DK175520B1 - DNA, der koder T-celleoverfladeproteinet T4, og anvendelse af T-4 i behandlingen af AIDS - Google Patents

Description

DK 175520 B1 i I nærværende beskrivelse henvises der til flere publikationer med arabertal i parenteser. En liste over disse publikationer er angivet i slutningen af beskrivelsen umiddelbart før patentkravene. Der henvises til disse publikationer i deres helhed, således at der kan gives en mere omfattende beskrivelse af standpunktet af den 5 teknik, hvortil opfindelsen hører.

De forskellige funktionelle klasser af T-lymfocytter genkender antigener på overfladen af bestemte populationer af målceller. Hjælper-T-celler interagerer i stort omfang med makrofager og B-celler; cytotoxiske T-celler interagerer med et bre-10 dere udvalg af antigen-bærende mål-celler. Disse cellulære genkendelsesbegivenheder medieres sandsynligvis af den specifikke association mellem overflademolekyler på både effektor- og målceller. T-cellers overflade er karakteristisk ved en række polymorfe samt ikke-polymorfe proteiner, som for størstedelens vedkommende ikke findes andre steder end på T-lymfocytter. Selv om de fleste af disse 15 molekyler er fælles for alle T-celler, varierer to klasser overfladeproteiner konsekvent med hensyn til de forskellige funktionelle klasser af T-celler, og disse proteiner er inddraget i interaktioner mellem T-celler og målceller.

Én klasse af overflademolekyler adskiller de vigtigste funktionelle undergrupper af 20 T-lymfocytter: overfladeglycoproteinerne T4 og T8. Tidligt i udviklingen af thymus udtrykkes glycoproteinerne T4 og T8 sammen på overfladen af thymocytter (1). I det perifere immunsystem udtrykkes T4- og T8-molekylerne på T-celleundergrup-per, der indbyrdes udelukker hinanden, og udtrykkes kun sjældent på den samme celle (2, 3). T4-molekylet udtrykkes på T-celler, der interagerer med målceller, der 25 bærer molekyler fra det store histokompatibilitetskompleks ("major histocompatibility complex", MHC) af klasse II, hvorimod T8-bærende T-celler interagerer med målceller, der udtrykker MHC-proteiner af klasse I (4, 5, 6, 7, 8, 9). T4-popula-. tionen af T-lymfocytter indeholder hjælperceller, mens T8-populationen indeholder hovedparten af de cytotoxiske celler og suppressorcetler (6, 10). Imidlertid kan 30 sjældne T4+ T-celler fungere som cytotoxiske celler eller suppressorceller (6, 10), hvilket viser, at ekspressionen af T4 eller T8 mere stringent er forbundet med MHC-klassegenkendelse end med effektor-funktion. Betydningen af disse molekyler ved interaktioner mellem T-celler og målceller kan påvises ved undersøgelser med monoklonale antistoffer. Antistoffer rettet mod specifikke epitoper af T4-molekylet 35 (eller muse-ækvivalenten L3T4) inhiberer antigen-induceret T-celleproliferation,

I DK 175520 B1 I

I I

I lymfokin-frigivelse og hjælpercellefunktion (7, 8, 11, 12, 13). På lignende måde I

I inhiberer monoklonale antistoffer rettet mod T8 (eller muse-ækvivalenten Lyt2) I

I cytotoxisk T-cellemedieret drab (14, 15). Disse iagttagelser har sammen med den I

I kendsgerning, at T4 og T8 ikke udviser polymorfisme af betydning, ført til den I

I 5 hypotese, at T4 og T8 genkender ikke-polymorfe områder af henholdsvis klasse II I

I og klasse I molekyler. I

I En anden klasse af proteiner, som antages at være forskellige på forskellige effek- I

I tor-T-celler, er de receptorer, der genkender antigen i forbindelse med polymorfe I

I 10 områder af MHC-molekyler (16, 17, 18). Interaktionerne mellem hjælper-T-lymfo- I

I cytter er stort set begrænset til antigenbærende målceller, der udtrykker klasse II I

I MHC-proteiner, mens cytotoxiske celler og suppressor-T-celler er begrænset til I

I målceller, der bærer klasse I MHC-molekyler (4, 5, 6, 7, 8, 9). Disse specifikke I

I interaktioner medieres måske af T-cellereceptoren (eller -receptorerne), som gen- I

I 15 kender antigen i forbindelse med specifikke MHC-molekyler (17, 18). T-lymfocytten I

I kan således have to uafhængige receptorer, der er i stand til at genkende både I

I konstante og polymorfe MHC-proteindeterminanter, og disse receptorer kan være I

I ansvarlige for specifik målretning af funktionelt forskellige populationer af T-celler. I

I 20 Erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) hos mennesker er kendetegnet ved I

I depletering af T+-lymfocytter. Som følge heraf er T-cellemedieret immunitet I

I svækket hos AIDS-patienter, hvilket medfører forekomst af alvorlige I

I opportunistiske infektioner og usædvanlige neoplasmer. AIDS skyldes infektion af I

I T-lymfocytter med en række nært beslægtede retrovirus (LAV, HTLV-IU eller ARV), I

I 25 som nu betegnes human immundefektvirus (HIV). Omfanget af infektivitet hos I

I disse agentier er begrænset til celler, der udtrykker T4-glycoproteinet på deres I

I overflade. I

I Derfor kan T4-glycoproteinet ikke blot tjene som receptor for molekyler på overfla- I

I 30 den af målceller, men også som receptor for AIDS-virus. Monoklonale antistoffer I

I rettet mod T4 blokerer AIDS-virusinfektion af T4+-celler in vitro. Desuden har ny- I

I lige undersøgelser vist, at når T4+ T-lymfocytter udsættes for AIDS-virus, er det I

I 110 kd lange kappeglycoprotein på viruset associeret med T4-molekylet på værts- I

I cellen. Virusets lymfotrope beskaffenhed kan derfor forklares ved den begrænsede I

I 35 ekspression af dets receptor, T4, i subpopulationer af T-lymfocytter. I

DK 175520 B1 3

Depletering af T4+-T-lymfocytter ved AIDS bevirker en svækkelse af den cellulære immunrespons. Desuden ledsages AIDS hyppigt af centralnervesystem-(CNS)-dysfunktion, hvilket som oftest er en følge af en subakut encephalitis. RNA og DNA fra AIDS-virus er blevet identificeret i angrebne hjerner, og virus er blevet isoleret 5 fra bide hjernen og cerebrospinalvæsken fra patienter med neurologiske lidelser.

Disse iagttagelser viser, at AIDS-virus inficerer hjerneceller og er direkte ansvarligt for de CNS-læsioner, der ses hos AIDS-patienter. AIDS-virus kan således være neurotropisk såvel som lymfotropisk. Det er derfor vigtigt at bestemme, om T4 også udtrykkes i CNS, eller om yderligere hjernespecifikke overflademolekyler 10 kan tjene som receptor for AIDS-virus.

Opklaringen af de specifikke interaktioner mellem T4 og T8 ville blive faciliteret af isolering af T4- og T8-generne, bestemmelse af deres struktur og indføring heraf i forskellige cellulære omgivelser. Isolering og sekventering af cDNA, som koder for 15 T8-molekylet, er for nylig beskrevet (19, 20, 21). Den afledte proteinsekvens viser, at T8 er et membranbundet glycoprotein med et N-terminalt område, som er homologt med det variable område af de lette immunglobulinkæder.

For nylig er isoleringen af og nukleotidsekvensen for et cDNA, der koder for 20 hellængde-T-celleoverfladeproteinet T4, blevet beskrevet (se Maddon, PJ. et al.,

Cell, bind 42, nr. 1, august 1985, side 93-104 og Isobe, M. et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, bind 83, side 4399-4402). Det er blevet foreslået, at T4 kan udgøre en komponent af AI DS-virusreceptoren, da AIDS-virusers infektivitetsområde er begrænset til celler, der udtrykker T4-overfladeprotein. Nylige undersøgelser viste, 25 at monoklonale antistoffer rettet mod T4-epitoper blokerer AIDS-virusinfektoin af T5+-celler. Tilgængeligheden af T4 bør derfor muliggøre en detaljeret undersøgelse af denne specifikke genkendelsesbegivenhed (se Maddon, P J. et al., Cell, bind 42, nr. 1, august 1985, side 101). 1 35

Baseret på disse fund var problemet ved den foreliggende opfindelse at tilvejebringe terapeutiske midler baseret på T4-glycoproteiner til anvendelse i behandlingen af sygdomme forårsaget af AIDS-virus.

DK 175520 B1 I

KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN I

Den foreliggende opfindelse angår et isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle, I

som koder for et vandopløseligt polypeptid, som omfatter en del af et T4- I

5 glycoprotein, kendetegnet ved, at det vandopløselige polypeptid er i stand til I

specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra et humant I

immundefektvirus. Opfindelsen angår endvidere et vandopløseligt polypeptid, som

er i stand til at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra et humant I

immundefektvirus, kendetegnet ved, at det vandopløselige polypeptid omfatter en 10 del af et T4-glycoprotein. Dette polypeptid kodes for af det ovenfor beskrevne

enkeltstrengede nukleinsyremolekyle. I

Det opløselige polypeptid ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes som I

terapeutisk middel, dvs. som profylakse, til behandling af en patient, der er 15 inficeret med et humant immundefektvirus. Desuden kan et monoklonalt antistof

rettet mod det opløselige polypeptid ifølge den foreliggende opfindelse være nyttigt I

som vaccine til immunisering af en human patient mod et humant immundefekt-

virus. Ydermere kan et monoklonalt antistof rettet mod det opløselige polypeptid I

ifølge den foreliggende opfindelse være nyttigt til fremstilling af T4-glycoprotein- I

20 anti-idiotype-antistoffer. Disse T4-glycoprotein-anti-idiotype-antistoffer kan være I

nyttige som profylakse til behandling af en patient, der er inficeret med et humant I

immundefektvirus. I

KORT BESKRIVELSE AF FIGURERNE I

25 I

Fig. 1 Cvtofluoroorafiske mønstre for indirekte immunfluorescens-farvnino I

med QKT»4 oq QKT»8 I

Celler (5xl05) blev inkuberet med de murine monoklonale antistoffer ΟΚΤ·4Β eller I

30 OKT*8, vasket og derpå inkuberet med FITC-konjugeret gede-antimuse-immun- I

globulin. Cellerne blev analyseret på en FACS IV Cell Sorter og plottet med en VAX I

11/780-computer som celletal i forhold til log fluorescens, Utransformerede NIH I

3T3-celler og L-celler gav identiske cytofluorografiske spor. Fro 2.2 er en leukæ- I

misk T-cellelinje med fænotypen T3'; T4+; T8+; Tll+. LTD-4 er en T4+ primær I

DK 175520 B1 5 L-celletransformant vundet efter overførsel af totalt genomisk DNA. 3A+ er en NIH 3T3-cellelinje, som var transformeret med en T4-pMV6tk/neo retrovirusekspres-slonskonstruktion.

5 Fig. 2 Northern blot-analvse af RNA fra T4*-oo T4'-L-celler oa humane celler 3 jig poly(A)+-RNA eller 12 μς totalt RNA (perifere T-celler og thymocytter) blev underkastet elektroforese gennem en 0,8% agaroseformaldehydgel, blottet på 10 GeneScreen (New England Nuclear) og probet med et 32P-mærket 0,6 kb lang T4-cDNA-insert. T4+-celler indbefatter LTD-4 (T4+, T8* L-celletransformant), SK-7 T-cellehybridom (T4+, T8), CT-CLL leukæmi (T4+, T8 ), Fro 2.2 leukæmi (T4+, T8"), T4-berigede perifere T-lymfocytter og humane thymocytter. T4-celler indbefatter utransformerede celler, tk7 (T8+-L-celletransformant), HeLa-celler, human neu-15 roblastomceller (IMR) og T8-berigede perifere T-lymfocytter. Banen for human thy-mocyt blev eksponeret 4 gange længere og fotograferet på højkontrastfilm.

Fig. 3 Restriktionsnukleasekort over pT4B oq T4-aenet. sekventerinas- strateai oo rekombinante vektorer .

20 A. Alignment af BamHI-restriktionsfragmenterne af pT4B cDNA og T4-genet.

Rækkefølgen af BamHI-fragmenter i T4-genet blev bestemt ved Southern blotanalyse og genomisk klonkortlægning. Alignment af 5'-enden af pT4B og T4-genet er vist med stiplede linjer, og det mørke område i pT4B svarer til den kodende 25 sekvens. De angivne størrelser er i kilobaser.

B. Sekventeringsstrategi. Pilene viser længden af sekvensen bestemt ved subkloning af fragmenter i M13 og sekventering ved dideoxyterminerings-pro-ceduren (36).

30 C. Eukaryote ekspressionsvektorer. Disse konstruktioner indeholder to Moloney museleukæmivirus-"long terminal repeats" (LTR), hvis orientering er vist med pile. pT4B cDNA'et blev subklonet i EcoRI-stedet på hver vektor i den viste orientering.

(a) T4-pVcos7-konstruktionen.

I DK 175520 B1 I

I I

I (b) T4-pMV6tk/neo-konstruktionen indeholder neomycin-phosphotransferasegenet I

fusioneret med HSV-thymidinkinase-promotoren. I

I Fig. 4 Southern blot-analvse af DNA fra utransformerede L-celler qq T4*-L- I

I 5 celler oq T-. B- oq ikke-lvmfoide humane celler I

I 10 jig celle-DNA’er blev spaltet med BamHI, underkastet elektroforese gennem en I

I 0,8% agarosegel, blottet på GeneScreen og probet med et nick-translateret pT4B- I

I cDNA-insert. De anførte størrelsesmarkører er I kilobaser. Hybridiserende bind I

10 med en størrelse pi 20 kb, 6,6 kb, 4 kb, 1,8 kb og 1 kb fremkommer i alle humane I

I DNA’er. DNA'er af T4', ikke-lymfoid oprindelse, indbefatter utransformerede L- I

I celler, humane fibroblaster (GM), human neuroblastomceller (NB) og HeLa-celler. I

I CB, CP58 og CP94 er DNA’er afledt af EBV-transformerede humane B-cellelinjer. I

I LTD-4 er den T4* primære L-celletransformant. RPMI og HSB2 er T4 -humane T- I

I 15 celleleukæmilinjer; E+-celler og thymocytter (Thym.) indeholder T4+-T-celler. CT- I

I CLL, Jurkat (Jurk.), Fro 2.2, CEM og Molt 4 er T4+-T-celler. gλM4 er en genomisk I

klon, som indeholder sekvenser, der strækker sig over 3‘-enden af T4-genet. I

I Fig. 5 Immunudfældnino af T4-Qlycoproteinet fra NIH 3T3-celler I

I 20 transformeret med de retrovirale ekspressionskonstruktioner I

I L-[35SJ-methioninmærkede proteiner fra to uafhængige NIH 3T3-transformanter, I

I perifere T-lymfocytter og utransformerede 3T3-celler, blev underkastet linselectin- I

chromatografi for at berige med hensyn til glycoproteiner. 2,5xl06 cpm af hver I

I 25 prøve blev forklaret og derefter immunudfældet med monoklonale OKT*4- I

I antistoffer og Protein A-Sepharose. Kuglerne blev vasket, opløst i prøvebuffer og I

I underkastet elektroforese i en 10% SDS-polyacrylamidgel under reducerende I

I (bane a-d) og ikke-reducerende (bane e og f) betingelser. Bane a, utransformerede I NIH 3T3-celler. Bane b, T4C2, en NIH 3T3-cel!e transformeret med T4-pVcos7-kon- 30 struktionen. Bane c og e, 3A+, en NIH 3T3-celle transformeret med T4- pMV6tk/neo-konstruktionen. Bane d og f, perifere humane T-lymfocytter. Relative molekylmasser (Mr) er angivet i kilodalton.

35 DK 175520 B1 7

Fig. 6 Nukleotidsekvensen for T4-CDNA og den translaterede sekvens af T4- proteinet

Nukleotidsekvensen og den afledte aminosyresekvens for cDNA-klonen pT4B blev 5 opnået ved den i fig. 3B viste sekventeringsstrategi. Tal over aminosyre-sekvensen betegner aminosyreresternes stillinger. Tallene til højre angiver nukleotidstillinger.

Alle ekstracellulære cysteiner er angivet med (·) eller (o). Ledersekvensen (L), variabellignende (V), forbindelseslignende (J), transmembrane (TM) og cytoplasmiske (CYT) områder er vist med horisontale pile under sekven-sen, selv 10 om de nøjagtige grænser er uklare. To potentielle N-forbundne glyco-syleringsste-der (Asn-Leu-Thr) er også vist (CHO).

Fig. 7 In vitro translateret RNA stammende fra SPe-transkriDtion 15 T4-cDNA-insertet af fuld længde blev subklonet i RNA-ekspressionsvek-toren pSP65 (Promega Biotec). Lineariseret plasmid-DNA blev transkriberet med SP6-polymerase (40), og RNA blev translateret i et hvedekimsystem (Bethesda Research Laboratories) indeholdende L-[35S]-methionin. In v/tro-translationspro-dukterne blev underkastet elektroforese gennem en 10% SDS-polyacrylamidgel 20 (bane T4). Bovin hypofyse-RNA (BP) blev anvendt som kontrol. Relative molekylvægte (Mr) er angivet i kilodalton.

Fig. 8 Skematisk diagram over det T4-atvcoprotein. der strækker sia over cellemembranen 25 T4 består af fire VJ-lignende tandemområder (V1J1-V4J4), et hydrofobt segment, der.strækker sig over membranen (skraveret areal), og et ladet cytoplasmisk område (CYT). To potentielle N-forbundne glycosyleringssteder i den ekstracellulære del er vist (·_). Positionerne af intronerne 2-8 i T4-genet er også markeret 30 (A).

35

I DK 175520 B1 I

I 8 I

Fig. 9 Alignment af variable, forbindende oq transmembrane områder af T4 I

I med medlemmer af immunalobulinaenfamilien I

I 5 A. Alignment af T4's variable område med en muse-let kappa-immunglobulinkæde I

I J606 (66), T8 (20), en human T-cellea ntigen receptors β-kæde YT35 (97) og en I

I human T-celleantigen-receptors α-kæde HPB-MLT a (98). De invariante rester i det I

I variable område af let kæde er omfattet af den omhandlede alignment (Inv.). I

I Alignment blev udført for at maksimere identiteter og strukturelle homologier med I

I 10 TA, som er vist som rester i kasser. Linjerne under sekvensen med bogstaverne A, I

I 6, C, C, D, E, F og G angiver de rester, som danner β-strenge (67). β-streng G I

I fortsætter ind i J-sekvensen. I

I B. Alignment af aminosyresekvensen for T4's forbindende område med consensus- I

15 J-sekvenserne af T-celleantigenreceptorens β-kæde, immunglobulin λ og κ lette I

I kæder og J-sekvensen for den humane T-cellereceptors α-kæde (99). I

I C. Alignment af T4's transmembrane områder med en MHC klasse II β-kæde (100). I

Det formodede transmembrane område (TM) er angivet under sekvensen. I

I 20 I

I Fig. 10 Restriktionsnukleasekort over T4-oenet i humant chromosomalt DNA I

Positionerne af de 9 exoner blev bestemt ved genomisk klonkortlægning, Southern I

I blot-analyse og nukleotidsekventering. Ledersekvensen (L), variabellignende (V), I

25 forbindelseslignende (J), transmembrane (TM) og cytoplasmiske (CYT) områder er I

I vist med kasser. Positionen af methioninkodonen omgivet af initierings-consensus- I

I sekvensen er vist (ATG) ved begyndelsen af lederexonen (L); terminationskodonen I

I TGA er vist ved enden af den anden cytoplasmiske exon (CYT). De angivne størrel- I

I ser er i kilobaser. I

I 30 I

I Fig. 11 Rekombinante retrovirale ekspressionsvektorer oq konstruktion af I

I transformerede celler I

I A. Rekombinante retrovirale ekspressionsvektorer. pMV7 indeholder to direkte gen- I

I 35 tagne Moloney musesarkomvirus-"long terminal repeats" (LTR) i den med pile viste I

DK 175520 B1 9 orientering. pMV7 indeholder også det bakterielle neomycin-phosphotransferasegen (neo) fusioneret til HSV-thymidinkinase-promotoren (tk). cDNA-inserter i fuld længde, der koder for T4 (T4B) (70) eller T8 (T8F1) (20), blev subklonet i EcoRI-stedet i den med pile viste orientering, hvilket gav henholdsvis T4-pMV7 og T8-5 pMV7. De kodende sekvenser er vist som sorte områder. De angivne størrelser er i kilobaser.

B. Retrovirus-medieret genoverførselsstrategi.

10 Fig. 12 Effektiviteten af infektion af naturligt isolerede og transformerede T4*-celler

Celler blev inokuleret med 10-foidsfortyndinger af AIDS-virus, inkuberet i 18 timer ved 37°C, vasket og udpladet i mikrokultur. Frekvensen af inficerede kulturer blev 15 bestemt ved et enzymbundet immunabsorbentassay (ELISA) 12 dage efter infektion (46). Resultaterne blev plottet som procent positive kulturer i forhold til log virusfortynding. Infektiøst virus-titer (ID-50) defineres som det reci-prokke af den fortynding, ved hvilken 50% af kulturerne er viruspositive (47). Naturligt isolerede T4+-celler indbefatter phytohæmagglutinin (PHA)-stimulerede normale 20 perifere lymfocytter (·_·) og T-celle-linjen CEM (o_o). T4+ transficerede cellelinjer omfatter HSB2-T4+T-celler (A_▲) og Raji-T4+ B- celler (__). De T8+-transficerede cellelinjer HSB2-T8+ og Raji-T8+ (□_□) tjente som kontroller ved disse undersøgelser.

25 Fig. 13 Dannelse af syncytier i T4+ HeLa-transformanter A. 2xl05 enkeltlags HeLa-T4+ transformanter blev blandet med 2xl04 AIDS-virusproducerende H9-celler og inkuberet ved 37°C. Iagttagelse af kulturerne efter 18 timer viste, at over 90% af kernerne i enkeltlagshinden var indeholdt i 30 syncytier.

B. Monoklonalt anti-T4A-antistof (1:20) blev tilsat til de blandede kulturer på tids' punktet for podning. Iagttagelse af kulturerne efter 18 timer viste fuldstændigt fravær af cellefusion.

35 I

I DK 175520 B1 I

I 10 I

I Kulturerne blev fotograferet ved 160 X forstørrelse. I

5 Fig. 14 Flow-cvtometrisk analyse af AIDS-virusbindino til I

transformerede T4*-celler I

Søjle A. Celler (5xl05) blev inkuberet sammen med fluorescein-konjugerede I

monoklonale anti-T4A (_) eller anti-T8 (—) -antistoffer, vasket og analyseret I

I 10 ved cyto-fluorometri. I

I Søjle B. Celler (5xl05) blev inkuberet med buffer (—) eller AIDS-virus (_), I

vasket, inkuberet med fluorescein-konjugeret anti-AIDS-virusantistof og analyseret I

H ved cytofluorometri. I

I 15 I

Søjle C. Celler (5x10s) blev inkuberet med buffer (-—) eller med monoklonalt anti- I

T4A-antistof efterfulgt af AIDS-virus (_) eller med monoklonalt anti-T8-antistof I

efterfulgt af AIDS-virus (- -). Efter vask blev der tilsat fluoresceinkonjugeret anti- I

I AIDS-virus-antistof, og cellerne blev analyseret ved cytofluorometri. I

I 20 I

Fluorescens-histogrammer (celletal i forhold til fluorescensintensitet) af hver I

cellelinje er opstillet horisontalt.

I Fig. 15 Northern blot-analvse af RNA afledt af menneske- oq musehjerne, I

25 Ivmfoide oo mveloide celler I

I A. Northern blot-analyse af humane RNA-prøver. 1 ug poly(A)+-RNA fra Raji (T4‘ B- cellelinje), U937 (T4+ monocytisk cellelinje) og Jurkat (T4+ T-cellelinje) og 5 ug poly(A)+-RNA fra cerebral cortex blev underkastet elektroforese gennem en 1% I 30 agarose-formaldehydgel, blottet på Hybond (Amersham) og probet med en 32P- I mærket T4-cDNA-indsætning, pT4B (70).

I B. Northern blot-analyse af muse-RNA-prøver. 5 ug poly(A)+-RNA fra 3T3-celler I (fibroblastcellelinje), forhjerne og baghjerne og 20 jig totalt RNA fra thymocytter DK 175520 B1 11 blev underkastet elektroforese gennem en 1% agarose-formaldehydgel, overført til Hybond og probet med en 32P-mærket L3T4-cDNA-indsætning, pL3T4B.

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN 5

Opfindelsen angår et enkeltstrenget nukleinsyremolekyle, der koder for et vandopløseligt polypeptid, som omfatter en del af et T4-glycoprotein. Det vandopløselige polypeptid, der kodes for af nukleinsyremolekylet, er i stand til specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra humant 10 immundefektvirus. I en specifik udførelsesform af opfindelsen er nukleinsyremolekylet mindst 90% homologt med et nukleinsyremolekyle, som koder for en amionsyresekvens, som udgør i det mindste en del af et T4-glycoprotein. Udtrykket "vandig opløsning” indbefatter i nærværende ansøgning, men er ikke begrænset til, detergentfrie vandige buffere og legemsvæsker såsom blod, plasma og serum.

15 Desuden betegner udtrykket "opløseligt T4" et fragment af et T4-glycoprotein, som er opløseligt i en vandig opløsning. I en yderligere udførelsesform af opfindelsen koder nukleinsyremolekylet for et vandopløseligt polypeptid, der i det mindste er en del af et humant T4-glycoprotein.

20 Opfindelsen angår også et nukleinsyremolekyle, som er komplementært til det ovenfor beskrevne enkeltstrengede nukleinsyremolekyle. Dette komplementære nukleinsyremolekyle kan være mærket med en detekterbar markør. Sådanne detekterbare markører er kendte inden for det tekniske område, som opfindelsen hører til, og indbefatter detekterbare enzymer, radiomærkede grupper, 25 fluorescerende grupper og kemiluminescerende grupper.

Det enkeltstrengede nukleinsyremolekyle kan være et DNA-molekyle. I én udførelsesform af opfindelsen omfatter DNA-molekylet en del af det genomiske DNA-molekyle, der er vist ved restriktionsenzymkortet i fig. 10. I en anden 30 udførelsesform af opfindelsen kan det enkeltstrengede nukleinsyremolekyle være et cDNA-molekyle. I en anden udførelsesform af opfindelsen kan det enkeltstrengede nukleinsyremolekyle være et cDNA. Dette cDNA-molekyle kan omfatte en del af den i fig. 6 viste nukleinsyresekvens.

I DK 175520 B1 I

I 12 I

I Den foreliggende opfindelse angår desuden et RNA-molekyle, der koder for et I

I vandopløseligt polypeptid, som omfatter en del af et T4-glycoprotein. I

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til detektion af et enkelt- I

I 5 strenget nukleinsyremolekyle, som koder for et vandopløseligt polypeptid, som I

I omfatter en del af et T4-glycoprotein. Denne fremgangsmåde omfatter, at I

I enkeltstrengede nukleinsyremolekyler bringes i kontakt med et mærket, I

enkeltstrenget nukleinsyremolekyle, som er komplementært til et enkeltstrenget I

I nukleinsyremolekyle, der koder for et vandopløseligt polypeptid som defineret I

I 10 ovenfor, under betingelser, der tillader hybridisering af komplementære I

I enkeltstrengede nukleinsyremolekyler. Hybridiserede nukleinsyremolekyler adskil- I

I les fra enkeltstrengede nukleinsyremolekyler for at detektere et enkeltstrenget I

I nukleinsyremolekyle, der koder for et vandopløseligt polypeptid, som omfatter en I

I del af et T4-glycoprotein. I én udførelsesform af opfindelsen er det detekterede I

I 15 enkeltstrengede molekyle et DNA-molekyle afledt af chromosomalt DNA. Det I

ch ro mosom a le DNA kan være afledt af lymfoide eller myeloide celler eller hjerne- I

I celler. Den lymfoide celle kan være en T-celle eller en B-celle. Desuden kan den I

I myeloide celle være et granulocytsted eller en makrofag. I

I 20 Den foreliggende opfindelse angår også et vandopløseligt polypeptid, der omfatter I en del af et T4-glycoprotein. Det vandopløselige polypeptid er i stand til specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, og kodes for af det enkeltstrengede nukleinsyremolekyle som defineret ovenfor. I en I anden udførelsesform af opfindelsen er det vandopløselige polypeptid mindst 90% I 25 homologt med det vandopløselige polypeptid.

Det vandopløselige polypeptid, der er i stand til specifikt at danne et kompleks med I et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, og som omfatter en del af et I T4-glycoprotein, og som kodes for af det ovenfor definerede enkeltstrengede I 30 nukleinsyremolekyle, er nyttigt som et terapeutisk middel til behandling af en I patient, der er inficeret med et humant immundefektvirus, dvs. som profylakse | I mod AIDS. I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen omfatter det I vandopløselige polypeptid den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra mindst aminosyre I -23 til højst aminosyre +374. Andre foretrukne udførelsesformer af opfindelsen I 35 indbefatter aminosyresekvenser, der omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens DK 175520 B1 13 fra mindst aminosyre +287 til højst aminosyre +374, fra mindst aminosyre +182 til højst aminosyre +286, fra mindst aminosyre +112 til højst aminosyre +181 og fra mindst aminosyre +1 til højst aminosyre +111.

5 Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk præparat, der er nyttigt som terapeutisk middel til behandling af en patient, som er inficeret med et humant immundefektvirus. Dette farmaceutiske præparat omfatter et vandopløseligt polypeptid ifølge den foreliggende opfindelse, hvilket polypeptid omfatter en del af et T4-glycoprotein, som er i stand til specifikt at danne et kompleks med et 10 kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, og som kodes for af det ovenfor definerede enkeltstrengede nukleinsyremolekyle, samt en farmaceutisk acceptabel bærer. Sådanne farmaceutisk acceptable bærere er kendte inden for det område, som opfindelsen hører til, og omfatter, men er ikke begrænset til, 0,01-0,1 M, fortrinsvis 0,05 M, phosphatbuffer eller 0,8% saltopløsning.

15

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til behandling af en patient, der er inficeret med et humant immundefektvirus. Denne fremgangsmåde omfatter, at der til patienten administreres en effektiv mængde af et farmaceutisk præparat, der indeholder en farmaceutisk acceptabel bærer og det vandopløselige polypeptid, 20 således at humane immundefektvirus (også betegnet AlDS-virus), hvormed patienten er inficeret, bliver ude af stand til at inficere T4+-cefler.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes et oprenset polypeptid, der kodes for et cDNA-molekyle, der omfatter i det mindste en del af den i fig. 6 viste 25 nukleinsyre-sekvens.

Opfindelsen angår tillige en vektor, der omfatter et cDNA-molekyle, som i det mindste er en del af den i fig. 6 viste nukleinsyresekvens. I én udførelsesform af opfindelsen er vektoren et plasmid. I en anden udførelsesform for opfindelsen er 30 vektoren et virus.

Den foreliggende opfindelse angår også et vært-vektorsystem til fremstilling af et vandopløseligt polypeptid, som omfatter en del af et T4-glycoprotein. Dette vært-vektorsystem omfatter et plasmid ifølge den foreliggende opfindelse i en hensigts-35 mæssig vært. 1 én udførelsesform af opfindelsen er den hensigtsmæssige vært en

I DK 175520 B1 I

I 14 I

I baktériecelle. I en anden udførelsesform af opfindelsen er bakteriecellen en I

I Escherichia coli-ceIle. I endnu en udførelsesform af opfindelsen er den hen- I

I sigtsmæssige vært en eukaryot celle. I en yderligere udførelsesform af opfindelsen I

I er den eukaryote celle en pattedyrcelle. I en yderligere udførelsesform af opfin- I

I 5 delsen er den eukaryote celle en gærcelle. I endnu en udførelsesform af opfin- I

I delsen er den hensigtsmæssige vært en insektcelle. I

I Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt I

I polypeptid, som omfatter en del af et T4-glycoprotein, og som er i stand til I

I 10 specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra et humant I

I immundefektvirus. Denne fremgangsmåde omfatter, at et vært-vektorsystem I

I ifølge den foreliggende opfindelse dyrkes under betingelser, der tillader produktion I

I af det vandopløselige polypeptid, og at det resulterende vandopløselige polypeptid I

I isoleres. Den foreliggende opfindelse angår endvidere vært-vektorsystemer og I

I 15 fremgangsmåder til fremstilling af det vandopløselige polypeptid, hvor vektoren I

I omfatter et cDNA-molekyle ifølge den foreliggende opfindelse og et virus. Passende I

I værter indbefatter, men er ikke begrænset til, bakterieceller, fx Escherichia coli- I

I celler, eukaryote celler, fx pattedyr- og gærceller, og insektceller. Et vandopløseligt I

I polypeptid, som er en del af et T4-glycoprotein, kan fremstilles ved at dyrke et I

I 20 vært-vektorsystem, der omfatter et virus og et cDNA-molekyle ifølge den I

I foreliggende opfindelse, under passende betingelser, der tillader produktion af en I

I del af et T4-glycoprotein. Den resulterende del af et T4-glycoprotein kan isoleres I

I fra vært-vektorsystemet ved kendte fremgangsmåder. I

I 25 Den foreliggende opfindelse angår endvidere et stof, der er i stand til at danne et I

I kompleks med det vandopløselige polypeptid som defineret ovenfor. I én I

I udførelsesform af opfindelsen er antistoffet et monoklonalt antistof. I en yderligere I

I udførelsesform af opfindelsen er det monoklonale antistof et humant monoklonalt I

I antistof. I

I 30 I

I Opfindelsen angår også en vaccine, der kan anvendes til immunisering af en hu- I

I man patient mod et humant immundefektvirus. Denne vaccine omfatter et mono- I

I klonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse og en farmaceutisk acceptabel I

I bærer. Ved til en human patient at administrere en effektiv immuniserende I

I 35 mængde af en vaccine ifølge den foreliggende opfindelse kan man udløse I

DK 175520 B1 15 produktionen af antistoffer, som er i stand til at neutralisere humane immunde-fektvirus, hvorved patienten immuniseres mod et humant immundefektvirus.

Opfindelsen angår tillige et antistof, der er i stand til specifikt at danne et kompleks 5 med et monoklonalt antistof ifølge den foreliggende opfindelse. I én udførelsesform af opfindelsen er antistoffet desuden i stand til at danne et specifikt kompleks med et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus. I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen omfatter substansen et anti-idiotypisk T4-glycoprotein-antistof, der indeholder et "indre billede" af det T4-bindingsområde, 10 som er i stand til at genkende receptorbindingsdomænet af et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus.

Opfindelsen angår også et farmaceutisk præparat, som omfatter et anti-idiotypisk T4-glycoprotein-antistof ifølge den foreliggende opfindelse og en farmaceutisk 15 acceptabel bærer. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til behandling af en patient, der er inficeret med et humant immundefektvirus, ved hvilken metode der til patienten administreres en effektiv mængde af et farmaceutisk præparat ifølge den foreliggende opfindelse, hvilket præparat omfatter et anti-idiotypisk T4-glycoprotein-antistof og en farmaceutisk acceptabel bærer, således at 20 humane immundefektvirus, hvormed patienten er inficeret, bliver ude af stand til at inficere T4+-celler.

De forskellige profylakse- og immuniseringsfremgangsmåder for AIDS, der tilvejebringes ifølge den foreliggende opfindelse, er baseret på evnen hos de hidtil 25 ukendte peptider, antistoffer og DNA-molekyler, der er beskrevet i nærværende ansøgning, til at danne komplekser med, eller hybridisere til, specifikke molekyler og fremprovokere en immun logisk respons, der er effektiv med hensyn til at neutralisere AIDS-viruset. Disse molekyler, fremgangsmåder til fremstilling deraf og fremgangsmåder til behandling af AIDS forklares nærmere under henvisning til 30 følgende eksperimenter og eksempler, som er anført som en belysning af opfindelsen og på ingen måde skal opfattes som en begrænsning af opfindelsens omfang, som er angivet i nedenstående patentkrav.

35

I DK 175520 B1 I

I 16 I

I MATERIALER OG METODER I

I Celler og antistoffer I

I 5 Perifere blodleukocytter isoleret ved Ficoll-Hypaque-densitetsgradientcentrifugering I

I blev fraktioneret i fåreerythrocyt-rosette-positive (E+) celler. T4+ og T8+ under- I

I grupper inden for E* populationen blev isoleret ved positiv selektion af T8-bærende I

I celler med anti-T8-antistof og humane erythrocytter konjugeret med affinitetsop- I

renset kanin-antimuse-IgG (10). Cytofluorometrisk analyse af disse undergrupper I

I 10 viste, at T4+ cellerne var >95% T4+ og <2% T8+, mens T8+ cellerne var >95% T8+ I

og <2% T4+. I

I Fro 2.2 T-cellelinjen (T3', T4+, T8+, Tll+) stammede fra en voksen patient med I

udifferentieret akut leukæmi. Jurkat erT3', T4+, T8+, Til', RPMI 8402 erT3', T4‘, I

I 15 T8‘, Tll+. OT-CLL er en kronisk lymfocytær leukæmi, som er T3+, T4+, T8‘ og Tll+ I

I (22). T4+ cellelinjerne CEM og Molt 4 blev skaffet fra American Type Culture I

I Collection. Alle leukæmiske T-cellelinjer blev kontinuerligt dyrket i RPMI 1640- I

medium indeholdende 5% føtalt kalveserum. Transformerede B-cellelinjer CB, I

CP58 og CP94 blev fremstillet som beskrevet tidligere (23). I

20 I

Affinitetsoprenset kanin-antimuse-IgG blev konjugeret med humane erythrocytter I

ved chromchloridmetoden (24). I

Cotransformation af L-celler og NIH 3T3-celler I

25

L tk'aprt' museceller blev holdt i Dulbecco’s modificerede Eagle’s medium (DME) I

beriget med 10% kalveserum (Gibco) og 50 fig/ml diaminopurin (DAP). L-celler I

blev udpladet med en tæthed på 5xl04 celler pr. 10 cm skål 1 dag før transformation. Calciumphosphatpræcipitater blev fremstillet ved fremgangsmåden ifølge I

30 Graham og van der Eb (25), modificeret af Wigler et al. (26) under anvendelse af 100 ng pTK og 20 pg højmolekylært T-celle- eller L-celle-DNA pr. skål. L-cellerne blev den følgende dag anbragt under selektion i DME med 10% kalveserum, 15 ng/ml hypoxanthin, 1 Mg/ml aminopterin og 5 ng/ml thymidin (HAT-medium (27)). Efter 12-14 dages HAT-selektion blev tk+-transformanter screenet under 35 anvendelse af rosettedannelsesassayet.

DK 175520 B1 17 NIH 3T3-musecel ler blev holdt i DME beriget med 10% nyfødt kalveserum (Gibco). NIH 3T3-celler blev udpladet med en tæthed pi 5xl04 celler pr. 10 cm skål 2 dage før transformation. Et calciumphosphatpræcipitat blev anbragt på 5 cellerne under anvendelse af 10 ug bærer-DNA og enten 10 ug T4-pMV6tk/neo eller 10 Mg T4-pVcos7 og 500 ng pSV2neo. Efter 2 dage blev cellerne anbragt under selektion i DME med 10% kalveserum og 500 Mg/ml G418 (Geneticin®; Gibco). Rosettedannelsesassays blev udført på overlevende kolonier 1 uge efter vækst i selektivt medium.

10

Rosettedannelsesassay

Efter én skylning med phosphatbufret saltopløsning (PBS) blev pladerne inkuberet med 2,5 ml af det oprensede monoklonale antistof ΟΚΤ·4Α (1 mg/ml) fortyndet 15 1:500 i PBS indeholdende 5% føtalt kalveserum i 45 minutter ved stuetemperatur.

Frit antistof blev fjernet fra pladerne ved 3 nænsomme skylninger i PBS. 6 ml humane erythrocytter konjugeret med oprenset kanin-antimuse-IgG-antistof (2% vol/vol stamsuspension, fortyndet 1:10 i PBS/5% føtalt kalveserum) blev tilsat, og pladerne henstod ved stuetemperatur. Efter 45 minutter blev frie erythrocytter 20 nænsomt suget op, og PBS blev tilsat før undersøgelse for rosettepositive kloner.

Cytofluorometrisk analyse

Adhærerende celler blev fjernet med 0,005 M EDTA i PBS og vasket én gang med 25 PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,01% natriumazid (cyto-vask). Celler (5xl06) i 0,1 ml blev sat til rør med hensigtsmæssige fortyndinger af ΟΚΤ·4, ΟΚΤ·8 eller kontrolantistoffer. Celle/antistofblandingen blev inkuberet i 45 minutter ved 4°C og derefter vasket to gange i cytovask. Fluoroscein-isothiocyanat-(FlTC)-konjugeret gede-antimuse-IgG + A + M (Cappel) blev sat til cellerne og 30 inkuberet i 1 time ved 4°C. Cellerne blev derpå vasket 3 gange i cytovask og resuspenderet i 0,5 ml PBS med 0,01% natriumazid. Cellerne blev analyseret på en Becton Dickinson FACS IV Cell Sorter, og dataene blev lagret og plottet under anvendelse afen VAX 11/780-computer (Digital Equipment Co.).

35 __:___

I DK 175520 B1 I

I 18 I

I RNA- og DNA-isolering I

I Totalt RNA blev isoleret fra cellerne ved homogenisering i 4 M guadinium- I

I thiocyanat efterfulgt af ultracentrifugering gennem en 5,7 M CsCI-pude (28). I

5 Poly(A)+-selektion blev foretaget ved oHgo(dT)-cellulosechromatografi (Type 3, I

I Collaborative Research) (29). Højmolekylært genomisk DNA blev fremstillet som I

I beskrevet af Wigler et al. (26). I

I cDNA- og genombiblioteker I

I 10 I

I Dobbeltstrenget cDNA blev syntetiseret ud fra poly(A)+-RNA fra perifere humane T- I

H celler (20). Efter behandling med EcoRI-methylase og T4 DNA-polymerase blev det I

dobbeltstrengede cDNA klonet i EcoRI-stedet på XgtlO (30) under anvendelse af I

I EcoRI-linkere. Charon 4 humant genombibliotek blev venligt stillet til rådighed af I

15 Dr. Tom Maniatis (Harvard University) (31). I

Syntese af en subtraheret cDNA-probe I 32P-mærket cDNA bfev syntetiseret ud fra poly(A)+-RNA fra den primære transfor- I 20 mant, LTD-4, som beskrevet af Davis et al. (32). Efter sammenføjning af cDNA'et I med et overskud af utransformeret L-celle poly(A)+-RNA (Rot = 3000) blev enkelt- I strengede sekvenser, som var rige på humane cDNA'er, isoleret ved hydroxyapatit- chromatografi (32). Før filterhybridisering blev den subtraherede cDNA-probe kon- centreret med sek.butanol og afsaltet på en G-50 Sephadex-søjle ækvilibreret i TE.

I 25 .

I Screening af cDNA- og genombiblioteker I Biblioteket af perifere humane T-celler blev udpladet på E. coii C600/HFL, og det I humane genombibliotek blev udpladet på E. coti LE392. Screening af duplikat-filtre I 30 blev udført ved en standardprocedure (33), hvor hybridiseringen blev udført i 50% I formamid og 5x SSC ved 42°C. Ved screeningen af cDNA-biblioteket blev I 6xl04 cpm subtraheret probe påført pr. 137 mm nitrocellulosefilter. Filtre fra genombiblioteket blev hybridiseret til en nick-translateret (34) cDNA-indsætning.

I Vaskningerne blev udført ved 68°C med en afsluttende vask i 0,2x SSC. Autoradio- 35 grafi blev udført ved -70°C i nærværelse af forstærkningsskærme i 1-2 dage.

DK 175520 B1 19 DNA-sekventering

Restriktionsfragmenter fra pT4B blev subklonet i M13-vektorerne mpl8 og mpl9 (35). Sekventeringsreaktioner blev udført under anvendelse af dideoxykædeter-5 minationsteknikken (36). Sekventeringsstrategien er vist i fig. 3B.

Southern og northern blot-hybridiseringer

Celle-DNA'er med høj molekylvægt blev spaltet med 5 enheder 10 restriktionsnuklease pr. pg DNA ifølge leverandørens forskrifter (Boehringer

Mannheim). Prøver (10 ug) blev underkastet elektroforese på en 0,8% agarosegel. DNA-fragmenter blev over-ført til GeneScreen (New England Nuclear; (37)) og hybridiseret som beskrevet af Church og Gilbert (38).

15 RNA blev kørt på en 0,8% agarose-formaldehydgel (39) og overført til GeneScreen. Northern-hybridisering blev udført ifølge de af leverandøren givne forskrifter. Både Southern og northern blots blev hybridiseret til nick-translaterede prober.

Syntese og in viVo-translation af SP6 RNA

20

Det .... kb lange T4-CDNA blev subklonet i EcoRI-stedet på pSP65 (Promega Biotec) og lineariseret med Hindlll. Transkription af lineariseret plasmid-DNA (1 μg) med SP6-polymerase i fraværelse af radiomærkede nukleotider blev udført som beskrevet (40) bortset fra, at GpppG og umærket CTP blev sat til transkriptionsbuf-25 feren. 1/10 af reaktionsblandingen blev translateret i et hvedekimsystem (Bethesda Research Laboratories) indeholdende L-[32S]-methionin (Amersham) og 1 pmol'S-adenosylmethionin. In wtro-translationsprodukterne blev underkastet SDS-polyacrylamidelektroforese under reducerende betingelser som beskrevet nedenfor.

30

Cellemærkning, lectinchromatografi og immunudfaeldning

Celler blev dyrket i 12 dage i methioninfrit DME-medium indeholdende 10% dialyseret kalveserum og 1 mCi L-[32S]-methionin (Amersham) som beskrevet tidligere 35 (41). Cellerne blev solubiliseret i 10 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCI (TBS) I DK 175520 B1

I 20 I

I indeholdende 0,5% Nonidet P-40 (Shell) og 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid I

I (Sigma). Lysaterne blev centrifugeret i 1 time ved 100.000 x g, og superna- I

H tanterne blev underkastet linselectinchromatografi (Pharmacia) ved fremgangs- I

I miderne ifølge Hedo et al. (42). Eluater blev præabsorberet én gang med en I

I 5 blanding af kontrol-museascites og protein A-Sepharose (Pharmacia) i 1 time I

I ved 4°C og to gange med protein A-Sepharose alene i 1 time ved 4°C. Af hver I

I supernatant blev 2,5xl04 cpm derefter blandet med 10 μΙ monoklonalt antistof (ca.

I 1 mg/ml) og protein A-Sepharose og inkuberet på en drejeskive natten over ved H 4°C. Kuglerne blev derefter vasket 4 gange med koldt TBS indeholdende 0,5% NP- 10 40 og 0,2% SDS og blev resuspenderet i elektroforeseprøvebuffer.

I Gelelektroforese SDS-polyacrylamidgelelektroforese blev udført ved proceduren ifølge Laemmli (43).

I 15 Immunpræcipitaterne og in v/tro-translationsprodukterne blev opløst i prøvebuffer I med eller uden 2-mercaptoethanol og blev derefter sat på 10% polyacrylamidgeler.

I Autoradiografi blev udført på Kodak XAR-5-film i nærværelse af forstærknings- I skærme (DuPont Chemical Company).

I 20 Cotransformation og rosettedannelsesassay I Muse ψ-2-celler (44) blev holdt i Dulbecco’s modificerede Eagle’s medium (DME) I beriget med 10% kalveserum (CS) (Gibco). ψ-2-celler blev udpladet med en tæt- hed på 5xl05 celler pr. 10 cm skål 2 dage før transformation. Calciumphosphat-25 præcipitater blev fremstillet ved metoden ifølge Graham og van der Eb (25), modificeret af Wigler et al. (27). Præcipitater blev tilført cellerne under anvendelse af 10 pg bærer-DNA og enten 10 Mg T4-pMV7 eller 10 Mg T8-pMV7. Efter 2 dage blev cellerne anbragt under selektionsbetingelser i DME/10% CS og 500 Mg/ml G418 (Geneticin®; Gibco).

30 I

Rosettedannelsesassays for at identificere T4+- eller T8+-kolonier blev udført på overlevende kolonier 1 uge efter vækst i selektivt medium. Efter én skylning med phosphatbufret saltopløsning (PBS) blev pladerne inkuberet med 2,5 ml af det oprensede monoklonale antistof ΟΚΤ·4Α eller ΟΚΤ·8 (1 mg/ml; Ortho) fortyndet DK 175520 B1 21 1:500 i PBS indeholdende 5% føtalt kalveserum (FCS) i 45 minutter ved stuetemperatur. Frit antistof blev fjernet fra pladerne ved tre nænsomme skylninger i PBS.

6 ml humane erythrocytter konjugeret med oprenset kanin-antimuse-IgG-antistof (2% vol/vol stamsuspensioh fortyndet 1:10 1 PBS/5% FCS) blev tilsat, og pladerne 5 henstod ved stuetemperatur. Efter 45 minutter blev frie erythrocytter nænsomt suget op, og PBS blev tilsat før undersøgelse. T4+ og T8+ ψ-2-kloner blev oprenset ved koloniisolering og karakteriseret ved flow-cytometri og Northern blot-analyse.

Fremstilling af og infektion med rekombinant retrovirus 10

Der blev isoleret T4+-og T8+-\j/-2-kloner, som producerer rekombinant stam-retrovi-rus i titere på 105 cfu/ml. Stam-virus blev fremstillet ved tilsætning af 10 ml frisk DME/10% CS til et næsten konfluerit monolag af T4+-eller Τ8+-ψ-2-klonerne. Efter 24 timer blev mediet fjernet og filtreret gennem et 0,45 μηη filter 15 (Millipore). Til infektion blev 5xl05 celler inkuberet med 2 ml viral supernatant (eller en fortynding) i nærværelse af 8 Mg/ml polybren (Aldrich). Efter 3 timer blev der tilsat 8 ml frisk medium. 3 dage efter infektionen blev cellerne på ny podet i DME/10% CS indeholdende 500 Mg/ml G418, dyrket i 2 uger, analyseret for G418r kolonier og screenet for overflade T4- eller T8-ekspression under anvendelse af in 20 s/frj-rosette-dannelsesproceduren eller flow-cytometri.

ψ-2-kultursupernatanter blev anvendt til at inficere muse-iy-AM-celler som beskreet ovenfor. Adhærerende T4+-eller T8+-transformanter blev oprenset ved in situ-rosettedannelsesassayet efterfulgt af koloniisolering; ikke-adhærente T4+-eller 25 T8+-transformanter blev oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Ikke-adhærerende humane lymfoide cellelinjer (HSB2, RPMI - T-celler; Raji - B-celler)og adhærerende epitelceller (HeLa) blev inficeret ved samdyrkning med T4+-eller T8+-\j/-AM-kloner (forbehandlet med 10 μg/ml mitomycin-C i 2 timer; Sigma) og blev oprenset.

30

Cellelinjer blev selekteret for G418-resistens ved en koncentration på 1,5 mg/ml undtagen HeLa-celler, som kræver 1 mg/ml, og fibroblaster, som kræver 0,5 g/ml.

Alle cellekulturer, der producerede rekombinante amfotrofe virus (ψ-ΑΜ), blev holdt under P3-indeslutningsbetingelser.

35

I DK 175520 B1 I

I 22 I

I AIDS-virus I

I Prototype-LAV-stammen HTLV-III/LAV blev skaffet fra J.-C. Cherman (Institut I

I Pasteur, Paris; (45)). Virusinokula, der blev anvendt ved disse undersøgelser, var I

I 5 fra den 2. til 5. passage af virus i nærværende ansøgers laboratorium. Inokula er I

I kultursupernatanter fra HTLV-III/LAV-inficerede, phytohæmagglutinin-(PHA)- I

I stimulerede perifere lymfocytter, som blev høstet ved sekventiel centrifugering I

I (300 x g i 7 minutter efterfulgt af 1500 x g i 20 minutter) og blev opbevaret i - I

I flydende nitrogen. Til bindingsundersøgelser blev virus koncentreret fra kultur- I

I 10 superatanter og høstet som beskrevet ovenfor ved ultracentrifugering ved 90.000 x I

I g i 90 minutter over en 15% pude af Renograffin (E.R. Squibb) i 0,01 M Tris, 0,15 I

I M NaCI, 1 mM EDTA, pH 8,0. I

I Anti-HTLV-III/LAV-reagenser I

I 15 I

I Serum med høje niveauer af antistof mod HTLV-III/LAV blev vundet fra en homo- I

I seksuel mand med kronisk lymfadenopati, og dets specificitet er blevet beskrevet I

I ved immunfluorescens (46), western blot-analyse (47) og radioimmunudfældning I

I (48). Portioner af IgG-fraktionen blev koblet med fluorescein-isothiocyanat (FITC; I

I 20 FlTC:protein-forhold på 10,7 μg/ml), peberrodsperoxidase (HPO; type VI; Sigma) I

I og agarose som beskrevet (47, 49, 50, 51). Konjugater af IgG fra et ikke-immunt I

I serum blev fremstillet parallelt. I

I Omvendt transkriptase-assay I

I 25 I

I Magnesiumafhængig, partikelformig omvendt transkriptase (RT)-aktivitet blev målt I

I med en skabelon-primer af (A)n(dT)12-18 (eller (dA)„(dT)i2-i8 som negativ kontrol) · I

I i nærværelse af 7,5 mM Mg2+ (52). I

I 30 Immunfluorescens-detektion af cytoplasmisk AIDS-virus I

I Dyrkede celler (lxlO5 i 0,1 ml) blev centrifugeret over på objektglas (Shandon I

I Cytocentrifuge), fikseret i 95% ethanol og 5% eddikesyre ved -20°C i 30 minutter I

I og rehydreret med tre 10 minutters udskiftninger af PBS (0,01 M P04, 0,15 M NaCI, I

I 35 pH 8,0). Objektglassene blev eksponeret på en 1:500 fortynding af FITC-anti- I

DK 175520 B1 23 HTLV-III/LAV (19 fjg/ml) i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev derefter vasket (tre udskiftninger, 10 minutter hver) og under et dækglas tilsat 50% glycerol i PBS. Objektglassene blev undersøgt under et epiiltumineret Leitz Orthoplan-mikroskop ved 630x forstørrelse. Under disse betingelser er FITC-anti-5 HTLV-III/LAV-reagenset specifikt over for HTLV-III/LAV. Uinficerede PHA-stimu-lerede celler, Epstein Barr (EB)-virusinficerede B-cellelinjer, en adenovirusinficeret cellelinje, flere T-cellelinjer og HTLV-I- og HTLV-II-inficerede cellelinjer blev ikke farvet 10 AIDS-virus-immunassay (antigenbindingsassay)

Dette er et sandwich-immunassay, som er beskrevet i detaljer (47). Kort fortalt sættes kultursupernatant til mikrotiterpladebrønde belagt med anti-HTLV-III/LAV-IgG. Efter at pladerne er vasket, detekteres bundet virusantigen med HPO-anti-15 HTLV-III/LAV. Dette assay, som er mindst lige så følsomt som RT-assayet, er negativt med kultursupernatanter fra PHA-stimulerede lymfocytter fra flere donorer, EB-virusinficerede B-cellelinjer, flere T-cellelinjer, polyklonale og klonede IL-2-afhængige T-cellelinjer, den myeloide linje K562 samt cellelinjer, der indeholder HTLV-I eller HTLV-II. OD^o-grænsen for at kunne skelne en positiv fra en negativ 20 supernatant blev bestemt for hvert forsøg ud fra gennemsnittet plus 2 SD af mindst 10 gentagne bestemmelser pi kontrolsupernatanter (uinficeret cellekultur) høstet på samme tid.

AIDS-virusinfektivitetsassay (ID-50) 25

Mikrokulturassayet for titrering af infektiøst HTLV-III/LAV er beskrevet i detaljer (47). Kort fortalt inokuleres PHA-stimulerede lymfocytter eller cellelinjer (2xl06 celler/ml) med 10 ganges serie-fortyndinger af virusinokulum og inkuberes i 18 timer ved 37°C. Cellerne blev derpå vasket og udpladet i mikrokultur (10-20 kul-30 turer pr. fortynding: lxlO5 celler pr. kultur i 0,25 ml medium). Hver 4. dag blev 100 μΙ supernatant fjernet og erstattet med frisk medium. Supernatanter blev derefter analyseret for virusantigen ved antigen-bindingsassayet som beskrevet ovenfor. Infektiøst virustiter (ID-50) defineres som det reciprokke af den fortynding, ved hvilken 50% af kulturerne er positive for virus (47).

35

I DK 175520 B1 I

I 24 I

I VSV-pseudotypeassay I

I Vesikulær stomatitisvirus (VSV, Indiana-stamme, vildtype) blev propageret i celler, I

I der producerede det retrovirus, der er nødvendigt for kappepseudotypen som be- I

I 5 skrevet (53). Hyperimmunt neutraliserende fåre-anti-VSV-serum blev sat til det I

høstede VSV for at inaktivere ikke-pseudotype-virioner. Pseudotype-titerne lå I

I mellem 104 og 105 PFU/ml. Til assayet blev 2xl05 celler, der skulle inficeres med I

I VSV-pseudotyper, udpladet i vævskulturbrønde med en diameter på 30 mm. I

I HeLa-, NIH 3T3- og L-celler var naturligt adhærerende; alle andre celletyper blev I

I 10 bundet ved forbehandling af det underliggende lag med 50 ng/ml poly-L-lysin. Efter I

virusadsorption i 1 time blev cellerne vasket, og 106 CCL64-minkceller eller bovine I

I MDBK-celler blev sat til hver brønd. Disse celler tilvejebringer udmærkede plaques I

til sekundær VSV-infektion, men er resistente over for infektion med pseudo-type- I

I virioner. Efter at plaque-indikatorcellerne havde fået lov at etablere sig og sprede I

I 15 sig (ca. 90 minutter), blev enkeltlagene overlejret med agarmedium. VSV-plaques I

I blev talt 2 dage efter infektion. Monoklonalt anti-T4A-antistof (1:20), anti-HTLV- I

I Ill-serum (1:10) eller anti-HTLV-I-serum (1:10) blev anvendt for at inhibere I

pseudotype-plaquedannelse ved forbehandling af celler 30 minutter før tilsætning I

I af pseudotyper som beskrevet i (54). I

I 20 I Syncytium-induktionsassay I 2xl05 celler blev dyrket sammen med 2xl04 H9-celler, der var inficeret med og I producerede HTLV-III (55), i brønde med en diameter på 10 mm. Kulturerne blev I 25 inkuberet ved 37°C og undersøgt for syncytiumdannelse efter 18 timer som beskre- vet tidligere (54, 56). Celler med 5 syncytier eller derover blev anset for positive.

Syncytiuminhibering blev analyseret ved tilsætning af anti-T4A monoklonalt anti- I stof (1:20) til de blandede kulturer ved tidspunktet for podning.

I 30 Cytofluorometrisk analyse og AIDS-virusbinding I Metoden er beskrevet i detaljer (46). Kort fortalt blev celleoverflade T4- eller T8- I ekspression detekteret ved direkte immunfluorescens med fluorescein-konjugere- de anti-T4A eller anti-T8 monoklonale antistoffer (OKT*4A, ΟΚΤ·8). Diluent/vaske- I 35 bufferen var 0,01 Μ PO4, 0,15 M NaCI, pH 7,4, indeholdende 0,1% bovint DK 175520 B1 25 serumalbumin, 2% vol/vol AB+ humant serum og 0,01% NaN3. Alle reagenser blev prætitreret for optimal (mættende) binding. Celler (5x10s) blev inkuberet i en 25 μΙ fortynding af monoklonalt antistof i 30 minutter ved 4°C. Cellerne blev vasket ved centrifugering (300 x g i 7 minutter), resuspenderet i 0,5 ml 1% paraformaldehyd i 5 saltopløsning og analyseret med et fluorescensaktiveret cellesorteringsapparat (FACS IV, Becton Dickinson). Til HTLV-lII/LAV-binding blev 5x10s celler inkuberet med HTLV-III/LAV (500 ng i 10 μΙ) i 30 minutter ved 37°C. Vaskede celler blev resuspenderet i 25 μΙ fluorescein-konjugeret anti-HTLV-III/LAV i 30 minutter ved 4°C. Cellerne blev vasket, resuspenderet i 1% paraformaldehyd og analyseret ved FACS 10 som ovenfor. Til inhibering af HTLV-III/LAV-binding blev cellerne præinkuberet med anti-T4A eller anti-T8 (20 ng i 20 μΙ) i 30 minutter efterfulgt af tilsætning af HTLV-III/-1LAV (500 ng i 10 μΙ) i 30 minutter ved 37°C. Cellerne blev vasket, inkuberet med fluorescein-konjugeret anti-HTLV-III/LAV, vasket, resuspenderet i paraformaldehyd og analyseret ved FACS som ovenfor.

15

Celleoverflade-radioiodering, immunudfældning og gelelektroforese T4+ NIH 3T3-transformanter blev overflade-radioioderet ved lacto-peroxidasetek-nikken (18) som følger: 4xl07 celler blev suspenderet i 1 ml PBS indeholdende 0,5 20 mM EDTA, 2 mCi Nal25I og 20 μg lactoperoxidase. Ved 0, 1, 5, 10 og 15 minutter blev der tilsat 10 μΙ 0,03% Η2θ2· Reaktionen blev udført ved 23eC og blev standset efter 20 minutter ved 2 centrifugeringer i 50 volumen koldt PBS indeholdende 10 mM Nal. Mærkede celler blev opdelt i 4 rør og inkuberet som beskrevet med HTLV-III/LAV (2 μg i 20 μΙ) i 30 minutter ved 37°C. Efterfølgende vaskninger og 25 manipulationer blev udført ved 0-4°C. Vaskede celler blev lyseret ved tilsætning af 1 ml detergentlyseringsbuffer (LB; 0,02 M Tris, 0,12 M NaCI, pH 8,0, indeholdende 0,2 mM phenylethylsulfonylfluorid, 5 μθ/πηΙ aprotinin, 0,2 mM EGTA, 0,2 mM NaF, 0,2% natriumdeoxycholat og 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40). Rørene blev holdt på is i 15 minutter, og kernerne blev fjernet ved centrifugering ved 3000 x g i 20 minut-30 ter.

Til absorptioner blev Sepharose-konjugater af human anti-HTLV-III/-LAV-IgG-, human ikke-immun IgG-, anti-T4A- og anti-T8-antistoffer fremstillet som beskrevet (48). Lysater blev præabsorberet med 200 μΙ Sepharose/ikke-human IgG i 1,5 time 35 under rotation og derpå immunudfældet med 20 μΙ Sepharose-konjugater (som

I DK 175520 B1 I

I 26 I

I beskrevet) i 3 timer under rotation. Sepharose-absorbanter blev vasket 3 gange: 1 I

gang med LB; 1 gang med LB indeholdende 0,5 M NaCI; og 1 gang med LB inde- I

I holdende 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS). Absorberet materiale blev elueret ved I

I 65°C i 30 minutter med 20 μΙ prøvebuffer (0,01 M Tris, pH 8,0, indeholdende 2% I

5 SDS, 5% 2-mercaptoethanol (vol/vol), 25 pg bromphenolblit og 10% glycerol I

I (vol/vol). Elektroforese blev udført i en 3,3-20% gradient polyacrylamidgel med en I

I 3% stackinggel (57), og autoradiografier blev fremkaldt med Kodak XAR-5-film. I

I Virusinhiberingsassay I

I 10 I

I 2xl05 T4+ JM T-celler blev udsat for AIDS-virus ved 0 minutter. Inhibitorerne I

I ammoniumchlorid (20 mM) eller amantadin (20 mM) blev tilsat på forskellige I

I tidspunkter i løbet af virusinfektionen (0 minutter, 30 minutter og 60 minutter). I

I Efter 6 timer blev cellerne vasket og udpladet i frisk medium (RPMI/10% FCS). I

15 Virkningen af disse agentier på AIDS-virusinfektion blev bestemt 5 dage efter I

infektion. Den fraktion af inficerede celler i kulturerne, der udtrykte virusantigener, I

I blev bestemt ved immunfluorescensmikroskopi som beskrevet ovenfor (58). I

RNA-isolering og northern blot-hybridisering I

I 20 I

I Totalt RNA blev isoleret fra celler ved homogenisering i 4M guanidiniumthiocyanat I

efterfulgt af ultracentrifugering gennem en 5,7 M CsCI-pude (28). Poly(A)+ selek- I

I tion blev udført ved oligo(dT)-cellulosechromatografi (type 3, Collaborative I

I Research) (29). I

I 25 I

I RNA blev underkastet elektroforese gennem en 1% agaroseformaldehydgel (39) og I

I overført til Hybond (Amersham). Northern blot-hybridisering blev udført ifølge I

leverandørens forskrifter. Prober blev nick-translateret til en specifik aktivitet på I

I 0,5-lxl09 cpm/Mg med a32P-mærket deoxynukleotid-triphosphater (59). I

I 30 I

I 35 I

DK 175520 B1 27

RESULTATER Isolering af T4-cDNA

5 Den strategi, der blev fulgt for at isolere et T4-cDNA, omfattede til at begynde med, at der blev konstrueret L-celletransformanter, som udtrykker T4 på deres overflade. cDNA syntetiseret ud fra en T4+-transformeret fibroblasts mRNA blev isoleret ved subtraktiv hybridisering og anvendt som probe for at isolere et cDNA-kodende T4 fra et cDNA-bibliotek, der var fremstillet ud fra mRNA’et fra perifere T-10 lymfocytter. Identiteten af T4+-cDNA-kloner blev bestemt ved northern og

Southern blot-analyser og til sidst ved disse kloners evne til at overføre T4+-fæno-typen til modtagerceller. Lignende teknikker er tidligere blevet anvendt for at isolere det gen, der koder for T8-proteinet (20).

15 Muse-L-celler, der manglede thymidinkinase (tk), blev cotransformeret med geno-misk DNA fra den leukæmiske T-cellelinje HUT-102 sammen med det tk-holdige plasmid pTK (25, 26). tk+-L-celletransformanter, der udtrykte T-celleoverfladepro-teiner, blev identificeret ved et in s/tu-rosettedannelsesassay. tk+-kolonier blev udsat for muse-monoklonale antistoffer rettet mod T4 og blev dernæst inkuberet 20 med røde blodlegemer koblet med kanin-antimuse-immunglobulin. T4+-transfor-manter er synligt røde på grund af deres specifikke association med røde blodlegemer. På denne måde fik man én primær T4+-transformant, LTD-4. Denne klons ekspression af T4-molekylet blev uafhængigt bekræftet ved cytofluorometrisk analyse (fig. 1).

25 mRNA-populationen fra T4+-transformanten LTD-4 bør kun være forskellig fra populationen af en utransformeret L-celle med hensyn til ekspressionen af nyligt transformerede gener. Disse sekvenser blev isoleret ved at sammenføje højradioaktivt cDNA fremstillet ud fra poly-(A)+-RNA fra T4+-transformanten med et stort 30 overskud af RNA fra en utransformeret L-celle (32, 60). cDNA, som ikke kunne hybridisere, selv ved høje Rot-værdier, blev isoleret ved hydroxyapatit-chromato-grafi og anvendt til at screene et human perifer T-celle-cDNA-bibliotek, som var konstrueret i lambda-kloningsvektoren gtlO. 4 svagt hybridiserende plaques blev identificeret, plaque-oprenset og analyseret for tilstedeværelsen af T4-sekvenser.

35

I DK 175520 B1 I

I 28 I

I For at bestemme, om nogle af disse kloner kodede for T4, blev der indledningsvis I

I udført northern blot-analyser med RNA fra T4+-og T4'-perifere L-celler, leukæmier, I

I thymocytter, L-celletransformanter og ikke-lymfoide celler (fig. 2). 1 af de 4 kloner I

I hybridiserede til et RNA, som kun var til stede i T4+-celler. Denne klon detekterer I

I 5 et 3 kb langt RNA, som er til stede i T4+-transformanten, LTD-4, som også er til I

I stede i en population af T4+-perifere lymfocytter, forskellige T4+-leukæmiske I

I cellelinjer og thymocytter. Ingen hybridisering blev observeret med RNA fra I

I utransformerede fibroblaster, T4'-perifere lymfocytter, HeLa-celler eller humane I

I neuroblastomceller. I

I 10 I

I Det RNA-ekspressionsmønster, der blev detekteret af denne klon, stemmer I

I overens med den mulighed, at det koder for T4. Dette cDNA er imidlertid kun 0,6 I

I kb langt, men hybridiserer til et 3 kb langt mRNA. Derfor blev det humane perifere I

I T-celle cDNA-bibliotek screenet på ny, og dette gav én klon (pT4B), som indeholdt I

I 15 en 3 kb lang indsætning, hvis størrelse lå tæt på størrelsen af det modne I

I messenger-RNA. Restriktionskort over denne klon er vist i fig. 3A og 3B. I

I Genomisk blotanalyse I

I 20 Southern blot-forsøg (37) blev dernæst udført for at påvise, at den isolerede cDNA- I

I klon hybridiserede med DNA fra T4+-transformanten samt humant DNA, men ikke I

I med utransformeret muse-L-celle-DNA (fig. 4). Genomisk DNA fra en række huma- I

I ne celler udviser et sæt på 5 hybridiserende fragmenter efter skæring med enzy- I

I met BamHI. Som forventet kan der detekteres T4-sekvenser i transformanten LTD- I

I 25 4, men ikke i utransformeret L-celle-DNA. BamHI-fragmentet nærmest ved 3’- I

I enden af genet (6,6 kb) er ikke til stede i LTD-4, formodentlig som følge af inte- I

I grationsbegivenheden. Desuden kan der med det blotte øje ikke ses nogen I

I omlejringer ved dette grove analyseniveau, når man sammenligner DNA fra I

I lymfoide og ikke-lymfoide celler. Summen af molekylvægte af de hybridiserende I

I 30 fragmenter er 33 kb, hvilket antyder, atT4-genet er temmelig stort. Et fuld- I

I stændigt sæt af genomiske kloner, der spænder over dette område, blev opnået I

I (se nedenfor), og BamHI-fragmenterne blev ordnet ved restriktionsanalyse af disse I

I kloner (fig. 3A), hvilket bekræftede, at genet er stort og må indeholde introner I

I med betydelige længder. I

I 35 I

DK 175520 B1 29

Ekspression af T4-CDNA i transformerede musefibroblaster

Der kan tilvejebringes en yderligere påvisning af, at det isolerede cDNA koder for T4, hvis denne klon kan omdanne fibroblaster til T4+ fænotypen efter transfor-5 mation. T4-genet i chromosomalt DNA er stort og strækker sig over flere geno-miske kloner. Derfor blev cDNA-klonen indsat i to retrovirale ekspressionsvektorer, pVcos7 og pMV6tk/neo, som indeholder Moloney museleukæmivirus "long terminal repeats" (LTR), der flankerer et enkelt EcoRI-kloningssted (fig. 3C). 5’-LTR fremmer transkription gennem kloningsstedet, og 3’-LTR indeholder sekvenser, der er 10 nødvendige for skæring og polyadenylering. Vektoren pMV6tk/neo indeholder også tk-promotoren fusioneret til det kodende område af neomycin-phosphotransferase-genet. Den konstruktion, der benytter pVcos7, kræver transformation med en ubundet selekterbar markør, mens pMV6tk/neo bærer markøren for neomycin-resistens, som tillader bundet cotransformation. Neo+ kolonier af NIH 3T3-celler, 15 der var vundet efter transformation, blev selekteret ved deres evne til at vokse på medier, der indeholdt neomycin-analogen G418, og blev screenet under anvendelse af rosettedannelsesproceduren for at detektere ekspressionen af T4 på celleoverfladen. Ca. 50% af de G418-kolonier, der blev vundet med pVcos7, og 75% af de kolonier, der blev vundet med pMV6tk/neo, var positive for T4 ved dette 20 assay. Rosette-positive kolonier blev desuden analyseret ved cytofluorometri for at bekræfte, at T4 udtrykkes på den transformerede celleoverflade (fig. 1).

Forsøg med metabolisk proteinmærkning blev udført, hvilke viser, at den T4+-transformerede fibroblast og T-lymfocytten udtrykker et T4-protein med identisk 25 molekylvægt. Utransformerede NIH 3T3-celler, T4+-transformanter og T-lymfo-cytter blev mærket i 12 timer i nærværelse af L-[35S]-methionin (41). Cellerne blev detergentsolubiliseret, og lysatet blev ledt gennem linselectinsøjler for at isolere glycoproteiner (42). Den bundne glycoproteinfraktion blev elueret og immun-udfældet med monoklonale antistoffer rettet mod T4 (fig. 5). Under reducerende 30 betingelser detekteres der et glycoprotein, som vandrer ved en relativ molekylvægt på 55 kd, i ekstrakter fra T-lymfocytter og to uafhængige T4+-transformanter.

Dette protein detekteres ikke i 3T3-kontrolfibroblaster. Under ikke-reducerende betingelser immunudfældes et 51 kd langt glycoprotein med anti-T4 i T-celler og i de transformerede fibroblaster.

i 35

I DK 175520 B1 I

I 30 I

I Disse forsøg viser, at transformanterne udtrykker et 55 kd glycoprotein, der I

I immunudfældes med anti-T4, og som har samme størrelse som det, der udtrykkes I

på overfladen af T-lymfocytter. Northern- og Southern-analyser under anvendelse I

I af det isolerede cDNA sammen med dette cDNA's evne til at meddele musefibro- I

5 blaster T4+-fænotypen indikerer således, at hele den kodende sekvens for T- I

I celleoverflade-proteinet T4 var blevet klonet. I

I Nukleotidsekvens for T4-CDNA og den afledte proteinsekvens I

I 10 Den fuldstændige nukleotidsekvens af det T4-kodende område blev bestemt ved at I

sekventere begge strenge af den 3 kb lange cDNA-indsætning under anvendelse af I

I dideoxyterminationsmetoden (35, 36). Den fuldstændige nukleotidsekvens og den I

H forventede proteinsekvens er vist i fig. 6. Den længste åbne læseramme begynder i I

I position 76 med en methioninkodon omgivet af initierings-consensussekvensen I

I 15 PurNNATG-Pur (61). Denne læseramme strækker sig over 1374 nukleotider og I

I koder for et polypeptid indeholdende 458 aminosyrer. Sammenhængen i denne I

I læseramme blev bekræftet ved at indsætte dette cDNA i RNA-ekspressionsvek- I

I toren pSP6 (40). Hvis RNA syntetiseret fra denne vektor translateres in vitro, I

I styrer det syntesen af et umodificeret 51 kd protein, hvis præcise molekylvægt er I

I 20 bestemt ud fra nukleotidsekvensen (fig. 7). I

I T4 består af en ledersekvens, 4 tandem variable-forbindelses (VJ)-lignende områ- der og et område, der strækker sig over membranen, hvilke områder hver har homologi med tilsvarende områder i forskellige medlemmer af immunglobulin- I 25 genfamilien (62, 63) (fig. 6 og 8). En strækning af hydrofobe rester svarende til et I lederpeptid, der blev forudsagt ved et Kyte-Dolittle (64) hydropaticitetsplot, følger I umiddelbart efter initieringskodonen. Selv om den nøjagtige position, i hvilken det native T4'protein forarbejdes, ikke kan bestemmes, antages det, at skæringen sker I lige efter threonin i position -1, på basis af kendte skæringsmønstre (65). Derfor I 30 indeholder signalpeptidet 23 aminosyrer, og det forarbejdede T4-protein består af 435 rester.

I Resterne 1-94 i det modne protein deler både aminosyrer og strukturel homologi med immunglobulins lette kædes variable område (fig. 9A). Den samlede homolo- I 35 gi af dette område med immunglobulins variable områder er 32%. Sekvenssam- DK 175520 B1 31 menligning mellem V-omriderne af immunglobuliner med lette kæder og det N-terminale V-lignende område (VI) i T4 viser, at 8 af 14 invariante rester er bevaret (66). Dette Område indeholder to cysteinrester, adskilt af 67 aminosyrer, hvis positioner og afstand er analogt med det, der findes i immunglobuliner med 5 lette kæder og beslægtede molekyler (67). Disse cysteinrester er måske i stand til at danne den bevarede disulfidbinding mellem strengene, der er karakteristisk for V- områder. Denne teori underbygges af den iagttagelse, at T4 vandrer hurtigere under ikke-reducerende betingelser end under reducerende betingelser, hvilket stemmer overens med dannelsen af mindst én binding mellem strengene (fig. 5, 10 bane e og f).

Bortset fra homologier på enkeltaminosyreniveau deler VI-området af T4 strukturelle træk med variable områder i immunglobulin. Variable og konstante områder i immunglobulin foldes i et karakteristisk mønster, i hvilket en række antiparallelle 15 β-strenge foldes til dannelse af to β-lag (67, 68). Disse β-lag holdes både sammen af en disulfidbro og af karakteristiske hydrofobe interaktioner. For at bestemme, hvorledes den forventede sekundære struktur af det V-lignende T4-område er i forhold til strukturen af V-områderne ilette immunglobulinkæder, blev der foretaget todimensionale strukturelle opstillinger. Der blev også opnået et 20 plot over sandsynlige β-strenge og β-drejninger i disse sekvenser under anvendelse af den empirisk afledte algoritme ifølge Chou og Fasman (69). Disse analyser tyder på tilstedeværelse af 7 β-strenge i det V-lignende T4-område, hvilke strenge svarer godt til dem, der findes i V-området i immunglobulin (fig. 9A). De to bevarede cysteiner i T4 findes i β-strengene B og F og svarer nøjagtig til positionerne af de 25 cysteiner i V-området, der vides at danne den bevarede disulfidbinding i immunglobulin. En tryptophanrest ligger 12 aminosyrer nedstrøms for den første cystein, og en tyrosinrest befinder sig to aminosyrer før den anden cystein. Disse rester er i høj grad karakteristiske for β-strengene henholdsvis C og F i lette kæders V-område. Desuden findes der en aspartatrest 6 aminosyrer før den anden cystein, 30 og en argininrest ligger ved basen af β-strengen D. Disse ladede rester er meget karakteristiske for V-områder (67). Endelig er stykker af skiftende hydrofobe rester til stede i alle β-strengene, hvilke rester styrker interaktionen mellem de to β-lag.

VI- området i T4 følges af en strækning af aminosyrerester, som bærer betydelig 35 homologi med forbindelses (J)-områder i immunglobuliner og T-celleantigen-

I DK 175520 B1 I

I 32 I

I receptorer. I fig. 9B er dette J-lignende T4-område stillet op sammen med I

I consensus-forbindelsessekvenserne af lette immunglobulinkæder og de to kæder af I

I T-celleantigenreceptoren. Dette J-lignende område følges af en strækning på 265 I

aminosyrer, som i strukturel henseende kan opdeles i tre yderligere VJ-lignende I

5 områder med statistisk signifikant sekvens- og strukturhomologi med prototypiske I

I immunglobulin VJ-områder (fig. 6 og 8). Desuden indeholder I

I denne sekvens to potentielle N-bundne glycosyleringssteder (Asn-Leu-Thr; fig. 6). I

I Det ekstracellulære område efterfølges af en formodet transmembran sekvens, I

I 10 hvilket er forventet ved et hydropaticitetsplot (64), hvilken sekvens kun indeholder I

I hydrofobe og neutrale aminosyrerester. Dette segment har en slående homologi I

I med den transmembrane exon for β-kæderne af klasse II store histokompatibi- I

I litetsproteiner (fig. 9C). Opstilling af de transmembrane områder af T4 og MHC I

I klasse II β-kæder viser 48% homologi uden mellemrum. Efter det segment, der I

I 15 strækker sig over membranen, omfatter en højladet sekvens på 40 aminosyrer det I

I cytoplasmiske område (fig. 6 og 8). I

I T4-genet: chromosomplacering og positioner af intron-exon I

I 20 T4-cDNA'et blev anvendt til bestemmelse af chromosomplaceringen af T4-genet I

I ved analyse af dets segregationsmønster i en række muse-humane somatiske I

I cellehybrider og ved in s/'tu-hybridisering til humane metafase-chromosomer (101). I

I Genomblotforsøg og in s/fu-hybridisering viser, at T4-genet findes på den korte I

I arm af det humane chromosom 12 mellem områderne 12pl2 og 12pter. I

I 25 I

I En række overlappende genomkloner, der spændte over T4-genet, blev vundet ved I

I at screene humane genombiblioteker, der var konstrueret i lambda-kloningsvek- I

I torerne Charon 4 og EMLB-3 (31) med en radiomærket pT4B cDNA-indsætning I

I (70). Karakterisering af disse kloner ved både restriktions- og Southern blot- I

I 30 analyse viste, at de indeholdt hele den T4-kodende sekvens. Den fuldstændige I

I intron/exon-organisation af T4-genet blev derefter bestemt ved at sekventere I

I specifikke fragmenter af genomklonerne under anvendelse af dideoxytermina- I

I tionsproceduren (35, 36). I

DK 175520 B1 33 T4-genet omfatter 9 exoner adskilt af 8 introner som vist i fig. 8 og 10. Den første exon indeholder det 5’-utranslaterede område og ledersegmentet. Det første variabel-lignende område, VJ; er adskilt af en stor intron i nukleotidposition 289 (fig. 6). Derfor indkodes ViVområdet af den anden og tredje exon, og V2J2-, V3J3-, 5 V4J4- og transmembran (TM)-områder indkodes hver især af separate exoner (exon 4-7). Det cytoplasmiske område (CYT) er afbrudt af en intron, og den sidste del af det cytoplasmiske område og det 3'-utranslaterede område indkodes af den 9. exon.

10 Konstruktion af T4+-og T8+-transformerede celler

Den eksperimentelle procedure, der blev anvendt til undersøgelse af T4's rolle ved AIDS-virusinfektion, omfattede først indføring af T4-genet i T4'-cellelinjer, som ikke kunne fremme virusinfektion. De transformerede celler blev derefter testet for 15 modtagelighed over for AIDS-virus, efterfulgt af undersøgelser af den mekanisme, ved hjælp af hvilken T4 medierer virusinfektion.

En cDNA-klon med fuld længde, som indkoder T4-overfladeproteinet, blev subklonet i den retrovirale ekspressionsvektor pMV7. Ekspressionsvektoren pMV7 20 (fig. 11A) indeholder to direkte gentagne Moloney musesarkomvirus "long terminal repeats" (LTR), som flankerer et enkelt EcoRI-kloningssted. 5’-LTR fremmer konstitutivt transkription gennem kloningsstedet, mens 3’-LTR tilvejebringer sekvenser, der er nødvendige for skæring og polyadenylering af RNA'et. Desuden indeholder pMV7 herpesvirus-thymidinkinase-promotoren (tk) fusioneret til det 25 kodende område af det bakterielle neomycin-phosphotransferasegen (neo), en dominerende selekterbar markør, der tillader bundet co-transformation og infektion.

T4-pMV7 blev indsat i ψ-2- og ψ-AM-celler, NIH 3T3-cellelinjer, som 30 indeholdt defekte henholdsvis økotrope og amfotrope provirus (fig. 11B) (44, 59).

Begge cellelinjer er ude af stand til at indkapsle ("encapsidate") endogent viralt RNA, men kan tilvejebringe alle obligate transvirale funktioner. Stabil transfektion af disse cellelinjer med T4-pMV7 medfører produktion af rekombinante T4-kodende stamretrovirus, som er fri for hjælpervirus. Disse rene stamvirus kan derefter an-

I DK 175520 B1 I

I 34 I

I vendes til effektivt at indføre T4-sekvenser i både museceller og menneskeceller, I

I uden at målcellen producerer retrovirus. I

Kort fortalt blev T4-pMV7 DNA indsat i ψ-2-celler under anvendelse af proceduren I

I 5 med DNA-medieret genoverførsel (fig. 1 IB) (25, 27). Neo+-positive kolonier blev I

I selekteret ved deres evne til at vokse i medier indeholdende neomycin-analogen I

I G418 (Geneticin®) og screenet for ekspressionen af T4 på celleoverfladen under I

anvendelse af et in situ-rosettedannelsesassay (20, 70). Der blev derefter identi- I

ficeret kolonier af transficerede ψ-2-celler, der udtrykte T4, og som producerer I

I 10 rekombinant retrovirus i titere på 105 cfu/ml. T4+-iy-2-kloner blev derefter anvendt I

I til at frembringe retrovira, som kunne inficere muse ψ-AM-celler. T4, der udtrykte I

I ψ-AM-kloner, blev isoleret, og disse gav rekombinante retrovirustitere på ΙΟ4 I

I cfu/ml. Humane TA*-transformanter blev genereret ved samdyrkning af celler med I

mitomycin-C-behandlede kloner eller ψ-AM-kloner (fig. 1 IB). T4+-transformanter I

15 blev derefter analyseret ved Northern blot-analyse og flow-cytometri for at be- I

I kræfte, atT4 udtrykkes og er til stede på celleoverfladen. Kontrolcellelinjer, der I

I udtrykte T8-overfladeproteinet, blev konstrueret på analog måde. I

I T4 er essentiel for AIDS-virusinfektion I

20 I

I For indledningsvis at bestemme, hvorvidt tilstedeværelsen af T4-proteinet pi I

I overfladen af en human lymfocyt er tilstrækkelig til at gøre cellen følsom over for I

I AIDS-virusinfektion, blev der konstrueret transformanter af den primitive Jeukæ- I

I miske T-cellelinje HSB2 (71), der kun udtrykker de tidlige T-lymfocytproteiner TI I

I 25 og Til på overfladen. HSB2 udtrykker hverken T4 eller T8 og udtrykker heller ikke I

I T-celleantigenreceptoren eller det associerede kompleks af T3-proteiner. HSB2- I

transformanter, som enten udtrykker T4- eller T8-proteinerne på celleoverfladen, I

I blev selekteret og anvendt for at bestemme disse cellelinjers følsomhed over for I

I AIDS-virusinfektion. Flere forskellige forsøgsprocedurer blev benyttet for at I

30 bedømme AIDS-virusinfektion, herunder ekspression af omvendt transkriptase I

I (52), ekspression af virus i cellens cytoplasma ved immunfluorescensmikroskopi I

I (46), detektion af virusantigener i kultursupernatanten under anvendelse af et I

I immunassay (47) samt produktion af infektiøse virioner af supernatant-subkultur I

I med phytohæmagglutinin (PHA)-stimulerede perifere lymfocytter (46). Under I

DK 175520 B1 35 anvendelse af disse assays blev der ikke iagttaget tegn på AIDS-virusinfektion af HSB2-cellelinjen (tabel I).

TABEL I

5

Humane T4+- og T84 -transformanters følsomhed for AIDS-virusinfektion

Maksimal om- Cytoplasmisk Supernatant-• Human celle vendt tran- virus viral Ag jq skriptase CEM(T4+) 675023 + + HSB2 4245 HSB2-T8+ 4460 HSB2-T4+ 190915 + +

. c Raj i ND ND ND

Raj i-T8+ 5595

Raj i-T4+ 103500 + +

HeLa 6438

HeLa-T8+ 4875

HeLa-T4+ 48125 + + 2o Supernatant- Syncytium- VSV(AlDS) Virus-

Human celle subkultur induktion pseudotype- binding infektion CEM(T4+) + + + + HSB2 - HSB2-T8+ ....

25 HSB2-T4+ + + + +

Raj i ND - ND

Raj i-T8+ - - -

Raji-T4+ + + + +

HeLa - - ' -

HeLa-T8+ ND

2q HeLa-T4+ + + + + 35

I DK 175520 B1 I

I 36 I

I 5xl06 celler blev inokuleret med AIDS-virus, inkuberet ved 37°C i 24 I

I timer, vasket og udpladet i frisk medium. Celler og supernatanter blev fjernet pi I

I dag 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24 og 28 og anvendt i 4 virusdetektionsassays: omvendt I

I transkriptase, cytoplasmisk virus, supernatant-virusantigen og supernatant- I

I 5 subkultur. I

I Resultaterne af pseudotypeinfektionseksperimenterne er udtrykt som følger: I

I + (>103 PFU/ml); - (10 PFU/ml); ND = ikke bestemt. I

I Desuden er det tidligere blevet pivist, at der forekommer omfattende cellefusion, I

I 10 når uinficerede humane celler, der bærer receptorer for AIDS-virus, dyrkes I

I sammen med celler, som producerer AIDS-virus (54). I dette assay er der ingen I

I induktion af syncytier, når HSB2-celler blandes med AIDS-virusproducerende H9- I

I celler (tabel I), selv om der dannes mange syncytier med HTLV-I- og HTLV-II- I

I producerende celler (data ikke vist). I

I 15 I

I Til slut blev der testet for virusindtrængen under anvendelse af pseudotyper af I

I vesikulær stomatitisvirus (VSV), som bærer kappeglycoproteinerne af AIDS-virus I

I (tabel I) (53, 54). Når celler inficeret med AIDS-virus superinficeres med VSV, I

I opsamler en del af VSV-afkommet tilstrækkelig AIDS-viruskappeglycoprotein til at I

I 20 modstå neutralisering med hyperimmunt anti-VSV-serum. De værter, der kan I

I anvendes med disse VSV (AIDS)-pseudotypevirioner, er begrænset til celler, der I

I udtrykker AIDS-virusspecifikke receptorer. Efter indtrængen i cellen og afdækning I

I af virionen replikerer det transkapsiderede VSV-genom og danner ikke-pseudo- I

I type-partikler. Under den sekundære infektion trænger VSV-afkom, som er afgivet I

I 25 fra inficerede celler, ind og ødelægger tilstødende indikatorceller, som er resistente I

I over for VSV (AIDS)-pseudotype-infektion (CCL64-minkceller eller bovine MDBK- I

I celler), hvilket resulterer i dannelse af VSV-plaques, som derefter tælles. Infektion I

I med VSV (AIDS)-pseudotyper giver således et kvantitativt cytopatisk plaque-assay I

I for virusindtrængen (54). I dette assay blev der ikke observeret nogen plaques I

I 30 over baggrundsniveau, når HSB2-celler blev udsat for VSV (AIDS)-pseudotyper I

I (tabel I). I kontrolforsøg med pseudotyper af VSV RNA indkapslet i en HTLV-I- I

I kappe (VSV (HTLV-I)) blev der iagttaget adskillige plaques, hvilket viser, at HSB2- I

I cellen, som bærer HTLV-I-receptorer, er I stand til at replikere VSV på effektiv I

I måde. Disse iagttagelser viser, at VSV-genomet indkapslet i en AIDS-viruskappe er I

I 35 ude af stand til at trænge ind i HSB2-celler. I

DK 175520 B1 37

Det blev derefter undersøgt (tabel I), om indsætning af et funktionelt T4-CDNA i HSB2 ville gøre denne celle følsom over for AIDS-virusinfektion. Udsættelse af HSB2-T4+-transformanter for AIDS-virus resulterer i en produktiv virusinfektion, 5 hvilket blev bestemt ved ekspression af omvendt transkriptaseaktivitet (52), ekspression af virus i cellens cytoplasma ved immunfluorescens-mikroskopi (46), detektion af virusantigen i kultursupernatanten under anvendelse af et immun-assay (47) samt produktion af infektiøst virus af supernatantsubkultur med PHA-stimulerede lymfocytter (tabel I) (46). HSB2-T8+-kontrolceller var hele tiden 10 negative i hvert af disse assays.

Desuden undersøgtes også den effektivitet, hvormed forskellige T4+-T-celler inficeres med AIDS-virus. HSB2-T4+- og HSB2-T8+-transformanter, den naturligt isolerede T4+-T-cellelinje CEM samt PHA-stimulere-de perifere lymfocytter blev 15 udsat for 10 ganges seriefortyndinger af AIDS-virus, vasket og udpladet i mikro-kultur. Frekvensen af inficerede kulturer blev derefter bestemt under anvendelse af et immunassay 12 dage efter udsættelse for virus (Fig. 12) (47). På denne måde blev den titer af AIDS-virus, der krævedes for at inficere 50% af de udsatte kulturer (ID-50), defineret. ID-50 af PHA-stimulerede perifere lymfocytter er 2-3 20 størrelsesordener større end det, der blev observeret for enten naturligt isolerede eller transformerede T4+-cellelinjer. Infektionseffektiviteten af HSB2-T4+-celler er ca. 10 gange større end det, der blev iagttaget for den naturligt isolerede T4+-T-cellelinje CEM (fig. 12). HSB2-T8+-kontrolceHer er ikke følsomme over for infektion selv ved de højeste virustitere, der blev undersøgt.

25 HSB2-T4+-ce!lers evne til at fremme bide syncytiumdannelse og replikation af VSV (AIDS)-pseudotyper blev også undersøgt. Når HSB2-T4+-celler dyrkes sammen med AIDS-virusproducerende H9-celler, ses der let syncytium-dannelse i løbet af 18 timer (tabel I og II). Desuden undertrykkes syncytiuminduktion ved at 30 forbehandle kulturer med monoklonalt anti-T4A-antistof (tabel II). Når HSB2-T4+-celler udsættes for VSV (AIDS)-pseudotyper, dannes der endelig infektiøse VSV-partikler, som nedbryder tilstødende indikatorceller (tabel I og III). Desuden inhiberes plaquedannelse ved forbehandling med enten anti-AIDS-virusantistof eller monoklonalt anti-T4A-antistof (tabel III). HSB2-T8+-kontrolceller er hele tiden H ti I i I DK 175520 m

I 38 I

I negative i hvert af de 7 assays, der blev anvendt for at detektere AIDS-virus- I

I infektion (tabel I, Il og III). Disse iagttagelser tilvejebringer genetisk bevis for, I

at den blotte tilstedeværelse af T4-proteinet i en umoden human lymfocyt I

I tilvejebringer en essentiel funktion, der er nødvendig for AIDS-virusinfektion. I

I 5 I

I TABEL II I

I il |

I Induktion af syncytier i T4+ humane transformanter I

I 10 I

Syncytium-induktion I

I Humane H9/AIDS H9/AIDS I

celler + QT4A I

I 15 JM(T4+) 411 _ I

I 8166 (T4+) -H-H+ I

I HSB2 ND I I

I HSB2-T8+ ND I

I HSB2-T4+ ++ I

20 I

I Raji ND I

I Raji-T8+ ND I

I Raji-T4+ +++ I

I He La - ND I

HeLa-T8+ ND I

HeLa-T4+ wu - I 1

2xl05 celler blev dyrket sammen med 2xl04 AIDS-virusproducerende H9-celler I

(H9/AIDS) og inkuberet ved 37°C. Kulturerne blev undersøgt for syncytium- I

35 dannelse efter 18 timer. Resultaterne er udtrykt som den omtrentlige procentdel af I

DK 175520 B1 39 kerner indeholdt i syncytier: - (ingen syncytier); ++ (25%); +++ (50%); +++++ (90%); ND (ikke bestemt). Syncytiuminhibering blev analyseret ved at tilsætte monoklonalt ant»-T4A-antistof (aT4A; 1:20) til de blandede kulturer ved tidspunktet for 5 podning. De naturligt isolerede T44 T-cellelinjer JM og 8166 tjente som positive kontroller i disse undersøgelser.

TABEL III

10 VSV-pseudotype cytopatisk plaqueassay på T4+ og T8+ humane transfor-manter VSV-pseudotype-titer (PFU/ml) 15 Humane VSV(HTLV-I) VSV(AIDS)

celler + aHTLV-I + oAlDS + aT4A

CEM(T4+) 20.000 50 Wl. 000 50 200

2Q HSB2-T8+ 10.000 50 0 ND ND

HSB2-T4+ 12.000 50 1.000 100 300

Raji-T8+ 5.000 ND 0 ND ND

Raji-T4+ 5.000 50 1.500 25 150

25 . HeLa 10.000 ND 0 ND ND

HeLa-T4+ 10.000 50 17.000 50 200 1 2xl05 celler blev inkuberet med VSV (AlDS)-pseudotyper (53, 54) i 1 time ved 37°C. Cellerne blev derefter vasket, og til hver brønd blev der sat lxlO6 CCL64-mink- eller bovine MDBK-plaqueindikatorceller, som tillod VSV-infektion, men var 35 resistente over for VSV (AIDS). Kulturerne blev derefter overlejret med agarme- I DK 175520 B1 Η

I 40 I

I dium, og VSV-plaques blev talt to dage efter infektion. Monoklonalt anti-T4A- I

I antistof (aT4A; 1:20) eller anti-AIDS-virusserum (aAIDS; 1:10) blev anvendt I

I til at inhibere VSV (AIDS)-pseudotype-plaquedannelse ved forbehandling af celler I

I 30 minutter før udsættelse for pseudotypen (54). VSV (HLTV-I) pseudotyper, som I

I 5 blev udpladet på en lang række humane celletyper (54), blev anvendt som

H kontroller i disse forsøg. Anti-HTLV-I-serum (1:10) blev anvendt for at blokere VSV I

I (HTLV-I) pseudotype-plaquedannelse. Resultaterne er udtrykt som PFU/ml; ND

I (ikke bestemt). I

10 AlPS-virusinfektion er ikke beorænset til T-lymfocvtter I Et funktionelt T4-CDNA blev indsat i to humane ikke-T-cellelinjer:

HeLa, en epitelcellelinje stammende fra et cervikalt carcinom (72), og Raji, en B- lymfoblastoid cellelinje fra en patient med Burkitt's lymfom (73) (fig. 11B). Før I 15 retrovirusmedieret genoverførsel udtrykker disse cellelinjer ikke T4-overfladepro- tein eller T4-mRNA, og de er heller ikke følsomme over for AIDS-virusinfektion (tabel I). Desuden fremmer forældrecellelinjerne ikke induktion af syncytium og heller ikke udpladning af VSV (AIDS)-pseudotyper (tabel I, II og III).

I 20 Derimod fremmer T4+-Raji- og HeLa-transformanter AIDS-virusinfektion ifølge alle de kriterier, der tidligere er beskrevet (tabel I). Den effektivitet, hvormed Raji-T4+- celler kan inficeres med AIDS-virus, ligger tæt på HSB2-T4+-cellers og er ca. 10 I gange større end infektionseffektiviteten hos den naturligt isolerede T4+-T-cellelinje I CEM (fig. 12). Efter dyrkning sammen med AI DS-virusproducerende H9-celler I 25 fremmer Raji-T4+-og HeLa-T4+-celler desuden induktion af syncytier, hvilket undertrykkes ved at forbehandle kulturer med monoklonalt anti-T4A~antistof (tabel I I og II; fig. 13). Desuden medfører udsættelse af disse celler for VSV (AIDS)- I pseudotyper produktion af infektiøst VSV og dannelse af plaques, som inhiberes I ved forbehandling med anti-AIDS-virusantistof eller anti-T4A monoklonalt antistof 30 (tabel I og III). Raji-T8+-og HeLa-T8+-kontroltransformanter er hele I tiden negative i hvert af disse assays (tabel I, II og III).

I Derfor er indføring af et funktionelt T4-gen i enten humane T-lymfocytter, B- I lymfocytter eller epitelceller tilstrækkeligt til at gøre sådanne celler følsomme over I 35 for AIDS-virusinfektion. Tilsammen indikerer disse iagttagelser, at den T4* T- DK 175520 B1 41 celletropisme, der iagttages in vivo, er en følge af den begrænsede ekspression af T4-moleky-let og ikke arten af den celletype, i hvilken det udtrykkes.

AIDS-virus binder til T4-overfladeprotein 5

De tidligere eksperimenter giver genetisk bevis for, at T4-ekspression er nødvendig for AIDS-virusinfektion, men giver ingen information om dette molekyles rolle for virusets livscyklus. Den iagttagelse, at overfladeekspression af T4 er nødvendig for AIDS-virusinfektion, antyder, at T4 er AIDS-virusreceptoren. Der blev derfor 10 anvendt cytofluorometri for at undersøge bindingen af AIDS-virus til overfladerne af transformerede humane T4+- og T8+-celler (tabel I; fig. 14). HSB2-, Raji- og HeLa-celler og T4+- og T8+-transformanterne blev inkuberet med AIDS-virus. Efter virusabsorption blev cellerne vasket, udsat for fluorescein-konjugeret anti-AIDS-virusantistof og analyseret ved flow-cytometri. Dette assay viste, at AIDS-virus 15 binder effektivt og specifikt til de humane transformanter, der udtrykker overflade-T4, men ikke til T4~-forældrecellerne og ej heller til T8+-transformanterne (fig. 14, diagram B; tabel I). Bindingen af AIDS-virus til T4+-celler undertrykkes ved præinkubation med monoklonalt anti-T4A-antistof, men ikke ved præinkubation med monoklonalt anti-T8-antistof {fig. 14, diagram C). Nar T4+-transformerede 20 celler udsættes for AIDS-virus, copræcipiteres T4-glycoproteinet desuden sammen med viruskappeglycoproteinet, hvilket antyder en direkte fysisk forbindelse mellem disse molekyler (data ikke vist). Disse resultater viser, at AIDS-viruset binder til T4-molekylet på celleoverfladen, og at denne binding er uafhængig af andre T-celle-specifikke proteiner, da binding forekommer til alle de undersøgte T4+-25 celletyper.

T4 mRNA udtrykkes i hjernen

Ud over nedbrydning af det cellulære immunsystem er AIDS ofte ledsaget af 30 lidelser i centralnervesystemet (CNS), som antages at være en følge af den direkte infektion af hjerneceller med AIDS-virus (81). Det var derfor af interesse at bestemme, om T4 udtrykkes i celler i CNS, hvilket kunne give en forklaring af virusets neurotrope egenskaber. Northern blot-analyser af RNA fremstillet ud fra både menneske- og musehjerner blev udført for at bestemme, om T4-mRNA-„ 35 sekvenser udtrykkes i CNS (fig. 15). Poly(A)+-RNA fra human cerebral cortex

I DK 175520 B1 I

I 42 I

I indeholder to forskellige T4-mRNA'er med en molekylvægt på ca. 3 og 1,8 kb. (fig. I

I 15A). Det svageste 3 kb lange RNA har samme størrelse som det mRNA, der I

I udtrykkes af to leukæmiske T4+-cellelinjer, U937 (monocytisk cellelinje) og Jurkat I

I (T-cellelinje) samt af perifere T-lymfocytter. Det mindre, mere talrige 1,8 kb lange I

I 5 mRNA, som er fraværende i T-lymfocytter, kunne skyldes alternativ splejsning eller I

I alternative 5‘- eller 3'-terminaler. I

I En mere omhyggelig analyse af lokaliseringen af T4-mRNA blev udført ved at I

I isolere poly(A)+-RNA fra specifikke områder af musehjernen (fig. 15B). Hybri- I

I 10 disering med radiomærket cDNA, der koder for musehomologen til 74, L3T4, viser I

et intenst 2,2 kb langt mRNA i museforhjernen, som ikke findes i prøver fra bag- I

hjernen. Det 2,2 kb lange L3T4-mRNA kan detekteres i cortex, hypothalamus og er I

mest talrigt i striatum, men er fraværende i cerebellum, hjernestammen eller I

I rygmarven (data ikke vist). Dette 2,2 kb lange mRNA, der detekteres i CNS, I

I 15 er ca. 1 kb mindre end det 3,2 kb lange mRNA, som koder for L3T4 i thymocytter I

I (fig. 15B). Disse resultater viser, at den neurotropisme, der udvises af AIDS-virus, I

I sandsynligvis er et resultat af overfladeekspression af T4-molekylet på hjerneceller. I

I Det niveau af mRNA, der detekteres i forhjernen, er ca. 1/30 af niveauet i thymo- I

I cytter. Dette kan afspejle lavniveauekspression af et stort antal celler eller højere I

I 20 ekspressionsniveauer af en lille subpopulation af celler. Det er for tiden ikke kendt, I

I om T4 udtrykkes af neuroner eller støtteceller. Tilstedeværelsen af et variant- I

I transkript i CNS gør det imidlertid usandsynligt, at T4-mRNA’et i hjernen udtrykkes I

I af den sjældne invaderende T-lymfocyt. I

I 25 Diskussion I

I Adskillelse af T4 og T8 med funktionelt forskellige undergrupper af T-celler viser, at I

I disse molekyler kan være vigtige for interaktionen mellem T-lymfocytter og I

I relevante målceller. Som et første trin til forståelse af disse proteiners specifikke I

I 30 rolle blev der opnået cDNA-kloner fra både T4- og T8-molekylerne, og deres nu- I

I kleotidsekvens blev bestemt (20, 70). Sammenligning af de deducerede protein- I

I sekvenser af T4 og T8 viser, at disse molekyler har betydelig fælles sekvens- og I

I strukturhomologi med immunglobulins variable (V) områder og som medlemmer af I

I immunglobulin-supergenfamilien. Imidlertid er de N-terminale V-lignende områder I

I 35 i T4 og T8 temmelig forskellige: de har kun 28% homologi til fælles og er derfor I

DK 175520 B1 43 mindre homologe med hinanden, end de hver især er med lette immun-globulinkæder (fig. 9A). Desuden er områderne med maksimal bevarelse mellem T4 og T8 også de områder, der har stærkest homologi med immunglobulins og T-cellereceptorers V-områder. Disse to molekylers immunglobulin-lignende områder 5 udviser således, selv om de strukturmæssigt ligner hinanden, betydelige sekvensforskelle, som underbygger den hypotese, at de genkender forskellige molekyler på forskellige undergrupper af målceller.

Den strukturelle homologi i det V-lignende område, som de N-terminale områder i 10 T4 og T8 har til fælles, kan have særlig relevans for disse proteiners funktioner.

Praktisk talt alle medlemmer af immunglobulin-supergenfamilien tager del i immunresponset (62). Desuden har de individuelle medlemmer af denne familie en stærk tendens til at gå i forbindelse med hinanden og danne dimerer. Denne forbindelse er tydelig ved interaktionen mellem de tunge og lette immunglobulin-15 kæder, a- og β-kæderne af T-celleantigenreceptoren, P2-mikroglobulin og klasse I MHC-proteiner og a- og β-kæderne af klasse II MHC-molekyler. T8-glycoproteinet danner en disulfidbinding med T6, et formodet MHC-lignende molekyle, på overfladen af thymocytter (82) og eksisterer som multimerer af den 32 kd lange underenhed på perifere T-lymfocytter (83). Tilstedeværelsen af 4 V-lignende områder i 20 T4 indikerer, at disse områder går i forbindelse med hinanden samt med specifikke ligander på overfladen af andre celler eller virus. Disse specifikke affiniteter hos immunglobulin-lignende molekyler kan være essentielle for T4 og T8’s genkendelsesfunktioner.

25 Evolution af T4 I immunglobulin- og T-celleantigenreceptorgenerne ligger V- og J-exonerne langt fra hinanden og bliver først sammenstillet efter en somatisk rekombinationsbegivenhed (62, 63). T4 mRNA’et koder for 4 sammenhængende V- og J-lignende 30 elementer uden at kræve DNA-rekombinationsbegivenheder. Det er derfor muligt, at T4 afspejler et mere primitivt gen, der udviklede sig før fremkomsten af omlejringsmekanismer. Yderligere belæg for dette kommer fra nylige iagttagelser af, at det første V-lignende område i T4 (VI) er afbrudt af en intron, som ikke er til stede i de V-gener, der enten koder for immunglobulinerne eller T-celleantigenre-

I DK 175520 B1 I

I I

I ceptorerne. En beviskæde tyder på, at det er langt mere sandsynligt, at introner I

fjernes præcist under udviklingen, end at introner indsættes i et tidligere intronfrit I

I miljø. T4 kan således repræsentere et tidligt immunglobulingen, som gennemgik I

I duplikationer, divergens og omlejring for at danne den aktuelle immunglobulin- I

I 5 genfamilie. Selv om T4 for tiden er funktionel i et langt mere komplekst immun- I

I system, kan T4 afspejle receptorer, som er virksomme i mere primitive cellulære I

I immunresponser. Primitive immunresponser såsom dem hos hvirvelløse dyr ser I

I ikke ud til at involvere et forskelligartet repertoire af receptormolekyler, men er i I

I de simpleste tilfælde begrænset til en skelnen mellem sig selv og ikke sig selv (85, I

I 10 86) og akkomoderes sandsynligvis af et "statisk" sæt af gener, som ikke gennem- I

I går omlejring. I

I Uanset rækkefølgen af fremkomsten af T4 i udviklingen er organisationen af dette I

I gen et interessant eksempel på exon-blanding. T4 består af 4 V-J-lignende om- I

I 15 råder, et J-lignende område og et transmembrant segment, der hver har fælles I

I homologi med forskellige medlemmer af immunglobulin-supergenfamilien. De V- I

I og J-lignende områder er homologe med de tilsvarende områder i både immun- I

I globuliner og T-celleantigenreceptorkæderne; det transmembrane område udviser I

I betydelig homologi med dette område i β-kæderne af klasse II MHC-molekyler (fig. I

I 20 9C). T4 består derfor af en række exoner, der er bevaret i flere medlemmer af ! I

I immunglobulin-supergenfamilien, som er blandet på forskellige måder til dannelse I

I af et stort antal forskellige molekyler, som tager del i immunresponset. I

I T4 er AIDS-virusreceptoren I

I 25 I

I De i nærværende sammenhæng tilvejebragte data tyder på en mekanisme for I

I AIDS-virusinfektion, som i begyndelsen involverer den specifikke association af I

I AIDS-viruset med T4-molekyler på celleoverfladen. Denne association kan påvises I

I på T-lymfocytter, B-lymfocytter og epitelceller og kræver derfor ikke deltagelse af I

I 30 yderligere T-cellespecifikke proteiner. Desuden viser disse data, at T4-AIDS- I

I viruskomplekset internaliseres via receptormedieret endocytose, og viruskappen I

I fusionerer derefter med endosomets begrænsende membran og afgiver nukleo- I

I kapsidet i cytoplasmaet. Virusreplikation og -transkription kan derpå forekomme i I

I både lymfoide og ikke-lymfoide cellelinjer. Desuden udtrykkes T4-genet i hjernen I

I 35 samt i lymfocytter, hvilket forklarer AIDS-virusets dobbelte neurotrope og lymfo- I

I I

DK 175520 B1 45 trope karakter. På denne måde er et T-lymfocyt-overfladeprotein, som er vigtigt ved mediering af effektorcelle/målcelle-interaktioner, blevet udnyttet af et humant retrovirus til specifikt at målrette AIDS-viruset til populationer af T4+-celler.

5 Cetleoverfladereceptorer er blevet identificeret for en række kappevirus, og disse receptorers ekspressionsmønster er ofte ansvarligt for specifikke virusers mulige værter og tropiske egenskaber (74, 76). Nogle virus inficerer kun et snævert udvalg af celletyper, hvilket afspejler ekspressionen af virusreceptoren på specifikke popu-lationer af målceller. Rabiesvirus samvirker fx med 10 nikotinacetylcholinreceptoren (87) og inficerer hovedsagelig skeletmuskler og neuroner, hvorimod Epstein-Barr-virus samvirker med C3d-komplementreceptortype 2 (88) og inficerer B-lymfo-cytter. Andre virus såsom myxovirus interagerer med ubikvitært forekommende sialsyrerester på celleoverfladen og inficerer et meget bredere udvalg af celletyper.

15

Den begrænsede ekspression af celleoverfladereceptorer giver kun én forklaring på viral tropisme. Nogle virus replikerer kun i et begrænset sæt af differentierede celletyper, mens andre kun transkriberes effektivt i specifikke celletyper. Således inducerer Moloney museleukæmivirus (Mo-MuLV) T-ceflelymfomer hos nyfødte 20 mus, mens det nært beslægtede Friend-hjælper-museleukæmivirus (Fr-MuLV) primært inducerer erythroleukæmier (89, 90, 91). Denne tropisme antages at skyldes forskelle i de LTR’er, som letter den effektive transkription af Mo-MuLV-genomet i T-lymfocytter og Fr-MuLV-genomet i erythroide precursorer (92, 93, 94).

25

Som beskrevet er den primære tropiske AIDS-virusdeterminant ekspressionen af T4-proteinet på overfladen af målcellen. In v/Vo-infektion er begrænset til lymfoide celler og myeloide celler samt hjerneceller: tre populationer, der udtrykker T4. In vitro-forsøg viser, at indsætning af T4 i humane T4'-B-lymfocytter og epithelceller, 30 celler, som ikke er naturlige mål for AIDS-virus, gør disse celler følsomme over for produktiv infektion med AIDS-virus.

35

I DK 175520 B1 I

I 46 I

I EKSEMPEL 1 I

I Opløselige T4-fragmenter I

I 5 Der fremstilles opløselige T4-glycoproteinfragmenter under anvendelse af I

I begrænset proteasenedbrydning ud fra cellepræparationer. Alternativt kan der I

I konstrueres DNA-ekspressionsvektorer, der koder for T4-fragmenter, og som I

I mangler transmembranområdet, et område indeholdende neutrale og hydrofobe I

I I

I rester, og disse vektorer kan anvendes til fremstilling af sådanne T4-fragmenter. I

I 10 Disse fragmenter er opløselige i vandige opløsninger og indeholder leder- (signal)- I

I sekvenser. Nar disse fragmenter udtrykkes i pattedyrceller, transporteres de til det I

I grove endoplasmatisk retikulum/golgikompleks og udskilles til slut fra cellerne. I

I EKSEMPEL 2 I

I 15 I

I Behandling af AIDS-patienter I

I Opløselige T4-glycoproteinfragmenter som beskrevet i eksempel 1, typisk i en I

I farmaceutisk acceptabel bærer, administreres til patienter, der er inficeret med et I

I 20 humant immundefektvirus, for at fragmenterne skal binde til virus, som findes i I

I patientens blod og andre legemsvæsker, og blokere infektion af T4+-celler in vivo. I

I Alternativt eller yderligere ledes en patients blod gennem en søjle, der enten 1 I

I indeholder immobiliserede T4-glycoproteiner eller opløselige T4-fragmenter, ! I

I således at viruset kan adskilles fra blodet. Sådanne foranstaltninger gør det muligt I

I 25 for immunsystemet at etablere et mere effektivt immunlogisk respons mod viruset, I

I dvs. tillade uinficerede T4+-T-celler at proliferere. I

I Opløselige T4-fragmenter anvendes som terapeutisk middel, dvs. en inhibitor for I

I ekstracellulær spredning og celle-celle-spredning af HIV-infektion. Nærværende I

I 30 ansøgere har påvist, at opløselige T4-fragmenter inhiberer in vitro HIV-binding til I

I og infektion af T4+-målceller (jfr. eksempel 4). Administration af opløselige T4- I

I fragmenter til personer inficeret med HIV inhiberer ekstracellulær spredning af I

I virusinfektionen. Desuden inhiberes fusion af HIV-inficerede T4+-celler og uinfi- I

I cerede T4+-celler, hvilket også er en vej, ad hvilken viruset spredes, ved admini- i I

I 35 stration af opløselige T4-fragmenter. I

I I

I I

DK 175520 B1 47

Derfor forsinker administration af opløselige T4-fragmenter sygdommens forløb, lindrer adskillige symptomer, der er forbundet med AIDS, og forhindrer forekomst af nye patologiske forandringer.

5

Opløselige T4-fragmenter, der er biokemisk rene, vandopløselige reagenser, anvendes i kombination med andre reagenser for at analysere for konkurrenter til T4-HIV-interaktionen. Opløselige T4-fragmenter anvendes således i kombination med HIV-kappeproteiner eller biokemiske blandinger indeholdende HIV-kappe-10 proteiner til at screene for inhibitorer for virusbinding.

EKSEMPEL 3

Produktion af opløselige T4-fragmenter 15

Et plasmid (pT4B), der indeholder cDNA, som koder for det membranbundne T4-protein, er blevet isoleret, karakteriseret og udtrykt i en række pattedyrcelletyper (70). Opløselige T4-fragmenter produceres i bakterie-, gær-, insekt- og pattedyrsystemer. Da det native T4-protein sandsynligvis foldes på en kompliceret måde og 20 er glycosyleret, foretrækkes ekspression i pattedyrsystemer. Opløselige T4-fragmenter produceres ved at skære pT4B efter V^-området. Sådanne DNA-fragmenter ender før transmembransegmentet, der begynder ved ca. nukleo-tidposition 1264 (fig. 6). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Oprensning og karakterisering af opløselige T4-fragmenter lettes i høj grad ved 2 konstruktion af en cellelinje, der overudtrykker det udskilte proteinfragment.

3

Strategier, der tillader overekspression af proteiner, er blevet anvendt med 4 bakterie-, gær-, insekt- og pattedyrsystemer. Inducerbare ekspressionssystemer er 5 også blevet anvendt med bakterier og gær for at overproducere proteiner, som kan 6 være toxiske, hvis de udtrykkes konstitutivt. Overekspression af opløselige T4- 7 fragmenter udføres ved at amplificere en opløselig T4-ekspressionsvektor, hvilket 8 medfører konstitutiv overekspression. Amplifikation af dihydrofolatreduktase 9 (dhfr)-generne ved dyrkning i progressivt stigende koncentrationer af lægemidlet 10 methotrexat, en dhfr-antagonist, er i vid udstrækning blevet benyttet. Da den 11 amplificerede enhed ikke er begrænset til dhfr-kodende sekvenser, resulterer

I DK 175520 B1 I

I 48 I

I denne fremgangsmåde i coamplifikation af sekvenser, der grænser op til disse. I

Derfor anvendes dhfr som selekterbar markør og som middel til coamplifikation af I

I nyligt indførte sekvenser. Denne strategi er med held blevet anvendt til at forøge I

I ekspressionen af flere forskellige gener, som cotransformeres med dhfr-plasmider. I

I 5 En alternativ amplifikationsprocedure omfatter cotransfektion af den opløselige T4- I

I cDNA-ekspressionsvektor med plasmidet pdLAT-3 efterfulgt af en selektionsproce- I

dure som beskrevet tidligere (102). I

I Ved anvendelse af rekombinant DNA-teknologier fremstilles en vektor, som | I

10 udtrykker et udskilt, opløseligt, ekstracellulært T4-fragment, der kodes for af den I

I humane cDNA-klon pT4B (70). Basepar 1-1252 i pT4B (se fig. 6) koder for I

I lederpeptidet i T4, der er nødvendigt til syntese af et udskilt protein, samt den I

I ekstracellulære del af T4 omfattende de 4 VJ-lignende områder (V^j-V^), men I

I ikke de transmembrane og cytoplasmiske områder, som forankrer proteinet i I

I 15 membranen. Denne vektor indeholder sekvenser, der koder for den ekstracellulære I

I del af T4-proteinet, som indeholder HIV-bindingsomridet. Disse sekvenser er I

I anbragt nedstrøms for promotoren for det tidlige område fra SV40. Desuden er der I

I en TAA-terminationskodon efterfulgt af polyadenyleringsområdet fra genet for I

I bovint væksthormon nedstrøms for det afkortede T4-cDNA, hvilket tilvejebringer I

I 20 de signaler, der er nødvendige for termination af proteinsyntese, I

I transkriptionstermi-nation og polyadenylering af RNA-transkriptet. Det I

I resulterende opløselige T4-minigen ligeres derefter til dihydrofolatreduktase (dhfr)- I

I genet fra mus til dannelse af et plasmid, som er i stand til at blive amplificeret I

I efter indsættelse i dhfr-deficiente (dhfr-) kinesisk hamsterovarieceller (CHO-celler). I

I 25 I

I Det 1,8 kb lange EcoRI-BamHI-fragment fra pT4B, som indeholder hele den T4- I

I kodende sekvens, indsættes fx mellem Stul- og BclI-stederne på pattedyr-ekspres- I

I sionsvektoren DSP (103) modificeret til at indeholde den tidlige SV40-promotor og I

I polyadenyleringssekvensen af det bovine væksthormon. Ved anvendelse af I

30 syntetiske linkere indsættes Haell (bp 124) - Hpall (bp 1252) fragmentet af pT4B I

I mellem Kpnl- og Xbal-stederne i plasmidet pUC18. Der fremstilles en opløselig T4-. I

I ekspres-sionsvektor ved at ligere: I

I 1. et 0,95 kb langt Bglll-SacI-fragment fra modificeret DSP, som I

I 35 indeholder det 1,8 kb lange EcoRI-BamHI-fragment fra pT4B (dette I

DK 175520 B1 49 segment indeholder den tidlige SV40-promotor, T4-ledersekvensen og den aminoterminale del af den ekstracellulære T4-sekvens); 2. det 0,66 kb lange SacI-Xbal-fragment af plasmidet pUC18 indeholdende Haell-Hpall-fragmentet fra pT4B (dette segment indeholder 5 den carboxyterminale del af den ekstracellulære T4-sekvens efterfulgt af en TAA-terminationskodon indsat efter valin 371 (fig. 6)); og 3. det 2,48 kb lange Bglll-Xbal-fragment fra modificeret DSP, som indeholder polyadenyleringssekvensen af bovint væksthormon.

10 Til slut indsættes det 2,2 kb lange Bglll-BamHI-fragment fra en anden modificeret DSP, som indeholder en muse-dhfr-ekspressionskassette (β-globinpromotor -muse-dhfr-kodende område - SV40-polyadenyleringsområde) flankeret af Bglll- og BamHI-steder, i BamHI-stedet på et plasmid for at danne et opløseligt T4-ekspressionsplasmid.

15 DXB-11, en klon af kinesisk hamsterovarieceller, som mangler dhfr (104), transficeres med det opløselige T4-ekspressionsplasmid. DXB-11- transformanterne dyrkes derefter i F12-medium uden hypoxanthin eller tbymidin, men indeholdende 10% dialyseret føtalt bovint serum. Der udvælges kloner, som underkastes trinvis 20 stigende koncentrationer af methotrexat (mtx), en dhfr-antagonist, for at selektere for stabile transformanter, som har ampiificeret det nyligt indsatte dhfr-gen og tilstødende opløselige T4-sekvenser.

Kultursupernatanter af selekterede kloner dyrket i mtx underkastes radioimmunud-25 fældning for at detektere opløselige T4-fragmenter. Konfluente kulturer af selekterede kloner radiomærkes med 35S-methionin og cystein i 18 timer, og kultursupernatanter immunudfældes med monoklonale antistoffer, som er specifikke over for T4 (OKT4, OKT4A), samt med kontrolantistoffer OKT8 og uspecifik muse-IgG. Immunpræcipitaterne underkastes SDS-polyacrylamidgelelek-troforese 30 og eksponeres på film. Et protein med en molekylvægt på ca. 45 kd, den forventede størrelse af et opløseligt T4-fragment, immunudfældes specifikt fra kultur-supernatanter af både OKT4 og OKT4A.

Konditioneret medium (CM) isoleres serumfrit fra kulturer af selekterede kloner og 35 klares ved centrifugering ved lav hastighed og koncentreres 10 gange. Den kon-

I DK 175520 B1 I

I 50 I

I centrerede prøve fortyndes 2 gange for at reducere saltkoncentrationen, indstilles I

I til pH 6 og sættes på S-Sepharose (Pharmacia). Opløselige T4-fragmenter holdes I

I tilbage på harpiksen ved denne pH og elueres med en saltgradient. I

I 5 Lignende fremgangsmåder kan anvendes med bakterier, gær og insekter for at I

I producere opløselige T4-fragmenter. Desuden kan der produceres fragmenter med I

I en mindre størrelse end beskrevet i nærværende sammenhæng, fx kun I

I indeholdende ViJi-området. I

I 10 EKSEMPEL 4 I

I Bindings- og infektivitetsassays under anvendelse af opløselige T4-t’ragmenter I

I Evnen hos et opløseligt T4-fragment, der var fremstillet som beskrevet i eksempel I

I 15 3, til at konkurrere med, og inhibere HIV-binding til, T4+-celler blev testet. Serie- I

I fortyndinger af HIV-virus blev præinkuberet med seriefortyndinger af 10 gange I

I koncentreret CM fra selekterede celler, der producerede opløselige T4-fragmenter, I

I før tilsætning til målet, T4+-T-cellelinjen CEM. HIV-binding til CEM-celler blev I

kvantificeret ved inkubation med et FITC-konjugeret anti-HIV-antistof efterfulgt af I

20 cytofluorometrisk analyse. CM fra de selekterede cellelinjer, der producerede op- I

I løselige T4-fragmenter, inhiberede HIV-binding til overfladen af CEM-celler på en I

I fortyndingsafhængig måde, hvorimod der ikke blev iagttaget noget respons med I

I CM fra tilsvarende ikke-producerende celler. I

25 Evnen hos opløselige T4-fragmenter til at inhibere HIV-infektivitet af T4+-celler in I

vitro blev også testet. CM fra en selekteret cellelinje, der producerede opløselige I

I T4-fragmenter, blev sat til kulturer af PHA-stimulerede T4+-T-celler inokuleret med I

I seriefortyndinger af HIV. HIV-replikation blev overvåget i kulturerne på dag 4, 8 I

I og 12 ved det ovenfor beskrevne antigenindfangningsassay. Opløselige T4-frag- I

I 30 menter inhiberede HIV-infektivitet på hvert tidspunkt med en faktor på ca. 1 log. I

I 35 i DK 175520 B1 51 EKSEMPEL 5

Fremstilling af anti-opløseligt T4-fragment-antistoffer 5 8 uger gamle Balb/c-mus injiceres intraperitonealt med 50 pg af et oprenset opløseligt T4-fragment ifølge den foreliggende opfindelse (fremstillet som beskrevet ovenfor) i Freund's komplette adjuvans, 1:1 efter volumen. Musene reimmuniseres derefter med månedlige intervaller med det opløselige T4-fragment blandet med Freund’s inkomplette adjuvans, og der udtages blod fra halevenen.

10 Immunglobulinfraktioner af sera genereres ved ammoniumsulfatudfældning, og specifikke anti-opløseligt T4-fragment-antistoffer oprenses ved affinitetschroma-tografi under anvendelse af et immobiliseret T4-fragment.

EKSEMPEL 6 15

Fremstilling af opløseligt T4-fragment-anti-idiotypiske antistoffer

Syngeniske og kongeniske mus injiceres intraperitonealt med 50 pg af et oprenset anti-opløseligt T4-fragment-antistof ifølge den foreliggende opfindelse 20 (fremstillet som beskrevet ovenfor) i Freund's komplette adjuvans og reimmuniseres hver måned med det antiopløseligt T4-fragment-antistof i Freund's ukomplette adjuvans. På dag 4, 3 og 2 før fusion injiceres musene intravenøst med 50 pg immunglobulin i saltopløsning. Splenocytter fusioneres derefter med P3X63 AG8.653 ikke-secernerende myelomceller ifølge procedurer, der er beskrevet og er 25 kendte inden for det område, som opfindelsen tilhører. 2 uger senere screenes hybridom-supernatanter for bindingsaktivitet mod antiopløseligt T4-fragment-antistoffer ved radioimmunassay. Positive kloner analyseres derefter for deres evne til at binde et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus og AIDS-virus.

Ved at anvende "ettrins"-proceduren injiceres musene alternativt intraperitonealt 30 med et opløseligt T4-fragment i Freund's komplette adjuvans og immuniseres intravenøst med det opløselige T4-fragment i saltopløsning, og musemiltceller fusioneres med myelomer som ovenfor. Hybridom-supernatanter analyseres derefter direkte for anti-idiotypiske opløseligt T4-fragment-antistoffer.

__ I DK 175520 B1

I 52 I

I REFERENCER I

1. E.L. Reinherz et al., "Discrete Stages of Human Intrathymic I

I Differentiation: Analysis of Normal Thymocyte and Leukemic I

Lymphoblasts of T Cell Lineage", Proc. Nad. Acad. Sci. USA 77: I

I 1588-1592 (1980). I

I 2. E.L. Reinherz og S.F. Schlossman, "The Differentiation and I

I Function of Human T Lymphocytes", Cell 19: 821-827 (1980). I

I 3. M.L. Blue et al., "Coexpression of TA and T8 on Peripheral Blood I

T Cells Demonstrated by Two-color Fluoroescence Flow Cytometry", I

I J. Immunol. 136: 2281-2286 (1985). I

I A. E.G. Engleman et al., "Activation of Human T Lymphocyte subsets: ] I

I Helper and Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize and Respond to I

Distinct Histocompatibility Antigens", J. Immunol. 127: 212A- I

I 2129 (1981). I

I 5. A.M. Krensky et al. , "Long-term Human Cytolytic T-cell Lines I

Allospecific for HLA-DR6 Antigen Are 0KTA+", Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 79: 2365-2369 (1982). I

I 6. S.C. Meuer, S.F. Schlossman og E. Reinherz, "Clonal Analysis of I

Human Cytotoxic T Lymphocytes TA+ and T8+ Effector T Cells I

I Recognize Products of Different Major Histocompatibility Complex I

I Regions", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: A395-A399 (1982). I

I 7. W.E. Biddison et al., "Possible Involvement of the OKTA Molecule I

I in T Cell Recognition of Class II HLA Antigens", J. Exp. Ned. I

I 156: 1065-1076 (1982). I

I 8. D.R. Wilde et al., "Evidence Implicating L3TA in Class II MHC I

I Antigen Reactivity Monoclonal Antibody GK 15 (Anti-L3TA) Blocks I

Class II MHC Antigen-Specific Proliferation, Release of Lympho- I

DK 175520 B1 53 kines and Binding by Cloned Murine Helper T Lymphocyte Lines", J. Immunol. 131: 2178-2183 (1983).

9. S.L. Swain, "T Cell Subsets and the Recognition of MHC Class", Immunol. Rev. 74: 129-142 (1983).

5 10. Y. Thomas et al., "Functional Analysis of Human T Cell Subsets

Defined by Monoclonal Antibodies. IV. Induction of Suppressor Cells Within the 0KT4+ Population", J. Exp. Med. 154: 459-467 (1981).

11. E.G. Engleman et al., "Antibodies to Membrane Structures that 10 Distinguish Suppressor/Cytotoxic and Helper T Lymphocyte Sub- populations Block the Mixed Leukocyte Reaction in Man", J. Exp. Med. 154: 193-198 (1981).

12. P. Marrack et al., "The Major Histocompatibility Complex-restricted Antigen Receptor on T Cells. II. Role of the L3T4 15 Product”, J. Exp. Med. 158: 1077-1091 (1983).

13. L. Rogozinski et al., "The T4 Surface Antigen is Involved in the Induction of Helper Function", J. Immunol. 132: 735-739 (1984).

14. S.L. Swain, "Significance of Lyt Phenotypes: Lyt2 Antibodies Block Activities of T Cells that Recognize Class I Major Histo- 20 compatibility Complex Antigens Regardless of Their Function",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7101-7105 (1981).

15. U. Landegren et al., "Selective Inhibition of Human T Cell Cytotoxicity at Levels of Target Recognition of Initiation of Lysis by Monoclonal 0KT3 and Leu-2a Antibodies", J. Exp. Med.

25 155: 1579-1584 (1982).

16. R.M. Zinkernagel og P.C. Doherty, "MHC-restricted Cytotoxic T Cells: Studies on the Biological Role of Polymorphic Major Transplantation Antigens Determining T Cell Restriction, Specificity, Function, and Responsiveness", Adv. Immunol. 27: 52-177 30 (1979).

17. J. Kappler et al., "The Major Histocompatibility Complex-Restricted Antigen Receptor on T Cells in Mouse and Man: Identification of Constant and Variable Peptides", Cell 35: 295-302 (1983).

35 18. 0. Acuto et al., "The Human T Cell Receptor: Appearance in

Ontogeny and Biochemical Relationship of Alpha and Beta Subunits on IL-2 Dependent Clones and T Cell Tumors", Cell 34: 717-726 (1983).

I DK 175520 B1 I

I 54 I

I 19. P. Kavathas et al., "Isolation of the Gene Coding for the Human I

I T Lymphocyte Antigen Leu-2 (T8) by Gene Transfer and cDNA Sub- I

I traction", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7688-7692 (1984). I

I 20. D.R. Littman et al., "The Isolation and Sequence of the Gene I

I 5 Encoding T8: A Molecule Defining Functional Classes of T Lympho- I

I cytes", Cell 40: 237-246 (1985). I

I 21. V.P. Sukhatraa et ai., "The T Cell Differentiation Antigen Leu- I

2/T8 is Homologous to Immunoglobulin and T Cell Receptor Vari- I

I able Regions". Cell 40: 591-597 (1985). I

I 10 22. S.M. Friedman et al., "OT-CLL: A Human T Cell Chronic Lyraphoey- I

I tic Leukemia That Produces IL-2 in High Titer", J. Immunol. 128: I

I 935-940 (1982). I

I 23. D.A. Thurley-Lawon, L. Chess og J.L. Strominger, "Suppression of I

I In Vitro Epstein-Barr Infection: A New Role for Adult Human T I

I 15 Cells", J. Exp. Med. 146: 495-508 (1977). I

I 24. J.W. Goding, "The Chromic Chloride Method of Coupling Antigens I

I to Erythrocytes: Definition of Some Important Parameters", J. I

I Immunol. Methods 10: 61-66 (1976). I

I 25. F.L. Graham og A.J. van der Eb, "A New Technique for the Assay I

I 20 of Infectivity of Human Adenovirus DNA", Virology 52: 456-467 I

I (1973). I

I 26. M. Wigler et al.p "Biochemical Transfer of Single-Copy Eucaryo- I

I tic Genes Using Total Cellular DNA as Donor”, Cell 14: 725-731 I

I (1978). I

I 25 27. M. Wigler et al., "Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine I

I Kinase Gene to Cultured Mouse Cells”, Cell 11: 223-232 (1977). I

I 28. J.M. Chirgwin et al., "Isolation of Biologically Active Ribo- I

I nucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease" , Biochemi- I

I stry 18: 5294-5299 (1979). I

I 30 29. H. Aviv og P. Leder, "Purification of Biologically Active Globin I

I Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic Acid-Celluio- I

I se", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972). I

30. T. Huynh, R.A. Young og R.U. Davis, "Construction and Screening I

I cDNA Libraries in gtlO and gtll”, DNA Cloning Techniques - A I

I 35 Practical Approach, D.M. Glover, red. (Oxford: IRL Press), under I

I udgivelse. I

I 31. t. Maniatis et al., "The Isolation of Structural Genes from I

I Libraries of Eucaryotic DNA", Cell 15: 687-701 (1978). I

DK 175520 B1 55 32. M.M. Davis et al., "Cell-Type-Specific cDNA Probes and the Murine X Region: the Localization and Orientation of A4* Alpha",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2194-2198 (1984).

33. T. Maniatis, E.F. Fritch og J. Sambrook, Molecular Cloning (Cold 5 Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) (1982).

34. P.W.J. Rigby et al., "Labelling Deoxyribonucleic Acid to High - Specific Activity In Vitro by Nick Translation with DNA Polymerase 1", J. Mol. Biol. 113: 237-251 (1977).

35. J. Vieira og J. Messing, "The pUC Plasmids, an M13mp7-Derived 10 System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic

Universal Primers", Gene 19: 259-268 (1982).

36. F. Sanger, S. Nicklen og A. Coulson, "DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977).

15 37. E. Southern, "Detection of Specific Sequences Among DNA Frag ments Separated by Gel Electrophoresis”, J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975).

38. G.M. Church og W. Gilbert, "Genomic Sequencing", Proc. Nad.

Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984).

20 39. R.H. Scheller et al., "A Family of Genes that Codes for ELH, a

Neuropeptide Eliciting a Stereotyped Pattern of Behavior in Aplysia", Cell 28: 707-719 (1982).

40. K. Zinn, D. DiMaio og T. Maniatis, "Identification of Two Distinct Regulatory Regions Adjacent to the Human Beta-Interferon 25 Gene", Cell 34: 865-879 (1983).

41. C. Terhorst et al., "Further Structural Studies of the Heavy Chain of HLA Antigens and Its Similarity to Immunoglobulins",

Proc. Nad. Acad. Sci. USA 74: 4002-4006 (1977).

42. J.A. Hedo, L.C. Harrison og J. Roth, "Binding of Insulin Recep- 30 tors to Lectins: Evidence for Common Carbohydrate Determinants on Several Membrane Receptors", Biochemistry 20: 3385-3393 (1981).

43. U.K. Laemmli, "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature 227: 680-685 35 (1970).

44. R. Mann, R.C. Mulligan og D. Baltimore, "Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus", Cell 33: 153-159 (1983).

I DK 175520 Bl I

I 56 I

45. F. Barre-Sinoussi et al., "Isolation of a T lymphotropic retro- I

I virus from a patient at risk for acquired immune deficiency I

I syndrome (AIDS)", Science 220: 868-871 (1983). I

I 46. J.S. McDougal et al., "Cellular tropism of the human retrovirus I

I 5 HTLV-III/lAV. I. Role of T cell activation and expression of the I

I T4 antigen", J. Imaol. 135: 3151-3162 (1985). I

47. J.S. McDougal et al., "Immunoassay for the detection and quanti- I

I tation of infectious human retrovirus, lymphadenopathy-associa- I

I ted virus (LAV)··, J. Immunol. Meth. 76: 171-183 (1985). I

I 10 48. J.S. McDougal et al., "Binding of HTLV-III/LAV to T4+ cells by a I

I complex of the 110K viral protein and the T4 molecule", Science I

I 231: 382-385 (1986). I

I 49. C.B. Reimer et al., "Standardization of ligand binding assays I

I for alpha-fetoprotein", i Immunofluorescence and Related Stal- I

I 15 ning Techniques, W. Knapp, K. Holubar og G. Wick, red. (Amster- I

I dam: Elsevier/North Holland Press), s. 189 (1978). I

I 50. M.B. Wilson og P.K. Nakane, "Recent developments in the perioda- I

I te method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to anti- I

bodies", i Immunofluorescence and Related Staining Techniques, I

I 20 W. Knapp, K. Holubar og G. Wick, red. (Amsterdam: Elsevier/North I

I Holland Press), s. 215 (1978). I

I 51. J. Porath, R. Axen og S. Ermback, "Chemical coupling of proteins I

I to agar", Nature 215: 1491-1493 (1967). I

I 52. B.J. Poiesz et al., "Detection and isolation of type C retro- I

I 25 virus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient I

with cutaneous T cell lymphoma", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: I

I 7415-7419 (1980). I

53. P. Clapham, K. Nagy og R.A. Weiss, "Pseudotypes of human T-cell I

I virus types 1 and 2: Neutralization by patients' sera”, Proc. I

I 30 Natl. Acad. Sci. USA 81: 2886-2889 (1984). I

I 54. A.G. Dalgleish et al., "The CD4 (T4) antigen is an essential I

component of the receptor for the AIDS retrovirus", Nature 312: I

I 763-766 (1984). I

I 55. M. Popovic et al., "Detection, isolation, and continuous produc- I

I 35 tion of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with I

I AIDS and Pre-AIDS", Science 224: 497-500 (1984). I

I 56. K. Nagy et al., "Human T-cell leukemia virus type 1: induction I

DK 175520 B1 57 of syncytia and inhibition by patients' sera", Int. J. Cancer 32: 321-328 (1983).

57. D.M. Neville og H. Glossman, "Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein subunits by discontinuous gel 5 electrophoresis in dodecyl sulfate". Methods Enzymol. 32: 92-102 (1974).

58. A. Helenius et al., "On the entry of Semliki Forest virus into BHK-21 cells", J. Cell. Biol. $4: 404-420 (1980).

59. R.D. Cone og R.C. Mulligan, "High-efficiency gene transfer into 10 mammalian cells: Generation of helper-free recombinant retro viruses with broad mammalian host range", Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81: 6349-6353 (1984).

60. F.W. Alt et al., "Probes for Specific mRNAs by Subtractive Hybridization: Anomalous Expression of Immunoglobulin Genes", i 15 Eucaryotic Gene Regulation, R. Axel, T. Maniatis og C.F. Fox, red. (New York: Academic Press), s. 407-419 (1979).

61. M. Kozak, "Comparison of Initiation of Protein Synthesis in Procaryotes, Eucaryotes and Organelles", Microbiol. Rev. 47: 1-45 (1983).

20 62. L. Hood, M. Kronenberg og T. Hunkapiller, “T Cell Antigen Recep tors and the Immunoglobulin Supergene Family", Cell 40: 225-229 (1985).

63. S. Tonegawa, "Somatic Generation of Antibody Diversity", Nature 302: 575-581 (1983).

25 64. J. Kyte og R.F. Doolittle, "A Simple Method for Displaying the

Hydropathic Character of a Protein", J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982).

65. G. von Heijne, "Patterns of Amino Acids Near Signal-Sequence Cleavage Sites", Eur. J. Biochem. 133: 17-21 (1983).

30 66. E.A. Rabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological

Interest" (Washington, D.C.; US Department of Health and Human Services), s. 281 (1983).

67. A.F. Williams et al., "Cell Surface Glycoproteins and the Origins of Immunity", i the Proceedings of the Sigrid Juselius t 35 Symposium, L.C. Andersson, C.G. Gahmberg og P. Ekblom, red. (New

York: Academic Press), under udgivelse (1984).

68. L.M. Amzel og R.J. Poljak, "Three-Dimensional Structure of Immunoglobulins", Ann. Rev. Biochem. 48: 961-997 (1979).

I DK 175520 B1 I

I 58 I

I 69. P.Y. Chou og G.D. Fasman, "Empirical Predictions of Protein I

I Conformation", Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276 (1978). I

70. P.J. Maddon et al., "The isolation and nucleotide sequence of a I

cDNA encoding the T cell surface protein T4: A new member of the I

I 5 immunoglobulin gene family", Cell 42: 93-104 (1985). I

I 71. R.A. Adams, A. Flowers og B.J. Davis, "Direct implantation and I

serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in I

I hamsters, SB-2", Can. Res. 28: 1121-1125 (1968). I

I 72. G.O. Gey, W.D. Coffman og M.T. Kubicek, "Tissue culture studies I

I 10 of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal I

I epithelium", Cancer Res. 12: 264-265 (1952). I

73. R.J.V. Pulvertaft, "Cytology of Burkitt's tumor (African Lyrapho- I

I roa)", Lancet I: 238-240 (1964). I

I 74. N.J. Dimmock, "Initial stages of infection with animal viruses", I

I 15 J. Gen. Virol. 59: 1-22 (1982). I

75. J. White, M. Kielian og A. Helenius, "Membrane fusion proteins I

of enveloped animal viruses", Quart. Rev. Biophys. 16: 151-195 I

I (1983). I

I 76. M. Marsh, "The entry of enveloped viruses into cells by endocy- I

I 20 tosis", Biochem. J. 218: 1-10 (1984). I

I 77. M. Kielian og A. Helenius, "Entry of alphaviruses", i the Toga~ I

I viridae and Flaviviridae, S. Schlesinger og M.J. Schlesinger, I

I red. (Plenum Publishing Corp.), s. 91-119 (1986). I

I 78. S. Ohkuraa og B. Poole, "Fluorescence probe measurements of the I

25 intralysosomal pH in living cells and the pertubation of pH by I

various agents", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3327-3331 I

I (1978). I

I 79. F.R. Maxfield, "Weak bases and ionophore rapidly and reversibly I

I raise the pH of endocytic vesicles in cultured mouse fibro- I

I 30 blasts", J. Cell. Biol. 95: 676-681 (1982). . I

I 80. A. Helenius, M. Marsh og J. White, "Inhibition of Semliki Forest I

virus penetration by lysosomotropic weak bases", J. Cen. Virol. I

I 58: 47-61 (1982). I

I 81. R.T. Johnson og J.C. McArthur, "AIDS and the brain", TINS 9: 91- I

I 35 94 (1986). I

I 82. P.M. Snow, M. Van de Rijn og C. Terhorst, "Association Between I

I the Human Thymic Differentiation Antigens T6 and T8”, Eur. J. I

I Immunol., under udgivelse (1985). I

DK 175520 B1 59 83. P.M. Snow og C. Terhorst, "The T8 Antigen is a Multiraeric Complex of Two Distinct Subunits on Human Thymocytes but Consists of Homomultimeric Forms on Peripheral Blood T Lymphocytes", J.

Biol. Chem. 258: 14675-14681 (1983).

5 84. C. Terhorst et al., "Biochemical Analysis of Human T Lymphocyte

Differentiation Antigens T4 and T5”, Science 209: 520-521 (1980).

85. W.H. Hildemann, "Immunocompentance and Allogeneic Polymorphism Among Invertebrates", Transplantation 27: 1-3 (1979).

10 86. V.L. Scofield et al., "Protochordate Allorecognition is Control led by a MHC-like Gene System", Nature 295: 499-502 (1982).

87. T.L. Lentz et al., "Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor?", Science 215: 182-184 (1982).

88. J.D. Fingeroth et al., "Epstein-Barr virus receptor of human B

15 lymphocytes is the C3d receptor CR2", Proc. Natl. Acad. Sci. USA

81: 4510-4514 (1984).

89. P.E. Tambourin et al., "The physiopathology of Friend leukemia", Leukemia Res. 3: 117-129 (1979).

90. A. Oliff et al., "Isolation of transplantable erythroleukemia 20 cells from mice infected with helper-independent Friend murine leukemia virus", Blood 58: 244-254 (1981).

91. J.E. Silver og J.M. Fredrickson, "Susceptibility to Friend helper virus leukemias in CXB recombinant inbred mice", J. Exp.

Ned. 158: 1693-1702 (1983).

25 92. P.A. Chatis et al., "Role for the 3' end of the genome in determining disease specificity of Friend and Moloney murine leukemia viruses", Proc. Natl. Acad. 5ci. USA 80: 4408-4411 (1983).

93. P.A. Chatis et al., "A 3' end fragment encompassing the transcriptional enhancers of nondefective Friend virus confers 30 erythroleukemogenicity on Moloney leukemia virus", J. Virol. 52: 248-254 (1984).

94. A. Bosze, H.J. Thiesen og P. Charnay, "A transcriptional enhancer with specificity for erythroid cells is located in the long terminal repeat of the Friend murine leukemia virus", EHBO J. 5: 35 1615-1623 (1986).

95. A.N. Barclay et al., "Immunoglobulin-related structures associated with vertebrate cell surface", under udgivelse.

I DK 175520 B1 I

I 60 I

I 96. M.O. Dayhoff, W.C. Barker og L.T. Hunt, "Establishing homologies I

I in protein sequences", i Methods in Enzymology. Enzyme Structure I

I Part I, C.H.W. Hirs og S.N. Tiroasheff, red. (New York: Academic I

I Press), s. 524-545 (1983). I

I 5 97. Y. Yanagi et al., "A human T cell-specific cDNA clone encodes a I

I protein having extensive homology to immunoglobulin chains", I

I Nature 308: 145-149 (1984). I

I 98. G.K. Sim et al., "Primary structure of human T-cell receptor I

I chain". Nature 312: 771-775 (1984). I

I 10 99. H. Saito et al., "A third rearranged and expressed gene in a I

I clone of cytotoxic T lymphocytes", Nature 312: 36-40 (1984). I

100. H. Saito et al., "Complete primary structure of the E chain and I

I gene of the mouse major histocompatibility complex", Proc. Natl. I

I Acad. Sci. USA 80: 5520-5524 (1983). I

I 15 101. M. Isobe et al.. "The gene encoding the T-cell surface protein I

I T4 is located on human chromosome 12", Proc. Natl. Acad. Sci. I

I USA 83: 4399-4402 (1986). I

I 102. J.M. Roberts og R. Axel, “Gene Amplification and Gene Correction I

I in Somatic Cells", Cell 29: 109-119 (1982). I

I 20 103. D.S. Pfarr, G. Sathe og M.E. Reff, "A Highly Modular Cloning I

I Vector for the Analysis of Eucaryotic Genes and Gene Regulatory I

I Elements". DNA 4: 461-467 (1985). I

I 104. G. Urlaub og L.A. Chasin, "Isolation of Chinese Hamster Cell I

I Mutants Deficient In Dihydrofolate Reductase Activity", Proc. I

I 25 Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980). I

Claims (41)

1. Isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle, der koder for et vandopløseligt polypeptid, der omfatter en del af et T4-glycoprotein, kendetegnet ved, at det 5 vandopløselige polypeptid er i stand til specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus.

2. Isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at T4-glycoproteinet er et humant T4-glycoprotein. 10

3. Isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at nukleinsyremolekylet er et DNA-molekyle.

4. DNA-molekyle ifølge krav 3, kendetegnet ved, at DNA-molekylet er et cDNA-15 molekyle. 5. cDNA-molekyle ifølge krav 4, hvor cDNA-molekylet omfatter en del af den i fig. 6 viste nukleotidsekvens.

6. Isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nukleinsyremolekylet er et RNA-molekyle.

7. Nukleinsyremolekyle, kendetegnet ved, at det er mindst 90% homologt med det isolerede, enkeltstrengede nukleinsyremolekyle ifølge krav 1. 25

8. Isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle, kendetegnet ved, at det er komplementært til det isolerede, enkeltstrengede nukleinsyremolekyle ifølge krav 1.

9. Isoleret, enkeltstrenget nukleinsyremolekyle ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det er mærket med en detekterbar markør.

10. Fremgangsmåde til påvisning af et enkeltstrenget nukleinsyremolekyle, der koder for det vandopløselige polypeptid, der omfatter en del af et T4-glycoprotein, 35 som er i stand til specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra I DK 175520 B1 I I 62 I I humant immundefektvirus, kendetegnet ved, at fremgangsmåden omfatter, at I I enkeltstrengede nukleinsyremolekyler bringes i kontakt med det isolerede, I I enkeltstrengede nukleinsyremolekyle ifølge krav 9 under betingelser, der tillader I I hybridisering af komplementære enkeltstrengede nukleinsyremolekyler, og at I I 5 således dannede hybridiserede nukleinsyremolekyler separeres fra enkeltstrengede I I nukleinsyremolekyler for derved at detektere et enkeltstrenget I I nukleinsyremolekyle, der koder for et vandopløseligt polypeptid, der omfatter en I I del af et T4-glycoprotein. I I 1 I I 10 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det enkeltstrengede I I nukleinsyremolekyle, der koder for det vandopløselige polypeptid, der omfatter en I I del af et T4-glycoprotein, er et enkeltstrenget DNA-molekyle afledt af kromosomalt I I ONA. I I 15 12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det kromosomale DNA er I I afledt af en celle valgt fra gruppen bestående af lymfoide celler, myeloide celler og I hjerneceller. I

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den lymfoide celle er en T- I I 20 celle. I

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den lymfoide celle er en I I B-celle. I I 25 15. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at myeloidcellen er en I I granulocyt. I

16. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at myeloidcellen er en I I makrofag. I I 30 I

17. Vandopløseligt polypeptid, der er i stand til specifikt at danne et kompleks med I I et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, kendetegnet ved, at det I I vandopløselige polypeptid omfatter en del af et T4-glycoprotein, og at det kodes for I I af det isolerede, enkeltstrengede nukleinsyremolekyle ifølge krav 1. I I 35 I DK 175520 B1

18. Vandopløseligt polypeptid, kendetegnet ved, at det er mindst 90% homologt med det vandopløselige polypeptid ifølge krav 17.

19. Vandopløseligt polypeptid ifølge krav 17, der er nyttigt som et terapeutisk 5 middel til behandling af erhvervet immundefektsyndrom.

20. Vandopløseligt polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra mindst aminosyre -23 til højst aminosyre +372. io 21. Vandopløseligt polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra mindst aminosyre +287 til højst aminosyre + 374.

22. VandopJøseligt polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter den 15 i fig. 6 viste aminosyresekvens fra mindst aminosyre +182 til højst aminosyre +286.

23. Vandopløsligt polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra mindst aminosyre +112 til højst aminosyre +181. 20

24. Vandopløseligt polypeptid ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra mindst aminosyre +1 til højst aminosyre +111.

25. Anvendelse af det vandopløselige polypeptid ifølge et hvilket som helst af 25 kravene 19-24 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af en human immundefektvirusinfektion. 1 2 3 35 Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter det vandopløselige polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 19-24, og en farmaceutisk 30 acceptabel bærer. 2 Oprenset aminosyresekvens, der kodes for af cDNA-molekylet ifølge krav 4. 3 Vektor, der er omfatter cDNA-molekylet ifølge krav 4. I DK 175520 B1 I I 64 I

29. Vektor ifølge krav 28, kendetegnet ved, at vektoren er et plasmid. I

30. Vektor ifølge krav 28, kendetegnet ved, at vektoren er et virus. I I 5 31. Vært-vektorsystem til produktion af et vandopløseligt polypeptid, der omfatter I I en del af et T4-glycoprotein, hvilket system omfatter plasmidet ifølge krav 29 i en I I passende vært. I

32. Vært-vektorsystem ifølge krav 31, kendetegnet ved, at den passende vært er I I 10 en bakteriecelie. I

33. Vært-vektorsystem ifølge krav 32, kendetegnet ved, at bakteriecellen er en I I Escherichia coli-celle. I I 15 34. Vært-vektorsystem ifølge krav 31, kendetegnet ved, at en passende vært er en I I eukaryot celle. I

35. Vært-vektorsystem ifølge krav 34, kendetegnet ved, at den eukaryote celle er I I en pattedyrcelle. I 2° I

36. Vært-vektorsystem ifølge krav 34, kendetegnet ved, at den eukaryote celle er I I en gærcelle. I I 37. Vært-vektorsystem ifølge krav 34, kendetegnet ved, at den eukaryote celle er I 25 en insektcelle. I

38. Fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt polypeptid, der omfatter en I I del af et T4-glycoprotein, og som er i stand til specifikt at danne et kompleks med I I et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, hvilken fremgangsmåde I I 30 omfatter de trin, at vært-vektorsystemet ifølge et hvilket som helst af kravene 31- I I 37 dyrkes under betingelser, der tillader produktion af det vandopløselige I I polypeptid, og at det således producerede vandopløselige polypeptid isoleres. I DK 175520 B1

39. Vært-vektorsystem til fremstilling af et vandopløseligt polypeptid, der omfatter en del af et T4-glycoprotein, kendetegnet ved, at det omfatter viruset ifølge krav 30 i en passende vært. 5 40. Vært-vektorsystem ifølge krav 39, kendetegnet ved, at den passende vært er en bakteriecelle.

41. Vært-vektorsystem ifølge krav 40, kendetegnet ved, at bakteriecellen er en Escherichia coli-ce\\e. 10

42. Vært-vektorsystem ifølge krav 39, kendetegnet ved, at en passende vært er en eukaryot celle.

43. Vært-vektorsystem ifølge krav 42, kendetegnet ved, at den eukaryote celle er 15 en pattedyrcelle.

44. Vært-vektorsystem ifølge krav 42, kendetegnet ved, at den eukaryote celle er en gærcelle. 20 45. Vært-vektorsystem ifølge krav 42, kendetegnet ved, at den eukaryote celle er en insektcelle.

46. Fremgangsmåde til fremstilling af et vandopløseligt polypeptid, der omfatter en del af et T4-glycoprotein, og som er i stand til specifiktat danne et kompleks med 25 et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, hvilken fremgangsmåde omfatter de trin, at vaert-vektorsystemet ifølge krav 39 dyrkes under betingelser, der tillader produktion af det vandopløselige polypeptid, og at det således producerede vandopløselige polypeptid isoleres.

47. Antistof, der er i stand til specifikt at danne et kompleks med det vandopløselige polypeptid ifølge krav 17. 1 35 Antistof ifølge krav 47, kendetegnet ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof. I DK 175520 B1 I I 66 I

49. Monoklonalt antistof ifølge krav 48, kendetegnet ved, at det monoklonale I I antistof er et humant monoklonalt antistof. I

50. Anvendelse af det monoklonale antistof ifølge krav 48 eller 49 til fremstilling af I 5 en vaccine til behandling af en human immundefektvirusinfektion. I

51. Vaccine, der er nyttig til behandling af en human immundefektvirusinfektion, I I kendetegnet ved, at den omfatter det monoklonale antistof ifølge krav 48 eller 49 I I og en farmaceutisk acceptabel bærer. I I 10 I

52. Monoklonalt antistof, der er i stand til specifikt at danne et kompleks med det I I monoklonale antistof ifølge krav 48 eller 49. I

53. Monoklonalt antistof ifølge krav 52, hvilket monoklonalt antistof yderligere er i I I 15 stand til specifikt at danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra et humant I immundefektvirus. I

54. Monoklonalt antistof ifølge krav 53, kendetegnet ved, at det omfatter et anti-T- I 4-glycoprotein-idotype-antistof. I I 20 I

55. Anvendelse af anti-T4-glycoprotein-idiotype-antistoffet ifølge krav 54 til I fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af en human I I immundefektvirusinfektion. I I 25 56. Farmaceutisk præparat, der omfatter anti-T4-glycoprotein-idiotype-antistoffet I ifølge krav 54 og en farmaceutisk acceptabel bærer. I