ES2821832T3 - Modificación de FVIII dirigida al sitio - Google Patents

Modificación de FVIII dirigida al sitio Download PDF

Info

Publication number
ES2821832T3
ES2821832T3 ES16186901T ES16186901T ES2821832T3 ES 2821832 T3 ES2821832 T3 ES 2821832T3 ES 16186901 T ES16186901 T ES 16186901T ES 16186901 T ES16186901 T ES 16186901T ES 2821832 T3 ES2821832 T3 ES 2821832T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
fviii
cysteine
mutein
factor viii
peg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16186901T
Other languages
English (en)
Inventor
Clark Q Pan
John E Murphy
Baisong Mei
Jonathan S Strauss
Hendri Tjandra
Jianmin Chen
Thomas Barnett
Liang Tang
Deqian Wang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Healthcare LLC
Original Assignee
Bayer Healthcare LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36337298&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2821832(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bayer Healthcare LLC filed Critical Bayer Healthcare LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2821832T3 publication Critical patent/ES2821832T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

Un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional con el dominio B eliminado que está mutado de manera que el resto de lisina en la posición de aminoácido 1804 se sustituye por un resto de cisteína de manera que exista un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante en la posición de aminoácido 1804.

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación de FVIII dirigida al sitio
Campo de la invención
La presente invención se refiere a las muteínas del factor VIII (FVIII) con el dominio B eliminado que permiten el acoplamiento, en un sitio determinado, a uno o más polímeros biocompatibles tales como el polietilenglicol. Además, se proporcionan formulaciones relacionadas, dosificaciones, y sus usos con fines terapéuticos. Estas muteínas del FVIII modificado son útiles para proporcionar una opción de tratamiento con una frecuencia de inyecciones reducida y una respuesta inmunogénica reducida para individuos afectados con hemofilia A.
Antecedentes de la invención
La hemofilia A es el trastorno de la coagulación hereditario más común, con una incidencia estimada de 1 por cada 5000 hombres. Está causada por la deficiencia o defectos estructurales del FVIII, un componente crítico de la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea. El tratamiento actual para la hemofilia A implica la inyección intravenosa de FVIII humano. El FVIII humano se ha producido de manera recombinante como una molécula de cadena sencilla de aproximadamente 300 kD. Consiste en los dominios estructurales A1-A2-B-A3-C1-C2 (Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp. 11-22). El producto precursor se procesa en dos cadenas polipeptídicas de 200 kD (pesada) y de 80 kD (ligera) en el aparato de Golgi, manteniendo unidas las dos cadenas por iones metálicos (Kaufman y col., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352; Andersson y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979).
Parece que el dominio B del FVIII es prescindible ya que se ha demostrado que el FVIII con el dominio B eliminado (BDD, cadena pesada A1-A2 de 90 kD más la cadena ligera de 80 kD) es eficaz como terapia de remplazo para la hemofilia A. La secuencia del dominio de FVIII que se elimina contiene una eliminación de todos excepto los 14 aminoácidos del dominio B.
Los pacientes de hemofilia A se tratan actualmente con la administración intravenosa de FVIII según lo necesiten o como terapia profiláctica administrada varias veces a la semana. Para el tratamiento profiláctico se administra factor VIII a 15-25 UI/kg de peso corporal tres veces a la semana. Esto es necesario constantemente para el paciente. Debido a su corta semivida en el hombre, el FVIII se tiene que administrar frecuentemente. A pesar de su gran tamaño de más de 300 kD para la proteína de longitud completa, el FVIII tiene una semivida en los seres humanos de solo 11 horas (Ewenstein y col, 2004, Semin. Hematol. 41, pp. 1-16). La necesidad de inyecciones intravenosas frecuentes crea tremendas barreras a la conformidad del paciente. Sería más conveniente para los pacientes que se pudiera desarrollar un producto de FVIII que tuviera una semivida más larga y que por lo tanto necesitara una administración menos frecuente. Además, el coste del tratamiento se podría reducir si se aumenta la semivida debido a que se necesitarían menos dosificaciones.
Una desventaja adicional de la terapia actual es que aproximadamente el 25-30 % de los pacientes desarrollan anticuerpos que inhiben la actividad del FVIII. Los epítopos principales de los anticuerpos inhibidores se localizan en el dominio a 2 en los restos 484-508, el dominio A3 en los restos 1811-1818, y el dominio C2 (Saenko y col., 2002, Haemophilia 8, pp. 1-11). El desarrollo de anticuerpos evita el uso de FVIII como terapia de remplazo, forzando a este grupo de pacientes a buscar un tratamiento incluso más caro con una alta dosis de Factor VIIa recombinante y terapia de inmunotolerancia.
Los siguientes estudios identificaron los epítopos de FVIII de los anticuerpos inhibidores. En un estudio de 25 muestras de plasma inhibidoras, se descubrió que 11 se unían al fragmento A3C1C2 de cadena ligera a 73 kD generado de trombina, 4 al dominio A2, y 10 a ambos (Fulcher, C. y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp. 7728-32). En otro estudio, seis de 8 inhibidores del dominio A2 de los pacientes se neutralizaron con un polipéptido A2 recombinante (Scandella, D. y col., 1993, Blood 82(6), pp. 1767-75). Los epítopos de seis de nueve inhibidores de los pacientes se mapearon en los restos 379-538 de A2 (Scandella, D. y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp. 6152-6). Se localizó un epítopo de 18 cadenas pesadas inhibidoras para la misma región del extremo N de 18,3 kD del dominio A2 (Scandella, D. y col., 1989, Blood 74(5), pp. 1618-26).
Una molécula de FVIII activa recombinante híbrida humana/porcina, generada remplazando los restos del dominio A2 humano 387-604 con la secuencia porcina homóloga, era resistente a un inhibidor A2 del paciente (Lubin, I. y col., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp. 8639-41) y resistente a un anticuerpo monoclonal murino mAb 413 IgG que compite con los inhibidores A2 del paciente por la unión con A2 (Scandella, D. y col., 1992, Thromb Haemost. 67(6), pp. 665­ 71). Este epítopo de dominio A1 se localizó adicionalmente en los restos 484-508 del dominio A2 cuando los experimentos demostraron que el mAb 413 IgG y cuatro inhibidores de paciente no inhibían un FVIII híbrido humano/porcino en el que los restos 484-508 del dominio A2 se remplazaban con los porcinos (Healey, J. y col., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp. 14505-9). Este FVIII híbrido también era más resistente para al menos la mitad de los 23 pacientes explorados (Barrow, R. y col., 2000, Blood 95(2), pp. 564-8). La mutagénesis por exploración de alanina identificó que el resto 487 era crítico para la unión con los cinco inhibidores de paciente ensayados, mientras que los restos 484, 487, 489 y 492 eran importantes para la interacción con el mAb 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp. 30191-5). Los títulos de anticuerpos inhibidores en ratones que recibían el mutante R484A/R489A/P492A, pero no el mutante R484A/R489A, eran significativamente menores que en los ratones que recibían el FVIII BDD humano de control (Parker, E. y col., 2004, Blood 104(3), pp. 704-10). En suma, la región 484-508 del dominio A2 parece que es un sitio de unión para los inhibidores de la actividad del FVIII.
Además del desarrollo de una respuesta inmunitaria contra FVIII, otro problema con la terapia convencional es que necesita una dosificación frecuente debido a la corta semivida del FVIII in vivo. Se han estudiado los mecanismos de aclaramiento de FVIII de la circulación.
El aclaramiento de FVIII de la circulación se ha atribuido en parte a la unión específica a la proteína relacionada con el receptor lipoproteico de baja densidad (LRP), un receptor de aclaramiento hepático con una amplia especificidad de ligando (Oldenburg y col., 2004, Haemophilia 10 Supl. 4, pp. 133-139). Recientemente, el receptor lipoproteico de baja densidad (LDL) también demostró que tenía un papel en el aclaramiento del FVIII, tal como cooperando con el LRP en la regulación de los niveles plasmáticos del FVIII (Bovenschen y col., 2005, Blood 106, pp. 906-910). Ambas interacciones están facilitadas por la unión a los proteoglicanos de sulfato de heparina de la superficie celular (HSPG). La semivida en el plasma en ratones puede prolongarse 3,3 veces cuando se bloquea la LRP o de 5,5 veces cuando se bloquean tanto la LRP como los HSPG de la superficie celular (Sarafanov y col., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp.
11970-11979). Se ha hecho la hipótesis de que HSPG concentran el FVIII en la superficie celular y lo presentan a la LRP. Los sitios de unión de LRP a FVIII se han localizado en los restos de A2484-509 (Saenko y col., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 37685-37692), los restos 1811-1818 de A3 (Bovenschen y col., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp. 9370­ 9377) y un epítopo en el dominio C2 (Lenting y col., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 23734-23739).
El FVIII también se aclaraba de la circulación por la acción de las proteasas. Para entender este efecto, se tiene que entender el mecanismo por el que el FVIII está implicado en la coagulación sanguínea. El FVIII circula como un heterodímero de cadenas pesadas y ligeras, unido al vWF. En la unión con el vWF están implicados los restos 1649­ 1689 de FVIII (Foster y col., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp. 5230-5234), y partes de los dominios C1 (Jacquemin y col., 2000, Blood 96, pp. 958-965) y C2 (Spiegel, P. y col., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp. 53691-8). El FVIII se activa por trombina, que escinde los enlaces peptídicos después de los restos 372, 740 y 1689 para generar un heterotrímero de los dominios A1, A2, y A3-C1-C2 (Pittman y col., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp. 12434-12439). Al activarse, el FVIII se disocia del vWF y se concentra en la superficie celular de plaquetas uniéndose a los fosfolípidos. La unión a los fosfolípidos implica los restos 2199, 2200, 2251, y 2252 de fViII (Gilbert y col., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp.
6374-6381). Ahí se une al FIX mediante interacciones con los restos 558-565 (Fay y col., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 20522-20527) y 1811-1818 de FVIII (Lenting y col., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935-1940) y FX mediante las interacciones con los restos 349-372 de FVIII (Nogami y col., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp. 15763-15771) y actúa como cofactor para la activación de FX por FIX, un componente esencial de la ruta de coagulación intrínseca. El FVIII activado (FVIIIa) está parcialmente inactivado por la proteína C activada por proteasas (APC) mediante la escisión después de los restos 336 y 562 de FVIII (Regan y col., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987). El determinante predominante de inactivación, sin embargo, es la disociación del dominio A2 del A1 y A3-C1-C2 (Fay y col., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp. 8957-8962).
Un procedimiento que ha demostrado aumentar la semivida in vivo de una proteína es la PEGilación. La PEGilación es la unión covalente de moléculas de polietilenglicol (PEG) de cadena larga a una proteína u otra molécula. El PEG puede estar en forma lineal o en forma ramificada para producir moléculas diferentes con características diferentes. Además de para aumentar la semivida de péptidos o proteínas, la PEGilación se ha utilizado para reducir la producción de anticuerpos, proteger la proteína de la digestión por proteasas y mantener el material aparte del filtrado renal (Harris y col., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-551). Además, la PEGilación puede aumentar también la estabilidad general y la solubilidad de la proteína. Finalmente, la concentración sostenida de proteínas PEGiladas puede reducir la extensión de efectos secundarios adversos reduciendo los niveles de depresión a pico de un fármaco, eliminando de esta manera la necesidad de introducir niveles súper-fisiológicos de proteína en puntos de tiempo tempranos (Harris y col., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40(7): 539-551, Resumen).
Se ha intentado la modificación aleatoria de FVIII dirigiéndose a aminas primarias (extremo N y lisinas) con grandes polímeros tales como el PEG y dextrano con distintos grados de éxito (documento WO94/15625, Patente de EE. UU.
4970300, Patente de EE. UU. 6048720). La mejoría más impresionante, publicada en una solicitud de patente de 1994 (documento WO94/15625), muestra una mejoría de la vida media de 4 veces pero con un coste de pérdida de actividad de 2 veces tras hacer reaccionar el FVIII de longitud completa con un exceso molar de 50 veces de PEG. El documento WO2004/075923 desvela conjugados de FVIII y polietilenglicol que se habían creado por modificación aleatoria. Las proteínas PEGiladas aleatorias, tales como el interferón alfa (Kozlowski y col, 2001, BioDrugs 15, pp. 419-429) se han aprobado en el pasado como agentes terapéuticos.
Esta estrategia aleatoria, sin embargo, es mucho más problemática para el FVIII heterodimérico. El FVIII tiene cientos de sitios potenciales para la PEGilación, incluyendo 158 lisinas, los dos extremos N, y múltiples histidinas, serinas, treoninas, y tirosinas, los cuales podrían PEGilarse potencialmente con reactivos que se dirigen primeramente a las aminas primarias. Por ejemplo, se demostró que el isómero posicional principal para el interferón alfa-2b PEGilado era una histidina (Wang y col., 2000, Biochemistry 39, pp. 10634-10640). Además, el procesamiento heterogéneo del FVIII de longitud completa puede dar lugar a una mezcla de material de partida que da lugar a una complejidad adicional en los productos PEGilados. Un inconveniente adicional de no controlar el sitio de PEGilación en FVIII es la reducción potencial de la actividad si el PEG se uniera en o cerca de sitios activos críticos, especialmente si más de un PEG o un PEG único grande se conjugan con el FVIII. Debido a que la PEGilación aleatoria invariablemente producirá grandes cantidades de múltiples productos PEGilados, la purificación para obtener solo productos mono-PEGilados disminuirá drásticamente el rendimiento total. Finalmente, la enorme heterogeneidad en el perfil del producto hará que la síntesis y caracterización de cada lote sea prácticamente imposible. Como la buena fabricación requiere un producto consistente, bien caracterizado, la heterogeneidad del producto es una barrera para la comercialización. Por todas estas razones, se desea un procedimiento más específico para PEGilar FVIII.
Se han resumido distintas estrategias de PEGilación dirigida al sitio en una reciente revisión (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, disponible en internet como del 15 de octubre de 2005, identificador de objeto directo ido:10.1016/j.cbpa.2005.10.007). Una estrategia implica la incorporación de un aminoácido innatural en proteínas por síntesis química o expresión recombinante seguido por la adición de un derivado de PEG que reaccionará específicamente con el aminoácido innatural. Por ejemplo, el aminoácido innatural puede ser uno que contenga un grupo ceto que no se encuentra en proteínas nativas. Sin embargo, la síntesis química de proteínas no es factible para una proteína tan grande como el FVIII. El límite actual de la síntesis peptídica es aproximadamente 50 restos. Se pueden ligar varios péptidos para formar una pieza más grande de polipéptido, pero incluso para producir el FVIII con el dominio B eliminado se necesitaría ligar más de 20 veces, lo que resultaría en menos de un 1 % de recuperación incluso en condiciones de reacción ideales. La expresión de proteínas con aminoácidos innaturales se ha limitado principalmente a sistemas de expresión no mamíferos. Se espera que esta estrategia sea problemática para una proteína grande y compleja tal como el FVIII que necesita expresarse en sistemas de mamífero.
El documento WO90/12874 desvela la modificación específica del sitio de los polipéptidos IL-3 humana, factor estimulante de colonias de granulocitos y eritropoyetina insertando o sustituyendo una cisteína por otro aminoácido, añadiendo después un ligando que tiene un grupo reactivo sulfhidrilo. El ligando se acopla selectivamente a los restos de cisteína. La modificación de FVIII o cualquier variante del mismo no se desvela.
Por las razones establecidas anteriormente, existe la necesidad de una variante del FVIII con el dominio B eliminado mejorada que posea una mayor duración de acción in vivo e inmunogenicidad reducida, que retenga la actividad funcional. Además, es deseable que dicha proteína se produzca como un producto homogéneo de manera constante.
Sumario de la invención
Es un objetivo de la invención proporcionar un FVIII polipeptídico funcional conjugado con un polímero biocompatible que tenga reducida la unión a la proteína relacionada con el receptor lipoproteico de baja densidad (LPR), receptor lipoproteico de baja densidad (LDL), proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) y/o anticuerpos inhibidores contra el FVIII.
Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar una variante mejorada de FVIII que posea mayor duración de acción in vivo e inmunogenicidad reducida, que es capaz de producirse como un producto homogéneo de manera constante.
La invención se define en las reivindicaciones. En un aspecto de la invención, se proporciona un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional con el dominio B eliminado, que está mutado de manera que el resto de lisina en la posición de aminoácido 1804 se sustituye por un resto de cisteína de manera que exista un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante en la posición de aminoácido 1804. La invención también incluye un procedimiento para la preparación de este conjugado. La invención se dirige también a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La invención también incluye el conjugado para su uso en el tratamiento de la hemofilia.
La invención también se refiere a un procedimiento para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína del factor VIII que comprende (a) la expresión de una muteína del factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado dirigida al sitio en la que la muteína tiene una sustitución de cisteína en un resto de aminoácido en la posición de aminoácido 1804 y la cisteína está protegida; (b) la puesta en contacto de la muteína de cisteína con un reductor en condiciones para reducir moderadamente la muteína de cisteína y liberar la protección; (c) la eliminación de la protección y del reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos 5 minutos después de la eliminación del reductor, el tratamiento de la muteína de cisteína con PEG que comprende una fracción de acoplamiento de sulfhidrilo en condiciones tales que se produzca la muteína del factor VIII PEGilada.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1. Mapas de vector y estrategia de mutagénesis para las muteínas de PEG.
FIG. 2. Procedimiento de PEGilación dirigida al sitio en tres etapas. PEG representa un PEG reactivo con cisteína tal como un PEG-maleimida. Las barras cerradas representan la formación de disulfuro mientras que las barras abiertas representan las cisteínas reducidas.
FIG. 3. Gel que muestra la PEGilación de PEG2+14 en función de concentración de reductor. Se trataron el PEG2+14 se trató con 67 a 670 uM de TCEP durante 30 min a 40C. El reductor se retiró en una columna de centrifugación seguido por PEGilación con un PEG de 12 kD. Las cadenas pesada y ligera de FVIII están resaltadas por “H” y “L” respectivamente. Los dos puntos puntualizan las cadenas pesada y ligera PEGiladas.
FIG. 4. Espectro de masas desarrollado de PEG2+14 tratado en 67 a 670 uM de TCEP seguido por eliminación del reductor
Descripción detallada de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. La presente invención se basa en el descubrimiento de que los FVIII polipeptídicos con el dominio B eliminado mutados se pueden unir covalentemente a un sitio predefinido de un polímero biocompatible que no sea una amina del extremo N, y de que dichos polipéptidos mantienen sustancialmente su actividad coagulante. Además, estos conjugados polipeptídicos tienen un tiempo de circulación mejorado y antigenicidad reducida. Los conjugados de la invención son ventajosos respecto a los conjugados de la técnica anterior que tenían uniones aleatorias del polímero a FVIII o uniones en el extremo N. Dicha unión dirigida al sitio permite diseñar modificaciones que eviten las regiones necesarias para la actividad biológica y de esta manera mantener sustancialmente la actividad de FVIII. También permite diseñar dónde unir los polímeros para bloquear la unión a sitios implicados en el aclaramiento de FVIII. Dicha unión dirigida al sitio también permite un producto uniforme más que los conjugados heterogéneos producidos en la técnica por acoplamiento aleatorio del polímero.
Definiciones
Polímero biocompatible. Un polímero biocompatible incluye óxidos de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG).
Polietilenglicol (PEG). “PEG” y “polietilenglicol” como se utilizan en el presente documento son intercambiables e incluyen cualquier poli(óxido de etileno) hidrosoluble. El término “PEG” también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, mayor del 50 %, de subunidades -OCH 2CH2-repetidas.
PEGilación. PEGilación es un procedimiento por el que un polietilenglicol (PEG) se une covalentemente a una molécula tal como una proteína.
FVIII con el dominio B eliminado (BDD). Como se utiliza en el presente documento, BDD se caracteriza por tener la secuencia de aminoácidos que contiene una eliminación de casi todos los 14 aminoácidos del dominio B de FVIII. Los primeros 4 aminoácidos del dominio B (SFSQ, SEQ ID NO: 1) están unidos a los 10 últimos restos del dominio B (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 2). (Lind, P. y col, 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp. 19-27). El BDD utilizado en el presente documento tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Factor VIII polipeptídico funcional. Como se utiliza en el presente documento factor VIII polipeptídico funcional significa un polipéptido o combinación de polipéptidos funcionales que son capaces, in vivo o in vitro, de corregir las deficiencias de factor VIII humano, que caracterizan, por ejemplo, la hemofilia A. El factor VIII tiene múltiples formas de degradación o procesadas en el estado natural. Estos se derivan proteolíticamente de un precursor, una cadena proteica, como se demuestra en el presente documento. Un factor VIII polipeptídico funcional incluye dicha proteína de cadena sencilla y también proporciona estos distintos productos de degradación que tienen actividad biológica corrigiendo las deficiencias de factor VIII humano. Probablemente existen variaciones alélicas. Los factores VIII polipeptídicos funcionales incluyen todas dichas variaciones alélicas, versiones glucosiladas, modificaciones y fragmentos que dan como resultado derivados del factor VIII siempre que contengan el segmento funcional del factor VIII humano y la actividad esencial, característica del factor VIII humano funcional permanezca sin afectar del mismo modo. Estos derivados del factor VIII que poseen el requisito de actividad funcional se pueden identificar fácilmente por ensayos in vitro directos descritos en el presente documento. Además, el factor VIII polipeptídico funcional es capaz de catalizar la conversión del factor X a Xa en presencia del factor IXa, calcio, y fosfolípidos, así como la corrección del defecto de coagulación en el plasma derivado de individuos afectados por hemofilia A. A partir de la divulgación de la secuencia de secuencias de aminoácidos del factor VIII humano y las regiones funcionales en la misma, los fragmentos que se pueden derivar mediante el corte con enzimas de restricción del ADN o proteolítico u otra degradación del factor VIII proteico humano serán evidentes para los expertos en la técnica.
Muteína. Una muteína es una proteína modificada genéticamente que aparece como resultado de una mutación inducida en el laboratorio en una proteína o polipéptido.
Discusión
La mutación dirigida al sitio de una secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido que tiene actividad FVIII puede producirse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los procedimientos preferidos incluyen la mutagénesis para introducir un codón de cisteína en el sitio elegido para la unión covalente del polímero. Esto se puede conseguir utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio tal como el kit de mutagénesis dirigida al sitio cQuickChange™ de Stratagene, el kit de mutagénesis dirigida al sitio n.° K1600-1 Transformer de Clontech, el sistema de mutagénesis dirigida al sitio n.° 12397014 GenTaylor de Invitrogen, el kit de sistema de mutagénesis in vitro n.° Q6210 Altered Sites II de Promega, o el kit de mutagénesis por PCR n.° TAK RR016.
Los conjugados de la invención pueden prepararse remplazando primero el codón de uno o más aminoácidos en la superficie del FVIII polipeptídico funcional con un codón para la cisteína, produciendo la muteína de cisteína en un sistema de expresión recombinante, hacer reaccionar la muteína con un reactivo polimérico específico de cisteína, y purificar la muteína.
En los ejemplos siguientes, las muteínas se nombran de la manera convencional en la técnica. La convención para nombrar los mutantes se basan en la secuencia de aminoácidos del Factor VIII de longitud completa, maduro como se proporciona en SEQ ID NO: 4. Como una proteína secretada, el FVIII contiene una secuencia de señal que está escindida proteolíticamente durante el proceso de traducción. Después de la retirada de la secuencia de señal de 19 aminoácidos, el primer aminoácido del producto FVIII secretado es una alanina.
Como es convencional y se utiliza en el presente documento, cuando se hace referencia a aminoácidos mutados en BDD FVIII, el aminoácido mutado se designa por su posición en la secuencia del FVIII de longitud completa. Por ejemplo, la muteína PEG6 expuesta posteriormente se designa K1808C debido a que cambia la lisina (K) en la posición análoga a 1808 en la secuencia de longitud completa por cisteína (C).
La afinidad de unión de LRP, receptor LDL, o HSPG por el FVIII puede determinarse utilizando una tecnología de resonancia de plasmones superficiales (Biacore). Por ejemplo, el FVIII se puede revestir directa o indirectamente por medio de un anticuerpo de FVIII contra un chip Biacore™, y se pueden pasar concentraciones variables de LRP sobre el chip para medir tanto la tasa de asociación como de disociación de la interacción (Bovenschen N. y col., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp. 9370-7). la relación de las dos tasas da una medida de la afinidad. Sería deseable una disminución de la afinidad de dos veces, preferentemente cinco veces, más preferentemente diez veces, e incluso más preferentemente de 30 veces con la PEGilación.
La degradación de un FVIII por la proteasa APC se puede medir por cualquiera de los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína del factor VIII que comprende: (a) la expresión de una muteína del factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado dirigida al sitio en la que la muteína tiene una sustitución de cisteína en un resto de aminoácido en la posición de aminoácido 1804 y la cisteína tiene una protección; (b) la puesta en contacto de la muteína de cisteína con un reductor en condiciones para reducir moderadamente la muteína de cisteína y liberar la protección; (c) la eliminación de la protección y del reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos 5 minutos, y preferentemente al menos 15 minutos, aún más preferentemente al menos 30 minutos después de la eliminación del reductor, el tratamiento de la muteína de cisteína con PEG que comprende una fracción de acoplamiento de sulfhidrilo en condiciones tales que la muteína del factor VIII PEGilado se produzca. La fracción de acoplamiento de sulfhidrilo del PEG se selecciona del grupo que consiste en fracciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo y maleimida, preferentemente maleimida.
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para la administración parenteral que comprende cantidades terapéuticamente eficaces de los conjugados de la invención, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables son sustancias que se pueden añadir al principio activo para formular o estabilizar la preparación y que no produzcan efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. Los ejemplos de dichos adyuvantes son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, agua, azúcares tales como maltosa o sacarosa, albúmina y sales. Otros adyuvantes se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz del conjugado junto con una cantidad adecuada de vehículo con el fin de preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración eficaz al huésped. Por ejemplo, el conjugado se puede administrar por vía parenteral a los sujetos que padecen hemofilia A con una dosificación que puede variar con la gravedad del episodio hemorrágico. Las dosis medias administradas por vía intravenosa están en el intervalo de 40 unidades por kilogramo para indicaciones pre-operatorias, 15 a 20 unidades por kilogramo para una hemorragia menor, y de 20 a 40 unidades por kilogramo administradas durante un periodo de 8 horas para una dosis de mantenimiento.
El procedimiento de la invención implica la sustitución de un aminoácido del BDD de superficie, producir la muteína de cisteína en un sistema de expresión de mamífero, reducir una cisteína que se haya protegido durante la expresión por cisteína del medio de cultivo, eliminar el reductor para permitir que se vuelvan a formar los disulfuros del BDD, y hacerlo reaccionar con un reactivo de polímero biocompatible específico de cisteína, tal como PEG-maleimida.
La posición 1804 se mutó a cisteína para permitir potencialmente el bloqueo de la unión a LRP tras la PEGilación.
En una realización, el medio de cultivo celular contiene cisteínas que "protegen" los restos de cisteína en la muteína mediante la formación de enlaces disulfuro. En la preparación del conjugado, la muteína de cisteína producida en el sistema recombinante se protege con una cisteína del medio y esta protección se retira mediante una reducción suave que libera la protección antes de añadir el reactivo polimérico específico de cisteína. Además, pueden usarse otros procedimientos conocidos en la técnica para la mutación específica del sitio de FVIII, como resultará evidente para un experto en la materia.
Ejemplos
Los ejemplos no cubiertos por las reclamaciones tienen fines ilustrativos.
ANÁLISIS DE LA RELACIÓN ENTRE ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD DE FVIII. Que el Factor VIII BDD pudiera mutarse específicamente y luego añadirse un polímero de una manera específica del sitio era sorprendente. Además, los resultados de mejora de las propiedades farmacocinéticas y mantenimiento de la actividad también eran sorprendentes, dados los problemas de los conjugados poliméricos anteriores que causaban adición no específica y actividad reducida.
El BDD de FVIII tiene 19 cisteínas, 16 de las cuales forman disulfuros y las otras tres son cisteínas libres (McMullen y col., 1995, Protein Sci. 4, pp. 740-746). El modelo estructural de BDD sugiere que las 3 cisteínas libres están ocultas (Stoliova-McPhie y col., 2002, Blood 99, pp. 1215-1223). Debido a que las cisteínas oxidadas no pueden PEGilarse por los PEG-maleimidas, las 16 cisteínas que forman disulfuros en BDD no pueden PEGilarse sin reducirse primero. Basándose en los modelos estructurales de BDD, las 3 cisteínas libres de BDD no se pueden PEGilar sin desnaturalizar antes la proteína para exponer estas cisteínas al reactivo de PEG. Por lo tanto, no parece factible conseguir una PEGilación específica de BDD por PEGilación de los restos de cisteína nativos sin alterar drásticamente la estructura de BDD, lo que muy probablemente alterará su función.
El estado redox de las 4 cisteínas del dominio B del FVIII de longitud completa es desconocido. La PEGilación de las 4 cisteínas del dominio B puede ser posible si no forman disulfuros y están expuestas en la superficie. Sin embargo, debido a que el FVIII de longitud completa y el BDD tienen un perfil farmacocinético similar (PK) y semividas similares in vivo (Gruppo y col., 2003, Haemophilia 9, pp. 251-260), es improbable que la PEGilación del dominio B dé como resultado una semivida plasmática mejorada a menos que el PEG también proteja las regiones no del dominio B.
Stoilova-McPhie, S. y col., 2002, Blood 99(4), pp. 1215-23 muestra la estructura del BDD.
La especificidad de la PEGilación se puede conseguir modificando restos de cisteína únicos en el dominio A3 utilizando técnicas de mutagénesis de ADN recombinante seguido por PEGilación específica del sitio de la cisteína introducida con un reactivo PEG específico de cisteína tal como PEG-maleimida. Otra ventaja de PEGilar en 484-509 y 1811-1818 es que estos dos epítopos representan dos de las tres clases principales de sitios antigénicos inhibidores en los pacientes.
La región 1811-1818 está implicada en la unión tanto con LRP como con FIX (Bovenschen y col., 2003, J. Biol. Chem.
278, pp. 9370-9377; Lenting y col., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935-1940). PEG14 (1804) se diseñó para que estuviera cerca del bucle 1811-1818 pero no en el bucle, de manera que se pudiera disociar la unión a LRP de FIX con diferentes tamaños de PEG.
MUTAGÉNESIS. Los sustratos para la PEGilación dirigida al sitio de FVIII se pueden generar introduciendo un codón de cisteína en el sitio escogido para la PEGilación. Se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio cQuickChange™ II de Stratagene para fabricar todos los mutantes de PEG (kit Stratagene 200523 de Stratagene Corporation, La Jolla, CA). El procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio cQuikChange™ se llevó a cabo utilizando la ADN polimerasa Pfu Turbo® y un ciclador de temperatura. Se alargaron dos oligonucleótidos cebadores incluidos, que contenían la mutación deseada utilizando la Pfu Turbo, la cual no desplazaba los cebadores. Se utilizó el gen de FVIII tipo silvestre que contenía el ADNdc como matriz. A continuación de los múltiples ciclos de elongación, el producto se digirió con la endonucleasa DpnI, que es específica para el ADN metilado. El ADN recién sintetizado, que contenía la mutación, no está metilado, mientras que el ADN parental de tipo silvestre está metilado. El ADN digerido se utiliza entonces para transformar células supercompetentes de XL-1 Blue.
La eficacia de la mutagénesis es de casi el 80 %. Las reacciones de mutagénesis se llevaron a cabo en pSK207+BDD C2.6 o pSK207+BDD (Figura 1). La mutagénesis satisfactoria se confirmó por secuenciación de ADN y los fragmentos apropiados, que contenían la mutación, se transfirieron a la matriz de FVIII en el vector de expresión de mamífero pSS207+BDD. Tras la transferencia, se confirmó la secuencia de todas las mutaciones. Para las muteínas de A3 se hicieron las mutagénesis de PEG 6, 7, 8, 9 Y 10, en el vector pSK207+BDD C2.6. Tras confirmarse por secuenciación, el fragmento mutante, KpnI/Pme se subclonó en pSK207+BDD. La muteína BDD se subclonó entonces en el vector de expresión pSS207+BDD. Para las muteínas de A3 PEG 11, 12, 13, 14, la mutagénesis se hizo directamente en el vector pSK207+BDD y la secuencia confirmada de BDD mutante se subclonó en pSS207+BDD. Para las muteínas A2 PEG 1, 2, 3, 4,5, la mutagénesis se hizo en el vector pSK207+BDD C2.6. La secuencia mutante confirmada se subclonó en pSK207+BDD y después en pSS207+BDD.
CEBADORES (SOLO EN SENTIDO DIRECTO) QUE SE UTILIZAN PARA MUTAGÉNESIS:
PEG14, K1804C: GGAGCAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT (SEQ ID NO: 18)
EXPRESIÓN DE MUTEÍNAS. Tras la inserción en un vector que da lugar a resistencia a Higromicina B, las muteínas de PEG se transfectaron en células HKB11 (Patente de EE. UU. 6.136.599) formando un complejo con el reactivo de transfección Fectin 293 (Invitrogen Corp. n.° de Cat. 12347-019) según las instrucciones del fabricante. Se evaluó la expresión de FVIII a los tres días post-transfección por el ensayo cromogénico Coatest (Chromogenix Corp. n.° de cat.
821033, véase el Ensayo cromogénico). Las células transfectadas se colocaron entonces bajo presión selectiva con 50 |jg/ml de Hig. B en un medio de cultivo suplementado con un 5 % de FBS. Cuando aparecieron las colonias resistentes a Hig B, se recolectaron manualmente y se exploraron en cuanto a la expresión de FVIII por el ensayo cromogénico Coatest. Las células que expresaban FVIII establemente se adaptaron entonces a un medio que contenía un suplemento HPPS. Las células se expandieron y sembraron a 1 x 106 células/ml en matraces con agitado con medio reciente. El fluido de cultivo tisular (TCF), recolectado tras 3 días, se utilizaron para la purificación de muteínas BDD de FVIII. La actividad de FVIII del TCF se ensayó por el Coatest (Tabla 1).
La PEG 14 de transfecciones transitorias y estables tenía el siguiente nivel de expresión: transitorias: 0,18 IU/ml; estables: 1,14 UI/ml.
PURIFICACIÓN DE MUTEÍNAS. Al recolectar el sobrenadante del cultivo celular que contiene la muteína secretada del FVIII proteico, se filtró el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,2 micrómetros para retirar las células restantes. El sobrenadante se concentró entonces por ultrafiltración o intercambio aniónico. Entonces se aplicó en una columna de inmunoafinidad donde los componentes del medio de cultivo celular y la mayoría de las impurezas proteicas de la célula huésped se retiran. El eluido de la columna de inmunoafinidad se intercambia de tampón por diafiltración en un tampón de formulación que contiene sacarosa y se congela. Se evaluó el rendimiento y recuperación de proteínas a través de una columna de anticuerpo monoclonal de FVIII mediante un ensayo cromogénico. PEGILACIÓN. El FVIII o BDD no se puede PEGilar por PEG específicos de cisteína sin reducción y desnaturalización en una relación de un exceso de 100 veces de PEG: proteína (datos no mostrados), lo que confirma la hipótesis que se basa en el modelo de la estructura de BDD en el que todas las cisteínas nativas forman disulfuros o están escondidas dentro de la FVIII. FVIII
En otro aspecto, se desarrolló un procedimiento en tres etapas que permitía la PEGilación de FVIII específica del sitio (Figura 3). En la etapa 1, la muteína de cisteína en FVIII purificada a aproximadamente 1 pM se reduce medianamente con reductores tales como aproximadamente 0,7 mM de Tris (2-carboxietil)fosfina (TCEp ) o 0,07 mM de ditiotreitol (DTT) durante 30 minutos a 40C para liberar la “protección”. En la etapa 2, el reductor se elimina junto con la “protección” por un procedimiento de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) tal como pasando la muestra a través de una columna con centrifugación (BioRad®) para permitir que se vuelvan a formar los sulfhidrilos de FVIII a la vez que se deja libre y reducida la cisteína introducida. En la etapa 3, al menos 30 minutos después de eliminar el reductor, la muteína de cisteína en FVIII liberada se trata con al menos un exceso molar de 10 veces de PEG-maleimida con tamaños que varían desde 5 a 64 kD (Nektar Therapeutics y N.O.F. Corporation) durante al menos 1 hora a 4 oc. Este procedimiento produce altamente un perfil de producto constante con datos reproducibles durante docenas de reacciones repetidas por diferentes individuos.
ANÁLISIS DE PEGILACIÓN POR SDS PAGE Y TRANSFERENCIA DE WESTERN. El producto PEGilado se puede analizar por electroforesis en un gel de poliacrilamida de SDS con un 6 % de Tris glicina reducido (Invitrogen). A continuación de la electroforesis, el gel se puede teñir con Azul de Coomassie para identificar todas las proteínas o se sometieron a un protocolo de transferencia de Western convencional para identificar el patrón de PEGilación en diferentes regiones del FVIII. La tinción de la transferencia con un anticuerpo monoclonal de ratón R8B12 o C7F7 producidos contra la región del extremo C de la cadena pesada del FVIII o la región del extremo N de la cadena ligera del FVIII, respectivamente, debería identificar la PEGilación de las respectivas cadenas.
ANÁLISIS DE PEGILACIÓN POR ESCISIÓN POR TROMBINA Y TRASNSFERENCIA DE WESTERN. El producto PEGilado se puede tratar con trombina (40 UI/ug de FVIII) a 37 oc durante 30 minutos. La trombina que se utilizó también contenía APC como contaminante. La escisión por trombina generará los dominios A1 de 50 kD y A2 de 43 kD de la cadena pesada, mientras que la escisión por APC dividirá adicionalmente el dominio A2 en los fragmentos de 21 y 22 kD.
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD
ENSAYO DE COAGULACIÓN. El procedimiento de ensayo de coagulación FVIII:C es un ensayo de una etapa que se basa en el tiempo parcial de tromboplastina activada (aPTT). El FVIII actúa como un cofactor en presencia del Factor IXa, calcio, y fosfolípidos en la conversión enzimática del Factor X a Xa. En este ensayo, las muestras de ensayo diluidas se incuban a 37 oc con una mezcla de sustrato de plasma deficiente en FVIII y reactivo para aPTT. Se añade cloruro de calcio a la mezcla incubada y se inicia la coagulación. Existe una relación inversa entre el tiempo (segundos) que se toma para la formación del coágulo y el logaritmo de la concentración de FVIII:C. Los niveles de actividad de muestras desconocidas se interpolan por comparación de los tiempos de coagulación de distintas diluciones de material de ensayo con una curva construida a partir de una serie de diluciones de material de referencia de actividad conocida y se presentan en unidades internacionales por ml (UI/ml).
ENSAYO CROMOGÉNICO. El procedimiento del ensayo cromogénico consiste de dos etapas consecutivas donde la intensidad del color es proporcional a la actividad de FVIII. En la primera etapa, se activa el Factor X a Factor Xa por el FIXa con su cofactor, el FVIIIa, en presencia de cantidades óptimas de iones de calcio y fosfolípidos. Están presentes cantidades en exceso de Factor X de manera que la tasa de activación del Factor X solamente depende de la cantidad de FVIII. En la segunda etapa, el Factor Xa hidroliza el sustrato cromogénico para dar lugar a un cromóforo y se lee la intensidad de color fotométricamente a 405 nm. La potencia desconocida se calcula y se comprueba la validez del ensayo con un procedimiento estadístico de relación de pendiente. La actividad se presenta en Unidades Internacionales por ml (UI/ml).
ANTÍGENO TOTAL DE ELISA (TAE). Se capturó el FVIII en una placa de microtitulación que se había revestido con un anticuerpo policlonal de FVIII. El FVIII unido se detecta con un anticuerpo policlonal biotinilado de rFVIII y un conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano rusticano (HRP). El complejo de peroxidasa-estreptavidina produce una reacción de color al añadirse el sustrato de tetrametilbencidina (t Mb ). Las concentraciones de muestra se interpolan a partir de una curva de referencia utilizando modelos ajustados de cuatro parámetros. Los resultados
PURIFICACION DE FVIII PEGILADO POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO. El FVIII PEGilado se aplica en una columna de intercambio aniónico o una columna de intercambio catiónico donde la proteína se une a la columna mientras que cualquier exceso de reactivo de PEG libre no se une y se elimina en el flujo continuo. La muteína PEG se eluye entonces de la columna con un gradiente de cloruro sódico. Se utilizó un gel del 4-12 % Bis-Tris teñido con bario-yodo de carga, flujo continuo, y fracciones de gradiente para confirmar que las fracciones de la elución de la columna tenía la muteína PEGilada.
PEG14 tratada con control de tampón tiene una actividad de coagulación de 6,8 UI/ml frente a 3,2 UI/ml para la muestra de PEG14 PEGilada de 12 kD. Sin embargo, la eficacia de la PEGilación de PEG14 tratado con tampón de control tenía una actividad de coagulación de 6,8 UI/ml vs. 3,2 UI/ml para la muestra de PEG14 PEGilado con 12 kD. Sin embargo, la eficacia de PEGilación era de aproximadamente el 80 %, lo que significa que el 3,2 UI/ml representa la actividad agregada de aproximadamente el 80 % PEGilado y el 20 % no PEGilado. Asumiendo que la muestra no PEGilada tiene la misma actividad que la PEG14 tratada con tampón de control, el porcentaje de actividad de no PEGilado para el PEG14 PEGilado se calcula que es del 34 % = (3,2-6,8 veces el 20 %) / (6,8 veces el 80 %).
Para confirmar los efectos del PEG sobre la actividad de coagulación de PEG14, se purificaron las construcciones PEGiladas del exceso de PEG y no PEGiladas. Como el PEG no tiene efecto sobre la actividad cromogénica la relación actividad cromogénica respecto a coagulación es una buena estimación del efecto relativo del PEG sobre la actividad de coagulación.
ESTUDIO DE PK EN RATÓN. Se utilizaron ratones con ICR normal o hemofílicos, deficientes de FVIII (Taconic, Hudson, NY) en los estudios de PK. Los ratones normales se utilizaron para el estudio, 5 ratones por grupo por punto de tiempo. Los materiales de ensayo se diluyeron en el tampón de formulación con una concentración nominal final de 25 UI/ml. Cada ratón se puede administrar a 4 ml/kg (-0,1 ml de volumen total) del material de ensayo diluido por la vena caudal. Las muestras de sangre (0,45 o 0,3 ml para el estudio en ratón normal o hemofílico, respectivamente) se extraen en una jeringa de 1 ml (cargada con 50 o 30 pl de Citrato Na al 3,8 % para el estudio con ratón normal o hemofílico, respectivamente) de la vena cava inferior en el punto de tiempo indicado (un animal por muestra). Las muestras de plasma se ensayan en cuanto a la concentración de FVIII utilizando el procedimiento del ensayo cromogénico que se ha descrito anteriormente. La PEG14 PEGilada presenta una recuperación de plasma mayor en comparación con BDD.
Tabla 6. Sumario del estudio de PK de FVIII PEGilado que muestra las semividas en horas.
Figure imgf000009_0002
Tabla 7. Recuperación en plasma de muteína PEG14 PEGilada en ratones hemofílicos. Se presentan las veces de mejoría en la recuperación en plasma a las 16 horas post-inyección en comparación con BDD de control llevado a cabo la misma fecha
Figure imgf000009_0001
MODELO DE LACERACIÓN RENAL. Para determinar si las muteínas de FVIII PEGilado eran eficaces en detener el sangrado en un ratón hemofílico, se empleó el modelo de laceración renal, como conoce un experto en la materia. Los ratones hemofílicos (C57/BL6 con un gen FVIII alterado) se anestesiaron con isofluorano y se pesaron. Se expuso la vena cava posterior y se inyectaron 100 ul de solución salina o FVIII utilizando una aguja de calibre 31. La aguja se retiró con cuidado y se aplicó presión en el sitio de la inyección durante 30-45 segundos para evitar el sangrado. Tras dos minutos se expuso el riñón y se mantuvo entre los fórceps a lo largo del eje vertical. Utilizando un bisturí del n.° 15, se cortó el riñón horizontalmente con una profundidad de 3 mm. Para asegurar una profundidad uniforme de la lesión el riñón se dejó ligeramente en al medio para exponer el mismo tejido en cada lado del fórceps. La superficie del riñón expuesta se cortó hasta la profundidad del fórceps. Se cuantificó la pérdida de sangre como se ha descrito anteriormente. Se ensayaron diferentes dosis de FVIII en ratones para caracterizar la relación dosis respuesta de FVIII sobre el sangrado renal.
Para explorar rápidamente un gran número de muteínas de PEG, se ha desarrollado un nuevo procedimiento de alto rendimiento que puede ensayar la eficacia de PEGilación y la actividad funcional de productos PEGilados a partir de muteínas transfectadas transitoriamente. Tan poco como 5-10 ml de muteínas de p Eg expresadas transitoriamente con un valor cromogénico de FVIII tan bajo como 0,1-0,2 UI/ml se concentra aproximadamente 50 veces utilizando un

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional con el dominio B eliminado que está mutado de manera que el resto de lisina en la posición de aminoácido 1804 se sustituye por un resto de cisteína de manera que exista un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante en la posición de aminoácido 1804.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el polímero biocompatible comprende polietilenglicol.
3. El conjugado de la reivindicación 2, en el que el polietilenglicol comprende metoxipolietilenglicol.
4. Una composición farmacéutica para administración parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de la reivindicación 1 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
5. Un conjugado de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la hemofilia.
6. Un procedimiento para la preparación del conjugado de la reivindicación 2, que comprende:
(a) la expresión de una muteína del factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado dirigida al sitio en la que la muteína tiene una sustitución de cisteína en un resto de aminoácido en la posición de aminoácido 1804 y la cisteína está protegida;
(b) la puesta en contacto de la muteína de cisteína con un reductor en condiciones para reducir moderadamente la muteína de cisteína y liberar la protección;
(c) la eliminación de la protección y el reductor de la muteína de cisteína; y
(d) al menos 5 minutos después de la eliminación del reductor, el tratamiento de la muteína de cisteína con PEG que comprende una fracción de acoplamiento de sulfhidrilo en condiciones tales que se produzca la muteína del factor VIII PEGilada.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que en la etapa (c) la protección y el reductor se eliminan de la muteína de cisteína mediante cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el PEG tiene un intervalo de tamaño de 5 kD a 64 kD.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la fracción de acoplamiento de sulfhidrilo del PEG se selecciona del grupo que consiste en fracciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo y maleimida.
ES16186901T 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio Active ES2821832T3 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62727704P 2004-11-12 2004-11-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2821832T3 true ES2821832T3 (es) 2021-04-27

Family

ID=36337298

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11153300T Active ES2930159T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio
ES16186901T Active ES2821832T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio
ES05849392.5T Active ES2633916T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio
ES11153297T Active ES2930143T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11153300T Active ES2930159T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES05849392.5T Active ES2633916T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio
ES11153297T Active ES2930143T3 (es) 2004-11-12 2005-11-14 Modificación de FVIII dirigida al sitio

Country Status (32)

Country Link
US (4) US7632921B2 (es)
EP (9) EP3153181A1 (es)
JP (5) JP2008524117A (es)
KR (7) KR101654011B1 (es)
CN (6) CN105148287B (es)
AU (1) AU2005304622B2 (es)
BR (2) BRPI0517795B8 (es)
CA (1) CA2586379C (es)
CY (3) CY1119292T1 (es)
DK (3) DK2363414T3 (es)
ES (4) ES2930159T3 (es)
FR (1) FR19C1031I2 (es)
HK (3) HK1117875A1 (es)
HN (1) HN2007015683A (es)
HR (2) HRP20180481B1 (es)
HU (5) HUE059193T2 (es)
IL (3) IL182903A (es)
LT (5) LT3130601T (es)
LU (1) LUC00118I2 (es)
MA (1) MA29663B1 (es)
MX (2) MX350293B (es)
NL (1) NL300989I2 (es)
NO (3) NO20210454A1 (es)
NZ (1) NZ555032A (es)
PH (2) PH12014500352B1 (es)
PL (3) PL2363414T3 (es)
PT (4) PT2363414T (es)
RU (1) RU2423380C2 (es)
SI (4) SI3130601T1 (es)
UA (1) UA95225C2 (es)
WO (1) WO2006053299A2 (es)
ZA (1) ZA200703696B (es)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004099231A2 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
CA2571292C (en) * 2004-06-30 2013-05-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
EP3153181A1 (en) 2004-11-12 2017-04-12 Bayer HealthCare LLC Site-directed modification of fviii bdd
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
CN104593348A (zh) * 2006-05-24 2015-05-06 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内半寿期的因子ix类似物
JP2009544327A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｏ−結合型グリコシル化配列によるペプチドのグリコシル化
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
CN103804489A (zh) 2006-12-15 2014-05-21 巴克斯特国际公司 具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物
KR20150064246A (ko) 2007-04-03 2015-06-10 바이오제너릭스 게엠베하 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
ES2551123T3 (es) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Proceso mejorado para la producción de azúcares de nucleótido
GB2467700A (en) 2007-11-09 2010-08-11 Baxter Int Modified recombinant Factor VIII and von Willebrand Factor and methods of use
CN101965200B (zh) * 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
CN102112144A (zh) 2008-05-16 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
CA2726942A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Bayer Healthcare Llc Fviii muteins for treatment of von willebrand disease
CN103739712B (zh) 2008-06-24 2016-10-05 德国杰特贝林生物制品有限公司 具有延长的体内半衰期的因子viii、冯·维勒布兰德因子或它们的复合物
WO2010019263A2 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Genzyme Corporation Soluble flt constructs for treating cancers
PL2349342T3 (pl) * 2008-10-17 2019-01-31 Baxalta GmbH Zmodyfikowane czynniki krwi zawierające mały stopień polimeru rozpuszczalnego w wodzie
JP2012508172A (ja) * 2008-11-03 2012-04-05 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー 血友病の治療方法
CA2744340A1 (en) * 2008-11-24 2010-05-27 Bayer Healthcare Llc Method of determining pegylated blood coagulation factor activity in a silica-based activated partial thromboplastin time assay
CA2748662A1 (en) * 2009-01-19 2010-07-22 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CN102333788A (zh) * 2009-02-19 2012-01-25 诺沃—诺迪斯克有限公司 因子viii的修饰
BRPI1013626B8 (pt) * 2009-03-20 2021-05-25 Hanmi Holdings Co Ltd método para preparar conjugado de polipeptídeo fisiologicamente ativo em sítio específico
US20120142593A1 (en) * 2009-03-24 2012-06-07 Bayer Healthcare Llc Factor VIII Variants and Methods of Use
TWI537006B (zh) 2009-07-27 2016-06-11 巴克斯歐塔公司 凝血蛋白接合物
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
NZ597600A (en) 2009-07-27 2014-05-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
LT2506868T (lt) 2009-12-06 2018-02-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii-fc chimeriniai ir hibridiniai polipeptidai ir jų panaudojimo būdai
WO2011075185A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Oligasis Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
US20130040888A1 (en) 2010-02-16 2013-02-14 Novo Nordisk A/S Factor VIII Molecules With Reduced VWF Binding
ES2769629T3 (es) * 2010-02-21 2020-06-26 Bayer Healthcare Llc Procedimiento de activación y conjugación de biomoléculas
KR102416359B1 (ko) 2010-04-15 2022-07-01 코디악 사이언시스 인코포레이티드 고분자량 쌍성이온-함유 중합체
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
GB201007357D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
EP2591101B1 (en) 2010-07-09 2018-11-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
SG190136A1 (en) 2010-11-05 2013-07-31 Baxter Int A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity
CN103282045A (zh) * 2010-12-16 2013-09-04 诺沃—诺迪斯克有限公司 因子viii水溶液
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
CA3012117A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Baxalta Incorporated Fusions of psa with serpins and other therapeutic proteins
EP2717898B1 (en) 2011-06-10 2018-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
BR112014000055A2 (pt) 2011-07-01 2017-06-13 Bayer Ip Gmbh polipeptídeos de fusão de relaxina e usos dos mesmos
CA2841066C (en) 2011-07-08 2023-09-26 Biogen Idec Hemophilia Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
EP2758426B1 (en) 2011-09-23 2019-08-07 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
PL3564260T3 (pl) 2012-02-15 2023-03-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Kompozycje czynnika viii oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania
AU2013204636B2 (en) 2012-02-15 2016-04-14 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant Factor VIII proteins
EP2666782A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-27 Imnate Sarl Coagulation factor VIII with reduced immunogenicity.
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2870250B2 (en) 2012-07-06 2022-06-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP3943102A1 (en) 2012-10-30 2022-01-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
TWI828269B (zh) 2013-03-15 2024-01-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ix多肽調配物
RU2015144076A (ru) * 2013-03-15 2017-04-24 БАЙЕР ХелсКер ЛЛСи Композиции рекомбинантного фактора viii
EP4122487A1 (en) 2013-03-15 2023-01-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii polypeptide formulations
AU2014255608B2 (en) 2013-04-18 2018-01-25 Novo Nordisk A/S Stable, protracted GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
TW201519900A (zh) * 2013-04-28 2015-06-01 Bayer Healthcare Llc 用於誘導對凝血因子蛋白之免疫耐受性的組成物及方法
WO2015023894A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
TW202003554A (zh) 2013-08-14 2020-01-16 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
EP3041513B1 (en) 2013-09-08 2020-08-05 Kodiak Sciences Inc. Factor viii zwitterionic polymer conjugates
EP3060242A1 (en) * 2013-10-22 2016-08-31 DBV Technologies Method of treating haemophilia by inducing tolerance to blood factors
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
RU2546297C1 (ru) * 2013-11-19 2015-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Средство, улучшающее реологические свойства крови
ES2967617T3 (es) 2013-12-06 2024-05-03 Bioverativ Therapeutics Inc Herramientas de farmacocinética poblacional y sus usos
CN106414491B (zh) 2014-01-20 2021-06-18 奥克塔法马股份有限公司 一种制备FVIII:C/FVIII:Ag比例提高的因子VIII的方法
KR20230136616A (ko) 2014-02-04 2023-09-26 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온교환 크로마토그래피의 용도
WO2015132724A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
AU2015236340B2 (en) 2014-03-24 2020-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Lyophilized factor IX formulations
US11181534B2 (en) * 2014-04-04 2021-11-23 Bloodworks Routine laboratory and point-of-care (POC) testing for hemostasis
CA2945390A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Bayer Healthcare Llc Compounded media powder formulation and method of preparation of liquid medium for cell culture
EP3151852A1 (en) 2014-06-04 2017-04-12 Novo Nordisk A/S Glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
CA2953593C (en) 2014-07-02 2023-09-26 Csl Limited Modified von willebrand factor
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
US11155601B2 (en) 2015-03-06 2021-10-26 CSL Behring Lengnau AG Modified von Willebrand factor having improved half-life
AU2016266627A1 (en) 2015-05-22 2018-01-18 CSL Behring Lengnau AG Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia
AU2016267539B2 (en) 2015-05-22 2019-12-05 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von willebrand factor
CN108472337B (zh) 2015-08-03 2022-11-25 比奥贝拉蒂治疗公司 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法
US9849125B1 (en) 2015-11-03 2017-12-26 Banner Lifie Sciences LLC Anti-overingestion dosage forms
JP6851381B6 (ja) 2016-01-07 2021-04-21 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 変異切断型フォンウィルブランド因子
WO2017117630A1 (en) 2016-01-07 2017-07-13 Csl Limited Mutated von willebrand factor
EP3476860A4 (en) * 2016-06-24 2020-01-22 Mogam Institute for Biomedical Research RECOMBINANT SINGLE CHAIN FVIII AND CHEMICAL CONJUGATE THEREOF
SG10201912768YA (en) 2016-11-11 2020-02-27 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
ES2869339T3 (es) 2016-11-11 2021-10-25 CSL Behring Lengnau AG Polipéptidos del factor von Willebrand truncados para el tratamiento de la hemofilia
PE20190966A1 (es) 2016-11-16 2019-07-08 Bayer Healthcare Llc Factor viii direccionado a los globulos rojos y metodo para su uso
AU2017368328A1 (en) 2016-12-02 2019-07-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of inducing immune tolerance to clotting factors
CN110520150A (zh) 2016-12-02 2019-11-29 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 使用嵌合凝血因子治疗血友病性关节病的方法
JP2020505424A (ja) 2017-01-31 2020-02-20 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 因子ｉｘ融合タンパク質ならびにその製造および使用方法
US10335375B2 (en) 2017-05-30 2019-07-02 Patheon Softgels, Inc. Anti-overingestion abuse deterrent compositions
KR20190086269A (ko) * 2018-01-12 2019-07-22 재단법인 목암생명과학연구소 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법
SG11202010767SA (en) 2018-05-18 2020-11-27 Bioverativ Therapeutics Inc Methods of treating hemophilia a
CN114786731A (zh) 2019-10-10 2022-07-22 科达制药股份有限公司 治疗眼部病症的方法
WO2021091881A1 (en) * 2019-11-04 2021-05-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High concentration cell penetrating caspase inhibitor conjugates compositions and methods thereof
JP2023505208A (ja) * 2019-12-06 2023-02-08 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア 第ｖｉｉｉ因子の機能を調節するための組成物および方法

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US7138505B1 (en) 1984-01-12 2006-11-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Factor VIII:C nucleic acid molecules
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
US5422260A (en) 1986-05-29 1995-06-06 Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs Human factor VIII:c muteins
US5451521A (en) 1986-05-29 1995-09-19 Genetics Institute, Inc. Procoagulant proteins
EP0294910B1 (en) 1987-06-12 1996-09-11 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity, process for their preparation using genetically engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
AU2473388A (en) * 1987-11-16 1989-06-22 Scripps Clinic And Research Foundation Treatment of factor viii inhibitors
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
CA2124690C (en) 1992-10-02 2007-09-11 Thomas Osterberg Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer
WO1994015625A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
EP0730660A4 (en) 1993-10-29 1998-02-25 Incyte Pharma Inc CHIMEAN PROTEINE PROTEASE NEXIN-1 CONTAINING VARIANTS
IL113010A0 (en) 1994-03-31 1995-10-31 Pharmacia Ab Pharmaceutical formulation comprising factor VIII or factor ix with an activity of at least 200 IU/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration
BE1008491A3 (fr) * 1994-07-14 1996-05-07 Croix Rouge De Belgique Depart Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci.
CA2204726A1 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Robin E. Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
EP0776530A4 (en) * 1995-06-21 1998-06-10 Motorola Inc METHOD AND ANTENNA PRODUCING AN OMNIDIRECTIONAL RADIATION DIAGRAM
AU6486196A (en) 1995-07-11 1997-02-10 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered protease sites
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
AT403438B (de) 1996-05-24 1998-02-25 Immuno Ag Pharmazeutische präparation mit faktor viii prokoagulationsaktivität und vwf-bindungsaktivität
US6458563B1 (en) * 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
EP0964702B1 (en) * 1996-08-02 2006-10-04 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
WO1999003887A1 (en) 1997-07-14 1999-01-28 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CA2306629A1 (en) * 1997-10-17 1999-04-29 Harvest Technologies Corporation Precipitation of growth-factor-enriched fibrinogen concentrate from platelet rich plasma
EP0922446A1 (en) 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
WO1999055306A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Opperbas Holding B.V. Pharmaceutical composition comprising factor viii and neutral liposomes
US6759216B1 (en) 1998-11-06 2004-07-06 Emory University Glycosylated, low antigenicity low immunogenicity factor VIII
EP1129186B2 (de) 1998-11-10 2016-11-30 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Ein faktor viii-polypeptid mit faktor viii:c-aktivität
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
US6136599A (en) 1998-12-10 2000-10-24 Bayer Corporation Human hybrid host cell for mammalian gene expression
EP2305804B1 (en) * 1999-01-14 2015-05-06 Bolder Biotechnology, Inc. MonoPEGylated human growth hormone
AU5282200A (en) 1999-05-24 2000-12-12 American National Red Cross, The Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor
ATE428445T1 (de) * 2000-02-11 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
PL206105B1 (pl) 2000-09-19 2010-07-30 Emory Universityemory University Zmodyfikowany ludzki czynnik VIII oraz sposób modyfikacji ludzkiego czynnika VIII ze zmniejszeniem reaktywności na przeciwciało hamujące i zachowaniem aktywności prokoagulacyjnej
CA2434097A1 (en) 2001-01-12 2002-08-08 The American National Red Cross Methods and compositions for reducing heparan sulfate proteoglycan-mediated clearance of factor viii
EP1373493B1 (en) * 2001-03-22 2013-07-31 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii derivative
AU2002312660A1 (en) 2001-05-31 2002-12-16 D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijsen Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools
WO2002096454A1 (en) 2001-05-31 2002-12-05 D. Collen Research Foundation Vzw Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools
DE60234193D1 (de) 2001-06-14 2009-12-10 Scripps Research Inst Stabilisierte faktor viii mit gentechnisch konstruierten disulfidbindungen
JP4634036B2 (ja) 2001-10-05 2011-02-16 エクスプレッション セラピューティクス， エルエルシー 高レベルエキスプレッサー第ｖｉｉｉ因子ポリペプチドをコードする核酸配列およびアミノ酸配列および使用方法
CN1646564A (zh) 2002-04-18 2005-07-27 默克专利有限公司 修饰的因子ⅷ
JP4412461B2 (ja) 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8003117B2 (en) 2002-11-20 2011-08-23 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
AU2003300139B2 (en) 2002-12-31 2008-08-28 Nektar Therapeutics Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
KR101025143B1 (ko) 2002-12-31 2011-04-01 넥타르 테라퓨틱스 가수분해상으로 안정한 말레이미드－종결 중합체
MXPA05007348A (es) 2003-01-06 2005-10-05 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados de polimeros solubles en agua tiol-selectivos.
EP2572732A1 (en) * 2003-02-26 2013-03-27 Nektar Therapeutics Polymer-factor VIII moiety conjugates
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
MXPA05012315A (es) 2003-05-12 2006-04-18 Affymax Inc Compuestos poli(etilenglicol) modificados novedosos y usos de los mismos.
NZ541374A (en) 2003-05-23 2008-09-26 Nektar Therapeutics Al Corp PEG derivatives having an amidocarbonate linkage
EP1502921A1 (en) 2003-07-29 2005-02-02 ZLB Behring GmbH Recombinant mutated human factor VIII (FVIII) with improved stability
EP1682106A4 (en) 2003-10-30 2008-06-11 Univ Emory MODIFIED FVIII FACTOR WITH REDUCED IMMUNOGENICITY THROUGH MUTAGENESIS OF A2 AND C2 EPITOPES
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
CA2547569C (en) 2003-12-03 2013-04-16 University Of Rochester Recombinant factor viii having increased specific activity
WO2006027111A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Zlb Behring Gmbh Modified coagulation factor viii with enhanced stability
EP3153181A1 (en) 2004-11-12 2017-04-12 Bayer HealthCare LLC Site-directed modification of fviii bdd
WO2006103298A2 (en) 2005-04-01 2006-10-05 Novo Nordisk Health Care Ag Blood coagulation fviii analogues
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) * 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ

Also Published As

Publication number Publication date
CN101124331A (zh) 2008-02-13
HUS1900026I1 (hu) 2022-04-28
EP1824988B1 (en) 2017-04-19
FR19C1031I1 (es) 2019-06-28
JP6559642B2 (ja) 2019-08-14
EP1824988A2 (en) 2007-08-29
HK1218718A1 (zh) 2017-03-10
JP2013067621A (ja) 2013-04-18
NO20072997L (no) 2007-06-27
KR20140019489A (ko) 2014-02-14
JP6018238B2 (ja) 2016-11-02
KR20070110260A (ko) 2007-11-16
MX2007005466A (es) 2007-10-19
EP2371856A2 (en) 2011-10-05
KR20130036780A (ko) 2013-04-12
DK1824988T3 (en) 2017-08-07
CA2586379A1 (en) 2006-05-18
MA29663B1 (fr) 2008-08-01
CN105148287A (zh) 2015-12-16
EP2363414A3 (en) 2012-03-21
PL1824988T3 (pl) 2018-01-31
EP2371856B1 (en) 2022-05-18
BR122016022033B1 (pt) 2021-03-02
NO345800B1 (no) 2021-08-09
PH12014500352A1 (en) 2015-07-20
PH12014500352B1 (en) 2015-07-20
LTC1824988I2 (lt) 2021-02-25
EP3243833B1 (en) 2020-06-17
NO344606B1 (no) 2020-02-10
JP6109523B2 (ja) 2017-04-05
CY1119292T1 (el) 2018-02-14
HK1182121A1 (en) 2013-11-22
KR101654011B1 (ko) 2016-09-05
US20060115876A1 (en) 2006-06-01
EP2772500A1 (en) 2014-09-03
AU2005304622B2 (en) 2012-03-29
PL2363414T3 (pl) 2022-09-05
HUE060016T2 (hu) 2023-01-28
EP3323829B1 (en) 2020-07-15
US20160051633A1 (en) 2016-02-25
ES2633916T3 (es) 2017-09-26
ES2930159T3 (es) 2022-12-07
KR101243564B1 (ko) 2013-03-27
PT2363414T (pt) 2022-08-04
NO20210454A1 (no) 2007-06-27
SI2363414T1 (sl) 2022-09-30
IL234433B (en) 2019-11-28
CN105148287B (zh) 2019-07-09
EP3243833A1 (en) 2017-11-15
PT3130601T (pt) 2020-10-01
DK2363414T3 (da) 2022-08-08
ZA200703696B (en) 2008-08-27
KR20180110192A (ko) 2018-10-08
EP2363414A2 (en) 2011-09-07
ES2930143T3 (es) 2022-12-07
HUE033776T2 (en) 2018-01-29
IL232540A (en) 2017-08-31
CN103102406A (zh) 2013-05-15
EP3153181A1 (en) 2017-04-12
RU2423380C2 (ru) 2011-07-10
EP3130601A1 (en) 2017-02-15
WO2006053299A3 (en) 2006-08-24
EP3130601B1 (en) 2020-07-15
CN105753968A (zh) 2016-07-13
IL232540A0 (en) 2014-06-30
EP2363414B1 (en) 2022-05-18
PL2371856T3 (pl) 2022-08-22
CN103214569A (zh) 2013-07-24
HRP20070268B1 (hr) 2018-04-20
HRP20070268A2 (en) 2007-09-30
PH12019501613A1 (en) 2020-09-14
LT2371856T (lt) 2022-08-25
HK1117875A1 (en) 2009-01-23
HRP20180481B1 (hr) 2022-02-18
US20100081615A1 (en) 2010-04-01
EP2772500B1 (en) 2019-12-25
CN107082806A (zh) 2017-08-22
DK2371856T3 (en) 2022-08-08
IL182903A0 (en) 2007-08-19
AU2005304622A1 (en) 2006-05-18
MX350293B (es) 2017-09-04
SI2371856T1 (sl) 2022-09-30
LT3130601T (lt) 2020-09-10
NL300989I1 (nl) 2019-05-22
JP2017105773A (ja) 2017-06-15
NL300989I2 (nl) 2019-11-28
PT1824988T (pt) 2017-07-21
LTPA2019509I1 (lt) 2019-08-26
IL182903A (en) 2014-09-30
LUC00118I1 (es) 2019-05-13
UA95225C2 (ru) 2011-07-25
CY2019024I1 (el) 2019-11-27
CN103102406B (zh) 2015-05-27
JP6487895B2 (ja) 2019-03-20
LT1824988T (lt) 2017-10-25
US9364520B2 (en) 2016-06-14
CN101124331B (zh) 2013-04-24
JP2008524117A (ja) 2008-07-10
HN2007015683A (es) 2011-07-11
EP3243834A1 (en) 2017-11-15
BRPI0517795A8 (pt) 2018-12-26
KR20120136413A (ko) 2012-12-18
BRPI0517795A (pt) 2008-10-21
JP2015134780A (ja) 2015-07-27
BRPI0517795B8 (pt) 2021-05-25
BR122016022033B8 (pt) 2021-05-25
EP1824988A4 (en) 2008-12-31
FR19C1031I2 (fr) 2020-06-05
NZ555032A (en) 2010-02-26
HRP20180481A2 (hr) 2018-06-29
HUE050542T2 (hu) 2020-12-28
US9096656B2 (en) 2015-08-04
BRPI0517795B1 (pt) 2020-03-31
PT2371856T (pt) 2022-08-12
EP2371856A3 (en) 2012-03-14
KR101483917B1 (ko) 2015-01-16
CY1123384T1 (el) 2021-12-31
CA2586379C (en) 2012-04-03
CY2019024I2 (el) 2019-11-27
KR20140091618A (ko) 2014-07-21
HUE059193T2 (hu) 2022-10-28
SI1824988T1 (sl) 2017-11-30
KR101468345B1 (ko) 2014-12-03
SI3130601T1 (sl) 2020-11-30
JP2017101028A (ja) 2017-06-08
KR20160105928A (ko) 2016-09-07
CN103214569B (zh) 2016-12-28
LT2363414T (lt) 2022-10-25
US20130274445A1 (en) 2013-10-17
EP3323829A1 (en) 2018-05-23
LUC00118I2 (es) 2019-12-27
KR101904630B1 (ko) 2018-10-04
WO2006053299A2 (en) 2006-05-18
US7632921B2 (en) 2009-12-15
NO20200044A1 (no) 2007-06-27
RU2007121517A (ru) 2008-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2821832T3 (es) Modificación de FVIII dirigida al sitio
KR20110017420A (ko) 폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 ｆｖｉｉｉ 뮤테인
AU2016203693B2 (en) Site-directed modification of FVIII
AU2012203813B2 (en) Site-directed modification of FVIII
AU2013203348B2 (en) Site-directed modification of FVIII