JP5343825B2 - 血液中のステロイドホルモン又はビタミン類の測定法 - Google Patents

Description

本発明は、血液中のステロイドホルモン又はビタミン類（以下、両者を纏めて「小分子」と記載することがある）を免疫学的に測定する方法において、反応系に２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸、２‐アミノナフタレンスルホン酸、アニリン‐２，５‐ジスルホン酸、３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種以上（以下、「蛋白質結合阻害剤」と記載することがある）を共存させることによって血液中のステロイドホルモン又はビタミン類の濃度を正確に測定する方法に関するものである。

血液中の小分子は、その大部分が特異的又は非特異的に蛋白質、脂質などと結合している。そのためそれら小分子の濃度を正確に精度良く測定するためには、小分子を前記蛋白質等から遊離する必要がある。なお、小分子類には、それぞれ特異的な結合蛋白質が存在し、血液中での安定性の向上に貢献している。例えばセックスホルモン・バインディンググロブリンやビタミンＤバインディングプロテイン（ＤＢＰ）などが良く知られている。

従来知られているステロイドホルモンの特異的結合阻害剤は、コルチゾールの免疫測定法におけるグルタミン酸溶液（特許文献１）、同じくコルチゾールの分析方法における８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸又はその塩（特許文献２）が報告されている。ビタミンＤ代謝産物の特異的結合阻害剤は、ビタミンＤ代謝産物の検出方法における８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩、３‐（アセトニルベンジル）‐４‐ヒドロキシクマリンおよび水和性溶媒を含む非競合置換剤（特許第３７８７１２１）、ビタミンＤアッセイにおける０．０１〜５％のシクロデキストリン、０．０１〜５％のサリチル酸ナトリウム、及び０．１〜１．０ＭのＮａＯＨを含む遊離剤（特許文献３）が報告されている。

特開昭５３−１０１５２１号公報 特開昭６１−１２５４７号公報 特許第４１３０９５８号公報

前記したグルタミン酸溶液等を用いたとしても、エストラジオール測定試薬のように低濃度域の測定精度が要求される場合、これらの添加だけでは十分な感度を得ることは困難である。グルタミン酸溶液等を高濃度となるように添加することにより感度をあげることは可能であるが、その一方で小分子を免疫測定するための反応（免疫反応）への影響が生じる可能性があり、一概に高濃度となるように添加することも困難である。

本発明者らは、上記のような状況に鑑みて鋭意検討を行った結果、小分子を免疫学的に測定する方法において、反応系に蛋白質結合阻害剤を共存させることによって小分子の濃度を正確に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸、２‐アミノナフタレンスルホン酸、アニリン‐２，５‐ジスルホン酸、３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種以上を共存させることを特徴とする、ステロイドホルモン又はビタミン類の免疫測定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明でいう小分子は、ステロイドホルモン又はビタミン類という、分子量の小さい測定対象である。ステロイドホルモンとしては、例えば、エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾール、アンドロステンジオン又はデヒドロエピアンドロステロン硫酸等が例示でき、ビタミン類としては、例えば、２５‐ヒドロキシビタミンＤなどのビタミンＤ代謝産物、そしてビタミンＢ12、葉酸等を例示することができる。

小分子の測定に適用される免疫測定方法は、その原理や検出のためのラベルの種類を問わないものである。即ち、原理としてはサンドイッチ法、競合法、凝集法等を使用することができ、ラベルとしては放射性同位元素、酵素、化学発光、又は生物化学発光等を使用することができる。中でも、原理上測定感度が高く、かつ、実施に当たって特別な取扱いを要する試薬を使用する必要のない、酵素、蛍光物質又は化学発光物質をラベルとして用いた、サンドイッチ法又は競合法が好ましい。

共存させる蛋白質結合阻害剤は、２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸、２‐アミノナフタレンスルホン酸、アニリン‐２，５‐ジスルホン酸、３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種以上であれば良い。即ち、これらのうちの一種類を単独で用いても、二種類以上を混合して用いてもよい。特に二種類以上を用いる場合には、個々の蛋白質結合阻害剤の相乗的な効果を期待することができる。

蛋白質結合阻害剤は、上記した免疫測定を実施する際に、反応系に共存させる、即ち免疫反応を生じさせる反応液に添加すれば良い。共存させる濃度は、重量／体積（ｗ／ｖ）換算で０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１０％であり、二種以上を混合して用いる場合にはその総量がこの範囲となるようにすれば良い。

蛋白質結合阻害剤の共存のさせ方に特別な制限はなく、小分子と先に接触させる、免疫反応用の成分（抗原や抗体等）と先に接触させる、小分子及び免疫反応用の成分と同時に接触する、のいずれであっても良い。

蛋白質結合阻害剤共存下での免疫反応は、該阻害剤非存在下の免疫反応と同様に、即ち同様の反応温度、時間で行うことができる。

本発明によれば、蛋白質結合阻害剤を共存させるだけで、小分子の濃度を精度良く測定することが可能となる。例えば、臨床検査において非常に有効な手段であるＥＩＡ、ＲＩＡで測定されている小分子は、その大部分が特異的、非特異的に蛋白質や脂質などと結合しているため、低濃度の小分子を精度よく測定することは容易ではない。そのような測定系にて、正確な小分子濃度を測定することは非常に有用であり、高精度な測定、測定時間の短縮、自動化への発展に対する多くの要望を簡便に解決するものであり、その応用範囲は広い。

実施例

以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

免疫測定装置としてＡＩＡ−１８００自動免疫測定装置（商品名、東ソー（株）製）を用い、１ステップ競合法によりデヒドロエピアンドロステロン硫酸の測定を行った。なお、測定に必要な試薬は後述したようにして調製した。

まず、ヤギ抗ウサギ抗体を固定化した担体及びアルカリ性フォスファターゼにて標識されたデヒドロエピアンドロステロン硫酸とウサギ抗デヒドロエピアンドロステロン硫酸抗体を含む反応カップに試験試料（血清）を添加し３７℃にて攪拌保温した。なお反応カップは、試験試料添加時に標識デヒドロエピアンドロステロン硫酸と競合して反応するようにするため最初にヤギ抗ウサギ抗体を固定化した担体とアルカリ性フォスファターゼ標識デヒドロエピアンドロステロン硫酸溶液を分注して凍結した後、ウサギ抗デヒドロエピアンドロステロン硫酸抗体溶液を分注して凍結し凍結乾燥したものを作製した。

次に、未反応物をＢ／Ｆ分離により除去しデヒドロエピアンドロステロン硫酸を介して結合したアルカリ性フォスファターゼ標識デヒドロエピアンドロステロン硫酸を、４メチルウンベリフェリルりん酸塩を添加し、単位時間当たりの４メチルウンベリフェロンの生成（ｎＭ／秒）を蛍光測定した。なお、本生成度はアルカリ性フォスファターゼ量に比例する。

デヒドロエピアンドロステロン硫酸測定反応試薬は、以下のようにして調製した。ヤギ抗ウサギ抗体を固定化させた担体にアルカリ性フォスファターゼ標識デヒドロエピアンドロステロン硫酸を含む溶液を添加し凍結させた後に、ウサギ抗デヒドロエピアンドロステロン硫酸抗体を含む溶液を添加し、凍結乾燥してデヒドロエピアンドロステロン硫酸測定試薬（試薬Ａ）を作製した。また、同一条件で２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸ナトリウムを０．６７％（ｗ／ｖ）添加したデヒドロエピアンドロステロン硫酸測定試薬（試薬Ｂ）を作製した。さらに同様に２‐アミノナフタレンスルホン酸ナトリウムを２．６７％（ｗ／ｖ）添加したデヒドロエピアンドロステロン硫酸測定試薬（試薬Ｃ）を作製した。

デヒドロエピアンドロステロン硫酸標準液は、脱ステロイドヒト血清に、市販デヒドロエピアンドロステロン硫酸（シグマ社製）を０、５、１２、６０、３００、１２００μｇ／ｄｌになるように添加して調製した。

次に、上記のようにして調製した試薬Ａ、Ｂ、Ｃを用い、前記自動免疫測定装置で前記のようにして調製した標準液を測定し、アルカリ性フォスファターゼの蛍光基質である４メチルウンベリフェロンの蛍光強度の増加速度をそれぞれ測定した（ｎＭ／ｓｅｃ）。なお、各標準液は３回ずつ測定した。

各標準液濃度（μｇ／ｄｌ）において、標識化デヒドロエピアンドロステロン硫酸の抗体への結合率（Ｂ／Ｂ_０）を「Ｂ／Ｂ_０＝（各標準液の蛍光増加速度／濃度０の標準液の蛍光増加速度）×１００」により算出した。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、標準液５μｇ／ｄｌの時に、試薬Ａ、Ｂ、Ｃの結合率Ｂ／Ｂ_０を比較すると、２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸ナトリウムや２‐アミノナフタレンスルホン酸ナトリウムを含有する試薬Ｂ、Ｃの方がはるかに低いことから、同濃度の標準液を加えた場合でも、試薬Ｂ、Ｃの方が遊離のデヒドロエピアンドロステロン硫酸の量が多く、標識化デヒドロエピアンドロステロン硫酸と競合したことが分かる。したがって、２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸ナトリウムや２‐アミノナフタレンスルホン酸ナトリウムを共存させることにより、デヒドロエピアンドロステロン硫酸を感度よく測定することができる。

「濃度０の蛍光増加速度−２×濃度０の蛍光増加速度の標準偏差」を、上記した各標準液の測定結果から作成した検量線を用いて濃度（μｇ／ｄｌ）に換算した値を最小検出限界（ＭＤＣ）とした。結果を表２に示す。

ＭＤＣは２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸ナトリウムや２‐アミノナフタレンスルホン酸ナトリウムを含有する試薬Ｂ、Ｃの方がはるかに低いことが分かる。したがって、２‐ヒドロキシ‐３‐ナフトエ酸ナトリウムや２‐アミノナフタレンスルホン酸ナトリウムを共存させることにより、低濃度のデヒドロエピアンドロステロン硫酸を精度よく測定することができる。

免疫測定装置としてＡＩＡ−１８００自動免疫測定装置（商品名、東ソー（株）製）を用い、１ステップ競合法によりエストラジオールの測定を行った。なお、測定に必要な試薬は後述したようにして調製した。

まず、ヤギ抗ウサギ抗体を固定化した担体およびアルカリ性フォスファターゼにて標識されたエストラジオールとウサギ抗エストラジオール抗体を含む反応カップに試験試料（血清）を添加し３７℃にて攪拌保温した。なお反応カップは、試験試料添加時に標識エストラジオールと競合して反応するようにするため最初にヤギ抗ウサギ抗体を固定化した担体とアルカリ性フォスファターゼ標識エストラジオール溶液を分注して凍結した後、ウサギ抗エストラジオール抗体溶液を分注して凍結し凍結乾燥したものを作製した。

次に、未反応物をＢ／Ｆ分離により除去しエストラジオールを介して結合したアルカリ性フォスファターゼ標識エストラジオールを、４メチルウンベリフェリルりん酸塩を添加し、単位時間当たりの４メチルウンベリフェロンの生成（ｎＭ／秒）を蛍光測定した。なお、本生成度はアルカリ性フォスファターゼ量に比例する。

エストラジオール測定反応試薬は、以下のようにして調製した。ヤギ抗ウサギ抗体を固定化させた担体にアルカリ性フォスファターゼ標識エストラジオールを含む溶液を添加し凍結させた後に、ウサギ抗エストラジオール抗体を含む溶液を添加し、凍結乾燥してエストラジオール測定試薬（試薬Ｄ）を作製した。また、同一条件でアニリン‐２，５‐ジスルホン酸１ナトリウムを１．３３％（ｗ／ｖ）添加したエストラジオール測定試薬（試薬Ｅ）を作製した。さらに同様に３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸１ナトリウムを０．６７％（ｗ／ｖ）添加したエストラジオール測定試薬（試薬Ｆ）を作製した。

エストラジオール標準液は、脱エストラジオールヒト血清に、市販エストラジオール（ＳＩＧＭＡ社）を０、４２、１０５、５１６、１０３０、３２７０ｐｇ／ｍｌになるように添加して調製した。

次に、上記のようにして調製した試薬Ｄ、Ｅ、Ｆを用い、前記自動免疫測定装置で前記のようにして調製した標準液を測定し、アルカリ性フォスファターゼの蛍光基質である４メチルウンベリフェロンの蛍光強度の増加速度をそれぞれ測定した（ｎＭ／ｓｅｃ）。なお、各標準液は３回ずつ測定した。

各標準液濃度（ｐｇ／ｍｌ）において、標識化エストラジオールの抗体への結合率（Ｂ／Ｂ_０）を前記のようにして算出した。結果を表３に示す。

表３から明らかなように、標準液４２ｐｇ／ｍｌの時に、試薬Ｄ、Ｅ、Ｆの結合率Ｂ／Ｂ_０を比較すると、アニリン‐２，５‐ジスルホン酸１ナトリウムや３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸１ナトリウムを含有する試薬Ｅ、Ｆの方が低いことから、同濃度の標準液を加えた場合でも、試薬Ｅ、Ｆの方が遊離のエストラジオールの量が多く、標識化エストラジオールと競合したことが分かる。したがって、アニリン‐２，５‐ジスルホン酸１ナトリウムや３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸１ナトリウムを共存させることにより、エストラジオールを感度よく測定することができる。

次に、前記のようにして最小検出限界（ＭＤＣ）算出した。結果を表４に示す。

ＭＤＣはアニリン‐２，５‐ジスルホン酸１ナトリウムや３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸１ナトリウムを含有する試薬Ｅ、Ｆの方が低い事が分かる。したがって、アニリン‐２，５‐ジスルホン酸１ナトリウムや３‐アミノ‐２，７‐ナフタレンジスルホン酸１ナトリウムを共存させることにより、低濃度のエストラジオールを精度よく測定することができる。

Claims (2)

1. ２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸、２−アミノナフタレンスルホン酸、アニリン−２，５−ジスルホン酸、３−アミノ−２，７−ナフタレンジスルホン酸及びそれらの塩からなる群から選ばれる一種以上を共存させることを特徴とする、ステロイドホルモンの免疫測定方法。
2. ステロイドホルモンがエストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾール、アンドロステンジオン又はデヒドロエピアンドロステロン硫酸である請求項１に記載の免疫測定方法。