CN113390836A - 硫磺素t的应用及一种牛奶中酪蛋白的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了硫磺素T的应用及一种牛奶中酪蛋白的检测方法，涉及酪蛋白检测技术领域。本发明利用酪蛋白与硫黄素T结合后会限制硫黄素T的自由旋转，从而产生荧光发射现象，进而实现对酪蛋白的检测。本发明将硫黄素T用于牛奶中酪蛋白的检测，具有较高的灵敏度和选择性，硫黄素T对酪蛋白的线性范围在5～200μg/mL内，并且检测限达到0.15μg/mL(3σ)。将其应用到实际样品牛奶中酪蛋白的检测，其回收率在92.9％到104.8％之间。

Description

硫磺素T的应用及一种牛奶中酪蛋白的检测方法

技术领域

本发明涉及酪蛋白检测技术领域，尤其涉及硫磺素T的应用及一种牛奶中酪蛋白的检测方法。

背景技术

牛奶一直是人类蛋白质摄入的重要来源之一，对人类具有重要意义。牛奶中含有多种营养成分，如蛋白质、脂类、乳糖和维生素，其中，蛋白质的含量最高，是评价牛奶品质的重要因素之一。而蛋白质中酪蛋白的含量占 80％以上，因此，酪蛋白含量的确定对于牛奶中蛋白质含量的确定极为重要。

目前，蛋白质的主要测定方法是凯氏定氮法，这种分析技术主要是通过测定氮的含量来确定蛋白质的含量，致使一些非法分子往牛奶中添加尿素、三聚氰胺等对人体有害的物质，因此，发明一种可以单纯识别酪蛋白的超灵敏探针至关重要。如今，已经被报道的一些分析技术，如酶联免疫分析、色谱分析、聚集诱导发光、热力学方法等，由于其复杂的操作流程，昂贵的分析仪器，复杂的前处理步骤等等而受到限制，因此，发明简单、高效、超灵敏的检测手段是目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供硫黄素T的应用及一种牛奶中酪蛋白的检测方法，将硫黄素T用于牛奶中酪蛋白的检测，具有较高的灵敏度，且简单、高效、实用性强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了硫黄素T在检测酪蛋白中的应用。

本发明提供了一种牛奶中酪蛋白的检测方法，包括以下步骤：

对牛奶中的酪蛋白进行提取，得到含酪蛋白的提取物；

将所述提取物、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合，得到混合液；

对所述混合液进行荧光测试，根据酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线，得到牛奶中酪蛋白的含量。

优选的，所述提取的方法包括：采用醋酸/醋酸钠缓冲溶液调节牛奶的pH值为4.3，分离后得到含酪蛋白的提取物。

优选的，所述荧光测试的激发波长为400～450nm。

优选的，所述荧光测试的激发和发射狭缝独立地为3～5mm。

优选的，所述混合液中硫黄素T的浓度为10～100μM。

优选的，所述荧光测试时混合液的用量为1mL。

优选的，所述硫黄素T溶液的浓度为0.1～10mM，溶剂为水或PBS缓冲液。

优选的，所述PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。

优选的，将所述提取物、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合的过程包括：将所述提取物溶解到PBS缓冲液中，然后再和硫黄素T溶液混合。

本发明提供了硫黄素T在检测酪蛋白中的应用。硫黄素T与酪蛋白具有较强的结合能力，且结合后会引起酪蛋白的聚集，聚集后的酪蛋白会限制硫黄素T的自由旋转，从而产生荧光发射现象，进而实现对酪蛋白的检测。

本发明将硫黄素T用于牛奶中酪蛋白的检测，具有较高的灵敏度和选择性，硫黄素T对酪蛋白的线性范围在5～200μg/mL内，并且检测限达到 0.15μg/mL(3σ)。将其应用到实际样品牛奶中酪蛋白的检测，其回收率在 92.9％到104.8％之间。

附图说明

图1为混合液中酪蛋白浓度(100μg/mL)一定的情况下，不同浓度ThT 与之结合发光的荧光谱图(图1中a)和荧光强度的统计曲线(图1中b)；

图2为混合液中ThT浓度为80mM的情况下，与不同浓度酪蛋白结合发光的荧光谱图(图2中a)和线性曲线以及线性方程(图2中b)；

图3为ThT探针选择性测试结果。

具体实施方式

本发明提供了硫黄素T在检测酪蛋白中的应用。

在本发明中，所述硫黄素T(简称ThT)为黄色粉末，易溶于水，具有式I所示结构：

在本发明中，所述应用的方法优选包括：

将待测酪蛋白样品、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合，对得到的混合液进行荧光测试，根据酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线，得到待测酪蛋白样品中酪蛋白的含量。

本发明对所述待测酪蛋白样品的来源没有特殊要求，任意需要检测酪蛋白含量的待测酪蛋白样品均可。

本发明对所述待测酪蛋白样品、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合的过程没有特殊要求，能够确保待测酪蛋白样品全部溶解且各物质混合均匀即可。在本发明中，所述混合的过程优选为：将待测酪蛋白样品溶解于部分PBS 缓冲液中，得到待测酪蛋白溶液；取部分待测酪蛋白溶液与硫黄素T溶液和另一部分PBS缓冲液混合，得到混合液。在本发明中，所述PBS缓冲液的 pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.4；所述硫黄素T溶液的浓度优选为 0.1～10mM，更优选为1～5mM，最优选为1mM，所述硫黄素T溶液的溶剂优选为水或PBS缓冲液。在本发明中，所述荧光测试时混合液的用量优选为 1mL；本发明对所述部分PBS缓冲液和另一部分PBS缓冲液以及硫黄素T 溶液的用量没有特殊要求，优选满足所述混合液中硫黄素T的浓度为 10～100μM，待测酪蛋白样品的浓度为5～200μg/mL即可。在本发明，所述混合液中硫黄素T的浓度进一步优选为50～100μM，更优选为80～100μM，最优选为80μM；所述混合液中待测酪蛋白样品的浓度进一步优选为 20～180μg/mL，更优选为40～120μg/mL。

得到混合液后，本发明对所述混合液进行荧光测试，根据酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线，得到待测酪蛋白样品中酪蛋白的含量。在本发明中，所述荧光测试的条件优选为：激发波长为400～450nm，激发和发射狭缝独立地为3～5mm；更优选激发波长为440nm，激发和发射狭缝均为3mm。本发明对所述荧光测试采用的设备没有特殊要求，采用本领域熟知的荧光测试设备即可。

本发明对所述标准曲线的绘制没有特殊要求，采用本领域熟知的绘制方法即可。具体的：在绘制标准曲线时，参照上述荧光测试的条件，不同之处在于将待测酪蛋白样品换成标准酪蛋白样品，即可得到酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线。在本发明中，所述标准曲线的横坐标为酪蛋白浓度，纵坐标为荧光强度。本发明利用硫黄素T与酪蛋白具有较强的结合能力，且结合后会引起酪蛋白的聚集，聚集后的酪蛋白会限制硫黄素T的自由旋转，从而产生荧光发射现象，进而实现对酪蛋白的检测。需要说明的是，在确定待测酪蛋白中酪蛋白的含量时，混合溶液中硫黄素T的浓度需要与绘制标准曲线时混合液中硫黄素T的浓度保持一致。

本发明提供了一种牛奶中酪蛋白的检测方法，包括以下步骤：

对牛奶中的酪蛋白进行提取，得到含酪蛋白的提取物；

将所述提取物、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合，得到混合液；

对所述混合液进行荧光测试，根据酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线，得到牛奶中酪蛋白的含量。

本发明对牛奶中的酪蛋白进行提取，得到含酪蛋白的提取物。本发明对所述牛奶的来源没有特殊要求，本领域熟知的市售牛奶均可。在本发明中，所述提取的方法优选包括：采用醋酸/醋酸钠缓冲溶液调节牛奶的pH值为 4.3，分离后得到含酪蛋白的提取物。本发明对所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液的 pH值没有特殊要求，能够保证将牛奶的pH值调整到4.3即可。在本发明中，所述分离优选为离心，本发明所述离心的条件没有特殊要求，能够将酪蛋白分离出来即可。完成所述分离之后，本发明优选还包括对分离所得提取物清洗两次。在本发明中，所述清洗采用的清洗液优选为PBS缓冲液。由于酪蛋白在PBS缓冲液中搅拌2～3小时后才可溶解，因此采用PBS缓冲液清洗不会造成酪蛋白溶解。本发明所述清洗可以洗去牛奶中的脂肪等杂质。

得到含酪蛋白的提取物后，本发明将所述提取物、PBS缓冲液和硫黄素 T溶液混合，得到混合液。本发明优选将所述提取物溶解到PBS缓冲液中，然后再和硫黄素T溶液混合；更优选将所述提取物溶解到第一部分PBS缓冲液中，得到含酪蛋白的溶液，将所述含酪蛋白的溶液用第二部分PBS缓冲液进行稀释，取部分稀释液与第三部分PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合。

在本发明中，所述PBS缓冲液的pH值优选为7.2～7.4，更优选为7.4；所述硫黄素T溶液的浓度优选为0.1～10mM，更优选为1～5mM，最优选为 1mM，所述硫黄素T溶液的溶剂优选为水或PBS缓冲液。在本发明中，所述第一部分PBS缓冲液的体积优选与牛奶的体积相同，在本发明的实施例中具体为2mL；在本发明中，所述第二部分PBS缓冲液的体积优选根据稀释倍数确定，所述稀释的倍数优选为1×10⁵倍。在本发明中，所述混合液的体积优选为1mL(也即后续荧光测试时混合液的用量)，其中，混合液中包括稀释液的体积优选为100μL，硫黄素T溶液的体积优选为10～100μL，余下部分为PBS缓冲液(也即第三部分PBS缓冲液)。在本发明中，所述混合液中硫黄素T的浓度优选为10～100μM，进一步优选为50～100μM，更优选为80～100μM，最优选为80μM。由于牛奶中酪蛋白含量较高，本发明采用稀释可确保酪蛋白浓度落在本发明的线性检测范围，同时还可避免牛奶中脂肪等杂质的影响。

在本发明的实施例中，具体是将2mL的纯牛奶采用醋酸/醋酸钠缓冲溶液调节pH值到4.3，然后在3200rpm下离心10分钟，得到含酪蛋白的提取物；然后将所述提取物分散到PBS缓冲液(pH＝7.4)中清洗两遍，再溶解到2mLPBS缓冲液中并用PBS缓冲液稀释1×10⁵倍，得到稀释液；取100μL 稀释液与10～100μL硫黄素T溶液(浓度为1mM)、再加入820μLPBS缓冲液混合，得到待测混合液。

得到混合液后，本发明对所述混合液进行荧光测试，根据酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线，得到牛奶中酪蛋白的含量。在本发明中，所述荧光测试的激发波长优选为400～452nm，更优选为440nm，所述荧光测试的激发和发射狭缝独立地优选为3～5mm，更优选均为3mm。本发明对所述荧光测试采用的设备没有特殊要求，采用本领域熟知的荧光测试设备即可。

本发明对所述标准曲线的绘制没有特殊要求，采用本领域熟知的绘制方法即可，也可参照上述方案所述标准曲线的绘制方法进行绘制，这里不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的硫磺素T的应用及一种牛奶中酪蛋白的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所用各原料来源为：硫黄素T，购自于上海如吉生物科技(上海，中国)公司，酪蛋白(作为标准品酪蛋白)购自于西格玛试剂公司，葡萄糖、乳球蛋白、乳清蛋白、尿素和牛血清蛋白购自于西格玛试剂公司。

实施例1

荧光检测不同浓度硫黄素T对酪蛋白的识别能力：

将购买的标准品酪蛋白准确称取25mg溶解在5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)中，在室温下温和磁力搅拌2小时，待其溶解，得到澄清的酪蛋白溶液(浓度为5mg/mL)。

将上述酪蛋白溶液准确取20μL，共称取10份，然后分别加入不同体积的硫黄素T溶液(浓度1mM，溶剂为水，加入体积分别为10、20、30、50、 60、80、90、100μL)，再加入一定量的PBS缓冲液，使混合液总体积为1mL，混合液中，酪蛋白浓度为100μg/mL，硫黄素T浓度依次为10、20、30、50、 60、80、90、100mM。

用从日本岛津公司购买的型号为RF-5301PC的荧光光谱仪对上述混合液进行检测，采用晔辉玻璃仪器厂购买的狭缝3mm的石英比色皿来测量荧光强度。测试条件为：激发波长为440nm，测量时激发和发射狭缝分别为 3mm和3mm。得到的结果如图1所示，其中a为荧光光谱，b为荧光强度统计曲线。结果显示，当ThT分子的浓度在80mΜ时，具有较强的荧光效应，后续实施例将会采用该浓度进行检测。

实施例2

ThT对于标准品酪蛋白的线性测试：

采用实施例1的荧光测试手段，采用浓度为80μM的ThT与不同浓度的标准品酪蛋白混合，具体的操作过程为：将实施例1配制的5mg/mL的酪蛋白溶液准确取不同体积(分别为1、2、4、8、12、16、20、40μL)，然后加入80μL硫黄素T溶液(浓度1mM，溶剂为水)，再加入一定量的PBS 缓冲液，使总体积为1mL。使得混合液中酪蛋白浓度分别为5、10、20、40、60、100、200μg/mL，硫黄素T浓度为80mM。

对本实施例的混合液进行荧光测试，测试条件同实施例1，重复以上实验三组，扣除偏差大的点，做成曲线及折线图，结果见图2。其中a为不同浓度酪蛋白结合发光情况的荧光谱图，b为得到的线性曲线以及线性方程。结果表明，ThT对酪蛋白的线性检测范围在5～200μg/mL内，并且根据b中斜率计算得到检测限达到0.15μg/mL(3σ)，R²＝0.996。

实施例3

实际样品纯牛奶中酪蛋白的检测：

将2mL的纯牛奶(购自当地超市)采用醋酸/醋酸钠缓冲溶液调节pH 值到4.3，然后在3200rpm下离心10分钟，得到酪蛋白；将所述酪蛋白分散到2mLPBS缓冲液(pH＝7.4)中清洗两遍，再溶解到2mLPBS缓冲液中并再用PBS缓冲液稀释1×10⁵倍，以避免其他杂质的干扰，得到稀释液；取 100μL稀释液与80μL硫黄素T溶液(浓度为1mM，溶剂为水)、再加入 820μLPBS缓冲液混合，得到待测混合液，所述待测混合液中硫黄素T的浓度为80μM。

对本实施例的混合液进行荧光测试，测试条件同实施例1，根据标准曲线(图2中b)计算酪蛋白的含量，得到的结果如表1所示。

表1本发明和现有检测方法的检测结果

表1的结果表明，本发明采用荧光法检测酪蛋白具有较高的检测灵敏度，得到的回收率在92.9％到104.8％之间，与国标法(ChineseGB/T21676-2008)相符。

针对牛奶体系的选择性测试：

对牛奶中含量较高的共存物Whey(乳清蛋白)、lactoglobulin(乳球蛋白)、 BSA(牛血清蛋白)、lactose(乳糖)、glucose(葡萄糖)、lecithin(卵磷脂)、stearicacid(硬脂酸)、palmiticacid(棕榈酸)、myristicacid(肉豆蔻酸)、V_B5、V_B1、V_B6、V_m、V_D3、V_E、V_C、Na⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、K⁺、 Mg²⁺、Ni²⁺、Urea(尿素)和melamine(三聚氰胺)进行了识别测试，具体的操作过程是：将实施例1制备的5mg/mL的酪蛋白溶液准确取24μL，然后加入80μL硫黄素T溶液(浓度1mM，溶剂为水)，再加入一定量的PBS 缓冲液，使总体积为1mL，得到含酪蛋白的混合液；使得混合液中酪蛋白浓度为120μg/mL，硫黄素T浓度为80mM。

同时采用水分别将上述共存物溶解，配制浓度均为1mg/mL的溶液，分别取120μL溶液与80μL硫黄素T溶液(浓度为1mM，溶剂为水)、再加入800μLPBS缓冲液混合，得到各共存物的混合液，所述各共存物混合液中硫黄素T的浓度均为80μM，各共存物的浓度均为120μg/mL。

对上述各混合液进行荧光测试，测试条件同实施例1，检测结果见图3。结果表明，硫黄素T分子对酪蛋白的识别具有专一性，对其他分子没有荧光识别作用或者识别较弱。

由以上实施例可知，本发明提供了硫黄素T在检测酪蛋白中的应用，利用硫黄素T与酪蛋白具有较强的结合能力，且结合后会引起酪蛋白的聚集，聚集后的酪蛋白会限制硫黄素T的自由旋转，从而产生荧光发射现象，进而实现对酪蛋白的检测。

本发明将硫黄素T用于牛奶中酪蛋白的检测，具有较高的灵敏度和选择性，硫黄素T对酪蛋白的线性范围在5～200μg/mL内，并且检测限达到 0.15μg/mL(3σ)。将其应用到实际样品牛奶中酪蛋白的检测，其回收率在 92.9％到104.8％之间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.硫黄素T在检测酪蛋白中的应用。

2.一种牛奶中酪蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

对牛奶中的酪蛋白进行提取，得到含酪蛋白的提取物；

将所述提取物、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合，得到混合液；

对所述混合液进行荧光测试，根据酪蛋白浓度与荧光强度的标准曲线，得到牛奶中酪蛋白的含量。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述提取的方法包括：采用醋酸/醋酸钠缓冲溶液调节牛奶的pH值为4.3，分离后得到含酪蛋白的提取物。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述荧光测试的激发波长为400～450nm。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光测试的激发和发射狭缝独立地为3～5mm。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述混合液中硫黄素T的浓度为10～100μM。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述荧光测试时混合液的用量为1mL。

8.根据权利要求2、6或7所述的检测方法，其特征在于，所述硫黄素T溶液的浓度为0.1～10mM，溶剂为水或PBS缓冲液。

9.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。

10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，将所述提取物、PBS缓冲液和硫黄素T溶液混合的过程包括：将所述提取物溶解到PBS缓冲液中，然后再和硫黄素T溶液混合。

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