノコンプレックス抗体を用いたＦＴ４の測定系を構築できたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以上の結果から、抗ハプテンウサギモノクローナル抗体を固相抗体として用い、抗イムノコンプレックス抗体を標識抗体として用いる測定系において、ＦＴ４を高感度で検出可能であることが確認された。
　［実施例３］
　以下、本発明の実施例をエストラジオール（Ｅ２）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体とを用いて、９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡプレートで実施する方法に関して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　（１）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体
　抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は、実施例１に記載した抗体と同一の抗体を使用した。
　（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体は、実施例１に記載した抗体と同一の抗体を使用した。
　（３）測定
　Ｅ２の測定はプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ５００）を用いて以下の方法で行った。
　９６ｗｅｌｌマイクロプレート（ブラック、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を０．２５μｇ／ｍＬ（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　（０．０５Ｍ　ｐＨ９．６））で固相化した。その後、１％のスキムミルク／ＰＢＳ溶液によりブロッキング処理を行った。別のプレートを用いて、Ｅ２の希釈系列液（５，０００ｐｇ／ｍＬから２倍希釈）を作製し、抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体が固定化された９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。５分間インキュベートした後に、プレートウォッシャーを用いた洗浄操作を行った。次に、アルカリホスファターゼで標識した抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体を２８０ｎｍの吸光度が１ｍＡになるよう調整し、１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した後、５分間インキュベートした。その後、プレートウォッシャーを用いた洗浄操作を行い、酵素の基質である４－ＭＵＰ（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＭＥＲＣＫ）を添加し、３０分後に蛍光強度を測定した。
　［比較例１］固相抗体に抗イムノコンプレックス抗体を用いた例
　以下、本発明の比較例としてエストラジオール（Ｅ２）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体とを用いて、抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体を水不溶性担体に固定化させた抗体（以下「固相抗体」という）として用い、９６ｗｅｌｌ　ＥＬＩＳＡプレートで実施する場合に関して詳細に説明する。
　（１）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体
　抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は、実施例１に記載した抗体と同一の抗体を使用した。
　（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体は、実施例１に記載した抗体と同一の抗体を使用した。
　（３）測定
Ｅ２の測定はプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ５００）を用いて以下の方法で行った。
　９６ｗｅｌｌマイクロプレート（ブラック、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体を０．２５μｇ／ｍＬ（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５Ｍ　ｐＨ９．６））で固相化した。その後、１％のスキムミルク／ＰＢＳ溶液によりブロッキング処理を行った。別のプレートを用いて、Ｅ２の希釈系列液（終濃度５，０００ｐｇ／ｍＬから２倍希釈）を作製し、そこにアルカリホスファターゼで標識した抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を終濃度が１ｍＡ（２８０ｎｍの吸光度）となるよう添加し、直ちに抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体が固定化された９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。１０分間インキュベートを行った後に、プレートウォッシャーを用いた洗浄操作を行い、酵素の基質である４－ＭＵＰ（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＭＥＲＣＫ）を添加し、３０分後に蛍光強度を測定した。
　実施例３及び比較例１の蛍光強度測定結果を表３に示す。また比較を行いやすくするよう、Ｓ／Ｎ比（ｓｉｇｎａｌ／ｎｏｉｓｅ）を計算した結果を表４及び図４に示す。どのＥ２濃度においても、実施例３（抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体が固相抗体）の方がＳ／Ｎが大きく、同じ抗体の組み合わせを用いた場合においても、固相抗体として抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を用いた方が、測定感度が高くなることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　［実施例４］
　以下、本発明の実施例をジゴキシン（Ｄｉｇ）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体とを用いて実施する方法に関して詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
　（１）抗Ｄｉｇウサギモノクローナル抗体
　抗Ｄｉｇウサギモノクローナル抗体は特開２００９－２４０３００号公報に記載の方法で取得した。
　（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　Ｄｉｇと抗Ｄｉｇウサギモノクローナル抗体の免疫複合体に対する抗体（抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体）は特許第６０３１９４４号公報に記載の方法で取得した。
　（３）測定
　自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
　（３－１）試薬カップの作製
　図１に示す２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。抗Ｄｉｇウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液を、微粒子側のセルに５０μＬ分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識した抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体を含む溶液を７５μＬ分注した。アルミシールをし、Ｄｉｇ測定用試薬カップとした。
　（３－２）測定
　全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（３－１）で作製したＤｉｇ測定用試薬カップをセットし、Ｄｉｇ濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は１０μＬの濃度既知サンプルと４０μＬの希釈液をＤｉｇ測定用試薬カップの微粒子側のセルに分注し、５分間反応（一次反応）させた後、洗浄液による洗浄（Ｂ／Ｆ分離）を行い、次にコンジュゲート側のセルの試薬（５０μＬ）を微粒子側のセルに移し反応させた（二次反応、３分間）。二次反応の終了後、二回目の洗浄液による洗浄を行った。その後、酵素の基質を添加し、発光強度を測定した。測定結果を表５及び図５に示す。
Ｄｉｇの濃度に応じて発光強度が大きくなることが確認され、抗イムノコンプレックス抗体を用いたＤｉｇの測定系を構築できたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の結果から、抗ハプテンウサギモノクローナル抗体を固相抗体として用い、抗イムノコンプレックス抗体を標識抗体として用いる測定系において、Ｄｉｇを検出可能であることが確認された。
［実施例５］
　以下、本発明の実施例をエストラジオール（Ｅ２）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体、および交叉反応性低減を目的として添加する吸収抗体（ＥＥ２Ｂ－１８）に関して詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体
　抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は実施例１に記載の抗体を用いた。
（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体は実施例１に記載の抗体を用いた。　（３）吸収抗体（エチニルエストラジオール（ＥＥ２）に対する抗体）
　吸収抗体、即ちＥ２の類似物質であるＥＥ２に対する抗体（ＥＥ２Ｂ－１８）は以下に示す方法で取得した。
　（３－１）動物への免疫
　免疫動物としては、マウス５週齢メス６匹を使用した。抗原は１，３，５（１０）－ＥＳＴＲＡＴＲＩＥＮ－１７α－ＥＴＨＹＮＹＬ－３，１７－ｂｅｔａ－ＤＩＯＬ－６－ＯＮＥ－６－ＣＡＲＢＯＸＹＭＥＴＨＹＬＯＸＩＭＥ：ＢＳＡ（ＳＴＥＲＡＬＯＩＤＳ社製）を用い、抗原溶液とアジュバンドとを等量混合したエマルジョンを作製し、それをマウスに対して１週間間隔で４回免疫した。マウス１匹あたりの免疫量は抗原量として５０μｇを免疫した。またアジュバントは、初回の免疫ではフロイント完全アジュバントを、二回目以降の免疫ではフロイント不完全アジュバントをそれぞれ用いた。
　（３－２）抗体価の確認
　以下に示すＥＬＩＳＡで抗体価の上昇を確認した。
（３－２－１）
　ＫＬＨに化学的に結合したＥＥ２（ＫＬＨ－ＥＥ２）を１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％のスキムミルク溶液でブロッキングした。
（３－２－２）
　取得したマウスの抗血清を１０００倍希釈の状態から希釈系列（２倍希釈）を作製し、ＥＬＩＳＡプレートに固相化したＫＬＨ－ＥＥ２と反応させた。
（３－２－３）
　Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離後、アルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰとする）標識抗体であるαＭｏｕｓｅＩｇＧ－ＡＬＰ（Ｍｅｒｃｋ社製）をプレートに添加して、プレート上のマウス抗体と反応させた。
（３－２－４）
　未反応のＡＬＰ標識抗体をＢ／Ｆ分離後、ＡＬＰの基質である４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）をプレートに分注し、蛍光強度を測定することで検出し、抗体価の上昇したマウスを選別した。
　（３－３）吸収抗体生産ハイブリドーマの作製
　（３－２）で選択したマウスから、以下に示す方法で抗体産生細胞を作製した。
（３－３－１）抗体価の上昇したマウスの脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を調製した。調製した脾臓細胞を電気融合法によりマウスミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマを作製した。
（３－３－２）融合後のハイブリドーマ浮遊液を１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）と１×ＨＡＴ（ｓｉｇｕｍａ製）を含むＥ－ＲＤＦ培地（極東製薬製）に懸濁後、マイクロタイタープレートにまいて８日間培養し、培養上清を取得した。
　（３－４）吸収抗体生産ハイブリドーマのスクリーニング
　吸収抗体はＥＥ２と強く反応し、Ｅ２との反応性は低いことが好ましい。そこで本発明における吸収抗体のスクリーニングでは、Ｅ２の存在下でもＥＥ２と選択的に反応する抗体を選別すればよい。具体的には、以下に示すＥＬＩＳＡでスクリーニングを行った。
（３－４－１）
　ＫＬＨ－ＥＥ２を１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％のスキムミルク溶液でブロッキングした。
（３－４－２）
　培養上清をＥ２の存在下、又は非存在下でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化したＫＬＨ－ＥＥ２と反応させた。
（３－４－３）
　Ｂ／Ｆ分離後、ＡＬＰ標識抗体であるαＭｏｕｓｅＩｇＧ－ＡＬＰ（Ｍｅｒｃｋ社製）をプレートに添加して、プレート上のマウス抗体と反応させた。
（３－４－４）
　未反応のＡＬＰ標識抗体をＢ／Ｆ分離後、ＡＬＰの基質である４－ＭＵＰをプレートに分注し、蛍光強度を測定することで検出し、Ｅ２の存在下でＥＥ２と反応する抗体を生産するハイブリドーマを選別した。
　（３－５）吸収抗体の生産及び精製
　（３－４）で選別した吸収抗体生産ハイブリドーマを、１０％ＦＣＳを含むＥ－ＲＤＦ培地（極東製薬製）で培養し、培養上清を得た。培養上清に存在する抗体を硫安沈殿により濃縮し、Ｔｓｋｇｅｌ　Ｅｔｈｅｒ－５ｐｗカラムを用いて精製し、吸収抗体（ＥＥ２Ｂ－１８）を得た。
　（４）自動分析
　自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
　（４－１）試薬カップの作製
　２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液に、吸収抗体（ＥＥ２Ｂ－１８）を１０μｇ／ｍＬになるよう添加し、微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識した抗イムノコンプレックス抗体と、特許文献１を参考に、β－エストラジオール－６－オン６－（Ｏ－カルボキシメチルオキシム）を含む溶液を分注した。溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、Ｅ２測定用試薬カップとした。
　（４－２）測定
　全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（４－１）で作製したＥ２測定用試薬カップをセットし、Ｅ２濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は実施例１の（３－２）測定と同様にして行った。測定結果を図６に示す。Ｅ２の濃度に応じて発光強度が大きくなることが確認され、吸収抗体存在条件下で、抗イムノコンプレックス抗体を用いたＥ２の自動分析系を構築できたことを確認した。
　（４－３）交叉反応性の評価
　ＥＥ２を１０ｎｇ／ｍＬに調整した溶液を用いて、（４－１）で作製したＥ２測定用試薬カップ及び、ＡＩＡ－ＣＬ２４００を用いて（４－２）と同様に発光強度を測定した。また、（４－２）で作成した検量線から交叉反応率を計算した。結果を表６に示す。
　［実施例６］
　以下、実施例５で作製したＥ２測定用試薬カップ中に吸収抗体（ＥＥ２Ｂ－１８）を含まない場合を実施例６として説明する。
　（１）吸収抗体を含まないＥ２測定用試薬カップ
　実施例５（４－１）と同様にして、但し吸収抗体を添加せずに、Ｅ２測定用試薬カップを製造した。
　（２）測定
　ＡＩＡ－ＣＬ２４００に（１）で作製したＥ２測定用試薬カップをセットし、Ｅ２濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定は実施例１の（３－２）測定と同様にして行った。測定結果を図７に示す。図６（実施例５）と比較して、吸収抗体の有無で検量線の形に大きな変化はないことが確認された。
　（３）交叉反応性の評価
　（１）で作製したＥ２測定用試薬カップとＥＥ２を１０ｎｇ／ｍＬに調整した溶液を用いて、ＡＩＡ－ＣＬ２４００で実施例５（４－２）と同様に測定した。（２）で作成した検量線から交叉反応率を計算した。
実施例５及び実施例６で測定した交叉反応率を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６の交叉反応率の結果から、吸収抗体（ＥＥ２Ｂ－１８）の存在により、交叉反応を大幅に改善可能であることが示された。以上の結果から、吸収抗体の存在により抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定系において、交叉反応の抑制が可能であることが確認された。
　［実施例７］
　以下、本発明の実施例をエストラジオール（Ｅ２）に対するウサギモノクローナル抗体と、それらの免疫複合体に対する抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体、および交叉反応性低減を目的として添加する吸収抗体に関して詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（１）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体
　抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は特開２００９－２４０３００号公報に記載の方法で取得した。
　（２）抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体
　Ｅ２と抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の免疫複合体に対する抗体（抗イムノコンプレックスマウスモノクローナル抗体）は特許第６０３１９４４号公報に記載の方法で取得した。
　（３）吸収抗体（エチニルエストラジオール（ＥＥ２）に対する抗体）
　Ｅ２の類似物質であるＥＥ２に対する抗体は、実施例５と同様の方法を用いて作製し、ＥＥ２Ｂ－１８とは異なる抗体を用いた。
　（４）自動分析
　自動分析は全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）を用いて以下の方法で行った。
　（４－１）試薬カップの作製
　２つのセルを有するカップを用いて、自動分析に用いる試薬カップを作製した。
抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を固定化した微粒子を含む溶液に、吸収抗体を１０μｇ／ｍＬになるよう添加し、微粒子側のセルに分注した。コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼ標識した抗イムノコンプレックス抗体と、特許文献１を参考に、β－エストラジオール－６－オン６－（Ｏ－カルボキシメチルオキシム）を含む溶液を分注した。溶液を凍結乾燥し、アルミシールをし、Ｅ２測定用試薬カップとした。
　（４－２）測定
　全自動化学発光酵素免疫測定装置（ＡＩＡ－ＣＬ２４００、東ソー（株）製）に（４－１）で作製したＥ２測定用試薬カップをセットし、Ｅ２濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定結果を図８に示す。Ｅ２の濃度に応じて発光強度が大きくなることが確認され、吸収抗体存在条件下で、抗イムノコンプレックス抗体を用いたＥ２の自動分析系を構築できたことを確認した。
　（４－３）交叉反応性の評価
　ＥＥ２を１０ｎｇ／ｍＬに調整した溶液を用いて、（４－１）で作製したＥ２測定用試薬カップ及び、ＡＩＡ－ＣＬ２４００を用いて発光強度を測定した。また、（４－２）で作成した検量線から交叉反応率を計算した。結果を表７に示す。
　［実施例８］
　以下、実施例７で作製したＥ２測定用試薬カップ中に吸収抗体を含まない場合を実施例８として説明する。
　（１）吸収抗体を含まないＥ２測定用試薬カップ
　実施例７（４－１）と同様にして、但し吸収抗体を添加せずに、Ｅ２測定用試薬カップを製造した。
　（２）測定
　ＡＩＡ－ＣＬ２４００に（１）で作製したＥ２測定用試薬カップをセットし、Ｅ２濃度既知のサンプル６種（ｃａｌ１～ｃａｌ６）の測定を行い、検量線を作成した。測定結果を図９に示す。図８（実施例７）と比較して、吸収抗体の有無で検量線の形に大きな変化はないことが確認された。
　（３）交叉反応性の評価
　（１）で作製したＥ２測定用試薬カップとＥＥ２を１０ｎｇ／ｍＬに調整した溶液を用いて、ＡＩＡ－ＣＬ２４００で測定した。（２）で作成した検量線から交叉反応率を計算した。
実施例７及び実施例８で測定した交叉反応率を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　交叉反応率の結果から、吸収抗体の存在により、交叉反応を大幅に改善可能であることが示された。以上の結果から、本発明の方法により抗イムノコンプレックス抗体を用いた測定系において、交叉反応の抑制が可能であることが確認された。
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　なお、２０１９年１１月２０日に出願された日本特許出願２０１９－２０９４０７号、２０１９年１１月２９日に出願された日本特許出願２０１９－２１６５２１号、２０２０年３月１２日に出願された日本特許出願２０２０－０４２９１５号、２０２０年６月１０日に出願された日本特許出願２０２０－１００８４２号及び２０２０年８月１８日に出願された日本特許出願２０２０－１３８１０１号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (6)

  1. ・水不溶性担体に固定化された抗ハプテンウサギモノクローナル抗体、及び
    ・標識された抗イムノコンプレックス抗体、
    を用いた免疫測定法であって、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む方法：
    （ｉ）水不溶性担体に固定化された抗ハプテンウサギモノクローナル抗体と測定対象溶液中のハプテンとを反応させる工程、
    （ｉｉ）標識された抗イムノコンプレックス抗体を、ハプテン－抗ハプテンウサギモノクローナル抗体の免疫複合体と反応させる工程、
    （ｉｉｉ）標識に由来するシグナルを検出する工程。
  2. 工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）がこの順に行われ、かつ、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間、及び工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の間に、それぞれ洗浄工程を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 抗イムノコンプレックス抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 標識がアルカリホスファターゼである、請求項１～３いずれかに記載の方法。
  5. ハプテンがエストラジオール、チロキシン又はジゴキシンである、請求項１～４いずれかに記載の方法。
  6. 工程（ｉ）を吸収抗体の存在下で行う、請求項１～５いずれかに記載の方法。
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