CN101421304A - 亲和区 - Google Patents

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CN101421304A CNA2007800134201A CN200780013420A CN101421304A CN 101421304 A CN101421304 A CN 101421304A CN A2007800134201 A CNA2007800134201 A CN A2007800134201A CN 200780013420 A CN200780013420 A CN 200780013420A CN 101421304 A CN101421304 A CN 101421304A
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Abstract

本发明提供了一种用于从IgIV分子的集合中选择出至少一种包含亲和区的IgIV分子的方法，其中该亲和区能够与错折叠蛋白和/或交叉－β结构的表位和/或包含交叉－β结构的蛋白的表位相互作用，所述方法包括将IgIV分子的集合与错折叠蛋白和/或交叉－β结构和/或与包含交叉－β结构的蛋白相接触以及收集至少一种包含与所述错折叠蛋白和/或表位相互作用的亲和区的IgIV分子。

Description

亲和区
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学、结构生物学和医学领域。
背景技术
静脉注射的免疫球蛋白(IgIV)是看起来健康的动物或人类的免疫球蛋白，这些球蛋白从血清或血液收集。IgIV对于动物和人类被认定是缺少抗体的。所述缺少抗体的原因可能是影响免疫系统的疾病例如AIDS，或者引起完全或部分无γ球蛋白血症(a-gammaglobulinaemia)或低丙种球蛋白血症(hypogammaglobulinaemia)的先天性缺陷例如原发性免疫缺陷综合症(SCIDS)。从人血清或血液收集的免疫球蛋白可以许多不同名称例如“静脉注射人类免疫球蛋白”(IgIV，或IVIg)商业获得。由于IgIV是在1981年首次介绍用于上述免疫缺陷人类的免疫球蛋白替代疗法，所以它们也已非适应症疗法(off label)地应用与患有广大多种多样的疾病的患者，并且大许多病例中，利用IgIV的实验治疗证明是成功的。
由于作用机理至今还没有被阐明，所以利用IgIV的许多非适应症治疗是尝试实验，并且结果是相当不可预知的。
利用IgIV的治疗不是没有危险。自从1981年以来，(美国)食品及药物管理局(FDA)已经接到超过114个世界范围(美国大约83个)与给予这些产品有关的肾功能不全和/或急性肾衰竭的有害事件报告。尽管极性肾衰竭在多数病例中被成功处理，但是世界范围内报道了17个患者死亡。死亡的患者中许多患有严重潜在病症。对于在患者中与给予IgIV有关的其他报道的副作用参见表1。
总之，利用IgIV治疗人类不是明确地局限于特定疾病病症，缺少对作用模式的清楚理解并且对于新型疾病单元的IgIV治疗的结果是不可预知的。大量IgIV的给予涉及有害副作用的危险。因此，需要改善目前的IgIV治疗(疗法)。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于改善IgIV疗法的器械和方法。另一个目的是提供一种对来自IgIV池的一组免疫球蛋白的选择和/或纯化，以及一种制备免疫球蛋白或其功能等价物的可替换方式以便获得一种免疫球蛋白或其等价物，适用于治疗一种疾病或一组疾病，相比于IgIV具有至少一种改善的性能，例如降低有害副作用的危险和/或改善的治疗作用。至今，本领域技术人员还不知晓如何开始以及进行那一种选择。
本发明提供了一种领悟，即富集于能够与错折叠蛋白的表位、交叉-β结构的表位和/或包含交叉-β结构的蛋白的表位相互作用的IgIV分子中的IgIV的选择相比于目前使用的IgIV来说具有改善的性能。在其他方面中，因为有害副作用至少部分地被预防和/或治疗作用被改善，所以所述选择优于目前使用的IgIV。
错折叠蛋白(misfolded protein)在本文中定义为具有不同于天然、非淀粉样蛋白(non-amyloid)、非交叉-β结构结构的结构的蛋白。因此，错折叠蛋白是具有非天然三维结构、和/或交叉-β结构、和/或淀粉样蛋白结构的蛋白。蛋白错折叠对于许多种疾病，经常涉及老化(如淀粉样蛋白疾病)具有病因学重要性。错折叠疾病也称为构象疾病。目前，已经描述了超过30中错折叠疾病，包括但不限于局部或系统性淀粉样变性病，如阿尔茨海默病和渗析相关淀粉样变性病、帕金森病以及海廷顿氏病等。我们之前披露了，除了这些已知的错折叠疾病之外，许多其他的疾病(其中大量仍然是部分或很大程度上不清楚病因，包括(自身)免疫疾病和动脉粥样硬化症)与蛋白错折叠相关(专利WO 2004004698(EP1536778)以及相关专利)。对于这些疾病中的许多疾病，没有获得充分的治疗或治愈。我们还披露了其他过程，其中多种可以是疾病相关的，如在它们的寿命结束时从废蛋白体的清除、血液凝固、血小板聚集和血纤蛋白溶解与蛋白错折叠相关。
除了错折叠蛋白在疾病发作和/或疾病进展中的作用，蛋白错折叠还是多种并发症的原因，如自身抗体的有害产生、过敏反应和其他炎症反应或变应性反应，与使用蛋白质药物相关。为此，蛋白错折叠在基于蛋白质的药物的生产、储存和应用过程中是主要关注点。
最后，错折叠蛋白有助于诱导免疫性，并错折叠蛋白可用来触发和/或增强免疫反应，例如对于疫苗中的应用。
错折叠蛋白趋于多聚化(multimerize)并且可引发纤维化(fibrillization)。这可导致形成可在尺寸上很大程度发生变化的无定形聚集体。在某些情况下，错折叠蛋白在性质性上更规则和纤维状。术语淀粉样蛋白(amyloid)最初引入用来定义纤维丝，其由错折叠蛋白形成并且在患有各种已知的错折叠疾病的患者的器官和组织中发现，统称为淀粉样变性病。通常，淀粉样蛋白表现为具有无限长度且平均直径为10nm的纤维丝，细胞外沉淀，用染料刚果红(Congo red)和硫磺素T(ThT)染色，当结合刚果红时在偏振光下表现出特征性绿光双折射，包含β折叠二级结构，并且包含特征性交叉β构象(参见以下)，如通过X射线纤维衍射分析确定的。然而，由于已经确定，蛋白错折叠是一种更常见现象以及由于错折叠蛋白的许多特性与淀粉样蛋白共享有，所以术语淀粉样蛋白已在更广范围内使用。现在，术语淀粉样蛋白也用来限定细胞内原纤维和体外形成的原纤维。而且术语淀粉样蛋白类和淀粉状类似物(amylog)用来指示具有与淀粉样蛋白共享的性质的错折叠蛋白，但这没有达到对淀粉样蛋白的所有标准，如上列出的。
总之，错折叠蛋白在特性上是高度不同的，范围包括单体错折叠蛋白，至小寡聚物种，有时称为初原蛋白，较大聚集体具有无定形外观，直至大的高度有序原纤维，它们所有的外观可共享有淀粉样蛋白提及的结构特征。如本文使用的，术语“错折叠体(misfoldome)”涵盖错折叠蛋白的任何集合。
没有达到对于被鉴定为淀粉样蛋白的所有标准的淀粉样蛋白和错折叠蛋白可与淀粉样蛋白和/或与其他错折叠蛋白共享有结构和功能特征，与它们变化的氨基酸序列无关。共享的结构特征包括例如结合至某些染料如刚果红、ThT、硫磺素S，伴随有染料的荧光增强；多聚化；以及结合至某些蛋白如组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、用于高级糖化终产物的受体(RAGE)和伴侣蛋白，如热休克蛋白，象BiP(grp78或免疫球蛋白重链结合蛋白)。共享的功能活性包括tPA的激活和细胞反应的诱导，如炎性反应，以及细胞毒性的诱导。
错折叠蛋白的一个亚类例如淀粉样蛋白的独特标志是存在交叉β构象或交叉β构象的前体形式。
交叉β结构是肽和蛋白中的二级结构要素。交叉β结构(也成为“交叉-β”结构)被限定为蛋白或肽的一部分、或肽和/或蛋白的装配体的一部分，其包括单β-链(第1阶段)和/或一(n阶第n个次序)组的β-链(第2阶段)、和/或通常排列在β-折叠中的一组β-链(第3阶段)、和/或尤其是一组堆叠的β-折叠(第4阶段)，也成为“淀粉样蛋白”。交叉β结构在蛋白错折叠例如蛋白的变性、蛋白水解或展开时，在形成交叉β结构前体形式之后形成。交叉β结构前体限定为在形成交叉β结构的任何上述结构阶段之前的任何蛋白构象。这些存在于交叉β结构中的结构要素(元件)通常缺乏蛋白(天然部分)的球状区域。交叉β结构的存在例如用X射线纤维衍射或结合硫磺素T或结合刚果红、伴随染料的荧光增强而得到证实。交叉β结构前体的典型形式是部分或完全错折叠蛋白。错折叠蛋白的典型形式是部分或完全展开的蛋白，部分再折叠蛋白、部分或完全聚集蛋白、寡聚或多聚蛋白、或者部分或完全变性蛋白。交叉β结构或交叉β结构前体可表现为单体分子，分子的二聚体、三聚体、直至寡聚装配体，并且可表现为多聚结构和/或分子的装配体。
任何前述状态的交叉β结构(前体)可以可溶形式在水溶液和/或有机溶剂和/或任何其他溶液中出现。交叉β结构(前体)也可作为固体状态物质存在于溶液中，例如作为不可溶聚集体、原纤维颗粒、例如作为悬液或在固态交叉β结构相和溶剂相中分开。
蛋白错折叠、交叉β结构前体的形成、聚集体或多聚体和/或交叉β结构的形成可在任何包含肽的组合物中出现，为至少2个氨基酸，和/或蛋白质。术语“肽”用来包括寡肽以及多肽，而术语“蛋白”包括蛋白性质类分子包括肽，在有和没有翻译后改性如糖基化和糖化。还包括脂蛋白以及包含蛋白性质部分的复合体，如蛋白-核酸复合体(RNA和/或DNA)、膜-蛋白复合体等。如本文使用的，术语“蛋白”还涵盖蛋白质性质的分子、肽、寡肽和多肽。因此，在本申请中使用“蛋白”或“蛋白和/或肽”具有相同含义。
堆叠β-折叠的典型形式是以原纤维状结构，其中β-折叠在原纤维轴方向或垂直于原纤维轴方向上堆叠。交叉β结构中β-折叠的堆叠方向垂直于长纤维轴。交叉β结构构象是触发诱导清除和破碎旧蛋白或肽的级联行为的信号。当清除不充分时，不希望的蛋白和/或肽聚集并形成毒性结构，范围从可溶性寡聚物直至沉淀原纤维和无定形斑块。这样的包含聚集体的交叉β结构构象成为各种疾病的基础，例如亨廷顿氏病、淀粉样变性病型疾病、动脉粥样硬化、糖尿病、出血、血栓症、癌症、败血病和其他炎性疾病、类风湿关节炎、可传染海绵状脑病如克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、多发性硬化、自身免疫疾病、与丧失记忆有关的疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和其他神经疾病(癫痫)、脑病和全身性淀粉样变性病。
交叉β结构例如是在蛋白和肽展开以及再折叠过程中形成的。肽和蛋白的展开在有机体内定期地出现。例如，肽和蛋白经常在它们生命周期结束时自发地展开和再折叠。此外，展开和/或再折叠是由环境因素例如pH、糖化、氧化性压力、热、辐射、机械应力、蛋白水解等诱导的。如本文使用的，术语“交叉β结构”也涵盖任何交叉β结构前体和任何错折叠蛋白，即使错折叠蛋白不必需包含交叉β结构。术语“交叉β结合分子”或“能够特异性地结合交叉β结构的分子”也涵盖能够特异性地结合任何错折叠蛋白的分子。
术语展开、再折叠和错折叠涉及蛋白或肽的三维结构。展开是指蛋白或肽丢失其三维结构的至少部分。术语再折叠涉及卷绕回到某种三维结构中。通过再折叠，蛋白或肽可恢复其天然构造，或者可出现错误再折叠。术语“错误再折叠”是指当形成不同于天然构造的三维结构时的情形。错误再折叠也称为错折叠。蛋白和肽的展开及再折叠涉及交叉β结构形成的危险。交叉β结构的形成有时也在蛋白合成之后直接出现，而没有正确地折叠蛋白中间体。
交叉β路径：对错折叠蛋白的反应
我们之前披露了传感错折叠蛋白出现的生物学机制，导致错折叠蛋白的破坏和清除，称为交叉β路径(专利WO 2004 004698)。我们实验地鉴定了大量蛋白，包括tPA和紧密相关的蛋白因子XII、肝细胞生长因子激活剂(HGFA)和纤连蛋白，其识别错折叠蛋白，具有与包含交叉β结构或交叉β结构前体形式的蛋白共有的结构特征。基于文献的分析，我们还披露了大量另外的蛋白，包括细胞表面受体，涉及(暗示)身体对错折叠蛋白的反应，包括错折叠蛋白的清除，因而是交叉β路径的一部分。我们披露了大量的这些蛋白，如tPA及其相关因子，能够直接识别错折叠蛋白。已知所述蛋白结合大量似乎对于3D结构和/或氨基酸序列无关的配体。这些蛋白配体经常涉及疾病，但是共有结构的存在或识别的顺序模式没有较早地鉴定。总之，tPA、它的相关因子以及识别错折叠蛋白的其他蛋白因此是有利于清楚错折叠蛋白的机制的一部分，即交叉β路径。其中涉及交叉β路径的生理学过程的实例是长期增强(potentiation)、先天免疫、获得性免疫、血管发生、血液凝固、血栓形成和纤维蛋白溶解(fibrinolysis)。交叉β路径的故障将导致产生形成危险错折叠蛋白的蛋白，有或者没有伴随通常在淀粉样蛋白中观察到的结构特征，例如具有交叉β构象的聚集体或原纤维。如上以及以前在专利申请WO 2004 004698所述，错折叠蛋白存在各种健康问题和疾病，其中的一部分之前与蛋白错折叠以及还没有同样相关的其他方面是相关的。这些健康问题和疾病包括亨廷顿氏病、局部化淀粉样变性病、动脉粥样硬化、糖尿病、出血、血栓症、癌症、败血症、炎性疾病、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、其他自身免疫疾病、与丧失记忆相关的疾病如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病和其他神经疾病，例如癫痫、脑病、脑炎、白内障、全身性淀粉样变性病、传染性海绵状脑病如克罗伊茨费尔特-雅各布病，以及与患有肾机能不全的患者的透析相关的淀粉样变性病。
总之，交叉β路径包括分子，其中的部分直接结合错折叠蛋白，称为交叉β结构结合化合物或交叉β结合化合物或错折叠蛋白结合化合物，其有助于错折叠蛋白的传感、破坏和/或清除。交叉β路径传感蛋白的任何非天然3D折叠并通过各种模式响应。交叉β路径还包括能够与错折叠相互作用以有助于折叠和/或展开的分子，如伴侣分子，以便防止聚集体、原纤维的积累和/或错折叠蛋白沉积。
例如，tPA是在对直接结合至错折叠蛋白的反应中bei激活的丝氨酸蛋白酶。这样的一种错折叠蛋白是原纤维，存在于血凝块中。一旦激活，tPA从血纤维蛋白溶酶原产生纤溶酶。丝氨酸蛋白酶纤溶酶由切割许多底物如原酶(proenzyme)，象原胶原酶，以及细胞外基质蛋白，象原纤维。同样地，tPA引发级联行为以降解错折叠蛋白的聚集体，如血凝块。
另一个实例是RAGE。该受体涉及结合糖化蛋白、淀粉样蛋白和其他配体(包含淀粉样蛋白性质)，并且涉及许多疾病如淀粉样变性病、糖尿病和自身免疫疾病的病理。该受体的可溶形式的给药在多种前述蛋白错折叠疾病的动物模型中具有有益效果。
涉及交叉β路径的错折叠蛋白结合分子的另一个实例是伴侣分子、或热休克蛋白(HSP)、或应力蛋白。伴侣分子例如触珠蛋白(haptoglobin)和丛生蛋白(clusterin)有助于以ATP独立方式阻止错折叠蛋白聚集体的形成的事实使它们成为在交叉β路径中起重要作用的候选。可能是一系列蛋白，其中样品蛋白的构型作用是一致的。这些蛋白之中，在交叉β路径中共同起作用的是伴侣分子，例如HSP60、HSP90、DNAK、丛生蛋白、触珠蛋白、gp96、BiP、其他(位于细胞外的)HSP、蛋白酶、例如HGFA、tPA、血纤维蛋白溶酶原(plasminogen)、因子XII、IVIg、以及细胞表面受体。涉及交叉β路径的细胞表面受体包括低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP，CD91)和相关物质、CD36、清道夫受体A、清道夫受体B-I、RAGE，在文献中总称为多配体受体。
概括地说，交叉β路径能够阻止错折叠蛋白形成毒性结构，例如淀粉样交叉β结构寡聚体和原纤维，并且能够降解和清除错折叠蛋白(的聚集体)。作为交叉β路径的部分，错折叠蛋白结合至多配体错折叠蛋白结合受体，导致胞吞以及随后的蛋白水解破坏。
因此，交叉β路径的调节对蛋白错折叠疾病提供治疗机会。
错折叠疾病
如上所述，与蛋白错折叠有关的疾病，称为蛋白错折叠疾病、错折叠蛋白疾病、蛋白错折叠紊乱、构象疾病、错折叠蛋白相关和/或有关疾病、或蛋白折叠紊乱，包括淀粉样变性病，并且蛋白错折叠还与许多其他疾病和健康问题以及生理过程有关，不必需通过术语淀粉样变性病或蛋白错折叠紊乱来加以限定的，其中的几种在上文提及。
根据本发明，富集于能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的IgIV分子中的IgIV的选择，相比于目前所使用的IgIV具有至少一种改善的性能。因此，本发明提供一种用于从IgIV分子的集合中选择至少一种能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的IgIV分子的方法，这优选通过使IgIV分子的集合与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相接触以及收集至少一种包含与所述蛋白和/或表位相互作用的亲和区的IgIV分子来进行。因此，提供了一种用于从IgIV分子选择至少一种包含能够与错折叠蛋白和/或与或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的IgIV分子，所述方法包括使IgIV分子的集合与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相接触以及收集至少一种包含与所述蛋白和/或表位相互作用的亲和区的IgIV分子。
亲和区影响蛋白和肽结合至表位的亲和力，并且在本文中被限定为能够特异性地结合至表位的抗体的至少部分。所述亲和区例如包括免疫球蛋白的至少部分(如在IgIV中)、单克隆抗体的至少部分和/或人源化抗体的至少部分。所述亲和区优选包括抗体重链的至少部分和/或轻链的至少部分。在一个实施方式中，所述亲和区包含成双的F(ab’)2或单个形式Fab片段。
通常，亲和区出现在细胞如T-细胞或B-细胞或其他免疫细胞的表面上，在这种情况下，它们经常是细胞受体的部分。亲和区还以合成形式出现在噬菌体显示文库中。
本发明的一个实施方式包括是IgIV溶液的免疫球蛋白集合与错折叠蛋白和/或交叉β结构的集合相接触，优选与给定的所选交叉β结构、和/或与包含交叉β结构的蛋白，优选给定的所选包含交叉β结构的蛋白相接触。由亲和区识别的表位在一个实施方式中位于交叉β结构本身上。因此，本发明一个实施方式提供了根据本发明的一种方法，用于从IgIV分子的集合中选择至少一种包含亲和区的IgIV分子，该亲和区能够与交叉β结构的表位和/或与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用，其中所述表位是蛋白的交叉β结构的至少部分。在另一实施方式中，所述表位不必需位于所述交叉β结构上。通常地，交叉β结构诱导蛋白的不同折叠，其经常导致迄今未知的表位的诱导和/或显露，或者所述蛋白已知表位的改变或缺失。因此，还可能的是，其中交叉β结构是在错折叠过程中形成的蛋白显示与交叉β结构存在相关的表位。在一个实施方式中，选择。能够特异性地结合这样诱导和/或显露的表位的IgIV分子。
如前所述，错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的(错折叠)蛋白是许多疾病病症的潜在原因。所述病症(与交叉β结构存在有关)通过给予根据本发明的IgIV分子集合而至少部分地消除。根据本发明的IgIV分子的集合尤其适用于从一个样品例如体液或组织样品去除错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白或肽(优选涉及和/或与疾病有关)，从而降低(循环)错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白或肽的量。如本文使用的，术语“去除错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白或肽“包括从样品分离所述蛋白和/或肽，以及结合、覆盖、屏蔽和/或中和(使无效)错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白或肽的任何其他部分，由此至少部分地防止所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白或肽与其他结合分子的相互作用。这种方式，至少部分地减少了与错折叠蛋白和/或交叉β结构的存在相关和/或与包含交叉β结构的蛋白或肽的存在相关的有害作用，例如AIDS中的感染和/或发炎、和/或这样的疼痛且破坏性疾病的病症例如类风湿性关节炎和多发性硬化。相同原理也适用于炎症，其中蛋白由于交叉β结构(在某方面由身体产生或由病原体产生和/或诱导的交叉β结构)的存在发生改变。
由于与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白反应的抗体的低浓度和广泛多样性，所以必须给予相对较大量的IgIV以获得阳性结果，其增大有害副作用的危险。此外，在目前的IgIV治疗中，身体不必需通过给予大量对于它们给药的疾病没有作用的蛋白而受到逼迫。因此，主要优点是现在利用根据本发明的方法可以从IgIV池中选择能够特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的IgIV分子。根据本发明的包括富集的能够特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的免疫球蛋白部分的IgIV制剂尤其适用于给予处于患有危险或已经患有交叉β结构相关疾病的非人动物或人类。因为现在给予富集的IgIV选择，包括能够特异性地与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的低蛋白发生反应的IgIV分子，已经可以使用低于目前IgIV治疗中的IgIV分子的总浓度并且仍然具有与目前使用的IgIV相同或甚至更好的治疗作用。
包含能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的IgIV分子以各种方式选自IgIV分子的集合。例如，所述IgIV分子通过使IgIV分子池与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相接触而加以选择。随后，收集结合的IgIV分子。在一个实施方式中，所述交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白与疾病相关。例如，优选使用髓磷脂、髓磷脂碱性蛋白和/或髓磷脂少突细胞糖蛋白以便选择IgIV分子以用于至少部分地治疗和/或预防多发性硬化。同样，优选使用胶原和/或炎性分泌物(风湿性，rheuma)因子以便选择IgIV分子以用于至少部分地治疗和/或预防类风湿性关节炎。用于选择能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的IgIV分子的各种可选替换方法在本领域可以获得，它们适合用于根据本发明的方法。
在本发明的一个优选实施方式中，能够与任何给定的感兴趣错折叠蛋白和/或任何给定的感兴趣交叉β结构表位和/或任何给定的包含交叉β结构的蛋白的感兴趣表位相互作用的IgIV分子是利用错折叠蛋白、交叉β结构表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位中的任一种加以选择的。根据本发明，利用一种或多种包括错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白或淀粉样蛋白的亲和性基质，亲和区从亲和区的任意组合物中选取，其能够优先地、选择性地并以增大的亲和力地结合至错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白(其不必需包括在一组用于选择的亲和区中)。这些实例证实了，利用带有固定的所选错折叠蛋白的固体载体(支持物)，分离了对理论上任何错折叠蛋白具有亲和力的亲和区。
另外，根据本发明，利用具有原纤维状外观的错折叠蛋白以及缺乏原纤维状特征的错折叠蛋白聚集体，选择对于错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白表现出宽范围特异性的亲和区。例如，利用Aβ原纤维-亲和性基质，选择对例如错折叠BSA-AGE的非原纤维状多聚体、Aβ和dOVA的聚集体显示亲和力的亲和区。另一方面，利用非原纤维状HbAGE基质或非原纤维状错折叠IgIV基质，选择有效结合至Aβ原纤维的亲和区。
在实例中，利用牛血清白蛋白-AGE基质，选择了对人类Aβ、人类白蛋白和小鸡卵白蛋白具有亲和力的亲和区。利用人类Aβ基质，选择了能够结合至糖化牛血清白蛋白和小鸡卵白蛋白的亲和区。利用糖化人类Hb基质，选择了能够结合至错折叠小鼠IgG的亲和区。因此，根据本发明，利用起源于一个物种的错折叠蛋白，可选择对起源于另一个物种的错折叠蛋白具有亲和力的亲和区。
此外，根据本发明，从人类IgIV亲和区集合中，可选择起源于至少4个不同B-细胞克隆体(产生IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型)的亲和区的选择，其表现出对于宽范围的蛋白的结合性能，其中所述蛋白起源于不同物种并且不需要具有实质性氨基酸序列同源性，也不需要具有相似氨基酸序列长度，也不需要在它们的天然折叠中具有重叠或相似3D结构，尽管它们共享与错折叠蛋白共有的结构特征。所选具有对错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白的特异性的亲和区对于各种各样的应用很有用。以下，更详细地概述用于针对蛋白错折叠疾病的疗法的富集亲和区。
根据本发明的方法使得能够从其他物质之中选择出可用于治疗和/或诊断与蛋白错折叠相关的疾病的亲和区。根据本发明的方法的一个概括概述的优选实施方式在图26中描述。选择的任何错折叠蛋白(图26中的混合X和Y，表示错折叠体)适合用来选择亲和区，但优选地使用与疾病相关的错折叠蛋白(图26中的混合A)。由于错折叠蛋白共享有共有特性，所以通常，选择结合于多于一种特定错折叠蛋白的亲和区。如在本申请中所描述的，还可以选择优先结合错折叠蛋白的一个亚类或甚至单个类型的亲和区。通过组合一组系列物(column)，本领域技术人员能够选择感兴趣的可用于治疗和/或诊断通常的错折叠或者优先用于特定疾病或其中涉及选择错折叠蛋白的疾病组的那些亲和区。如在图26中举例说明的，柱1的应用(不必需与疾病有关的错折叠蛋白的混合)将导致对通常的错折叠蛋白具有亲和力的亲和区(制剂1)，即错折叠体。这样的亲和区适用于诊断以及用于治疗。然而，对于治疗目的，使用这样的亲和区包含(暗示)副作用的潜在危险，这是由于这样的事实：引入患者的亲和区不仅结合至疾病相关错折叠蛋白(期望的治疗作用)，而且结合至存在的其他错折叠蛋白(不期望的治疗副作用)。通过组合柱I和III，并且更优选地组合柱II和IV，选择的那些亲和区有限与对疾病或一组疾病特异性的错折叠蛋白相互作用。柱IV用来去除那些与选择的靶疾病不相关的错折叠蛋白相互作用的亲和区。因此，优先选择制剂3和4用于特定的治疗目的。
因此，为了选择能够特异性地结合与感兴趣疾病相关的错折叠蛋白的亲和区，优选使用两个柱。一个柱(“通用柱”)包含与所述疾病不必需相关的错折叠蛋白。相比于该通用柱，另一个柱(“特异性柱”)包含更多的与所述疾病相关的错折叠蛋白。优选地，所述特异性柱的错折叠蛋白基本上由与所述疾病相关的错折叠蛋白构成。
在一个实施方式中，首先使用通用柱。在该步骤中，分离能够特异性地结合至任何错折叠蛋白的亲和区。接着，根据该实施方式，使用特异性柱。在这个步骤中，包含该亲和区的组合物富集对于与感兴趣疾病相关的错折叠蛋白特异性的亲和区。
在另一个实施方式中，以上提及的柱以相反顺序使用。首先，使用特异性柱以便分离能够特异性地结合与感兴趣疾病相关的错折叠蛋白的亲和区。实践中，所得组合物还将包括能够特异性地结合与所述感兴趣疾病不相关的错折叠蛋白的亲和区。因此，优选随后使用通用柱。该第二个柱的重要特性是，其不包含或较低程度地包含与所述感兴趣疾病相关的错折叠蛋白。所述第二柱将结合能够特异性地结合u所述感兴趣疾病不相关的错折叠蛋白的亲和区，但其将不结合或较低程度地结合对与所述感兴趣疾病相关的错折叠蛋白特异性的亲和区。因此，流过部分(flow through fraction)被富集在对于与所述感兴趣疾病相关的错折叠蛋白特异性的亲和区中。
在一个实施方式中，所选IgIV分子对它们与患有所述疾病的人类或动物身体样品中给定的感兴趣蛋白或肽的反应性进行测试。根据本发明的所选IgIV集合结合来自身体样品的感兴趣的特异性蛋白的能力例如利用血小板聚集试验、调理吞噬试验(opsonophagocytosis test)、和/或补体激活或已知试验进行检测。
另一个实施方式提供了根据本发明的一种选择方法，其中错折叠蛋白和/或表位(为交叉β结构或包含交叉β结构的蛋白的表位)附着于载体例如胶乳或琼脂糖或琼脂糖凝胶或玻璃或塑料或金属或任何其他合适物质或化合物或材料或分子的球体或颗粒或珠子或薄板或链，以增强选择的效力，例如磁珠。因此，本发明提供如本文所述的一种方法，其中所述错折叠蛋白和/或所述表位结合至固体载体。
此外，本发明提供了IgIV分子的集合，富集包含能够特异性地与错折叠蛋白和或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的IgIV分子。如上解释说明的，所述IgIV分子的集合相比于目前使用的IgIV具有至少一种改善的性能。根据本发明的IgIV分子的集合优选地利用根据本发明的方法从目前使用的IgIV中选取。利用本发明的方法，本领域技术人员能够从大的IgIV集合中选择较小的IgIV分子选集(selection)，其富集包含能够特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构上的表位和/或包含交叉β结构的蛋白上的表位的亲和区的IgIV分子。因此，一个实施方式提供了一个IgIV分子的集合，富集包含能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的IgIV分子，通过根据本发明的一种方法加以选择的。根据本发明的富集IgIV分子集合适合于以比目前使用的IgIV制剂更小量给予需要这种药物的患者，因为在所述富集集合中能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构上的表位和/或包含交叉β结构的蛋白上的表位相互作用的亲和区相对增多。
本发明进一步提供了一种包含至少5个分离、合成和/或重组分子的组合物，其中所述分子包含能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区。优选地，所述组合物包含至少8个，更优选至少10个以上提及的分离、合成和/或重组分子。在一个优选实施方式中，使用合成和/或重组分子。合成和/或重组分子的组合物的优点是这样的事实，即省略了对IgIV的需要。在其他方面中，这是有利的因为IgIV的供应和可利用度不充分，并且因为存在某些涉及给予来源于人类血液的生物产品的危险(例如，感染朊病毒病和病原体如肝病毒或HIV的危险)。因为本发明已经提供了根据本发明的IgIV分子的富集选集，所以就可以产生具有与所述IgIV分子的所述富集选集在种类上而不必需是在量上相同的至少一种相似性质的合成和/或重组分子。一旦形成了IgIV某些免疫球蛋白的富集选集，则本领域技术人员能够通过本领域已知的方法(例如但不限于Maldi-Toff方法)确定所述免疫球蛋白的氨基酸序列、或至少所述免疫球蛋白的亲和区。所述氨基酸序列然后优选用来选择或生产合成或部分合成的分子，该分子具有与根据本发明所选的IgIV分子的至少一个亲和区在种类上而不必需是在量上相同的结合特性。合成或部分合成分子的非限制性实例是通过肽、蛋白或其他分子的重组或化学合成获得的产物。甚至可以筛选具有错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白、或所述蛋白的表位的噬菌体显示文库，以选择具有与所述错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白反应的亲和区的结合分子。因此，一个实施方式提供了一种用于生产根据本发明的组合物的方法，包括限定(定义)能够与错折叠蛋白、交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的至少一种IgIV分子的亲和区的氨基酸序列，以及生产包含所述氨基酸序列的合成和/或重组分子。在另一实施方式中，本发明还提供了一种合成或重组分子，该分子包含能够与错折叠蛋白、交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区，所述分子根据如上所述的方法进行生产。
因此，如与从IgIV分离出来的那些类似的亲和区例如通过采用本领域技术人员已知的标准技术，包括蛋白序列分析、DNA克隆和表达技术重组或合成地制备。本发明的一个实施方式包括以下步骤：(1)至少来自重链和轻链可变区的、或至少来自互补确定区1-3(CDR)的、或至少来自分离亲和区重链(HC)的CDR3的氨基酸序列通过蛋白质序列分析获得。(2)编码所鉴定氨基酸序列的核酸序列，优选DNA序列合成地加以制备。作为对通过蛋白质分析确定的精确序列的可选替换，可生产一个序列，其中引入了一个或多个突变，优选在CDR3中，并且甚至更优选在重链(HC)的CDR3中，以便产生具有改变的亲和力，优选增加和/或更加特异性的亲和力的亲和区。(3)将所述核酸克隆入恰当表达载体中。这样的载体优选已经含有编码期望类型的免疫球蛋白的恒定区的序列，例如以获得IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM、IgA、IgE等。(4)所述载体以任一种方式转导如选择的表达系统中，优选为哺乳动物细胞中。(5)选择表达该亲和区的细胞。(6)重组地制备的亲和区从所述细胞或细胞衍生的培养物上清液进行纯化。如果将突变引入到原始亲和区序列中以优化亲和力，则新制备的亲和区可选地进行再选择，优选利用根据本发明的方法进行选择。这种具有甚至增加的亲和区组分(优选在补体确定区中，优选在CDR3中，甚至更优选在HC的CDR3中)的半合成亲和区的生成优选通过生成半合成文库，如噬菌体显示文库来进行(参见下文)。
除了人类免疫球蛋白如获自血液的IVIg的集合之外，组合文库也可从任何其他组的亲和区，优选一组重组亲和区如存在于噬菌体显示文库中的那些获得(Winter et al.1994；Hoogenboom，1992，1997，2000，2002，2005)。优选地，这样的文库由与哺乳动物亲和区，优选人类亲和区，象免疫球蛋白相关的序列组成。在一个优选实施方式中，包含亲和区集合的这种噬菌体显示文库制备如下(Winter etal.1994，de Kruif et al.1995a，1995b)：首先，从B细胞或包含B细胞的组织中提取RNA。接着，制备cDNA。接下来，扩增编码可变区的cDNA，克隆入恰当噬菌粒载体中并转化到恰当宿主例如大肠杆菌菌株中。以这种方式，亲和区在丝状噬菌体表面上作为融合蛋白被表达，即通过噬菌体显示。噬菌体显示文库例如制备自从健康哺乳动物，优选人类、小鼠、大鼠或骆马(llama)或可替换地从用错折叠蛋白免疫接种的哺乳动物获得的B细胞。在一个实施方式中，噬菌体显示文库制备自来自患有特定疾病，优选错折叠疾病(例如RA)的哺乳动物，优选人类的B细胞。以这种方式，亲和区的集合以特定目的制备以包含对错折叠蛋白特异性的那些亲和区。例如，在一个实施方式中，小鼠用一种错折叠蛋白或错折叠蛋白的选集免疫接种一次或多次(如在实例20中)，B细胞分离自脾并用来制备噬菌体显示文库。在另一个实施方式中，B细胞分离自患有特定疾病例如(类风湿性)关节炎的人类。制备自这些B细胞的cDNA然后优选用来制备噬菌体显示文库。以这样的方式，制备噬菌体显示文库以包含对于涉及所选错折叠疾病的错折叠蛋白具有特异性的亲和区。例如，制备的文库对于Ig的Fc结构域具有亲和区，即如类风湿因子(RF)的亲和区(van Esch et al.2003，Clin Exp.Immunol)。以上述的方式，本领域技术人员能够设计和制备具有亲和区的任何集合的噬菌体显示文库，其中着重于特定疾病或应用。
在一个实施方式中，合成地制备具有这样的亲和区的集合(具有增多的组成组分)(Hoogenboom，1992，1997，2000，2002，2005；de Kruif et al.1995a，1995b)。以这种方式，本领域技术人员能够涉及包含相当多附加多样性的亲和区的文库。优选地，通过在高变区(与抗原相互作用的CDR)中执行附加序列，制得附加亲和区，使可变结构域再成形。除了获自人类序列的亲和区之外，亲和区的集合在一个实施方式中从任何其他物种如骆马、骆驼、羊驼或峰驼形成，以获得亲和区，如骆马抗体，也称为纳米体(nanobody)，具有与这些物种相关的性质。因此，噬菌体显示文库和/或亲和区集合以多种方式制备，例如，从用一种或一组错折叠蛋白免疫接种的哺乳动物制备。在一个特别优选的实施方式中，噬菌体显示文库和/或亲和区集合制备自患有疾病，优选错折叠疾病的哺乳动物。对错折叠蛋白特异性的亲和区优选利用根据本发明的器械(means)和方法，优选联合分离噬菌体的标准方法(步骤)而选自噬菌体显示文库。在一个优选实施方式中，制备了大多数成直线的错折叠蛋白并固定，优选根据本申请中披露的方法中的任一种，随后允许结合噬菌体。在广泛清洗之后，提取结合的噬菌体并通过宿主再感染进行扩增。为了可以仅回收特定的噬菌体，选取过程优选重复多次。最后，分离那些能够特异性地结合错折叠靶的噬菌体。在一个特别优选的实施方式中，从患有疾病的一个个体或个体组合获得的样品中分离错折叠蛋白。例如，利用能够特异性地结合包含交叉β结构的错折叠蛋白的蛋白，如tPA、RAGE或它们的功能等价物，从患有(类风湿性)关节炎的患者的滑液中分离错折叠蛋白。类似地，可使用任何其他样品。
利用如上所述的方法，获得了重组制备的用于错折叠蛋白的亲和区。
在选择恰当的噬菌体(抗菌素)之后，编码分离亲和区的可变区的DNA优选分离自噬菌粒DNA以便产生完全抗体。这根据标准方法易于实施。该DNA优选克隆入编码重链和轻链的恒定区的载体中。可以使用任何载体和任何期望类型的恒定区。载体优选以任何已知方式转导如选择的表达系统，优选哺乳动物细胞中。优选选择表达亲和区的细胞。重组地制得的亲和区优选从细胞或细胞衍生的培养物上清液纯化。以这样的方式，可以制备用于错折叠蛋白的任何免疫球蛋白亲和区(Bloemendal et al 2004；Huls et al 1999a，1999b；Boel et al 2000)。
为了用于人类，优选产生“嵌合”或“人源化”重组亲和区。获自其他物种的亲和区优选以以下方式进行修饰，即非人类序列用人类序列替代(只要是有可能的情形)，同时优选不会过多影响亲和区的结合性能。在一个实施方式中，亲和区是在典型免疫接种方案过程中制备的，优选使用小鼠或大鼠，甚至更优选使用编码人类免疫球蛋白的转基因小鼠。在免疫接种之后，表达单克隆抗体的杂交细胞系优选通过标准方法和/或通过采用上述的噬菌体显示技术进行制备。优选能够特异性地与错折叠蛋白相互作用的单克隆抗体。当使用正常小鼠或大鼠制备时，这样的亲和区的“嵌合”或“人源化”形式例如通过用相关人类同源区替代非人恒定区和相关非人可变区而加以制备(Morrison et al 1984；Jones et al.1986)。此外，在需要时引入不同的恒定区。
在一个优选实施方式中，根据本发明的一种组合物包括至少一种IgIV分子的功能部分、衍生物和/或类似物，该IgIV分子包含能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区。IgIV分子的功能部分限定为在种类上而不必需在量上具有相同免疫学结合性能的化合物。所述功能部分能够结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，虽然不必需达到与所述IgIV分子相同的程度。IgIV分子的功能衍生物限定为一种IgIV分子，其已被改变使得所得化合物的结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的能力在种类上而不必需在量上是基本上相同的。衍生物以多种方式提供，例如通过保守氨基酸替换，其中一个氨基酸残基被另一个具有通常相似性质(大小、疏水性等)的残基所替换，使得整体功能可能没有被严重影响，或甚至被改善。
本领域技术人员能够很好地生成IgIV分子的类似化合物。这可例如通过肽文库的筛选来完成。这样的类似物能够结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，虽然不必需达到与所述IgIV分子相同的程度。
所选IgIV分子和/或包含能够特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位和/或包含交叉β结构的蛋白的表位的亲和区的分离、合成或重组分子在本发明的一个实施方式中用于在体外与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白发生反应并结合。所述分子优选与体液或组织、食物、流体、或包含错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的药物组合物发生反应，并且优选移出结合物质(bound material)。根据本发明的分子的另一种应用是在体内与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白发生反应并结合。
一个优选实施方式提供了根据本发明的一种组合物，其中所述分子的至少一种包括错折叠蛋白和/或交叉β结构结合化合物。错折叠蛋白和/或交叉β结构结合化合物是能够特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构的化合物。错折叠蛋白和/或交叉β结构结合分子是通过增强根据本发明的组合物的分子特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构或包含交叉β结构的蛋白的能力而能够用作效应子分子(effector molecule)。由于所述交叉β结构结合分子而增强的错折叠蛋白和/或交叉β结构的结合例如对于增强从血液循环和/或从身体形成以及去除错折叠蛋白和/或交叉β结构复合体是期望的。可替换地，或者另外地，错折叠蛋白和/或交叉β结构的局部积累如存在于淀粉样蛋白斑块中被消除。
错折叠蛋白和/或交叉β结构结合分子的非限制性实例是组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、肝细胞生长因子激活剂(HGFA)、因子XII、或纤连蛋白、或多配体受体家族的成员如用于高级糖化终产物(RAGE)、或低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)或CD36的指状结构域(也称为纤连蛋白I型结构域)。这样的错折叠蛋白和/或交叉β结构结合分子可以甚至是非蛋白质性质的分子，例如染料(刚果红或硫磺素)。
在一个实施方式中，效应子分子提供给本发明的分离、合成和/或重组分子和/或所选的本发明的IgIV免疫球蛋白。因此，还提供了根据本发明IgIV分子的组合物和集合，其中所述分子的至少一个进一步包含效应子分子。
在一个优选实施方式中，所述效应子分子包含错折叠的抑制剂，例如刚果红。在另一个优选实施方式中，所述效应子化合物能够增强动物(优选人类)的补体系统和/或吞噬细胞系统以便增强不期望交叉β结构(包含其的蛋白)的去除。因此，在一个优选实施方式中，所述效应子化合物包含补体激活因子例如但不限于任何补体蛋白、补体激活细胞因子、C反应性蛋白、血清淀粉样蛋白P补体、正五聚蛋白-3(Pentraxin-3)、免疫球蛋白的Fc区(用于Clq的配体)、补体对照蛋白、能够增强补体对照蛋白的补体激活活性的分子、和/或能够抑制补体对照蛋白的抑制活性的分子。补体对照蛋白的非限制性实例是C1-抑制剂、C4结合蛋白、因子H、因子I、备解素(properdin)、S蛋白、补体受体I型、膜辅因子蛋白、衰变加速因子、C8结合蛋白和CD59。在一个进一步优选的实施方式中，所述效应子化合物能够促进破坏错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白。所述效应子化合物的另一优选性能是促进错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的细胞吸收的能力。一个实施方式提供了根据本发明的一种组合物，其中所述分离、合成和/或重组分子、或所述选择的IgIV分子，包含为蛋白酶或其错折叠蛋白和/或交叉β结构结合部分的效应子化合物。所述效应子特别适合于结合和/或破坏错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或不期望的包含交叉β结构的蛋白。在一个进一步优选的实施方式中，所述效应子化合物包含免疫增强化合物以便增强针对错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的免疫反应。所述免疫增强化合物优选包含细胞因子。
在一个进一步的实施方式中，所述效应子化合物包含错折叠蛋白和/或交叉β结构结合增强因子。这是一种能够增强根据本发明的分子结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或结合包含交叉β结构的蛋白的能力的因子。这样的因子的非限制性实例是硫磺素T和硫磺素S(参见例如实施例4)。
在一个进一步的实施方式中，所述效应子化合物包含有助于在本发明的分子和/或IgIV分子已经结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白之后去除所得复合体的清除信号。清除信号在本领域是熟知的。清除信号的一个优选实例是Fc区的至少部分，更优选能够与Fc受体(优选与FcγIIb受体)相互作用的Fcγ区的至少部分。所述清除信号能够增强从动物(优选人类)血液循环和/或身体去除包含结合至错折叠蛋白和/或交叉β结构或包含交叉β结构的蛋白的根据本发明的分子的复合体。
补体系统的激活导致级联反应，包括发炎、细胞破坏、和组织损伤。在某些情况下，期望对抗补体系统以便减少有害副作用。这样的情形的非限制性实例是如下的情形：在补体系统过多和/或缺少控制的激活或补体系统(持续)激活下而没有正确起作用的负反馈机制或补体系统的过度刺激，例如由于激活剂的持续和/或过度表达水平，例如在发炎、淀粉样变性病和/或类风湿性关节炎期间。因此，在一个实施方式中，使用的效应子化合物是炎症抑制性化合物，优选补体抑制因子例如能够至少部分地抑制或阻断补体蛋白的重要功能和/或能够至少部分地抑制或阻断包含补体系统刺激能力的任何蛋白或化合物的重要功能的免疫球蛋白或化合物。补体抑制因子的非限制性实例是可溶性TNF受体、IL-1受体拮抗剂和抗炎性细胞因子。
在另一个实施方式中，所述效应子化合物包含调理化合物(opsonizing compound)。另外地，或可替换地，本发明的所述分离、合成和/或重组分子本身是调理化合物。调理在本文中限定为诱导和/或增强吞噬细胞如巨噬细胞、多形核白细胞等对物质的吞噬作用的过程。一些物质能够经受和/或避开吞噬作用，例如由于它们的表明特性。在这样的情况下，吞噬作用优选通过调理结合化合物加以诱导和/或增强，其一旦附着于一种物质，则通过吞噬细胞如巨噬细胞和多形核白细胞等促进所述物质的摄取。
在一个实施方式中，利用吞噬细胞，确定了根据本发明的所选IgIV分子和/或分离、合成和/或重组分子是否具有调理能力。根据该实施方式，一旦已经提供了根据本发明的IgIV分子的富集选集，则所述集合优选用错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白孵育，其中在结合至错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的IgIV分子的复合体随后与吞噬细胞接触之后，以便确定哪一个IgIV分子能够诱导和/或增强所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的吞噬作用。当然，也可以利用根据本发明的分离、合成和/或重组分子进行同种试验。因此，进一步提供了一种用于从根据本发明的IgIV分子的集合、或从根据本发明一种组合物中选择包含亲和区的分子的方法，其中所述亲和区在与错折叠蛋白和/或交叉β结构的表位相互作用之后和/或在与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用之后，能够诱导吞噬细胞对所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的到那边的调理作用，所述方法包括：
-使根据本发明的IgIV分子的集合、和/或根据本发明的组合物与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的错折叠蛋白相接触；以及
-收集能够诱导或增强吞噬细胞对所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的吞噬作用的IgIV分子和/或分离、合成和/或重组分子。
所述试验优选在体外实施。优选使用所选的IgIV分子和/或能够诱导或增强吞噬作用的分离、合成和/或重组分子，以便诱导和/或增强能够经受和/或避开吞噬作用的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的调理作用。这样的能够经受和/或避开吞噬作用的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白例如出现一些疾病状态中，其中能够诱导或增强吞噬作用的分子缺乏或以降低(功能)水平存在，例如在AIDS、SCIDS和γ球蛋白血症(gammaglobulinaemia)中，以及例如在一些疾病状态中，其中错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的形成例如在TSE、淀粉样变性病、糖尿病、血栓症和炎症中增多。
如前所述，错折叠蛋白和/或蛋白中的交叉β结构经常涉及和/或相关于疾病危险和/或存在，例如亨廷顿氏病、淀粉样变性病类型疾病、动脉粥样硬化、糖尿病、出血、血栓症、癌症、败血症和其他炎性疾病、类风湿性关节炎、传染性海绵状脑病如克罗伊茨费尔特-雅各布病、多发性硬化、自身免疫疾病、与丧失记忆有关的疾病如阿尔茨海默病、帕金森病和其他神经疾病(癫痫)、脑病和全身性淀粉样变性病。根据本发明的IgIV分子的富集集合和根据本发明的分离、合成和/或重组分子的集合，其能够特异性地结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，特别适合于至少部分地预防和/或治疗这样的错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的疾病。因此，一个实施方式提供了根据本发明的IgIV分子的结合和/或根据本发明的组合物，用作药物和/或预防药剂。此外，本发明提供了根据本发明IgIV分子的集合和/或组合物在制备药物和/或预防药剂中的应用。所述药物和/或预防药剂特别适合于至少部分地预防、治疗和/或稳定与存在错折叠蛋白和/或交叉β结构有关和/或相关的疾病、凝血紊乱、败血症、炎症、和/或微生物、病原体、细菌、寄生虫和/或病毒的感染。因此，进一步提供了根据本发明IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物在制备用于至少部分地预防和/或治疗错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的疾病、凝血紊乱、败血症、炎症、和/或微生物/病原体/寄生虫细菌/病毒感染的药物中的应用。因此，还提供了一种用于至少部分地预防和/或治疗个体中与错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的疾病、凝血紊乱、败血症、炎症、和/或微生物/病原体/寄生虫细菌/病毒感染的方法，包括向所述个体给予根据本发明的IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物。
在一个优选实施方式中，所述微生物/病原体/寄生虫/细菌/病毒感染包括机会性感染。这是一种通过通常不会引起疾病但在某些情形(如受损免疫系统)中变得致病性的有机体例如病原体和/或病毒的感染。受损免疫系统例如是由药物疗法如化疗引起的。在一个特别优选的实施方式中，所述微生物/病原体/寄生虫/细菌/病毒感染包括HIV相关机会性感染。由于机会性感染是HIV患者死亡的主要原因，所以高度期望提供针对这样的感染的药物和/或预防药剂。很多机会性感染涉及错折叠蛋白和/或交叉β结构的存在。例如，淀粉样蛋白结构出现在微生物有机体如真菌、酵母和细菌的表面上。所述淀粉样蛋白结构通常在真菌上称为疏水蛋白(hydrophobin)、在革兰氏阳性细菌上称为chaplin，而在革兰氏阴性细菌上称为curli或tafi或聚集菌毛。由于根据本发明的IgIV分子的富集集合以及根据本发明的分离、合成和/或重组分子的集合特别适合于结合这样的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，所以本发明的所述集合特别适合于对抗和/或至少部分地预防HIV相关的机会性感染。因此，本发明提供了一种用于至少部分地预防和/或治疗个体中的HIV相关的机会性感染的方法，包括向所述个体给予根据本发明的IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物。
本文还提供了一种组合物，其包含根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物以及适当载体、稀释剂和/或赋形剂。所述组合物优选包含药物组合物。为了能够向需要治疗的患者给予根据本发明的药物，所述药物必须满足药学上可接受制剂的需要。这意味着根据本发明的药物包括根据本发明的IgIV分子的富集集合和/或根据本发明的分离、合成和/或重组分子的集合，它们都是药物级、生理学可接受的，并经过对外来试剂的试验。本文还提供了包含根据本发明的IgIV分子的富集集合和/或根据本发明的分离、合成和/或重组分子的集合以及药学上可接受载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。优选地，所述组合物包括错折叠蛋白和/或交叉β结构结合化合物，以便增强所述药物组合物与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的相互作用。因此，本发明提供了根据本发明的一种组合物，进一步包括错折叠蛋白和/或交叉β结构结合化合物。在本发明的一个进一步优选的实施方式中，根据本发明的组合物与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的结合，通过添加已知其错折叠蛋白和/或交叉β结构结合增强特性的化合物，例如染料分子如硫磺素T或硫磺素S而得到进一步增强或促进。因此，本发明披露了根据本发明的一种组合物，其进一步包括错折叠蛋白和/或交叉β结构结合增强化合物。
在另一个优选实施方式中，从身体去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白通过向根据本发明的组合物中加入能够增强补体激活的补体增强信号而得到增强。因此，本发明提供了根据本发明的一种组合物，进一步包括补体增强化合物。
由于补体系统的激活导致级联反应，包括发炎、细胞破坏和组织损伤，所以有时期望至少部分地对抗补体激活。在某些情况下，与错折叠蛋白和/或交叉β结构的清除相关的补体系统的激活本身引起疾病。在这样的情况下，根据本发明的组合物优选进一步包括补体抑制化合物。在一个实施方式中，根据本发明的组合物包括炎症抑制性化合物。
此外，本发明提供了用于增大个体中细胞外蛋白降解和/或蛋白清除的器械和方法。在一种自然情形下，错折叠蛋白和/或交叉β结构的形成引发和/或参与生理学级联行为，处理不需要分子例如错折叠蛋白、凋亡细胞或甚至病原体的去除。这个路径在多个过程中调节不需要生物分子的去除，包括在内质网中合成期间的蛋白错折叠，血纤蛋白溶解，神经突触网络的形成，使用的、不需要的和/或破坏(变性)的蛋白的清除，细胞凋亡的诱导以及凋亡细胞、坏死细胞、老化细胞和/或病原体的清除。由于根据本发明的IgIV分子的集合以及根据本发明的组合物特别适合于结合错折叠蛋白和/或交叉β结构和包含交叉β结构的蛋白，所以细胞外蛋白降解和/或蛋白清除增加。因此，进一步提供了一种用于增加个体中的细胞外蛋白降解和/或蛋白清除的方法，包括向所述个体给予根据本发明的IgIV分子的集合和/或根据本发明组合物。
通过结合和除去错折叠蛋白和/或交叉β结构和包含交叉β结构的蛋白，根据本发明的IgIV分子的集合和根据本发明的组合物能够至少部分地对抗个体中的错折叠蛋白和/或交叉β结构介导的效应。因此，进一步提供了一种用于至少部分地抑制个体中的错折叠蛋白和/或交叉β结构介导的效应的方法，包括向所述个体给予有效量的根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物。
在一个优选实施方式中，使用根据本发明的IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物以便抑制由错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白诱导的血小板聚集。这样的应用的一个实例在实施例2中示出。因此，本发明提供了根据本发明的IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物在抑制蛋白诱导的血小板聚集中的应用。
在另一个优选实施方式中，使用根据本发明的IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物以便完成丝氨酸蛋白酶组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的结合。tPA通过血纤蛋白溶酶原(plasminogen)的切割而诱导纤溶酶的形成。纤溶酶切割血纤蛋白并且这在血凝块溶解期间发生。经过对于小鼠中的血纤蛋白溶解不是必需的，但是tPA已经长期被认识到其在血纤蛋白溶解中的作用。血纤蛋白溶酶原通过tPA的激活是通过血纤蛋白或血纤蛋白片段而不是通过其前体血纤蛋白原(fibrinogen)刺激的。tPA是一种错折叠蛋白和交叉β结构结合蛋白，一种多配体受体和和交叉β结构路径的一个成员。tPA介导错折叠蛋白和/或交叉β结构诱导的细胞功能障碍和/或细胞毒性。tPA通过血纤蛋白溶酶原的激活介导至少部分的细胞功能障碍和/或毒性。血纤蛋白溶酶原依赖性效应利用根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物进行抑制。在疾病状态过程中的过度或不受控制的tPA/血纤蛋白溶酶原激活以这种方式处理。这样的疾病状态的非限制性实例是阿尔茨海默病、感染、先兆子痫(preeclampsia)、心绞痛(angina pectoris)、炎性和非炎性关节疾病、糖尿病。
一个优选实施方式提供了根据本发明的IgIV分子集合和/或组合物在用于至少部分地从样品中去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白中的应用。错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的去除在各种应用中是期望的。例如，如果一个个体患有或处于患有与存在错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的紊乱的危险，则从身体中去除这样的错折叠蛋白和/或交叉β结构是有益的，以便对抗这样的紊乱和/或减轻有害副作用。此外，从打算用于(人类)消费的产品中去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白是有利的，以便至少部分地避免摄取错折叠蛋白和/或交叉β结构。因此，一个实施方式提供了一种用于至少部分地从样品中去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的方法，所述方法包括使一个样品与根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物相接触，以及从所述样品去除结合于IgIV分子和/户分离、合成和/或重组分子的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的任何复合体。所述样品优选包括流体样品。在一个实施方式中，所述流体包括食物。
在一个优选实施方式中，所述样品包括体液。该实施方式特别适合于至少部分地预防和/或治疗动物，优选为人类个体的错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的紊乱。在一个优选实施方式中，施加体外透析(extracorporeal dialysis)。例如，患有错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关紊乱的患者进行他的血液透析。根据本发明的IgIV分子集合和/或组合物例如耦接于载体或支持物和/或用于透析的管内部。这样，错折叠蛋白和/或交叉β结构和包含交叉β结构的蛋白将从所述患者的血流中去除，由此至少部分地减轻所述患者的与所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相关和/或有关的负面效应。作为另一个实例，这种用途应用于肾患者的血透析(haemodialysis)。还提供了一种用于实施根据本发明方法的分离设备(separation device)。因此，一个实施方式提供了一种用于实施根据本发明方法的分离设备，所述设备包括一种用于传输(循环)流体的系统，所述系统提供由用于连接至流动流体，优选个体的血液循环的装置、用于使流体进入所述系统并使流体从所述系统返回的装置，优选回到个体血液循环，所述系统进一步包括固相，所述固相包括根据本发明IgIV分子的集合和/或根据本发明的组合物。所述分离设备优选包括透析装置。
另一优选实施方式提供了根据本发明的IgIV分子集合和组合物在用于至少部分地从药物或其任何组分中去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白中的应用。如今包括蛋白或蛋白质性质化合物作为活性物质的药物组合物的重要种类包括但不限于急速、酶、疫苗和抗原、细胞因子和抗体。除了上述蛋白质性质的药物组合物外，大量药物组合物在包含蛋白质的生产和/或纯化步骤的帮助下进行制备。例如，许多药物组合物包括一种或多种蛋白作为稳定剂。涉及使用药物组合物的健康问题例如涉及血液病学、血纤蛋白溶解和免疫学的领域。在给予药物组合物后观察到的副作用的不完全列表包括例如发热、过敏反应、(自身)免疫反应、止血失调、炎症、溶解纤维蛋白问题，包括败血症和弥散性血管内凝血(DIC)，其可能是致命的。所述副作用例如是由所述药物组合物中存在的蛋白或蛋白质性质化合物的改变或所述药物组合物添加的稀释剂或载体物质引起的。药物组合物的蛋白质性质化合物的改变包括例如蛋白质的变性、多聚化、蛋白水解、乙酰化、糖化、氧化、展开或错折叠。初始正确折叠的天然蛋白的展开或错折叠导致在所述蛋白中形成毒性结构。药物组合物的毒性结构经常包括错折叠蛋白和/或交叉β结构。所述毒性结构至少部分地利用根据本发明的IgIV分子集合和/或组合物去除。
因此，提供了一种用于从包含蛋白的药物组合物或其任何组分中去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的方法，所述方法包括：
-使所述包含蛋白的药物组合物或其任何组分与根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物相接触；
-允许所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白结合至所述IgIV分子集合和/或组合物；以及
-从所述包含蛋白的药物组合物或其任何组分中分离结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或结合的包含交叉β结构的蛋白。
通过从药物组合物中去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，至少部分地降低和/防止了不期望的副作用。因此，还提供了一种用于降低和/或防止药物组合物的不期望副作用和/或增加每克蛋白的特异性活性的方法，所述方法包括利用根据本发明的一种方法，从所述药物组合物或其任何组分中去除展开蛋白、展开肽、错折叠蛋白、变性蛋白、聚集蛋白、聚集肽、多聚蛋白和/或多聚肽、和/或包含交叉β结构的肽。
本文还提供了一种可通过根据本发明的一种方法获得的包含蛋白质的药物组合物或其任何组分。相比于未处理的药物组合物，所述药物组合物涉及减小的不期望副作用的危险。
在一个实施方式中，利用根据本发明的IgIV分子集合和/或分离、合成和/或重组分子的组合物，从样品中去除了错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，其中所述集合和/或组合物结合于固体载体。这提供了可以使用连续工艺的优点，其中所述固体载体用样品孵育。随后，所述样品和所述固体载体易于彼此分开，所述载体包含(间接)结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，而所得样品具有降低浓度的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白。
在另一个实施方式中，根据本发明的所选IgIV免疫球蛋白和/或分离、合成和/或重组分子用来制备诊断试剂盒。所述诊断试剂盒特别适合于与存在错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的疾病的诊断。所述试剂盒优选包括至少一个根据本发明的IgIV分子集合的亲和区、和/或至少一个根据本发明的组合物的亲和区，其能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相互作用，以及所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白与所述亲和区相互作用的可视化方法。
利用这样的诊断试剂盒，不仅诊断了通常涉及和/或与存在错折叠蛋白和/或交叉β结构相关的疾病，而且可以进行更加明确的诊断，这取决于试剂盒中的亲和区的特异性。能够特异性地诊断一种紊乱的诊断试剂盒例如是通过提供具有能够特异性地结合给定错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或给定的包含交叉β结构的蛋白(其对于所述一种紊乱，例如与类风湿性关节炎、SLE或其他自身免疫疾病或炎性反应是特异性的)的亲和区的所述试剂盒来形成。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种如上所述的诊断试剂盒，其中所述错折叠蛋白和/或交叉β结构是疾病相关的错折叠蛋白和/或交叉β结构。
由于错折叠蛋白和/或交叉β结构和包含交叉β结构的蛋白有效地结合至根据本发明的IgIV分子结合和/或根据本发明的组合物，所以它们从样品和/或动物或人类身体被有效分离，随后被鉴定。因此，在另一个实施方式中，根据本发明的所选IgIV免疫球蛋白和/或分离、合成和/或重组分子被用来分离错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白。优选地，鉴定了存在于体液，例如血液、血清、血浆、脑脊液、滑液、唾液和/或尿中的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白。例如，将健康个体的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的存在和/或鉴定与患有涉及和/或与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相关的疾病的个体的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的存在和/或鉴定进行比较。错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的鉴定和相对浓度利用本领域技术人员熟知的任何方法加以确定，例如但不限于2D凝胶电泳和/或质谱分析。来源于健康个体的样品和来源于患者的样品的结果优选进行比较。以这种方式，获得了信息，例如是关于在指定疾病状态过程中趋于错折叠和/或采用交叉β结构构象的蛋白的鉴定和/或易感性的信息。该获得的信息随后用作诊断工具，例如用来监控疾病状态、健康疗法效力、监控疾病发作，以及提供有价值的引导以开发靶向错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白(其优选对指定疾病是特异性的)的疗法。
因此，本发明提供了一种用于确定包含蛋白质的样品中的错折叠蛋白和/或交叉β结构或包含交叉β结构的蛋白的同一性的方法，所述方法包括：
-使所述样品与根据本发明的IgIV分子集合、和/或根据本发明的组合物相接触，产生结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或结合的包含交叉β结构的蛋白，以及
-鉴定结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或结合的包含交叉β结构的蛋白。所述结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或结合的包含交叉β结构的蛋白，优选利用本领域已知的任何方法，通过分析所述错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或蛋白的氨基酸序列的至少一部分而进行鉴定。所述样品优选包括水溶液，更优选体液。在一个优选实施方式中，使用来源于健康个体(优选人类)的体液和来源于患有或怀疑患有涉及和/或与存在错折叠蛋白和/或交叉β结构相关的疾病的个体的体液，以便比较健康状态与疾病状态(或增强疾病危险的状态)。
由于本发明提供了一种从IgIV集合中选择那些具有能够与错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白相互作用的亲和区的免疫球蛋白的方法，所以技术人员限制也能够利用所述根据本发明的所选IgIV和/或分离、合成和/或重组分子，以便确定错折叠和/或包含交叉β结构的蛋白或肽在样品中存在。因此，提供了一种用于确定错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白和/或肽是否存在于包含蛋白的水溶液中的方法，所述方法包括：
-使所述水溶液与根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物相接触，以及
-检测是否存在结合的错折叠蛋白和/或结合的包含交叉β结构的蛋白和/或肽。所述蛋白和/或肽优选通过使所述水溶液与本发明的集合和/或组合物相接触并检测结合的肽和/或蛋白而在水溶液中进行检测的。因此，提供了一种用于检测在包含蛋白质的水溶液中的错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白和/或肽的方法，所述方法包括使所述水溶液与根据本发明的IgIV分子集合、和/或根据本发明的组合物相接触，产生结合的错折叠蛋白和/或结合的包含交叉β结构的蛋白和/或肽，以及检测结合的错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白和/或肽。本发明的所述集合和/或组合物与错折叠蛋白和/或交叉β结构的结合优选通过可视化反应例如通过荧光染色或酶促或比色分析检测、或通过技术人员可利用的任何其他可视化系统进行检测。
所述水溶液优选包括去污剂、食品、食品增补剂、细胞培养介质、商业可获得的用于研究目的的蛋白质溶液、血液、血液产品、体液例如尿、脑脊液、滑液、淋巴液和/或唾液、化妆品、细胞、包含蛋白质的药物组合物或其任何组分、或者这些的任意组合。
本文还提供了根据本发明的IgIV分子集合、和/或根据本发明的组合物在确定积累沉积的错折叠蛋白和/或具有交叉β结构的蛋白的存在中的应用。优选地，检测涉及构象疾病的错折叠蛋白的存在。构象疾病定义为由蛋白的错折叠和/或构象改变引起的或与其相关和/或有关的疾病。
此外，一种实施方式包括检测组合物中的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的量。进行这种检测是例如为了确定疾病病程(course)。因此，进一步提供了一种用于确定组合物，优选药物和/或疫苗中的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的量的方法，包括使所述组合物与根据本发明的IgIV分子集合和/或根据发明的组合物相接触，以及使结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的量与存在于所述组合物中的交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的量相关联。
由于错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白有效地结合于根据本发明的IgIV分子集合以及结合于根据本发明的组合物，所以它们被有效地从样品和/或动物身体(优选人身体)中去除。这样，消除了错折叠蛋白的积累。因此，进一步提供了根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物在消除错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白中的应用。所述错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白优选涉及构象疾病。消除这样的蛋白的积累导致所述构象疾病的症状减轻和/或至少部分地治疗和/或预防疾病病程。所述构象疾病优选包括淀粉样变性病类型疾病、动脉粥样硬化、糖尿病、出血、血栓症、癌症、败血症和其他炎性疾病、类风湿性关节炎、传染性海绵状脑病、多发性硬化、自身免疫疾病、与记忆丧失相关的疾病或帕金森病以及其他神经疾病(癫痫)、脑病和/或风湿病。
血凝固和血小板凝块形成也涉及错折叠蛋白和/或交叉β结构的存在。错折叠蛋白和/包含交叉β结构的(错折叠)蛋白的作用的实例是血小板激活以及诱导血小板聚集和凝集、内皮的激活，导致组织因子表达和暴露于血液，导致血凝固，以及经由因子XII激活的学凝固的接触系统的激活。另外，在血凝固过程中，形成了具有交叉β结构构象的血纤蛋白聚合物。构建血纤蛋白网络块的交叉β结构随后用作用于tPA的结合部位以在需要纤维蛋白溶解活性的部位处定位tPA。由于根据本发明的集合和组合物能够特异性地结合和/或去除错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白，所以所述集合和组合物特别适合于干扰血凝固和/或凝块形成和/或组织因子激活。因此，进一步提供了一种用于感染血凝固和/或凝块形成的方法，包括向血液提供根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物。
还提供了一种用于确定参考样品中蛋白的交叉β结构含量与试验样品中所述蛋白的交叉β结构含量之间的不同，其中所述试验样品经历了预期对所述蛋白的交叉β结构含量具有影响的处理，该方法包括：
-利用根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合，确定参考样品中蛋白的交叉β结构含量；
-使所述蛋白经历预期对所述蛋白的交叉β结构含量具有影响的处理，由此获得一个试验样品；
-利用根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物，确定在获得的试验样品中的所述蛋白的交叉β结构含量；以及
-确定所述参考样品中所述蛋白的交叉β结构含量是否显著不同于所述试验样品中所述蛋白的交叉β结构含量。
该实施方式特别适合于确定某个环境(情形)和/或处理是否对蛋白的交叉β结构含量具有影响。一旦这已经确定，则可以选择具有低诱导和/或增强交叉β结构构象的能力的环境和/或处理。当然，还可以选择很好能够诱导和/或增强交叉β结构构象的环境和/或处理，这取决于具体应用。
附图说明
图1：人类IgIV特异性地结合至错折叠糖化蛋白
在ELISA装置中，用于治疗用途的人类IgIV(获自两个制造商I和II)的结合利用固定的糖化蛋白进行评价。A：测试了来自制造商I的IgIV(IgIV(I))与涂覆的糖化人类血红蛋白(Hb-AGE)、新溶解的Hb和聚集的淀粉样-β肽(Aβ)的结合。B：测试了来自制造商II的IgIV(IgIV(II))与涂覆Hb-AGE、新溶解的Hb和聚集的Aβ的结合。C：分析了IgIV(I)与涂覆的糖化白蛋白(BSA-AGE)、新溶解的对照白蛋白和FP13 K157G淀粉样蛋白的结合。D：tPA和K2P tPA对15μg/ml IgIV(I)与涂覆Hb-AGE的结合的影响通过将浓度系列的tPA或K2P tPA加入到IgIV(I)孵育混合物中而呈现。10mM的εACA加入到该混合物中以避免tPA与暴露的赖氨酸或精氨酸侧链结合。
图2：由具有淀粉样蛋白构象的错折叠糖化蛋白诱导的血小板聚集受IgIV和单克隆抗体的混合物抑制
在引入骨胶原或TRAP(阳性对照)、缓冲液(阴性对照)或错折叠淀粉样糖化白蛋白或血红蛋白之后的血小板聚集利用从新抽的在HEPES-Tyrode缓冲液中的柠檬酸化血浆分离的血小板在集合度计中进行。提出的对四种不同淀粉样蛋白结构提出的人类IgIV和鼠单克隆抗体对血小板聚集的抑制性能进行了评价。A：购自制造商I的IgIV有效地抑制人类供体“A”的血小板的糖化血红蛋白诱导的聚集。IgIV(I)本身对血小板没有作用(影响)，也就是说，通过将IgIV(I)加入到血小板中没有诱导聚集。使用的IgIV(I)浓度为4.7mg/ml，Hb-AGE浓度为18μg/ml，骨胶原以10μg/ml的浓度使用。B：确定了10μg/ml骨胶原、18μg/ml Hb-AGE、4.7mg/ml IgIV(I)和用4.7mg/ml IgIV(I)预孵育的18μg/ml Hb-AGE对供体A的血小板的聚集的影响。C：类似于利用供体A的血小板实施的实验(A)，利用供体“B”的血小板的血小板聚集及时进行。现在，使用10μg/ml骨胶原、90μg/ml Hb-AGE、4.7mg/ml IgIV(I)和用4.7mg/ml IgIV(I)预孵育的90μg/ml Hb-AGE。D：在利用供体“C”的血小板的对照实验中，5μM TRAP用作阳性对照。利用TRAP作为聚集激活剂或利用HEPES-Tyrode缓冲液对照确定了对于100μg/ml的带有交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的5个单克隆抗体的混合物的影响。E、F：血小板聚集(供体C)通过25μg/ml糖化牛血清白蛋白(BSA-AGE，E)或糖化人类血红蛋白(Hb-AGE，F)诱导。确定了这种聚集通过25或100μg/ml的对于100μg/ml的带有交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的5个单克隆抗体的混合物的抑制。
图3：血小板聚集由淀粉样蛋白-β诱导，且由IgIV或单克隆抗体抑制。
A、B：由50μg/ml淀粉样蛋白-β诱导的血小板聚集在2.5mg/mlIgIV(I)用淀粉样蛋白-β预孵育(A)时或在160μg/ml的结合至错折叠蛋白的5个单克隆抗体混合物用淀粉样蛋白-β预孵育(B)时被抑制。两种供体D和E的血小板分别分析。
图4：淀粉样蛋白特异性小化合物不同地影响IgIV或tPA与固定的错折叠蛋白的结合
在ELISA装置中，IgIV或tPA(一种对包含交叉β结构三级/四级折叠的错折叠蛋白具有亲和力的多配体结合蛋白)的结合在浓度系列的淀粉样蛋白特异性染料刚果红和硫磺素T的影响下进行分析。A-C：淀粉样蛋白特异性染料刚果红(A)、硫磺素T(B)和硫磺素S(C)对15μg/ml IgIV(I)与固定Hb-AGE的结合的影响，通过在将该溶液加入到ELISA板之前用浓度系列的三种染料预孵育IgIV(I)进行显现。D、F：刚果红对不最理想浓度的tPA与涂覆的BSA-AGE(D)或Aβ(F)的结合的影响。E、G：硫磺素T对不最理想浓度的tPA与涂覆的BSA-AGE(E)或Aβ(G)的结合的影响。
图5：具有结合其结合至具有交叉β结构构象的错折叠蛋白的蛋白的能力的亲和基质。
糖化和错折叠的人类血红细胞连接至CNBr-琼脂糖并且结合对错折叠蛋白具有和亲和力的蛋白(其包含交叉β结构折叠)的能力通过分析tPA结合加以确定。接着，亲和基质用来从包含用于交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的亲和区的IgIV-I中分离免疫球蛋白分子的亚组。A：Hb-AGE琼脂糖和空白对照珠子用6μM tPA溶液孵育并且上清液接着通过加入tPA生色底物S2765来分析tPA活性的存在。B：在用tPA孵育之后，Hb-AGE琼脂糖和对照珠子用清洗缓冲液清洗多次。在第一清洗洗出液中存在tPA再次通过及时在37℃进行tPA底物S275转化进行分析。C：在充分清洗之后，结合的tPA从空白对照琼脂糖珠子和具有高盐的Hb-AGE琼脂糖洗脱。10倍稀释的洗出液通过加入S2765分析tPA的存在。D：稀释IgIV原料(Octagam)用ADV01染色，在590nm的吸收率的标准曲线。E：稀释系列的IgIV原料(Octagam)与Hb-AGE的结合标准曲线，如利用ELISA确定的。F：1000倍稀释的IgIV原料、在与Hb-AGE琼脂糖接触后的IgIV和在与对照基质接触后的IgIV的固定Hb-AGE的结合，如利用ELISA评价的。G：从Hb-AGE琼脂糖洗脱的IgIV以及从对照基质洗脱的IgIV的固定Hb-AGE的结合，如利用ELISA评价的。以相对数值给出信号，如根据IgIV原料结合曲线计算的(参见图E)。H：稀释系列的IgIV原料(Octagam)与热变性BSA的结合的标准曲线，如利用ELISA确定的。I：1000倍稀释的IgIV原料、在与Hb-AGE琼脂糖接触后的IgIV以及在与对照基质接触后的IgIV的固定热变性BSA的结合，如利用ELISA评价的。J：从Hb-AGE琼脂糖洗脱的IgIV和从对照基质洗脱的IgIV的固定热变性BSA的结合，如利用ELISA评价的。以相对数值给出信号，如从IgIV原料结合曲线计算的(参见图H)。
图6：通过糖化的错折叠白蛋白(BSA-AGE)和血红蛋白(HbAGE)的TEM分析
这些照片示出了BSA-AGE(A)和HbAGE(B)形成非纤维状无定形聚集体。
图7：Octagam IgIV的错折叠诱导交叉β结构
A-E：在10mM NaPi缓冲液pH 8.1中的1mg/ml(A)、2.5mg/ml(B)、5mg/ml(C)、10mg/ml(D)和20mg/ml(E)的错折叠IgIVOctagam的TEM分析。F：错折叠Octagam IgIV的硫磺素T分析。可以看出不同的变性条件导致具有不同TEM和硫磺素T特性的错折叠蛋白。
图8：Gammagard IgIV的错折叠诱导交叉β结构
各种错折叠IgIV Gammagard制剂的硫磺素(A)、刚果红(B)、ANS(C)、Bis-ANS(D)和硫磺素S(E)荧光。F：当在375nm的荧光强度在283nm激发后进行检测时，各种错折叠IgIVGammagard制剂的色氨酸荧光。
图9：Gammagard IgIV的错折叠诱导聚集，伴随有激活tPA/血纤蛋白溶解酶原的能力。
A-天然IgIV Gammagard、以及各种形式的错折叠IgIVGammagard的TEM分析，即B.IgIV RF、C.IgIV 65、D.IgIV 69、E.IgIV 76、F.IgIV 80、G.IgIV 83Gammagard、H.IgIV 86、I.IgIVAcid和J.IgIV Base、K.IgIV HFIP/TFA、L.hIgG-BASE-37℃、M.tPA介导的纤溶酶产生(在以100μg/ml的中浓度暴露于各种变性IgIVGammagard制剂之后)。40μg/ml的dOVA的辅因子刺激任意设定为100％。
图10：Aβ制剂的ThT、刚果红和ANS分析
图11：Aβ的TEM分析
A：Aβ40t＝0；B：Aβ40HCl；C.fAβ40(即，储存了168h)；D.Aβ42t＝0；E.Aβ42HBS以及F.fAβ42(即，在37℃ HCl处理24h)。
图12：HSA结构的分析
天然和变性HSA(A)的硫磺素T荧光以及天然HSA(B)和以1mg/ml(C)、2.5mg/ml(D)、5mg/ml(E)、10mg/ml(F)或20mg/ml(G)变性的HSA的TEM分析。
图13：ThT和CR用错折叠小鼠IgG增强的荧光。
热变性小鼠IgG(dmIgG85℃)、酸变性的小鼠IgG(dmIgGACID)、碱变性的小鼠IgG(dmIgG BASE)和天然小鼠IgG(nmIgG)的硫磺素T(A)和刚果红(B)荧光。使用的小鼠IgG制剂是小鼠γ-球蛋白的组合物。
图14：人类ApoA-I的结构分析。
纤连蛋白F4-5-FLAG-His的(A)、刚果红(B)荧光、(C)A280nm蛋白确定、(D)tPA/血纤蛋白溶解酶原(Plg)激活测定以及与固定ApoA-I和HbAGE(阳性对照)的(E)结合。利用对照缓冲液涂覆孔获得的背景信号从利用在固定蛋白质上的对应Fn4-5稀释系列获得信号减去。错折叠ApoA-I a至c：a＝在将达到终浓度100mM的NaOH加入至天然ApoA-I原料之后、在升温后加入HCl至终浓度100mM在37℃孵育30分钟；b＝与a一样，现在加热至75℃；c与a、b一样，现在加热至100℃。(F)：类似于在A中，tPA结合之ApoA-I制剂和HbAGE。为了清楚，显示了两段y-轴，因为利用tPA和ApoA-I制剂获得的绝对信号基本上低于利用HbAGE获得的信号。
图15：增强的与利用指定的结合至基质的错折叠交叉β蛋白富集的亲和区的错折叠BSA-AGE的结合
该附图中是指定的固定在基质上的错折叠蛋白。“FT”，亲和基质流出物；“EL”亲和基质洗出液，或在结合至指定错折叠蛋白的亲和区洗脱之后的回收组分。富集因子为1的实线表示相对于亲和区与例如该示意图中的BSA-AGE的结合的沉积或富集之间的边界。
图16：在IgIV接触错折叠交叉βBSA-AGE亲和基质接触之后，富集和缺失的IgIV与错折叠交叉β蛋白的结合。
Octagam IgIV用BSA-AGE琼脂糖孵育。流出物(FT)组分的一部分在ELISA中处理用于结合至BSA-AGE，剩余的FT再次施加至新鲜量的BSA-AGE基质(A)。收集洗出组分E并在ELISA中进行检测也用于结合至BSA-AGE(B)。富集因子以结合至每质量单位的错折叠蛋白给出，相比于Octagam IgIV起始原料。在连续结合期间，更多BSA-AGE结合Ig分子从Octagam池中分离，导致对于连续FT组分降低的富集因子。特异性地结合至BSA-AGE基质的Ig分子从亲和基质(洗出液，E)洗脱。FT和洗出组分的富集因子也用Aβ(C和D)、dOVA(E和F)以及HbAGE(G和H)来确定。
图17：Octagam IgIV与各种具有交叉β构象的蛋白包括血纤蛋白的结合(用ELISA分析)。
A-D：示出了Octagam IgIV与固定Hb-AGE(A.阳性对照)、dOVA(B.)、血纤蛋白(C.)、以及Octagam IgIV Aβ 1-40和Aβ 1-42(D.)的结合的ELISA。E：tPA与血纤蛋白的结合(对C的阳性对照)。
图18：各种IgIV制剂与各种错折叠人类血浆载脂蛋白A-I制剂的结合。
A：在ELISA中，评价了Octagam IgIV与固定天然ApoA-I以及通过加入NaOH至终浓度100mM、接着通过在37℃、或75℃、或100℃的30分钟孵育而错折叠的ApoA-I的结合。用在100℃加热的ApoA-I没有观察到结合。B：如A中的ELISA，利用从HbAGE亲和基质在该基质与Octagam IgIV接触之后回收的缺失IgIV流出物。同样，利用加热至100℃的ApoA-I没有观察到结合。C：如在A和B中的ELISA，利用在HbAGE亲和基质与Octagam IgIV接触之后富集的IgIV洗出液。
图19：通过错折叠IgIV的刚果红和硫磺素T荧光增强、tPA结合和tPA/血纤蛋白溶解酶原激活。
IgIV在NaPi缓冲液pH8.1中在65℃或者在65℃的HCl pH 2中以增加浓度热变性6小时。检测了刚果红(A)和硫磺素T(B)荧光增强。刚果红荧光没有利用以1mg/ml变性的IgIV进行测试。tPA/血纤蛋白溶解酶原通过天然IgIV和热变性错折叠IgIV的激活(以1mg/ml或5mg/ml加热)利用用于纤溶酶的生色底物进行确定。C：最大纤溶酶活性利用以指定浓度错折叠的受热IgIV确定。D：代表性曲线示出了通过以1mg/ml和5mg/ml在NaPi缓冲液中错折叠的IgIg诱导的纤溶酶活性。E：tPA与Aβ40t＝0和错折叠IgIV的结合。
图20：人类血小板通过oxLDL的聚集受IgIV抑制；相比于飞富集起始原料和缺失IgIV，在IgIV暴露于错折叠HbAGE亲和基质之后对oxLDL富集的IgIV的亲和力收集作为流出物。
A：IgIV对oxLDL诱导的血小板聚集的影响。由TRAP诱导的聚集最大并任意设定为100％。IgIV浓度系列的影响在加入到血小板悬液和聚集实验开始之前，通过用IgIV预孵育天然LDL对照或oxLDL进行评价。B-D：ELISA：与固定Octagam IgIV的BSA-AGE的结合(B)，从固定在HbAGE基质上的亲和区缺失的IgIV(C)，以及通过采用HbAGE亲和基质富集的IgIV(D)。E-G：显示与相同三种指定亲和区原液的oxLDL的结合。E：起始原料OctagamIgIV，F：从对于蛋白质中的交叉β蛋白和/或交叉β诱导的构象具有亲和力的亲和区缺失的IgIV，以及G：富集IgIV与oxLDL的结合。如果可能，计算kD值以获得对实验相当的定性测量。对IgIV与oxLDL结合获得的kD与对利用错折叠HbAGE基质富集的IgIV与oxLDL的结合获得的kD之间的比值为27，表明利用所依据的程序获得的富集因子对于亲和区与错折叠ApoB100的结合为27.
图21：交叉β结构结合化合物IgIV和HGFA F在体内小鼠出血时间测定中的影响
A：在小鼠尾巴切割测定中，HGFA F(大约234μg/ml终浓度)和IgIV(大约2.5mg/ml终浓度)显著延长出血时间。缓冲液(PBS)用作用于出血时间的参考。10IE肝素/小鼠在延长出血时间的阳性对照组中使用。给出了计算的平均出血时间和误差棒。B：如在A中示出的平均数据现在以分散点显示出以便提供测定的出血时间的分布的观察。注意：超过20分钟的出血时间设定为20分钟并主动停止出血，另外，导致血损失超过200μl的过量出血也设定为出血时间20分钟，并主动停止出血(两种程序依据由当地伦理委员会批准的方案进行)。
图22：细胞对错折叠蛋白的粘附以及用富集亲和区的调节。
A：EC结合至用明胶(任意设定为100％)或BSA-AGE预涂覆的培养板的孔。当Octagam IgIV在细胞悬液中滴定时，对糖化白蛋白的粘附性被剂量依赖性地抑制。粘附性的类似抑制利用人类RAGE的重组可溶性片段观察到。B：EC比以相同浓度涂覆的天然IgIV优先结合至富集IgIV。对于粘附性的阳性对照是明胶(任意设定为100％)和BSA-AGE。阴性对照是细胞对一点也没有用蛋白涂覆的细胞培养板孔的细胞粘附性。
图23：利用富集IgIV从溶液缺失错折叠蛋白
A-B：通过利用固定在固体载体(即ELISA板的孔)上的富集IgIV亲和区从蛋白溶液提取错折叠dOVA(A)或HbAGE(B)。阴性对照：固定在固体载体上的HSA。
图24：富集人类IgIV与Octagam IgIV与各种形式的错折叠小鼠IgG的结合
A：富集人类IgIV与错折叠小鼠IgG的结合利用固定小鼠IgG制剂在直接ELISA中进行评价。B：在第二种方法中，第一抗-小鼠IgG抗体涂覆到96孔板的孔上，接着结合各种小鼠IgG制剂，并用Octagam人类IgIV浓度系列覆盖。
图25：小鼠杂交瘤IgM7H2H2与各种形式的错折叠人类γ-免疫球蛋白和小鼠自身γ-球蛋白的结合
在ELISA中评价了小鼠杂交瘤IgM 7H2H2与各种形式的错折叠人类IgG制剂的结合。A：以在PBS/0.1％ Tween 20中的12.5μg/ml的7H2H2 IgM测试与15种不同人类IgG制剂的结合，如在“用于实施例6-20的通用材料和方法”部分中指出的。B：在第二个实验中，以指定浓度的纯化杂交瘤克隆7H2H2 IgM再次分析与5种人类IgG制剂的结合。对照天然IgG是Gammagard IgIV和OctagamIgIV。对于IgIV制剂的数值参考用于A中的IgIV制剂。(也参见正文)。C：小鼠杂交瘤IgM 7H2H2与hIgG-BASE-37℃和天然IgIVGammagard的结合。D：7H2H2与各种错折叠小鼠IgG的制剂和天然小鼠γ-球蛋白的结合。
图26：用于选择对诊断和治疗特异的蛋白错折叠疾病的亲和区的优选程序的概括。
针对任何错折叠蛋白组的亲和区课通过采用在错折叠蛋白的亲和基质上施加包含亲和区的组合物进行选择。当这样基质含有一种或错折叠蛋白(mix(混合物)X，柱I)时，获得的亲和区(制剂1)是针对通常的错折叠蛋白的。这样的亲和区课应用于所有错折叠疾病，但可能引起副作用，因为它们一点也不是疾病特异性的。疾病特异性亲和区可通过在具有一种或疾病特异性错折叠蛋白组的柱(mix A，柱II)上施加亲和区的组合物加以分离。以这样的方式获得的亲和区(制剂2)含有疾病特异性亲和区，而且亲和区通常与错折叠蛋白相互作用。类似于获自柱I的亲和区，后者在应用于特定疾病时可能仍然引起副作用，由于存在可结合至偶尔存在的任何错折叠蛋白的亲和区。因此，更优选地，亲和区(制剂3)通过采用在错折叠蛋白的柱(柱I)上施加包含亲和区的组合物接着在具有一种或疾病特异性错折叠蛋白组的柱(柱III，类似或等同于柱II)上施加。甚至更优选地，对有助于疾病病理的错折叠蛋白高度特异性的亲和区(制剂4)在包含亲和区的组合物接着施加到具有一种或一组疾病特异性错折叠蛋白的柱(柱II)、接着包含任何错折叠蛋白组但不包括有助于靶疾病病理且固定在柱II上的那些错折叠蛋白的柱(柱IV)上时获得，用于缺失利用柱II从通常与错折叠蛋白相互作用的那些收集的亲和区。
本发明通过以下实施例(不局限于它们)进一步进行解释说明。
实施例
材料与方法
材料
人类光谱免疫球蛋白G(IgG)抗体，称为“静脉注射Ig”(“IgIV”或“IgIV”)、“γ球蛋白”、“静脉注射免疫球蛋白”、“静脉免疫球蛋白”或其他，从当地乌得勒支大学医学中心药学系获得。使用购自Octapharma(Octapharma International Services N.V.，Brussel，Belgium；在50ml中的剂型2.5gr.，批次4270568431，实验05-2006，下文称为IgIV“制造商I”或IgIV(I)或IgIV-I)的Octagam和购自Baxter(Baxter B.V.，Utrecht，The Netherlands；具有96ml重建溶液的剂型5gr.，批次LE08E044AL，实验04-2007，下文称为IgIV“制造商II”，IgIV(II)或IgIV-II)的Hyland Immuno Gammagard S/D IVIg。Gammagard通过加入供应的96ml H2O并在室温下在压辊装置上将该溶液留置30分钟而在无菌条件下进行重建(最终IgG浓度为52mg/ml)。获得清澈溶液，没有泡沫形成。将重建溶液等分并储存在-20℃。在重建之后，Gammagard溶液包含0.06gr.巴氏消毒人类白蛋白、0.45gr.甘氨酸、0.175gr.NaCl、0.43gr.水合葡萄糖以及0.04gr.聚乙二醇3,350。Octagam作为包含50mg/ml IgIV的备用溶液供应。其他组分是100mg/ml麦芽糖以及低于5μg/ml的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和低于1μg/ml的磷酸三正丁酯。将其储存在4℃下。根据制造商，Octagam主要由IgG构成(≥95％)，具有少量IgA成分(≤0.4％)。四种IgG同种型的分布是：IgG1，62.6％；IgG2，30.1％；IgG3，6.1％；IgG4，1.2％。在室温下使用Gammagard和Octagam。使用之前溶液在室温下保持至少30分钟。Gammagard的冷冻等分试样首先迅速解冻至大约0℃，然后在室温下留置。人类免疫球蛋白的第三个来源是大约40个表面健康供体的正常集中的柠檬酸化的血浆，其在乌得勒支大学医学中心制备的。将该血浆在抽血后直接混合，直接等分并在-80℃下冷冻。使用之前，将等分试样在37℃-水浴中解冻10分钟并在室温下保持30分钟。通过涡旋和/或通过用吸液管再悬浮来混合血浆；避免涡旋，如用IgIV制剂完成的并使用所有其他蛋白质溶液。
对于ELISA，使用Microlon高结合板(Greiner Bio-One GmbH，Frickenhausen，Germany；目录号655092，批次05130103，实验03-2009)。使用的抗体是羊抗-人类IgG碱性磷酸酶(Biosource Int.，美国加利福利亚卡马里奥；目录号AHI0305，批次7602)、羊抗-人类IgM碱性磷酸酶(Biosource Int.；目录号AHI0605，批次3903)、过氧化物酶轭合兔抗-小鼠免疫球蛋白(RAMPO，目录号P0260，DAKOCytomation，Glostrup丹麦)、过氧化物酶连接的猪抗-兔免疫去蛋白(SWARPO，目录号P0217，DAKOCytomation)、兔多克隆抗-人类白蛋白抗体A-001(DAKOCytomation)、兔多克隆抗-人类血红蛋白抗体A-0118(DAKOCytomation，批次122(021))、小鼠单克隆抗-人类淀粉样蛋白-β抗体M0872(DAKOCytomation；克隆6F/3D，批次00003503，实验08-2006)、兔多克隆抗-人类血纤蛋白原抗体A0080(DAKOCytomation；批次097(701)，实验08-2006)和鼠单克隆杂交瘤抗-葡萄糖-6-磷酸酯糖化的人类纤连蛋白抗体4B5(批次2，编码100901BB，参考(Bouma et al.，2003))。在ELISA中，碱性磷酸酶轭合的抗体的结合利用对硝基苯基磷酸二钠6*H2O(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA；磷酸酶底物目录号104，批次120K6008)进行评价，并且过氧化物酶轭合的抗体的结合利用1，2-苯二胺(“OPD”，Merck，德国达姆施塔特；目录号1.07243.0050，批次L937543-844)进行评价。
利用ELISA装置的抑制研究使用刚果红(Aldrich，Milwaukee，WI，USA；目录号86，095-6)、硫磺素T(Sigma，St.Louis，MO，USA；目录号T3516，批次80K3444)、硫磺素S(Sigma；目录号T1892)、组织型纤溶酶原激活剂(tPA，Actilyse，Boehringer-Ingelheim，Alkmaar，The Netherlands)、或者缺少三个氨基末端结构域(包括纤连蛋白I型结构域，或可替换地指定的指状(F)结构域)的tPA的截短形式(K2P tPA，Rapilysin，Boehringer-Ingelheim，Alkmaar，TheNetherlands)。
用于IgIV结合ELISA中的抗原是合成人类血纤蛋白肽148-KRLEVDIDIGIRS-160(SEQ-ID 1)，具有K157G突变；合成人类淀粉样蛋白-β肽1-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV-40(SEQ-ID2)(Aβ(1-40))；合成人类Aβ(1-40)E22Q Dutch型1-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAQDVGSNKGAIIGLMVGGVV-40(SEQ-ID 3)(Peptide facility，Dutch Cancer Institute，荷兰阿姆斯特丹)；牛血清白蛋白(BSA，组分V，目录号A-7906，通过热休克的初步分馏，纯度≥98％(电泳)，残余部分大多数是球蛋白，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)；人类血红蛋白(Hb，Sigma-Aldrich；目录号H7379)；以及它们的高级糖化终产物改性的对抗物(counterpart)BSA-AGE和Hb-AGE的浓度系列来实施(参见下文)。
方法
蛋白质的糖化
白蛋白和Hb的糖化如下进行。对于BSA-AGE的制备，将100mg ml-1的白蛋白在黑暗中在37℃下，用含有1M的D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐水合物(无水)(g6p，ICN，Aurora，Ohio，USA)和0.05％m/v NaN3的磷酸盐缓冲盐水(PBS，140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钠，pH 7.3)进行孵育。将该溶液糖化70周。10mg/ml的人类Hb在37℃下用含有1M的g6p和0.05％ m/v的NaN3的PBS孵育75周。在孵育之后，将白蛋白和Hb溶液针对蒸馏水进行透析，随后等分试样并在-20℃下储存。
蛋白质浓度利用高级蛋白质测定试剂ADV01(Cytoskeleton，Denver，CO，USA)加以确定。
热变性蛋白的制备
热变性错折叠蛋白制备如下。将在67mM NaPi缓冲液pH 7.0、100mM NaCl中的1mg/ml的内皮他丁(重组生产的骨胶原XVIII片段，EntreMed，Inc.，Rockville，MD；溶液)、BSA(Sigma-Aldrich；冻干的，目录号A7906)、鼠血清白蛋白(MSA，Calbiochem，EMDBiosciences，Inc.，San Diego，CA；冻干的，目录号126674)、鸡卵白溶菌酶(ICN，Irvine，CA，USA；冻干的，目录号100831)、人类胰高血糖素(Glucagen，Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark；冻干的，目录号PW60126)、纯化小鸡purified chicken卵白蛋白(OVA，Sigma；目录号A7641，批次071k7094)或人类β2-糖蛋白I(β2gpi，内部纯化的，来自新鲜血浆，参考(Horbach et al.，1996))在PTC-200热循环仪(MJ Research，Inc.，Waltham，MA，USA)的PCR杯中加热5个循环。在每一个循环中，将蛋白以5℃/min的速率从30℃加热到85℃。另外，内皮他丁、MSA、卵白蛋白和溶菌酶仅使用一个热孵育循环以相同方式在1mg/ml下进行热变性。7.9mg/ml的内皮他丁在H2O中稀释至1mg/ml。1mg/ml的MSA和卵白蛋白在PBSpH 7.4中，溶菌酶溶解在添加了10μM HCl的PBS中，1mg/ml浓度。对照蛋白不进行热循环程序。为了确认蛋白错折叠成淀粉样蛋白结构，硫磺素T(ThT)增强利用热处理蛋白以及对照蛋白进行评价。ThT—淀粉样蛋白/肽加合物的荧光检测如下。25μg ml-1的蛋白或肽制剂的溶液在具有25μM ThT的50mM甘氨酸缓冲液pH9.0中制备。在435nm激发后在485nm处检测荧光。来自缓冲液、具有ThT的缓冲液和没有ThT的蛋白/肽溶液的背景信号从利用ThT孵育的蛋白溶液的相应检测值中减去。常规地，Aβ的荧光用作阳性对照，而合成人类血纤蛋白片段FP10(148-KRLEVDIDIK-157(SEQ-ID4)；Peptide facility，Dutch Cancer Institute，Amsterdam，theNetherlands)、非淀粉样血纤蛋白片段(Kranenburg et al.，2002)以及缓冲液的荧光用作阴性对照。在日立F-4500荧光分光光度计(Hitachi，Ltd.，Tokyo，Japan)上一式三份地检测荧光。可替换地，以类似方式分析刚果红荧光。现在，激发和发射波长为550nm和590nm。同样，在25μM刚果红溶液中，分析了25μg/ml的检测蛋白(tester protein)。
可替换地，热变性淀粉样肽制备如下。将人类血纤蛋白肽NH2-IDIKIR-COOH(SEQ-ID 6，FP6)以大约10mg/ml溶解在1:1体积比的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇和三氟乙酸中。在空气流下蒸发该有机溶剂。将FP6溶解在蒸馏水中至终浓度1mg/ml并在37℃下保持72h。随后将该溶液在室温下储存。交叉β结构构象的存在通过检测淀粉样蛋白特异性人类ThT和刚果红的荧光增强以及通过X射线纤维衍射分析(personal communication，L.Kroon-Batenburg，Bijvoet Center for Biomolecular Research，Dept.of Crystal &Structural Chemistry，University of Utrecht，The Netherlands)加以确认(数据未示出)。此外，评价了在血纤蛋白溶解酶原/纤溶酶/显色底物转化测定中FP6溶液激活tPA的性能并发现是阳性的(数据在其他地方示出)。
具有淀粉样蛋白构象的酵母朊病毒肽寡聚物的制备
酵母朊病毒蛋白的肽片段NH2-GNNQQNY-COOH(SEQ-ID 5)购自(H.Hilkmann，NKI-Amsterdam，The Netherlands；lot5LKB1-2081)。肽的纯度通过实施反相HPLC进行分析并且为～90％。将肽溶解至在H2O中的终浓度为1mg/ml和10mg/ml。清澈溶液在滚筒箱(rollerbank)中4℃下孵育72h或者在没有移动的情况下室温下孵育5h。刚果红荧光增强确定为淀粉样蛋白构象存在的一个量度标准(参见上文)。另外，利用这批肽的交叉β结构的形成使用在H2O中的10mg/ml溶液以X射线纤维衍射分析加以确认(personal communication，L.Kroon-Batenburg，Bijvoet Centerfor Biomolecular Research，Dept.of Crystal & Structural Chemistry，University of Utrecht，The Netherlands)(这里未示出数据)。
氧化蛋白的制备
蛋白的氧化利用溶液中的蛋白长期暴露于CuSO4来实施。使用的蛋白是人类正常集中的表观健康个人的柠檬酸化血浆、配制的内皮他丁(EntreMed，Inc.，Rockville，MD；7.9mg/ml溶液)、小鸡卵白溶菌酶(ICN，目录号100831，批次98032)、人类血红蛋白(Sigma-Aldrich，目录号H7379，批次039H7605)、人胰高血糖素(Glucagen from NovoNordisk Farma B.V.，批次RW 60038，牛白蛋白(Sigma-Aldrich，A7906，批次81K1813)、人类γ-球蛋白(Sigma-Aldrich，G4386，批次21K7600)、小鸡卵白卵清蛋白(Sigma-Aldrich，A7641，批次071K7094)。冻干蛋白以2mg/ml溶解在PBS中，血浆进行40倍稀释并将内皮他丁在PBS中稀释至2mg/ml。添加2％ m/v的NaN3原溶液至终浓度0.02％。添加在H2O中的1M CuSO4原溶液至终浓度10mM。在对照蛋白溶液中添加H2O代替CuSO4。所有蛋白溶液通过涡旋进行混合，避免旋涡。将溶液在滚筒箱上在4℃下保持72h。检测ThT的增强(参见上文)。
可替换地，蛋白通过引入在溶液中的10μM CuSO4进行氧化。以这种方式，卵白蛋白、白蛋白、内皮他丁、溶菌酶、γ-球蛋白(所有都在2.5mg/ml)和胰高血糖素(1mg/ml)在PBS中在37℃下孵育144h。在对照蛋白溶液中，省去CuSO4。检测硫磺素T荧光作为具有交叉β结构构象的错折叠蛋白存在的一个量度标准。表现出增强的ThT荧光的蛋白溶液对PBS以及它们的非氧化对照物进行透析。
低密度脂蛋白(LDL)分离自新鲜(<24h)人类血浆，其保持在10℃下，获自荷兰血库。基本上如早期所述(4)分离LDL。将血浆在超离心机中离心三个连续循环。分离LDL成分并储存在4℃的N2下。实验之前，将天然LDL(nLDL)在4℃下对0.9％ w/v NaCl透析过夜。为了获得具有不同氧化程度的氧化LDL(oxLDL)，将天然LDL首先对含有1mM NaNO3的0.15M NaCl溶液在4℃下透析过夜。然后，将nLDL稀释至3-5mg/ml，并加入CuSO4至终浓度25μM并在37℃下孵育。以类似方式，利用FeSO4代替CuSO4来氧化LDL。利用FeSO4的氧化也通过透析步骤来进行。接下来，LDL对在具有另外150mM NaCl和1mM NaN3的PBS pH7.2中的5μM FeSO4进行透析。氧化程度通过选择一定数量的氧化缓冲液更新周期加以控制。更经常会的在缓冲液中的FeSO4每10-12h进行更新，氧化程度将越高。为了终止氧化，将LDL样品在4℃下对150mM NaCl、1mM NaN3、1mM EDTA的缓冲液透析4h。氧化程度在λ＝234nm(Ultrospec 3000 Spectrophotometer(PharmaciaBiotech))的二烯形成检测之后。为了终止氧化反应，将LDL对0.15M NaCl、1mM NaNO3和1mM EDTA进行透析。将LDL溶液在4℃储存在N2下。LDL的ApoB蛋白部分中的交叉β结构构象的存在利用硫磺素T荧光测定进行分析(参见上文)。
利用变性表面的错折叠蛋白的制备
为了制备经暴露于由多聚分子构成的表面的错折叠蛋白，将21.4μg/ml的CpG-ODN(Coley Pharmaceutical Group，MA，USA)或600μg/ml脂多糖(LPS，来自大肠杆菌血清型011:B4，#L2630，批次104K4109，Sigma-Aldrich)与1mg/ml的小鸡卵白溶菌酶(冻干的，Fluka，Sigma-Aldrich；目录号62971)、BSA、内皮他丁和卵清蛋白进行混合，并在滚筒箱上在4℃孵育o/n或在室温下孵育1h。为此，将冻干蛋白溶解在HEPES缓冲盐水(HBS，10mM HEPES，4mM KCl，137mM NaCl，pH 7.2)中至终浓度2mg/ml，并将7.9mg/ml的内皮他丁在HBS稀释至2mg/ml。将蛋白在室温下在滚筒箱上温和溶解10min、在37℃和室温下溶解10min。然后在使用之前将2mg/ml的蛋白溶液uo 100,000*g超离心1h，随后用42.9μg/mlCpG-ODN或用1200μg/ml LPS在HBS中1:1进行稀释。淀粉样蛋白交叉β结构的形成通过检测硫磺素T荧光相对于其中省去变性表面的对照蛋白的增强而进行评价。为此，将蛋白稀释至25μg/ml并用测定缓冲液或在测定缓冲液中的25μM硫磺素T加以孵育(测定细节参见上文)。
可替换地，在蛋白暴露于变性分子如(带负电)(磷)脂如磷脂酰丝氨酸和心磷脂(cardiolipin)、硫酸葡聚糖(500,000Da)、明矾、鞣花酸(ellagic acid)、玻璃或高岭土之后获得。这些错折叠蛋白包括在实施以显示IgIV作用工作机制的试验中。
用于测试IgIV结合至错折叠蛋白的酶联免疫吸附测定
正常集中血浆中的IgIV或免疫球蛋白的结合利用酶联免疫吸附测定(ELISA)装置进行确定。为此，将50μl/孔处于指定浓度的潜在配体或仅用于对照和背景检测目的包被缓冲液(coat buffer)在50mM NaHCO3 pH 9.6中移动下，在4℃涂布过夜。糖化白蛋白和Hb(BSA-AGE和Hb-AGE)、对照BSA和对照Hb以5μg/ml进行涂布。Aβ和FP13以25μg/ml进行涂布。BSA和Hb对照通过将1mg/ml的冻干蛋白溶解在PBS(通过移液再悬浮)而新鲜制备，接着在室温、滚筒箱中30分钟时间。蛋白质溶液以16,000*g离心10分钟，并在包被缓冲液中稀释。包被对照利用抗-糖化蛋白抗体、抗-白蛋白抗体、抗-Hb抗体和抗-Aβ抗体来实施。FP13不被多克隆抗-血纤蛋白原抗体。碱性磷酸酶轭合的抗人类Ig抗体通过用二次抗体涂布IgIV并覆盖它们而加以控制。涂布之后，板用50mMTris-HCl pH 7.3、150mM NaCl、0.1％ v/v Tween 20清洗两次，并在移动中室温下用175μl/孔封闭试剂(Roche Diagnostics，Almere，TheNetherlands；目录号11112589001)封闭1h。板清洗两次，并在稳定移动中，在室温下，用指定抗体稀释系列、血浆稀释系列或对照，包括仅结合缓冲液，在有或没有推定抑制剂的情况下，在结合缓冲液；PBS/0.1％ v/v Tween 20(以50μl/孔)一式三份地加以孵育。在四个清洗循环之后，二次抗体加入这些孔中，50μl/孔，移动中在室温下45分钟。RAMPO和SWARPO以2000倍稀释使用，羊抗-人类IgG抗体稀释3000倍，羊抗-人类IgM抗体稀释1000倍。在用清洗缓冲液清洗5次接着用PBS清洗两次之后，评价抗体的结合。对于碱性磷酸酶轭合二次抗体，在DEA缓冲液pH9.8(在H2O中的10％ v/v二乙醇胺，具有240μM MgCl2.6H2O，用HCl调节pH)中的对硝基苯基磷酸酯(600μg/ml)以100μl/孔使用约5分钟。通过加入50μl/孔的在H2O中的2.4M NaOH来终止反应。5分钟之后，在405nm处读出吸收率。对于过氧化物酶轭合RAMPO和SWARPO，在50mM柠檬酸/100mM Na2HPO4/0.06％ v/v H2O2 pH 5中的OPD(1.3mg/ml)以100μl/孔使用约5分钟。通过加入50μl/孔的在H2O中的2M H2SO4来终止反应。5分钟之后，在490nm处读出吸收率。每一个试验至少进行两次。为了检测淀粉样蛋白交叉β结构结合哗哈哈和对照(参见(Bouma et al.，2003)和专利申请P57716EP00)是否干扰IgIV结合至交叉β结构配体，潜在抑制剂的浓度系列在不最理想IgIV浓度存在下进行测试。为此，使用的tPA、K2P tPA、刚果红、硫磺素S(ThS)和硫磺素T(ThT)的原溶液分别为3.7mg/ml、1.1mg/ml、10mM、10mM和10mM。tPA和K2P tPA的影响在10mM ε-氨基己酸存在下进行测试，以避免tPA和K2P tPA的kringle 2结构域结合至赖氨酸-和精氨酸残基(结合至淀粉样结构的tPA由其指状结构域介导，其在截短K2P tPA中缺少；kringle 2结构域结合至赖氨酸和精氨酸暴露的侧链)。。结合缓冲液和K2P tPA在这些抑制研究中用作阴性对照。单独地，类似抑制研究利用固定Aβ或BSA-AGE、不最理想浓度的tPA(参见(Bouma etal.，2003；Kranenburg et al.，2002))和刚果红或ThT的浓度系列来进行。数据整理如下进行。平均一式三份并计算标准偏差。减去利用缓冲液涂布孔获得的背景信号(初次抗体与空孔的结合)以及利用其中省去初次抗体获得的背景信号(二次抗体对涂布配体的结合)。
在单独系列的实验中，酵母朊病毒肽NH2-GNNQQNY-COOH(SEQ-ID 5)以25μg/ml的浓度涂布到ELISA板。使用在4℃孵育73h的1mg/ml原溶液。在对照孔中，涂布5μg/ml Hb-AGE或包被缓冲液。分析稀释系列IgIV(I)的结合并与浓度系列tPA和K2P tPA的结合相比较。另外，5个对于错折叠蛋白具有亲和力的单克隆抗体也对与固定配体的结合进行检测(参见下文对于单克隆的细节)。为此，包含336μg/ml的该5个抗体每一个的混合物在PBS中制备，获得1.83mg/ml总抗体的原溶液。
鼠单克隆抗-错折叠蛋白抗体的制备
通过ABC-杂交瘤设备(P.van Kooten & M.Smits，UtrechtUniversity，The Netherlands)进行免疫接种。小鼠(Balb/c)用在100μl H2O和100μl完全弗氏佐剂中的100μg Aβ进行免疫接种。三周后，获得在H2O-Specol(ID-DLO，Lelystad，The Netherlands)中的50μg Aβ的第一次放大，接着是在第一次放大后30天的第二次放大。在第二次放大后36和37天，小鼠给予具有在PBS中的50μg Aβ的两个另外的放大(静脉内)。在开始用Aβ免疫接种之后大约44周和48周之间，小鼠得病，但恢复。49周以后，小鼠用50μg在H2O-Specol中的重组小鸡血清淀粉样蛋白A免疫接种。这种抗原是一种Dr H.Toussaint(Dept.of Veterinary Medicine，University ofUtrecht，The Netherlands)的研究成果。4周以后，小鼠用50μgHb-AGE免疫接种。最后，31天和32天以后，小鼠用在PBS中的50μg FP6(SEQ-ID 6)静脉内地放大两次。最后放大后3天，杀死小鼠并将脾用来制备杂交瘤。融合介质用PEG4000(Merck，目录号9727)富集。脾包含格外高数量的细胞，即7*108个细胞，具有相对高丰度的渗透纤维原细胞。2*108个细胞与4*107Sp2/0浆细胞瘤细胞混合以融合。融合之后，使用由具有10％ 10％ Fetalclonel(Hyclone)的OptiMEM I、4μM氨喋呤和1％ Glutamax I构成的选择性杂交瘤培养基。在允许脾B-细胞和浆细胞瘤细胞融合的孵育时间之后，使用带有Accudrop软件的Facs Vantage装置，将细胞以1个细胞/孔转移到96-孔板。在大约两周之后，筛选杂交瘤以用于推定的抗交叉β结构抗体的生产。首先，对96孔板中的768个克隆体进行筛选存在结合至固定FP13 K157G淀粉样蛋白和淀粉样γ-球蛋白的抗体。为此，将FP13 K157G和淀粉样γ-球蛋白在H2O中一起稀释至每个多肽为5μg ml-1。Microlon高结合ELISA板(Greiner，Bio-One GmbH，Frickenhausen，Germany)填充50μl的这种溶液并在37℃下空气干燥过夜。板用封闭试剂(目录号#11112589001，Roche Applied Science，Basel，Switzerland)封闭并用自来水清洗。将含10％ v/v胎牛血清的100μl杂交瘤细胞培养物上清液转移到涂布板并在室温(RT)ixa孵育1h同时摇晃。板用Tris-缓冲压水pH7.3(TBS，50mM Tris-HCl，150mM NaCl)与0.1％ Tween-20(清洗缓冲液)清洗，接着用在PBS/0.1％ Tween 20中的2000x稀释的过氧化物酶结合兔抗-小鼠免疫球蛋白(RAMPO，#P0260，DAKO，Denmark)在RT下覆盖30分钟同时摇晃。在充分清洗之后，结合的RAMPO用四甲基联苯胺(TMB，#45.01.20，/#45.014.01，Biosource，Nivelles，Belgium)可视化。反应利用在H2O中的1％ H2SO4在5分钟之后终止。这些板在450nm处读数。当信号达到至少1.5x背景水平时，克隆体包括在进一步筛选试验中。同样，推定抗-交叉β结构抗体的存在用固定FP13 K157G和淀粉样γ-球蛋白进行分析。然后，35个克隆体保持阳性。将那些克隆体转移到细胞培养瓶中并进行进一步分析。为此，现在单独地再次将FP13 K157G和淀粉样γ-球蛋白以及Aβ和Hb-AGE固定在ELISA板上。另外，将新溶解的Aβ、FP13K157G、Hb和γ-球蛋白涂布到固定器板(Exiqon，
Figure A200780013420D0072144922QIETU
，Denmark)上。这些新溶解的对照分别以在PBS中的20、12.5、50和50μgml-1在室温下涂布1h同时摇晃。分别20、12.5、50和50μg ml-1的Aβ、FP13 K157G、Hb和γ-球蛋白原溶液首先以238*103xg离心30分钟，以除去可能存在的不溶聚集物。缓冲液涂布到Greiner(H2O)和Exiqon(PBS)板上作为另外的阴性对照。Greiner板在利用768个克隆体的初选过程中不封闭。细胞培养基中的10％ FCS在ELISA板中的细胞上清液孵育过程中是有效的封闭剂。将10μl的PBS/1％Tween-20加入到Exiqon板的孔中，然后加入细胞上清液。浓度为0.1％的Tween-20对于固定器板是有效的瞬时封闭剂。将100μl的杂交瘤上清液转移到这些板。培养基用作阴性对照。信号计算为在具有10％ FCS的新培养基在各种固定的抗体和对照上孵育时获得的信号的积。当用新培养基获得超过2.0x背景值是认为信号是阳性的。接下来在Greiner板上进行从35个克隆体中筛选出21个，制备如上所述。显著首先用封闭剂粉笔这些板并清洗。50μl的每一个杂交瘤克隆体上清液一式两份地检测序列独立但结构特异性的抗体的存在，新培养基四个一组地进行试验作为对照。从最初21个克隆体，选择6个用于进一步的单个细胞亚克隆以获得单克隆杂交瘤。该6个克隆体以1个细胞/孔接种96孔培养板并在富集10％v/vFCS的介质中进行培养。对这些克隆体都检测对两种涂布淀粉样蛋白的结合。对于6个克隆体的每一个，5个亚克隆体鉴定为结合至这两种淀粉样蛋白，用于接下来在25cm2培养瓶中进行培养。使用荧光标记的同种型特异性抗体的30个亚克隆体的同种型化根据制造商(Luminex，Austin，TX，USA)推荐通过ABC-杂交设备(M.Smits)来进行。利用传统层析纯化技术从细胞培养基中纯化抗体。样品利用在Econo柱(Biorad，Veenendaal，The Netherlands)中的AFFI-T凝胶基质(KemEnTEC，Biozym，Landgraaf，The Netherlands)进行亲硫层析(thiophillic chromatography)。纯化的抗体在-20℃储存在PBS中。
为了获得单克隆抗体，将小鼠连续用人类淀粉样Aβ(1-40)E22Q、重组小鸡血清淀粉样蛋白A和具有淀粉样蛋白性质的糖化人类血红蛋白进行免疫接种，接着用淀粉样人类纤连蛋白肽FP6进行最后放大。杂交瘤形成并且对它们的细胞培养物上清液筛选存在特异性识别一个表位的抗体，该表位仅在交叉β结构构象存在于具有与用于免疫接种无关的氨基酸组分的任何多肽中时被识别。在768个克隆体中，选出6个克隆体2E2、4F4、7H1、7H2、7H9和8F2，其对于较宽范围的不同于用于免疫接种的抗原的淀粉样蛋白聚集体表现出亲和力。在多轮选择和亚克隆之后，最后以下5个单克隆抗体对具有交叉β结构构象的错折叠蛋白表现出稳定的结合：2E2B3D12、7H2H2、7H1C6A7、7H9B9、8F2G7H7。7H2H2克隆体特异性地只结合各种形式的免疫球蛋白，使我们将该克隆体分类为“稀粘液因子类抗体”。制备5个所列单克隆抗体的混合物，其中单个抗体的终浓度对于2E2B3D12、7H2H2、7H1C6A7、7H9B9和8F2G7H7分别为1.5、0.37、0.4、0.45和0.47mg/ml，获得的总抗体浓度为3.2mg/ml。可替换地，所有抗体在PBS中稀释至1.83mg/ml并1:1:1:1:1合并，产生具有336μg/ml单个抗体的总抗体浓度1.83mg/ml。这些鼠抗-错折叠蛋白抗体的混合物用作用于进一步血小板聚集测定的原溶液(参见实施例)。
血小板聚集
IgIV对由具有淀粉样蛋白交叉β结构构象的错折叠糖化Hb的聚集诱导的血小板聚集的影响在集合度测定中利用洗过的血小板进行检测。新抽的人类阿司匹林游离血温和地与柠檬酸盐缓冲液混合以避免凝固。血液在20℃以150*g旋转15分钟，并收集上清液；富含血小板血浆(PRP)。加入具有2.5％柠檬酸三钠、1.5％柠檬酸和2％葡萄糖的缓冲液pH6.5至最终体积比为1:10(缓冲液-PRP)。在20℃以330*g离心15分钟旋转沉积血小板之后，将粒状物再悬浮在HEPES-Tyrode缓冲液pH6.5中。加入依前列醇(Prostacyclin)至终浓度10ng/ml，并将溶液在20℃以330*g离心15分钟，同时温和摇晃。将粒状物以终血小板数调节为200,000-250,000个血小板/μl的方式再悬浮在HEPES-Tyrode缓冲液pH 7.2中。在用于测定之前，血小板在37℃下保持至少30分钟，以确保它们处于检测状态。5个供体的血小板在不同三天中单独分离(2，2，1)。
对于集合度测定，将270、280或300μl血小板溶液加入到玻璃管中并预热至37℃。加入搅拌磁子并将旋转设为900rpm，并使装置(Whole-blood aggregometer，Chrono-log，Havertown，PA，USA)密闭(blank)。加入终体积30、30或33.3μl包含感兴趣的激动剂和/或感兴趣的预混合拮抗剂(在HEPES-Tyrode缓冲液pH 7.2中预稀释。通过检测溶液的吸收率及时进行聚集，在血小板聚集时该吸收率及时降低。作为阳性对照，使用10μg/ml骨胶原(Kollagenreagens Horm，NYCOMED Pharma GmbH，Linz，Austria；批次502940)或5μM的合成凝血酶受体激活肽TRAP(NH2-SFLLRN-COOH，SEQ-ID 7)。记录聚集15分钟并表示为透射光的百分数(0-100％)。
用于捕获结合错折叠蛋白的蛋白的交叉β结构亲和基质的制备
为了能够进一步考察IgIV中的Ig亚组是否结合于错折叠蛋白，我们制备了具有结合错折叠蛋白的亲和基质。为此，我们根据制造商推荐将糖化Hb结合至CNBr-琼脂糖(GE Healthcare-Amersham，Roosendaal，The Netherlands)。对于在辊筒箱中4℃的过夜结合，将250μg HCl洗过和结合缓冲液洗过的抽气珠子(干重)仅用125μl结合缓冲液孵育(对照珠子)(100mM NaHCO3，pH 8.3，500mMNaCl)或用结合缓冲液与3.33mg/ml Hb-AGE孵育。在充分清洗后，我们确定Hb-AGE是否结合至琼脂糖以及制备的亲和基质是否真的能够捕获对带有交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的蛋白。结合效力通过比较Hb-AGE起始原料的浓度与结合反应之后Hb-AGE上清液浓度进行确认。稀释系列在ADV01蛋白染色(细胞骨架)中进行制备并在590nm处读出吸收率。比较吸收率信号表明，50％的Hb-AGE结合至琼脂糖，即在250μg珠子(干重)上有大约200μg Hb-AGE。
之前，我们建立了，组织型血纤蛋白溶解酶原激活剂是一种对带有交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的蛋白，包括糖化蛋白(Bouma et al.，2003；Kranenburg et al.，2002)。为了检测Hb-AGE亲和基质结合tPA的能力，将20μl在HBS中的Hb-AGE琼脂糖或对照琼脂糖的1:1悬浮液一式二份地在辊筒箱中在4℃过夜孵育，用6μM tPA(在0-10μM浓度系列试验之后的优化浓度)进行孵育。在以8,000*g离心2分钟并抛弃上清液之后，珠子用HBS清洗5次。结合tPA通过在室温下用20μl洗提缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，1140mM NaCl，10mM ε-氨基己酸，4.5mM CaCl2，0.005％Tween20)孵育该基质1h而进行洗提。洗出液分析tPA含量并将其与在接触Hb-AGE琼脂糖或对照琼脂糖之前和之后的孵育混合物的tPA含量进行比较。相对tPA浓度利用生色tPA底物S2765(Chromogenix，Instrumentation Laboratory SpA，Milano，Italy)来确定。为此，将1-5μl的试样(tPA起始溶液，接触Hb-AGE琼脂糖后的上清液，用洗提缓冲液孵育Hb-AGE琼脂糖之后的洗出液)与10μl 5mM S2765和5μl的10倍HBS原溶液混合，并用H2O调节至终体积50μl。通过tPA底物从无色试剂至黄色物质的转变在37℃的吸收96孔动力板读数器上及时记录。
接着，将120μl或20μl的亲和Hb-AGE琼脂糖基质或者120μl或20μl的对照琼脂糖(无结合蛋白)用200μl的50mg/ml IgIV(Octagam)原溶液孵育(室温下4h)。然后，确定残留在溶液中IgIV的浓度和在用孵育缓冲液充分清洗后结合于基质的IgIV的量。蛋白浓度通过使用IgIV标准稀释系列测量在280nm的吸收率以及通过比较IgIV样品在用ADV01(细胞骨架)染色、用IgIV标准稀释系列染色后在590nm处的吸收率来确定。结合至Hb-AGE琼脂糖或对照琼脂糖的IgIV用大约2体积的HBS(结合缓冲液)清洗6次。然后，结合IgIV用具有1M NaCl的200μl HBS和10mM ε-氨基己酸洗提(室温下30分钟，搅拌)。固定在ELISA板上的Hb-AGE的结合用稀释系列的未处理IgIV、接触Hb-AGE琼脂糖后的IgIV、接触对照琼脂糖后的IgIV、从Hb-AGE琼脂糖洗脱的IgIV、从对照琼脂糖洗脱的IgIV进行分析。为此，将5μg/ml Hb-AGE或热变性BSA在搅拌、室温下涂布1h(Greiner Microlon高结合板)、这些板用封闭剂(Roche)封闭。IgIV制剂稀释系列的结合评价如上所述。从Hb-AGE琼脂糖洗脱的IgIV和从对照琼脂糖洗脱的IgIV中的IgIV的相对量相对于IgIV原料进行计算。为此，制得结合Hb-AGE或结合热变性BSA的IgIV稀释系列的标准曲线。从Hb-AGE琼脂糖洗脱的IgIV的富集相对于对涂布Hb-AGE的结合利用用120μl琼脂糖孵育的IgIV进行评价。相对于对热变性BSA的结合的富集利用用20μl琼脂糖孵育的IgIV进行评价。
降低雅氏病患者的脑切片用IgIV和单克隆抗-错折叠蛋白抗体的混合物的免疫组织化学染色
对于患有偶发性CJD或新变异CJD的克雅氏病(CJD)患者的脑切片的免疫组织化学染色，制备石蜡切片(Dept.of Pathology，University Medical Center Utrecht，The Netherlands)。这些切片应用于包括以下步骤的标准染色程序：1、用封闭缓冲液封闭固定的切片；2、用IgIV或对带有交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的单克隆抗体孵育，在结合缓冲液中稀释；3、清洗；4、分别用抗-人类IgG抗体和抗-鼠IgG/IgM抗体孵育；5、清洗；6、用Powervision孵育；7、清洗；8、用DAB染色；以及9、密闭并计数，在显微分析和计分之前通过酸处理去污。该程序由配备以TSE污染材料工作的授权III类实验室中的有资格人员实施，位于UMC Utrecht，TheNetherlands。作为对照，这些切片连续用tPA、鼠单克隆抗-tPA抗体和Powervision孵育，接着DAB染色。作为用于染色程序的对照，降低阿尔茨海默病患者的脑切片还用IgIV或tPA孵育，遵循上面给出的相同程序。
结果与讨论
实施例1：IgIV(人类免疫球蛋白IgG抗体)结合包含交叉β结构构象的错折叠蛋白
通过碳水化合物(烃)的蛋白的非酶促修饰，一种称为糖化作用的过程，诱导蛋白错折叠伴随有淀粉样蛋白交叉β结构形成((Bouma et al.，2003)。IgIV对固定的糖化蛋白Hb-AGE和BSA-AGE以及非糖化的Hb和BSA的结合利用ELISA装置构建(图1A-C)。IgIV的结合利用碱性磷酸酶标记的抗-人类IgG或IgM抗体进行检测。IgIV(I)和IgIV(II)二者以高亲和力结合至包含交叉β结构的糖化蛋白，而它们很弱地结合至固定的天然白蛋白和天然血红蛋白(图1A-C)。IgIV(I)对固定蛋白的亲和力高于IgIV(II)的。IgIV(I)对Hb-AGE的亲和力高于对于BSA-AGE的。取决于白蛋白或血红蛋白制剂，稍微不同量的IgIV结合至这些“天然”蛋白，最可能是由于不同量的具有非天然构象的分子，暴露用于对错折叠蛋白具有亲和力的IgIV抗体的结合部位。
组织型血纤蛋白溶解酶原激活剂是含有特异性地与包含交叉β结构的错折叠蛋白相互作用的组件(称为指状结构域)的丝氨酸蛋白酶(Kranenburg et al.，2002；Gebbink et al.，2005)。IgIV(I)在不最理想浓度15μg/ml对涂布的糖化蛋白的结合通过浓度系列的tPA有效地消除，而截短K2P tPA对IgIV(I)结合没有影响(图1D)。已知tPA以相对高的亲和力(kD大约为500pM)结合至糖化蛋白，并且以稍微较低亲和力结合至许多具有包含交叉β结构的淀粉样蛋白构象的其他错折叠蛋白，最可能经由其纤连蛋白I型结构域，其在K2PtPA中缺少。类似于tPA，淀粉样特异性染料刚果红也有效地阻断15μg/ml IgIV(I)对涂布的糖化蛋白的结合(图4A)。
为了评价IgIV对任何错折叠蛋白是否具有宽范围的特异性，在没有限制具有交叉β结构的蛋白的氨基酸序列的情况下，热变性MSA、卵清蛋白和胰高血糖素分析IgIV结合、以及氧化卵清蛋白、胰高血糖素、血红蛋白和LDL、以及对照非氧化或非热变性对应物。为此，所有蛋白以在50mM NaHCO3中的25μg/ml浓度(胰高血糖素：12.5μg/ml)固定在Greiner microlon高结合板上，并用IgIV(I)PBS/0.1％ v/v Tween 20中的0/1/3/9/27/81/243/729μg/ml浓度系列覆盖。
总之，这些结果表明，IgIV结合至包含交叉β结构构象的固定错折叠蛋白。为了进一步证实这些发现，评价了对一系列错折叠蛋白的结合。例如，开展了IgIV对氧化蛋白、热变性蛋白、通过暴露于(生物相容性)表面例如在体外循环装置中而变性的蛋白、暴露于疾病相关错折叠蛋白(例如淀粉样蛋白-β(阿尔茨海默病)、β2-微球蛋白(透析))而变性的蛋白的结合。
实施例2：血小板聚集由淀粉样错折叠蛋白诱导并由人类IgIV和鼠单克隆抗体抑制
从表面健康人类自愿者新抽的柠檬酸化血液分离出的血小板当暴露于错折叠糖化蛋白时易于聚集，如来自三个不同的带有Hb-AGE的个体(供“A”、“B”、“C”)的血小板证实的(图2)。当错折叠蛋白Hb-AGE或BSA-AGE用IgIV(I)预孵育(图2A，C)或用5个对包含交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的单克隆抗体(2E2B3D12，7H2H2，7H1C6A7，7H9B9，8F2G7H7)的混合物孵育(图2E，F)时，血小板聚集被抑制。血小板聚集通过骨胶原或TRAP的诱导很难受到IgIV(I)或混合的单克隆抗体影响(图2B，D)，表明这些单克隆抗体特异性地已知由包含交叉β结构的蛋白介导的作用。
在单独系列的使用人类供体D和E的血小板的实验中，血小板聚集由50μg/ml Aβ诱导(图3)。提供了2.5mg/ml IgIV(I)或单克隆抗体混合物对淀粉样蛋白诱导的聚集的影响(图3)。IgIV(I)和单克隆抗体混合物都抑制具有两种不同供体(D和E)的血小板的淀粉样蛋白诱导的血小板聚集。在由Aβ刺激之后，供体D表现出比供体E更高的％最后聚集。对于这两个供体，IgIV(I)延迟血小板聚集开始大约2分钟。当相比于用Aβ孵育时，用Aβ和IgIV孵育的供体D的血小板最后聚集到相同程度。在供体E的血小板的情况下，IgIV加入到Aβ导致对血小板聚集的更强抑制。4μM TRAP用作阳性对照。在对照实验中，IgIV或单克隆抗体对血小板的TRAP激活的影响通过用单克隆抗体的混合物预孵育TRAP原料进行分析。这些聚集实验表明，IgIV或单克隆不影响TRAP诱导的聚集(未示出)。
这些结果表明，人类IgIV含有抑制由包含交叉β结构的糖化蛋白和Aβ诱导的血小板聚集的抗体。单克隆抗-错折叠蛋白抗体的混合物表现出相似抑制活性(指示在人类IgIV治疗溶液中存在抗-错折叠蛋白抗体。现在对大量各种各样的错折叠蛋白测试它们诱导血小板聚集的能力。接着进行人类IgIV或鼠抗-错折叠蛋白抗体的影响以证实当前的发现。用来诱导血小板聚集的可选替换错折叠蛋白是但不限于氧化蛋白、(热)变性蛋白、糖化蛋白、暴露于变性表面或变性分子的蛋白，该变性分子例如是CpG-ODN、脂多糖、硫酸葡聚糖、高岭土、玻璃、脂质、或淀粉样肽例如FP6、淀粉样-β、FP13。
实施例3：通过硫磺素T和硫磺素S对IgIV和tPA与错折叠蛋白的结合的增强
两种淀粉样蛋白特异性染料硫磺素T和硫磺素S在相对较低染料浓度下在一定程度上抑制IgIV-糖化蛋白相互作用，而在相对较高染料浓度下，两种染料看起来促进IgIV与固定的错折叠蛋白的结合(图4B，C)。这通过这样的事实解释，即，淀粉样特异性染料与错折叠蛋白的结合促进对结合至错折叠蛋白具有亲和力的蛋白的随后结合。硫磺素T和硫磺素S结合使具有交叉β结构构象的周围分子或部分分子稳定在代表用于IgIV的结合部位的相对固定状态。在低染料浓度下，这些作用力还太弱而不能触发固定入更均匀的暴露交叉β结构的IgIV结合部位。现在，染料结合直接对IgIV结合部位完成。在较高染料浓度下，结合的染料分子将它们的稳定作用力一致地施加到周围的交叉β结构，从而形成用于IgIV的易于接近的结合部位。刚果红和硫磺素T的相似作用在考虑不最理想浓度的tPA与固定BSA-AGE或Aβ的结合时观察到(图4D-G)。淀粉样蛋白特异性分析与交叉β结构在一定条件下的结合促进对错折叠蛋白具有特异性的另一分子的结合的观察结果用来改善药物如抗体的效力，以及用来处理蛋白错折叠疾病如淀粉样变性病。
实施例4：用于结合对具有淀粉样蛋白交叉β结构构象的配体具有亲和力的蛋白的错折叠蛋白琼脂糖亲和基质
广泛葡萄糖-6-磷酸酯糖化血红蛋白、Hb-AGE固定到CNBr-琼脂糖基质导致用于从溶液捕获tPA的有效亲和基质(图5)。证实了tPA特异性地结合错折叠蛋白亲和基质(图5A)。这通过分析清洗缓冲液在该缓冲液用tPA孵育的Hb-AGE错折叠蛋白亲和琼脂糖基质或tPA孵育的没有结合蛋白的对照基质进行孵育之后的tPA含量而进一步描述(图5B)。任何tPA丝氨酸蛋白酶活性在清洗Hb-AGE琼脂糖后在清洗缓冲液中很难恢复，并在清洗tPA孵育的对照珠子后在清洗缓冲液中观察到部分tPA活性。在用洗提缓冲液孵育tPA孵育的亲和基质和对照基质之后，洗提缓冲液中tPA活性恢复的分析表明，Hb-AGE琼脂糖对于tPA是一种有效和选择性的亲和基质(图5C)。
在接下来的系列实验中，用于结合错折叠蛋白的蛋白的Hb-AGE琼脂糖亲和基质用来捕获在特异性地结合错折叠蛋白的IgIV中的部分。特异性地结合至Hb-AGE琼脂糖的IgIV在ELISA中测试与固定的Hb-AGE和热变性BSA的结合。首先，利用蛋白染色ADV01制备IgIV原料稀释系列的标准曲线(图5D)。在接触亲和基质之后和从亲和基质洗脱结合的蛋白的IgIV浓度利用IgIV标准曲线来确定。以类似方式，对于IgIV原料稀释系列与固定的Hb-AGE或热变性BSA的结合制备标准曲线(图5E，H)。在接触亲和基质或对照基质之后的IgIV中以及在洗出液中的相对IgIV浓度通过利用标准曲线计算IgIV浓度来确定。将这些计算的IgIV浓度与直接利用ADV01染色确定的IgIV浓度进行比较。利用这些数值，计算用于IgIV特异性结合错折叠蛋白的富集因子。
在图5F中，示出了1000倍稀释的IgIV原料(50μg/ml)和与Hb-AGE琼脂糖或对照琼脂糖接触的IgIV与涂布Hb-AGE的结合。Hb-AGE结合在IgIV接触Hb-AGE基质之后大约减少50％，而在IgIV与对照基质接触之后没有观察到信号降低。接触Hb-AGE基质或对照基质之后的总蛋白浓度为55mg/ml和60mg/ml。与最大预期值50mg/ml(起始原料)的这些偏差是由标准曲线的非线性导致的。在从Hb-AGE琼脂糖和对照基质洗脱的IgIV组分中，分别存在120和7μg/ml IgIV，如利用ADV01蛋白染色确定的。当评价100倍稀释的洗出液与固定的Hb-AGE的结合时，观察到的信号相当于在大约75和0.3mg/ml IgIV原料结合后获得的信号(图5G)。因此，总之，120μg/ml富集IgIV的Hb-AGE琼脂糖亲和基质以相当于大约75mg/ml的原始IgIV原料的潜力结合Hb-AGE。这相当于大约75.000/120＝600倍的富集因子。在图I中，描述了当相比于起始原料时，IgIV与Hb-AGE琼脂糖或对照基质的接触不会减少在评价IgIV结合至固定的热变性BSA之后获得的信号。然而，当测试从Hb-AGE基质洗脱的120μg/ml IgIV与热变性BSA的结合时，信号相当于1.7mg/ml起始原料(原始IgIV原料)的结合之后获得的信号(图5J)。这表明，IgIV与错折叠蛋白亲和基质的接触增大对于热变性BSA的特异性大约1700/120＝14倍。
对于Hb-AGE的可选替换，其他错折叠蛋白固定于一种基质以便改善亲和基质的选择性、亲和性、能力和/或稳定性。固定的可选替换错折叠蛋白是但不限于氧化蛋白、(热)变性蛋白、糖化蛋白、暴露于变性表面或变性分子的蛋白，这些分子例如是CpG-ODN、脂多糖、硫酸葡聚糖、高岭土、玻璃、脂质、淀粉样肽例如FP6、淀粉样蛋白-β、FP13。对于CNBr琼脂糖的可选替换，其他基质或固体载体应用于错折叠蛋白配体的固定。优选地，固体载体是在良好生产实践(GMP)条件下生产的，并且优选地，该基质指定为“生物过程介质(Bioprocess medium)”，提及与医学应用相容的基质相对于人类的安全方面。其他基质/固体载体是但不限于NHS-琼脂糖、抗生蛋白链菌素-琼脂糖(Streptavidin-琼脂糖)、胶乳珠、环氧树脂活化固体载体例如交联聚甲基丙烯酸酯、活化的硫醇琼脂糖、Carboxylink、Profinity环氧化物。一种亲和基质利用有益于特定疾病的错折叠蛋白进行制备。利用这种亲和基质，结合具有交叉β结构构象的疾病相关错折叠蛋白的那些Ig被选择性地分离。在回收这种Ig组分之后，当用作用于错折叠疾病的治疗时，以更高特异性有益结果获得疾病特异性IgIV。不仅仅包含IgG的IgIV应用于这个程序，而且每一个Ig组分测试抗体的有益亚组的存在，例如IgM亚类的抗体。与疾病状态相关并用于制备IgIV富集亲和基质的错折叠蛋白的一些实例是淀粉样蛋白-β(阿尔茨海默病)、糖化蛋白(透析，糖尿病)、β2-微球蛋白(透析)、甲状腺素运载蛋白(transthyretin)(全身性淀粉样变性病)。对于形成错折叠交叉β结构富集分子和用于疾病特异性负极程序的蛋白的其他实例，参见表4和表5。
组合对具有清除信号的高特异性和亲和力的新构建体：具有Ig的Fc结构域的错折叠蛋白结合蛋白的嵌合体
基于以下的发现，即IgIV中的IgG分子和鼠单克隆IgG1/IgM/IgG2a抗体结合具有交叉β结构构象的错折叠蛋白，设计了一种新的分子，具有对于错折叠蛋白甚至更高的特异性和/或亲和力，组合有易于经由与Fc受体相互作用的清除能力。为此，指状结构域(F)或具有对交叉β结构的亲和力的任何其他蛋白结构域，例如，用于高级糖化终产物的受体的Ig结构域、低密度脂蛋白受体相关蛋白(的簇II、簇IV)的结构域、清道夫受体A、-B-I或CD36的结构域在DNA水平或氨基酸水平上与Ig分子的Fc部分融合。事实上，对于错折叠蛋白具有亲和力的任何蛋白提供合适结构域以引入对具有Fc结构域的复合构建体中的交叉β结构特异性(表4、5)。tPA、因子XII、肝细胞生长因子激活剂和纤连蛋白的指状结构域都结合具有交叉β结构构象的错折叠蛋白，因此都用于设计嵌合构建体。指状结构域的任何组合或多个指状结构域的序列段或指状结构域与其他错折叠蛋白结合结构域的组合也用于开发具有Fc结构域的嵌合构建体。制备嵌合体基因并合成地制备，以及在适当表达载体中进行克隆用于在例如酵母细胞、植物细胞、细菌、真核细胞(例如人类中胚肾细胞、幼地鼠肾细胞)中的表达目的。在例如重组F-Fc嵌合蛋白纯化后，作为治疗剂应用于对其使用IgIV的任何疾病。可选替换地，亲和区或合成分子或者对交叉β结构或包含交叉β结构的蛋白具有亲和力的任何蛋白(的部分)，通过本领域技术人员已知的用于蛋白(片段)(非)共价结合的任何方法融合至例如Fc区。此外，对交叉β结构和/或包含交叉β结构的分子(表3)具有亲和力的非蛋白质性质分子以类似方式融合至Fc区。
实施例5
用于测试给予IgIV、亲和纯化的富集IgIV或错折叠蛋白结合蛋白或分子与Fc结构域的嵌合结构的保护和/或有益作用的模型
为了测试IgIV、或利用具有结合错折叠蛋白的基质亲和纯化后的富集IgIV组分、(人源化)抗-错折叠抗体、或例如指状结构域和IgG分子的Fc结构域的嵌合结构的有益作用，多个用于疾病状态的体外细胞基模型、以及体内动物或人类模型用来确定这些模态是否具有比给予总IgIV或者比目前的标准疗法更显著的有益作用。
体外鼠树突细胞分析
(自身)免疫性依赖于通过抗原呈递细胞如树突细胞的(自身)抗原的呈递。因此，培养的鼠树突细胞(DC)用作用于(自身)免疫原性的模型。为此，从例如8-12周龄Black-6小鼠的后退分离DC。分离骨头并在70％乙醇中漂洗，在具有25mM HEPES、10％胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI-1640中漂洗。然后骨头用这种缓冲液在两个方向上冲洗。洗出液通过加入红血球特异性溶解缓冲液(获自当地UMC Utrecht Pharmacy Dept.，目录号97932329)而从红细胞清除。洗出液通过在细胞培养板中进行培养而分析存活细胞。在这个阶段，该介质富集10ng/ml GM-CSF。DC在悬液中或在巨噬细胞层上生长。利用FACS和特异性抗体，确定了DC是否存在和激活。优选地，所谓共刺激分子如B7.1、B7.2、MHC II类、CD40、CD80、CD86的水平优选在CD11c阳性细胞上进行确定。可替换地，NF-κB的激活和/或细胞因子的表达用作涉及免疫原性激活的指示剂，如APC和DC。优选地，量化以下细胞因子：TNFα、IL-1、IL-2、IL-6和/或IFNγ。优选地，细胞因子水平通过ELISA量化。可替换地，量化mRNA水平。对于本领域技术人员来说，很明显也测试了APC和DC的作用(功能)。
可替换地，获自从人类血液或其他抗原呈递细胞的单核细胞的稳定DC种系、培养的树突细胞用来测试具有交叉β结构的错折叠蛋白的排除或失效的有益作用(Citterio et al.，1999)。利用DC进行的其他实验是这些细胞暴露于脂多糖(LPS)，接着读出上述活化标记物的水平。还测试了在LPS暴露于DC之前或期间，LPS与(富集)IgIV和/或其他亲和区的预孵育和/或共赋予的作用。这些实验看作是用于人类细菌感染和败血症的模型。
体外人类脐静脉内皮细胞分析
包含交叉β结构的糖化蛋白诱导炎性反应，认为是有助于某些疾病包括糖尿病性肾病的发病。一般地，错折叠蛋白诱导具有增强的炎症信号的表达或激活的细胞功能障碍。错折叠蛋白对内皮细胞(功能障碍)功能的作用例如是通过确定反应性氧物种响应于错折叠蛋白的水平而进行检测的。使用根据标准方案分离和培养的人类脐静脉内皮细胞或其他内皮细胞如bEnd.3内皮细胞。反应性氧物种(ROS)水平的水平利用荧光探针如CM-H2DCF-DA监测。可替换地，细胞存活性通过MTT-测定监测。培养的原始细胞提供进行在研究团体接收作为用于某些疾病状态的模型系统的体外细胞测定的机会。同样，IgIV、其分离的组分、功能等同体或我们的抗-交叉β抗体的能力应用于这些系统。
弥散性血管内凝血的体内鼠模型
交叉β结构诱导弥散性血管内凝血(DIC)。作为用于DIC的模型，在雌性C57B1/6小鼠中，引发泛化舒瓦茨曼反应。为此，小鼠用5μg脂多糖(LPS)在第0天从足垫中注射并在t＝24h静脉地注射300μg LPS。及时监测存活率以及多种蛋白如细胞因子的血浆水平。
体内小鼠/大鼠实验用自身免疫脑脊髓炎模型
为了测试抗-错折叠蛋白抗体在多发性硬化(MS)复发期间是否提供有益作用，使用用于MS的体内小鼠模型，即实验用自身免疫(或变应性)脑脊髓炎(EAE)模型。为此，髓磷脂碱蛋白(MBP)或髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白肽35-55(MOG35-55)在具有分枝杆菌的不完全弗氏佐剂(IFA)中进行乳化。错折叠蛋白的存在利用硫磺素T和刚果红荧光测定、以及tPA结合和激活测定加以确定。评价了IgIV或亲和纯化后的IgIV富集组分与乳化的MBP或MOG35-55的结合。为了诱导小鼠或大鼠中的EAE，将乳化的MBP或MOG35-55注入例如后足垫中。在小鼠中，MOG35-55的皮下注入量优选伴随有腹膜内注射百日咳杆菌毒素，其在48h后重复。例如，使用刘易斯雌性大鼠，或雌性Balb/c小鼠。用于临床疾病的检测例如计分如下：0，正常；1，跛行踪迹(limp tail)；2，受损翻正反射；3，后肢轻瘫；4，后肢完全瘫痪；5，死亡。任何(嵌合)抗体制剂的作用通过在诱导EAE后在一个或多个时间点给予该药物进行分析。测试的制剂之一是在具有固定的变性/错折叠MBP或MOG35-55的亲和基质上亲和纯化的IgIV，取决于其用于诱导疾病的两种蛋白。
体内骨胶原诱导的关节炎模型
在体内骨胶原诱导的关节炎模型中，大鼠在尾巴根部和每条硅上方的背部上皮内地注射II型(牛)骨胶原，溶解在一算中并在IFA中乳化。通过监测水肿和红斑而每天检查大鼠病征。测试的制剂之一是在具有在IFA中固定的变性/错折叠骨胶原的亲和基质上亲和纯化的IgIV。
体内小鼠败血症模型
败血症由交叉β结构介导。用来检测IgIV、单克隆抗体或相关药物的作用的体内小鼠败血症模型之一是“盲肠结扎和穿孔”模型。对于该模型，将雌性Balb/c小鼠在形成腹部切口以将盲肠从腹部取出之前进行麻醉。在盲肠穿孔之后在盲肠返回腹部和小鼠闭合之前，通过穿孔将一定量的腔内含物转移到外部。感染进展通过检测体温和计分小鼠的模态而进行监测。人们认为当小鼠体温过低时(T<33℃)和当小鼠不能将它们本身翻正时，小鼠被致死性地感染。在盲肠穿孔之后，给予对带有交叉β结构构象的错折叠蛋白具有亲和力的抗体的作用通过监测一组未处理小鼠和一组接受(富集)IgIV、单克隆抗体或嵌合构建体的小鼠进行评价。
体内大鼠败血症模型
作为对于小鼠败血症模型的可选替换，使用大鼠败血症模型。例如，内毒素性休克在大约150gr.的Fischer大鼠中通过静脉内注入150mg/kg大肠杆菌内毒素进行诱导。作为用于疾病进展的量度，在ELISA中，监测血液中的组织坏死因子和白介素-1的水平。用IgIV或抗体或对于错折叠蛋白具有亲和力的嵌合构建体的任何制剂的治疗作用以这种方式进行评价。
体内小鼠再活化链球菌细胞壁诱导的关节炎模型
在体内小鼠再活化链球菌细胞壁诱导的关节炎模型中，C57BL/6小鼠通过在膝关节中动脉内注入链球菌生脓T12有机体的细胞壁进行诱导。以1周间隔期重复该注射5次。疾病进展通过检测注射膝关节水肿持续约40天。杀死小鼠之后，在从膝关节除去皮之后，显微镜地计分关节炎严重程度。给予抗-交叉β结构抗体或嵌合体的作用与接受没有治疗剂的对照以及与注射缓冲液的对照小鼠进行对比。
体内小鼠实验用类风湿性关节炎模型
在用于实验骨胶原诱导的类风湿性关节炎的体内小鼠模型中，例如DBA/1株和/或C57BL/6株的雄性小鼠用天然牛II型骨胶原进行攻击。通过在尾巴根部皮下地注射在具有结核分支杆菌的完全弗氏佐剂中乳化的骨胶原诱导关节炎。利用在IFA中乳化的骨胶原在第21天刺激增长小鼠。使用标准程序，监测小鼠的关节炎的症状并计分疾病的严重程度。基于抗体的疗法的作用通过对比患有关节炎的对照小鼠和仅用缓冲液注射两次的对照小鼠、在诱导关节炎之后用IgIV/单克隆抗体/嵌合构建体处理小鼠而进行评价。
体内人类炎症/免疫原性模型：糖化蛋白+/-IgIV的给予
包含交叉β结构的糖化蛋白诱导炎性反应，有助于某些疾病包括糖尿病性肾病的发病(机理)。一般地，错折叠蛋白诱导具有增强的炎症信号的表达或激活的细胞功能障碍。错折叠蛋白和抗-交叉β结构试剂如IgIV、其片段或者功能等同物发炎的炎性作用在小鼠和人类中进行研究。包含交叉β结构的蛋白通过静脉内给予进行融合。在不同时间间隔，检测了对急性期蛋白如C-反应性蛋白、血清淀粉样蛋白A(SAA)、血清淀粉样P-成分(SAP)或补体因子3(C3)的水平的作用。可替换地，确定对炎症标记物如IL-6、IL-8、D-二聚体或凝血酶原(prothombin)F1+2水平的作用。通过ELISA确定最终(自身)抗体形成的水平。
用于确定化合物的炎性或免疫原性特性的全血测定
评价免疫系统细胞通过具有交叉β结构构象的蛋白的激活是否被利用交叉β结构结合化合物例如IgIV、单克隆抗-交叉β结构抗体、嵌合构建体所阻断的一种方式是通过使用“全血”测定。为此，在第1天，将新抽人类EDTA-血以1:1比例加入到RPMI-1640介质(HEPES缓冲的，具有L-谷酰胺，Gibco，Invitrogen，Breda，TheNetherlands)中，其在37℃预热。接着，加入包含交叉β结构构象的蛋白(有或没有交叉β结构结合化合物)。优选地，包括阳性对照，优选LPS。用于LPS的抑制剂是多粘霉素B(Polymyxin B)，处于5μg ml-1的终浓度。测试的标准富交叉β结构构象的多肽是Aβ、淀粉样γ-球蛋白、糖化蛋白、FP13、热变性OVA、热变性BSA、热变性MSA、热变性溶菌酶、以及暴露于心磷脂(cardiolipin)的β2gpi。阴性对照是天然γ-球蛋白、天然白蛋白、天然Hb、新溶解的Aβ或FP13、天然OVA、其他天然蛋白。作为对照，所有蛋白样品在存在或不存在5μg ml-1的多粘霉素B下进行测试，以排除由于推定内毒素污染而观察到的影响。另外，单独的天然蛋白或预暴露于变性佐剂例如LPS、和CpG-ODN、或其他变性化合物或变性条件(例如(Cu2+-氧化)测试免疫原活性。所有上述测试化合物在存在或不存在炎性或免疫原性反应的潜在抑制剂例如IgIV、单克隆抗-交叉β结构抗体的浓度系列下进行测试。添加到血介质混合物中的激活剂、对照、潜在抑制剂的最终体积大约为总体的1/200。更高浓度的激活剂或推定抑制剂通过利用用于预稀释步骤的浓缩RPMI-1640介质来获得(RPMI-1640介质粉末，Gibco，Invitrogen；目录号51800-035)。将血液和介质小心混合并在具有允许CO2进入的盖的CO2孵育器中孵育过夜。在第2天，室温下以1,000*g旋转10分钟之后收集介质。细胞粒状物冷冻储存。将该介质再次在室温下以2,000*g旋转20分钟。利用ELISA分析上清液中免疫反应标记物例如组织坏死因子-α(TNFα)、细胞因子、趋化因子的浓度。例如，在全血暴露于试验化合物之后的TNFα水平通过利用商业可获得TNF-α/TNFSF1A ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA；Human TNF-alpha Quantikine HS PharmPak)进行评价。当构建了阳性和阴性对照以及可靠的滴定曲线时，检测任何溶液相对于用于免疫原性的标记物浓度的交叉β结构加载。此外，测试了免疫反应的推定抑制剂。例如，IgIV和单克隆抗-交叉β抗体在加入到错折叠蛋白溶液中后阻止免疫反应。
包含交叉β结构部分的吞噬(作用)
包含交叉β结构的蛋白、多肽和/或肽以及细胞或细胞颗粒的摄取、和IgIV或其功能等同物的作用利用培养的细胞，优选单核细胞、树突细胞或巨噬细胞或类似细胞例如U937或THP-1细胞在体外进行研究。优选地，包含交叉β结构的分子进行标记，优选用125I或荧光标记，优选FITC，通过接头分子共价连接至该分子，优选ULS(通用键接系统)或类似结合方法进行连接。细胞优选用米帕林或其他荧光标记如罗丹明进行标记。吞噬性细胞在标记的包含交叉β结构的分子存在下进行孵育或者在交叉β结构结合化合物如IgIV或其功能等同物存在或不存在下的细胞进行孵育。孵育之后，由西安在几小时期间，标记分子或细胞的摄取优选利用闪烁计数器(用于125I)或FACS分析(利用荧光探针)或免疫荧光显微镜进行检测。细胞的摄取还在具有细胞可视化染色的光学显微镜下进行计数。
实施例6-20
用于实施例6-20的通用材料和方法
具有交叉β结构的错折叠蛋白的制备
人类IgIV的错折叠
IgIV丙种蛋白(Gammagard)RF(IgIV RF)
IgIV丙种蛋白(天然IgIV)根据用于制备类风湿因子(RF)的抗原的程序进行错折叠。IgIV丙种蛋白在无菌条件下在甘氨酸缓冲液中溶解为1mg/ml(100mM甘氨酸，17mM NaCl pH 8.2)。在65℃加热5分钟并在-80℃储存。
IgIV丙种蛋白(IgIV 65、IgIV 69、IgIV 76等)的热变性
IgIV丙种蛋白在无菌条件下在20mM磷酸钠pH 5.0中溶解至5mg/ml，并以5℃/分钟的温度梯度从25℃至指定温度进行热变性。最终温度为65℃，69℃，76℃，80℃，83℃和86℃。在热变性之后，将蛋白立即在-80℃下储存，并利用如下所述的各种测定分析它们的结构。作为天然对照，在20mM磷酸钠pH5.0中以5mg/ml浓度新溶解的IgIV丙种蛋白在室温下保持10分钟并在-80℃下储存。
IgIV丙种蛋白的HFIP/TFA变性(IgIV HFIP/TFA)
IgIV丙种蛋白在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)和三氟乙酸(TFA)的1:1(v:v)混合物中在无菌条件下溶解至5mg/ml。接着，在室温下在涡旋上充分混合5分钟。在N2气体下蒸发有机溶剂并将干燥过的物料在H2O中溶解至1mg/ml并在37℃下孵育7天，并保存在-20℃。
IgIV丙种蛋白的酸或碱变性(IgIV ACID，IgIV BASE)
IgIV丙种蛋白在PBS中溶解至5mg/ml并在辊筒装置上室温下孵育10分钟。然后，通过加入一体积的在H2O中的15％ HCl原料将pH降低至pH2(酸变性)或用一体积的在H2O中的5M NaOH原料将pH升高至pH11(碱变性)，并在37℃孵育30分钟。然后，通过分别加入5M NaOH或15％ HCl将pH调节至其初始、生理值，并保存在-80℃。
Octagam IgIV的错折叠
使用Octagam IgIV(Octapharma，Brussel，Belgium，批次5024018434，实验12/2006)。IgIV中的内毒素浓度低，即，在50mg/mlOctagam原料中的0.13 E.U./ml，如利用标准化鲎变形细胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL)测定(Cambrex)确定的。IgIV在10mM NaPi缓冲液中(pH8.1)稀释至1、2.5、5、10和20mg/ml并逐步从25℃加热至65℃(0.5℃/分钟)，室温保持1小时40分钟，接着保存在-80℃。可替换地，IgIV在10mM HCl pH 2.0中稀释并在65℃下孵育6小时。该孵育之后，pH用NaOH设定为7.3。
小鼠IgG组合物的酸或碱变性(dmIgG ACID，dmIgG BASE)
小鼠IgG(mγ-球蛋白，来自cohn组分II、III，大约99％，Sigma，批次090k7680)在PBS中溶解至1mg/ml并在辊筒装置上室温下孵育20分钟。IgG根据以上对于IgIV ACID和IgIV BASE所述的方法进行错折叠。错折叠的mγ-球蛋白称为dmIgG或dmγ-球蛋白。
小鼠IgG通过热的错折叠(dmIgG85℃)
小鼠IgG组合物在PBS中溶解至1mg/ml并在辊筒装置上室温下孵育20分钟。然后，以5℃/分钟幅度从25℃加热至85℃，接着保存在-80℃。
人类IgG组合物的错折叠
人类IgG(γ-球蛋白，Sigma，G4386)在HEPES缓冲液(20mMHEPES，137mM NaCl，4mM KCl，3mM CaCl2)中溶解至5mg/ml。然后通过加入一体积5M NaOH原料升高pH并在37℃保持40分钟。然后，加入等量的5M HCl原料以将pH调节至其初始值，并保存在-80℃。通过眼睛观察大的聚集体。
载脂蛋白A-I的酸和热变性
在10mM NH4HCO3和加入至100mM的HCl中的载脂蛋白A-I(ApoA-I，2.15mg/ml，来自人血浆，Sigma，A0722，批次116K1408)，通过在37℃、75℃或100℃加热30分钟进行变性。接着，加入等量的NaOH(100mM终浓度)以将pH变为初始值。
碱和热变性的载脂蛋白A-I
同样，在10mM NH4HCO3和现在加入至100mM的NaOH中的2.15mg/ml载脂蛋白A-I通过在37℃、75℃或100℃加热30分钟进行变性。接着，加入等量的HCl(100mM终浓度)以将pH变为初始值。
热变性的载脂蛋白A-I
在10mM NH4HCO3中的2.15mg/ml载脂蛋白A-I(ApoA-I)原料在75℃或100℃下进行热变性30分钟。
卵清蛋白的热变性(dOVAstd)
卵清蛋白(OVA，来自小鸡卵白，Sigma，A5503 V级，批次07147094)在PBS中溶解至1mg/ml的浓度，并以5℃/分钟的温阶在PCR机中从30℃至85℃加热5个循环。这种错折叠的OVA称为dOVA或dOVA标准(std)。
纤维状淀粉样蛋白β1-42(fAβ42)的制备
冻干合成的人类淀粉样蛋白-β(1-42)肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；NKI Amsterdam，The Netherlands；SEQ-ID9)(Aβ1-42)首先通过在HFIP中以1mM溶解而单体化，并在无菌微量离心管中等分。用氮气除去HFIP，并将肽膜再悬浮在干燥二甲基亚砜(DMSO，Pierce，20684)中至浓度为5mM，在液氮中骤冷并保存在-80℃(单体化Aβ1-42原料)。解冻的在DMSO中的单体化Aβ1-42以终浓度400μg/ml溶解在10mM HCl中，并在37℃孵育24h，接着保存在-80℃。
溶解在PBS中并在t＝0直接在-80℃冷冻的Aβ1-42(Aβ1-42t＝0)
解冻的在DMSO中的单体化Aβ1-42原料溶解在PBS中，过滤消毒(0.22μm)，至浓度为100μM，并保存在-80℃。
溶解在PBS中并在4℃孵育24h的Aβ1-42(Aβ42HBS)
解冻的在DMSO中的单体化Aβ1-42原料在HBS(HEPES缓冲盐水，137mM NaCl，4mM KCl，10mM HEPES，pH 7.3)中溶解至100μM浓度。缓冲液在使用前通过0.22μm注射过滤器进行过滤。样品在制备后保存在-80℃。
纤维状淀粉样蛋白β1-40(fAβ40)的制备
与Aβ1-42一样，制备单体化的合成人类Aβ1-40肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV，NKI Amsterdam，The Netherlands)并保存在-80℃。解冻的在DMSO中的单体化Aβ1-40原料溶解在PBS中，过滤消毒(0.22μm)，至浓度为100μM，并保存在-80℃。
溶解在PBS中并在t＝0直接在-80℃冷冻的Aβ1-40(Aβ1-40t＝0)
解冻的在DMSO中的单体化Aβ1-40溶解在PBS中至浓度为100μM，并直接保存在-80℃。
溶解在10mM HCl中的并在37℃孵育24h的Aβ1-40(Aβ40HCl)
解冻的在DMSO中单体化Aβ1-40在10mM HCl中溶解至浓度为100μM，并在37℃孵育24h。接着，用过量PBS1(140mM NaCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH 7.4。PBS1在使用之前利用0.22μm注射过滤器过滤)中和，并保存在-80℃。
人类血清白蛋白(HSA，Cealb，Sanquin，The Netherlands，批次05C29H120A)的错折叠
以1，2.5，5，10和20mg/ml，pH 2(用一体积从5M HCl原料降低)的HSA在65℃加热6h，接着用一体积5M NaOH原料中和，随后保存在-80℃。
透射电子显微镜(TEM)
TEM照片利用Jeol 1200EX透射电子显微镜(Jeol Ltd.，Tokyo，Japan)在80kV激发电压下收集。对于每个样品，100目铜或镍栅格的聚乙烯醇缩甲醛(formvar)和碳涂布的侧边在5μl液滴的蛋白溶液上定位5分钟。之后，在100μl液滴的PBS上定位2分钟，接着用100μl液滴的蒸馏水孵育3个2分钟。然后用100μl液滴的2％(m/v)甲基纤维素与0.4％乙酸双氧铀(uranyl acetate)pH4对这些栅格染色2分钟。过量液体通过在滤纸上划线栅格的侧边而除去，并且栅格接着在灯下干燥。样品以10K放大进行分析。
刚果红(CR)荧光
刚果红荧光增强是包含与具有交叉β构象的蛋白共有的结构特征的错折叠蛋白的特性。刚果红(CR)(Aldrich Chemical Company，Inc.，Milwaukee，WI，USA，86，095-6)的荧光在590nm发射波长和544nm激发波长下，在黑色96孔板中，在Thermo Fluoroskan Ascent2.5微孔板荧光计(Vantaa，Finland)上一式两份地(in duplo)进行检测。蛋白和肽原料在PBS中的25μM CR中稀释至100μg/ml用于dOVA和IgIV样品，稀释至40μg/ml用于Aβ样品，并在室温孵育5分钟。来自没有CR的缓冲液和蛋白溶液以及来自缓冲液中的CR的背景荧光从相应的用CR孵育的蛋白溶液检测值中减去。用于检测的阳性对照是100μg/ml dOVA(dOVA std)。
硫磺素T(ThT)荧光增强测定
ThT荧光增强是包含与具有交叉β构象的蛋白共有的结构特征的错折叠蛋白的特性。硫磺素T(ThT)(Sigma，St.Louis，MO，USA，T-3516)的荧光类似于对于CR所述的程序进行检测。现在的发射波长为485nm而激发波长为435nm。蛋白和肽原料在50mM甘氨酸缓冲液pH9.0中的25μM ThT中进行稀释。
8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)荧光测定
ANS荧光在结合至疏水氨基-酰基残基丛时得到增强。在结合至蛋白的溶剂暴露的疏水区时，当在380nm波长激发(λEX)时，发射波长(λEM)从514nm转移到460nm，伴随荧光强度显著增强。ANS(Sigma，A1028)的荧光在发射波长460nm和激发波长380nm处检测。各种试验蛋白和肽原料溶液溶解在PBS中的40μM ANS中并在室温下孵育5分钟。来自没有ANS的缓冲液和背景荧光以及缓冲液中的ANS的荧光从相应的用ANS孵育的蛋白溶液检测值中减去。用于检测的阳性对照是100μg/ml dOVA(dOVA std)。
4，4’-二苯胺基-1，1’-二萘基-5，5’-二磺酸二钾盐(Bis-ANS)荧光增强测定
类似于CR、ThT和ANS，检测了Bis-ANS(Sigma)荧光增强。发射波长为485nm而激发波长为435nm。蛋白和肽原料在PBS中的25μM Bis-ANS中稀释。
硫磺素S(ThS)荧光增强测定
ThS荧光增强是包含与具有交叉β构象的蛋白共有的结构特征的错折叠蛋白的特性。硫磺素S(ThS)(Sigma，033k1076)的荧光根据对于CR和ThT所述的程序进行检测。发射波长为542nm而激发波长为435nm。蛋白和肽原料在PBS中的25μM ThS中进行稀释。
固有色氨酸荧光测定
固有色氨酸(Trp)荧光检测在283nm激发波长处，在黑色96孔板中，用100μl样品，使用Softmax pro v5.01软件在GeminiSpectramax XPS(Molecular Devices)上进行。发射光谱在360-850nm范围室温下收集。相比于其错折叠对应物，天然折叠蛋白显示增加或降低的荧光。Trp荧光强度的绝对值不是非常具有信息性的。然而，幅度上的变化用作用于监测蛋白折叠的干扰的探测参数。荧光发射波长的偏移是对于Trp荧光环境中的局部变化的较好指示。暴露Trp残基的溶剂在340-350nm显示最大荧光，而总体隐蔽残基在约330nm显示最大荧光。
tPA/血纤蛋白溶解酶原激活测定
在两种丝氨酸蛋白酶暴露于错折叠蛋白后tPA/血纤蛋白溶解酶原活性的增强利用标准生色测定加以确定(参见例如专利申请WO2006101387第[0195]段，以及Kranenburg et al.，2002，Curr.Biology 12(22)，pp.1833)。tPA和血纤蛋白溶解酶原在交叉β路径中起作用(参见表4)。交叉β结合蛋白酶活性的增强是对于包含交叉β结构的错折叠蛋白存在的一个量度。
结合错折叠蛋白的重组纤连蛋白指状结构域
对于重组人类纤连蛋白指状结构域4-5(Fn F4-5)的克隆、表达和纯化的描述，现在利用C-末端FLAG标签和His标签，参见专利申请WO2006101387(第[0137]-[0165]和[0192-0194]段)。人类中胚肾细胞中的蛋白表达和纯化在ABC-表达设备(University ofUtrecht，The Netherlands)的辅助下进行。纯化的Fn F4-5在含5％甘油的PBS中为288μg/ml保存在-80℃。
tPA和纤连蛋白指状4-5ELISA
为了分析Fn F4-5和tPA与各种人类血浆ApoA-I制剂的结合，如上所述应用标准ELISA。为了分析tPA结合，10mM ε-氨基己酸包括在结合缓冲液(PBS/0.1％ Tween 20)中。Fn F4-5FLAG-His的结合利用抗-FLAG抗体(小鼠抗体，M2，过氧化物酶结合物，Sigma，A-8592)加以确定。
结果
dOVA标准的TEM分析
在指定测定中用作标准错折叠蛋白的热变性卵清蛋白(dOVAstd.)的TEM分析表明，错折叠蛋白聚集成非纤维状多聚体(未示出)。对于如上所述的所有荧光增强测定，以及对于tPA/血纤蛋白溶解酶原活性测定，已经鉴定了分别产生最大荧光增强或最大tPA/血纤蛋白溶解酶原激活的dOVA std.浓度。对于荧光增强测定，该浓度已经设定为100μg/ml。对于tPA/血纤蛋白溶解酶原激活测定，40μg/ml dOVA std.用作参照。当恰当时，由dOVA std.诱导的荧光增强和tPA/血纤蛋白溶解酶原激活已经任意设定为100％用于比较目的。
糖化BSA和Hb的TEM分析
图6举例说明了BSA和血红细胞通过糖化的错折叠诱导非纤维状无定形聚集体。
IgIV Octagram
图7示出了Octagram IgIV的变性诱导交叉β结构。可以看出各种错折叠条件饬具有不同TEM和硫磺素T特征的错折叠蛋白。没有观察到原纤维。推断错折叠期间在相对较高IgIV浓度下，IgIV分子装配体的尺寸增加。这与ThT荧光不相关。
IgIV丙种蛋白
相比于天然IgIV，利用各种错折叠IgIV丙种蛋白样品观察到增强的硫磺素T、刚果红、ANS、Bis-ANS和硫磺素S的荧光(图8A-E)。一般地，观察到利用各种荧光染料的荧光增加与变性期间温度的增加成比例(图8F)。当相比于天然IgIV丙种蛋白时，对于碱和酸变性的IgIV丙种蛋白也观察到增加的荧光。可以看出，用于制备用于IgG中的RF的表位的条件在交叉β标记物中引入了相对较小的增加。对于hIgG-BASE-37℃、ThT、CR和Trp，检测了荧光。相比于天然IgIV以及相比于在可替换处理后错折叠的IgG，ThT荧光增加适中，但CR和Trp中的增加高。
以10K放大的TEM照片表明，天然IgIV丙种蛋白几乎没有包含任何harbours聚集体，而存在的聚集体是无定形的和小尺寸的(图9)。当变性温度增高时，聚集尺寸和聚集体丰度增大。TEM照片上的酸变性IgIV病症蛋白的外观与在76℃温度热变性的IgIV丙种蛋白具有最多的相似之处。碱变性的IgIV丙种蛋白表现出平均尺寸500nm的无定形聚集体(图9J)。错折叠IgIV HFIP/TFA和碱变性的人类γ-球蛋白表现为具有与对IgIV BASE看到的类似特征的聚集体(图9K，9L)。然而，相比于IgIV BASE，聚集体的数量更高并且多聚体装配体的平均尺寸稍稍更大。特别是在碱变性γ-球蛋白(hIgG-BASE-37℃)情况下，当相比于IgIV BASE时，多聚体的平均尺寸为约两倍。IgIV RF表现为较小密度和疏松装配体(图9B)。
考察了IgIV丙种蛋白的错折叠制剂在tPA介导的纤溶酶产生测定中激活tPA/血纤蛋白溶解酶原的潜力(图9M)。利用天然IgIV丙种蛋白没有观察到tPA/血纤蛋白溶解酶原激活。基于各种变性IgIV丙种蛋白制剂的tPA/血纤蛋白溶解酶原激活潜力，可氛围三类，即中等激活剂(IgIV RF，IgIV 65，IgIV 69和IgIV BASE)、有效激活剂(IgIV 76，IgIV 80，IgIV 83和IgIV 86)以及非常有效激活剂(IgIVACID和IgIV HFIP/TFA)。IgIV结构中的显著差异在错折叠温度从69℃增加到76℃时注意到。TEM照片显示出在69℃，形成一些密实聚集体(图9D)，而在76℃，观察到当错折叠温度进一步升高时尺寸增大的相对较大和非常密实的装配体(图9E-H)。当将69℃和76℃的错折叠进行比较时，IgIV装配体尺寸增大并伴随tPA/血纤蛋白溶解酶原激活的增加(图9M)。
Aβ制剂
各种Aβ42和Aβ40制剂表现出增强的ThT、CR和ANS荧光水平(图10)。Aβ42HCl和Aβ40PBS1在TEM照片上表现为纤维状聚集体(图11C、F)。Aβ40t＝0、Aβ42t＝0、Aβ40HCl和Aβ42HBS表现为无定形聚集体(图11A、B、D、E)。显著地，当相比于Aβ40HCl和Aβ40t＝0时，Aβ40PBS1原纤维获得类似的ThT荧光水平，而Aβ42HCl显著增加ThT和CR荧光。
人类血清白蛋白
如在图12A中看到的，浓度为20mg/ml的变性HSA显著增强ThT荧光，而在其他浓度下没有过观察到相比于天然HSA的增加。通过天然HSA或在1mg/ml下变性HSA的TEM分析没有过观察到聚集体(图12B、C)。无定形聚集体(尺寸大约为500nm)在2.5、5和10mg/ml的变性HSA中观察到(图12D-F)。聚集体尺寸和聚集体相对数量当HSA在以20mg/ml变性时更大程度地增加(图12G)。
小鼠IgG
相比于天然小鼠IgG，ThT和CR增强的荧光在利用各种方法错折叠的小鼠IgG制剂的情况下观察到(图13)。硫磺素T和刚果红荧光以下顺序增强：
ThT：天然IgG<IgG BASE<IgG ACID≈IgG 85℃
刚果红：天然IgG<<IgG BASE<IgG ACID<IgG 85℃。
相比于IgG 85℃，对于在IgG碱和IgG酸之间的ThT信号差异比刚果红荧光信号的更显著。推断所有三种错折叠方法导致IgG错折叠，伴随交叉β结构的形成。
载脂蛋白A-I
当与天然ApoA-I相比时，用100mM NaOH在缓冲液中100℃热变性ApoA-I，导致ThT荧光信号以及CR荧光信号的稍稍降低(图14A和B)。观察到的ThT和CR荧光降低不是由于如通过A280nm检测的蛋白损失(图14C)。图14B示出了，利用100mM NaOH(高pH)在缓冲液中37℃热变性的ApoA-I的CR荧光相比于天然ApoA-I稍稍增加。尽管在ThT或CR荧光强度上没有观察到清楚可见的差异，但是在错折叠ApoA-I制剂在tPA介导的血纤蛋白溶解酶原激活测定中激活tPA/血纤蛋白溶解酶原的潜力方面观察到显著差异。加热至37℃或75℃的ApoA-I制剂是相对适中至有效的tPA/血纤蛋白溶解酶原激活剂。在图14E和F中，显示了用于确定在各种人类血浆ApoA-I制剂中存在交叉β结构和/或交叉β诱导的构象的ELISA研究的结果。天然ApoA-I和具有加入到天然ApoA-I原料中的100mM NaOH接着加热至37℃、或75℃或100℃30分钟的ApoA-I在这些研究者整合。Fn F4-5的半最大值结合以110μg/ml(天然ApoA-I)，73μg/ml(75℃-错折叠ApoA-I)，48μg/ml(100℃-错折叠ApoA-I)以及5.2μg/ml(HbAGE)达到。对于37℃-错折叠ApoA-I，没有计算饱和结合。这些附图和曲线表明，在ApoA-I错折叠之后，用于Fn F4-5结合的亲和力对于在75℃或100℃错折叠的ApoA-I增加，伴随结合部位总数的增加(Bmax)。另外，tPA与ApoA-I制剂的结合增加。相比于错折叠ApoA-I制剂，用于tPA的结合部位的最高数量存在于天然ApoA-I上。tPA真的很难结合于在高pH加热至100℃的ApoA-I(没有检测到饱和结合)。对于天然ApoA-I，37℃-错折叠ApoA-I、75℃-错折叠ApoA-I和HbAGE，分别在4.3、3.1、1.6和3.5nM的tPA浓度实现半最大值结合，表明在碱性条件下在37℃或75℃的错折叠导致tPA以更高亲和力相互作用的tPA结合部位暴露(相比于天然ApoA-I)。tPA以相对较高亲和力结合天然ApoA-I的观察结果(具有如利用HbAGE观察到的相当的测量值)表明，具有交叉β结构和/或交叉β诱导的构象的分子在天然ApoA-I中已经存在。这个发现通过天然ApoA-I显出出增强的刚果红荧光和硫磺素T荧光的观察结果得到进一步证实。
用于实施例的样品中的内毒素水平
用于在实施例6-20中所述实验的各种溶液中的内毒素水平利用鲎变形细胞溶解物(LAL)试剂盒(Cambrex，QCL-1000)确定。该试剂盒根据制造商方案使用，只是现在利用所述测定体积的一半进行检测。作为参照，载脂蛋白(LPS，Sigma，2.5mg/ml L-2630克隆体011:B4)整合到多个检测中。利用LPS标准曲线获得的信号，内毒素含量(质量/体积)的估值利用位置样品获得的内毒素单位(EU)进行计算。在表6中，对于原溶液提供了内毒素水平(EU)。
实施例6
“交叉富集”：趋向对交叉β蛋白“A”增加亲和力的人类IgIV的富集也导致富集了对交叉β蛋白“B”、“C”、“D”、......具有增加亲和力的IgIV
我们之前已经证实了，在BSA-AGE基质上富集的OctagamIgIV也对其他错折叠蛋白如Aβ40、Hb-AGE和dOVA具有增加的亲和力(参见实施例4)。现在，我们通过在Aβ40/Aβ42原纤维-基质、BSA-AGE-基质、dIgIV-基质或dHSA-基质上富集IgIV并测试富集的IgIV与各种错折叠交叉β蛋白的结合。错折叠蛋白固定至NHS-琼脂糖。具有从每种亲和基质洗脱的IgIV的富集因子在其他方面确定在ELISA中与Aβ40/Aβ42原纤维、Aβ聚集体、HSA、dHSA、BSA-AGE、dOVA、mγ-球蛋白和dmγ-球蛋白的结合。
材料和方法
在1、2.5、5、10或20mg/ml的HSA(Cealb，Sanquin，TheNetherlands，批次05C29H120A)和IgIV(Octagam，Octapharma，批次50244018432)在固定到NHS-琼脂糖(GE-Healthcare)之前进行错折叠。HSA通过在65℃加热6h在pH2(HCl)下进行错折叠接着用NaOH中和。IgIV在10mM NaPi缓冲液(pH 8.1)中通过步进加热(0.5℃/min)从25℃加热至65℃而进行错折叠。NHS-琼脂糖在使用之前在Amicon过滤杯(Millipore，UFC30SV00)中用1mMHCl清洗12次。为了固定目的，5个错折叠HSA制剂或IgIV制剂混合(1:2.5:5:10:20mg/ml，以5:4:3:2:1(V:V:V:V:V)的比例混合)并在固定缓冲液(0.5M NaCl；0.2M NaHCO3)中稀释3x。BSA-AGE(10.25mg/ml)和Aβ40/Aβ42原纤维(0.28mg/ml)类似地固定。原纤维如在材料部分所述进行制备。简而言之，Aβ40在37℃孵育186h，而Aβ42在HCl中孵育24h。这些原纤维在固定缓冲液中1:1混合。基质在固定缓冲液中孵育过夜并用0.1M Tris pH 8.5封闭。基质用0.1M Tris pH 8.5清洗3x并用NaOAc 0.1M、0.5M NaCl清洗3x。这些清洗步骤重复4次。
基质用Octagam IgIV(50mg/ml)孵育4h或过夜。收集IgIV流出物(flowthrough)(“FT”)并将基质在洗提(2x1h，在1.140MNaCl，10mM HEPES，45mM CaCl2，0.005％ Tween 20，pH 7.4中；“洗出液”)之前用HBS(HEPES-缓冲盐水，140mM NaCl，10mMHEPES，45mM CaCl2，0.005％ Tween 20，pH 7.4)清洗12次。洗出液在进一步分析之前透析HBS。
FT和洗出液利用ELISA：Aβ40/Aβ42原纤维、β40/Aβ42非纤维状聚集体、HSA、HSA、SA-AGE、nOVA和dOVA检测对各种固定蛋白的结合。4中不同的Aβ40/Aβ42非纤维状聚集体如在材料部分所述进行制备并以400μg/ml的浓度1:1:1:1混合。简而言之，Aβ40溶解在PBS1中并直接在-80℃下冷冻，Aβ40在HCl溶液中孵育24h，Aβ42溶解在PBS1中并直接在-80℃下冷冻，并且Aβ42溶解在HBS中并在37℃下孵育24h。富集因子如实施例4中所述进行计算。FT和洗出液中的蛋白质浓度利用BCA测定试剂盒(Pierce，cat nr.23223)以及利用用于标准曲线的Octagam IgIV加以确定。
结果
图15示出了利用错折叠交叉β蛋白-亲和基质的IgIV富集实验的典型结果。对于利用具有错折叠蛋白X和固定蛋白Y、Z、...的基质富集的IgIV的可替换组合获得了相似数据，如下所述以及如表7作概括的。在举例性实例中，描述了利用Aβ原纤维-亲和基质选择的亲和区结合至各种其他具有不同氨基酸序列和序列长度的错折叠蛋白，例如BSA-AGE(图15)。另外，相比于起始原料(OctagamIgIV)，在BSA-AGE-基质上富集的IgIV对于结合Aβ40/Aβ42原纤维具有大约6的富集因子。在两个相似实验中，对于BSA-AGE基质富集的IgIV与Aβ40/Aβ42原纤维的结合，我们获得了甚至更高的富集因子(25和53)。在Aβ40/Aβ42原纤维-基质上富集的IgIV对于结合Aβ40/Aβ42原纤维具有的富集因子为3。相比于利用Aβ40/Aβ42原纤维基质观察到的富集，利用BSA-AGE基质，IgIV更有效地富集用于结合Aβ40/Aβ42。
对于结合BSA-AGE的富集因子对于在BSA-AGE琼脂糖上富集的IgIV平均最高。对于在Aβ40/Aβ42原纤维基质上富集的IgIV与BSA-AGE的结合的富集因子大约为5，如在三个独立实验中确定的(图15)。BSA-AGE琼脂糖的IgIV洗出液还富集用于结合dOVA(富集因子为3)。在相似实验中，dIgIV-琼脂糖和Aβ40/Aβ42原纤维-琼脂糖的IgIV洗出液也富集用于结合dOVA(富集因子分别为1.5和6)。该后一个富集因子在三个连续研究之一中没有观察到。对于结合至nOVA没有观察到富集，表明利用该富集程序获得的IgIV亚种群特异性地结合至蛋白的错折叠对应部分(counterpart)。
确定了对于另外的错折叠蛋白的富集因子。Octagam IgIV起始原料的浓度系列很难结合至固定的HSA、mγ-球蛋白和dmγ-球蛋白。Octagam IgIV对dHSA增加的结合在相比于对HSA结合时观察到。对Aβ40/Aβ42错折叠非纤维状聚集体的结合对于在Aβ40/Aβ42原纤维基质和BSA-AGE琼脂糖(富集因子为约10)上富集的IgIV是最大增强的。BSA-AGE琼脂糖的IgIV洗出液富集用于结合至错折叠小鼠γ-球蛋白(dmγ-球蛋白)。
综合起来，我们已经证实了，在包含错折叠交叉β蛋白“A”的亲和基质上富集的Octagam IgIV也被富集用于结合至错折叠交叉β蛋白“B”、“C”等。利用包含Aβ40/Aβ42原纤维或BSA-AGE的亲和基质，获得了对错折叠交叉β蛋白具有最光谱特异性的富集IgIV，表示为相对最高的富集因子(表7)。最感兴趣的是，对于亲和基质的制备，在研究中合并了三种非纤维状错折叠交叉β蛋白，即BSA-AGE、dHSA和dIgIV(参见在用于TEM照片的通用材料和方法部分中的附图6、7、12)。
基于本文描述的结果，提供了一种程序(步骤)以从亲和区的组合物中选取特异性结合包含交叉β结构的错折叠蛋白的亲和区，这特别有利于某些疾病的病理学(也参见图26)。为此，在一个实施方式中，对能够特异性地结合错折叠蛋白的亲和区具有亲和力的两种单独的交叉β-基质的组合连续应用。如下文更详细描述的，在两种可能顺序的任一种中，使用基质I来选择能够特异性地与任何交叉β结构和/或包含非天然3-D-结构的错折叠蛋白和/或交叉β结构和/或淀粉样蛋白，即错折叠体(Misfoldome)，以及具有一种或多种所选的有助于感兴趣疾病的病理学的错折叠蛋白的基质II，对于这些疾病，治疗性亲和区是指用于治疗目的，永固选择能够特异性地结合疾病相关错折叠蛋白的那些亲和区。当基质以顺序I→II应用时，使用包含广泛可能的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象、和/或完全错折叠体的代表(包含或不包含有助于靶蛋白错折叠疾病的病理学的那些错折叠蛋白)的外观的蛋白质任何组合来制备亲和基质I。当基质以顺序II→I应用时，使用包含广泛可能的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象、和/或完全错折叠体的代表(不包含有助于靶蛋白错折叠疾病的病理学的那些错折叠蛋白)的外观的蛋白质组合，其暗示用于设计亲和基质II。当然，技术人员能够设计可替换的实施方式。
实施例7
利用具有各种错折叠交叉β蛋白的亲和基质，特异性且饱和富集对错折叠交叉β蛋白具有亲和力的IgIV
在实施例4中，HbAGE基质用于从Octagam IgIV分离对错折叠交叉β蛋白具有亲和力的免疫球蛋白(Ig)的亚种群。我们测试了富集的Octagam IgIV和减少(deplete)的残余物(称为“流出物”(FT))对于结合至各种交叉β蛋白的结合。我们观察到，从该亲和基质洗脱的IgIV真正被富集用于结合HbAGE(富集因子为600)，并且FT对于结合HbAGE(富集因子为0.5，或可替换地：缺失因子(depletion factor)为2.0)而缺失。为了检测IgIV是否在错折叠交叉β蛋白-琼脂糖上对于错折叠交叉β蛋白具有特异性亲和力(在该实施例中高于HbAGE)的Ig分子亚种群而不是对于基质被特异性富集，在当前实验中，在用BSA-AGE基质孵育IgIV之后的FT再次与BSA-AGE基质的一个新的部分接触，这在3个连续步骤中重复。如果IgIV与BSA-AGE基质的结合不是特异性的，则IgIV在每一个连续步骤中没有饱和情况下缺失，最终以在FT中不再有Ig结束。如果结合是特异性的，则在用新的量的BSA-AGE基质孵育FT后将获得越来越少的富集IgIV。
材料和方法
10ml的NHS-琼脂糖基质在BSA-AGE涂布之前用10ml 1mMHCl清洗12x。通过加入2.5ml固定化溶液(5.1mg/ml BSA-AGE，0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)，接着用0.1M Tris pH 8.5封闭4h而在4℃的辊筒装置上进行涂布过夜。为了去除未涂布蛋白，实施多个清洗步骤，用0.1M Tris pH 8.5清洗3x，接着用酸性缓冲液(0.1M乙酸酯(盐)，0.5M NaCl，pH 4.2)清洗3x。这些清洗步骤重复4次。珠子保存在补充有0.1％叠氮化钠的HBS中。在Octagam(装料5024018434)结合之前，该基质用HBS清洗6x以去除叠氮化物。对2200μl珠子部分，加入1100μl Octagam IgIV(50mg/ml)。珠子用Octagam孵育1h并且收集FT组分(FT1)。保留200μl的这种FT并将剩余体积用于BSA-AGE基质的新的部分。亲和基质的量调整为FT的剩余体积，新基质的量现在为1800μl。基质在离心以收集第二个FT组分(FT2)之前，用FT1再孵育1h。这重复4次，导致4个FT组分(FT1-Ft4)。清洗所有用连续FT孵育的基质样品并将结合的Ig在用高盐(high salt)(1.14M NaCl，10mM HEPES，4.5mM CaCl2，0.005％ Tween 20，pH 7.4)孵育后两次洗提1h，获得4个洗提组分(E1-E4)。
同样，Aβ和dOVA以如上所述的相同方式结合于NHS-琼脂糖基质。具有Dutch类型突变E22Q的Aβ1-40在PBS中溶解至1mg/ml的浓度，并在室温下在辊筒装置上孵育2h，同时用铝箔防止光。Aβ1-40 E22Q在固定溶液中用浓度为0.66mg/ml的基质孵育。对于制备dOVA-琼脂糖亲和基质，乱清蛋白在浓度为5mg/ml的PBS中在100℃变性1h，并以3.5mg/ml浓度固定在固定缓冲液中的NHS-琼脂糖上固定。硫磺素T和刚果红检测值确认了在100℃加热后的错折叠dOVA样品中形成交叉β结构。4种FT组分和4中洗出液的富集因子在如之前(实施例4)描述的ELISA中确定。固定的错折叠交叉β蛋白是dOVA、Hb-AGE、BSA-AGE和Aβ40。
结果与讨论
广泛葡萄糖-6-磷酸酯-糖化牛血清白蛋白(错折叠交叉βBSA-aGE)固定至NHS-琼脂糖导致对于捕获来自Octagam的BSA-AGE结合IgIV的有效亲和基质(图16A和B)。证实了OctagamIgIV的组分特异性地结合至BSA-AGE琼脂糖。FT1对于对BSA-AGE(富集因子为0.15)具有亲和力的Ig分子缺失高达85％。这个数值在后续组分FT2-4中从94.6％(富集因子为0.054)增加至95％(富集因子为0.050)和96.2％(富集因子为0.038)。这些数据表明，IgIV对于对BSA-AGE具有亲和力的分子的有效缺失在IgIV与BSA-AGE琼脂糖第一次接触之后实现。为了进一步检测Ig分子是否特异性地结合至基质上的BSA-AGE，在ELISA中测试了洗出液(E1-4)对BSA-AGE的结合，并确定了富集因子。如预期的，E1表现出对结合BSA-AGE最高的亲和力。在其中后续的FT载体接触BSA-AGE基质的后续结合步骤中，富集因子从E1的41.3降低至E2的13.7，以及E3的11.8降低至E4的8.7。这清楚地表明，在对BSA-AGE具有亲和力的FT中的Ig分子的量在第一次与亲和基质接触之后已将显著减少。这在其中FT组分6次应用到新的亲和基质的类似实验中甚至更明显。在该实验中，FT的富集因子低至0.031，因此基本上没有保留BSA-AGE结合性能(未示出)。在洗出液E1-4中IgIV的绝对量和相对量分别为89μg(0.16％)、36μg(0.23％)、18μg(0.28％)和17μg(0.53％)。
而且确定了BSA-AGE富集的IgIV的结合性能以及伴随的对Aβ40、dOVA和HbAGE的流出物。FT组分对与Aβ40或与dOVA的结合都没有缺失，即富集因子保持为1(图16C、E)。不希望受限于理论，对于这个观察结果的可能解释是在仅用BSA-AGE基质富集后，选择的那些亲和区包含宽范围的对BSA-AGE以及对Aβ40h和dOVA的亲和力。明显地，许多对Aβ40或dOVA具有相对较高亲和力但对BSA-AGE具有较低亲和力的Ig分子保留在FT组分中，说明了最适度的缺失。然而，图16C和D示出了，在IgIV与BSA-AGE琼脂糖接触后洗出液仍然富集对Aβ40具有亲和力的Ig分子，尽管是基于对BSA-AGE的亲和力加以选择的。对于dOVA，利用E1观察到1.8的富集因子(图16E和F)。对于后续的洗出液富集因子较低，但与连续洗出液中的对BSA-AGE结合降低的富集因子不成比例(不平行)。明显地，对BSA-AGE以及dOVA具有双重亲和力的Octagam IgIV中的Ig分子组分相对较小，由此利用BSA-AGE基质的富集仅导致少量对结合至dOVA的富集。FT组分和洗出液组分与HbAGE的结合遵循如利用与BSA-AGE的结合观察到类似分布，表明了两种错折叠交叉β蛋白上的重叠表位(图16G和16H)。在连续FT组分中，结合HbAGE的Ig分子的组分显著减少。平行地，当相比于连续洗出液时，对于结合BSA-AGE基质富集的IgIV洗出液的富集因子减小。
总之，这些实验表明，利用BSA-AGE亲和基质，Octagam IgIV不仅对结合BSA-AGE富集，而且对结合其他错折叠交叉β蛋白如Aβ40、HbAGE和dOVA也富集。这证实了，错折叠非纤维状交叉βBSA-AGE包含同样在其他三种错折叠交叉β蛋白中暴露的表位。看起来，IgIV包含对BSA-AGE具有亲和力的亲和区的一个组分，其不具有带有对Aβ40或dOVA具有亲和力的Ig分子亚种群的大的重叠。
利用不最理想量的交叉β蛋白琼脂糖的一个优点在于，在第一次孵育中，仅选择了具有相对较高亲和力的亲和区。这对于其中应当仅使用高亲和区的目的是一个优势。
在后续类似实验中，Aβ40-琼脂糖和dOVA琼脂糖用于FT的6个连续孵育(未示出)。利用Aβ40基质，FT对于与BSA-AGE的结合缺失，例如在6轮的连续FT组分与新的量的Aβ40基质结合之后，“富集”因子为0.45。在用Aβ40基质孵育后FT与dOVA的结合受影响较小，在6个结合步骤之后“富集”因子为0.83。Aβ40-基质的洗出液对结合BSA-AGE富集，其中富集因子为17、4、5、3、8和4。这些洗出液一点也不结合至dOVA。这表明，结合至Aβ40的IgIV中的亲和区亚种群与结合至BSA-AGE的Ig分子亚种群重叠，但不与结合至dOVA的Ig分子亚种群重叠。
利用dOVA琼脂糖，Octagam IgIV对结合至dOVA的缺失利用施加比例的亲和基质和IgIV已经是不最理想的(83％)，即，利用dOVA基质连续孵育FT没有实现进一步减少FT与dOVA的结合。对于FT组分与BSA-AGE或Aβ40的结合的富集因子(实际上以“缺失”因子读出)没有受影响，并对BSA-AGE保持为约0.8而对Aβ40保持为1。然而，洗出液对结合至BSA-AGE和Aβ40富集(乳剂因子分别为5和14)。富集因子在利用连续FT的连续结合步骤期间获得的洗出液中没有减小。
同样，这些实验表明，利用具有错折叠交叉β蛋白“A”的亲和基质富集的IgIV也对结合错折叠交叉β蛋白“B”富集。这些实验还表明，利用所使用的实验设置，结合Aβ-琼脂糖的Octagam IgIV中的IgIV分子亚种群不与结合dOVA的Octagam IgIV中的亲和区亚种群重叠。对于BSA-AGE琼脂糖，洗出液E1-6中的富集IgIV的绝对量和相对量分别为31.5μg(0.084％)、11.2(0.062)、9.5(0.098)、7，2(0.16)、4.1(0.145)和0.27μg(0.032％)。对于Aβ40，这些数值分别为33.9(0.09)、29.4(0.17)、11.2(0.11)、9.45(0.21)、9.8(0.35)和3.8μg(0.22％)。对于dOVA基质，这些数值分别为27.6(0.07)、22.4(0.07)、21.8(0.12)、17.1(0.15)、11.5(0.13)和2.8μg(0.06％)。
这些结果还表明，对错折叠交叉β蛋白具有特异性的亲和区是利用具有固定错折叠交叉β蛋白的亲和基质特异性地选择的。一定量的IgIV的缺失是饱和的，也就是说，IgIV从对错折叠蛋白具有特异性的亚种群的缺失是通过利用错折叠蛋白基质实现的。
尽管BSA、Aβ40和OVA缺少序列同源性，并且在它们的天然状态下缺少3D结构同源性，但是BSA-AGE、HbAGE、Aβ40和dOVA共享存在的具有交叉β构象的氨基酸链。因此，我们的结果证实了，IgIV包含对各种蛋白(在它们天然形式中缺少3D结构同源性和/或缺少序列同源性)中的交叉β构象或交叉β诱导的构象具有光谱亲和力的亲和区亚种群。此外，利用Aβ-琼脂糖和后续dOVA ELISA的结果表明，交叉β结构看起来具有不同的结构细节，导致不同IgIV亚种群的结合，但相同的交叉β染料，即刚果红、ThT(参见“实施例6-20的通用材料和方法”)。
实施例8
Octagam IgIV和富集的IgIV(通过利用HbAGE-亲和基质获得的)与血纤蛋白、Aβ聚集体和错折叠卵清蛋白的结合
材料&方法
为了测试Octagam IgIV是否包含对血纤蛋白具有亲和力的Ig分子，其中血纤蛋白是包含交叉β结构的聚合物(参见专利申请US2007003552，第[187、188]段)，实施ELISA，其中通过在ELISA板的孔中用凝血酶/因子IIa孵育血纤蛋白溶解酶原原位形成血纤蛋白。另外，为了比较，评价了IgIV与固定的具有交叉β结构的蛋白特性(参见材料部分)的错折叠卵清蛋白(dOVA)的结合和与淀粉样蛋白-β聚集体的结合。
卵清蛋白(Sigma，A5503，V级)以1mg/ml的浓度温和地溶解在PBS中，在37℃下孵育20分钟，基质在辊筒装置上室温下孵育10分钟，并保存在-80℃→称为nOVA。nOVA以5℃min-1从30℃加热至85℃。该步骤重复4次，接着将变性的OVA保存在-80℃→称为dOVA std。对于利用dOVA std的结合研究，涂布5μg/ml dOVAstd。为了分析Octagam IgIV对于固定的Aβ的亲和力，将Aβ40t＝0和Aβ42t＝0原料在结合研究中合并。两种Aβ制剂以5μg/ml涂布。同样HbAGE以5μg/ml涂布并将与这种交叉β蛋白的结合的分析确定为阳性对照。为了测试IgIV和tPA与具有交叉β构象的固定血纤蛋白的结合，应用以下方案以获得具有固定血纤蛋白的96孔ELISA板的孔：
1、从标准因子IIa/凝血酶原料(人类血浆，高活性，Calbiochem，Germany，生产编号605195)制备在H2O中的2U/ml因子IIa原料；
2、从使用之前以16.000*g离心10分钟的原溶液制备在PBS中的50μg/ml血纤蛋白溶解酶原溶液(在20mM柠檬酸钠-HCl pH7.0中的Fib3L 2170L，Kordia，The Netherlands)。
3、将5μl的因子IIa溶液移入孔中，加入100μl的血纤蛋白溶解酶原溶液，或者向对照孔中加入100μl PBS。终浓度：[因子IIa]≈0.1U/ml，[血纤蛋白溶解酶原]≈47.5μg/ml。
4、温和搅拌室温下孵育2h。利用抗-人类血纤蛋白溶解酶原抗体(DAKO-Cytomation，P0455)实施包被对照。
5、用TBS/0.1％ Tween20对空孔清洗两次。TBS：Tris-缓冲盐水，具有150mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH 7.3。
首先，用Aβ、dOVA、血纤蛋白或对照包被缓冲液涂布的孔一式三份地用50μl/孔的IgIV或tPA浓度系列在温和搅拌、室温下覆盖1h。在tPA系列中，结合缓冲液中包含10mM εACA以避免kringle结构域与血纤蛋白暴露的赖氨酸和精氨酸残基结合，并且引导tPA指状结构域与暴露的交叉β结构构象结合。利用fIIa涂布的以浓度系列tPA或IgIV覆盖的对照孔(无血纤蛋白溶解酶原)获得的信号从具有固定血纤蛋白的对应孔减去。对于利用具有交叉β接哦故的固定蛋白获得的所有信号，利用包被缓冲液涂布孔获得的对应信号作为背景减去。
在第二系列的实验中，评价了在用Octagam IgIV孵育HbAGE亲和基质之后获得的富集IgIV与血纤蛋白的结合。
结果&讨论/结论
我们之前确定了，血纤蛋白聚合物表现出对具有淀粉样蛋白性质如交叉β特异性染料刚果红和硫磺素T的结合、以及tPA和血纤蛋白溶解酶原的激活的蛋白回忆的特性。我们还确定了，OctagamIgIV包含显示出对具有交叉β结构的蛋白的亲和力的Ig亚种群。因此，我们解决了ELISA中IgIV是否结合血纤蛋白。在图17中，示出了IgIV实际上结合至阳性对照HbAGE，如较早评价的(参见例如示例性图1)，以及结合至dOVA、Aβ40和Aβ42制剂。对HbAGE的亲和力相对较高，而对后三个错折叠蛋白的亲和力相似且稍微较低。当考虑血纤蛋白时，tPA和IgIV都以饱和方式结合。IgIV与血纤蛋白的半最大结合在200μg/ml(大约1.3μM)获得，并且该值与利用dOVA和Aβ制剂获得的值相当。这些发现表明，OctagamIgIV不仅结合常规使用的包含交叉β结构的蛋白，即HbAGE、dOVA、Aβ，而且结合最近鉴定的血纤蛋白中包含交叉β的分子。
这些结果表明，Octagam IgIV包含对血纤蛋白具有亲和力的Ig亚种群。因此，使用这种亚种群在一些紊乱中是有益的，这些紊乱中通过血纤蛋白结合IgIV与tPA竞争来延长血纤蛋白寿命有助于减少疾病症状或健康问题，或者这些紊乱中，血纤蛋白的受阻形成是有益的，这可通过引入干扰血纤蛋白单体聚合的血纤蛋白结合IgIV而实现。
实施例9
IgIV亲和区与错折叠人类血浆载脂蛋白A-I的结合
背景
膝关节半月板中的淀粉样蛋白是局部淀粉样变性病最常见形式之一并且尤其在老年人中逐渐流行。淀粉样蛋白沉积可导致关节问题，其最终需要进行手术。载脂蛋白A-I(ApoA-I)在膝关节中是可检测的，形成淀粉样蛋白并在许多疾病和健康问题包括关节问题中是复杂的。ApoA-I是高密度脂蛋白的组要蛋白成分。淀粉样蛋白ApoA-I还在动脉粥样硬化斑块和粥样硬化患者的动脉中发现。因此，从(血液)循环或身体其他地方去除错折叠ApoA-I对于患有与淀粉样蛋白ApoA-I相关的疾病的患者来说是有益的。我们测试了亲和区是否能够结合错折叠ApoA-I以及披露的装置和方法是否能够选择对结合至ApoA-I的那些亲和区富集的亲和区。以下显示的结果表明，亲和区实际上识别ApoA-I以及披露的方法和装置适用于分离能够结合ApoA-I的亲和区。ApoA-I这里用作疾病相关蛋白(对其分离了亲和区)的另一个实例。
材料和方法
为了分析在利用用Octagam IgIV孵育的HbAGE琼脂糖选择亲和区之后获得的富集IgIV对于人类血浆ApoA-I的结合性能，利用固定ApoA-I制剂实施直接ELISA。对于这些研究，合并天然ApoA-I，并将在100mM NaOH中ApoA-I在37℃、或75℃、100℃加热30分钟，结合至用5M NaOH将pH调回到生理pH。如在图14中看到的，在对于所选交叉β标记物的相对阳性，即刚果红荧光增强、ThT荧光增、tPA/血纤蛋白溶解酶原的激活、纤连蛋白指状4-5的结合以及tPA的结合中观察到以下顺序：
刚果红：            100℃<天然<37℃<75℃
ThT：               100℃<天然<75℃<37℃
tPA/Plg act.：      背景＝天然<37℃<75℃<<100℃
Fn F4/5结合：       天然＝37℃<75℃<100℃
tPA结合：           背景＝100℃<天然≈37℃≈75℃
根据这些比较，很明显，天然ApoA-I已经带有具有交叉β结构的错折叠蛋白的特性，即其增强刚果红和ThT的荧光，并且其结合tPA。通常，通过在碱性条件下在37℃或75℃下加热获得的ApoA-I制剂作为具有较高含量的交叉β结构的组合物起作用。然而，当单独考虑激活丝氨酸蛋白酶(tPA/血纤蛋白溶解酶原)的潜力时，加热至100℃的ApoA-I明显地被描述为具有最高“生物学活性的”的交叉β含量的组合物。
结果与讨论
在图18中，显示了用于富集IgIV与天然ApoA-I和三种热/碱-错折叠制剂的结合的结合曲线。当考虑富集IgIV时，kD对于ApoA-I75℃、ApoA-I 37℃、天然ApoA-I和ApoA-I 100℃分别是以增序1.3、1.6、2.0和2.8μg/ml。结合部位的数量对于天然ApoA-I和ApA-I75℃是相似的，对于ApoA-I 37℃稍高，而对于ApoA-I 100℃显著更低。根据A280测量结果，推断出四种制剂中的蛋白含量相似。结合部位的最大数量中的差异可以通过包被效力的差异反映。然而，是ApoA-I 100℃暴露最多的用于Fn F4-5的结合部位(图14E)。当将用于4种ApoA-I制剂的富集IgIV的亲和力与Octagam IgIV(从其收集富集IgIV)的亲和力时，通过用Octagam IgIV获得kD除以利用富集IgIV获得的kD计算的富集因子对于天然ApoA-I和ApoA-I 75℃都为4.8，而对于ApoA-I 37℃，富集因子为12.8。对于ApoA-I 100℃，富集因子不能确定，虽然没有检测到OctagamIgIV的结合，以及富集IgIV的最适度结合。然而，对于结合ApoA-I100℃的富集通过如在图18C所示的结合特性反映。
总之，利用用于交叉β标记物的“天然”ApoA-I获得的信号在(富集)IgIV的结合特性中反映，进一步证实了这样的结论，即天然ApoA-I包含交叉β结构，如从制造商购买的。此外，推断出的结论是，刚果红和ThT荧光在与ApoA-I制剂接触之后的相对增强相对于预期的(富集)IgIV结合特性具有预见能力，其中ThT荧光表现出最强的相关性。根据利用富集IgIV和加热至37℃的ApoA-I的ELISA数据，推断出该ApoA-I制剂包含交叉β结构或交叉β结构诱导的蛋白构象，其与用于IgIV富集的HbAGE的蛋白构象具有最相近的类似，和/或用作用于富集IgIV的ApoA-I上的结合部位的最相当数量的暴露交叉β结构表位。总体地，这些数据表明，通过采用恰当交叉β-亲和基质，选择的亲和区结合错折叠ApoA-I。以这种方式，获得一种领先的(主要，lead)治疗性亲和区组合物，用于与存在错折叠ApoA-I相关的疾病或健康问题的治疗方案汇中，例如由膝关节淀粉样变性病引发的疼痛治疗、动脉中淀粉样蛋白沉积的溶解、以及伴随由斑块中ApoA-I淀粉样蛋白积累的动脉粥样硬化的治疗。
实施例10
错折叠IgG分子包含类风湿因子(存在于70-80％的类风湿性关节炎患者中的自身抗体)的靶表位
材料&方法
IgG错折叠和结构分析
我们验证了我们的假设，即人类风湿因子(RF)(一种存在于70-80％的类风湿性关节炎患者中的自身抗体)结合IgG自身抗原中的交叉β或交叉β诱导的蛋白构象。我们认识到这是一种常识，即，对于通过RF(其主要是IgM亚类(尽管IgG和IgA RF也出现))结合大概主要是其靶自身抗原的Fc结构域的IgG检测，在65℃热变性后要求IgG聚集。我们根据在对实施例6-20的通用材料和方法中所描述的程序，将纯化的人类IgG(Octagam IgIV)升温至65℃，并通过刚果红荧光、硫磺素T荧光、ANS荧光以及tPA的结合和激活的分析来分析结构。刚果红和硫磺素T荧光的增强利用稀释至100μg/ml的IgIV溶液来确定。接着，tPA/血纤蛋白溶解酶原活性的增强利用标准生色测定(如在专利申请WO2006101387第[0195]段中描述的)来确定。在10mM ε-氨基己酸存在下，tPA与错折叠IgIV的结合在如本文前面所述的标准ELISA中进行评价，利用固定的Aβ40t＝0作为用于tPA结合的阳性对照。
结果
刚果红和ThT荧光通过变性IgG的增强
刚果红荧光和硫磺素T荧光的增强利用热变性错折叠IgIV进行检测。基于相比于对照IgIV的相对信号，受热IgIV被错折叠，伴随具有交叉β构象的错折叠蛋白产生的标志(图19A、B)。
tPA结合至错折叠IgG
我们观察到，为交叉β途径的一个组分的tPA结合至dIgIV(图19E)。这个观察结果进一步证实了，dIgIV是以交叉β途径的组分识别新引入的结构特征的方式被错折叠的。
通过错折叠IgG的tPA/Plg激活
既然我们观察到tPA与dIgIV的结合，我们测试了dIgIV在tPA/血纤蛋白溶解酶原生色测定中是否激活tPA/血纤蛋白溶解酶原。天然IgIV不诱导tPA-介导的血纤蛋白溶解酶原激活(图19D)。然而，热变性错折叠IgIV样品激活tPA/血纤蛋白溶解酶原，即，在pH 2的缓冲液中在65℃变性的IgIV(未示出)以及在NaPi缓冲液中热变性的IgIV。
讨论
在RF自身抗原的IgG暴露表位中引入具有交叉β结构的错折叠
在65℃加热的人类IgG显示出一系列利用具有交叉β结构的淀粉样错折叠蛋白通常观察到的结构特性。根据之前由其他研究者描述的差异扫描计量检测，采用的温度稍高于诱导构象变化的61℃温度。错折叠IgG增强刚果红荧光和硫磺素T荧光、结合tPA并激活tPA/血纤蛋白溶解酶原。在我们的知识范围内，我们现在首先报告，用于RF的错折叠IgG自身抗原暴露包含令人回想具有交叉β构象的淀粉样蛋白的结构性质的新表位。根据我们的观察，现在解释所报道的事实，即tPA和因子IIa，结合且由包含交叉β结构的蛋白激活的两种丝氨酸蛋白酶的蛋白酶活性在RA患者中增加。
我们的观察结果指出，RF作为对蛋白中的交叉β结构和/或交叉β结构诱导的构象具有特异性的IgG、IgA和IgM类的人类抗体的有用来源。联合我们的观察结果，即IgIV中的Ig分子亚种群结合错折叠IgIV分子(参见表7)和/或结合错折叠小鼠γ-球蛋白(参见实施例19)，我们推断，事实上分离的在对错折叠Ig或错折叠蛋白具有亲和力的IgIV中的亚种群通常令人回想到RF。对错折叠IgG自身抗原具有亲和力的亲和区的两种来源对开发用于治疗与出现出现错折叠IgG相关的疾病或健康问题的基于亲和区的治疗手段(装置)是有益的。
实施例11
各种亲和区制剂中免疫球蛋白亚类和IgG同种型的相对存在的确定
方法
为了确定存在于作为来自HbAGE亲和基质的洗出液获得的富集IgIV中的IgG同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的相对含量，我们利用Nanosep 10k离心装置(Pall life science)浓缩了550μl样品。浓缩的富集IgIV的终浓度为890μg/ml，如通过比较在280nm处的吸收与利用Octagam IgIV在PBS中的稀释液确定的标准曲线而确定的。Ig亚类相对丰度的同种型化和确定利用图像免疫化学比浊计(Beckman Coulter)、用于医学免疫学的实验室(UMC Utrecht，The Netherlands)的标准化方法来确定。为了比较，还分析富集IgIV从其提取的Octagam IgIV的IgG同种型的相对丰度。另外，确定了Ig亚类的外观。除了浓缩的富集IgIV样品外，在PBS中的103μg/ml的未浓缩材料也进行同种型化和亚类确定。根据制造商说明，制备自超过3500个人类供体的Ig组分的Octagam IgIV由IgG(≥95％)构成，具有少量IgA组分(≤0.4％)和痕量≤0.2％的IgM。四种IgG同种型的分布：IgG1，62.6％；IgG2，30.1％；IgG3，6.1％；IgG4，1.2％。根据制造商说明，在IgIv中，≤3％的Ig分子聚集并且超过90％的这些分子是单体和二聚体。
结果&讨论
对于Octagam IgIV，用于IgG亚类确定和同种型化的所有7种检测列于表8中。利用Octagam IgIV，已经证实了，事实上Ig的大部分是IgG亚类，即大约99.5％。四种IgG同种型的分布非常近似于在Octagam IgIV数据表中报道的分布(如在方法部分所述)。利用未浓缩的富集IgIV，该亚类分布由于图像免疫化学比浊计的较低检测限而不能确定。IgG2相对存在的确定由于检测限也受阻。IgG1、IgG3和IgG4的浓度可被确定(表8)。富集IgIV中的总Ig浓度利用BCA蛋白浓度确定技术构建为103μg/ml。利用比浊计，计算了总Ig浓度为108μg/ml。利用浓缩的富集IgIV，可确定对于所有四种IgG同种型的浓度，以及总IgG含量。IgA和IgM水平低于检测限。在富集IgIV组分中，当相比于作为参照的IgG1时，IgG3的相对丰度在相比于Octagam IgIV起始原料(利用HbAGE亲和基质选择了富集IgIV)时大约增加两倍。当相比于IgG1的量时，IgG2和IgG4的相对丰度在富集后很难变化。因此，总之，IgG3亚种群对于HbAGE比其他同种型具有相对更高的亲和力。
基于这样的结果，即所有四种IgG同种型是在富集IgIV组分中确定的，推断出Ig组分由至少四种不同人类抗体的混合物构成。作为在非还原条件下的等电聚焦凝胶上的涂片的富集IgIV的外观也表现出，多于一个单克隆抗体存在于富集IgIV选集中(未示出)。不能构建富集亲和区种群中的IgA和IgM抗体的浓度，而痕量的一种或多种IgA和IgM克隆体的存在基于这些结果也不能推出。
实施例12
IgIV亲和区对由错折叠低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的血小板聚集的影响的分析以及通过采用HbAGE亲和基质从OctagamIgIV获得的富集IgIV与oxLDL的结合的分析
修饰的LDL(例如由于氧化(oxLDL))在灾难性疾病和健康问题例如动脉粥样硬化中起着突出的作用。我们最近证实了，在氧化后，结构特征引入LDL的蛋白部分，即ApoB-100，其令人回想到淀粉样蛋白交叉β构象(参见专利申请WO2003NL00501)。我们现在解决了这样的可能性，即IgIV包含针对人类oxLDL中的交叉β构象或交叉β诱导的构象的亲和区，并且甚至更优选地，在ApoB-100中。对于该研究，使用富集IgIV，其已经通过利用HbAGE琼脂糖从Octagam人类IgIV中提取那些亲和区而获得，这些亲和区特异性地结合固定的错折叠蛋白(参见实施例6、7)。另外，Octagam IgIV包括在这些研究中。
材料和方法
评价了Octagam IgIV对人类血小板通过oxLDL或TRAP(血栓受体激活肽、氨基酸：SFLIRN)的激活的影响。oxLDL通过利用包含FeSO4的缓冲液(详细参见实施例2的材料&方法部分)孵育从人类血液纯化的LDL而制备。56％的氧化程度通过检测二烯含量进行确定。如之前确定的(专利申请WO2003NL00501)，在氧化后，oxLDL增强硫磺素T荧光(数据未示出，例如参见专利申请US2007003552)。血小板聚集以900rpm在37℃下在集合度计中及时跟踪15分钟。270μl体积的血小板悬浮液(200.000/μl)用含有用于在指定浓度分析的样品的30μl溶液进行孵育。用于利用IgIV的抑制实验，将270μl血小板悬液用0.3mg/ml血纤蛋白溶解酶原(血纤蛋白溶解酶原、纤连蛋白和血管假性血友病因子缺失，酶研究实验室，Lafayette，IN，USA)、25μl氧化LDL、天然LDL(nLDL)或TRAP溶液以及5μl具有IgIV的溶液机械能孵育。在利用抑制剂的实验中，oxLDL、nLDL或TRAP在22℃用增加浓度的IgIV孵育10分钟。最大聚集表示为由8μM TRAP诱导的响应的百分数(其任意设定为100％).
缺失IgIV(在IgIV与HbAGE琼脂糖接触后的流出物)和富集IgIV的Octagam IgIV与oxLDL的结合利用ELISA进行评价。作为阳性对照，亲和区制剂的结合利用固定的BSA-AGE进行测试。
结果&讨论
在图20A中，可以看出，Octagam IgIV有效地以剂量依赖性方式抑制oxLDL诱导的血小板激活和聚集。IgIV不影响血小板在用TRAP激活后的聚集。在血小板暴露于天然LDL后观察到的低水平聚集在天然LDL用IgIV浓度系列预孵育时没有发生变化。
在直接ELISA设置中，评价了IgIV亲和区与氧化LDL的结合，并将利用错折叠HbAGE亲和基质富集的IgIV对oxLDL的相对亲和力与缺失IgIV(作为该亲和基质的流出物回收)的亲和力进行比较，以及与Octagam IgIV起始原料(用作用于选择对错折叠交叉β蛋白具有亲和力的亲和区的来源)的亲和力进行比较。结合特性与利用BSA-AGE(另一种错折叠蛋白)获得的那些进行比较。在图20中，示出了结合研究的结果。富集IgIV和起始原料的结合性能的比较结果趋向BSA-AGE和oxLDL，表明利用HbAGE基质的亲和区选择导致富集IgIV对这两种错折叠蛋白的亲和力增大。富集因子趋向糖化白蛋白或oxLDL的结合，计算了表示为利用起始IgIV样品的结合获得的kD值和利用富集IgIV获得kD值之间的比率。对于BSA-AGE，富集因子为45。对于oxLDL，富集因子为27。流出物很难结合至这两种错折叠蛋白，表明IgIV利用HbAGE琼脂糖从对错折叠蛋白具有特异性的亲和区的再次缺失更有效地发生，令人回想到在实施例7中所描述的。
被动给予或通过接种诱导的抗体通常被认为是用于治疗增加量的疾病的良好治疗剂。修饰LDL包括氧化LDL是用于治疗与增加形成和沉积的修饰LDL相关的疾病，主要是动脉粥样硬化的一种候选靶。这些结果证实，所披露的方法恩你刚刚选择亲和区，如人类抗体，其优先结合错折叠蛋白，包含交叉β结构特性，如氧化LDL。这样的抗体优选用于与错折叠蛋白(优选由于修饰如氧化导致的错折叠LDL)形成相关的疾病如动脉粥样硬化的检测且优选治疗中。另外，那些所选亲和区优选用作显示对错折叠蛋白具有亲和力的亲和区的氨基酸序列和3D结构特性的模型分子，用于设计合成的亲和区(参见实施例20)。
在图20E中，示出了IgIV饱和地结合至用于血小板激活的oxLDL。在图20G中，示出了相比于富集IgIV从其选择的OctagamIgIV时，基于它们对错折叠Hb-AGE的亲和力选择的亲和区也以增加的亲和力结合至oxLDL。结合观察到的IgIV对oxLDL诱导的血小板聚集的抑制作用，我们的结果表明，IgIV包含对错折叠ApoB-100具有特异性的亲和区并且这些亲和区能够干扰细胞对错折叠蛋白响应，即，在该实施例12中，血小板在暴露于oxLDL(一种例如与动脉粥样硬化相关的错折叠蛋白)后的聚集。
实施例13
交叉β结合化合物静脉内免疫球蛋白和肝细胞生长因子激活剂指状结构域对小鼠尾巴切除实验中的出血时间的作用
材料&方法
为了分析交叉β结构结合化合物对体内凝血和/或血小板聚集的影响，实施小鼠尾巴切除测试以确定出血时间。对于这种方法，根据由当地动物实验的伦理委员会(Utrecht University，TheNetherlands)批准的方案，使用50只11-13周龄雄性黑色6C57BL/6JOlaHsd小鼠。小鼠在尾部静脉中静脉内(i.v.)地注射100μl缓冲液(PBS，对照组，n＝14)或者具有测试化合物或肝素的缓冲液(阳性对照，已知为延长出血)。在5-20分钟之后，小鼠利用5％异氟烷(诱导)在小室中进行麻醉，接着在实验期间利用面罩使用具有2-2.5％异氟烷的麻醉剂(保持)。将小鼠在它们的尾巴悬在工作台上的情况下保持在温和毯子(37℃)中。利用剪刀切下5mm的尾巴并将血收集在杯子中。记录注射和尾巴切除之间的时间，以及开始出血和停止出血之间的时间。获得出血结束时间点，出血时间持续超过20分钟，其是通过燃烧而闭合伤口主动停止的，并且由于快速出血而达到超过200μl的出血体积。超过20分钟的延长出血和相对过量的出血都任意设定为20分钟的出血时间。作为用于预期延长出血的阳性对照，我们使用了在100μl 0.9％ NaCl中的静脉注射(i.v.)的10 I.E./小鼠肝素(Leo Pharmaceutical ProductsB.V.，5000 IE/ml)(n＝8)。肝细胞生长因子激活剂(HGFA)指状/纤连蛋白I型结构域以4.7mg/ml使用。静脉内注射100μl导致基于估计的出血体积2ml/小鼠的大约234μg/m的终浓度(n＝14)。来自如通过制造商供应的50mg/ml原料的人类静脉内免疫球蛋白(IgIV，Octagam，OctaPharma)以20倍稀释使用(n＝14)。
对于这些研究，使用合成的HGFA指状结构域，其是根据标准程序化学合成的(Dr T.Hackeng，Academic Hospital Maastricht，TheNetherlands；Hackeng，T.et al.(2001)Protein Sci.10，864-870，Hackeng，T.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A94，7845-7850)。对于HGFA，取残基200-240(Swiss-Prot entry Q04756)。HGFA F结构域可结合至具有交叉β结构的错折叠蛋白(例如参见专利申请WO2003NL00501)。
结果
确定了缓冲液处理、HGFA F处理和IgIV处理的小鼠中的14只小鼠，在夹断大约0.5cm尾巴之后从尾巴伤口出血的平均时间(图21)。出血时间随意由5个不同的人记录。用于诱导延长出血时间的阳性对照是剂量为10IE/小鼠的肝素(n＝8)。在对照组中，注射PBS(n＝4)。对于注射PBS的对照小鼠平均出血时间为368秒，而对于注射肝素的对照小鼠为1056秒。HGFA F和IgIV将出血时间延长至平均为706秒和765秒。根据利用两个截尾P值的未成对t试验，注射HGFA F的小鼠和注射IgIV的小鼠的出血时间显著不同于利用注射PBS的小鼠观察到的出血时间(参见图21)。当相比注射PBS的对照组时，P值分别对于HGFA F为0.013而对于IgIV为0.0045。这些观察结果证实了，具有交叉β结构的错折叠蛋白在导致血小板栓(platelet plug)凝结和形成的级联反应中的作用。如我们之前描述的(参见例如专利申请WO2003NL00501)，血纤蛋白聚合需要交叉β结构形成，并且通过tPA和血纤蛋白溶解酶原的血纤蛋白凝块溶解受交叉β结构结合化合物抑制。此外，血小板由具有交叉β结构的错折叠蛋白激活，并且激活的血小板本身暴露交叉β结构。在实施例2和12中，我们证实了IgIV干扰交叉β诱导的血小板聚集。在实施例8中，我们证实了当相比于用于IgIV富集的起始原料时，在HbAGE琼脂糖上富集的IgIV以增加的特异性结合至血纤蛋白。现在在尾巴夹断出血测定中利用HGFA F和IgIV获得的数据表明，这些交叉β结合分析对于基于交叉β结构结合化合物或基于在凝血和血小板激活期间结合至与交叉β结构结合的分子的化合物而开发抗凝血治疗剂是有意义的起点，因而有利于凝血和/或血栓形成。在建议的治疗的一个实施方式中，选择了对带有交叉β结构的蛋白(其有助于凝血和血小板聚集)具有特异性的亲和区，由此将治疗作用更特异性地引向凝血和/或血栓形成的原因的具有交叉β结构的蛋白。
实施例14
利用具有用于错折叠蛋白的亲和区的基质，对从全身性淀粉样变性病患者的蛋白以及RA患者的血清和滑液的分离和鉴定
由于交叉β结构和包含交叉β结构的蛋白有效地结合至根据本发明的IgIV分子集合和/或根据本发明的组合物，所以它们被有效地从样品和/或动物或人类身体分开和/或分离，并接着被鉴定。在利用交叉β亲和基质富集后，IgIV用来分离交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白和/或能够特异性地结合至蛋白中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象的蛋白。能够特异性地结合至蛋白中的交叉β结构和/或交叉β诱导的构象的蛋白通过以下事实鉴定，即当以不饱和方式结合至具有交叉β结构和/或交叉β诱导的构象的蛋白时，富集IgIV的基质结合至具有交叉β结构和/或交叉β诱导的构象的蛋白上的游离结合部位，从而间接地结合至与结合至交叉β结构和/或交叉β诱导的构象的交叉β结构和/或交叉β诱导的构象结合的蛋白。健康个体中交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白和/或能够特异性地结合至蛋白中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象的蛋白的存在和/或鉴定与来自患有与交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白和/或能够特异性地结合至蛋白中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象的蛋白相关和/或有关的疾病或健康问题的个体，例如来自患有原发性AL淀粉样变性病或类风湿性关节炎(RA)的个体的交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白和/或能够特异性地结合至蛋白中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象的蛋白的存在和/或鉴定进行比较。利用亲和区的基质分离的蛋白的鉴定通过质谱分析进行鉴定。来源于健康个体的样品和来源于患者的样品的结果进行比较。此外，利用来自患者或接触富集IgIV的基质的健康个体的样品获得的结果与在相同样品与对照基质(没有固定的亲和区)接触后获得结果进行比较。以这种方式，获得关于在指定疾病状态期间易于错折叠和采纳交叉β结构构象的蛋白的鉴定和/或易感性的信息。这提供了对于开发疾病特异的诊断工具，例如用来监测疾病状态、监测治疗效力、监测疾病发生的关键信息，以及提供了对于开发靶向交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白和/或能够特异性地结合蛋白中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象的蛋白(优选对于示例性紊乱是特异性的)是有价值的导向。在透析方案过程中例如使用亲和区，治疗剂例如原位清除错折叠蛋白或者清除体外的错折叠蛋白。
材料和方法
Octagam IgIV(Octapharma，批次5024018434)在Aβ琼脂糖、HbAGE琼脂糖和dIgIV琼脂糖上富集，如在本申请其他地方描述的。这些基质的洗出液对PBS进行透析(2h，1:2000，4℃)，集中并涂布到CNBr琼脂糖上(GE-Healthcare，Amersham Biosciences)。富集IgIV的固定基本上如本申请其他地方对NHS琼脂糖所述的进行。CNBr基质以200mg/ml溶解在1mM HCl中并与NHS基质相同处理，只是在该缓冲液中清洗之前又一个在辊筒装置上在1mM HCl中的另外5分钟激活步骤。集中的富集组分在固定缓冲液(50mMNaCl和40mM NaHCO3)中稀释至15μg/ml的浓度。对照基质仅暴露于固定缓冲液。过夜固定之后，基质用Tris封闭并清洗。
6个样品用IgIV琼脂糖和对照琼脂糖进行孵育：正常集中的血浆、患有AL淀粉样变性病的患者I或患者II的血浆、患有RA(类风湿因子，RF效价682)的患者III的血清、对照血清以及患有RA(RF效价23)的患者IV的滑液。所有样品在HBS中稀释20x并应用到在两个500μl体积中的200μl珠子。一个体积在室温下孵育4h并在离心(1400rpm，2分钟)后抛弃上清液。接着，第二个体积应用与相同基质并在4℃辊筒装置上孵育过夜。亲和基质或对照基质在两个接下来的每一个1h的孵育步骤中，用HBS清洗12次并用2 x 50μl的在PBS中的8M脲洗提结合的蛋白。为了收集洗出液，离心基质并对每个样品收集两个洗出液。
样品编码：
A1 正常收集的血浆
C1 正常收集的血浆
A2 AL淀粉样变性病患者I
C2 AL淀粉样变性病患者I
A3 AL淀粉样变性病患者II
C3 AL淀粉样变性病患者II
A4 患有RA(RF效价682)的患者III的血清
C4 患有RA(RF效价682)的患者III的血清
A5 对照血清
C5 对照血清
A6 患有RA(RF效价23)的患者IV的滑液
C6 患有RA(RF效价23)的患者IV的滑液
A 系列：富集IgIV的琼脂糖的亲和基质
C 系列：对照基质(激活/失活的琼脂糖)
洗提的蛋白用二硫苏糖醇(DTT)还原(60分钟，终浓度6.5mM)，然后用碘乙酰胺烷基化(30分钟，终浓度54mM)，随后过夜胰蛋白酶消化(10ng/μl)。蛋白消化物如所述进行脱盐(Rappsilberet al 2003，Anal.Chem.75，663-670)，真空干燥并溶解在2.5％甲酸中。
为了分析肽混合物，使用连接至hermo Finnigan LTQ-MS(Thermo Electron，Bremen，Germany)的Agilent 1100 HPLC system(Agilent Technologies)。蛋白消化物以5μl/分钟注到阱柱(trapcolumn)(Reprosil C18 RP(Dr Maisch，Germany)，20mm×100μmI.D.)上。接着，以100nL/分钟溶解A(0.1M乙酸)的分段减压流速转移到分析柱(Reprosil C18 RP，20cm×50μm I.D.)上。肽的洗脱在40分钟内以从0至40％B(在80％(v/v)乙腈中的0.1M乙酸)线性梯度实现。柱流出物经由铰链连接的纳米-ESI发射器(NewObjectives，Woburn，MA)直接引入到质谱仪的ESI源中。该质谱仪以阳离子模式操作并且选择母离子以用于数据依赖性模式的片段化。在质谱仪检测之后，利用BioWorks软件(Thermo Electron，Bremen，Germany)生成峰列。蛋白鉴定通过搜索IPIhuman数据库(版本3.2.4，从ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/IPI/current下载)利用Mascot软件(www.matrixscience.com)进行，使用以下设置：完全胰蛋白酶肽，肽耐受量0.8Da，MS/MS耐受量0.9Da，允许1个缺失分裂，脲甲基(Cys)和氧化(Met)分别作为固定和可变修饰。支架软件包(www.proteomesoftware.com)用来解析这些数据并用来以95％的置信度过滤肽，允许仅鉴定具有至少2个肽的蛋白鉴定。
结果&讨论
在表9中，显示了对不同样品的结果。对于淀粉样患者，人类集中血浆用作对照。对于RA患者，来自健康对象的血清用作对照。对照血清和正常收集血浆的结果用于鉴定独特存在于利用患者样品获得的肽组合物中的肽。显示的肽是相比于对照血清或血浆，来自患者血清或血浆的特异性结合的蛋白或蛋白片段。由于没有可利用的辣子健康对象的滑液，所有仅对照基质用作用于来自RA患者的滑液的阴性对照。如所述，蛋白鉴定通过搜索IPIhuman数据库而实施。IPI代表“国际蛋白索引(International Protein Index)”并用来鉴定不同数据库如Swiss-Prot、TrEMBL和PIR(这些数据库都接入UniProt)中的蛋白、蛋白前体和蛋白片段。IPI蛋白组对有限数量的高级真核物种制备，这些高级真核物种的基因组序列已经完全确定但对其存在大量预测的在UniProt中(还没有)列出的蛋白序列)。IPI从UniProt获取数据并还从包括预测的来源获取数据，并将它们非多余地合并到用于每一个物种的全面蛋白质组中。这种信息通过欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)(EBI)的网页(其可经由www.ebi.ac.uk访问)全部进行评价。
列出了一种蛋白(IPI00807428)，其一种肽在与滑液接触的对照基质的洗出液中被鉴定，因为这种蛋白的7个肽在富集IgIV的基质洗出液中被鉴定。如看到的，存在多种“假定”蛋白和通过所检测蛋白的分子量指定的蛋白。由于相对较短的氨基酸序列不能总是独特地归于特定蛋白，这尤其在免疫球蛋白中可观察到，所以对于鉴定的一些蛋白片段多种结果是可能的。在一些其他情况中，假定蛋白的IPI编号提及已鉴定的蛋白。
在样品2/3中，AL淀粉样变性病患者I和II的血清，一种鉴定的蛋白是“动力蛋白重链结构域3”。动力蛋白是一种“机动蛋白”，其将细胞内货物(cargo)从细胞膜移动到细胞中。这例如是具有自体吞噬和轴突输送的情形。动力担保涉及蛋白聚集体的输送。因此，如果由于某种原因结合至血浆中的蛋白聚集体，则其最终可结束结合富集IgIV的基质。因此，动力蛋白被鉴定为交叉β结合蛋白。另外，在样品2/3中，鉴定了一种假定蛋白、两种25kDa蛋白和一种免疫球蛋白λ恒定1区。具有IPI编号IPI00747752的25kDa蛋白在任何数据库中都没有参考。然而，其具有免疫球蛋白的全部结构特性。其他25kDa蛋白具有对免疫球蛋白λ座位的基因参考。假定蛋白具有对免疫球蛋白λ可变4-3的基因和蛋白参考。免疫球蛋白由两个重链和两个轻链构成，其中每一个重链具有恒定区和抗原结合可变区，每一个轻链也具有恒定区和抗原结合可变区。
由于患者患有原发性AL淀粉样变性病，所以鉴定的轻链最可能是与疾病病理相关的错折叠免疫球蛋白轻链。
在样品4中，从RA患者III的血清，鉴定了多种独特蛋白。该患者具有超过600的RF效价，表明该患者患有严重RA。鉴定蛋白中的4种是假定蛋白，其中之一(IPI00760678)具有对免疫球蛋白λ座位的基因参考和对免疫球蛋白λ恒定区的蛋白参考。其他三种缺失具有免疫球蛋白的所有结构特性。鉴定为25kDa蛋白的两种蛋白都具有对免疫球蛋白λ座位的基因参考。一种具有对类风湿因子G9轻链的特异性蛋白参考，一种明显对类风湿因子是特异性的λ可变3区。因此，推断出该片段是交叉β结合免疫球蛋白的部分。有两种鉴定为免疫球蛋白λ恒定区1(IPI00658130，IPI00719373)的蛋白和两种鉴定为免疫球蛋白λ恒定区2(IPI00555945，IPI00450309)的蛋白。有一种鉴定为免疫球蛋白区的另一种蛋白，即免疫球蛋白λ可变区3-25。推断出该片段包含显示对错折叠蛋白的亲和力的氨基酸序列。
在不同的研究中，证实了许多情形下类风湿因子含有特定λ区，其中之一在这个实验中明显地被鉴定。鉴定的其他λ区也可以是类风湿因子的部分。这些区还可以是错折叠免疫球蛋白分子的部分，或者它们是RF自身免疫抗原的部分，其是免疫球蛋白的Fc区，显示包含交叉β结构的错折叠蛋白的特性(参见实施例10)。
鉴定了三种其他的蛋白。一种鉴定为中心体蛋白(Centrosomalprotein)Cep290的同种型1(IPI00784201)。中心体-和纤毛-相关蛋白在分裂期后细胞中构建极性以及调节细胞内输送方面起关键作用。由于其细胞内定位，所以存在表明水解的细胞内容物存在于患者样品中。
第二个鉴定血纤蛋白溶解酶原γ链前体的同种型γ-B(IPI00021891)。血纤蛋白溶解酶原的不同形式是用于类风湿性关节炎中的自身抗体的抗原。血纤蛋白溶解酶原的去亚胺化形式是这些抗原中的一种，其在类风湿性关节炎患者的滑膜中大量发现。
鉴定的最后一个蛋白(IPI00004233)是单克隆抗体Ki-67的抗原。该抗原用作增殖标记物。在一些情形下，用作用于肿瘤生长的标记物。最感兴趣的是，在类风湿性关节炎中它还被描述为增殖标记物，用来评价滑膜中炎性细胞型的增殖。
在实施例6中，类风湿性关节炎患者IV的滑液，也独特地有鉴定的多种蛋白。这些蛋白中的三种是假定蛋白。一种(IPI00807428)没有基因或蛋白参考，但具有免疫球蛋白的所有特性。一种(IPI00760678)具有对免疫球蛋白λ作为(恒定区2)的基因数据库参考和对免疫球蛋白λ作为恒定区的蛋白数据库参考，而且具有对可变2-14区的蛋白参考和对假定蛋白的参考。最后一种(IPI00003362)事实上是热休克蛋白BiP(GRP78)。BiP是交叉β途径的构成组分之一并且结合错折叠蛋白(参见表4和5)。BiP最可能是在患者样品中鉴定的，因为它结合于错折叠蛋白。BiP在RA患者中本身也被鉴定为靶自身抗原。不同于假定蛋白，鉴定了三种其他的未命名蛋白；两种25kDa和一种26kDa蛋白。两种25kDa蛋白具有对免疫球蛋白λ座位的基因参考(IPI00747752，IPI00154742)。这些中的一种(IPI00154742)也具有对类风湿因子G9轻链(对类风湿因子特异性的λ可变3区，其在前面提及过)的蛋白参考。该26kDa蛋白具有对免疫球蛋白κ可变区1-5。
还有一些鉴定的其他免疫球蛋白区。一种是免疫球蛋白κ恒定区(IPI00807413)，一种(IPI00166866)是免疫球蛋白重链恒定α1，一种(IPI00748998)是免疫球蛋白单链Fv片段(重链可变区)以及最后一种(IPI00658130)，其被鉴定为免疫球蛋白轻链恒定区1。
滑液还含有补体系统的一些成分，即补体Clq亚成分亚单位C(IPI00022394)、补体Clr亚成分(IPI00296165)和补体因子H-相关蛋白1(IPI00011264)。已经证实，相比于来自类风湿性关节炎患者以及健康对照的血清，在来自类风湿性关节炎患者的滑液中大量发现具有结合的Clq、C4和/或C3的微粒。还发现Clq在淀粉样蛋白β斑块中积累。最后，Clq结构上类似于表面蛋白A(SP-A)，都具有球状头部区和骨胶原状尾部。SP-A与滑膜中的片层体相关并且对于SP-A的自身抗体存在于类风湿性关节炎患者的滑液中。这些自身抗体具有与Clq的交叉反应活性。Clq在交叉β途径中起作用(参见表4和5)。根据针对带有Clq的自身抗体的交叉反应活性判断，其也被认为是自身免疫抗原。尤其是因为骨胶原是类风湿性关节炎中共用自身抗原。
补体Clr是丝氨酸蛋白酶，其能够与Clq相关。Clr可激活其他补体因子。迄今没有明显发现与类风湿性关节炎或蛋白错折叠相关。
补体因子H-相关蛋白1(FHR-1)由5个短共有重复序列(在因子H中也发现)构成并且其功能迄今未知。FHR-1在人类血浆中是作为某些脂蛋白颗粒部分发现的。已证实FHR-1与磷脂和血浆中的其他蛋白的脂蛋白复合体相关，并且该复合体介导细胞对脂多糖(LPS)的反应。我们证实了LPS诱导蛋白中的交叉β构象。我们还建立了ApoA-I能够采取交叉β构象。另外，ApoA-I能够结合其他包含交叉β构象的蛋白。该复合体中的脂蛋白由磷脂、载脂蛋白A-I(apoA-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)以及因子H-相关蛋白(FHR)构成。推断出FHR-1在运载和/或调节LBP功能中起作用。由于FHR-1是这些颗粒的主要蛋白成分，所以FHR-1呈现比ApoA-I或LBP大若干倍的丰度。在前面，证实了由6个短共有重复序列构成相关蛋白，称为β2-糖蛋白I(也称为载脂蛋白H)，与HDL颗粒和磷脂都相关。β2-糖蛋白I(IPI00298828)还在滑液样品中鉴定。β2-糖蛋白I在粥样动脉硬化和抗-磷脂综合征(一种具有增加血栓形成危险的病症)中是一种已知的自身抗原。β2-糖蛋白I的功能仍不清楚。然而，已经证实，它抑制磷脂依赖性凝固反应，如凝血酶原因子-X复合酶的活性、以及因子XII激活。它还结合因子XI并已知其激活。相反，它抑制激活的蛋白C的抗-凝固活性并且它可以有助于体内凝血酶生成。当β2-糖蛋白I由凝血酶切割时，它结合血纤蛋白溶解酶原并抑制纤溶酶生成。我们证实了当接触心磷脂时或当烷基化时，β2gpi包含交叉β构象，使其具有免疫原性潜力。
在滑液样品中鉴定了三种蛋白，即钙调蛋白5(IPI00021536)(也称为钙调蛋白皮肤蛋白)、桥粒斑蛋白(desmoplakin)(DPI)d同种型I(IPI00013933)和凝溶胶蛋白(gelsolin)的同种型I(IPI00026314)。钙调蛋白5是皮肤特异性钙结合蛋白并且其表达局限于颗粒层(stratum granulosum)和角质层的下层。其在细胞分化期间表达。这种蛋白可探测地作为污物(皮肤蛋白)存在于滑液中。桥粒斑蛋白是表皮中的微管机体组织的调节子并且它与表皮的角蛋白相关。这种蛋白还可探测地是污物。凝溶胶蛋白帽肌动蛋白丝和一种分泌形式的凝溶胶蛋白存在于血浆中，其中它可探测地充当肌动蛋白清道夫。凝溶胶蛋白还能够形成淀粉样蛋白沉积并且是引发大脑淀粉样血管病的蛋白之一。凝溶胶蛋白基因中的突变导致Finnish型的凝溶胶丹麦相关家族淀粉样变性病。当凝溶胶蛋白聚集或错折叠凝溶胶蛋白存在于滑液样品中时，其结合富集IVIg基质不会令人惊讶。
通过使用富集IgIV亲和基质，如在本实施例中所述的，我们鉴定了对于淀粉样变性病患者独特的多种蛋白，并且在从患有类风湿性关节炎的患者获得的样品中独特地鉴定了系列蛋白。这些蛋白含有交叉β结构或者它们本身是交叉β结合蛋白。这些蛋白形成开发疾病特异性诊断工具的基础和/或是新鉴定的用于开发靶向使病人体内(例如通过给予药物)和/或体外(例如，体外装置)缺失疾病调节性错折叠蛋白的治疗剂的靶。此外，研究表明，多种鉴定的交叉β结合分析的考察明显与疾病相关。鉴定的Ig的可变区用作用于开发合成的亲和区的良好起点(参见下文，实施例20)。
实施例15
错折叠蛋白与细胞的相互作用通过亲和区的调节
包含交叉β结构的错折叠蛋白能够结合至细胞并引起细胞反应，包括但不限于炎性反应和细胞生长或凋亡中的变化。我们解决了亲和区是否调节这样的错折叠蛋白与细胞的相互作用。我们使用从脐静脉分离的人类原发内皮细胞(HUVEC)。
材料&方法
人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离、培养和分析
分离和培养
HUVEC是原发内皮细胞(EC)，根据本领域技术人员已知的广泛使用的标准程序，利用0.1％胶原酶(Sigma，C0130，100mg，溶解在100ml M199介质中，该介质补充有10％ FCS(Gibco 10106-169)和青霉素-链霉素(P/S，Gibco，15140-122))分离自脐带。HUVEC具有EC的典型特征，例如鹅卵石形态和储存在怀布尔-帕拉德体(Weibel-Palade body)中的血管假性血友病因子。HUVEC可常规地培养直至第5代；超过第5代的HUVEC丢失典型的EC标记物。这里简短描述分离。脐带在乙醇接着用PBS清洗少于3分钟。静脉连接至导管并用10ml PBS冲洗，接着加载0.1％胶原酶溶液。在37℃的15分钟培养之后，分离的内皮细胞悬液通过用10ml介质冲洗该静脉，接着加入胶原酶溶液而恢复。EC悬液在室温以低g-力离心5分钟。抛弃上清液并将细胞球粒再悬浮在5ml“富集基质”(EGM-2；内皮细胞基本介质(EBM-2，Cambrex，CC-3156)和含用于内皮细胞的上清液的Singlequots(Cambrex，CC-4176))中。细胞(第0代，P0)接种到用0.5％明胶(Sigma，G1393)涂覆的培养瓶中。为了促进内皮细胞的粘附，将人类纤连蛋白以终浓度2μg/ml加入到该细胞培养基中。EC在5％ CO2、37℃下培养。细胞培养基酶2-3天更新直至铺满。然后，在加入胰蛋白酶-EDTA下，将细胞从培养瓶分离，以低g-力离心，再悬浮在富集介质中并接种到更大的0.5％明胶预涂覆的细胞培养瓶中。
RAGE的表达和纯化
对于描述重组人类sRAGE克隆、表达和纯化，参见专利申请WO2006101387(第[0303]段)。纯化的sRAGE-FLAG-His原料为PBS中的284μg/ml，保持在-80℃。
细胞与错折叠蛋白的粘附
在96孔板(Immulon 1B Thermo Labsystems 3355)中，利用100μl溶液涂覆蛋白质(即，BSA-AGE(5μg/ml))、10μg/ml天然IVIg(Octagam charge#5024018434)、10μg/ml富集IVIg(通过使Octagam IgIV接触Hb-AGE-琼脂糖富集的[参见本申请说明书其他地方])或明胶(Sigma G1393，2％在H2O或PBS中的溶液，用于粘附至EC的阳性对照)。在37℃孵育2小时之后，抛弃溶液并用100μl/孔在PBS中的0.5％聚乙烯基吡咯烷酮(PVP，Sigma P5288)在37℃封闭1小时，过滤(0.22μm)灭菌。PVP是一种不支持细胞粘附的惰性聚合物。接着，抛弃具有PVP的溶液。接下来，将板用40μlRPMI 1640介质(Gibco 52400)和10μl潜在抑制剂如亲和区进行孵育。HUVEC通过胰蛋白酶消化获得。离心之后，细胞再悬浮在具有P/S的RPMI 1640介质中并稀释至80.000-100.000个细胞/ml。每个孔用100μl的细胞悬浮液接种。允许细胞在37℃粘附1小时。板用具有P/S的RPMI 1640介质温和清洗。介质通过沿着孔壁移液移出。清洗板直至空白孔很难含有任何细胞，即1-3次。接着，每个孔加入50μl RPMI介质，然后加入在PBS中的5μl/孔10％Triton-X100并在37℃孵育10分钟。接着，根据制造商说明书加入50ul乳糖脱氢酶(LDH，Roche Applied Science，11644793001)溶液。板在黑暗中室温下孵育0.5-3小时。在不同时间点在Versamax微板读数器上检测在490nm的吸收率。
错折叠蛋白与细胞的结合通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析进行评价
对于这些实验，HUVEC通过胰蛋白酶消化分离。在胰蛋白酶消化之后，在含有P/S和10％ FCS的RPMI 1640中收集细胞并离心。在离心之后，将细胞以250.000个细胞/250μl的浓度再悬浮在没有FCS的RPMI介质中。制成单个4-ml管(聚丙烯，Greiner)，含250μl细胞悬液。向每个管中，加入75μl样品，仅含有缓冲液(PBS)、50μl具有25μl oxLDL的缓冲液(1mg/ml)或74μl具有1μlBSA-AGE的缓冲液(25mg/ml)。接着，细胞用该样品在4℃孵育大约3.5小时。接着，通过离心移出细胞并抛弃上清液。细胞接着在4℃用FACS缓冲液清洗并以大约1 x 105个细胞/100μl再悬浮在FACS缓冲液中用于后续分析。通过加入3μl 7-氨基放线菌素D(7AAD)溶液(根据标准程序制备)确定细胞死亡。样品BSA-AGE的结合(制备细节参见本申请其他地方)利用抗-AGE单克隆抗体4B5(10μg/ml)来确定，并在清洗之后用羊抗-小鼠PE二次抗体(Jackson Immunoresearch，West Grove，USA)确定。BSA-AGE的结合还利用PE通道中的BSA-AGE的内在荧光进行评价。氧化LDL(oxLDL，在用FeSO4孵育后氧化56％；硫磺素T荧光特定增强)的结合利用具有抗-ApoB100多克隆抗体的兔血清(Dade Behring，Newark，DE，USA，批次153670)以160μg/ml的浓度并且在清洗细胞之后用FITC标记的羊抗-兔抗体(1:200，Jackson)加以确定。
结果&讨论
细胞与错折叠蛋白的粘附
已发现HUVEC粘附至错折叠蛋白，即如利用BSA-AGE在这里示出的，在一定的更大程度上，大约125％，高于明胶(图22A，条1vs.3)。增加浓度的亲和区，即IgIV，抑制EC与BSA-AGE的粘附(条7-9vs.条3)。这些数据表明，亲和区干扰错折叠蛋白与细胞的相互作用。
图22B示出了细胞还结合亲和区(IVIg，Octagam)，最有效地富集亲和区(乳剂IVIg，在通过使Octagam接触Hb-AGE琼脂糖富集之后，对于描述参见本申请其他地方)。EC与包含Fc结构域的固定亲和区的结合不受典型Fc受体的介导，因为这些受体，即CD16、CD32a和b以及CD64，在细胞上不存在，如利用FACS分析(未示出)确定的。由于亲和区能够特异性地结合错折叠蛋白，亲和区与细胞之间的这种相互作用通过细胞上的错折叠蛋白与亲和区的结合(特异性地)进行解释。事实上，大约1-2％的这些细胞较低存活，如利用FACS所确定的(未示出)。
错折叠蛋白与细胞的结合通过流式细胞仪进行评价
利用两种方法，发现BSA-AGE有效地结合至96％的EC，其中平均荧光强度(MFI)为13.9。oxLDL结合于18％的孵育EC并显示1.6的MFI。利用在具有BSA-AGE的悬液中孵育的EC获得的结合特性符合以下观察结果，即EC有效地结合至用BSA-AGE涂覆的细胞培养板的孔(参见图22)。
综合起来，这些结果证实了，这些细胞能够特异性地结合具有交叉β结构的错折叠蛋白，以及亲和区(优选富集的亲和区)调节这样的错折叠蛋白与细胞的相互作用。在本实施例中，我们观察到存在于Octagam IgIV中的IgIV亲和区有效地阻断EC与固定的错折叠BSA-AGE的粘附。推断出针对固定的错折叠蛋白的亲和区结合并遮蔽错折叠蛋白与EC表面受体的相互作用。
实施例16
利用富集IgIV从溶液中提取错折叠蛋白
我们分析了富集IgIV(在选择结合具有包含交叉β结构的固定错折叠蛋白的基质的亲和区之后获得的)是否适用于从溶液中提取交叉β结构。简而言之，在ELISA方法中，将通过利用Aβ原纤维琼脂糖、dIgIV琼脂糖、dHSA琼脂糖和BSA-AGE琼脂糖富集的IgIV(如实施例6中所述)的混合物固定，暴露于具有错折叠HbAGE和dOVA的掺料(spike)的溶液，随后评价错折叠蛋白与富集IgIV的结合。
材料和方法
Octagam IgIV(批次5024018434)通过利用Aβ原纤维琼脂糖、dIgIV琼脂糖、dHSA琼脂糖和BSA-AGE琼脂糖富集，如实施例6中所述。Ig浓度大约为30μg/ml。对于当前的实验，来自亲和基质的四个洗出液在体积基础上以1:1:1:1混合，并以5μg/ml浓度在移动中室温下在Greiner Microlon高结合板上涂覆1h。作为阴性对照，仅涂覆缓冲液或天然HSA(CEALB，Sanquin，The Netherlands)。基本上如前所述实施ELISA。用富集IgIV或HSA或包被缓冲液涂覆的封闭(Roche封闭剂)孔一式两份地用0、1、10或100μg/ml的dOVA或HbAGE覆盖。dOVA的结合利用单克隆抗-小鸡卵清蛋白(Sigma，A6075，1:10,000)和RAMPO(Dako Cytomation，P0260，1:3,000)进行测定分析。HbAGE利用AGE特异性小鼠杂交瘤IgG4B5(针对葡萄糖-6-磷酸糖化人类纤连蛋白产生)和RAMPO进行检测。利用缓冲液涂覆的孔(其接着用蛋白溶液覆盖(参见下文))获得的背景信号从利用具有涂覆的富集IgIV或HSA的孔获得的信号中减去。另外，对于利用其中没有加入dOVA或HbAGE的孔(用于结合的缓冲液对照)的初次抗体和二次抗体孵育获得的背景信号从利用1、10和100μg/ml错折叠蛋白获得的信号中减去。
结果与讨论
图23示出了，通过固定的富集IgIV从溶液中提取dOVA，而很难发生与HSA的任何附着。类似地，HbAGE还特异性地通过富集IgIV提取。这些结果表明，对包含交叉β结构的错折叠蛋白具有增加亲和力的富集IgIV(其被固定在合适固体载体上)适合于用来从溶液中缺失包含交叉β结构的错折叠蛋白，例如dOVA和HbAGE。
对于这种披露的方法用于从蛋白溶液中提取错折叠蛋白的应用于例如但不限于以下的领域i)诊断蛋白错折叠疾病，例如肾功能障碍、全身性淀粉样变性病例如AL-、AA-或ATTR淀粉样变性病，或者RA；ii)蛋白溶液的质量控制，例如生物医药和疫苗；iii)患有蛋白错折叠疾病，例如肾功能障碍、全身性淀粉样变性病例如AL-、AA-或ATTR淀粉样变性病，或者RA的患者的透析，例如使用体外装置；以及iv)从生物医药中清除带有诱导(免疫原性)副作用的文献的错折叠蛋白。对于所有上述的应用，对于优先且特异性结合错折叠蛋白的所应用的亲和区的规定根据需要进行调整。在一个优选实施方式中，利用实施例6和7以及“基于实施例1-20的总结”(以下给出的)所述的方法和装置，那些特异性亲和区选自亲和区的组合物，其对于某些靶目的例如上文列出的那些是需要的。
实施例17
对错折叠蛋白的细胞反应通过富集的亲和区的免疫调节
为了从身体清楚错折叠蛋白，免疫细胞以各种方式对错折叠蛋白反应(响应)。反应包括错折叠蛋白的调理作用、细胞因子和趋化因子产生以便激活和吸引免疫系统的其他细胞以及细胞表面标记物表达以激活其他细胞。尤其是，抗体如能够特异性地将诶和错折叠蛋白的亲和区与免疫细胞相互作用以便激活这样的免疫细胞。我们测试了亲和区(对于识别错折叠蛋白如糖化BSA的抗体富集的)能够增强对错折叠的反应。我们使用了从健康自愿者外周血分离的原代人类数突细胞(DC)。我们确定了细胞因子白介素-6(IL-6)和趋化因子IL-8的产生、细胞表面标记物(CD80，CD83，CD86和CD40)的表达以及细胞存活力和存活性(7AAD的结合)。
材料&方法
外周血人类单核细胞来源的树突细胞的体外生成以及对激活的分析
人类DC产生自选自外周血单核细胞(PBMC)的非增生性前体，基本上通过公开方法(Sallustro and Lanzavecchia[1994]，J.Exp.Med.179 1109-1118)。CD1a、CD32、CD36、CD40、CD54、CD86、HLA-DR和CD206的相对丰度存在以及CD14阳性、CD16阳性、CD64阳性、CD80阳性、CD83阳性和CD163阳性细胞的相对较低含量用作对于未成熟DC的定性检测。在通过用GM-SCF和IL-4刺激后获得未成熟DC之后，将1ml细胞悬液用50μl以下化合物(终浓度)孵育22h：i)PBS；ii)50μg/ml聚-IC，具有100ng/mlTNFα；iii)50μg/ml BSA-AGE；iv)BSA-AGE+4.4μg/ml富集IgIV；v)与iv)相同，但细胞用饱和浓度的封闭抗-CD32a抗体预孵育；vi)BSA-AGE+660μg/ml Octagam IgIV；vii)与vi)相同，但细胞用饱和浓度的封闭抗-CD32a抗体预孵育。富集IgIV通过使Octagam IgIV与HbAGE琼脂糖以及接着分离那些结合于错折叠蛋白基质的亲和区而获得。
分析DC的以下参数：利用FACS测定的CD83、CD86、CD80和CD40的表面密度(平均荧光强度MFI，或％阳性细胞)，以及如通过凋亡标记物7-氨基-放线菌素D(7AAD)结合确定的细胞死亡/细胞存活力。另外，IL-6分泌和IL-8分泌的程度对IL-6利用PelipairELISA(M9316，Sanquin Reagents，Amsterdam，The Netherlands)而对IL-8利用Cytosets CHC1304试剂盒(Biosource)在细胞培养物上清液中确定。
结果和讨论
表10示出了来自分析的结果。观察到DC有效地响应于对照刺激剂(在TNFα存在下的聚I-C)。这些数据证实了富集IgIV能够在BSA-AGE存在下刺激DC。相反，以150倍较高浓度下的非富集IgIV很难能够增强DC。例如，IL-6(4433pg/ml)和IL-8(19316pg/ml)的表达分别通过IgIV有效刺激，但利用非富集IgIV(191pg/ml和4682pg/ml)仅在有限程度上刺激。另外，富集IgIV还刺激共刺激分子如CD80、CD83、CD86和CD40的表达。该反应(响应)由针对FcγRIIa(抗-CD32a)的抗体抑制，表明所述作用通过这种Fc受体介导。
综合起来，这些结果表明，亲和区(优选富集亲和区)在增强免疫系统中起作用以便去除错折叠蛋白，主要通过FcR。因此，借助于所披露的方法，本领域技术人员能够选择要使用的亲和区(优选在疾病治疗中)以去除错折叠蛋白、消除错折叠蛋白在疾病病理学中的作用。
实施例18
对富集的IgIV亲和区及IgIV中的抗-环状瓜氨酸化肽抗体的存在的分析，其中富集的IgIV利用HbAGE-琼脂糖错折叠蛋白亲和基质加以选择
在实施例1和3-9中，我们证实了亲和区(即，人类IgIV)的各种制品能够特异性地结合之具有交叉β结构的错折叠蛋白。在实施例10中，我们证实了广泛接受的通过在65℃加热的聚集方法用于制备人类IgG，以用在用于分析类风湿因子(RF)效价的分析的测定中，针对IgG分子的Fc结构域的自身抗体，在IgG分子中诱导交叉β结构。RF效价在70-80％的所有类风湿关节炎患者中观察到。另外，大约5％的表面健康群体对于RF也检测为阳性。我们现在强调在能够特异性地结合与交叉β结构或交叉β结构诱导蛋白构象的IgIV中的Ig亚种群对于环状瓜氨酸化肽(CCP)具有亲和性的可能性。
已经广泛描述了，在超过80％的类风湿关节炎患者中发现的自身抗体种群靶向某些蛋白如纤维蛋白原、中间丝相关蛋白和波丝蛋白的脱亚胺基形式。最近，已经描述了抗-合成瓜氨酸化中间丝相关蛋白序列抗体事实上结合于患者的瓜氨酸化纤维蛋白。我们之前证实了，纤维蛋白带有交叉β结构构象。在脱亚胺基化中，氨基酸精氨酸转化成氨基酸瓜氨酸。因此，这个过程称为瓜氨酸化，产生瓜氨酸化蛋白。常规地使用对于类风湿关节炎的诊断试验，其基于这些抗-瓜氨酸化蛋白自身抗体与瓜氨酸化蛋白的结合，如抗环状瓜氨酸化肽(CCP)ELISA试验(抗-CCP ELISA)。至今，本发明很大程度上不知晓蛋白的瓜氨酸化如何触发RA患者的自身免疫反应。我们注意到，良好记载的蛋白瓜氨酸化的结果是蛋白的未折叠/再折叠。根据本发明，通过酶肽基精氨酸脱亚胺酶的精氨酸残疾的瓜氨酸化诱导包含精氨酸残疾的蛋白的错折叠。精氨酸瓜氨酸化的结果是净损失蛋白上的正电荷。这种正电荷的净损失有助于通过离子相互作用和氢键的调节的错折叠，设计蛋白三位结构的稳定性和完整性。我们之前已经证实了出现交叉β结构构象的蛋白的错折叠使该蛋白变成免疫原性体(参见专利申请“crossbeta adjuvation”，WO2007008070)。因此，我们现在推断，蛋白的瓜氨酸和所得的这些蛋白的错折叠伴随形成交叉β结构的形成，解释了这些瓜氨酸化蛋白的(自身)免疫原性特性。为了证实这个结论，我们检测了在我们的富IgIV亲和区种群中存在抗-CCP抗体，该亲和区种群通过使Octagam IgIV与错折叠糖基化血红蛋白，固定在NHS-琼脂糖上。
材料与方法
以下亲和区制品对于出现抗-CCP抗体效价的分析：
1.Octagam IgIV(Octapharma，编号：5024018434，50mg/ml)。
2.10mg/ml人类γ-球蛋白(Sigma G4386，Lot21k7600)。溶解在PBS中，在卷挠装置上在室温下孵育10分钟，并且接着在37℃孵育10分钟以及在卷挠装置上在室温下再次孵育10分钟。
3.Gammagard丙种IgIV(B axter Hyland Immuo GammagardS/D5g，Lot LE08E044AL，52mg/ml，溶解在供应的溶液中，等分并在-20℃下储存)。
4.103μg/ml在PBS中的富集IgIV。使用HbAGE-琼脂糖从Octagam IgIV(帐户编号：5024018434)富集，如实施例6、7中所述。
常规效价确定使用用于抗-CCP抗体效价确定的Elia系统(Phadia GmbH)通过用于医学免疫学的实验室(UMC Utrecht，TheNetherlands)进行。样品1-4稀释10x用于分析，代替常规用于患者血清实施的100x稀释。
结果与讨论
各种亲和区制剂中的抗-CCP抗体效价利用EliA系统通过当地用于医学免疫学的实验室(UMC Utrecht，The Netherlands)进行确定。对于确定的效价参见表11。利用IgIV和γ-球蛋白制剂获得的值落入对于血清中抗-CCP效价指定为阴性(相对于(诊断疾病的目的，即<7U/ml)设置的限值范围内。事实上，测定的效价在外表健康个体的血清中常规发现。利用富集IgIV，现在，所获得的2.7U/ml的效价相当于利用Octagam IgIV(富集IgIV从其分离)测得的效价。然而，富集IgIV的浓度低485倍，表明对于抗-CCP抗体的富集IgIV亲和区制剂的437倍富集。据此，我们推断基于它们对错折叠Hb选择的亲和区也对瓜氨酸化肽表现出亲和力。
肽基精氨酸去亚胺酶已经在广大各种各样的组织和细胞(但不在红血球)中在蛋白水平和mRNA水平上局部化(集中，localize)。此外，在红血球蛋白质组中肽基精氨酸去亚胺酶的存在在蛋白质组方法中没有检测到。因此，基于这些发现，我们推断用于在赖氨酸和精氨酸残基处的广泛糖化的人类血红蛋白(Hb)没有被瓜氨酸化。另外，在抗-CCP效价分析中使用的环状瓜氨酸化肽是基于人类中间丝相关蛋白(filaggrin)的修饰序列并因此不包含Hb氨基酸序列。利用人类中间丝相关蛋白氨基酸序列和人类Hbα-链或β-链氨基酸序列的序列对比缺失表明，在大约19个氨基酸残基的肽链(即，用于分析中的第二代的CCP的长度)之间的序列同源性为低至没有(即，大约20-35％)。如前所述，瓜氨酸化对于诱导蛋白再折叠是熟知的。因此，我们的结果证实了，利用包含交叉β结构的错折叠蛋白，即HbAGE，我们能够从IgIV亲和区集合中选择一组对CCP具有特异性的亲和区，其具有与与人类Hb不相关的氨基酸序列。利用这个发现，我们证实了我们的结论，即通过糖化诱导的或通过瓜氨酸化诱导的、或通过任何其他用于蛋白错折叠的手段或方法诱导的错折叠导致蛋白中采取共用结构特征，即交叉β结构和/或交叉β诱导的构象，这独立于氨基酸序列。这对于解释抗-CCP效价数据具有重要的暗示。既然已经披露了能够特异性地结合瓜氨酸化蛋白的亲和区事实上包含对经过蛋白瓜氨酸化诱导的氨基酸序列独立的结构特征具有特异性的亲和区种群，疾病病理学中蛋白错折叠的表明(从其鉴定患者具有抗-CCP效价)明显地不能被忽视。因此，通过瓜氨酸化形成的错折叠蛋白是对实施以开发例如RA特异性疗法的研究方向的新鉴定靶。现在，我们的结果证实了，利用错折叠蛋白基质获得的富集IgIV亲和区是这样的用于开发针对RA相关错折叠蛋白的药物的新鉴定导向化合物。
实施例19
对错折叠小鼠γ-球蛋白具有特异性的人类富集IgIV亲和区
背景
类风湿因子(RF)针对自身-IgG分子Fc结构域中的表位(在IgG通过暴露于热而错折叠后暴露)的IgA、IgG、IgM自身抗体的一个组分(组合物)。RF出现在70-80％的类风湿性关节炎(RA)患者中，并且相对较高RF效价与多种疾病进展相关。在实施例10中，我们证实了暴露于RF表位实际上以形成交叉β接哦故的方式错折叠IgG，导致产生这样的结论，即RF是对IgG中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象具有亲和力的亲和区。我们发现，小鼠用四种具有交叉β结构的不同蛋白(即合成人类Aβ1-40、小鸡血清淀粉样蛋白A、糖化人类血红蛋白和人类原纤维α-链的合成片段)的免疫接种引发免疫反应，导致产生对错折叠人类IgG具有特异性的杂交瘤IgM，其包含交叉β结构。具有不相关氨基酸序列但通常存在交叉β结构或交叉β结构诱导的构象的四种蛋白抗原中的一种或多种包含交叉β结构或交叉β结构诱导的结构特征，其偶尔紧密地令人回想到错折叠人类IgG中的交叉β特征。一种可替换的解释是，四种抗原中的一种或多种中的结构交叉β特征类似小鼠自身Ig分子中的交叉β结构或交叉β结构诱导的构象。交叉反应活性坑内在免疫系统的高活性期间已经出现，伴随B细胞的Ig的过度生产。小鼠免疫系统的异常反应活性从极大的脾(7倍增加的细胞数)推出，伴随大量渗透纤维原细胞。此外，小鼠在免疫接种试验期间恰巧病了一段时间。这些观察结果可以是针对自身IgG的自身免疫反应的结果，反映在观察到的用于错折叠人类IgG的杂交瘤IgM的亲和力上。第三种似乎合理的解释是，小鼠刚具有带有与其库中的RF共有的性质的通用交叉β结合IgM克隆体，类似通过采用交叉β亲和基质从人类IgIV选择的IgG。我们现在评价富集用于对在HbAGE基质上选择的错折叠具有亲和力的亲和区的人类IgIV是否包含对错折叠小鼠IgG具有特异性的亲和区。这将进一步证实我们基于存在通常对错折叠蛋白具有特异性的自身免疫球蛋白种群的认识。
材料和方法
为了测试用作用于结合交叉β结构的亲和区选集的池的Octagam IgIV起始原料、以及富集人类IgIV是否包含对带有交叉β结构的错折叠小鼠IgG具有特异性的亲和区种群，我们分析了Octagam IgIV和富集IgIV与各种形式的小鼠IgG的结合并将结果与与天然小鼠IgG的结合进行比较。利用天然小鼠IgG、暴露于高pH的小鼠IgG(dmIgG BASE)、暴露于低pH的小鼠IgG(dmIgGACID)和在PBS中加热到85℃的小鼠IgG(dmIgG 85℃)检测ThT荧光和刚果红荧光表明，交叉β结构是由各种错折叠方法诱导的。以两种不同方式实施ELISA。在一种方法中，小鼠IgG直接涂覆到孔上并用浓度系列的富集IgIV覆盖。以一种可替换方式，第一兔抗-小鼠免疫球蛋白(RAMPO，Dako Cytomation，Denmark)涂覆到孔上。封闭孔(Roche封闭剂)，接着小鼠IgG制剂结合于固定的抗体，然后一式三份地施加浓度系列的Octagam人类IgIV。
结果&讨论
在图24中，概括了两种可替换ELISA方法的结果。在两种实验方法中，人类亲和区优先结合各种错折叠形式的小鼠IgG。很难检测到富集IgIV与天然小鼠IgG的任何结合，并且Octagam IgIV一点也不结合于天然小鼠IgG。Octagam IgIV和富集IgIV都以最高亲和力结合至dmIgG BASE，其中导致半最大结合的浓度分别为大约200μg/ml和4.4μg/ml IgIV。利用富集IgIV观察到部分结合天然小鼠IgG而利用Octagam IgIV不能检测到结合的事实指示，在该小鼠IgG组合物(富集IgIV对其具有增加的亲和力)中存在错折叠IgG分子的某些组分。根据这些数据，推导出富集IgIV是富集用于以大约因子50结合至错折叠小鼠IgG。
总之，错折叠小鼠IgG的三种不同形式包含用于富集人类IgIV和Octagam IgIV(富集IgIV从其选择)的结合部位。dmIgG BASE暴露错折叠蛋白构象(Octagam IgIV和富集IgIV都对其表达最高亲和力)。这些数据表明，通过利用由错折叠糖化血红蛋白构成的亲和基质，亲和区的一个种群选自IgG分子的组合物，即OctagamIgIV，其对错折叠小鼠IgG表现出亲和力。这表示在所选富集IgIV组分中出现RF类亲和区，因此在Octagam IgIV，即优先结合具有交叉β结构的错折叠亲和区中出现RF类亲和区。
实施例20
具有令人回想到类风湿因子的结合性质的杂交瘤IgM
背景
如前面在实施例1-5的材料和方法部分中提到的，小鼠杂交瘤IgM 7H2H2特异性地结合一些错折叠形式人类免疫球蛋白。因此，我们将7H2H2指定为类风湿因子类抗体。小鼠连续用合成人类Aβ1-40、小鸡血清淀粉样蛋白A、糖化人类血红蛋白和人类原纤维α-链的合成肽免疫接种，然后分离脾用一组制备杂交瘤。值得注意的是，在取出脾时，其包含特别大数量的细胞7*108个(正常数量为1*108个细胞)。另外，该脾包含出乎意料高数量的渗透纤维原细胞。这些观察结果表明了高度活性的脾，这是由于小鼠免疫系统的高活性。值得注意的是，在用第二、第三或第四中错折叠抗原的任何免疫接种之前，在用Aβ的第一次免疫接种后大约40周，小鼠得病，但在几周内恢复，最后在用第二抗原即小鸡SAA免疫接种之前。7H2H2识别γ-免疫球蛋白和错折叠IgIV，而四种抗原用于包含不相关氨基酸序列的免疫接种并且(外源)免疫球蛋白用作抗原的事实，联合在免疫接种程序期间小鼠的高度激活免疫系统和疾病，使得我们可以推断，小鼠形成了针对自身抗体的自身免疫反应。为了进一步分析人类IgG的结构要求以便暴露用于7H2H2的表位，我们利用一系列包含通过不同方法获得的错折叠抗体的人类IgG制剂实施了结合实验。
材料&方法
为了分析杂交瘤克隆体7H2H2 IgM与各种人类IgG结构外观的结合，纯化7H2H2的稀释系列(在PBS中2.5mg/ml；P.van Kooten，ABC-Hybridoma-facility，University of Utrecht/UMC Utrecht，TheNetherlands)或固定浓度12.5μg/ml的IgM用于利用固定人类IgG的ELISA中。作为阴性对照，使用杂交瘤IgM 2G10。用于这些分析的人类IgG的错折叠形式和天然对照示于图25中，并且是：1)IgIV在65℃下5分钟(‘RF’方法)；2)IgIV 65℃；3)IgIV 69；4)IgIV76；5)IgIV 80；6)IgIV 83；7)IgIV 86；8)IgIV酸/碱对照；9)IgIV酸；10)IgIV碱；11)天然Gammagard IgIV；12)IgIV HFIP/TFA；13)IgIV NaPi 5mg/ml；14)IgIV NaPi 20mg/ml；以及15)IgG碱变性的，37℃。对于结构细节，参考关于交叉β标准的制备和结构确定的“实施例6-20的通用材料和方法”部分。在图8和图9中，示出了15种形式的人类IgG的结构特征。在加入NaOH后在37℃升温30分钟的人类γ-球蛋白表现为悬液中的大颗粒(图9L)，当相比于天然IgIV时显示增加的Trp荧光，并且该制剂增强ThT和CR荧光(图8A、B)。
在第二实验中，纯化小鼠杂交瘤IgM7H2H2的浓度系列与各种小鼠γ-球蛋白制剂的结合与hIgG-BASE-37℃和对照天然IgIVGammagard的结合进行比较，并且与对照小鼠杂交瘤IgM 2G10和相同系列的IgG制剂的结合进行比较。与实施例19中相同的小鼠IgG制剂并入本研究中，即天然mIgG、dmIgG ACID、dmIgG BASE、dmIgG 85℃。5μg/ml的小鼠和人类IgG制剂或对照缓冲液涂覆到Microlon高结合ELISA板(Greiner)上，其在涂覆后用封闭剂(Roche)封闭。IgM 7H2H2和IgM 2G10(天然对照)一式三份地以在PBS/0.1％ Tween 20中的0/1/10/100μg/ml施加至孔。清洗后，利用二次羊抗-小鼠-IgM-PO抗体(Jackson)，在PBS/0.1％ Tween20中1:5000稀释，来检测IgM的结合。在450nm处读出吸收率。对非用IgM浓度系列涂覆的孔测得的背景信号、以及利用具有0μg/mlIgM但具有二次抗体的IgG涂覆的孔获得的背景信号从利用由IgM覆盖的IgG涂覆孔获得相应信号中减去。
结果&讨论
在图25A中，示出了12.5μg/ml的小鼠杂交瘤IgM 7H2H2不会或很难结合至人类IgG制剂1，2，3，9，10，11，13和14，很小程度上结合至制剂4和5，中度结合至6，7，8和12，而最佳结合至人类IgG制剂15(γ-球蛋白，碱性条件，在37℃处理30分钟，接着用HCl将pH调回生理pH)。当纯化7H2H2的结合利用制剂1，6，11，14和15进行分析时，没有检测到与天然Octagam IgIV1)IgIV在65℃ 5分钟(“RF”方法)、11)天然Gammagard IgIV或14)IgIV NaPi20mg/ml的结合(图25B)。类似地，高亲和力结合利用在20mM磷酸钠pH 5.0中的5mg/ml加热到83℃的人类IgG制品6)Gammagard丙种IgIV和在37℃的5mg/ml，37℃碱变性的15)IgG观察到。二者的结合部位数量相当(Bmax分别是0.65和0.59a.u.(任意单位))，以及结合部位的一半被占据的浓度7H2H2相当，即，对固定的错折叠IgG制剂均为3.3μg/ml 7H2H2。制剂15)在TEM照片上表现为类似于IgIV BASE(样品10)和IgIV HFIP/TFA(样品12)的聚集结构。用于IgM结合至固定人类IgG、杂交瘤IgM2G10的天然对照对于人类IgG制剂没有表现出任何亲和力(数据未示出)。对于制剂6)，根据图9很明显，所有荧光探针在相对高的程度并且甚至最高程度结合至刚果红和硫磺素S(相比于所有其他制剂)(图8)。然而，样品6)适度增强tPA/血纤蛋白溶解酶原激活，而9)和12)强烈增强该蛋白酶活性(图9M)。TEM照片分析表明，染料荧光一定程度的增加与多聚体大小的增加正相关。推断出6个荧光数据点(CR，ThT，ThS，Trp，bis-ANS和ANS)一起形成了对于7H2H2期望结合的预测能力。对每个IgG制剂的信号的乘积实际上预测了，样品6)显示为对于杂交瘤克隆体的最适合的配体。当还考虑tPA/血纤蛋白溶解酶原激活时，预测到7H2H2与样品9)和12)的结合稍高。总之，看起来一系列对交叉β结构具有亲和力的荧光染料，即CR，ThT和ThS的结合增加幅度，或蛋白结构中的疏水碎片的探针溶剂暴露，即bis-ANS和ANS，以及Trp残基中的局部环境中的变化，显示为荧光强度增加，预测了杂交瘤IgM克隆体7H2H2是否以高亲和力结合。这些结果清楚地表明，在某种程度上，或者作为天然免疫反应或者作为在暴露于用于免疫接种的四种交叉β抗原中的一种或多种后的适应性反应，小鼠形成对天然折叠的IgG中隐藏或不存在的表位(即暴露于的交叉β结构，或交叉β结构诱导的构象)的免疫反应。概括地说，我们的结果证实，通过选择某种错折叠蛋白或错折叠蛋白组，在小鼠中引发免疫反应，导致产生对指定错折叠蛋白具有明显特异性的亲和区，优先结合至交叉β结构或交叉β介导的暴露构象的某种外观。
在图25C中，示出了在所有测试浓度的7H2H2结合至hIgG-BASE-37℃，与在图25A和B中证实的一致。在100μg/ml，还观察到与天然IgIV Gammagard的一些结合。这可以反映在Gammagard中存在一定百分数的IgIV聚集体，或者这可以显示出所使用的ELISA板的变性条件。阴性对照IgM 2G10一点也不结合。在图25D中，观察到1μg/ml 7H2H2已结合酸变性的小鼠γ-球蛋白(dmIgG-ACID)。在10和100μg/ml，杂交瘤IgM结合所有三种形式的错折叠自身IgG，其中对dmIgG-ACID和dmIgG-BASE在100μg/ml获得最大信号。在100μg/ml，还出现一些与天mIgG的结合。阴性对照IgM 2G10一点也不结合至任何小鼠IgG制剂(未示出)。利用这些结果，清楚地证实了，杂交瘤小鼠IgM 7H2H2不仅特异性地结合至错折叠形式的人类IgG，而且结合至错折叠形式的小鼠自身IgG。这表明，从其选择杂交瘤克隆体7H2H2的小鼠形成了针对自身IgG的自身免疫反应。这可以在用四种不同的非-IgG、非自身错折叠蛋白，即人类合成Aβ、小鸡SAA、人类HbAGE和合成人类血纤蛋白片段的免疫接种试验期间发生。利用7H2H2结合至具有交叉β结构的错折叠小鼠自身IgG的观察结果，将这种杂交瘤IgM指定为类风湿因子抗体。免疫接种实验期间小鼠的疾病和具有特别大量的渗透纤维原细胞的特别大的脾与触发的自身免疫反应同时用包含交叉β结构的不同错折叠蛋白免疫接种的相关。
重组/合成的亲和区
从富集IgIV获得的重组/合成亲和区的产生
本发明披露了用于选择对错折叠蛋白特异性的亲和区的方法和装置，用于诊断和治疗蛋白错折叠和蛋白错折叠疾病。亲和区选自亲和区的任何组合文库，例如天然存在的人类免疫球蛋白(即人类IVIg或IgIV)。如以这种方式获得的那些亲和区类似物例如是通过采用标准技术重组或合成地制备的，这些标准技术对本领域技术人员是已知的，包括蛋白质序列分析、DNA克隆和表达技术。本实施例描述了一种实施方式。以连续步骤：(1)通过蛋白质序列分析获得的氨基酸序列，至少来自重链和轻链的可变区、或至少来自互补决定区1-3(CDR)、或至少来自单个分离的亲和区的重链(HC)的CDR3。(2)合成地制备编码所鉴定的氨基酸序列的DNA序列。作为提取通过蛋白质分析确定的序列的可选替换，可使用这样的序列，其中一个或多个突变被引入，优选在CDR3中，甚至更优选在重链(HC)的CDR3中，以便产生具有变化亲和力的亲和区，优选增大和/或更特异性的亲和力。(3)将该DNA克隆入恰当表达载体中。这样的载体优选已含有编码期望类型免疫球蛋白的恒定区的序列，如为了获得IgG1，IgG2a，IgG2b，IgM，IgA，IgE等。(4)将该载体以任一种方式转导如选择的表达系统中，优选哺乳动物细胞。(5)选择表达该亲和区的细胞。(6)重组地制备的亲和区纯化自来源于培养物上清液的多个细胞或单个细胞。如果将突变引入到原始亲和区序列以优化亲和力，则新制备的亲和区可利用所披露的方法和装置进行再选择。利用甚至增大的亲和区库，这样产生的半合成亲和区，优选在互补决定区中，优选在CDR3中，甚至更优选在HC的CDR3中，优选通过产生半合成文库如噬菌体显示文库来进行(参见下文)。
重组/合成的亲和区的产生
错了人类免疫球蛋白如获自血液的IVIg的集合外，组合文库也可获自任何其他的亲和区组，优选重组亲和区如存在于噬菌体显示文库的那些的组(Winter et al.1994；Hoogenboom，1992，1997，2000，2002，2005)。优选地，这样的文库由与哺乳动物亲和区，优选人类亲和区相关的序列如免疫球蛋白组成。优选地，这样的包含亲和区集合的噬菌体显示文库制备如下(Winter et al.1994，de Kruifet al.1995a，1995b)。首先RNA从B细胞或从包含B细胞的组织提取。随后，制备cDNA。接着，扩增编码可变区的cDNA，克隆入恰当噬菌粒载体中并转化到恰当宿主例如大肠杆菌菌株。以这种方式，亲和区表达(即通过噬菌体显示)为丝状噬菌体表面哈桑的融合蛋白。噬菌体显示文库例如制备自从健康哺乳动物，优选人类、小鼠、大鼠或骆马，或者可选替换地从用错折叠蛋白免疫接种的哺乳动物获得的B细胞。在一种实施方式中，噬菌体显示文库从来自哺乳动物，优选患有特定疾病(优选错折叠疾病例如RA)的人类的B细胞制备。以这种方式，以特定目的制备了亲和区的集合以包含对错折叠蛋白特异性的那些亲和区。例如，小鼠用一种错折叠蛋白或错折叠蛋白选集免疫接种一次或多次(如同实施例20)，B细胞从脾分离并用来制备噬菌体显示文库。在另一实施例中，B细胞从患有特定疾病例如(类风湿性)关节炎的人类分离。制备自这些B细胞的cDNA然后用来制备噬菌体显示文库。以这样的方式，制备的噬菌体显示文库包含对错折叠蛋白(涉及所选错折叠疾病)具有特异性的亲和区。例如，制备的文库具有用于Ig的Fc结构域的亲和区，即如类风湿因子(RF)的亲和区(van Esch et al.2003，ClinExp.Immunol)。以上述的方式，本领域技术人员能够设计和制备具有重点在于特定疾病或应用的亲和区的任何集合的噬菌体显示文库。
具有这样的亲和区结合(其中增加了总组分)的噬菌体显示文库也合成地制备(Hoogenboom，1992，1997，2000，2002，2005；deKruif et al.1995a，1995b)。以这种方式，本领域技术人员能够设计包含相当大的其他多样性的亲和区的文库。最值得注意的是，通过使高变区(干扰抗原的CDR)中的其他序列生效，制得了其他亲和区，使可变结构域再成形。错了从人类序列获得的亲和区之外，本领域技术人员能够从任何其他物种如骆马、骆驼、羊驼或双峰驼(camelid)生成亲和区的集合，从而获得具有与这些物种相关的形成的亲和区，如骆马抗体，也称为纳米体(nanobody)。因而，以多种方式制备了噬菌体显示文库和/或亲和区结合，优选从用一种错折叠蛋白或错折叠蛋白组免疫接种的哺乳动物制备。在一种特别优选的实施方式中，噬菌体显示文库和/或亲和区的集合从患有疾病优选错折叠疾病的哺乳动物制备。对错折叠蛋白特异性的亲和区利用所披露的装置和方法联合用于分离噬菌体的标准程序选自噬菌体显示文库。最简单地，在一个优选实施方式中，制备错折叠蛋白并固定，优选根据本申请中披露的程序的任一种进行，接着允许结合噬菌体。在充分清洗之后，回收结合的噬菌体并通过宿主再感染进行扩增。为了允许仅回收特异性噬菌体，选择程序优选重复若干次。最后，分离那些能够特异性地结合错折叠靶的噬菌体。可替换地，错折叠蛋白分离自从患有疾病的个体或个体组合获得的组织样品。例如，错折叠蛋白利用能够特异性地结合包含交叉β结构的错折叠蛋白的蛋白(如tPA、RAGE或它们的功能等价物(参见表4))从患有(类风湿性)关节炎的患者的滑液中分离出。类推地，可取得任何其他样品。
利用如上所述的方法，获得重组制备的用于错折叠蛋白的亲和区。
在选择恰当噬菌体之后，编码分离亲和区的可变区的DNA优选从噬菌粒DNA中分离，以便产生完全抗体。这易于由本领域技术人员根据标准程序实施。该DNA优选克隆入编码重链和轻链的恒定区的载体中。可使用任何载体和任何期望类型的恒定区。载体以任何已知方式转导入选择的表达系统中，优选哺乳动物。选择表达亲和区的细胞。重组制得的亲和区优选从细胞或细胞来源的培养物上清液纯化。以这样的方式，制备了用于错折叠蛋白的任何免疫球蛋白亲和区(Bloemendal et al 2004；Huls et al 1999a，1999b；Boelet al 2000)。
“嵌合”或“人源化”重组亲和区的产生
对于人类中的应用，从其他物种获得的亲和区优选以非人类序列由人类序列替代(尽可能地)的方式进行修饰，同时优选不过多影响亲和区的结合性能。亲和区还在典型免疫接种方案期间制备，优选利用小鼠或大鼠，甚至更优选利用编码人类免疫球蛋白的转基因小鼠。在免疫接种之后，表达单克隆抗体的杂交瘤细胞系通过标准程序或采用上述噬菌体显示技术进行制备。选择的单克隆抗体能够特异性地与错折叠蛋白相互作用。当利用正常小鼠或大鼠制备时，这样的亲和区的“嵌合”或“人源化”形式例如是通过用相关人类同源区替代非人恒定区和相关非人可变区进行制备的(Morrison et al 1984；Jones et al.1986)。此外，不同恒定区在需要时引入。
基于实施例1-20的总结
用来选择富集用于一种或一组错折叠蛋白，优选对与该错折叠蛋白或错折叠蛋白组相关的特定疾病或健康问题特异性的亲和区的程序(方法或步骤)
在实施例1至9中，我们证实了利用含有包含错折叠蛋白和/或交叉β结构的错折叠蛋白的亲和基质，从亲和区的任何组合物中选出了亲和区，其优先且选择性地以及以增加亲和力地结合至错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白，其不必包括在用于选择的亲和区组中。这些实施例证实了利用带有固定的所选包含交叉β结构的错折叠蛋白的固体载体，我们能够从亲和区的集合中分离那些事实上对任何错折叠蛋白具有亲和力的亲和区。利用HbAGE-、dHSA-、Aβ原纤维-和dIgIV-基质，我们选择了结合dHSA、Aβ原纤维、Aβ非纤维状聚集体、OVA、BSA-AGE、Hb-AGE、错折叠小鼠IgG、瓜氨酸化肽/蛋白、ApoA-I和oxLDL的亲和区。用于富集IgIV组合物的配体的这个列表的多种膜有助于蛋白错折叠疾病的病理，例如Aβ(阿尔茨海默病)、oxLDL和ApoA-I(动脉粥样硬化，淀粉样变性病)、糖化蛋白(淀粉样变性病，末期肾病，糖尿病，RA)、错折叠IgG、瓜氨酸化蛋白(AL淀粉样变性病，RA)。
另外，我们证实了，利用带有纤维状外观的错折叠蛋白以及缺少纤维状特征的错折叠蛋白聚集体，选择的亲和区表现出对包含交叉β结构的错折叠蛋白的宽范围特异性。利用Aβ原纤维-亲和性基质，选择的亲和区对例如错折叠BSA-AGE的非纤维状多聚体、Aβ和dOVA的聚集体显示出亲和力。另一方面，利用非纤维状HbAGE基质或非纤维状错折叠IgIV基质，选择的亲和区有效地结合至Aβ原纤维。
利用牛血清白蛋白-AGE-基质，证实了亲和区对人类Aβ、人类白蛋白和小鸡卵清蛋白具有亲和力。利用人类Aβ-基质，选择了结合糖化牛血清白蛋白和小鸡卵清蛋白的亲和区。利用糖化人类Hb基质，选择了结合至错折叠小鼠IgG的亲和区。这些数据表明，利用起源于一个物种的错折叠蛋白，选择的人类亲和区对起源于其他物种的错折叠蛋白具有亲和力。
总之，我们证实了，从人类IgIV亲和区的集合中，选出了起源于至少四种不同的B细胞克隆体(产生IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型)的亲和区选集，其对于起源于各种物种的宽范围的蛋白表现出结合性能并且在它们的天然折叠中没有实质性氨基酸序列同源性，也没有类似的氨基酸序列长度，也没有重叠或类似的3D结构，虽然其共享错折叠蛋白共有的结构特征。该结构特征可通过各种方式引入到蛋白质结构中，例如但不限于赖氨酸和精氨酸残基的糖化、精氨酸的瓜氨酸化、氨基酸侧链的氧化，以及暴露于低pH、高pH、热、碳水化合物的任何组合(所有都在不同蛋白质浓度下)。所选的对错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白具有特异性的亲和区对于各种各样的应用是很有用的。下文中，将更详细地概述用于针对蛋白错折叠疾病的疗法的富集亲和区。
所披露的器械和方法允许可以选择看用于治疗和/或诊断与蛋白错折叠相关的疾病的亲和区。图26中示出了优选程序的通用特性的概括。所选的任何错折叠蛋白(图26中混合X和Y代表错折叠体)适合用来选择亲和区，但优选地使用指示疾病的错折叠蛋白(图26中的混合A)。由于错折叠蛋白共享共有特性，所以一般地，选择的亲和区结合多于一种的特定错折叠蛋白。然而，如本申请中所披露的，选择的亲和区也可优先结合错折叠蛋白的亚组或甚至单个类型。通过组合一组柱，本领域技术人员能够选择那些可用于治疗和/或诊断通常错折叠或者优先可用于其中指示选择的错折叠蛋白的特定疾病或疾病组的亲和区。如图26中所示，柱I的应用(不必与疾病相关的错折叠蛋白的混合)将导致产生对通常错折叠蛋白具有亲和力的亲和区(制剂I)，即错折叠体。这样的亲和区适合用于诊断以及用于疗法。然而，由于引入患者的亲和区不仅结合疾病相关错折叠蛋白(期望的治疗作用)而其另外结合存在的其他蛋白(非预测的治疗副作用)，所以这样的亲和区用于治疗目的意味着副作用的潜在危险。通过组合柱I和柱II，并且更优选柱II和IV，本领域技术人员选择了那些优先与对疾病或疾病组特异性的错折叠蛋白相互作用。柱IV用来去除那些能够与与所选靶疾病不相关的错折叠蛋白相互作用的亲和区。因此，制剂3和4优先选择用于特定的治疗目的。
表：
Figure A200780013420D01601
Figure A200780013420D01611
Figure A200780013420D01621
Figure A200780013420D01631
表6-11(实施例6-20)
Figure A200780013420D01641
Figure A200780013420D01652
Figure A200780013420D01661
Figure A200780013420D01671
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Claims (66)

1.一种用于从IgIV分子的集合中选择出至少一种包含能够与错折叠蛋白的表位和/或与交叉β结构的表位和/或与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的IgIV分子的方法，所述方法包括使IgIV分子的集合与错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白接触以及收集至少一种包含与所述表位相互作用的亲和区的IgIV分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表位是蛋白的交叉β结构的至少一部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表位在所述包含交叉β结构的蛋白上暴露。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白结合至固体载体。
5.一种IgIV分子的集合，富集包含能够与错折叠蛋白的表位、交叉β结构和/或与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的IgIV分子。
6.根据权利要求5所述的IgIV分子的集合，是通过根据权利要求1-4中任一项所述的方法而被选择出来的。
7.一种组合物，包含至少5种，优选至少8种，更优选至少10种包含能够与错折叠蛋白的表位、交叉β结构和/或与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区的分离的、合成的和/或重组分子。
8.根据权利要求7所述的组合物，包含至少一种IgIV分子的功能部分、衍生物和/或类似物，其中所述IgIV分子包含能够与错折叠蛋白的表位、交叉β结构和/或与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的亲和区。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中，所述分子的至少一种进一步包含交叉β结构结合分子。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的组合物，其中，所述分子的至少一种进一步包含效应分子。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是蛋白酶或其交叉β结构结合部分。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是免疫增强化合物，优选细胞因子。
13.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是补体激活因子。
14.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是清除信号，至少优选Fc结构域的部分。
15.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是炎症抑制性化合物，优选补体抑制因子。
16.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是交叉β结合结合增强因子。
17.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是调理化合物。
18.根据权利要求7-17中任一项所述的组合物，其中，所述分离的、合成的和/或重组分子是调理化合物。
19.一种用于制备根据权利要求7-18中任一项所述的组合物的方法，包括定义至少一种能够与错折叠蛋白的表位、交叉β结构和/或与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用的IgIV分子的亲和区的氨基酸序列，以及制备包含所述氨基酸序列的分离的、合成的和/或重组分子。
20.一种用于从根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、或者从根据权利要求7-18中任一项所述的组合物中选择出包含亲和区的分子的方法，其中所述亲和区通过与错折叠蛋白或交叉β结构的表位和/或通过与包含交叉β结构的蛋白的表位相互作用能够通过吞噬细胞诱导所述交叉β结构和/或蛋白的调理作用，所述方法包括：
使根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、或者根据权利要求7-18中任一项所述的组合物与错折叠蛋白、交叉β结构和/或与包含交叉β结构的蛋白接触；
使包括结合至IgIV分子和/或分离的、合成的和/或重组分子的错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的任何复合体与吞噬细胞接触；以及
收集能够诱导或增强所述错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白通过吞噬细胞的吞噬作用的IgIV分子和/或分离的、合成的和/或重组分子。
21.根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的作为药物的组合物。
22.根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物在制备用于至少部分预防和/或治疗错折叠蛋白和/或交叉β结构相关和/或有关的疾病、血液凝固障碍、败血症和/或微生物/病原体/细菌/寄生虫/病毒感染的药物中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用，其中，所述微生物/病原体/细菌/寄生虫/病毒感染包括HIV相关的机会性感染。
24.一种用于增加个体的细胞外蛋白降解和/或蛋白清除的方法，包括对所述个体给予根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物。
25.一种用于至少部分地抑制个体的错折叠蛋白和/或交叉β结构介导的作用的方法，包括对所述个体给予有效量的根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物。
26.一种用于至少部分地预防和/或治疗个体的错折叠蛋白和/或交叉β结构相关的和/或有关的疾病、血液凝固障碍、败血症和/或微生物/病原体/细菌/寄生虫/病毒感染的方法，包括对所述个体给予根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物。
27.一种用于至少部分地预防和/或治疗个体的HIV相关的机会性感染的方法，包括对所述个体给予根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物。
28.一种组合物，包括：
根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合；和/或
根据权利要求7-18中的任一项所述的组合物，以及
合适的载体、稀释剂和/或赋形剂。
29.根据权利要求28所述的组合物，进一步包含交叉β结构结合化合物。
30.根据权利要求28或29所述的组合物，进一步包含交叉β结构结合增强化合物。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，进一步包括补体激活化合物。
32.根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，进一步包含免疫增强化合物、炎症抑制性化合物、和/或补体抑制化合物。
33.根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物在抑制蛋白质诱导的血小板聚集中的应用。
34.根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物在组织型血纤蛋白溶解酶原激活剂(tPA)与错折叠蛋白、交叉β结构和/或与包含交叉β结构的分子的竞争性结合中的应用。
35.一种用于至少部分地从样品中去除错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的方法，所述方法包括使样品与根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物接触，以及从所述样品中去除结合至IgIV分子和/或分离的、合成的和/或重组分子的错折叠蛋白、和/或交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的复合体。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述样品是流体样品。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述流体包括体液。
38.根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述流体包括药物或者其任何组分。
39.根据权利要求35或36所述的方法，其中，所述流体包括食物。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中，所述IgIV分子的集合和/或组合物结合至固体载体。
41.一种诊断试剂盒，包括：
能够与错折叠蛋白、与交叉β结构和/或与包含交叉β结构的蛋白相互作用的根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合的至少一个亲和区、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物的至少一个亲和区；以及
使所述错折叠蛋白和/或所述交叉β结构和/或所述蛋白与所述亲和区的相互作用可视化的方式。
42.根据权利要求41所述的诊断试剂盒，其中，所述错折叠蛋白和/或所述交叉β结构包含疾病相关的错折叠蛋白和/或交叉β结构。
43.一种用于确定错折叠蛋白、和/或包含交叉β结构的蛋白和/或肽是否存在于包含蛋白的含水溶液的方法，所述方法包括：
使所述含水溶液与根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或与根据权利要求7-18中任一项所述的组合物接触；以及
检测是否存在结合的错折叠蛋白、和/或包含交叉β结构的蛋白和/或肽。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述含水溶液包括去污剂、食品制品、食品补充剂、细胞培养基、用于研究目的的商业可利用蛋白溶液、血液、血液制品、脊液、滑液、淋巴液、化妆品、细胞、药物组合物或其包含蛋白的任何组分、或者这些的任何组合。
45.一种用于从药物组合物或其包含蛋白的任何组分中去除错折叠蛋白、交叉β结构和/或包含交叉β结构的蛋白的方法，所述方法包括：
使所述药物组合物或其包含蛋白的任何组分与根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或与根据权利要求7-18中任一项所述的组合物接触；
允许所述错折叠蛋白、和/或包含交叉β结构的蛋白和/或肽与所述IgIV分子的集合和/或组合物结合；以及
从所述药物组合物或其包含蛋白的任何组分中分离结合的包含交叉β结构的蛋白和/或肽。
46.一种用于降低和/或预防不期望的药物组合物的副作用和/或增加每克蛋白的特异性活性的方法，所述方法包括利用根据权利要求45所述的方法从所述药物组合物或其任何组分中去除未折叠蛋白、未折叠肽、错折叠蛋白、变性蛋白、聚集蛋白、聚集肽、多聚蛋白和/或多聚肽、和/或包含交叉β结构的蛋白。
47.一种药物组合物或其包含蛋白的任何组分，通过根据权利要求45或46所述的方法获得。
48.根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物在消除错折叠蛋白和/或包含交叉β结构的蛋白的蓄集中的应用。
49.根据权利要求48所述的应用，其中，所述错折叠蛋白和/或交叉β结构参与构象病。
50.根据权利要求49所述的应用，其中，所述疾病是淀粉样变性病类型疾病、动脉粥样硬化、糖尿病、出血、血栓症、癌症、败血症和其他炎性疾病、类风湿性关节炎、传染性海绵状脑病、多发性硬化、自身免疫疾病、与记忆丧失有关的疾病或帕金森病以及其他神经疾病(癫痫)、脑病、和/或关节炎、和/或类风湿性关节炎。
51.根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物在确定蓄积沉积的错折叠蛋白或具有交叉β结构的蛋白的存在中的应用，优选涉及构象疾病。
52.一种用于实施根据权利要求35-40、或45-46中任一项所述的方法的分离装置，所述设备包括用于运送(循环)流体的系统，所述系统设置有用于连接至流动流体，优选连接至个体血液循环的器械，以使流体进入所述系统并使流体从所述系统返回，优选至个体的血液循环，所述系统进一步包括固体相，所述固体相包括根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-19中任一项所述的组合物。
53.根据权利要求52所述的设备，其是一种透析设备。
54.一种用于干扰血液凝固的方法，包括向血液提供根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物。
55.一种用于确定组合物，优选确定药剂和/或疫苗中的错折叠蛋白和/或交叉β结构的量的方法，包括：
使所述组合物与根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合、和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物接触；以及
使结合的错折叠蛋白和/或交叉β结构的量与存在于所述组合物中的交叉β结构的量相关联。
56.一种用于确定参考样品中蛋白的交叉β结构含量相比于试验样品中所述蛋白的交叉β结构含量的差异的方法，其中，所述试验样品经过预期对所述蛋白的交叉β结构含量具有影响的处理，所述方法包括：
利用根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物，确定参考样品中蛋白的交叉β结构含量；
使所述蛋白经过预期对所述蛋白的交叉β结构含量具有影响的处理，由此获得试验样品；
利用根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物，确定所述获得的试验样品中的所述蛋白的交叉β结构含量；以及
确定所述参考样品中所述蛋白的交叉β结构含量是否显著不同于所述试验样品中所述蛋白的交叉β结构含量。
57.一种用于确定样品中错折叠蛋白、交叉β结构或包含交叉β结构的蛋白的同一性的方法，所述方法包括：
使所述样品与根据权利要求5或6所述的IgIV分子的集合，和/或根据权利要求7-18中任一项所述的组合物接触，得到了结合的错折叠蛋白、交叉β结构和/或结合的包含交叉β结构的蛋白；以及
鉴定结合的错折叠蛋白、结合的交叉β结构和/或结合的包含交叉β结构的蛋白。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述样品包括含水溶液，优选体液。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中，使用来源于健康个体的体液以及来自患有或怀疑患有与交叉β结构存在相关和/或有关的疾病的个体的体液。
60.根据权利要求57-59任一项所述的方法，其中，使用来自患有或处于患有AL淀粉样变性病和/或关节炎危险的个体的样品。
61.一种能够特异性地结合至表9示出的化合物和/或能够消除表9示出的化合物的量和/或活性的用作药物的化合物。
62.能够特异性地结合至表9示出的化合物，和/或能够消除表9示出的化合物的量和/或活性的化合物在制备对抗错折叠蛋白相关和/或有关疾病、血液凝固障碍、败血症和/或微生物/病原体/细菌/寄生虫/病毒感染的药物中的应用。
63.根据权利要求51或62所述的应用，其中，所述疾病包括AL淀粉样变性病和/或关节炎。
64.一种治疗患有或处于患有错折叠蛋白相关和/或有关疾病、血液凝固障碍、败血症和/或微生物/病原体/细菌/寄生虫/病毒感染危险的对象的方法，包括给予所述个体一种能够特异性地结合至表9示出的化合物和/或能够消除表9示出的化合物的量和/或活性的化合物。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述疾病包括AL淀粉样变性病和/或关节炎。
66.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述效应分子是错折叠的抑制剂。
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