CN111518008B - 用于测定维生素d的含量或存在的化合物、产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式I所示的化合物，其可以用于测定含有维生素D分析物(包括维生素D2和维生素D3)及其代谢物的样品中其存在或量。本发明还涉及用于测定样品中维生素D的存在或含量的产品、方法和复合物。

Description

用于测定维生素D的含量或存在的化合物、产品和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测确定含有维生素D分析物(包括维生素D2和维生素D3)及其代谢物的样品中其存在或量的化合物、产品和方法。
背景技术
维生素D是一种脂溶性类固醇激素原，它有两种主要形式：维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。维生素D2是从营养补充剂中获得，而维生素D3来源于暴露在太阳光(紫外线辐射)照射下的皮肤以及主要从鱼、肝油和蛋黄等饮食中获得。维生素D2和D3在肝脏中代谢成25-OH维生素D(25-(OH) D)，然后在肾脏中转变为1，25-(OH)2D。25-(OH)D是循环中的主要代谢产物，因此，25-(OH)D值可以反映维生素D在体内的水平。血液中的维生素D以蛋白结合形式存在。临床检验报告上血液中维生素D是指25-(OH)D总和，包括 25-(OH)D2和25-(OH)D3。总25-OH维生素D水平的准确监测是临床应用的关键。
维生素D在维持骨矿物质密度中起重要作用,它与甲状旁腺激素(PTH)在钙的平衡中起着关键性作用。维生素D缺乏严重影响人体钙磷的吸收，可能导致佝偻病、新生儿低血钙、甲状腺功能减退、中老年人骨质疏松、等多种钙代谢异常疾病。维生素D过量会导致高钙血症及多种衰老相关疾病。
维生素D存在于几乎所有的人体组织，其作用不仅仅是维持钙和磷的平衡。研究表明，维生素D是通过与维生素D受体(VDR)结合发挥作用，最近的流行病学研究，发现维生素D和多种疾病有关—癌症，心脏疾病，高血压，糖尿病，自身免疫性疾病，感染性疾病和衰老。
目前市面上的25-OH维生素D检测方法主要有放射免疫法(RIA)，液相色谱-串联质谱法(LC-MS)、酶联免疫方法(ELISA)和化学发光方法(CLIA)。其中化学发光法以其灵敏度高，线性范围宽，操作方便，无污染等优势成为发展趋势。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种用于检测含有维生素D分析物(包括维生素D2和维生素D3)及其代谢物的样品中其存在或量的组合物、产品和方法。
为了实现上述目的，在第一个方面，本发明提供了式I所示的化合物。
Figure BDA0001966682790000021
其中，Z选自C1-C20烷基、C2-C20烯基和C2-C20炔基，所述烷基、烯基和炔基任选地被选自羟基、C1-C10烷氧基、C1-C10酯基和肟基的一个或多个取代基取代；
R1选自氢、羟基、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、 C2-C20烯氧基和C2-C20炔氧基；
R2和R3相同或不同，独立选自氢和C1-C20烷基；
R为至少被R1取代的C6-C30芳基、C5-C30杂芳基或C9-C30稠芳基，
R1为-(CH2)pX或-(CH2)pCOX，其中X选自标记部分、生物大分子部分、连接有标记部分或生物大分子部分的N-马来酰亚胺基、信号产生体系的成员、有机小分子以及所述有机小分子的结合配体或载体，p是0-10的整数，其中所述标记部分衍生自标记化合物，所述生物大分子部分衍生自生物大分子。
在本发明的一些实施方式中，Z选自C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，所述烷基、烯基和炔基任选地被选自羟基、C1-C10烷氧基、C1-C10酯基和肟基的一个或多个取代基取代。
在上述的一些实施方式中，Z选自C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地被选自羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5酯基和肟基的一个或多个取代基取代。
在上述的一些实施方式中，Z为带有支链的C4-C10烷基、带有支链的C4-C10烯基或带有支链的C4-C20炔基。
在上述的一些实施方式中，所述带有支链的C4-C10烷基、带有支链的C4-C10烯基或带有支链的C4-C20炔基的末端碳原子连接有羟基或受保护的羟基。
在上述的一些实施方式中，Z为4,4-二甲基-4-羟基丁基，具有如下结构：
Figure BDA0001966682790000031
在上述的一些实施方式中，R1选自氢、羟基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基和C1-C10烷氧基。
在上述的一些实施方式中，R2和R3独立选自氢和C1-C10烷基，优选选自氢和C1-C5烷基。
在上述的一些实施方式中，所述有机小分子选自生物素、荧光素、罗丹明、化学发光分子、二硝基苯酚、吖啶酯、碱性磷酸酶和标记化合物分子，所述有机小分子的结合配体选自抗生物素蛋白、荧光素的抗体、罗丹明的抗体、化学发光分子的抗体和二硝基苯酚的抗体。
在上述的一些实施方式中，所述信号产生体系的成员选自荧光化合物、化学发光化合物、增敏剂、酶和放射性标记物。
在上述的一些实施方式中，所述信号产生体系的成员包含颗粒。
在上述的一些实施方式中，所述颗粒选自荧光颗粒、化学发光颗粒、增敏剂颗粒和磁性颗粒。
在上述的一些实施方式中，所述生物大分子选自蛋白质分子、核酸分子、多糖分子和脂类分子。
在上述的一些实施方式中，所述有机小分子的结合配体选自维生素D及其类似物的抗体。
在上述的一些实施方式中，p为0、1、2、3、4或5。
在上述的一些实施方式中，R为至少被R1取代的C6-C20芳基、C5-C20杂芳基或C9-C20稠芳基。
在上述的一些实施方式中，R为至少被R1取代的C6-C10芳基、C5-C10杂芳基或C9-C10稠芳基，例如至少被R1取代的苯基、至少被R1取代的吡啶基、至少被 R1取代的喹啉基或至少被R1取代的异喹啉基。
在上述的一些实施方式中，所述化合物具有式II或式III所示的结构：
Figure BDA0001966682790000041
式II中，R2-R5相同或不同，独立选自氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、C6-C20芳基、C5-C20杂芳基、C9-C20稠芳基、氰基、卤原子、硝基、羧基、氨基和C1-C10烷基取代的氨基；
式III中，R2-R6相同或不同，独立选自氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、C6-C20芳基、C5-C20杂芳基、C9-C20稠芳基、氰基、卤原子、硝基、羧基、氨基和C1-C10烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式II中，R2-R5独立选自氢、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C1-C10烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式III中，R2-R6独立选自氢、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C1-C10烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式II中，R2-R5独立选自氢、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式III中，R2-R6独立选自氢、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
本发明在第二个方面提供了一种用于测定样品中维生素D的存在和/或量的产品，其包括以下组分：
1)上述的式I所示的化合物，和
2)维生素D的特异性结合成员。
根据上述的一些实施方式，所述产品为组合物或试剂盒。
根据上述的一些实施方式，所述样品为生物样品或非生物样品。
根据上述的一些实施方式，所述维生素D的特异性结合成员为维生素D的抗体及其维生素D的抗体偶联的配体。
本发明在第三个方面提供了上述的用于测定样品中维生素D的存在和/或量的产品在检测样品中维生素D的存在和/或量中的应用。
本发明在第四个方面提供了用于测定样品中维生素D的存在和/或量的方法，包括以下步骤：
1)提供本发明第二个方面提供的产品；
2)使维生素D的特异性结合成员与式I所示的化合物形成复合物；
3)测量所述复合物的量，所述复合物的量与所述样品中维生素D的存在和/ 或量有关。
本发明在第五个方面提供了一种复合物，其由本发明第一个方面提供的式I 所示的化合物与维生素D的特异性结合成员形成。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
I.术语
术语“烷基”是指直链的、支链的或环状的具有指定碳原子数的那些烷基。烷基的示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、降冰片基等。
术语“烯基”是指直链的或支链的具有指定碳原子数和至少一个碳碳双键的烃链，所述碳碳双键可以出现在沿着链的任何位点。烯基的示例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、二甲基戊烯基等。
术语“炔基”是指含有至少一个碳碳叁键的具有指定碳原子数的直链或直链烃。炔基的示例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基等。
“芳基”包括具有芳香性的基团，包括“共轭的”或多环体系，所述多环体系含有至少一个芳香环且在其环形结构中不含任何杂原子。其实例包括苯基、苄基、1,2,3,4-四氢萘基等。
“杂芳基”是指如上所定义的芳基，只是在环结构中具有1-4个杂原子，其还可以被称为“芳杂环”或“杂芳族化合物”。如本文所使用的，术语“杂芳基”是指包括稳定的5、6或7元单环或7、8、9、10、11或12元由碳原子和一个或多个杂原子构成的双环芳族杂环，例如1或1-2或1-3或1-4或1-5或1-6个杂原子，或者例如1、2、3、4、5或6个杂原子，所述杂原子独立地选自氮、氧和硫。氮原子可以被取代或不被取代(即，N或NR，其中R是氢或是如本文定义的其它取代基)。氮和硫杂原子可任选被氧化(即，N→O和S(O)p，其中p＝1或2)。但是应当注意的是，芳族杂环中硫和氧原子的总数不超过1。
杂芳基基团的例子包括吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、恶唑、异恶唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。
术语“羧基”是指-COOH或其C1-C6烷基酯。
术语“酯基”是指含有键连到与羰基上的碳键连的氧原子的碳原子或杂原子的化合物或片段。术语“酯”包括烷氧羰基基团，如甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、丁氧羰基、戊氧羰基等。
术语烷氧基包括与氧原子共价键连的取代和未取代的烷基。烷氧基的例子包括，但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基等。术语烯氧基包括与氧原子共价键连的取代和未取代的烯基。烯氧基的例子包括，但不限于乙烯氧基、丙烯氧基、丁烯氧基和戊烯氧基等。术语“炔氧基”包括与氧原子共价键连的取代和未取代的炔基。炔氧基的例子包括，但不限于乙炔氧基、丙炔氧基、丁炔氧基和戊炔氧基等。
本文所使用的“胺”或“氨基”是指未取代的或取代的-NH2。“烷基氨基”包括其中-NH2的氮原子同至少一个烷基基团键连的化合物的基团。烷基氨基的例子包括苄基氨基、甲氨基、乙氨基、苯乙基氨基等。“二烷基氨基”包括其中-NH2的氮原子同至少两个烷基基团键连的基团。二烷基氨基的例子包括，但不限于二甲氨基和二乙基氨基。“芳氨基”和“二芳氨基”包括其中氮原子同至少一个或两个芳基分别键连的基团。“氨基芳基”和“氨基芳氧基”指氨基取代的芳基、芳氧基。“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”或“芳基氨基烷基”是指同至少一个烷基基团和至少一个芳基基团键连的氨基。“烷基氨基烷基”是指同氮原子键连的烷基、烯基或炔基基团，所述氮原子还与烷基键连。“酰氨基”包括其中氮原子与酰基基团键连的基团。酰氨基的例子包括，但不限于烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基。
“芳基”包括具有芳香性的基团，包括“共轭的”或多环体系，所述多环体系含有至少一个芳香环且在其环形结构中不含任何杂原子。其实例包括苯基、苄基、1,2,3,4-四氢萘基等。
“杂芳基”是指如上所定义的芳基，只是在环结构中具有1-4个杂原子，其还可以被称为“芳杂环”或“杂芳族化合物”。如本文所使用的，术语“杂芳基”是指包括稳定的5、6或7元单环或7、8、9、10、11或12元由碳原子和一个或多个杂原子构成的双环芳族杂环，例如1或1-2或1-3或1-4或1-5或1-6个杂原子，或者例如1、2、3、4、5或6个杂原子，所述杂原子独立地选自氮、氧和硫。氮原子可以被取代或不被取代(即，N或NR，其中R是氢或是如本文定义的其它取代基)。氮和硫杂原子可任选被氧化(即，N→O和S(O)p，其中p＝1或2)。但是应当注意的是，芳族杂环中硫和氧原子的总数不超过1。
杂芳基基团的例子包括吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、恶唑、异恶唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶等。
此外，术语“芳基”和“杂芳基”包括多环芳基和杂芳基基团，例如，三环、双环，例如，萘、苯并恶唑、苯并二恶唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲二氧基苯基、喹啉、异喹啉、萘啶基、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、脱氮嘌呤、吲哚嗪。
环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基环可以在一个或多个环位置(例如，成环碳原子或杂原子，如氮原子)被取代基取代，所述取代基如上文所述，例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷氧基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、烷基氨基羰基、芳基烷基氨基羰基、烯基氨基碳酰基、烷基羰基、芳基羰基、芳基烷基、烯基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷硫基羰基、磷酸酯、膦酸根合、次膦酸根合、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基，或芳族或杂芳族片段。芳基和杂芳基基团也可以与非芳族的脂环族环或杂环稠合或桥连，以形成一个多环体系 (例如，四氢化萘，亚甲基二氧基苯基)。
术语“肟基”是指-C＝N-OH。
II.具体实施方案
下面将更详细地说明本发明。
为了实现上述目的，在第一个方面，本发明提供了一种式I所示的化合物。
Figure BDA0001966682790000091
其中，Z选自C1-C20烷基、C2-C20烯基和C2-C20炔基，所述烷基、烯基和炔基任选地被选自羟基、C1-C10烷氧基、C1-C10酯基和肟基的一个或多个取代基取代；
R1选自氢、羟基、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、 C2-C20烯氧基和C2-C20炔氧基；
R2和R3相同或不同，独立选自氢和C1-C20烷基；
R为至少被R1取代的C6-C30芳基、C5-C30杂芳基或C9-C30稠芳基，
R1为-(CH2)pX或-(CH2)pCOX，其中X选自标记部分、生物大分子部分、连接有标记部分或生物大分子部分的N-马来酰亚胺基、信号产生体系的成员、有机小分子以及所述有机小分子的结合配体或载体，p是0-10的整数，例如1-5的整数，其中所述标记部分衍生自标记化合物，所述生物大分子部分衍生自生物大分子。
在本发明的一些实施方式中，Z选自C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，所述烷基、烯基和炔基任选地被选自羟基、C1-C10烷氧基、C1-C10酯基和肟基的一个或多个取代基取代。例如，Z为羟基取代的C1-C10烷基。例如Z为C1-C10烷氧基取代的C1-C10烷基。例如，Z为羟基取代的C2-C10烯基。例如Z为C1-C10烷氧基取代的C2-C10烯基。
在上述的一些实施方式中，Z选自C1-C10烷基、C2-C10烯基和C2-C10炔基，所述烷基、烯基或炔基任选地被选自羟基、C1-C5烷氧基、C1-C5酯基和肟基的一个或多个取代基取代。例如，Z为羟基取代的C1-C5烷基。例如Z为C1-C5烷氧基取代的C1-C5烷基。例如，Z为羟基取代的C2-C5烯基。例如Z为C1-C5烷氧基取代的C2-C5烯基。
在上述的一些实施方式中，Z为带有支链的C4-C10烷基、带有支链的C4-C10烯基或带有支链的C4-C20炔基。例如，所述支链选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。所述支链的个数可以是一个或多个。
在上述的一些实施方式中，所述带有支链的C4-C10烷基、带有支链的C4-C10烯基或带有支链的C4-C20炔基的末端碳原子连接有羟基或受保护的羟基。例如，所述支链选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。所述支链的个数可以是一个或多个。
在上述的一些实施方式中，Z为4,4-二甲基-4-羟基丁基，其具有如下结构：
Figure BDA0001966682790000101
在上述的一些实施方式中，R1选自氢、羟基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基和C1-C10烷氧基。优选地，R1可以是氢、羟基、C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或C1-C5烷氧基等。例如R1是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，R2和R3独立选自氢和C1-C10烷基，优选选自氢和C1-C5烷基。例如，R2和R3均为氢。例如，R2为C1-C5烷基，R3为氢。例如， R2和R3均为甲基。例如R2是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。例如R3是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，R为至少被R1取代的C6-C20芳基、C5-C20杂芳基或C9-C20稠芳基。
在上述的一些实施方式中，R为至少被R1取代的C6-C10芳基、C5-C10杂芳基或C9-C10稠芳基。
在上述的一些实施方式中，R为至少被R1取代的苯基、吡啶、喹啉或异喹啉。
在上述的其他一些实施方式中，X为信号产生体系的成员。
在上述的其他一些实施方式中，X为有机小分子。
在上述的其他一些实施方式中，X为所述有机小分子的结合配体或载体。
在上述的一些实施方式中，所述有机小分子选自生物素、荧光素、罗丹明、化学发光分子、二硝基苯酚、吖啶酯、碱性磷酸酶和标记化合物分子，所述有机小分子的结合配体选自抗生物素蛋白、荧光素的抗体、罗丹明的抗体、化学发光分子的抗体和二硝基苯酚的抗体。
在上述的一些实施方式中，所述信号产生体系的成员选自荧光化合物、化学发光化合物、增敏剂、酶和放射性标记物。
在上述的一些实施方式中，所述信号产生体系的成员包含颗粒。优选地，所述颗粒选自荧光颗粒、化学发光颗粒、增敏剂颗粒和磁性颗粒。
在上述的一些实施方式中，所述有机小分子的结合配体选自维生素D及其类似物的抗体。
在上述的一些实施方式中，所述生物大分子选自蛋白质分子、核酸分子、多糖分子和脂类分子。
在上述的其他一些实施方式中，R1为-(CH2)pX，例如-(CH2)X。X可以为生物大分子部分或连接有生物大分子部分的N-马来酰亚胺基。所述生物大分子例如为生物素聚乙二醇氨基(分子量可以大于1道尔顿，例如在2-100道尔顿之间，例如在2-80道尔顿之间)或者牛血清白蛋白(BSA)。
在上述的其他一些实施方式中，R1为-(CH2)pCOX，例如-CH2COX。X可以为生物大分子部分或连接有生物大分子部分的N-马来酰亚胺基。所述生物大分子例如为生物素聚乙二醇氨基(分子量可以大于1道尔顿，例如在2-100道尔顿之间，例如在2-80道尔顿之间)或者牛血清白蛋白(BSA)。
在上述的一些实施方式中，p为0、1、2、3、4或5。
例如至少被R1取代的苯基、至少被R1取代的吡啶基、至少被R1取代的喹啉基或至少被R1取代的异喹啉基。
在上述的一些实施方式中，所述化合物具有式II或式III所示的结构：
Figure BDA0001966682790000121
式II中，R2-R5相同或不同，独立选自氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、C6-C20芳基、C5-C20杂芳基、C9-C20稠芳基、氰基、卤原子、硝基、羧基、氨基和C1-C10烷基取代的氨基；
式III中，R2-R6相同或不同，独立选自氢、C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、C6-C20芳基、C5-C20杂芳基、C9-C20稠芳基、氰基、卤原子、硝基、羧基、氨基和C1-C10烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式II中，R2-R5独立选自氢、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C1-C10烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式III中，R2-R6独立选自氢、C1-C10烷基、C1-C10烯基、C1-C10炔基、C1-C10烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式II中，R2-R5独立选自氢、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式III中，R2-R6独立选自氢、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。
在上述的一些实施方式中，式II中和/或式III中，R2选自氢、C1-C5烷基、 C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。例如，R2为氢。例如，R2为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，式II中和/或式III中，R3选自氢、C1-C5烷基、 C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。例如，R3为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，式II中和/或式III中，R4选自氢、C1-C5烷基、 C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。例如，R4为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，式II中和/或式III中，R5选自氢、C1-C5烷基、 C1-C5烯基、C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。例如，R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，式III中，R6选自氢、C1-C5烷基、C1-C5烯基、 C1-C5炔基、C1-C5烷氧基、氰基、卤原子、硝基、氨基和C1-C5烷基取代的氨基。例如，R5为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
在上述的一些实施方式中，
本发明式I所示的化合物的具体实例包括但不限于如下化合物：
Figure BDA0001966682790000141
Figure BDA0001966682790000151
本发明在第二个方面提供了一种用于测定样品中维生素D的存在和/或量的产品，其包括以下组分：
1)根据上述的式I所示的化合物，和
2)维生素D的特异性结合成员。
根据上述的一些实施方式，所述产品为组合物或试剂盒。
根据上述的一些实施方式，所述样品为生物样品或非生物样品。
根据上述的一些实施方式，所述维生素D的特异性结合成员为维生素D的抗体及其维生素D的抗体偶联的配体。
本发明在第三个方面提供了上述的用于测定样品中维生素D的存在和/或量的产品在检测样品中维生素D的存在和/或量中的应用。
本发明在第四个方面提供了用于测定样品中维生素D的存在和/或量的方法，包括以下步骤：
1)提供上述的式I所示的化合物；
2)使维生素D的特异性结合成员与式I所示的化合物形成复合物；
3)测量所述复合物的量，所述偶联物的量与所述样品中维生素D的存在和/ 或量有关。
本发明在第五个方面提供了一种复合物，其由上述的式I所示的化合物与维生素D的特异性结合成员形成。
Ⅲ.实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
试剂和仪器：
合成例1
合成含N-马来酰亚胺基芳基取代的维生素D的衍生物
称取化合物125-(OH)VD3 50mg，溶解于2.5mL无水DMSO中，配制成 20mg/mL的溶液。取4mL离心管，加入1.25mL的25-(OH)VD3(62.4umol)，按照摩尔比1.2:1(PMPI：25-(OH)VD3)加入16.04mgPMPI(对-马来酰胺亚胺基苯基异氰酸酯)(74.88umol)，室温搅拌3h。向反应液中加入饱和的氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，用无水Na2SO4干燥，旋干，经过薄层色谱层析纯化得到 15mg化合物2，收率39％。1HNMR(300MHz,CDCl3):0.56(s,3H,Me),0.90(d,3H,Me,J＝5.8Hz),0.79–2.46(several m,19H),1.25(s,6H,Me),2.62(dd,1H,J＝13.5,3.2Hz),2.75(d,1H,J＝11.2Hz),3.35(dd,2H,J＝11.5,6.1Hz),3.65(s,1H,OH),3.67 (t,2H,J＝5.7Hz),4.85–5.01(m,1H,H3),5.06(dd,2H,CH2),6.04and 6.22(2d,2H, CH,J＝11.2Hz),6.95(d,1H,CH),7.00(d,1H,CH)，7.25–7.62(m,4H,ArH)， 9.0(s,1H,NH).
Figure BDA0001966682790000171
合成例2
合成含N-马来酰亚胺基芳基取代的维生素D的标记物
称取10mg SHPEGnBiotin(5kD)(2umol)，溶解于0.02M PBS(0.15M NaCl， 25mMEDTA)pH 7.2的缓冲溶液中，按照摩尔比2:1加入2.4mg(4umol)化合物2，室温搅拌2h。经过脱盐柱纯化，冻干，得到化合物3冻干粉12mg。
Figure BDA0001966682790000172
合成例3
合成含氯甲基芳基取代的维生素D的衍生物
称取化合物1 25-(OH)VD3 50mg，溶解于2.5mL无水DMSO中，配制成20 mg/mL的溶液。取2mL离心管，加入1.25mL的25-(OH)VD3(62.4umol)DMSO 溶液，按照摩尔比3:1加入31.37mg 4-(氯甲基)苯基异氰酸酯(187.2umol)，室温搅拌3h，向反应液中加入饱和的氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，用无水 Na2SO4干燥，旋干，经过柱层析纯化得到12.5mg化合物4，产率35％。
1HNMR(300MHz,CDCl3):0.54(s,3H,Me),0.88(d,3H,Me,J＝5.8Hz), 0.76–2.51(several m,19H),1.30(s,6H,Me),2.55(dd,1H,J＝12.6,3.3Hz),2.64(d,1H, J＝10.9Hz),3.23(dd,2H,J＝10.5,5.8Hz),3.43(s,1H,OH),3.54(t,2H,J＝4.6Hz), 4.65(s,2H,CH2),4.74–4.97(m,1H,H3),5.03(dd,2H,CH2),5.95and 6.11(2d,2H,CH, J＝11.2Hz)，7.41–7.68(m,4H,ArH)，8.5(s,1H,NH).
Figure BDA0001966682790000181
合成例4
合成含氯甲基芳基取代的维生素D的标记物
称取10mg NH2PEGnBiotin(5kD)(2umol)，溶解于0.02M PBS(0.15M NaCl， 25mMEDTA)pH 7.2的缓冲溶液中，按照摩尔比2:1加入2.27mg(4umol)化合物4，37℃搅拌16h。经过脱盐柱纯化，冻干，得到化合物5冻干粉14mg。
Figure BDA0001966682790000182
合成例5
合成含氯甲基杂芳基取代的维生素D的衍生物
称取化合物1 25-(OH)VD3 50mg，溶解于2.5mL无水DMSO中，配制成20 mg/mL的溶液。取4mL离心管，加入1.25mL的25-(OH)VD3(62.4umol)DMSO 溶液，按照摩尔比3:1加入40.92mg 8-(氯甲基)-5-异氰酸基喹啉(187.2umol)，室温搅拌3h，向反应液中加入饱和的氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，用无水 Na2SO4干燥，旋干，经过柱层析纯化得到20mg化合物6，产率52％。
1HNMR(300MHz,CDCl3):0.57(s,3H,Me),0.89(d,3H,Me,J＝6.3Hz), 0.73–2.49(several m,19H),1.33(s,6H,Me),2.57(dd,1H,J＝12.4,3.6Hz),2.67(d,1H, J＝11.3Hz),3.25(dd,2H,J＝10.1,6.2Hz),3.46(s,1H,OH),3.58(t,2H,J＝4.7Hz), 4.64(s,2H,CH2),4.70–4.94(m,1H,H3),5.05(dd,2H,CH2),5.97and 6.15(2d,2H, CH,J＝10.3Hz)，7.62–9.01(m,5H,ArH)，8.7(s,1H,NH).
Figure BDA0001966682790000191
合成例6
合成含氯甲基杂芳基取代的维生素D的标记物
称取10mg NH2PEGnBiotin(5kD)(2umol)，溶解于0.02M PBS(0.15M NaCl， 25mMEDTA)pH 7.2的缓冲溶液中，按照摩尔比2:1加入2.48mg(4umol)化合物6，37℃搅拌16h。经过脱盐柱纯化，冻干，得到化合物7冻干粉13mg。
Figure BDA0001966682790000201
合成例7
合成含琥珀酸基取代的维生素D的标记物
取2mL的离心管，称取2mg化合物8_25-羟基维生素D3半琥珀酸酯，溶解于1mL无水DMSO中，加入1.9mg EDAC，2.3mg的NHS，室温搅拌1h。
称取10mg NH2PEGnBiotin(5kD)(2umol)，溶解于0.02MPBS(0.15M NaCl， 25mMEDTA)pH 7.2的缓冲溶液中，按照摩尔比2:1加入活化的25-羟基维生素 D3琥珀酸酯，室温搅拌2h。经过脱盐柱纯化，得到化合物9。
Figure BDA0001966682790000202
合成例8
合成BSA与和芳基取代的维生素D的偶联物
取2mL离心管，加入1mL 10mg/mL的BSA(0.02M PBS，pH7.2，25mM EDTA)缓冲液，加入1M DTT至终浓度10mM，涡旋混匀，室温静置2h。脱盐柱脱盐，除去多余的DTT。然后按照摩尔比10:1(化合物2:BSA)，加150uL 20 mg/mL的化合物2。室温搅拌2h，将蛋白透析至0.02MPBS，pH 7.2的缓冲溶液中。透析纯化得到偶联物10。
Figure BDA0001966682790000211
取2mL离心管，加入1mL 10mg/mL的BSA(0.02M PBS，pH 7.2，25mM EDTA)缓冲液，然后按照摩尔比10:1(化合物4:BSA)，加150uL 20mg/mL的化合物4。室温搅拌24h，将蛋白透析至0.02M PBS，pH 7.2的缓冲溶液中，透析纯化得到偶联物11。
Figure BDA0001966682790000212
实验名称：一种25-羟基维生素D化学发光法定量检测的试剂盒开发
实验目的：研制开发一种定量检测25-羟基维生素D的试剂盒
实验设计：利用竞争化学发光法检测
试剂和仪器：
抗25-OH VD3抗体(Bioventix)，生物素化-25-OH VD3化合物3(自产)，生物素化-25-OH VD3化合物5(自产)，生物素化-25-OH VD3化合物7(自产),生物素化-25-OH VD3化合物9(自产)，羧基微球(JSR)，磷酸盐缓冲液(0.02M PBS，pH 7.2)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDAC(Thermo fisher)， Tween-20，0.1M MES缓冲液(pH 6.0)。
LiCA HT(上海博阳生物科技有限公司)，日立高速冷冻离心机
实验步骤：
包被抗25-OH VD3抗体的微球的制备
第一步，2mL离心管中，取10mg羧基官能团化的微球，用0.1M MES(pH 6.0) 的缓冲溶液，4℃离心10000rpm，15min清洗一次。
第二步，加入200uL 0.1M MES(pH 6.0)缓冲液超声分散均匀，再加入8uL 1 mg/mL抗25-OH维生素D羊单抗，接着加入100uL 5mg/mL EDAC(0.1M MES) 溶液，室温搅拌4h。
第三步，加入50uL 200mg/mL的BSA封闭羧基微球。
第三步，用含有0.5％Tween-20的PBS缓冲溶液将微球离心清洗三次，最后用 PBS缓冲液定容至10mg/mL。
检测实验
实验一：
实验名称：不同生物素化的芳基取代的-25-OH VD3衍生物的检测
实验目的：筛选最优的生物素化芳基取代的25-OH VD3衍生物
实验设计：相同的反应模式，选择N-马来酰亚胺芳基取代的Bio-25-OH-VD3 3 和氯甲基芳基取代的Bio-25-OH-VD3 5的性能进行比较
实验步骤：
1.将发光微球稀释到30μg/mL，生物素化-25-OH VD3衍生物3,5分别梯度稀释到5ng/mL、0.5ng/mL、0.05ng/mL。
2.将浓度为1mg/mL的25-羟基维生素D的溶液，加入马血清，配制校准品1～6，并进行赋值，测值分别为0，4.07，8.15，17.75，33.13，65.12。
3.按照反应模式，加入样本溶液，再依次加入包被的发光微球和生物素化的25-OHVD3衍生物，各25uL。
4.进行第一阶段温育：37℃温育17min。
5.加入175ul通用液。
6.进行第二阶段温育：37℃温育15min。
7.读数。
Figure BDA0001966682790000231
校准品区分度：
Cal1/Cal2 1.58 1.77 1.19 1.80 2.17 1.74
Cal2/Cal3 1.37 1.36 1.19 1.10 1.37 1.24
Cal3/Cal4 1.59 1.32 1.10 1.50 1.43 1.25
Cal4/Cal5 1.31 1.18 1.08 1.65 1.41 1.11
Cal5/Cal6 1.97 1.14 0.95 3.01 1.51 1.18
Cal1/Cal6 8.94 4.28 1.59 14.81 8.99 3.52
数据分析：
从信号量和校准品区分度上看，Bio-25-OH-VD3 3提升试剂信号量和区分度比Bio-25-OH-VD3 5高。
生物素试剂浓度5ng/mL时整体区分度最佳。
实验结论：
从校准品信号量和区分度看，N-马来酰亚胺基芳基取代的Bio-25-OH VD33试剂性能优于氯甲基芳基取代的Bio-25-OH VD35。
实验二：
实验名称：不同生物素化的芳基和杂芳基取代的-25-OH VD3衍生物的检测
实验目的：杂芳基取代的25-OH VD3衍生物和芳基取代的25-OH VD3衍生物的标记物的性能比较
实验设计：相同的反应模式，选择芳基取代的Bio-25-OH-VD3 5和芳基取代的Bio-25-OH-VD3 7的性能进行比较
实验步骤：
1.将发光微球稀释到30μg/mL，生物素化-25-OH VD3衍生物5，7分别梯度稀释到5ng/mL、0.5ng/mL、0.05ng/mL。
2.将浓度为1mg/mL的25-羟基维生素D的溶液，加入马血清，配制校准品1～6，并进行赋值，测值分别为0，4.07，8.15，17.75，33.13，65.12。
3.按照反应模式，加入样本溶液，再依次加入包被的发光微球和生物素化的25-OHVD3衍生物，各25uL。
4.进行第一阶段温育：37℃温育17min。
5.加入175ul通用液。
6.进行第二阶段温育：37℃温育15min。
7.读数。
Figure BDA0001966682790000241
Figure BDA0001966682790000251
校准品区分度：
Cal1/Cal2 1.58 1.78 1.19 1.55 1.67 1.15
Cal2/Cal3 1.38 1.37 1.20 1.34 1.30 1.14
Cal3/Cal4 1.60 1.33 1.10 1.52 1.25 1.07
Cal4/Cal5 1.32 1.18 1.09 1.26 1.13 1.06
Cal5/Cal6 1.99 1.14 0.95 1.71 1.10 0.96
Cal1/Cal6 9.12 4.36 1.61 6.82 3.36 1.43
数据分析：
从信号量和校准品区分度上看，相同生物素试剂浓度时，Bio-25-OH-VD3 5和Bio-25-OH-VD3 7低端区分度比较接近，但Bio-25-OH-VD3 5整体试剂信号和区分度较高。生物素试剂浓度5ng/mL时整体区分度最佳。
实验结论：
从校准品信号量和区分度看，芳基取代的Bio-25-OH-VD3 5试剂性能优于杂芳基取代的Bio-25-OH-VD37。
实验三：
实验名称：不同生物素化的25-OH VD3衍生物的检测
实验目的：芳基取代的25-OH VD3衍生物和琥珀酸基取代的25-OH VD3衍生物的标记物的性能比较
实验设计：相同的反应模式，选择芳基取代的Bio-25-OH-VD3 3和琥珀酸基取代的Bio-25-OH-VD3 9的性能进行比较
实验步骤：
1.将发光微球稀释到30μg/mL，生物素化-25-OH VD3衍生物3,9分别梯度稀释到5ng/mL、0.5ng/mL、0.05ng/mL。
2.将浓度为1mg/mL的25-羟基维生素D的溶液，加入马血清，配制校准品1～6，并进行赋值，测值分别为0，4.07，8.15，17.75，33.13，65.12。
3.按照反应模式，加入样本溶液，再依次加入包被的发光微球和生物素化的25-OHVD3衍生物，各25uL。
4.进行第一阶段温育：37℃温育17min。
5.加入175ul通用液。
6.进行第二阶段温育：37℃温育15min。
7.读数。
Figure BDA0001966682790000261
校准品区分度：
Cal1/Cal2 1.80 2.17 1.75 1.76 2.03 1.56
Cal2/Cal3 1.10 1.37 1.25 1.10 1.31 1.17
Cal3/Cal4 1.50 1.44 1.25 1.46 1.34 1.16
Cal4/Cal5 1.66 1.41 1.11 1.57 1.29 1.07
Cal5/Cal6 3.05 1.52 1.19 2.40 1.32 1.11
Cal1/Cal6 15.12 9.23 3.61 10.64 6.09 2.50
数据分析：
从信号量和校准品区分度上看，Bio-25-OH-VD3 3提升试剂信号量和区分度比Bio-25-OH-VD3 9高。
生物素试剂浓度5ng/mL时整体区分度最佳。
实验结论：
从校准品信号量和区分度看，N-马来酰亚胺基芳基取代的Bio-25-OH VD33试剂性能优于琥珀酸基取代的Bio-25-OH VD39。
实验四：
实验名称：不同生物素化的25-OH VD3衍生物的检测
实验目的：探索下不同的生物素化的25-OH VD3衍生物在板式化学发光上的性能比较
实验设计：相同的反应模式，用板式化学发光法检测
实验步骤：
1.亲和素2ug/ml包被，100ul/孔，4℃过夜
2.洗板：用稀释后的洗涤液洗微孔板5次，每孔应加入不少于400μL的洗涤液，每次浸泡10秒，最后在干净的吸水纸上拍干。
3.分别加入CB稀释的Biotin-25-OH VD3化合物(1/10000)3，5，9，100ul/孔。
4.洗板：用稀释后的洗涤液洗微孔板5次，每孔应加入不少于400μL的洗涤液，每次浸泡10秒，最后在干净的吸水纸上拍干。
5.加样本：每孔加样本50μL。加抗体：每孔加入抗体100μL
6.温育：用微量震荡器振荡混匀5秒钟，用封板膜封闭反应板，置37℃温育2 小时。
7.洗板：用稀释后的洗涤液洗微孔板5次，每孔应加入不少于400μL的洗涤液，每次浸泡10秒，最后在干净的吸水纸上拍干。
8.加酶标记物：除空白对照孔外，其余每孔加入酶标记物100μL
9.温育：用微量震荡器振荡混匀5秒钟，用封板膜封闭反应板，置37℃温育1 小时。
10.洗板：用稀释后的洗涤液洗微孔板5次，每孔应加入不少于400μL的洗涤液，每次浸泡10秒，最后在干净的吸水纸上拍干。
11.加底物液：每孔加入现配的化学发光底物工作液100μL，建议使用8道移液器，用微量震荡器振荡混匀5秒钟。
12.检测：加入发光底物液后室温(20～27℃)避光静置反应5分钟，立刻在微孔板发光分析仪上依序测量各孔的发光值(RLU)，测量时间0.1～1.0秒/孔。检测结果：
Bio-25-OH VD<sub>3</sub>3 Bio-25-OH VD<sub>3</sub>5 Bio-25-OH VD<sub>3</sub>9
S0 5970 1958 2655
S1 4325 1855 2409
S2 3640 1640 1999
S3 2057 1527 1702
S4 1854 1477 1364
S5 1536 1395 1520
S6 1230 1287 1273
S7 705 1063 922
S0/S1 1.38 1.06 1.10
S1/S2 1.19 1.13 1.21
S2/S3 1.77 1.07 1.18
S3/S4 1.11 1.03 1.25
S4/S5 1.21 1.06 0.90
S5/S6 1.25 1.08 1.19
S6/S7 1.74 1.21 1.38
数据分析：
Bio-25OH VD33和Bio-25-OH VD39检测样本整体区分度均比Bio-25-OH VD35 高。Bio-25-OH VD33比Bio-25-OH VD39检测样本整体区分度略高，检测低端样本灵敏度更高。
实验结论：
从检测样本的区分度来看，N-马来酰亚胺基芳基取代的Bio-25-OH VD33试剂性能最佳。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (9)

1.选自如下式3、式5、式6、式7、式10或式11所示的化合物：
Figure FDA0003902063800000011
Figure FDA0003902063800000021
2.一种用于测定样品中维生素D的存在和/或量的产品，包括以下组分：
1)权利要求1所述的化合物，和
2)维生素D的特异性结合成员。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述样品为生物样品或非生物样品。
4.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于，所述维生素D的特异性结合成员为维生素D的抗体及其维生素D的抗体偶联的配体。
5.根据权利要求2或3所述的产品，其特征在于，所述产品为组合物或试剂盒。
6.权利要求2-5任一项所述的产品在检测非生物样品中维生素D的存在和/或量中的应用。
7.一种用于测定非生物样品中维生素D的存在和/或量的方法，包括以下步骤：
1)提供根据权利要求2-5任一项所述的产品；
2)使产品中的所述维生素D的特异性结合成员与所述的化合物形成复合物；
3)测量所述复合物的量，所述复合物的量与所述样品中维生素D的存在和/或量有关。
8.一种复合物，其由权利要求1所述的化合物与维生素D的特异性结合成员形成。
9.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述维生素D的特异性结合成员为维生素D的抗体及其维生素D的抗体偶联的配体。
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