JP2009528293A - 様々な形態の活性型第v因子を用いた止血を調節する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
本発明は、医学及び血液学の分野に関連している。より特異的には、本発明は、必要な患者において凝固カスケードを調節するための、FV及びそれの誘導体の活性型を用いた治療戦略を記載するものである。
FV−810;アミノ酸811〜1491を欠損した第V因子(JBC,279,2004,21643−21650に公開された)
FV−859;アミノ酸860〜1491を欠損した第V因子;
FV−866;アミノ酸867〜1491を欠損した第V因子;
FV−902;アミノ酸903〜1491を欠損した第V因子;
FV−924;アミノ酸923〜1491を欠損した第V因子;
FV−937;アミノ酸938〜1491を欠損した第V因子;
FV−956;アミノ酸957〜1491を欠損した第V因子。
FV−1033−B58−s131;アミノ酸1034〜1491を欠損し、第VIII因子のアミノ酸907〜1037と交換されたアミノ酸900〜1030を有する第V因子;
FV−1033−B58−s104;アミノ酸1034〜1491を欠損し、第VIII因子のアミノ酸972〜1075と交換されたアミノ酸904〜1007を有する第V因子;
FV−1033−B58−s46;アミノ酸1034〜1491を欠損し、第VIII因子のアミノ酸1032〜1077と交換されたアミノ酸963〜1008を有する第V因子である。上述した誘導体のそれぞれは、二本鎖活性型FVと同程度の機能特性を示す。
Arg506
Arg306
Arg679
で修飾されるであろう。理論においてはあらゆるアミノ酸はこの部位で交換されるが、Glnは好ましい。
本発明の生物学的分子に関連した様々な用語は、上で使用されたものと、本明細書及び請求項を通じて使用されたものである。
A.核酸分子
本発明のFVの活性型或いはその誘導体をコードする核酸分子は、組換えDNA技術法を用いることによって調合される。ヌクレオチド配列情報の利用能は、様々な手段によって本発明の単離核酸分子の調合を可能にする。例えば、FVの活性型或いはそれの誘導体ポリペプチドをコードする核酸配列は、本分野でよく知られた標準プロトコールを用いて適切な生物源から単離される。
本発明のFVの完全長活性型或いはその誘導体ポリペプチドは、既知方法に従って様々な方法で調合される。前記タンパク質は、例えば形質転換細菌或いは動物培養細胞、或いはFVの活性型を発現した組織などの適切な源から、免疫親和性精製によって精製される。しかしながら、これは、既知の細胞タイプにおいて常に存在する低量タンパク質であるので、好ましい方法ではない。
FVポリペプチドの活性型或いはその誘導体、若しくは改変凝固活性を持つ同じものをコードする核酸は、例えば、血液凝固カスケードを調節する治療上及び/若しくは予防的薬剤として、本発明に従って使用される。本発明は、これらの分子が凝固を増加するように変換され得ることを発見した。
FVの活性型或いはその誘導体−コード核酸は、本発明に従った様々な目的のために使用される。本発明の好ましい実施形態において、血液凝固を調節するための核酸送達媒体(すなわち発現ベクター)が提供され、ここにおいて前記発現ベクターはFVの活性型或いはその誘導体ポリペプチドがコードされた核酸配列、或いは本明細書に記載されたようなその機能的断片を有する。FVの活性型或いはその誘導体−コード発現ベクターの患者への投与は、FVの活性型或いはその誘導体ポリペプチドの発現をもたらし、これは凝固を増強するように作用する。本発明に従って、FVの活性型或いはその誘導体コード核酸配列は、本明細書に記載されたようにその発現が止血を調節するFVの活性型或いはその誘導体ポリペプチドをコードする。
組換え遺伝子発現に対するアデノウイルスベクターは、ヒト胚性腎臓細胞株293(Graham et al.,1977,J.Gen.Virol.36:59−72)において産生された。この細胞株は、アデノウイルス5ゲノムの左端を有しE1タンパク質を発現するため、アデノウイルス2(Ad2)及びE1機能が欠損したアデノウイルス5変異体の増殖に対して許容である。293細胞の細胞性ゲノムへ連結されたE1遺伝子は、これらの遺伝子が欠損したものからウイルスベクターを増幅する発現システムとしてこれらの細胞の使用を促進するレベルで発現されている。293細胞は、ヘルパー非依存性クローニング及びアデノウイルスベクターの発現のためのE1変異体の単離及び増殖に対して広範囲に使用されていた。従って、293細胞株のような発現システムは、トランスに本質的なウイルス機能を提供し、それにより外因性核酸配列がE1遺伝子に置換されたウイルスベクターの増殖を可能にする。Young et.al.(The Adenoviruses,Ginsberg,ed.,Plenum Press,New York and London(1984),pp.125−172)を参照のこと。
本発明の発現ベクターは、対象へ送達され、生物学的活性タンパク質(例えばFVの活性型或いはその誘導体ポリペプチド、若しくはそれらの機能的断片或いは誘導体)の産生を可能にする薬学的組成物へ取り込まれる。本発明の特定の実施形態において、レシピエントが治療上有効な量のFVの活性型或いはその誘導体ポリペプチドを産生することを可能にするのに十分な遺伝的物質を有する薬学的組成物は、前記対象における止血へ影響を及ぼすことができる。或いは、上で議論されたように、有効な量の変異第V因子ポリペプチドは、必要とする患者へ直接注射される。前記組成物は、単独で、若しくは、これに限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖及び水を含むあらゆる無菌生体適合性薬学的担体において投与される安定化化合物などの少なくとも1つの他の薬剤との組み合わせで投与される。前記組成物は、患者へ単独で、若しくは止血に影響を及ぼす他の薬剤との組み合わせで投与される。
単独或いは他の薬剤との組み合わせにおけるFVポリペプチドの変異活性型は、上述したような適切な生物学的担体において患者へ直接注射される。FVの活性型或いはその誘導体、若しくはそれらの機能的断片をコードする核酸配列を有する本発明の発現ベクターは、様々な手段によって患者へ投与され、FVの活性型或いはその誘導体ポリペプチドの予防的に及び/若しくは治療上有効なレベルを達成し維持する。本分野の当業者は、特定の患者の治療に対して、FVの活性型或いはその誘導体をコードした本発明の発現ベクターを用いた特異的なプロトコールを容易に決定できる。アデノウイルスベクターの製造及び患者への投与に対するプロトコールは、米国特許第5,998,205号;第6,228,646号;6,093,699号;第6,100,242号、及び国際特許出願第WO94/17810号及び第WO94/23744号に記載されており、これらはこの参照によってその全体が組み込まれるものである。
地域実験動物委員会は全ての手順を許可している。重篤なFVIII[20]或いはFIX欠損[21]のマウスモデルは、以前に記載された[22、23]ノック−イン技術によって産生されたFVL(C57B16バックグラウンド)を有するマウスと交雑させた。血友病Bモデルは、C57Bl/6−129混合バックグラウンドで作成し[21、14]、さらに付加的に5世代、C57Bl/6へ交雑させた。血友病Aマウスは、C57Bl/6−129混合バックグラウンドで作成した。一連の繁殖を通じて、本発明者らは全ての3種類の期待FVL遺伝子型の血友病A或いはBマウスを得、これにより同腹仔のうち一匹のマウスでの比較が可能となった。
尾部クリップによって得られた血液サンプルは、3.8%クエン酸ナトリウムへ回収した(9割の血液:1割の抗凝固剤)。凝固因子活性は、50μlの活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)試薬(Organon Teknika,Durham,ノースカロライナ州)を有する50μlのヒトFIX−或いはFVIII−欠損血漿、及びトータル50μlの無希釈テストサンプルをインキュベーションする修飾ワンステージアッセイによって決定した。50μlの25mM CaCl2を添加し、凝固形成までの時間をStat4 Coagulation Instrument(Diagnostic Stago,Parsipanny,ニュージャージー州)を用いて測定した。トロンビン−アンチトロンビン(TAT)複合体は、以前記載されたように、Dade Behring(Marburg,ドイツ)から購入したEnzygnost TAT酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)(これはマウスTATに高度交差反応性を示す[25、26])によって測定した。
マウスに麻酔をし、尾部の遠位部(2.5〜3mm直径)を切り、37℃生理食塩水に浸した。10分を超える出血時間測定は、尾部を縫合することによって止めた。血液損失は、報告されたように[26]尾部が置かれた前記生理食塩水におけるヘモグロビンの吸光度(A575nm)を測定することによって決定した。
成体マウスの頸動脈を露出し、Doppler flowプローブ(Model 0.5VB;Transonic Machinery Systems,Ithaca,ニューヨーク州)を露出動脈の表面へ置き、基準血流測定を記録した。次に、塩化鉄(15%溶液)に浸した2mm2切片のWhatman#1紙を前記露出動脈の外膜表面へ2分間適用し、除去後頸動脈血流を記録した。頸動脈閉塞の時間は、動脈障害の開始後時間及び安定閉塞の開始時間として定義した[27]。
成体マウスの精巣挙筋を露出し、生体内顕微鏡トレイへ固定した。ラット抗−CD41(マウス血小板糖タンパク質複合体IIb/IIIa)Alexa−555標識化抗体(Molecular Probes,Eugene,オレゴン州)をマウス当たり10μgの用量で注射した。前記抗体の注射後すぐに、精巣挙筋の血管壁へレーザー誘導性障害を実行した[28]。前記障害は、マイクロポイントレーザーシステム(Phototonic Instruments,St.Charles,イリノイ州)を介して適用されたパルス−窒素色素レーザーを用いて行なった。本発明者らは、長距離コンデンサー及び40X浸水対物レンズを備えたオリンパスBX6IWI固定ステージ電動直立蛍光顕微鏡を用いた。データ解析は、Slidebook4.0ソフトウェア(Intelligent Imaging Innovations,Denver,コロラド州)を用いて実行した。蛍光データは、300フレーム、10ミリ秒/イベントまでデジタル処理で保存した。発展血栓における血小板蓄積の量は、前記血小板特異的シグナルの全ピクセル値の合計によって決定し、集積血小板蛍光強度を決定する任意の単位である相対蛍光単位(RFU)として表した。
ヒトFVを血漿から単離し、組換えFVaを以前に記載された[29]ように調合した。両タンパク質の精製は、抗−ヒトFV抗体を含む免疫親和性カラムを用いて実行した[29]。FVのin vitro活性化に対して、20nM FVは0.25nMの濃度のマウス或いはヒトトロンビン(Haematological Technologies,Inc.,Essex−Junction,バーモント州)と共に37℃でインキュベーションした。サンプルは複数時点で反応混合液から採取し、特定補助因子活性はFV−欠損血漿を用いてPT−ベースアッセイによって決定した。マウス或いはヒトトロンビンによるFVの切断を決定するために、300nMの一本鎖FVは、複数時間インターバルの間トロンビン(1nM)とインキュベーションした。サンプルを除去し、SDS−PAGEによって解析した。次に、FVaを血友病Bマウスへ尾部静脈を介して注射し、FVaレベル、aPTT及びTATレベルを決定するために、血液サンプルをタンパク質注射の前、及び15分及び120分後に尾部クリップによって回収した。次に本発明者らは、ヒトFVa(30〜60μg/マウス)或いはFV(60〜120μg/マウス)を血友病A或いはBマウスの経静脈を通じて注射し、2時間周期で生体内顕微鏡における血栓形成をモニタリングした。
異なる実験群から得られたデータの比較は、JMPバージョン4.0.2(SAS Institute Inc.Cary,ニューヨーク州)を用いて解析した。
FVLを有する血友病A及びBマウスは、改善された凝固時間を示した
FVL変異に対する血友病Aマウスホモ接合体或いはヘテロ接合体の凝固活性の決定より、FVLを有さない血友病Aマウスと比較した場合、aPTT値の短縮が見られた(図1A)。aPTT値における同様の改善も、FVLを有する血友病Bマウスに対しても見いだされた(図1B)。本発明者らは次に、前記aPTT値の改善がトロンビン産生増加に関連するかどうかを評価するためにTATレベルを決定した。この免疫アッセイは、ヒトTATを検出するために開発されただけでなく、マウスTATに対して高度な交差反応性を示すものである[25、26]。aPTTの短縮とTATレベルの増加の間には良い相関関係が見られた(図1、パネルC及びD)。しかしながら、FVLを有する血友病マウスのTATレベルは血友病でないFVLのTATレベルには届かなかった(図1、パネルF)。
本発明者らは次に、in vitroでの凝固時間の軽度改善はin vivo止血能力と関連するかどうかをテストした。血液損失は、尾部の遠位部を切開した後10分間測定した。FVLを有する血友病AマウスとFVLを有さないマウスとの間に違いは見られなかったが、変異がないマウスと比較した場合、FVLに対する血友病Bマウスホモ接合体の間では血液損出が減少した(図2B)。
全ての正常マウス(n=5)或いは血友病を患っていないFVLホモ接合体マウス(n=5)は、完全な血管閉塞を示し(表1)、この血管閉塞は血管障害後6〜8分以内の血流の中断によって特徴付けた。FVLを有する10匹の血友病Aマウスの内2匹において、血流の一過性減少が検出されたが、完全な管腔閉塞を示唆するレベルではなかった(表1)。同様な知見はFVLに対する血友病Bホモ接合体においても決定され、8匹のマウスの内1匹のみが完全な血管閉塞を起こし、1匹が一過性血管閉塞を生じた。
本発明者らは、微小循環におけるレーザー誘導性内皮損傷のリアルタイム画像化の間の血小板蓄積をモニタリングした。合成画像は、血栓の明視野画像及び血小板の蛍光画像から構成された(図3)。正常マウス(n=3)において、本発明者らは全ての障害細動脈部位(n=30)において血栓形成を生じたことを決定した。加えて、本発明者らは、FVLホモ接合体マウス(n=4)の血栓形成、及び予想されたように全ての(n=40)障害部位における血栓形成を特徴付けした(表2)。
はじめに、本発明者らは、マウストロンビンがヒトトロンビンと同様の傾向でヒトFVを活性化することを決定した。FV或いはFVaにおける一過性増加がFVLのin vivo効果を模倣出来るかどうかテストするために、本発明者らは、精製ヒトFV或いはFVaをマウスに注射した。FVaは活性型で分泌されるので、前記精製タンパク質のトロンビン活性化は必要ではなかった[29]。従って、これらデータの直接的な解釈は、注射された前記タンパク質溶液におけるトロンビンの追跡に振り回されない。血友病Bマウスへの30μgのFVa/マウスの注射は、注射後の両時点(15或いは120分)で、基準での77±3秒から72±4秒にaPTTの個別短縮をもたらした。これらのデータは、15±5ng/ml(基準)から69±10及び67±22ng/ml(それぞれ15及び120分での)へのTATレベルの増加に十分一致していた。本発明者らは次に、インターバル顕微鏡における血栓形成をモニタリングした。タンパク質注射の前に、予想されたように血友病A及びBマウスの両方において血栓形成は観察されなかった。30μg或いは100μgのFVaの注射に続いて、全傷害部位において血小板堆積が直ちに観察された(図4、パネルC及びD)。対照的に、マウスに同様の血漿濃度(0.180或いは0.360pモル)を達成するのに匹敵する用量でプロ補助因子FVを注射した場合、血栓形成は検出されなかった。まとめると、これらの結果は両血友病モデルと類似であった(表2及び図4、パネルC−D)。
血友病表現型に対するFVLの臨床影響の評価は、議論の余地があり、他の後天性及び遺伝的修飾因子の複合体相互作用によって阻害された。従って、マウスモデルの使用はいくつかの後天性因子の影響を最小限にするものである。重篤な血友病A或いはBに対するマウスモデルにおける自発性出血発症の発生は稀である。従って、重篤な血友病表現型に対するFVLの効果を適当に扱うために、一連のin vivo止血テストをこれら動物モデルに行った
FVL変異を有する血友病マウスは、トロンビン産生の増強を反映した、aPTT−ベースアッセイの短縮及びTATレベルの増加によって決定されたように、止血において改善を示した。止血のin vitroパラメータに対する改善がin vivoで血友病表現型に対して関連影響を与えるかを検討するために、マウスを一連の止血実験に供した。
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Claims (15)
- 治療を必要とする患者における血友病を治療する方法であって、
FV変異体の活性型或いはその誘導体の有効量を投与する工程を有し、それによって前記患者における血栓形成を増強し、先天性及び遺伝性出血疾患の症状を軽減するものである、方法。 - 請求項1記載の方法において、前記誘導体は、FV−810;アミノ酸811−1491を欠損した第V因子、FV−859;アミノ酸860−1491を欠損した第V因子、FV−866;アミノ酸867−1491を欠損した第V因子、FV−902;アミノ酸903−1491を欠損した第V因子、FV−924;アミノ酸923−1491を欠損した第V因子、FV−937;アミノ酸938−1491を欠損した第V因子、FV−956;アミノ酸957−1491を欠損した第V因子、FV−1033−B58−s131;第VIII因子のアミノ酸907−1037と変換されたアミノ酸900−1030を有するアミノ酸1034−1491を欠損した第V因子、FV−1033−B58−s104;第VIII因子のアミノ酸972−1075と変換されたアミノ酸904−1007を有するアミノ酸1034−1491を欠損した第V因子、及びFV−1033−B58−s46;第VIII因子のアミノ酸1032−1077と変換されたアミノ酸963−1008を有するアミノ酸1034−1491を欠損した第V因子から成る群から選択されるものである。
- 血友病Aを治療するための、請求項1記載の方法。
- 血友病Bを治療するための、請求項1記載の方法。
- 請求項1記載の方法において、前記FVの活性型或いはその誘導体は静脈内に送達されるものである。
- 請求項1記載の方法において、前記FVの活性型或いはその誘導体をコードするベクターは前記患者へ投与されるものである。
- 請求項1記載の方法において、前記変異体はプロ凝固因子であり、前記疾患は、血友病A及びB、阻害抗体に関連した血友病A及びB、凝固因子欠損、ビタミンKエポキシド還元酵素C1欠損、ガンマ−カルボキシラーゼ欠損、外傷、傷害、血栓、血小板減少症、脳卒中、凝固障害、播種性血管内凝固(DIC)に関連した出血、過剰抗凝固治療疾患、ベルナールスーリエ症候群、グランツマン血小板無力症、及び貯蔵プール欠乏症から成る群から選択されるものである。
- 請求項7記載の方法において、前記過剰抗凝固治療疾患は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワルファリン、小分子抗血栓性、及びFXa阻害剤の投与に起因するものである。
- 請求項1記載の方法において、前記変異体は、約10〜500μg/kgの間の用量で少なくとも1日1回静脈内に投与されるものである。
- FVの活性型をコードする単離核酸分子であって、前記FVの活性型はFV−859、FV−866、FV−924及びFV−937から成る群から選択されるものである、単離核酸分子。
- FVの単離活性型であって、前記FVの活性型は、請求項1記載の核酸分子によってコードされているものである、FVの単離活性型。
- FVの活性型をコードする単離核酸分子であって、前記FVの活性型の506、306及び679位で少なくとも1つのアルギニン残基は、アルギニン以外のアミノ酸で置換されているものである、単離核酸分子。
- 請求項12記載の単離核酸分子において、前記アルギニン残基はグルタミンで置換されているものである。
- 請求項12記載の核酸分子において、前記FVの活性型は、FV−810;FV−859;FV−866;FV−902;FV−924;FV−937;FV−1033−B58−s131;FV−1033−B58−s104及びFV−1033−B58−s46から成る群から選択されるものである。
- FVの単離活性型であって、前記FVの活性型は、請求項12記載の核酸分子によってコードされているものである、FVの単離活性型。
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