CN113030484B - 降钙素原致敏胶乳、试剂盒及制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了降钙素原致敏胶乳、试剂盒及制备方法、应用，降钙素原致敏胶乳的制备方法，包括以下步骤：S1、将两种不同粒径的氨基微球分别与N‑琥珀酰亚胺基‑3‑(2‑吡啶基二硫)丙酸酯进行交联反应，分别得到产物A和产物B；S2、将步骤S1得到的产物A和产物B分别加入二巯苏糖醇进行产物巯基化，分别得到产物C和产物D；S3、将产物A和产物D进行交联，或产物B和产物C进行交联获得微球结合物；S4、将步骤S3获得的微球结合物与交联剂按一定比例混合活化微球结合物，然后加入降钙素原抗体包被微球结合物，加入封闭液，获得降钙素原致敏胶乳。本发明既保证产品灵敏度和线性的同时，同时大大提高了产品的批间、批内精密度及稳定性性能。
Description
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域，具体涉及降钙素原致敏胶乳、试剂盒及制备方法、 应用。
背景技术
降钙素原(PCT)是降钙素(CT)的前体物，由116个氨基酸组成的糖蛋白，分子量约为13KD，包括59个氨基酸的N端，32肽的活性降钙素(CT)以及21肽的下钙素；正常人 全血、血浆及血清中含量极低，小于0.5ng/ml；半衰期约20～24小时，稳定性较好；大量的 研究资料表明，PCT与感染所致的炎症反应综合征、脓毒症、脓毒性休克等全身感染情况的严重程度和预后具有明确的相关性。当PCT浓度升至2～10ng/ml时，很可能为脓毒症、严重 脓毒症或脓毒性休克，具有高度器官功能障碍的风险；当PCT浓度超过10ng/ml时，高度提 示为严重细菌性脓毒症或脓毒性休克，并常伴有器官功能衰竭，具有高度死亡风险；当PCT 浓度不超过0.05ng/ml时，细菌感染的可能性非常小，几乎不会发生血流感染。
目前，采用降钙素原试剂盒用于检测降钙素原(PCT)的浓度。现有的降钙素原试剂盒 以胶乳增强免疫技术为基础的诊断试剂凭借其高灵敏度、线性范围广、稳定性好的性能，越 来越受到临床医学检验工作者的认可，主要包括降钙素原致敏胶乳。但是，现有的降钙素原 试剂盒存在批间及批内精密度差、样本局限、及稳定性差等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供降钙素原致敏胶乳及其制备方法、应用，采用本发明所述方法制 备的降钙素原致敏胶乳，既能保证产品灵敏度和线性，且大大提高了产品的批批间、批内精 密度及稳定性性能。
此外，本发明还包括采用上述降钙素原致敏胶乳制备的试剂盒。
本发明通过下述技术方案实现：
降钙素原致敏胶乳的制备方法，包括以下步骤：
S1、将两种不同粒径的氨基微球分别与N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯进行交 联反应，分别得到产物A和产物B；
S2、将步骤S1得到的产物A和产物B分别加入二巯苏糖醇进行产物巯基化，分别得到 产物C和产物D；
S3、将产物A和产物D进行交联，或产物B和产物C进行交联获得微球结合物；
S4、将步骤S3获得的微球结合物与交联剂按一定比例混合活化微球结合物，然后加入降 钙素原抗体包被微球结合物，加入封闭液，获得降钙素原致敏胶乳。
本发明制备的产物A和产物中含有硫醇吡啶保护基，产物C和产物D中含有巯基硫醇吡 啶保护基，在步骤S3中，巯基与硫醇吡啶保护基交换，微球交联。
本发明运用硫醇吡啶保护基交换作用，将不同粒径大小的聚苯乙烯微球连接在一起，将 特异性抗体包被在融合微球可制备得到致敏胶乳。与现有的偶联技术相比，大大缩短了制备 时间，提高了生产效率。
本发明硫醇吡啶保护基交换作用，将不同粒径大小的聚苯乙烯微球连接在一起，将特异 性抗体包被在融合微球可制备得到致敏胶乳，既保证产品灵敏度和线性的同时，与现有的多 种致敏胶乳混合相比，大大提高了产品的批间、批内精密度及稳定性性能。
进一步地，氨基微球为聚苯乙烯微球，粒径为50nm～500nm，所述聚苯乙烯微球具有表 面修饰基团，表面修饰基团为羧基、氨基或甲苯璜酰基中的一种。
聚苯乙烯微球由聚苯乙烯通过乳液聚合方法制得，粒径范围一般为50nm～500nm。表面 无功能性基团的聚苯乙烯微球适合以物理吸附的方式结合抗原或抗体；表面修饰氨基、羧基 等疏水基团的聚苯乙烯微球可通过共价结合的方式与抗原/半抗原、抗体、多肽及核酸探针等 配体偶联。
进一步地，降钙素原抗体为一种或多种单克隆抗体，或为一种或多种多克隆抗体，或一 种或多种单克隆抗体和一种或多种多克隆抗体联合使用。
进一步地，降钙素原抗体至少包括鼠PCT单抗、羊PCT单抗、兔PCT单抗、兔抗人PCT多抗、羊抗人PCT多抗中的一种。
进一步地，步骤S4中，微球结合物与交联剂的比例为10～15：10，微球结合物与降钙素 原抗体的比例为2～5：1。
一种采用上述制备方法制备的降钙素原致敏胶乳。
一种降钙素原试剂盒，包括采用上述制备方法制备的降钙素原致敏胶乳。
进一步地，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1为缓冲液，pH为6.0～9.0；
所述试剂R2包括降钙素原致敏胶乳、表面活性剂、生物防腐剂及缓冲液。
本发明所述试剂盒能够直接用于全血、血清及血浆中降钙素原的定量检测，缩短了样本 预处理时间，有效解决样本局限所带来的困扰，对临床疾病的诊断和治疗具有一定的促进作 用。
进一步地，试剂R1的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-三羟甲基氨基甲 烷缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-四硼酸钠缓冲液、2-吗啉乙磺 酸-氢氧化钠缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的一种或多种；表面活性剂为非离子表面 活性剂，为烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯烷基醇酰胺、聚醚类中的一种或多种；试剂R2的 缓冲液的pH值为5.0～9.0，试剂R2的缓冲液为硼酸-四硼酸钠缓冲液、碳酸-碳酸氢钠缓冲液、 Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液一种或多种，生物防腐剂为叠氮钠、苯酚、双咪唑烷基脲、咪唑烷基脲、ProClin150、ProClin300及ProClin950的一种 或多种。
降钙素原致敏胶乳或降钙素原试剂盒在检测全血、血清或血浆中降钙素原浓度中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明运用硫醇吡啶保护基交换作用，将不同粒径大小的聚苯乙烯微球连接在一起， 将特异性抗体包被在融合微球可制备得到致敏胶乳。与现有的偶联技术相比，大大缩短了制 备时间，提高了生产效率。
2、本发明硫醇吡啶保护基交换作用，将不同粒径大小的聚苯乙烯微球连接在一起，将特 异性抗体包被在融合微球可制备得到致敏胶乳，既保证产品灵敏度和线性的同时，与现有的 多种致敏胶乳混合相比，大大提高了产品的批间、批内精密度及稳定性性能。
3、本发明所述试剂盒能够直接用于全血、血清及血浆中降钙素原的定量检测，缩短了样 本预处理时间，有效解决样本局限所带来的困扰，对临床疾病的诊断和治疗具有一定的促进 作用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
实施例1：
一种降钙素原试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
试剂R1为pH 7.4±0.1的磷酸盐缓冲液；
试剂R2含有如表1所示组分：
表1
| 2-吗啉乙磺酸 | 50mMol/L |
| PCT鼠单抗致敏胶乳混合液 | 0.5％ |
| 牛血清白蛋白 | 3g/L |
| 甘氨酸 | 1.5g/L |
| 山梨醇 | 50g/L |
| 氢氧化钠 | 15g/L |
| 生物防腐剂 | 0.10％ |
| 表面活性剂 | 0.3％ |
试剂R2的pH值为8.5±0.1。
在本实施例中，表面活性剂为聚氧乙烯烷基醇酰胺，生物防腐剂为ProClin300，制备PCT 致敏胶乳所使用的微球为322nm和183nm聚苯乙烯微球，表面修饰基团为氨基；制备PCT 致敏胶乳所使用的抗体为三株鼠PCT单克隆抗体，具体包括以下步骤：
S1、取50ul 322nm的聚苯乙烯微球，溶于1ml MES-NaOH(pH6.5，50mM)缓冲液中，迅速滴入一定量N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)液(溶于无水乙醇)，在20～25℃ 条件下反应30min，同时300rpm转速搅拌；反应结束后，15000rpm冰冻离心15min处理， 收集沉淀物，等体积缓冲液复溶(必要时进行浓缩)，得到产物A。
取183nm聚苯乙烯微球，按上述操作处理，得到硫醇化修饰的氨基微球得到产物B；
S2、将步骤S1得到的产物A和产物B分别加入固体二巯苏糖醇(DTT)，使其浓度达到40mmol/L，在20～25℃条件下反应约25min，同时300rpm转速搅拌；反应结束后，15000rpm冰冻离心15min处理，收集沉淀物，等体积缓冲液复溶(必要时进行浓缩)，分别得到产物C和产物D；
S3、将产物A和产物D进行交联，或产物B和产物C按一定的比例置于2～8℃条件下过 夜，不同时300rpm转速搅拌；反应结束后，15000rpm冰冻离心15min处理，收集沉淀物，等体积缓冲液复溶，获得微球结合物；
S4、取上述微球复合物D 15000rpm冰冻离心15min处理，收集沉淀物，等体积缓冲液 复溶；重复上述操作1～3次，除去结合物中可能含有少量游离杂质；
S5、取上述纯化后的微球结合物，MES(pH6.5，50mM)缓冲液稀释至微球浓度为1.0％， 按照微球：交联剂＝15：10比例活化微球结合物(其中交联剂为10mg/ml的EDAC)，37℃低 速搅拌20min，其上清，等体积复溶；按微球：抗体＝4：1比例包被不同片段PCT鼠单抗，37℃低速搅拌150min，其上清，MES(pH8.0，50mM)缓冲液等体积复溶；加入适量的15％ 的牛血清白蛋白(BSA)，37℃封闭60min。取上述溶液，5000rpm冰冻离心15min，弃上清，MES(pH8.0，20mM)缓冲液等体积复溶，即可得到PCT致敏胶乳。
实施例2：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
一种降钙素原试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
试剂R1为pH 5.0±0.1的磷酸盐缓冲液；
试剂R2含有如表2所示组分：
表2
| 甘氨酸 | 100mMol/L |
| PCT兔多抗致敏胶乳混合液 | 0.3％ |
| 牛血清白蛋白 | 5g/L |
| 山梨醇 | 50g/L |
| 氢氧化钠 | 15g/L |
| ProClin950 | 0.10％ |
| 聚氧乙烯烷基醇酰胺 | 0.1％ |
实施例3：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
一种降钙素原试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
试剂R1为pH 6.0±0.1的磷酸盐缓冲液；
试剂R2含有如表3所示组分：
表3
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 10mMol/L |
| PCT鼠单抗致敏胶乳混合液 | 0.5％ |
| 牛血清白蛋白 | 3g/L |
| 山梨醇 | 25g/L |
| 氢氧化钠 | 15g/L |
| 叠氮钠 | 0.10％ |
| 曲拉通-100 | 0.03％ |
实施例4：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于：
一种降钙素原试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
试剂R1为pH 7.5±0.1的Tris-HCl缓冲液；
试剂R2含有如表4所示组分：
表4
| 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 | 25mMol/L |
| PCT兔多抗致敏胶乳混合液 | 0.3％ |
| 牛血清白蛋白 | 5g/L |
| 山梨醇 | 25g/L |
| 氢氧化钠 | 15g/L |
| 叠氮钠 | 0.10％ |
| 聚氧乙烯烷基醇酰胺 | 0.03％ |
实施例5：
一种降钙素原试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
试剂R1为pH 6.0±0.1的磷酸盐缓冲液；
试剂R2含有如表5所示组分：
表5
| 硼酸 | 1.86g/L |
| 四硼酸钠(硼砂) | 0.73g/L |
| PCT兔单抗致敏胶乳 | 0.5％ |
| 牛血清白蛋白 | 5g/L |
| 山梨醇 | 25g/L |
| 叠氮钠 | 0.10％ |
| 曲拉通-100 | 0.03％ |
对比例1：
市售的全血降钙素原测定试剂盒。
对比例2
与实施例1的区别在于，试剂R2组分无表面活性剂。
对比例3
与实施例1的区别在于，试剂R2采用322nm的微球分别偶联三株PCT单抗。
对比例4
与实施例1的区别在于，试剂R2采用183nm的微球分别偶联三株PCT单抗。
性能验证
试验一
准确度比对试验：取具有溯源性的低值、中值及高值校准品各一份，实施例1～5和对比 例1～4每份样本测试3次，计算均值及与靶值的相对偏差，结果见表6。
试验二
同源性样本测试：取10例志愿者，分别抽取新鲜全血、血清、血浆样本，实施例1分别 测试1次，计算变异系数，结果见表7。
试验三
精密度试验：
1)批内精密度：取具有溯源性的低值、中值及高值校准品各一份，实施例1和对比例1 每份样本测试11次，计算均值变异系数，结果见表8。
2)批间精密度：取具有溯源性的低值、中值及高值校准品各一份，实施例1和对比例1 分别随机抽取10个批次试剂，每批次分别测试一次，计算均值变异系数，结果见表8。
试验四
长期稳定性试验：
在2～8℃储存条件下，分别在0天、3个月、6个月及13个月对降钙素原质控QC1和QC2 进行测试，每次测定3次，结果取均值，计算相对偏差，结果见表6。
表6
由以上结果分析可见，实施例1和对比例1(市售的全血降钙素原测定试剂盒)测定具 有溯源性的低值、中值及高值校准品的准确度优于其他实施例和对比例，且实施例1在测定 低值校准品优于对比例1(市售的全血降钙素原测定试剂盒)；实施例2、实施例4、对比例4 对于低值样本测试准确度较差；实施例2、实施例4不同水平样本测试准确度均较差；对比 例2无特异性反应信号。
表7
由以上结果分析可见，实施例1试剂盒单次测试10例临床新鲜全血、血清、血浆样本变 异系数(CV)≤25％，测试结果差异不明显。
表8
由以上批内精密度和批间精密度结果分析可见，实施例1批内精密度≤10％，批间精密 度≤12.5％，故本发明的试剂盒批内精密度和批间精密度性能较好，且优于对比例1在售试剂 盒。
表9
由以上结果分析可见，实施例1试剂盒和对照例1试剂盒13个月质控测定数据与第0天 质控测定数据比较，相对偏差较小，均在质控允许偏差范围内(±10.0％)，故本发明的试剂 盒在2～8℃稳定性较好，且优于目前在售试剂稳定性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说 明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护 范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.降钙素原致敏胶乳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将两种不同粒径的氨基微球分别与N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯进行交联反应，分别得到产物A和产物B；
S2、将步骤S1得到的产物A和产物B分别加入二巯苏糖醇进行产物巯基化，分别得到产物C和产物D；
S3、将产物A和产物D进行交联，或产物B和产物C进行交联获得微球结合物；
S4、将步骤S3获得的微球结合物与交联剂按一定比例混合活化微球结合物，然后加入降钙素原抗体包被微球结合物，加入封闭液，获得降钙素原致敏胶乳。
2.根据权利要求1所述的降钙素原致敏胶乳的制备方法，其特征在于，所述氨基微球为聚苯乙烯微球，粒径为50nm~500nm，所述聚苯乙烯微球具有表面修饰基团，表面修饰基团为氨基。
3.根据权利要求1所述的降钙素原致敏胶乳的制备方法，其特征在于，所述降钙素原抗体为一种或多种单克隆抗体，或为一种或多种多克隆抗体，或一种或多种单克隆抗体和一种或多种多克隆抗体联合使用。
4.根据权利要求3所述的降钙素原致敏胶乳的制备方法，其特征在于，所述降钙素原抗体至少包括鼠PCT单抗、羊PCT单抗、兔PCT单抗、兔抗人PCT多抗、羊抗人PCT多抗中的一种。
5.根据权利要求1所述的降钙素原致敏胶乳的制备方法，其特征在于，步骤S4中，微球结合物与交联剂的比例为10~15：10，微球结合物与降钙素原抗体的比例为2~5：1。
6.一种如权利要求1-5任一项所述制备方法制备的降钙素原致敏胶乳。
7.一种降钙素原试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项所述制备方法制备的降钙素原致敏胶乳。
8.根据权利要求7所述的一种降钙素原试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1为缓冲液，pH为6.0~9.0；
所述试剂R2包括降钙素原致敏胶乳、表面活性剂、生物防腐剂及缓冲液。
9.根据权利要求8所述的一种降钙素原试剂盒，其特征在于，试剂R1的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、硼酸-四硼酸钠缓冲液、2-吗啉乙磺酸-氢氧化钠缓冲液中的一种；表面活性剂为非离子表面活性剂，为烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯烷基醇酰胺、聚醚类中的一种或多种；试剂R2的缓冲液的pH值为5.0~9.0。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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