ES2821832T3 - Modificación de FVIII dirigida al sitio - Google Patents
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Abstract
Un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional con el dominio B eliminado que está mutado de manera que el resto de lisina en la posición de aminoácido 1804 se sustituye por un resto de cisteína de manera que exista un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante en la posición de aminoácido 1804.
Description
DESCRIPCIÓN
Modificación de FVIII dirigida al sitio
Campo de la invención
La presente invención se refiere a las muteínas del factor VIII (FVIII) con el dominio B eliminado que permiten el acoplamiento, en un sitio determinado, a uno o más polímeros biocompatibles tales como el polietilenglicol. Además, se proporcionan formulaciones relacionadas, dosificaciones, y sus usos con fines terapéuticos. Estas muteínas del FVIII modificado son útiles para proporcionar una opción de tratamiento con una frecuencia de inyecciones reducida y una respuesta inmunogénica reducida para individuos afectados con hemofilia A.
Antecedentes de la invención
La hemofilia A es el trastorno de la coagulación hereditario más común, con una incidencia estimada de 1 por cada 5000 hombres. Está causada por la deficiencia o defectos estructurales del FVIII, un componente crítico de la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea. El tratamiento actual para la hemofilia A implica la inyección intravenosa de FVIII humano. El FVIII humano se ha producido de manera recombinante como una molécula de cadena sencilla de aproximadamente 300 kD. Consiste en los dominios estructurales A1-A2-B-A3-C1-C2 (Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp. 11-22). El producto precursor se procesa en dos cadenas polipeptídicas de 200 kD (pesada) y de 80 kD (ligera) en el aparato de Golgi, manteniendo unidas las dos cadenas por iones metálicos (Kaufman y col., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352; Andersson y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979).
Parece que el dominio B del FVIII es prescindible ya que se ha demostrado que el FVIII con el dominio B eliminado (BDD, cadena pesada A1-A2 de 90 kD más la cadena ligera de 80 kD) es eficaz como terapia de remplazo para la hemofilia A. La secuencia del dominio de FVIII que se elimina contiene una eliminación de todos excepto los 14 aminoácidos del dominio B.
Los pacientes de hemofilia A se tratan actualmente con la administración intravenosa de FVIII según lo necesiten o como terapia profiláctica administrada varias veces a la semana. Para el tratamiento profiláctico se administra factor VIII a 15-25 UI/kg de peso corporal tres veces a la semana. Esto es necesario constantemente para el paciente. Debido a su corta semivida en el hombre, el FVIII se tiene que administrar frecuentemente. A pesar de su gran tamaño de más de 300 kD para la proteína de longitud completa, el FVIII tiene una semivida en los seres humanos de solo 11 horas (Ewenstein y col, 2004, Semin. Hematol. 41, pp. 1-16). La necesidad de inyecciones intravenosas frecuentes crea tremendas barreras a la conformidad del paciente. Sería más conveniente para los pacientes que se pudiera desarrollar un producto de FVIII que tuviera una semivida más larga y que por lo tanto necesitara una administración menos frecuente. Además, el coste del tratamiento se podría reducir si se aumenta la semivida debido a que se necesitarían menos dosificaciones.
Una desventaja adicional de la terapia actual es que aproximadamente el 25-30 % de los pacientes desarrollan anticuerpos que inhiben la actividad del FVIII. Los epítopos principales de los anticuerpos inhibidores se localizan en el dominio a 2 en los restos 484-508, el dominio A3 en los restos 1811-1818, y el dominio C2 (Saenko y col., 2002, Haemophilia 8, pp. 1-11). El desarrollo de anticuerpos evita el uso de FVIII como terapia de remplazo, forzando a este grupo de pacientes a buscar un tratamiento incluso más caro con una alta dosis de Factor VIIa recombinante y terapia de inmunotolerancia.
Los siguientes estudios identificaron los epítopos de FVIII de los anticuerpos inhibidores. En un estudio de 25 muestras de plasma inhibidoras, se descubrió que 11 se unían al fragmento A3C1C2 de cadena ligera a 73 kD generado de trombina, 4 al dominio A2, y 10 a ambos (Fulcher, C. y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp. 7728-32). En otro estudio, seis de 8 inhibidores del dominio A2 de los pacientes se neutralizaron con un polipéptido A2 recombinante (Scandella, D. y col., 1993, Blood 82(6), pp. 1767-75). Los epítopos de seis de nueve inhibidores de los pacientes se mapearon en los restos 379-538 de A2 (Scandella, D. y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp. 6152-6). Se localizó un epítopo de 18 cadenas pesadas inhibidoras para la misma región del extremo N de 18,3 kD del dominio A2 (Scandella, D. y col., 1989, Blood 74(5), pp. 1618-26).
Una molécula de FVIII activa recombinante híbrida humana/porcina, generada remplazando los restos del dominio A2 humano 387-604 con la secuencia porcina homóloga, era resistente a un inhibidor A2 del paciente (Lubin, I. y col., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp. 8639-41) y resistente a un anticuerpo monoclonal murino mAb 413 IgG que compite con los inhibidores A2 del paciente por la unión con A2 (Scandella, D. y col., 1992, Thromb Haemost. 67(6), pp. 665 71). Este epítopo de dominio A1 se localizó adicionalmente en los restos 484-508 del dominio A2 cuando los experimentos demostraron que el mAb 413 IgG y cuatro inhibidores de paciente no inhibían un FVIII híbrido humano/porcino en el que los restos 484-508 del dominio A2 se remplazaban con los porcinos (Healey, J. y col., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp. 14505-9). Este FVIII híbrido también era más resistente para al menos la mitad de los 23 pacientes explorados (Barrow, R. y col., 2000, Blood 95(2), pp. 564-8). La mutagénesis por exploración de alanina identificó que el resto 487 era crítico para la unión con los cinco inhibidores de paciente ensayados, mientras que los restos 484, 487, 489 y 492 eran importantes para la interacción con el mAb 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp. 30191-5). Los títulos de anticuerpos inhibidores en ratones que recibían el mutante R484A/R489A/P492A, pero no el mutante R484A/R489A, eran significativamente menores que en los ratones que recibían el FVIII BDD humano de
control (Parker, E. y col., 2004, Blood 104(3), pp. 704-10). En suma, la región 484-508 del dominio A2 parece que es un sitio de unión para los inhibidores de la actividad del FVIII.
Además del desarrollo de una respuesta inmunitaria contra FVIII, otro problema con la terapia convencional es que necesita una dosificación frecuente debido a la corta semivida del FVIII in vivo. Se han estudiado los mecanismos de aclaramiento de FVIII de la circulación.
El aclaramiento de FVIII de la circulación se ha atribuido en parte a la unión específica a la proteína relacionada con el receptor lipoproteico de baja densidad (LRP), un receptor de aclaramiento hepático con una amplia especificidad de ligando (Oldenburg y col., 2004, Haemophilia 10 Supl. 4, pp. 133-139). Recientemente, el receptor lipoproteico de baja densidad (LDL) también demostró que tenía un papel en el aclaramiento del FVIII, tal como cooperando con el LRP en la regulación de los niveles plasmáticos del FVIII (Bovenschen y col., 2005, Blood 106, pp. 906-910). Ambas interacciones están facilitadas por la unión a los proteoglicanos de sulfato de heparina de la superficie celular (HSPG). La semivida en el plasma en ratones puede prolongarse 3,3 veces cuando se bloquea la LRP o de 5,5 veces cuando se bloquean tanto la LRP como los HSPG de la superficie celular (Sarafanov y col., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp.
11970-11979). Se ha hecho la hipótesis de que HSPG concentran el FVIII en la superficie celular y lo presentan a la LRP. Los sitios de unión de LRP a FVIII se han localizado en los restos de A2484-509 (Saenko y col., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 37685-37692), los restos 1811-1818 de A3 (Bovenschen y col., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp. 9370 9377) y un epítopo en el dominio C2 (Lenting y col., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 23734-23739).
El FVIII también se aclaraba de la circulación por la acción de las proteasas. Para entender este efecto, se tiene que entender el mecanismo por el que el FVIII está implicado en la coagulación sanguínea. El FVIII circula como un heterodímero de cadenas pesadas y ligeras, unido al vWF. En la unión con el vWF están implicados los restos 1649 1689 de FVIII (Foster y col., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp. 5230-5234), y partes de los dominios C1 (Jacquemin y col., 2000, Blood 96, pp. 958-965) y C2 (Spiegel, P. y col., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp. 53691-8). El FVIII se activa por trombina, que escinde los enlaces peptídicos después de los restos 372, 740 y 1689 para generar un heterotrímero de los dominios A1, A2, y A3-C1-C2 (Pittman y col., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp. 12434-12439). Al activarse, el FVIII se disocia del vWF y se concentra en la superficie celular de plaquetas uniéndose a los fosfolípidos. La unión a los fosfolípidos implica los restos 2199, 2200, 2251, y 2252 de fViII (Gilbert y col., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp.
6374-6381). Ahí se une al FIX mediante interacciones con los restos 558-565 (Fay y col., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 20522-20527) y 1811-1818 de FVIII (Lenting y col., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935-1940) y FX mediante las interacciones con los restos 349-372 de FVIII (Nogami y col., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp. 15763-15771) y actúa como cofactor para la activación de FX por FIX, un componente esencial de la ruta de coagulación intrínseca. El FVIII activado (FVIIIa) está parcialmente inactivado por la proteína C activada por proteasas (APC) mediante la escisión después de los restos 336 y 562 de FVIII (Regan y col., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987). El determinante predominante de inactivación, sin embargo, es la disociación del dominio A2 del A1 y A3-C1-C2 (Fay y col., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp. 8957-8962).
Un procedimiento que ha demostrado aumentar la semivida in vivo de una proteína es la PEGilación. La PEGilación es la unión covalente de moléculas de polietilenglicol (PEG) de cadena larga a una proteína u otra molécula. El PEG puede estar en forma lineal o en forma ramificada para producir moléculas diferentes con características diferentes. Además de para aumentar la semivida de péptidos o proteínas, la PEGilación se ha utilizado para reducir la producción de anticuerpos, proteger la proteína de la digestión por proteasas y mantener el material aparte del filtrado renal (Harris y col., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-551). Además, la PEGilación puede aumentar también la estabilidad general y la solubilidad de la proteína. Finalmente, la concentración sostenida de proteínas PEGiladas puede reducir la extensión de efectos secundarios adversos reduciendo los niveles de depresión a pico de un fármaco, eliminando de esta manera la necesidad de introducir niveles súper-fisiológicos de proteína en puntos de tiempo tempranos (Harris y col., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40(7): 539-551, Resumen).
Se ha intentado la modificación aleatoria de FVIII dirigiéndose a aminas primarias (extremo N y lisinas) con grandes polímeros tales como el PEG y dextrano con distintos grados de éxito (documento WO94/15625, Patente de EE. UU.
4970300, Patente de EE. UU. 6048720). La mejoría más impresionante, publicada en una solicitud de patente de 1994 (documento WO94/15625), muestra una mejoría de la vida media de 4 veces pero con un coste de pérdida de actividad de 2 veces tras hacer reaccionar el FVIII de longitud completa con un exceso molar de 50 veces de PEG. El documento WO2004/075923 desvela conjugados de FVIII y polietilenglicol que se habían creado por modificación aleatoria. Las proteínas PEGiladas aleatorias, tales como el interferón alfa (Kozlowski y col, 2001, BioDrugs 15, pp. 419-429) se han aprobado en el pasado como agentes terapéuticos.
Esta estrategia aleatoria, sin embargo, es mucho más problemática para el FVIII heterodimérico. El FVIII tiene cientos de sitios potenciales para la PEGilación, incluyendo 158 lisinas, los dos extremos N, y múltiples histidinas, serinas, treoninas, y tirosinas, los cuales podrían PEGilarse potencialmente con reactivos que se dirigen primeramente a las aminas primarias. Por ejemplo, se demostró que el isómero posicional principal para el interferón alfa-2b PEGilado era una histidina (Wang y col., 2000, Biochemistry 39, pp. 10634-10640). Además, el procesamiento heterogéneo del FVIII de longitud completa puede dar lugar a una mezcla de material de partida que da lugar a una complejidad adicional en los productos PEGilados. Un inconveniente adicional de no controlar el sitio de PEGilación en FVIII es la reducción potencial de la actividad si el PEG se uniera en o cerca de sitios activos críticos, especialmente si más de un PEG o un PEG único grande se conjugan con el FVIII. Debido a que la PEGilación aleatoria invariablemente producirá grandes
cantidades de múltiples productos PEGilados, la purificación para obtener solo productos mono-PEGilados disminuirá drásticamente el rendimiento total. Finalmente, la enorme heterogeneidad en el perfil del producto hará que la síntesis y caracterización de cada lote sea prácticamente imposible. Como la buena fabricación requiere un producto consistente, bien caracterizado, la heterogeneidad del producto es una barrera para la comercialización. Por todas estas razones, se desea un procedimiento más específico para PEGilar FVIII.
Se han resumido distintas estrategias de PEGilación dirigida al sitio en una reciente revisión (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, disponible en internet como del 15 de octubre de 2005, identificador de objeto directo ido:10.1016/j.cbpa.2005.10.007). Una estrategia implica la incorporación de un aminoácido innatural en proteínas por síntesis química o expresión recombinante seguido por la adición de un derivado de PEG que reaccionará específicamente con el aminoácido innatural. Por ejemplo, el aminoácido innatural puede ser uno que contenga un grupo ceto que no se encuentra en proteínas nativas. Sin embargo, la síntesis química de proteínas no es factible para una proteína tan grande como el FVIII. El límite actual de la síntesis peptídica es aproximadamente 50 restos. Se pueden ligar varios péptidos para formar una pieza más grande de polipéptido, pero incluso para producir el FVIII con el dominio B eliminado se necesitaría ligar más de 20 veces, lo que resultaría en menos de un 1 % de recuperación incluso en condiciones de reacción ideales. La expresión de proteínas con aminoácidos innaturales se ha limitado principalmente a sistemas de expresión no mamíferos. Se espera que esta estrategia sea problemática para una proteína grande y compleja tal como el FVIII que necesita expresarse en sistemas de mamífero.
El documento WO90/12874 desvela la modificación específica del sitio de los polipéptidos IL-3 humana, factor estimulante de colonias de granulocitos y eritropoyetina insertando o sustituyendo una cisteína por otro aminoácido, añadiendo después un ligando que tiene un grupo reactivo sulfhidrilo. El ligando se acopla selectivamente a los restos de cisteína. La modificación de FVIII o cualquier variante del mismo no se desvela.
Por las razones establecidas anteriormente, existe la necesidad de una variante del FVIII con el dominio B eliminado mejorada que posea una mayor duración de acción in vivo e inmunogenicidad reducida, que retenga la actividad funcional. Además, es deseable que dicha proteína se produzca como un producto homogéneo de manera constante.
Sumario de la invención
Es un objetivo de la invención proporcionar un FVIII polipeptídico funcional conjugado con un polímero biocompatible que tenga reducida la unión a la proteína relacionada con el receptor lipoproteico de baja densidad (LPR), receptor lipoproteico de baja densidad (LDL), proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) y/o anticuerpos inhibidores contra el FVIII.
Es otro objetivo más de la presente invención proporcionar una variante mejorada de FVIII que posea mayor duración de acción in vivo e inmunogenicidad reducida, que es capaz de producirse como un producto homogéneo de manera constante.
La invención se define en las reivindicaciones. En un aspecto de la invención, se proporciona un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional con el dominio B eliminado, que está mutado de manera que el resto de lisina en la posición de aminoácido 1804 se sustituye por un resto de cisteína de manera que exista un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante en la posición de aminoácido 1804. La invención también incluye un procedimiento para la preparación de este conjugado. La invención se dirige también a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La invención también incluye el conjugado para su uso en el tratamiento de la hemofilia.
La invención también se refiere a un procedimiento para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína del factor VIII que comprende (a) la expresión de una muteína del factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado dirigida al sitio en la que la muteína tiene una sustitución de cisteína en un resto de aminoácido en la posición de aminoácido 1804 y la cisteína está protegida; (b) la puesta en contacto de la muteína de cisteína con un reductor en condiciones para reducir moderadamente la muteína de cisteína y liberar la protección; (c) la eliminación de la protección y del reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos 5 minutos después de la eliminación del reductor, el tratamiento de la muteína de cisteína con PEG que comprende una fracción de acoplamiento de sulfhidrilo en condiciones tales que se produzca la muteína del factor VIII PEGilada.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1. Mapas de vector y estrategia de mutagénesis para las muteínas de PEG.
FIG. 2. Procedimiento de PEGilación dirigida al sitio en tres etapas. PEG representa un PEG reactivo con cisteína tal como un PEG-maleimida. Las barras cerradas representan la formación de disulfuro mientras que las barras abiertas representan las cisteínas reducidas.
FIG. 3. Gel que muestra la PEGilación de PEG2+14 en función de concentración de reductor. Se trataron el PEG2+14 se trató con 67 a 670 uM de TCEP durante 30 min a 40C. El reductor se retiró en una columna de centrifugación seguido por PEGilación con un PEG de 12 kD. Las cadenas pesada y ligera de FVIII están
resaltadas por “H” y “L” respectivamente. Los dos puntos puntualizan las cadenas pesada y ligera PEGiladas.
FIG. 4. Espectro de masas desarrollado de PEG2+14 tratado en 67 a 670 uM de TCEP seguido por eliminación del reductor
Descripción detallada de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. La presente invención se basa en el descubrimiento de que los FVIII polipeptídicos con el dominio B eliminado mutados se pueden unir covalentemente a un sitio predefinido de un polímero biocompatible que no sea una amina del extremo N, y de que dichos polipéptidos mantienen sustancialmente su actividad coagulante. Además, estos conjugados polipeptídicos tienen un tiempo de circulación mejorado y antigenicidad reducida. Los conjugados de la invención son ventajosos respecto a los conjugados de la técnica anterior que tenían uniones aleatorias del polímero a FVIII o uniones en el extremo N. Dicha unión dirigida al sitio permite diseñar modificaciones que eviten las regiones necesarias para la actividad biológica y de esta manera mantener sustancialmente la actividad de FVIII. También permite diseñar dónde unir los polímeros para bloquear la unión a sitios implicados en el aclaramiento de FVIII. Dicha unión dirigida al sitio también permite un producto uniforme más que los conjugados heterogéneos producidos en la técnica por acoplamiento aleatorio del polímero.
Definiciones
Polímero biocompatible. Un polímero biocompatible incluye óxidos de polialquileno tal como polietilenglicol (PEG).
Polietilenglicol (PEG). “PEG” y “polietilenglicol” como se utilizan en el presente documento son intercambiables e incluyen cualquier poli(óxido de etileno) hidrosoluble. El término “PEG” también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, mayor del 50 %, de subunidades -OCH 2CH2-repetidas.
PEGilación. PEGilación es un procedimiento por el que un polietilenglicol (PEG) se une covalentemente a una molécula tal como una proteína.
FVIII con el dominio B eliminado (BDD). Como se utiliza en el presente documento, BDD se caracteriza por tener la secuencia de aminoácidos que contiene una eliminación de casi todos los 14 aminoácidos del dominio B de FVIII. Los primeros 4 aminoácidos del dominio B (SFSQ, SEQ ID NO: 1) están unidos a los 10 últimos restos del dominio B (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 2). (Lind, P. y col, 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp. 19-27). El BDD utilizado en el presente documento tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Factor VIII polipeptídico funcional. Como se utiliza en el presente documento factor VIII polipeptídico funcional significa un polipéptido o combinación de polipéptidos funcionales que son capaces, in vivo o in vitro, de corregir las deficiencias de factor VIII humano, que caracterizan, por ejemplo, la hemofilia A. El factor VIII tiene múltiples formas de degradación o procesadas en el estado natural. Estos se derivan proteolíticamente de un precursor, una cadena proteica, como se demuestra en el presente documento. Un factor VIII polipeptídico funcional incluye dicha proteína de cadena sencilla y también proporciona estos distintos productos de degradación que tienen actividad biológica corrigiendo las deficiencias de factor VIII humano. Probablemente existen variaciones alélicas. Los factores VIII polipeptídicos funcionales incluyen todas dichas variaciones alélicas, versiones glucosiladas, modificaciones y fragmentos que dan como resultado derivados del factor VIII siempre que contengan el segmento funcional del factor VIII humano y la actividad esencial, característica del factor VIII humano funcional permanezca sin afectar del mismo modo. Estos derivados del factor VIII que poseen el requisito de actividad funcional se pueden identificar fácilmente por ensayos in vitro directos descritos en el presente documento. Además, el factor VIII polipeptídico funcional es capaz de catalizar la conversión del factor X a Xa en presencia del factor IXa, calcio, y fosfolípidos, así como la corrección del defecto de coagulación en el plasma derivado de individuos afectados por hemofilia A. A partir de la divulgación de la secuencia de secuencias de aminoácidos del factor VIII humano y las regiones funcionales en la misma, los fragmentos que se pueden derivar mediante el corte con enzimas de restricción del ADN o proteolítico u otra degradación del factor VIII proteico humano serán evidentes para los expertos en la técnica.
Muteína. Una muteína es una proteína modificada genéticamente que aparece como resultado de una mutación inducida en el laboratorio en una proteína o polipéptido.
Discusión
La mutación dirigida al sitio de una secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido que tiene actividad FVIII puede producirse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los procedimientos preferidos incluyen la mutagénesis para introducir un codón de cisteína en el sitio elegido para la unión covalente del polímero. Esto se puede conseguir utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio tal como el kit de mutagénesis dirigida al sitio cQuickChange™ de Stratagene, el kit de mutagénesis dirigida al sitio n.° K1600-1 Transformer de Clontech, el sistema de mutagénesis dirigida al sitio n.° 12397014 GenTaylor de Invitrogen, el kit de sistema de mutagénesis in vitro n.° Q6210 Altered Sites II de Promega, o el kit de mutagénesis por PCR n.° TAK RR016.
Los conjugados de la invención pueden prepararse remplazando primero el codón de uno o más aminoácidos en la superficie del FVIII polipeptídico funcional con un codón para la cisteína, produciendo la muteína de cisteína en un
sistema de expresión recombinante, hacer reaccionar la muteína con un reactivo polimérico específico de cisteína, y purificar la muteína.
En los ejemplos siguientes, las muteínas se nombran de la manera convencional en la técnica. La convención para nombrar los mutantes se basan en la secuencia de aminoácidos del Factor VIII de longitud completa, maduro como se proporciona en SEQ ID NO: 4. Como una proteína secretada, el FVIII contiene una secuencia de señal que está escindida proteolíticamente durante el proceso de traducción. Después de la retirada de la secuencia de señal de 19 aminoácidos, el primer aminoácido del producto FVIII secretado es una alanina.
Como es convencional y se utiliza en el presente documento, cuando se hace referencia a aminoácidos mutados en BDD FVIII, el aminoácido mutado se designa por su posición en la secuencia del FVIII de longitud completa. Por ejemplo, la muteína PEG6 expuesta posteriormente se designa K1808C debido a que cambia la lisina (K) en la posición análoga a 1808 en la secuencia de longitud completa por cisteína (C).
La afinidad de unión de LRP, receptor LDL, o HSPG por el FVIII puede determinarse utilizando una tecnología de resonancia de plasmones superficiales (Biacore). Por ejemplo, el FVIII se puede revestir directa o indirectamente por medio de un anticuerpo de FVIII contra un chip Biacore™, y se pueden pasar concentraciones variables de LRP sobre el chip para medir tanto la tasa de asociación como de disociación de la interacción (Bovenschen N. y col., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp. 9370-7). la relación de las dos tasas da una medida de la afinidad. Sería deseable una disminución de la afinidad de dos veces, preferentemente cinco veces, más preferentemente diez veces, e incluso más preferentemente de 30 veces con la PEGilación.
La degradación de un FVIII por la proteasa APC se puede medir por cualquiera de los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína del factor VIII que comprende: (a) la expresión de una muteína del factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado dirigida al sitio en la que la muteína tiene una sustitución de cisteína en un resto de aminoácido en la posición de aminoácido 1804 y la cisteína tiene una protección; (b) la puesta en contacto de la muteína de cisteína con un reductor en condiciones para reducir moderadamente la muteína de cisteína y liberar la protección; (c) la eliminación de la protección y del reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos 5 minutos, y preferentemente al menos 15 minutos, aún más preferentemente al menos 30 minutos después de la eliminación del reductor, el tratamiento de la muteína de cisteína con PEG que comprende una fracción de acoplamiento de sulfhidrilo en condiciones tales que la muteína del factor VIII PEGilado se produzca. La fracción de acoplamiento de sulfhidrilo del PEG se selecciona del grupo que consiste en fracciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo y maleimida, preferentemente maleimida.
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para la administración parenteral que comprende cantidades terapéuticamente eficaces de los conjugados de la invención, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables son sustancias que se pueden añadir al principio activo para formular o estabilizar la preparación y que no produzcan efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. Los ejemplos de dichos adyuvantes son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, agua, azúcares tales como maltosa o sacarosa, albúmina y sales. Otros adyuvantes se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad eficaz del conjugado junto con una cantidad adecuada de vehículo con el fin de preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración eficaz al huésped. Por ejemplo, el conjugado se puede administrar por vía parenteral a los sujetos que padecen hemofilia A con una dosificación que puede variar con la gravedad del episodio hemorrágico. Las dosis medias administradas por vía intravenosa están en el intervalo de 40 unidades por kilogramo para indicaciones pre-operatorias, 15 a 20 unidades por kilogramo para una hemorragia menor, y de 20 a 40 unidades por kilogramo administradas durante un periodo de 8 horas para una dosis de mantenimiento.
El procedimiento de la invención implica la sustitución de un aminoácido del BDD de superficie, producir la muteína de cisteína en un sistema de expresión de mamífero, reducir una cisteína que se haya protegido durante la expresión por cisteína del medio de cultivo, eliminar el reductor para permitir que se vuelvan a formar los disulfuros del BDD, y hacerlo reaccionar con un reactivo de polímero biocompatible específico de cisteína, tal como PEG-maleimida.
La posición 1804 se mutó a cisteína para permitir potencialmente el bloqueo de la unión a LRP tras la PEGilación.
En una realización, el medio de cultivo celular contiene cisteínas que "protegen" los restos de cisteína en la muteína mediante la formación de enlaces disulfuro. En la preparación del conjugado, la muteína de cisteína producida en el sistema recombinante se protege con una cisteína del medio y esta protección se retira mediante una reducción suave que libera la protección antes de añadir el reactivo polimérico específico de cisteína. Además, pueden usarse otros procedimientos conocidos en la técnica para la mutación específica del sitio de FVIII, como resultará evidente para un experto en la materia.
Ejemplos
Los ejemplos no cubiertos por las reclamaciones tienen fines ilustrativos.
ANÁLISIS DE LA RELACIÓN ENTRE ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD DE FVIII. Que el Factor VIII BDD pudiera mutarse específicamente y luego añadirse un polímero de una manera específica del sitio era sorprendente. Además, los resultados de mejora de las propiedades farmacocinéticas y mantenimiento de la actividad también eran sorprendentes, dados los problemas de los conjugados poliméricos anteriores que causaban adición no específica y actividad reducida.
El BDD de FVIII tiene 19 cisteínas, 16 de las cuales forman disulfuros y las otras tres son cisteínas libres (McMullen y col., 1995, Protein Sci. 4, pp. 740-746). El modelo estructural de BDD sugiere que las 3 cisteínas libres están ocultas (Stoliova-McPhie y col., 2002, Blood 99, pp. 1215-1223). Debido a que las cisteínas oxidadas no pueden PEGilarse por los PEG-maleimidas, las 16 cisteínas que forman disulfuros en BDD no pueden PEGilarse sin reducirse primero. Basándose en los modelos estructurales de BDD, las 3 cisteínas libres de BDD no se pueden PEGilar sin desnaturalizar antes la proteína para exponer estas cisteínas al reactivo de PEG. Por lo tanto, no parece factible conseguir una PEGilación específica de BDD por PEGilación de los restos de cisteína nativos sin alterar drásticamente la estructura de BDD, lo que muy probablemente alterará su función.
El estado redox de las 4 cisteínas del dominio B del FVIII de longitud completa es desconocido. La PEGilación de las 4 cisteínas del dominio B puede ser posible si no forman disulfuros y están expuestas en la superficie. Sin embargo, debido a que el FVIII de longitud completa y el BDD tienen un perfil farmacocinético similar (PK) y semividas similares in vivo (Gruppo y col., 2003, Haemophilia 9, pp. 251-260), es improbable que la PEGilación del dominio B dé como resultado una semivida plasmática mejorada a menos que el PEG también proteja las regiones no del dominio B.
Stoilova-McPhie, S. y col., 2002, Blood 99(4), pp. 1215-23 muestra la estructura del BDD.
La especificidad de la PEGilación se puede conseguir modificando restos de cisteína únicos en el dominio A3 utilizando técnicas de mutagénesis de ADN recombinante seguido por PEGilación específica del sitio de la cisteína introducida con un reactivo PEG específico de cisteína tal como PEG-maleimida. Otra ventaja de PEGilar en 484-509 y 1811-1818 es que estos dos epítopos representan dos de las tres clases principales de sitios antigénicos inhibidores en los pacientes.
La región 1811-1818 está implicada en la unión tanto con LRP como con FIX (Bovenschen y col., 2003, J. Biol. Chem.
278, pp. 9370-9377; Lenting y col., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935-1940). PEG14 (1804) se diseñó para que estuviera cerca del bucle 1811-1818 pero no en el bucle, de manera que se pudiera disociar la unión a LRP de FIX con diferentes tamaños de PEG.
MUTAGÉNESIS. Los sustratos para la PEGilación dirigida al sitio de FVIII se pueden generar introduciendo un codón de cisteína en el sitio escogido para la PEGilación. Se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio cQuickChange™ II de Stratagene para fabricar todos los mutantes de PEG (kit Stratagene 200523 de Stratagene Corporation, La Jolla, CA). El procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio cQuikChange™ se llevó a cabo utilizando la ADN polimerasa Pfu Turbo® y un ciclador de temperatura. Se alargaron dos oligonucleótidos cebadores incluidos, que contenían la mutación deseada utilizando la Pfu Turbo, la cual no desplazaba los cebadores. Se utilizó el gen de FVIII tipo silvestre que contenía el ADNdc como matriz. A continuación de los múltiples ciclos de elongación, el producto se digirió con la endonucleasa DpnI, que es específica para el ADN metilado. El ADN recién sintetizado, que contenía la mutación, no está metilado, mientras que el ADN parental de tipo silvestre está metilado. El ADN digerido se utiliza entonces para transformar células supercompetentes de XL-1 Blue.
La eficacia de la mutagénesis es de casi el 80 %. Las reacciones de mutagénesis se llevaron a cabo en pSK207+BDD C2.6 o pSK207+BDD (Figura 1). La mutagénesis satisfactoria se confirmó por secuenciación de ADN y los fragmentos apropiados, que contenían la mutación, se transfirieron a la matriz de FVIII en el vector de expresión de mamífero pSS207+BDD. Tras la transferencia, se confirmó la secuencia de todas las mutaciones. Para las muteínas de A3 se hicieron las mutagénesis de PEG 6, 7, 8, 9 Y 10, en el vector pSK207+BDD C2.6. Tras confirmarse por secuenciación, el fragmento mutante, KpnI/Pme se subclonó en pSK207+BDD. La muteína BDD se subclonó entonces en el vector de expresión pSS207+BDD. Para las muteínas de A3 PEG 11, 12, 13, 14, la mutagénesis se hizo directamente en el vector pSK207+BDD y la secuencia confirmada de BDD mutante se subclonó en pSS207+BDD. Para las muteínas A2 PEG 1, 2, 3, 4,5, la mutagénesis se hizo en el vector pSK207+BDD C2.6. La secuencia mutante confirmada se subclonó en pSK207+BDD y después en pSS207+BDD.
CEBADORES (SOLO EN SENTIDO DIRECTO) QUE SE UTILIZAN PARA MUTAGÉNESIS:
PEG14, K1804C: GGAGCAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT (SEQ ID NO: 18)
EXPRESIÓN DE MUTEÍNAS. Tras la inserción en un vector que da lugar a resistencia a Higromicina B, las muteínas de PEG se transfectaron en células HKB11 (Patente de EE. UU. 6.136.599) formando un complejo con el reactivo de transfección Fectin 293 (Invitrogen Corp. n.° de Cat. 12347-019) según las instrucciones del fabricante. Se evaluó la expresión de FVIII a los tres días post-transfección por el ensayo cromogénico Coatest (Chromogenix Corp. n.° de cat.
821033, véase el Ensayo cromogénico). Las células transfectadas se colocaron entonces bajo presión selectiva con 50 |jg/ml de Hig. B en un medio de cultivo suplementado con un 5 % de FBS. Cuando aparecieron las colonias resistentes a Hig B, se recolectaron manualmente y se exploraron en cuanto a la expresión de FVIII por el ensayo cromogénico Coatest. Las células que expresaban FVIII establemente se adaptaron entonces a un medio que contenía
un suplemento HPPS. Las células se expandieron y sembraron a 1 x 106 células/ml en matraces con agitado con medio reciente. El fluido de cultivo tisular (TCF), recolectado tras 3 días, se utilizaron para la purificación de muteínas BDD de FVIII. La actividad de FVIII del TCF se ensayó por el Coatest (Tabla 1).
La PEG 14 de transfecciones transitorias y estables tenía el siguiente nivel de expresión: transitorias: 0,18 IU/ml; estables: 1,14 UI/ml.
PURIFICACIÓN DE MUTEÍNAS. Al recolectar el sobrenadante del cultivo celular que contiene la muteína secretada del FVIII proteico, se filtró el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,2 micrómetros para retirar las células restantes. El sobrenadante se concentró entonces por ultrafiltración o intercambio aniónico. Entonces se aplicó en una columna de inmunoafinidad donde los componentes del medio de cultivo celular y la mayoría de las impurezas proteicas de la célula huésped se retiran. El eluido de la columna de inmunoafinidad se intercambia de tampón por diafiltración en un tampón de formulación que contiene sacarosa y se congela. Se evaluó el rendimiento y recuperación de proteínas a través de una columna de anticuerpo monoclonal de FVIII mediante un ensayo cromogénico. PEGILACIÓN. El FVIII o BDD no se puede PEGilar por PEG específicos de cisteína sin reducción y desnaturalización en una relación de un exceso de 100 veces de PEG: proteína (datos no mostrados), lo que confirma la hipótesis que se basa en el modelo de la estructura de BDD en el que todas las cisteínas nativas forman disulfuros o están escondidas dentro de la FVIII. FVIII
En otro aspecto, se desarrolló un procedimiento en tres etapas que permitía la PEGilación de FVIII específica del sitio (Figura 3). En la etapa 1, la muteína de cisteína en FVIII purificada a aproximadamente 1 pM se reduce medianamente con reductores tales como aproximadamente 0,7 mM de Tris (2-carboxietil)fosfina (TCEp ) o 0,07 mM de ditiotreitol (DTT) durante 30 minutos a 40C para liberar la “protección”. En la etapa 2, el reductor se elimina junto con la “protección” por un procedimiento de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) tal como pasando la muestra a través de una columna con centrifugación (BioRad®) para permitir que se vuelvan a formar los sulfhidrilos de FVIII a la vez que se deja libre y reducida la cisteína introducida. En la etapa 3, al menos 30 minutos después de eliminar el reductor, la muteína de cisteína en FVIII liberada se trata con al menos un exceso molar de 10 veces de PEG-maleimida con tamaños que varían desde 5 a 64 kD (Nektar Therapeutics y N.O.F. Corporation) durante al menos 1 hora a 4 oc. Este procedimiento produce altamente un perfil de producto constante con datos reproducibles durante docenas de reacciones repetidas por diferentes individuos.
ANÁLISIS DE PEGILACIÓN POR SDS PAGE Y TRANSFERENCIA DE WESTERN. El producto PEGilado se puede analizar por electroforesis en un gel de poliacrilamida de SDS con un 6 % de Tris glicina reducido (Invitrogen). A continuación de la electroforesis, el gel se puede teñir con Azul de Coomassie para identificar todas las proteínas o se sometieron a un protocolo de transferencia de Western convencional para identificar el patrón de PEGilación en diferentes regiones del FVIII. La tinción de la transferencia con un anticuerpo monoclonal de ratón R8B12 o C7F7 producidos contra la región del extremo C de la cadena pesada del FVIII o la región del extremo N de la cadena ligera del FVIII, respectivamente, debería identificar la PEGilación de las respectivas cadenas.
ANÁLISIS DE PEGILACIÓN POR ESCISIÓN POR TROMBINA Y TRASNSFERENCIA DE WESTERN. El producto PEGilado se puede tratar con trombina (40 UI/ug de FVIII) a 37 oc durante 30 minutos. La trombina que se utilizó también contenía APC como contaminante. La escisión por trombina generará los dominios A1 de 50 kD y A2 de 43 kD de la cadena pesada, mientras que la escisión por APC dividirá adicionalmente el dominio A2 en los fragmentos de 21 y 22 kD.
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD
ENSAYO DE COAGULACIÓN. El procedimiento de ensayo de coagulación FVIII:C es un ensayo de una etapa que se basa en el tiempo parcial de tromboplastina activada (aPTT). El FVIII actúa como un cofactor en presencia del Factor IXa, calcio, y fosfolípidos en la conversión enzimática del Factor X a Xa. En este ensayo, las muestras de ensayo diluidas se incuban a 37 oc con una mezcla de sustrato de plasma deficiente en FVIII y reactivo para aPTT. Se añade cloruro de calcio a la mezcla incubada y se inicia la coagulación. Existe una relación inversa entre el tiempo (segundos) que se toma para la formación del coágulo y el logaritmo de la concentración de FVIII:C. Los niveles de actividad de muestras desconocidas se interpolan por comparación de los tiempos de coagulación de distintas diluciones de material de ensayo con una curva construida a partir de una serie de diluciones de material de referencia de actividad conocida y se presentan en unidades internacionales por ml (UI/ml).
ENSAYO CROMOGÉNICO. El procedimiento del ensayo cromogénico consiste de dos etapas consecutivas donde la intensidad del color es proporcional a la actividad de FVIII. En la primera etapa, se activa el Factor X a Factor Xa por el FIXa con su cofactor, el FVIIIa, en presencia de cantidades óptimas de iones de calcio y fosfolípidos. Están presentes cantidades en exceso de Factor X de manera que la tasa de activación del Factor X solamente depende de la cantidad de FVIII. En la segunda etapa, el Factor Xa hidroliza el sustrato cromogénico para dar lugar a un cromóforo y se lee la intensidad de color fotométricamente a 405 nm. La potencia desconocida se calcula y se comprueba la validez del ensayo con un procedimiento estadístico de relación de pendiente. La actividad se presenta en Unidades Internacionales por ml (UI/ml).
ANTÍGENO TOTAL DE ELISA (TAE). Se capturó el FVIII en una placa de microtitulación que se había revestido con
un anticuerpo policlonal de FVIII. El FVIII unido se detecta con un anticuerpo policlonal biotinilado de rFVIII y un conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano rusticano (HRP). El complejo de peroxidasa-estreptavidina produce una reacción de color al añadirse el sustrato de tetrametilbencidina (t Mb ). Las concentraciones de muestra se interpolan a partir de una curva de referencia utilizando modelos ajustados de cuatro parámetros. Los resultados
PURIFICACION DE FVIII PEGILADO POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO. El FVIII PEGilado se aplica en una columna de intercambio aniónico o una columna de intercambio catiónico donde la proteína se une a la columna mientras que cualquier exceso de reactivo de PEG libre no se une y se elimina en el flujo continuo. La muteína PEG se eluye entonces de la columna con un gradiente de cloruro sódico. Se utilizó un gel del 4-12 % Bis-Tris teñido con bario-yodo de carga, flujo continuo, y fracciones de gradiente para confirmar que las fracciones de la elución de la columna tenía la muteína PEGilada.
PEG14 tratada con control de tampón tiene una actividad de coagulación de 6,8 UI/ml frente a 3,2 UI/ml para la muestra de PEG14 PEGilada de 12 kD. Sin embargo, la eficacia de la PEGilación de PEG14 tratado con tampón de control tenía una actividad de coagulación de 6,8 UI/ml vs. 3,2 UI/ml para la muestra de PEG14 PEGilado con 12 kD. Sin embargo, la eficacia de PEGilación era de aproximadamente el 80 %, lo que significa que el 3,2 UI/ml representa la actividad agregada de aproximadamente el 80 % PEGilado y el 20 % no PEGilado. Asumiendo que la muestra no PEGilada tiene la misma actividad que la PEG14 tratada con tampón de control, el porcentaje de actividad de no PEGilado para el PEG14 PEGilado se calcula que es del 34 % = (3,2-6,8 veces el 20 %) / (6,8 veces el 80 %).
Para confirmar los efectos del PEG sobre la actividad de coagulación de PEG14, se purificaron las construcciones PEGiladas del exceso de PEG y no PEGiladas. Como el PEG no tiene efecto sobre la actividad cromogénica la relación actividad cromogénica respecto a coagulación es una buena estimación del efecto relativo del PEG sobre la actividad de coagulación.
ESTUDIO DE PK EN RATÓN. Se utilizaron ratones con ICR normal o hemofílicos, deficientes de FVIII (Taconic, Hudson, NY) en los estudios de PK. Los ratones normales se utilizaron para el estudio, 5 ratones por grupo por punto de tiempo. Los materiales de ensayo se diluyeron en el tampón de formulación con una concentración nominal final de 25 UI/ml. Cada ratón se puede administrar a 4 ml/kg (-0,1 ml de volumen total) del material de ensayo diluido por la vena caudal. Las muestras de sangre (0,45 o 0,3 ml para el estudio en ratón normal o hemofílico, respectivamente) se extraen en una jeringa de 1 ml (cargada con 50 o 30 pl de Citrato Na al 3,8 % para el estudio con ratón normal o hemofílico, respectivamente) de la vena cava inferior en el punto de tiempo indicado (un animal por muestra). Las muestras de plasma se ensayan en cuanto a la concentración de FVIII utilizando el procedimiento del ensayo cromogénico que se ha descrito anteriormente. La PEG14 PEGilada presenta una recuperación de plasma mayor en comparación con BDD.
Tabla 6. Sumario del estudio de PK de FVIII PEGilado que muestra las semividas en horas.
Tabla 7. Recuperación en plasma de muteína PEG14 PEGilada en ratones hemofílicos. Se presentan las veces de mejoría en la recuperación en plasma a las 16 horas post-inyección en comparación con BDD de control llevado a cabo la misma fecha
MODELO DE LACERACIÓN RENAL. Para determinar si las muteínas de FVIII PEGilado eran eficaces en detener el sangrado en un ratón hemofílico, se empleó el modelo de laceración renal, como conoce un experto en la materia. Los ratones hemofílicos (C57/BL6 con un gen FVIII alterado) se anestesiaron con isofluorano y se pesaron. Se expuso la vena cava posterior y se inyectaron 100 ul de solución salina o FVIII utilizando una aguja de calibre 31. La aguja se retiró con cuidado y se aplicó presión en el sitio de la inyección durante 30-45 segundos para evitar el sangrado. Tras dos minutos se expuso el riñón y se mantuvo entre los fórceps a lo largo del eje vertical. Utilizando un bisturí del n.° 15, se cortó el riñón horizontalmente con una profundidad de 3 mm. Para asegurar una profundidad uniforme de la lesión el riñón se dejó ligeramente en al medio para exponer el mismo tejido en cada lado del fórceps. La superficie del riñón expuesta se cortó hasta la profundidad del fórceps. Se cuantificó la pérdida de sangre como se ha descrito anteriormente. Se ensayaron diferentes dosis de FVIII en ratones para caracterizar la relación dosis respuesta de FVIII sobre el sangrado renal.
Para explorar rápidamente un gran número de muteínas de PEG, se ha desarrollado un nuevo procedimiento de alto rendimiento que puede ensayar la eficacia de PEGilación y la actividad funcional de productos PEGilados a partir de muteínas transfectadas transitoriamente. Tan poco como 5-10 ml de muteínas de p Eg expresadas transitoriamente con un valor cromogénico de FVIII tan bajo como 0,1-0,2 UI/ml se concentra aproximadamente 50 veces utilizando un
Claims (9)
1. Un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional con el dominio B eliminado que está mutado de manera que el resto de lisina en la posición de aminoácido 1804 se sustituye por un resto de cisteína de manera que exista un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante en la posición de aminoácido 1804.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el polímero biocompatible comprende polietilenglicol.
3. El conjugado de la reivindicación 2, en el que el polietilenglicol comprende metoxipolietilenglicol.
4. Una composición farmacéutica para administración parenteral que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de la reivindicación 1 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
5. Un conjugado de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de la hemofilia.
6. Un procedimiento para la preparación del conjugado de la reivindicación 2, que comprende:
(a) la expresión de una muteína del factor VIII polipeptídico con el dominio B eliminado dirigida al sitio en la que la muteína tiene una sustitución de cisteína en un resto de aminoácido en la posición de aminoácido 1804 y la cisteína está protegida;
(b) la puesta en contacto de la muteína de cisteína con un reductor en condiciones para reducir moderadamente la muteína de cisteína y liberar la protección;
(c) la eliminación de la protección y el reductor de la muteína de cisteína; y
(d) al menos 5 minutos después de la eliminación del reductor, el tratamiento de la muteína de cisteína con PEG que comprende una fracción de acoplamiento de sulfhidrilo en condiciones tales que se produzca la muteína del factor VIII PEGilada.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que en la etapa (c) la protección y el reductor se eliminan de la muteína de cisteína mediante cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el PEG tiene un intervalo de tamaño de 5 kD a 64 kD.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la fracción de acoplamiento de sulfhidrilo del PEG se selecciona del grupo que consiste en fracciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo y maleimida.
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