ES2633916T3 - Modificación de FVIII dirigida al sitio - Google Patents

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Abstract

Un conjugado que tiene actividad procoagulante del factor VIII que comprende un factor VIII polipeptídico funcional que está mutado de manera que al menos un resto no cisteína se ha remplazado con un resto de cisteína de manera que existe un resto de cisteína mutante, en el que el factor VIII polipeptídico funcional está unido covalentemente a un polímero biocompatible en el resto de cisteína mutante, en el que el polímero biocompatible está unido covalentemente al polipéptido en uno de los aminoácidos del factor VIII de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1864, 1911, 2091, 2118 y 2284.

Description

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FIG. 32. Espectro de masas desarrollado de PEG2+14 tratado en 67 a 670 uM de TCEP seguido por eliminación del reductor
Descripción detallada de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. La presente invención se basa en el descubrimiento de que los polipéptidos que tienen actividad de FVIII se pueden unir covalentemente a un sitio predefinido de un polímero biocompatible que no sea una amina del extremo N, y de que dichos polipéptidos mantienen sustancialmente su actividad coagulante. Además, estos conjugados polipeptídicos tienen un tiempo de circulación mejorado y antigenicidad reducida. Los conjugados de la invención son ventajosos respecto a los conjugados de la técnica anterior que tenían uniones aleatorias del polímero a FVIII o uniones en el extremo N. La unión dirigida al sitio permite diseñar modificaciones que eviten las regiones necesarias para la actividad biológica y de esta manera mantener sustancialmente la actividad de FVIII. También permite diseñar dónde unir los polímeros para bloquear la unión a sitios implicados en el aclaramiento de FVIII. La unión dirigida al sitio también permite un producto uniforme más que los conjugados heterogéneos producidos en la técnica por acoplamiento aleatorio del polímero. Evitando la unión en la amina del extremo N de la cadena ligera, los conjugados de la presente invención evitan la posible pérdida de actividad por unión del ligando en un sitio activo del FVIII polipeptídico. Se cree que la región del extremo N de la cadena ligera está implicada en la asociación del factor de vWF al FVIII, lo que es una asociación estabilizante en la circulación.
Definiciones
Polímero biocompatible. Un polímero biocompatible incluye óxidos de polialquileno tal como sin limitación, polietilenglicol (PEG), dextranos, ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidratos, polímeros de aminoácidos, derivados de biotina, alcohol polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, anhídrido del ácido maleico-co-polietileno, anhídrido del ácido málico-co-poliestireno, polioxazolina, poliacriloilmofolina, heparina, albúmina, celulosas, hidrolizados de quitosano, almidones, tales como hidroxietil-almidones e hidroxipropilalmidones, glicogeno, agarosas y derivados de las mismas, goma guar, pululano, inulina, goma de xantano, carragenano, pectina, hidrolizados de ácido algínico, otros biopolímeros y cualquier equivalente de los mismos. Se prefiere el polietilenglicol, y aún más preferido es el metoxipolietilenglicol (mPEG). Otros compuestos de polialquilenglicol útiles son los polipropilenglicoles (PPG), polibutilenglicoles (PBG), glicidil éteres-PEG (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietilenglicoles ramificados, polietilenglicoles lineales, polietilenglicoles bifurcados y polietilenglicoles multi-brazo o “súper ramificados” (star-PEG).
Polietilenglicol (PEG). “PEG” y “polietilenglicol” como se utilizan en el presente documento son intercambiables e incluyen cualquier poli(óxido de etileno) hidrosoluble. Típicamente, los PEG para su uso de acuerdo con la invención comprenden la siguiente estructura "--(OCH2CH2)n--" donde (n) es de 2 a 4000. Como se utiliza en el presente documento, PEG también incluye '--CH2CH2--O(CH2CH2O)n --CH2CH2--" y '-(OCH2CH2)nO--", dependiendo de si se han desplazado o no los oxígenos terminales. A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se debería recordar que el término “PEG” incluye estructuras que tienen distintos grupos terminales o “de protección final”, tal como sin limitación, un grupo hidroxilo o C1-20 alcoxi. El término “PEG” también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, mayor del 50 %, de subunidades -OCH 2CH2—repetidas. Con respecto a las formas específicas, el PEG puede tener cualquiera de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías, tales como ramificadas, lineales, bifurcadas, y multifuncionales.
PEGilación. PEGilación es un procedimiento por el que un polietilenglicol (PEG) se une covalentemente a una molécula tal como una proteína.
Grupo activado o activo funcional. Cuando un grupo funcional tal como un polímero biocompatible se describe como activado, el grupo funcional reacciona fácilmente con un electrófilo o nucleófilo en otra molécula.
FVIII con el dominio B eliminado (BDD). Como se utiliza en el presente documento, BDD se caracteriza por tener la secuencia de aminoácidos que contiene una eliminación de casi todos los 14 aminoácidos del dominio B de FVIII. Los primeros 4 aminoácidos del dominio B (SFSQ, SEQ ID NO: 1) están unidos a los 10 últimos restos del dominio B (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 2). (Lind, P. y col, 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp. 19-27). El BDD utilizado en el presente documento tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
FVIII. El Factor de coagulación sanguínea VIII (FVIII) es una glucoproteína sintetizada y liberada en la corriente sanguínea por el hígado. En la sangre circulante, se une con el factor de von Willebrand (vWF, también conocido como antígeno relacionado con el Factor VIII. Al activarse por la trombina, se disocia del complejo para interactuar con otros factores de coagulación en la cascada de coagulación, que da lugar eventualmente a la formación de un trombo. El FVIII de longitud completa humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, aunque es posible que haya variantes alélicas.
Factor VIII polipeptídico funcional. Como se utiliza en el presente documento factor VIII polipeptídico funcional significa un polipéptido o combinación de polipéptidos funcionales que son capaces, in vivo o in vitro, de corregir las deficiencias de factor VIII humano, que caracterizan, por ejemplo, la hemofilia A. El factor VIII tiene múltiples formas de degradación o procesadas en el estado natural. Estos se derivan proteolíticamente de un precursor, una cadena
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PEG tales como 5, 22, o 43 kD disponibles en Nektar Therapeutics of San Carlos, CA con los número de catálogo de Nektar 2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da, 2D2M0P01 mPEG-MAL PM 20 kD, 2D3X0P01 mPEG2-MAL PM 40 kD, respectivamente, o 12 o 33 kD disponibles en NOF Corporation, Tokyo, Japón con el número de catálogo NOF Sunbright ME-120MA y Sunbright ME-300MA, respectivamente. El producto PEGilado se purifica utilizando una cromatografía de intercambio iónico para retirar el PEG que no ha reaccionado y utilizando la cromatografía de exclusión por tamaño para retirar el BDD que no ha reaccionado. Este procedimiento puede utilizarse para identificar y proteger selectivamente cualquier interacción no favorable con el FVIII tal como el aclaramiento mediado por receptor, la unión a anticuerpos inhibidores, y la degradación por enzimas proteolíticas. Los inventores notaron que el reactivo de PEG suministrado por Nektar o NOF como de 5 kD se ensayó y era de 6 kD en su laboratorio, y de manera similar, el reactivo de PEG suministrado como de 20 kD lineal se ensayó y era de 22 kD, el que se suministró como de 40 kD se ensayó y era de 43 kD y el que suministró como de 60 kD se ensayó y era de 64 kD en su laboratorio. Para evitar confusiones, los inventores utilizaron el peso molecular como se ensayó en su laboratorio en la exposición del presente documento, excepto para el PEG de 5 kD, que se expuso como de 5 kD como lo identificó el fabricante.
Además de las mutaciones en cisteína en las posiciones 491 y 1808 de BDD (desvelado anteriormente), se mutaron en cisteína las posiciones 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, y 1804 para permitir potencialmente el bloqueo de la unión a LRP con la PEGilación. También se mutaron en cisteína las posiciones 377, 378, y 556 para permitir el bloqueo de la unión a LRP y HSPG con la PEGilación. Las posiciones 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091, y 2284 se seleccionaron al estar espaciadas igualmente en el BDD de manera que la PEGilación dirigida al sitio con PEG grandes (> 40 kD) en estas posiciones junto con la PEGilación en los sitios de glicosilación nativos (41, 239, y 2118) y sitios de unión a LRP debería cubrir completamente la superficie de BDD e identificar un nuevo mecanismo de aclaramiento para BDD.
Ejemplos
ANÁLISIS DE LA RELACIÓN ENTRE ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD DE FVIII. El FVIII y BDD son moléculas complejas muy grandes con muchos sitios diferentes implicados en reacciones biológicas. Los intentos anteriores para modificarlos para mejorar las propiedades farmacocinéticas tuvieron resultados mixtos. El que las moléculas se pudieran mutar específicamente y luego añadirse un polímero de una manera específica del sitio era sorprendente. Además, los resultados de mejora de las propiedades farmacocinéticas y mantenimiento de la actividad también eran sorprendentes, dados los problemas de los conjugados poliméricos anteriores que causaban adición no específica y actividad reducida.
En una realización, la invención se refiere a la mutagénesis dirigida al sitio utilizando ligandos específicos de cisteína tal como el PEG-maleimida. Un BDD no mutado no tiene cisteínas disponibles para reaccionar con un PEGmaleimida, por los que solo la posición mutada en cisteína será el sitio de la PEGilación. Más específicamente el BDD de FVIII tiene 19 cisteínas, 16 de las cuales forman disulfuros y las otras tres son cisteínas libres (McMullen y col., 1995, Protein Sci. 4, pp. 740-746). El modelo estructural de BDD sugiere que las 3 cisteínas libres están ocultas (Stoliova-McPhie y col., 2002, Blood 99, pp. 1215-1223). Debido a que las cisteínas oxidadas no pueden PEGilarse por los PEG-maleimidas, las 16 cisteínas que forman disulfuros en BDD no pueden PEGilarse sin reducirse primero. Basándose en los modelos estructurales de BDD, las 3 cisteínas libres de BDD no se pueden PEGilar sin desnaturalizar antes la proteína para exponer estas cisteínas al reactivo de PEG. Por lo tanto, no parece factible conseguir una PEGilación específica de BDD por PEGilación de los restos de cisteína nativos sin alterar drásticamente la estructura de BDD, lo que muy probablemente alterará su función.
El estado redox de las 4 cisteínas del dominio B del FVIII de longitud completa es desconocido. La PEGilación de las 4 cisteínas del dominio B puede ser posible si no forman disulfuros y están expuestas en la superficie. Sin embargo, debido a que el FVIII de longitud completa y el BDD tienen un perfil farmacocinético similar (PK) y semividas similares in vivo (Gruppo y col., 2003, Haemophilia 9, pp. 251-260), es improbable que la PEGilación del dominio B dé como resultado una semivida plasmática mejorada a menos que el PEG también proteja las regiones no del dominio B.
Para determinar el sitio predefinido en un polipéptido que tenga actividad de FVIII por unión a un polímero que mantenga la actividad del factor VIII y mejore la farmacocinética, se presentan las siguientes directrices basándose en el BDD del FVIII. Las modificaciones deberían dirigirse a los mecanismos de aclaramiento, inactivación e inmunogénicos tal como a los sitios LRP, HSPG, APC, y de unión a anticuerpos inhibidores. Stoilova-McPhie, S. y col., 2002, Blood 99(4), pp. 1215-23 muestra la estructura del BDD. Por ejemplo, para prolongar la semivida, se puede introducir un único PEG en un sitio específico en o cerca de los sitios de unión a LRP en los restos 484-509 de A2 y 1811-1818 de A3. La introducción de un PEG voluminoso en estos sitios debería alterar la capacidad del FVIII para unirse a LRP y reducir el aclaramiento de FVIII de la circulación. También se cree que para prolongar la semivida sin afectar significativamente la actividad, se puede introducir un PEG en el resto 1648, que está en la unión del dominio B y el dominio A3 en la molécula de longitud completa y en el engarce I del aminoácido 14 del BDD entre los dominios A2 y A3.
La especificidad de la PEGilación se puede conseguir modificando restos de cisteína únicos en los dominios A2 y A3 utilizando técnicas de mutagénesis de ADN recombinante seguido por PEGilación específica del sitio de la cisteína
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introducida con un reactivo PEG específico de cisteína tal como PEG-maleimida. Otra ventaja de PEGilar en 484509 y 1811-1818 es que estos dos epítopos representan dos de las tres clases principales de sitios antigénicos inhibidores en los pacientes. Para conseguir el máximo efecto de semivida circulante mejorada y reducción de respuesta inmunogénica, tanto los sitios de unión a LRP en A2 y A3 se pueden PEGilar para producir un producto diPEGilado. Se debería señalar que la PEGilación en la región 1811-1818 puede dar lugar a una pérdida de actividad significativa ya que esta región está implicada también en la unión al FIX. La PEGilación dirigida al sitio en 558-565 debería abolir la unión a HSPG, pero también reduce la actividad ya que esta región también se une al FIX.
Sitios de superficie adicionales que se pueden PEGilar para identificar nuevos mecanismos de aclaramiento de FVIII. La PEGilación del dominio A2 puede ofrecer ventajas adicionales ya que el dominio A2 se disocia de FVIII al activarse y presumiblemente se retira de la circulación más rápido que el resto de la molécula de FVIII debido a su menor tamaño. El A2 PEGilado, por otra parte, puede ser lo suficientemente grande para escapar al aclaramiento renal y tener una semivida plasmática comparable al resto de FVIII y por lo tanto puede reconstituir el FVIII activado in vivo.
IDENTIFICACION DE SITIOS DE PEGILACIÓN EN LAS REGIONES A2 Y A3. Se seleccionaron cinco posiciones (Y487, L491, K496, L504 y Q468 que se corresponden con las posiciones PEG1-5) en o cerca de la supuesta región de unión a LRP en A2 como ejemplos para la PEGilación dirigida al sitio basándose en la alta exposición en la superficie y la dirección hacia fuera de su trayectoria Cα to Cβ. Además, estos restos son más o menos equidistantes entre ellas en la estructura tridimensional de la molécula, de manera que juntos pueden representar esta región completa. Se seleccionaron ocho posiciones (1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804 que se corresponden con las posiciones PEG6-14) en o cerca de la supuesta región de unión a LRP en A3 como ejemplos para la PEGilación dirigida al sitio. El PEG6 está adyacente a 1811-1818 y el sitio natural de glicosilación unido a N en 1810. La PEGilación en la posición 1810 (PEG7) sustituirá el azúcar con un PEG. La mutación en la posición PEG8 T1812 también abolirá el sitio de glicosilación. Aunque se predijo que la posición PEG9 (K1813) apuntaba hacia dentro, se seleccionó en el caso de que el modelo de estructura no fuera correcto. PEG10 (Y1815) es un aminoácido hidrófobo voluminoso en el bucle de unión a LRP, y puede ser un resto de interacción crítica ya que los aminoácidos hidrófobos se encuentran normalmente en el centro de las interacciones proteína-proteína. Debido a que se ha expuesto que la región 1811-1818 está implicada en la unión tanto con LRP como con FIX, se pensó que la PEGilación en este bucle posiblemente daría como resultado una reducción de la actividad. Por lo tanto, PEG11-PEG14 (1795, 1796, 1803, 1804) se diseñaron para que estuvieran cerca del bucle 1811-1818 pero no en el bucle de manera que se pudiera disociar la unión a LRP de FIX con diferentes tamaños de PEG.
Para bloquear ambos sitios de unión a LRP simultáneamente, se puede generar una PEGilación doble en, por ejemplo, la posición PEG2 y PEG8.
Como se ha demostrado que la región 558-565 se une tanto a HSPG como a FIX, no se diseñaron sitios en esta región. En vez de eso, se diseñaron PEG15-PEG17 (377, 378, y 556) entre las regiones de unión a LRP y HSPG en A2 de manera que un PEG unido pueda interferir ambas interacciones y altere las posibles interacciones entre ellas. También se podrían seleccionar sitios adicionales que estén expuestos en la superficie y apuntando hacia afuera en
o cerca de las regiones de unión a LRP y HPSG. Para identificar nuevos mecanismos de aclaramiento, se puede PEGilar sistemáticamente el FVIII. Además de PEG1-17, se pueden utilizar los otros tres sitios de glicosilación naturales, a saber, N41, N239, y N2118 que se corresponden con PEG18-20 como puntos de unión para la PEGilación ya que deberían estar expuestos en la superficie. Las áreas de superficie con un radio de 20 angstroms desde los átomos Cβ de PEG2, PEG6 y los cuatro sitios de glicosilación se mapearon en el modelo BDD además de los sitios de interacción funcional para vWF, FIX, FX, fosfolípidos y trombina.
Después se seleccionaron PEG21-29 que se corresponden con Y81, F129, K422, K523, K570, N1864, T1911, Q2091, y Q2284 basándose en su capacidad para cubrir prácticamente toda la superficie restante de BDD con un radio de 20 angstroms desde cada uno de sus átomos Cβ. Estas posiciones se seleccionaron también debido a que están completamente expuestas, apuntando hacia fuera, y lejos de las cisteínas naturales para minimizar la posible formación incorrecta de disulfuros. El radio de 20 angstroms se escogió debido a que se espera que un PEG grande, tal como un PEG ramificado de 64 kD, tenga el potencial de cubrir una esfera con un radio de aproximadamente 20 angstroms. La PEGilación de PEG21-29 junto con PEG2 y PEG6 y los sitios de glicosilación PEG18, 19, y 20 es probable que protejan prácticamente toda la superficie no funcional del FVIII.
Las posiciones de PEGilación que dan lugar al aumento de las propiedades tales como un perfil PK mejorado, mayor estabilidad, o inmunogenicidad reducida se pueden combinar para generar un producto multi-PEGilado con propiedades aumentadas al máximo. El PEG30 y PEG31 se diseñaron para retirar los disulfuros expuestos en los dominios A2 y A3, respectivamente. El PEG30, o C630A, debería liberar su pareja de disulfuro C711 para la PEGilación. De la misma manera, el PEG31, C1899A debería permitir que el C1903 se PEGile.
MUTAGÉNESIS. Los sustratos para la PEGilación dirigida al sitio de FVIII se pueden generar introduciendo un codón de cisteína en el sitio escogido para la PEGilación. Se utilizó el kit de mutagénesis dirigida al sitio cQuickChange™ II de Stratagene para fabricar todos los mutantes de PEG (kit Stratagene 200523 de Stratagene Corporation, La Jolla, CA). El procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio cQuikChange™ se llevó a cabo utilizando la ADN polimerasa Pfu Turbo® y un ciclador de temperatura. Se alargaron dos oligonucleótidos cebadores
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PEG27, T1911C, CAGATGGAAGATCCCTGCTTTAAAGAGAATTAT (SEQ ID NO: 31)
PEG28, Q2091C: ACCCAGGGTGCCCGTTGCAAGTTCTCCAGCCTC (SEQ ID NO: 32)
PEG29, Q2284C: AAAGTAAAGGTTTTTTGCGGAAATCAAGACTCC (SEQ ID NO: 33)
PEG30, C630A: TTGCAGTTGTCAGTTGCTTTGCATGAGGTGGCA (SEQ ID NO: 34)
5 PEG31, C1899A: AATATGGAAAGAAACGCTAGGGCTCCCTGCAAT (SEQ ID NO: 35)
EXPRESIÓN DE MUTEÍNAS. Tras la inserción en un vector que da lugar a resistencia a Higromicina B, las muteínas
PEG se transfectaron en células HKB11 (Patente de EE. UU. 6.136.599) formando un complejo con el reactivo de
transfección Fectin 293 (Invitrogen Corp. nº de Cat. 12347-019) según las instrucciones del fabricante. Se evaluó la
expresión de FVIII a los tres días post-transfección por el ensayo cromogénico Coatest (Chromogenix Corp. nº de 10 cat. 821033, véase el Ejemplo 12. Ensayo cromogénico) (Tabla 1). Las células transfectadas se colocaron entonces
bajo presión selectiva con 50 µg/ml de Hig. B en un medio de cultivo suplementado con un 5 % de FBS. Cuando
aparecieron las colonias resistentes a Hig B, se recolectaron manualmente y se exploraron en cuanto a la expresión
de FVIII por el ensayo cromogénico Coatest. Las células que expresaban FVIII establemente se adaptaron entonces
a un medio que contenía un suplemento HPPS. Las células se expandieron y sembraron a 1 x 106 células/ml en 15 matraces con agitado con medio reciente. El fluido de cultivo tisular (TCF), recolectado tras 3 días, se utilizaron para
la purificación de muteínas BDD de FVIII. La actividad de FVIII del TCF se ensayó por el Coatest (Tabla 1).
Sumario de los títulos de muteína de PEG
Tabla 1. Nivel de expresión de muteínas PEG de transfecciones transitorias y estables
Título (UI/ml)
Mutación
Muteína ID Transitoria Células estables
Y487C
PEG1 0,07 N/A
L491C
PEG2 0,60 1,96
K496C
PEG3 0,45 N/A
L504C
PEG4 0,38 5,57
Q468C
PEG5 0,69 8,14
K1808C
PEG6 0,54 2,73
N1810C
PEG7 0,21 0,5
T1812C
PEG8 0,16 N/A
K1813C
PEG9 0,35 7,74
Y1815C
PEG10 0,09 N/A
D1795C
PEG11 0,27 N/A
Q1796C
PEG12 0,29 N/A
R1803C
PEG13 0,11 N/A
K1804C
PEG14 0,18 1,14
L491C/K1808C
PEG2+6 0,11 2,48
L491C/K1804C
PEG2+14 0,13 7,19
K377C
PEG15 0,11 12,58
H378C
PEG16 0,15 0,97
K556C
PEG17 0,09 0,15
N41C
PEG18 0,05 N/A
N239C
PEG19 0,16 N/A
N2118C
PEG20 0,13 N/A
Y81C
PEG21 0,36 N/A
F129C
PEG22 0,25 2,55
K422C
PEG23 0,28 N/A
K523C
PEG24 < 0,05 N/A
K570C
PEG25 < 0,05 N/A
N1864C
PEG26 0,15 N/A
T1911C
PEG27 0,28 N/A
Q2091C
PEG28 0,20 N/A
Q2284C
PEG29 0,17 N/A
C630A
PEG30 < 0,05 0,20
C1899A
PEG31 0,30 1,80
20 PURIFICACIÓN DE MUTEÍNAS. Al recolectar el sobrenadante del cultivo celular que contiene la muteína secretada del FVIII proteico, se filtró el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,2 micrómetros para retirar las células restantes. El sobrenadante se concentró entonces por ultrafiltración o intercambio aniónico. Entonces se
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Tabla 3. Porcentaje de actividad específica (S.A.) de muteínas de PEG y PEG2 y PEG6 PEGilados con respecto a BDD
Mutación
Cromogénica Coagulación vWF/TAE
BDD
100 100 100
PEG1
Y487C
PEG2
L491C 125 130 138
PEG2 rojo
L491C 137 141 98
PEG2-5 kD PEG
L491C 124 93 125
PEG2-12 kD PEG
L491C 118 25 71
PEG2-22 kD PEG
L491C 103 13 87
PEG2-33 kD PEG
L491C 130 17 59
PEG2-43 kD PEG
L491C 91 9 57
PEG3 PEG4 PEG5
K496C L504C Q468C 92
PEG6 PEG6-33 kD PEG
K1808C K1808C 83 42 60 6 100 90
PEG7
N1810C 100
PEG8
T1812C 100
PEG9
K1813C 83
PEG10
Y1815C 75
PEG11
D1795C
PEG12
Q1796C
PEG13
R1803C
PEG14
K1804C
PEG2+6
491C/1808C
PEG15
K377C 82
PEG16
H378C 126
PEG17
K556C 43
PEG18
N41C 80
PEG19
N239C
PEG20
N2118C 127
PEG21
Y81C
PEG22
F129C 83
PEG23
K422C
PEG24
K523C
PEG25
K570C
PEG26
N1864C
PEG27
T1911C
PEG28
Q2091C
PEG29
Q2284C
Como se utiliza en la Tabla 3, “PEG2 rojo” es la muteína PEG2 que se ha tratado con un reductor seguido por la
5 eliminación del reductor. Este procedimiento de reducción no alteraba significativamente las tres actividades funcionales del FVIII. La muteína PEG2 conjugada con PEG varía desde 5 kD (PEG2-5 kD) a 43 kD (PEG2-43 kD) no perdía una cantidad significativa de actividad cromogénica, pero tenía una actividad de coagulación mucho menor según aumentaba el tamaño del PEG por encima de 5 kD. Puede haber una modesta reducción de la unión con vWF también para el PEG2 PEGilado de mayor tamaño.
10 ANTÍGENO TOTAL DE ELISA (TAE). Se capturó el FVIII en una placa de microtitulación que se había revestido con un anticuerpo policlonal de FVIII. El FVIII unido se detecta con un anticuerpo policlonal biotinilado de rFVIII y un conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano rusticano (HRP). El complejo de peroxidasa-estreptavidina produce una reacción de color al añadirse el sustrato de tetrametilbencidina (TMB). Las concentraciones de muestra se interpolan a partir de una curva de referencia utilizando modelos ajustados de cuatro parámetros. Los resultados
15 de FVIII se presentan en µg/ml.
ELISA DE UNIÓN A vWF. Se permitió que el FVIII se uniera al vWF en una solución de Plasma Hemofílico Grave. El complejo FVIII-vWF se capturó entonces en una placa de microtitulación que se había revestido con un anticuerpo monoclonal específico de vWF. El FVIII unido al vWF se detectó con un anticuerpo policlonal de FVIII y un conjugado anti-conejo-peroxidasa de rábano rusticano. El complejo de anticuerpo conjugado con peroxidasa
20 produce una reacción de color al añadirse el sustrato. Las concentraciones de muestra se interpolaron a partir de una curva de referencia utilizando el modelo ajustado de cuatro parámetros. Los resultados de unión de FVIII se presentan en µg/ml. No existía un impacto significativo en ninguna de las actividades con la PEGilación, lo que sería consistente con la PEGilación del dominio B.
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tiene un acceso más fácil para un complejo FVIII/FIX/FX PEGilado que el gran sustrato proteico utilizado en el ensayo de coagulación. De manera alternativa, el PEG puede afectar la activación de la muteína. Esto se debería detectar más fácilmente por el ensayo de coagulación de una etapa que en el ensayo cromogénico de dos etapas.
Para confirmar los efectos del PEG sobre la actividad de coagulación de PEG2, 6, y 14, se purificaron varias construcciones PEGiladas del exceso de PEG y no PEGiladas. Como el PEG no tiene efecto sobre la actividad cromogénica la relación actividad cromogénica respecto a coagulación es una buena estimación del efecto relativo del PEG sobre la actividad de coagulación (Tabla 5). Los PEG más grandes en una determinada posición tal como PEG2 y un alto número de PEG como en el caso de la construcción PEG2+6 inducen una pérdida mayor de actividad de coagulación.
Tabla 5. Relación de cromogénica respecto a coagulación para el BDD PEGilado purificado. *PEG ramificado
BDD PEGilado
Cromogénica UI/ml / Coagulación UI/ml
ID de muestra
PEG Relación bruta Relación relativa a BDD
BDD
sin PEG 1,7 1
PEG2 (agrupamiento 2)
22 kD 491 9 5
PEG2
43 kD* 491 25 15
PEG6
12 kD 1808 5 3
PEG6 (antiguo)
33 kD 1808 13 7
PEG6 (nuevo)
33 kD 1808 8 5
PEG2+6 (LSP25)
33 kD en 491, Mono 10 6
PEG2+6 (LSP22)
33 kD en 491/1808, Di 24 14
PEG2+6 (ESP)
33 kD en 491/1808/A3, Tri 60 35
PEG22
64 kD* 129 14 8
PEG14
12 kD 1804 3,2 1,9
PEG14
20 kD* 1804 4,2 2,5
PEG14
33 kD 1804 5 2,9
PEG2+14 (ESP19)
33 kD en 491/1804, Di 21 12
ESTUDIO DE PK EN CONEJO. Para entender los efectos de la PEGilación en la farmacocinética (PK) de FVIII, se llevaron a cabo estudios de PK en varias especies. Se utilizaron conejos NZW SPF para el estudio: 10 hembras, 5 conejos por grupo, 2 grupos (FVIII PEG2 y PEG2 PEGilado con 22 kD). Las muestras se diluyeron en PBS estéril con una concentración final de 100 UI/ml (unidades cromogénicas). Cada conejo recibió una dosis de 1 ml/kg (100 UI/kg) de la sustancia de ensayo o el control diluidos por la vena marginal de la oreja. En varios tiempos postinyección, se extrajeron muestras de sangre (1 ml) en una jeringa de 1 ml (cargada con 100 µl de Citrato Na al 3,8 %) de la arteria central de la oreja en puntos de tiempo definidos tras la dosificación. Las muestras de plasma se incubaron con un revestimiento de anticuerpo R8B12 de la cadena pesada en una placa de 96 pocillos para capturar específicamente el FVIII humano dosificado. La actividad del FVIII capturado se determinó por el ensayo cromogénico (Figura 17). El PEG2 PEGilado y PEG6 PEGilado también se compararon con BDD (Figuras 18 y 19), mostrando las muteínas PEGiladas una mejora en la recuperación del plasma en comparación con BDD. El FVIII tipo silvestre de longitud completa PEGilado no parece mostrar mucha mejoría (Figura 20).
ESTUDIO DE PK EN RATÓN. Como una segunda especie, se utilizaron ratones con ICR normal o hemofílicos, deficientes de FVIII (Taconic, Hudson, NY) en los estudios de PK. Los ratones normales se utilizaron para el estudio, 5 ratones por grupo por punto de tiempo. Los materiales de ensayo se diluyeron en el tampón de formulación con una concentración nominal final de 25 UI/ml. Cada ratón se puede administrar a 4 ml/kg (~ 0,1 ml de volumen total) del material de ensayo diluido por la vena caudal. Las muestras de sangre (0,45 o 0,3 ml para el estudio en ratón normal o hemofílico, respectivamente) se extrajeron en una jeringa de 1 ml (cargada con 50 o 30 µl de Citrato Na al 3,8 % para el estudio con ratón normal o hemofílico, respectivamente) de la vena cava inferior en el punto de tiempo indicado (un animal por muestra). Las muestras de plasma se ensayaron en cuanto a la concentración de FVIII utilizando el procedimiento del ensayo cromogénico que se ha descrito anteriormente. El PEG6 PEGilado presentaba una recuperación del plasma mayor en comparación con la de BDD o PEG6 (Figura 21). El PEG2 PEGilado muestra una recuperación del plasma mayor en comparación con BDD (Figuras 22 y 23).
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ensayo cromogénico.
ENSAYO DE INHIBICIÓN POR ANTICUERPOS. Añadiendo un polímero de alto peso molecular tal como el polietilenglicol (PEG) específicamente en la posición 491 (es decir, PEG2) se debería reducir la unión y sensibilidad por el mAb 413, y por extensión a una gran proporción de anticuerpos inhibidores del paciente ya que muchos pacientes desarrollan anticuerpos inhibidores contra el mismo epítopo de mAb 413. Para ensayar esto, se incubaron cantidades crecientes del mAb 413 con cantidades no saturantes (0,003 UI/ml) de BDD o PEG2 PEGilado con 43 kD y se ensayaron en cuanto a la actividad funcional en un ensayo cromogénico (Figura 26). Se utilizaron el R8B12, un anticuerpo no inhibidor y el ESH4 un anticuerpo inhibidor que se dirige al dominio C2 como controles. El PEG2 PEGilado además es más resistente a la inhibición por el mAb 413 que el BDD y muestra un patrón de inhibición similar en presencia de los anticuerpos de control que no se unen cerca de la posición 491. Además, el efecto protector del PEG contra la inhibición del mAb 413 depende del tamaño del PEG, teniendo los PEG mayores un mayor efecto (Figura 27). Para ensayar si el FVIII PEGilado es más resistente a los anticuerpos inhibidores de los pacientes, se midió la actividad cromogénica en presencia de un panel de plasma derivado de pacientes con hemofilia A que habían desarrollado inhibidores del FVIII. De los 8 plasmas de pacientes ensayados, el PEG2 PEGilado con 43 kD era más resistente a la inhibición por el plasma de pacientes que el BDD en 4 muestras de plasma de pacientes. Por ejemplo, el PEG2, PEG6, o PEG2+6 PEGilados presentaban una actividad residual mayor que el BDD en el plasma de un paciente pero no en otro plasma (Figura 28). El PEG2+6 diPEGilado parece ser más resistente que el PEG2 o PEG6 monoPEGilados. Estos resultados sugieren que las muteínas PEG PEGiladas pueden ser más eficaces en el tratamiento de pacientes que desarrollan inhibidores del FVIII.
EXPLORACIÓN DE PEGILACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO. La eficacia de PEGilación de una muteína PEG en particular es impredecible, especialmente porque no hay una información estructural directa de BDD. Por ejemplo, basándose en el modelo de estructura de BDD, se podría predecir que la eficacia de PEGilación de PEG4 y PEG5 debería ser alta, similar a la del PEG2 y PEG15 ya que las tres posiciones están expuestas en la superficie y apuntan hacia afuera de acuerdo con la estructura. Por lo tanto, para utilizar PEG para buscar nuevos mecanismos de aclaramiento mediante la PEGilación sistémica necesitará que se explore una gran cantidad de muteínas.
Para explorar rápidamente un gran número de muteínas PEG, se ha desarrollado un nuevo procedimiento de alto rendimiento que puede ensayar la eficacia de PEGilación y la actividad funcional de productos PEGilados a partir de muteínas transfectadas transitoriamente. Tan poco como 5-10 ml de muteínas de PEG expresadas transitoriamente con un valor cromogénico de FVIII tan bajo como 0,1-0,2 UI/ml se concentra aproximadamente 50 veces utilizando un dispositivo Amicon-centra Ultra MWCO 30K de manera que la concentración de FVIII alcanza por encima de 1 nM, cerca del intervalo de afinidad de la interacción del anticuerpo contra FVIII. La muteína de PEG concentrada (~ 300 ul) se incuba con ~ 30 ul de resina de anticuerpo C7F7 de FVIII durante una noche a 4 C, se lava, eluye, dializa y reduce. El reductor se elimina y las muteínas de PEG reducidas se PEGilan y se procesan en un análisis de Western como se ha descrito anteriormente (Figuras 29 y 30). En respecto a la eficacia de PEGilación de las muteínas de PEG expresadas transitoriamente coincide exactamente con la de las muteínas de PEG purificadas.
Se pueden explorar docenas de muteínas de PEG por este procedimiento en uno o dos meses. Por ejemplo, el PEG14 (BDD K1804C) tenía al menos aproximadamente un 80 % de PEGilación de la cadena ligera con un PEG de 12 kD y no PEGilación de la cadena pesada (datos no mostrados), coincidiendo con la mutación K1804C localizada en la cadena ligera. La distancia C a C entre K1804 y K1808 (posición de PEG6) es solo de 8,4 amstrongs basándose en la estructura de BDD, sugiriendo que la introducción de un PEG de 43 kD en esta posición tiene una mejora similar en la PK que el PEG6 PEGilado de 33 kD, con la ventaja de tener un rendimiento de PEGilación mucho mayor. El rendimiento de PEGilación relativo para todas las muteínas de PEG ensayados se resumen en la Tabla 8. La PEG ilación era altamente selectiva para la cadena de FVIII particular en la que se introducía la mutación de cisteína, en cada muteína con la cisteína en la cadena pesada solamente se PEGilaba la cadena pesada mientras que cada muteína con la cisteína en la cadena ligera se PEGilaba en la cadena ligera. Las muteínas número 2 a 31 representan las mutaciones de cisteínas de BDD que sustituían el aminoácido nativo en la posición enumerada con una cisteína. El PEG2+6 es una doble muteína de BDD donde la posición 491 y 1808 se sustituían con cisteínas. A1 y A2 (y el dominio B para KG-2, el FVIII de longitud completa) pertenecen a la cadena pesada mientras que A3, C1 y C2 pertenecen a la cadena ligera. La eficacia de PEGilación se estimó de los productos PEGilados procesados en una SDS-PAGE comparando las intensidades de la banda PEGilada con la banda no PEGilada: +++ ~ 80 % de rendimiento de PEGilación, ++ ~ 30-70 % de rendimiento, + ~ 10-30 % de rendimiento, y ~ <10 % de rendimiento.
Tabla 8. Eficacia de PEGilación para distintos FVIII PEGilados
Muteína de PEG
Posición Dominio H-PEG L-PEG
2
491 A2 +++ -
4
504 A2 + -
5
468 A2 + -
6
1808 A3 - ++

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