CN111398577A - 一种定量免疫检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定量免疫检测方法，包括以下步骤：（a）在聚苯乙烯微球上包被抗体，制备成检测试剂；（b）将待测样本与检测试剂混合，检测试剂中的微球发生聚集反应；（c）通过粒径仪测量初始和反应后的聚苯乙烯微球粒径和数量，比较粒径范围内微球数量的变化。本发明所述的定量免疫检测方法，灵敏度较高，能够更加准确地测试出待测样本的含量。

Description

一种定量免疫检测方法
技术领域
本发明属于医学检验检测技术领域，具体涉及一种定量免疫检测方法。
背景技术
免疫检测在体外诊断、食品安全等诸多领域的应用非常广泛，在疾病筛查诊断、食品质量控制等方面有着非常重要的意义。免疫检测指利用抗原、抗体特异性结合的方式对目标抗原或抗体进行检测，方法分为乳胶凝集、ELISA等。乳胶凝集又细分为手工法、利用分光光度计读数的胶乳比浊法。ELISA方法又根据所用检测底物的不同，细分为放射免疫、酶联免疫、荧光免疫、发光免疫等等。胶乳比浊法：用特异性抗体标记乳胶颗粒后，将待测抗原与标记好的乳胶颗粒混合，此时乳胶颗粒上的抗体与抗原结合聚集，显著改变了整个液体的浑浊度，通过分光光度计测试液体吸光度的改变，从而计算出待测抗原的浓度。在实际应用的过程中，胶乳比浊法的灵敏度不够高，当胶乳颗粒聚集较少或过多时，通过检测胶乳颗粒凝集前后液体吸光度的变化来间接计算凝集程度就会不准确，不能监控每个胶乳粒子的聚集情况。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种能够显著改善测试灵敏度的定量免疫检测方法。
技术方案：本发明所述的一种定量免疫检测方法，包括以下步骤：
（a）在已经经过羧基化改性过的聚苯乙烯微球上包被抗体，制备成检测试剂；
（b）将待测样本与检测试剂混合，检测试剂中的聚苯乙烯微球发生聚集反应；
（c）通过粒径仪测量初始和反应后的聚苯乙烯微球粒径和数量，比较粒径范围内微球数量的变化。
进一步的，所述微球数量的变化定义为损失粒子比例，等于（初始粒子数量-反应后粒子数量）/初始粒子数量。
进一步的，步骤（a）具体包括：
（a1）微球活化：取已经经过羧基化改性过的、粒径为0.5-3μm的聚苯乙烯微球制备成溶液，再加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温静置，高速离心弃去上清液，再将沉淀的聚苯乙烯微球用MES缓冲液重悬；
（a2）交联抗体：将待测样本的抗体交联到（a1）得到的聚苯乙烯微球表面；
（a3）封闭：将（a2）中交联好的微球中加入BSA溶液，搅拌、离心弃去上清液，将沉淀物用MES缓冲液重悬，即制备得到所需检测试剂。
进一步的，步骤（a1）中取已经经过羧基化改性过的、粒径0.5-3μm的聚苯乙烯微球制备成溶液，优选为取已经经过羧基化改性过的、粒径为0.5μm的聚苯乙烯微球制备成浓度为0.1% W/V的溶液。
进一步的，步骤（a2）中所述交联包括通过羧基进行交联和利用物理方式进行吸附，部分抗体通过羧基交联到聚苯乙烯微球表面，部分抗体通过物理方式直接吸附到聚苯乙烯微球表面。
进一步的，步骤（a2）具体为：将待测样本的抗体加入步骤（a1）得到的微球溶液中，25-45℃水浴搅拌3-5小时，高速离心弃去上清液，再将沉淀物用MES缓冲液重悬。
进一步的，配制不同浓度的待测样本标准溶液分别上机测试，得出对应的损失粒子比例，以待测样本标准溶液浓度为X轴，损失粒子比例为Y轴，绘制标准曲线，根据待测样品的损失粒子比例，查曲线得出相应的浓度。
有益效果：本发明所述的免疫检测方法，与传统胶乳比浊法相比灵敏度更高，能够更加准确测试出待测样本的含量。传统的检测方法通过测试吸光度变化来确定待测样本含量的方法，且当胶乳颗粒聚集过多或过少时，通过吸光度变化来间接测定凝集程度的方法就会受到干扰，造成结果不准确，而本发明是通过直接计数的方法，所以不会受此干扰。
附图说明
图1聚苯乙烯微球交联抗体的示意图；
图2实施例1中微球发生抗原/抗体聚集反应前（即检测试剂）在粒径仪上的测试结果；
图3聚苯乙烯微球通过形成的抗原/抗体结合物聚合示意图；
图4实施例1中微球发生抗原/抗体聚集反应后在粒径仪上的测试结果。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合附图及实施例对本发明作详细描述。
测试原理：首先在聚苯乙烯微球1上包被抗体2（如图1），制备成检测试剂，将待测样本加入上述聚苯乙烯微球检测试剂溶液后，样本中的抗原3与微球上的抗体2发生免疫反应，互相结合，微球通过形成的抗原/抗体结合物聚合到一起（如图3），形成微球聚合物。待测样本的浓度与形成微球聚合的量相关，造成原来粒径的微球减少，微球上的抗体通过结合抗原，将两个微球连接到一起，形成了更大的微球。通过比对加入样本前后相应粒径微球数量的变化，可以定量的确定待测样本的浓度。
实施例1
克伦特罗检测
（a1）微球活化：取已经经过羧基化改性过的、粒径为0.5μm的聚苯乙烯微球制备成浓度为0.1% W/V的溶液，再加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温放置4小时，高速离心弃去上清液，再将沉淀的微球用MES缓冲液重悬。
（a2）交联抗体：取克伦特罗抗体1mg，加入上述微球溶液中，30℃水浴搅拌3小时。高速离心去上清液，再将沉淀的微球用MES缓冲液重悬。
（a3）封闭：向上述交联好的微球中加入BSA溶液，室温下搅拌1小时后，离心去上清液。将沉淀物用MES缓冲液重悬。即制备得到所需检测试剂。
（b）反应：取0.5ml检测试剂与50μl待测样本混合反应5分钟。
（c）检测：取上述（a3）所得检测试剂0.5ml，在粒径仪上测量粒子直径与数量，如图2。再取（b）反应后的微球溶液，在粒径仪上再次测量粒子直径与数量，如图4。比较相同直径范围内，粒子减少的数量，计算待测样本浓度。
实施例2
沙丁胺醇检测
（a1）微球活化：取已经经过羧基化改性过的、粒径为1μm的聚苯乙烯微球制备成浓度为0.1% W/V的溶液，再加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温放置4小时，高速离心弃去上清液，再将沉淀的微球用MES缓冲液重悬。
（a2）交联抗体：取沙丁胺醇抗体1mg，加入上述微球溶液中，45℃水浴搅拌3小时。高速离心去上清液，再将沉淀的微球用MES缓冲液重悬。
（a3）封闭：向上述交联好的微球中加入BSA溶液，室温下搅拌1小时后，离心去上清液。将沉淀物用MES缓冲液重悬。即制备得到所需检测试剂。
（b）反应：取0.5ml检测试剂与50μl待测样本混合反应5分钟。
（c）检测:取上述（a3）所得检测试剂0.5ml，在粒径仪上测量粒子直径与数量。再取（b）反应后的微球溶液，在粒径仪上再次测量粒子直径与数量。比较相同直径范围内，粒子减少的数量，计算待测样本浓度。
实施例3
莱克多巴胺检测
（a1）微球活化：取已经经过羧基化改性过的、粒径为3μm的聚苯乙烯微球制备成浓度为0.1% W/V的溶液，再加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温放置4小时，高速离心弃去上清液，再将沉淀的微球用MES缓冲液重悬。
（a2）交联抗体：取沙丁胺醇抗体1mg，加入上述微球溶液中，25℃水浴搅拌5小时。高速离心去上清液，再将沉淀的微球用MES缓冲液重悬。
（a3）封闭：向上述交联好的微球中加入BSA溶液，室温下搅拌1小时后，离心去上清液。将沉淀物用MES缓冲液重悬。即制备得到所需检测试剂。
（b）反应：取0.5ml检测试剂与50μl待测样本混合反应5分钟。
（c）检测:取上述（a3）所得检测试剂0.5ml，在粒径仪上测量粒子直径与数量。再取（b）反应后的微球溶液，在粒径仪上再次测量粒子直径与数量。比较相同直径范围内，粒子减少的数量，计算待测样本浓度。
实施例1-3的测试结果如表1中所示，克伦特罗项目对应的损失粒子比例为25.7%，表示样本中含有克伦特罗，另外两项损失的粒子比例接近0%，表示样本中不含沙丁胺醇和莱克多巴胺。
表1
待测项目 粒径范围（um） 原始粒子数量 反应后粒子数量 损失的粒子比例
克伦特罗 1.2-1.4 10.5×10<sup>6</sup> 7.8×10<sup>6</sup> 25.7%
沙丁胺醇 1.9-2.1 10.1×10<sup>6</sup> 10.2×10<sup>6</sup> -1.0%
莱克多巴胺 3.6-3.8 10.4×10<sup>6</sup> 10.3×10<sup>6</sup> 1.0%
定量的方法：配制已知浓度的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺标准溶液（5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml），分别上机测试，得出对应的损失粒子百分数，已克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺标准溶液为X轴，损失粒子百分数为Y轴，绘制标准曲线。根据待测样品的损失粒子百分数，查曲线得出相应的浓度。

Claims (6)

1.一种定量免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）在已经经过羧基化改性过的聚苯乙烯微球上包被抗体，制备成检测试剂；
（b）将待测样本与检测试剂混合，检测试剂中的微球发生聚集反应；
（c）通过粒径仪测量初始和反应后的聚苯乙烯微球粒径和数量，比较粒径范围内微球数量的变化。
2.根据权利要求1所述的一种定量免疫检测方法，其特征在于，步骤（c）中所述微球数量的变化定义为损失粒子比例，为（初始粒子数量-反应后粒子数量）/初始粒子数量。
3.根据权利要求1所述的一种定量免疫检测方法，其特征在于，步骤（a）具体包括：
（a1）微球活化：取已经经过羧基化改性过的、粒径为0.5-3μm的聚苯乙烯微球制备成溶液，再加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温静置，高速离心弃去上清液，再将沉淀的聚苯乙烯微球用MES缓冲液重悬；
（a2）交联抗体：将待测样本的抗体交联到（a1）得到的聚苯乙烯微球表面；
（a3）封闭：将（a2）中交联好的聚苯乙烯微球中加入BSA溶液，搅拌、离心弃去上清液，将沉淀物用MES缓冲液重悬，制备得到检测试剂。
4.根据权利要求3所述的一种定量免疫检测方法，其特征在于，步骤（a2）中所述交联包括通过羧基进行交联和利用物理方式进行吸附。
5.根据权利要求3所述的一种定量免疫检测方法，其特征在于，步骤（a2）具体为：将待测样本的抗体加入步骤（a1）得到的聚苯乙烯微球溶液中，25-45℃水浴搅拌3-5小时，高速离心弃去上清液，再将沉淀物用MES缓冲液重悬。
6.根据权利要求2所述的一种定量免疫检测方法，其特征在于，配制不同浓度的待测样本标准溶液分别上粒径仪测试，得出对应的损失粒子比例，以待测样本标准溶液浓度为X轴，损失粒子比例为Y轴，绘制标准曲线，根据待测样品的损失粒子比例，查曲线得出相应的浓度。
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