JPH01500879A - Ｔ細胞表面タンパク質ｔ４をコードするｄｎａ並びにｔ４フラグメントのａｉｄｓ治療への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞表面タンパク質Ｔ４をコードするＤＮＡびにＴ４フー　メントの＾■ＤＳ ゛、へのｌ吸へ１１ 本明細書では、参照する幾つかの刊行物を括弧に入れたアラビア数字によって示 す、参照文献の完全な表記は、明細書末尾の“請求の範囲”直前に掲げである。 これらの刊行物の開示は参照によってその全体が、本発明の係わる分野の技術水 準をより完全に説明するため本出願に含まれる。 機能上異なるクラスのＴリンパ球は、別個の標的細胞集団の表面上の抗原を認識 する。ヘルパーＴ細胞は主にマクロファージ及びＢｍ胞と相互作用する。細胞障 害性Ｔ細胞は、より広範囲の抗原保有標的細胞と相互作用する。これらの細胞認 識事象は、エフェクター及び標的細胞両方の表面分子の特異的結合によって媒介 されると考えられる。■細胞の表面は、大部分がＴリンパ球に限定される幾つか の多望性及び非多型性タンパク質によって特徴付けられる。これらの分子の殆ど は全Ｔ細胞に共通であるが、表面タンパク質の二つの群のものだけは機能の異な るクラスのＴ細胞において常に異なり、これらのタンパク質がＴ細胞−標的細胞 相互作用に関係している。 上記のうち一方の群の表面分子は、■リンパ球の主要な機能的サブセットを識別 する。即ち、表面糖タンパク質のＴ４及びＴ８である。胸腺発生の初期において 、環タンパク質Ｔ４及びＴ８は共に胸腺リンパ球表面で発現する（１）、末梢免 疫系では、１４分子と１８分子とはＴ細胞の互いに別個のサブセットで発現し、 同一細胞ではまれにしか発現しない（２，３）、７４分子は、クラス■の主要組 織適合遺伝子複合体（１４）ＩＣ）分子を保有する標的と相互作用するＴ細胞で 発現し、一方Ｔ８保有Ｔ細胞はクラス■のＭＨＣタンパク質を発現する標的と相 互作用する（４．５．６．７．８．９）、Ｔリンパ球のＴ４集団はヘルパー細胞 を含み、一方Ｔ８集団は細胞障害性細胞及びサプレッサー細胞の大部分を含む（ ６，１０）、　Ｌかし、Ｔ４’Ｔ細胞はまれにしか細胞障害性細胞あるいはサプ レッサー細胞として機能し得ず（６，１０）、このことからは、Ｔ４あるいはＴ ８の発現がエフェクター機能よりＭＨＣクラス認識の方に緊密に関連することが 示唆される。上記分子のＴ細胞−標的細胞相互作用における重要性は、モノクロ ーナル抗体を用いた研究によって提示され得る。　１４分子（あるいはマウスで の等傷物Ｌ３Ｔ４）の特異的なエピトープに対する抗体は、抗原によって誘発さ れるＴ＋ｌ［ｌ胞増殖、リンフ才力イン放出並びにヘルパー細胞機能を阻害する （７．８．１１．１２．１３）。 同様に、Ｔ８（あるいはマウス等傷物Ｌｙｔ２）に対するモノクローナル抗体は 細胞障害性Ｔ細胞によって媒介される破壊作用を阻害する（１４．１５）、これ らの観察を、Ｔ４及びＴ８が重大な多型性を示さないという事実と合わせると、 Ｔ４及びＴ８がクラス■及びクラス１分子の非多望性領域をそれぞれ認識すると いう仮定が成り立つとされていた。 異なるエフェクター丁細胞において異なると考えられる上記２群のタンパク質の うちの他方のものは、８８０分子の多望性領域に関連する抗原を認識するレセプ ターである（１６．１７．１８）、ヘルパーＴリンパ球の相互作用は主にクラス ■のＭ）ＩＣタンパク質を発現する抗原保有標的細胞に限定され、一方細胞障害 性Ｔ細胞及びサプレッサーＴ細胞はクラス■のＭＨＣ分子を保有する標的細胞に 限定される（４．５．６．７．８．９）、これらの特異的相互作用は、特定ＭＨ Ｃ分子に関連する抗原を認識する（１個以上の）Ｔ細胞レセプターによって媒介 され得る（１７．１８）、即ち、Ｔリンパ球はＭ）ＩＣタンパク質の定常の（抗 原）決定基及び多望の（抗原）決定基両方を認識し得る二つの独立のレセプター を有し得、これらのレセプターは機能の異なるＴ細胞集団が特異的に標的を定め ることを可能にし得る。 ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はＴ４’リンパ球の欠乏を特徴とする。 従って、ＡＩＤＳ患者においてはＴ細胞性免疫が損なわれ、その結果重度の日和 見感染並びに異常な腫瘍（新生物）が出来する。ＡＩＤＳは、現在ヒト免疫不全 ウィルス（Ｈｍと呼称される、互いに密接な関係を有する一連のレトロウィルス （ＬＡＹ、ＩＩＴＬＶ〜■あるいは＾ＲＶ）にＴリンパ球が感染することに起因 する。これらウィルスの感染範囲は、表面にＴ４糖タンパク質を発現する細胞に 限定される。 従って、Ｔ４糖タンパク質は標的細胞表面の分子のレセプターとしてのみでなく 、ＡＩＤＳウィルスのレセプターとしても機能し得る。　Ｔ４に対するモノクロ ーナル抗体は、Ｔ４”細胞の＾ＴＤＳウィルス感染をｉｎ　ｖｉｔｒｏで阻止す る。更に、最近の研究によれば、Ｔ４’Ｔリンパ球をＡＩＤＳウィルスに＆露す ると、ウィルスの１１０ｋｄエンベロープ（外被）糖タンパク質が宿主細胞上の １４分子と関連して結合する。従って、ウィルスのリンパ球指向性は、該ウィル スのレセプターであるＴ４がＴリンパ球の亜集団において限定的に発現するとす ることによって説明できよう。 ＡＩＤＳにおけるＴ４”Ｔリンパ球の欠乏は細胞性免疫応答の低下をもたらす、 そのうえ、ＡＩＤＳはしばしば、たいていは亜急性脳炎の結果である中枢神経系 （ＣＮＳ）の機能不全を伴う。 ＡＩＤＳウィルスのＲＮＡ及びＤＮＡが冒された脳において同定され、かつ神経 障害を有した患者の脳及び脳を髄液の両方からウィルスが単離されている。この ことは、ＡＩＤＳウィルスが脳細胞に感染し、ＡＩＤＳ患者に認められるＣＮＳ 障害に直接関与し得ることを示唆する。即ち、ＡＩＤＳウィルスはリンパ球指向 性であると同時に向神経性であり得る。従って、Ｔ４がＣＮＳにおいても発現す るかどうか、あるいは更に別の脳特異的表面分子がＡＩＤＳウィルスのレセプタ ーとして機能し得るかどうかを決定することが重要である。 Ｔ４及びＴ８の特異的相互作用の解明は、Ｔ４及びＴ８遺伝子の単離、単離した 遺伝子の構造決定、並びに該遺伝子を異なる細胞環境内に導入する可能性によっ て容易となろう、　Ｔ８分子をコードするｃＤＮ＾の単離並びに該ｃＤＮ＾の配 列は最近報告された（１９．２０．２１）、推定されたタンパク質配列は、Ｔ８ が、免疫グロブリンＬ鎖の可変部と相同性の有るＮ末端ドメインを有する腹結合 糖タンパク質であることを示している。 １吸へ１１ 本発明は、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をコードする 単鎖核酸分子を提供する。本発明はまた、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部を 含むアミノ酸配列をも提供する。このアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウィルスエ ンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に構成する可能性を有し得る。ヒト 免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に構成する可能 性に加え、上記アミノ酸配列は水溶液に溶解可能であり得る。 本発明の溶解性アミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウィルス感染者処置用の治療薬１ 、即ち予防薬として用いることができる。そのうえ、本発明の溶解性アミノ酸配 列に対するモノクローナル抗体は、人間をヒト免疫不全ウィルスに対して免疫す るワクチンとして有用であり得る０本発明の溶解性アミノ酸配列に対するモノク ローナル抗体はまた、Ｔ４糖タンパク質抗イディオタイプ抗体の製造にも有用で あり得る。上記Ｔ４糖タンパク質抗イディオタイプ抗体は、ヒト免疫不全ウィル ス感染者処置用の予防薬として有用であり得る。 ・・　の　′−＝　８ 第１図：０ＫＴＤタ　４　び０ＫＴ８−艶＠匝１」υ［艮生抹速−色一〇Ｌ１０ 」１計」）Ｌ乙二ンー 細胞（５Ｘ１０’個）を、マウスモノクローナル抗体０ＫＴ４Ｂあるいは０ＫＴ ８と共に保温（インキュベーション）し、洗浄し、その後ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マ ウス免疫グロブリンと共に保温した。細胞をＦＡＣＳ　Ｒ’　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒ ｔｅｒで分析し、蛍光対数に対する細胞個数のグラフを■＾Ｘ　１１／７８０コ ンピユーターによって描いた。形質転換（トランスフォーメーション）し５てい ないＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＬ細胞は同等の流動細胞計測カーブを示した。　Ｐｒ ｏ　２．２は、表現型Ｔ３−；　Ｔ４”；、Ｔ８’：　Ｔｌｌ＋の白血病Ｔ細胞 系である。ＬＴ　Ｄ　−４は、全ゲノムＤＮＡの転移によって得られるＴ４°− 次ＩＪＩＩ胞形質転換体でおる。３＾＋は、Ｔ４−ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏレトロ ウィルス発現構成体（組換えベクター）で形質転換した旧＋１３Ｔ３ＭＪ胞系で ある。 第２図：Ｔ４゛　びＴ４−Ｌ細　びヒト　に由　るＲＮＡのノｆλ」した新− ３μｇのポリ（＾）”ＲＮＡかあるいは１２．Ｈの全ＲＮ＾（末梢Ｔ細胞及び胸 腺リンパ球）を０．８％アガロース−ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動させ、 ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に染み込ま せ（ブロッティングし）、３２ｐで標識した０、６ｋｂＴ４　ｃＤＮ＾ＤＮＡ− トをプローブとして探査した。　７４°細胞には、ＬＴＤ−４（７４”、Ｔ８− ＬＩＩＨＩＩａ形１［検体）、５Ｋ−７７＋ｉＨ胞ハイフリド−７（Ｔ４°、Ｔ ８−）、０Ｔ−ＣＬＬ白血病細胞（Ｔ４９、Ｔ８−）、Ｆｒ。 ２．２白血病細胞（Ｔ４９、Ｔ８−）、Ｔ４に富む末梢Ｔリンパ球並びにヒト胸 腺リンパ球が含まれる。Ｔ４−細胞には、未形質転換細胞、ｔｋ７（Ｔ８”Ｌ細 胞形質転換体）、ＨｅＬａ細胞、ヒト神経芽腫細胞（ＩＭＲ）並びにＴ８に富む 末梢Ｔリンパ球が含まれる。ヒト胸腺リンパ球レーンは、露出時間を４倍にし、 かつ高コントラストフィルムを用いて撮影した。 第３図二　７４Ｂ　びＴ４　−　の　レアーゼマ・・プ゛並びに　゛　ベ　− ＾、ｐＴ４Ｂ　ｃＤＮ＾及びＴ４遺伝子のＢａ５ａｌ制限フラグメントの整列（ ｉｌｉｇｎｖｅｎｔ）、Ｔ４遺伝子におけるＢａ５ａｌフラグメントの順位は、 サザン法分析及びゲノムクローンマツピングによって決定した。　ｐＴ４Ｂ及び Ｔ４遺伝子の５′末端の整列（対応する位置）を点線で示す、ｐ７４Ｂの影付き 領域はコード配列に対応する１図示寸法はキロベース（ｋｂ）を単位とする。 Ｂ、配列決定法、矢印は、フラグメントを８１３中にサブクローニングし、かつ ジデオキシターミネーション法（３６）での配列決定によって決定した配列の長 さを示す。 Ｃ９真核発現ベクター、これらの構成体は２個のＭｏ１ｏｎｅｙマウス白血病ウ イルスの長い末端繰返し配列（ＬＴＲ）を含み、これらのＬＴＲの向きは矢印で 示しである。　ｐＴ４Ｂ　ｅＤＮ＾は、矢印で示した向きで各ベクターのＥｃｏ Ｒ１部位にサブクローニングした。　（ａ）Ｔ４−ｐＶｃｏｓ７楕成体、　構成 ）Ｔ４−ｐＨＶ６ｔｋ／ｎｅｏｎ４成体は、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ ーと融合したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。 第４図：　多　Ｌ　びＴ４”Ｌ　：Ｔ　Ｂ　び　−ンバ　ヒ　）′ｔ−ＤＮ＾の 　ン。 １０ＩＪｇの細胞ＤＮ＾をＢａ糟Ｈ１で消化し、０．８％アガロースゲル中で電 気泳動させ、にｅｎｅｓｃｒｅｅｎに染み込ませ、ニックトランスレーションで 製造したｐＴ４Ｂ　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トで探査した０図示した寸法目盛はキロベ ースを単位とする０寸法２０ｋｂ、６．６ｋｂ、４ｋｂ、１．８ｋｂ及びｌｋｂ のハイブリッド形成バンドが総てのヒトＤＮＡに認められる。ＤＮＡを得たａｔ 胞のうちＴ４−非リンパ球様細胞には、形質転換していないし細胞、ヒト繊維芽 細胞（にＭ）、ヒト神経芽腫細胞（ＮＢ）並びにＨｅＬａ細胞が含まれル、　Ｃ Ｂ、ＣＰ５８及びＣＰ９４！ｉ、ＥＢＶ形質転換しトＢ１１１ｌ胞系である。　 ＬＴＤ−４はＴ４”−次り細胞形質転換体である。　ＲＰＭＩ及び）ｌｓＢ２は Ｔ４−ヒト白血病子細胞系であり、Ｅ″細胞び胸腺リンパ球（Ｔｈｙ＋＊　、　 ）はＴ４ゴ細胞を含む、　０Ｔ−ＣＬＬ、　Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋ、）、Ｐｒ ｏ　２．２、ＣＥＭ及びＭｏ１ｔ　４はＴ４”Ｔ細胞である。ｇλＭ４は、■４ 遺伝子の３′末端に及ぶ（ｓｐａｎｎｉｎｇ）配列を含むゲノムクローンか　“ たＴ４　タンパ　の　２ ２個の独立のＮＩＩ（３Ｔ３形質転換細胞、末梢Ｔリンパ球並びに形質転換して いない３Ｔ３細胞から得てＬ−［ｓｓｓ］メチオニンで標識したタンパク質をレ ンズマメレクチンクロマトグラフィーに掛け、糖タンパク質を富化した。各試料 が２．５×１０’ｃｐｍであることを予め確保した後、０ＫＴ４モノクローナル 抗体及びプロティン＾−５ｅｐｈａｒｏｓｅで免疫沈降させた。ビーズを洗浄し 、試料緩衝液に溶解させ、還元（レーンａ　＝　ｄ　）及び非還元（レーンｅ及 びｆ）条件下に１０％５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させた。レ ーンａは形質転換していないＮ１１１３７３ＡＩ胞である。レーンｂは、Ｔ４− ｐＶｃｏｓ７ｉ成体で形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞Ｔ４Ｃ２である。レーンＣ 及びｅは、Ｔ４−ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏ梢成体で形質転換した旧Ｈ３Ｔ３細胞３ ＾÷である。レーンｄ及びｆはヒト末梢Ｔリンパ球である。相対分子量（Ｍ、） は、キロドルトン単位で示す。 第６図：　Ｔ４　ｅＤＮ＾のヌクレオ　ド　びにＴ４タンパ　の１２【１ 第３Ｂ図に概略的に示した配列決定法によって得られたｃＤＮ＾ＤＮＡン９Ｔ４ Ｂのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列。 アミノ酸配列上に記した数字はアミノｖｉ残基位置を示す。 図中右手に記した数字はヌクレオチド位置を示す、＋！ＩＩ胞外シ胞子システィ ン、（・）あるいは（０）で示しである。リーダー配列部（Ｌ）、可変様部（ｖ ）、接合（ｊｏｉｎｉｎｇ）機部（Ｊ）、膜透過部（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎ ｅ、　ＴＭ、膜結合部）及び細胞質部（ＣＹＴ）を配列下の水平矢印によって示 すが、正確な境界は不明である。２個の可能なＮ結合グリコシレージョン部位（ ＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）も示しである（ＣＩＯ）　。 第７図：５Ｐ６）’　れ　ＲＮＡの１ｎｖｉｔｒｏ＠完全長のＴ４　ｅＤＮ＾Ｄ ＮＡ−トをＲＮ＾発現ベクターｐＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅａ）中 にサブクローニングした。線状化したフラスミトＤＮ＾ヲＳＰ６ホリメラーセテ 転写シ（４０）、ｌ−［３５Ｓ］メチオニンを含む小麦胚系（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ＞においてＲＮＡを翻訳した 。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物を１０％５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電 気泳動させたくレーンＴ４）、対照としてウシ下垂体ＲＮ＾（ＢＰ）を用いた。 相対分子量（卜）は、キロドルトン単位で示す。 第８図２　゛　Ｔ４　ンパ　の　゛ Ｔ４は、四つのタンデム型（縦に連なった）ＶＪ様ドメイン（ＬＪ、〜Ｖ、Ｊ４ ）と、疎水性の膜横断セグメント（線動部分）と、荷電細胞質部（ＣＹＴ）とか ら成る。細胞外部分に位置する２個の可能なＮ結合グリコシレージョン部位を（ ・　）によって示す、　７４遺伝子中のイントロン２〜８の位置も、（ム）によ つン　ファミリー　の　つかのメンバーとの整住旦Ｖエエα ＾、Ｔ４の可変部アミノ酸配列と、マウスにＬ鎖免疫グロブリンＪ６０６（６６ ）、Ｔａ（２０）、ヒトＴｒｉｌｌ胞抗原レセプターβ鎖ＹＴ３５（９７）及び ヒトＴ細胞抗原レセプターα鎖ＨＰＢ−ＭＬＴα（９８）との整列（位置合わせ ）、Ｌ鎖可変部中の不変残基を整列に含める（Ｉｎｖ、）、整列はＴ４との同一 性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ＞及び構造的相同性を最大にするべ〈実施し、同一部及び 相同部は残基を枠で囲って表しである。記号＾、Ｂ、Ｃ，Ｃ’、Ｄ、Ｅ、　Ｆ及 びＧを付与した配列下方の線は、β鎖を構成する残基を示す（６７）。 β鎖ＧはＪ配列へと続く。 Ｂ、Ｔ４の接合部アミノ酸配列と、Ｔ細胞抗原レセプターβ鎖のコンセンサスＪ 配列、免疫グロブリンλ及びにＬＨのコンセンサスＪ配列並びにヒトＴ細胞レセ プターα鎖のＪ配列（９９）との整列。 Ｃ，Ｔ４の膜透過部とＭＨＣクラス■β鎖（１００）との整列、推定される膜透 過部（ＴＮ）を配列下方において示す。 ９個のエキソンの位置を、ゲノムクローンマツピング、サザン法分析及びヌクレ オチド配列決定によって決定した。 リーダー配列部（Ｌ）、可変様部（■）、接合様部（Ｊ）、膜透過部（ＴＭ）及 び細胞質部（ＣＹＴ）を四角く囲って示す、開始コンセンサス配列によって囲繞 されたメチオニンコドンは、リーダーエキソン（Ｌ）の始まりに位置する（＾Ｔ Ｇ）、終結コドンＴＧＡは、第二の細胞質エキソン（ＣＹＴ）の最後に位置する ０図示寸法はキロベース（塩基）ｋｂを単位とする。 ３１組換え体レトロウィルス発現ベクター、　ｐＭＶ７は、矢印で示した向きに おいて直接繰返す２個のＨｏ１ｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長い末端繰返し配 列（ＬＴＲ）を含む、　ｐＭＶ７はまた、Ｈ８ｖチミジンキナーゼプロモーター （ｔｋ）と融合した細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ ）を含む。 Ｔ４（７４Ｂ）をコードする（７０）かあるいはＴａ（Ｔ８Ｆ１）をコードする （２０）完全長のｃＤＮ＾インサートを矢印で示した向きにおいてＥｃｏＲＩ部 位にサブクローニングして、Ｔ４−ｐＭＶ７及びＴａ−ｐＭＶ７をそれぞれ作製 した。コード配列を影付き領域によって示す０図示寸法はキロベース（ｋｂ）を 単位とする。 Ｂ、レトロウィルスに媒介される遺伝子の転移方法。 第１２図：　・　Ｔ４・・　乏　Ｔ４”　の単連続的に１０倍に稀釈したＡＩＤ Ｓウィルスを接種した細胞を３７℃に１８時間保温し、洗浄し、マイクロカルチ ャープレートで培養した。感染培養物頻度を、感染１２日後の酵素結合免疫吸着 検定（ＥＬＩＳ＾）によって決定した（４６）　、結果を、ウィルス稀釈度の対 数に対する陽性培養物（％）のグラフとして描いた。感染ウィルス力価（ＩＤ− ５０）は、培養物の５０％がウィルスに対して陽性となる時の稀釈度の逆数と定 義する（４７）、天然単離Ｔ４”細胞には、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で 刺激した正常末梢リンパ球（＋＞並びにＴａｌ胞系ＣＥＭ（α−０）が含まれる 。Ｔ４゛にトランスフェクションした細胞系には、ＨＳＢ２−Ｔ４”Ｔ細胞（Ａ −（）及びＲａｊｉ−Ｔ４’Ｂ細胞（ＩＩ＋−Ｉｌ）が含まれる。この実験では 、Ｔ８’にトランスフェクションした細胞系ＨＳＢＺ−Ｔ８°及びＲａｊｉ−Ｔ ａ”（ロ　ロ）を対照として用いた。 第１３図：　Ｔ４”）ｌｅＬａ多　でのシンシ　ラム多　−＾、単層ＨｅＬａ− Ｔ４”形質転換細胞２Ｘ１０’個をＡＩＤＳウィルス産生性Ｈ９細胞２ｘ　１０ ’個と混合し、３７℃に保温した。１８時間後に培養物を調べた結果、単層シー ト中の９０％を上回る核がシンリチウム中に含まれたことが判明した。 Ｂ、播種時点で混合培養物に、抗Ｔ４＾モノクローナル抗体（１：　２０）を添 加した。１８時間後に培養物を調べた結果、細胞融合が全く存在しないことが判 明した。 培養物は、倍率１６０倍で撮影しである。 Δ列：細胞（５Ｘ１０５個）を、フルオレセイン結合抗Ｔ４＾（−）あるいは抗 Ｔ８（−−−）モノクローナル抗体と共に保温し、洗浄して、細胞蛍光定量法（ ｅｙｔｏｆ　ｌ　ｕｏｒｏ＋ｍｅｔｒｙ）で分析した。 ８列：細胞（５ｘｌＯ’個）を、緩衝液（−−−）あるいはＡＩＤＳウィルス（ −）と共に保温し、洗浄し、かつフルオレセイン結合抗ＡＩＤＳウィルス抗体と 共に保温して、細胞蛍光定量法で分析した。 ０列：細胞（５Ｘ１０’個）を、緩衝液と共に＜−−−＞か、先に抗Ｔ４＾モノ クローナル抗体と、次いで＾ＩＤＳウィルスと共に（−）か、あるいは先に抗Ｔ ８モノクローナル抗体と、次いでＡＩＤＳウィルスと共に（−・−・−）保温し た。洗浄後、フルオレセイン結合抗ＡＩＤＳウィルス抗体を加え、細胞を細胞蛍 光定量法で分析した。 各細胞系の蛍光ヒストグラム（蛍光強度に対する細胞個数）を水平方向に示す。 第１５図：ヒト　びマウスの脳細　リンパ球　びＡ髄細か　′！Ｉｔ−ＲＮ＾の ノ　ン゛ ＾、　ヒトＲＮ＾試料のノザン法分析、　Ｒａｊｉ（Ｔ４Ｊ細胞系）、Ｕ９３７ （Ｔ４゛単球細胞系）及びＪｕｒｋａｔ（Ｔ４”Ｔ細胞系）から得たポリ（＾） ′″ＲＮ＾１μｇ並びに大脳皮質から得たポリ（＾）”ＲＮ＾ｈｇを１％アガロ ース−ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動させ、１ｙｂｏｎｄ（＾−ｅｒｓｈａ ｍ）に染み込ませ、３２Ｐで標識したＴ４　ｃＤＮ＾インサートｐＴ４Ｂで探査 した（７０）。 Ｂ、マウスＲＮ＾試料のノザン法分析、３Ｔ３細胞（繊維芽細胞系）、前脳及び 後脳から得たポリ（＾）”８８３５１１ｇ並びに胸腺リンパ球から得た全ＲＮ＾ ２０．ｇを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動させ、Ｈｙｂａ ｎｄに移し取り、２２ｐで標識したＬ３Ｔ４　ｃＤＮ＾インサートｐＬ３７４Ｂ で探査した。 の；　ｆ； 本発明は、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をコードする 単鎖核酸分子を提供する０本発明の一具体例において、上記核酸分子は、ヒト免 疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得るアミ ノ酸配列をコードする０本発明の別の具体例において上記核酸分子は、Ｔ４糖タ ンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸配列をコードする核酸分子と少なくと も９０％相同である６本発明の更に別の具体例において核酸分子は、ヒト免疫不 全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得るのに加え 、水溶液に溶解し得るアミノ酸配列をコードする１本出願において“水溶液”に は、界面活性剤を含有しない水性緩衝液、並びに血液、血漿及び血清のような体 液が非限定的に包含される。また、”溶解性Ｔ４”という表現は、水溶液に溶解 し得るＴ４糖タンパク質フラグメントを意味する０本発明の更に別の具体例では 、核酸分子はヒトＴ４糖タンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸配列をコー ドする。 本発明はまた、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をコード する単鎖核酸分子と相補性である核酸分子を提供する。この相補的核酸分子は、 検出可能なマーカーで標識することができる。検出可能な上記マーカーは本発明 の係わる分野の当業者には公知であり、そのようなマーカーには、検出可能な酵 素、放射性に標識された物質、蛍光物質並びに化学発光物質が含まれる。 単鎖核酸分子はＤＮＡ分子であり得る０本発明の一具体例において、上記ＤＮＡ 分子は、第１０図に示した制限酵素マツプによって表されるゲノムＤＮＡ分子の 少なくとも一部を含む６本発明の別の具体例において単鎖核酸分子は、第６図に 示した核酸配列の少なくとも一部を含むｃＤＮＤＮＡ分子り得る０本発明の特定 具体例において、ｃＤＮ＾分子は、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパ ク質との複合体を特異的に形成し得、かつ水溶液に溶解し得るアミノ酸配列をコ ードする。このｃＤＮ＾分子は、第６図に示した核酸配列の少なくとも一部を含 む。 本発明は更に、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をコード するＲＮ八へ子を提供する。 本発明は、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸配列をコードする 単鎖核酸分子を検出する方法も提供する。この方法は、単鎖核酸分子を、Ｔ４糖 タンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸配列をコードする単鎖核酸分子と相 補性である標識した単鎖核酸分子と、相補的単鎖核酸分子同士のハイブリッド形 成を可能にする条件下に接触させることを含む、ハイブリダイズした核酸分子を 単鎖核酸分子から分離して、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸 配列をコードする単鎖核酸分子を検出する。 本発明の一具体例において、検出する単鎖分子は染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ分子 である。染色体ＤＮＡは、リンパ球、骨髄細胞あるいは脳細胞から取得できる。 リンパ球はＴ細胞であってもＢ細胞であってもよい、また、骨髄細胞は顆粒球（ 部位）あるいはマクロファージであり得る。 本発明は、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をも提供する ０本発明の一具体例において、上記アミノ酸配列はヒト免疫不全ウィルスエンベ ロープ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得る０本発明の別の具体例では 、上記アミノ酸配列はＴ４糖タンパク質の一部と少なくとも９０％相同で、かつ ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得 る１本発明の更に別の具体例では、Ｔ４糖タンパク質の一部と少なくとも９０％ 相同であるアミノ酸配列は、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質と の複合体を特異的に形成し得るのに加え、水溶液に溶解し得る。 本発明はまた、７４ｍタンパク質の一部である本発明のアミノ酸配列を少なくと も１個含むペプチドを提供する。このようなペプチドを少なくとも２個含むポリ ペプチドも、本発明は提供する。 本発明の一興体例において、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質と の複合体を特異的に形成し得、かつ水溶液に溶解し得るアミノ酸配列は、ヒト免 疫不全ウィルス感染者処置用の治療薬として、即ち＾■ＤＳ予防薬として有用で ある０本発明の好ましい具体例において、上記アミノ酸配列は第６図に示したア ミノ酸配列を、少なくともアミノ酸−２３から最高でアミノ酸＋３７４まで含む ０本発明のその他の好ましい具体例には、第６図のアミノ酸配列を少なくともア ミノ酸＋２８７から最高でアミノ酸＋３７４まで含むアミノ酸配列、少なくとも アミノ酸＋１８２から最高でアミノ酸＋２８６まで含むアミノ酸配列、少なくと もアミノ酸＋１１２から最高でアミノ酸＋１８１まで含むアミノ酸配列、並びに 少なくともアミノ酸＋１から最高でアミノ酸＋１１１まで含むアミノ酸配列が含 まれる。 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス感染者処置用の治療薬として有用な医薬組成物 も提供する６本発明の医薬組成物は、ヒト免疫不全ウィルスエンベロー１糖タン パク質との複合体を特異的に形成し得、かつ水溶液に溶解し得る本発明のアミノ 酸配列と、医薬に許容可能なキャリア（担体）とを含む、医薬に許容可能なキャ リアは本発明の係わる分野の当業者に公知であり、そのようなキャリアには０． ０１〜０、ＩＭ、好ましくは０．０５ＭのホスフェートＷＬ街液や０．８％生理 食塩水が非限定的に含まれる。 本発明は、ヒト免疫不全ウィルス感染者を処置する方法も提供する。この方法は 、上記感染者が感染したヒト免疫不全ウィルス（本明細書ではＡＩＤＳウィルス とも呼称）がＴ４”細胞に感染することを不可能にするべく、感染者に、ヒト免 疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得、かつ 水溶液に溶解し得る本発明のアミノ酸配列と医薬に許容可能なキャリアとを含有 する医薬組成物を有効量投与することを含む。 本発明は、第６図に示した核酸配列の少なくとも一部を含むｃＤＮ＾分子によっ てコードされた精製ポリペプチドも提供する。 更に本発明は、第６図に示した核酸配列の少なくとも一部であるｃＤＮ＾分子を 含むベクターを提供する８本発明の一具体例において、上記ベクターはプラスミ ドから成る０本発明の別の具体例では、ベクターはウィルスから成る。 本発明は、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸配列の製造のため の宿主ベクター系も提供する。この宿主ベクター系は、適当な宿主中に本発明の プラスミドを含む０本発明の一具体例において、適当な宿主は細菌細胞である。 本発明の別の具体例において、細菌細胞は大腸菌細胞である０本発明の更に別の 具体例では、適当な宿主は真核細胞である０本発明の更に別の具体例において、 真核細胞は哺乳類細胞である０本発明の更に別の具体例では、真核細胞は酵母細 胞である１本発明の更に別の具体例において、適当な宿主は昆虫細胞である。 本発明は、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部であるアミノ酸配列を製造する方 法も提供する。この方法は、丁４糖タンパク質の少なくとも一部の製造と可能に する条件下に本発明の宿主ベクター系を増殖させること、及び得られるＴ４４糖 タンパク質分を回収することを含む９本発明はまた、Ｔ４糖タンパク質の少なく とも一部であるアミノ酸配列の製造のための宿主ベクター系並びに該製造の方法 を提供し、その際ベクターは本発明のｃＤＮ八分へ並びにウィルスを含む。 適当な宿主には、例えば大腸菌のような細菌細胞、例えば哺乳類細胞及び酵母細 胞のような真核細胞、並びに昆虫細胞が非限定的に含丈れる。　７４＠タンパク 質の少なくとも一部であるアミノ酸配列は、ウィルス並びに本発明のｃＤＮ八分 へを含む宿主ベクター系を、Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部の製造を可能に する適当な条件下に増殖させることによって製造できる。得られるＴ４４糖タン パク質分は、当業者に公知の方法で宿主ベクター系から回収し得る。 本発明は、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的 に形成し得、かつ水溶液に溶解し得るアミノ酸配列との複合体を形成し得る物質 も提供する。 本発明の一具体例において、上記物質は抗体である１本発明の別の具体例におい て、上記抗体はモノクローナル抗体である６本発明の更に別の具体例において、 モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体である。 本発明は更に、人間をヒト免疫不全ウィルスに対して免疫感作するのに有用なワ クチンを提供する。このワクチンは、本発明のモノクローナル抗体と医薬に許容 可能なキャリアとを含む、有効免疫量の本発明ワクチンを人間に投与することに よって、ヒト免疫不全ウィルスを中和し得る抗体の製造が惹起され得、それによ って人間はヒト免疫不全ウィルスに対して免疫となり得る。 本発明は、本発明のモノクローナル抗体との複合体を特異的に形成し得る物質も 提供する０本発明の一具体例において、上記物質はヒト免疫不全ウィルスエンベ ロープ糖タンパク質との特異的複合体を付加的に形成し得る０本発明の好ましい 具体例では、上記物質は、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質のレ セプター結合ドメインを認識し得るＴ４結合ドメインの“内部像”を有するＴ４ 糖タンパク質抗イディオタイプ抗体を含む。 本発明は、本発明のＴ４糖タンパク質抗イディオタイプ抗体と医薬に許容可能な キャリアとを含む医薬組成物を提供する０本発明はまた、ヒト免疫不全ウィルス 感染者を、該感染者の感染したヒト免疫不全ウィルスが７４”ＭＥ胞に感染する ことを不可能にするべく、Ｔ４糖タンパク質抗イディオタイプ抗体と医薬に許容 可能なキャリアとを含有する本発明の医薬組成物を有効量投与することによって 処置する方法も提供する。 本発明の提供する様々なＡＩＤＳ予防及び免疫怒作法は、本明細書に開示した新 規なペプチド、抗体及びＤＮＡ分子の、特定分子との複合体を形成し、あるいは 前記特定分子とのハイブリッドを形成してＡＩＤＳウィルスの中和に有効な免疫 応答を惹起する能力に基づく０本発明の分子、該分子の製造方法並びにＡＩＤＳ 処理方法は、本発明の理解の一切とするべく以下に説明する実験及び実施例によ ってより明瞭となり、その際該実験及び実施例は、本明細書に付した“請求の範 囲”各項に規定した本発明の範囲を一切限定しないと看做されるべきである。 撫Ｉ」ばＬ友迭− 胆ｌ」Ｊと扱藤− Ｆ　ｉｃｅ　Ｉ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法によって単離した末梢血液 白血球を分画して、ヒツジ赤血球ロゼツト陽性（Ｅ゛）細胞とした。Ｅ゛集団中 の７４”及びＴ８’サブセットを、抗Ｔ８抗体並びにアフィニティー精製したウ サギ抗マウスＩｇＧと結合したヒト赤血球によるＴ８保有細胞の陽性選択によっ て単離した（１０）、単離したサブセットを細胞蛍光定量法で分析したところ、 Ｔ４”Ｊ胞は〉９５％Ｔ４”及びく２％Ｔ８°であり、一方Ｔ８”細胞は〉９５ ％Ｔ８’″及び〈２％Ｔ４’″であった。 Ｐｒｏ　２．２７細胞系（Ｔ３−１Ｔ４”、Ｔ８°、Ｔｌｌ”）は未分化急性白 血病の成人患者から得た。　ＪｕｒｋａｔはＴ３−１Ｔ４”、Ｔ８’、Ｔ１１− であり、ＲＰＭｌ　８４０２はＴ３−５Ｔ４−１Ｔ８″、Ｔ１１９である。０Ｔ −ＣＬＬは、Ｔ３”、Ｔ４”″、Ｔ８−及びＴ１１′″である慢性リンパ球白血 病細胞である（２２）、　Ｔ４’細胞系ＣＥＭ及びＨａｌｔ　４は、＾ｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙ−ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎがら入手した。総 ての白血病Ｔ細胞系は、５％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭｌ　１６４０培地で 連続的に増殖させた。形質転換Ｂ細胞系ＣＢ、ＣＰ５８及びＣＰ９４は先に述べ たようにして取得した（２３）。 アフィニティーによって精製したウサギ抗マウスＩｇＧとヒト赤血球とは、塩化 クロム法（２４）で結合させた。 Ｌ　びＮＩＢ　３Ｔ３　のｃ１３ マウスｔｋ−ａｐｒｔ−Ｌ細胞を、１０％仔ウシ血清（Ｇｉｂｅｏ）及び５０μ ｇ／＋ｌジアミノプリン（ＤＡＰ）を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ 培地（ＤＭＥ）中に維持した。形質転換の１日前に、Ｌ細胞を１０ｃｍ皿１個に つき５Ｘ１０’個の密度で播種した。　１１１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ。 によって改良された（２６）Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂの方法（２ ５）により、１皿当たり１１００ｎのｐＴＫ並びに２０μｇの高分子量Ｔ細胞あ るいはＬ細胞ＤＮＡを用いてリン酸カルシウム沈降物を製造した。翌日、Ｌ細胞 をＤＭＥ中での１０％仔ウシ血清、１５μｇ／ｖｂ　Ｉヒボキサンチン、１１１ ｇ／輸１アミノプテリン及び５ｕｇ／鋤１チミジン（ＨＡＴ培地（２７））によ る選択下に置いた。■へＴ選択の１２〜１４日後、ｔｋ”形質転換細胞を、ロゼ ツト形成アッセイを用いてスクリーニングした。 マウスＮＩＩＩ　３Ｔ３細胞は、１０％新生ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補ったＤ ＭＥ中に維持した。形質転換２日前に、Ｎ１１ｌ　３Ｔ３細胞を１０８１１皿１ 個につき５ｘｌＯ’個の密度で播種した０℃胞にリン酸カルシウム沈降物を、１ ０．、のキャリア［１８＾と、１０．ｇのＴ４−ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏかあるい は１０．、のＴ４−ｐＶｃｏｓ７と、５００ｎｇのｐＳＶ２ｎｅ。 とを用いて付与した。２日後、細胞をＤＭＥ中での１０％仔ウシ血清及び５００ ｐｇ／ｍｌ　Ｃ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）；　Ｇｉｂｃｏ）によ る選択下に置いた０選択培地での増殖の１週間後、生存コロニーにロゼツト形成 アッセイを実施した。 ロゼットン　アッセイ ホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回濯いだ後、プレートを、５％ウシ 胎児血清含有ＰＢＳで１１５００に稀釈した精製モノクローナル抗体０ＫＴ４＾ （１ｍｇ／輸Ｉ）２．５ｍｌと共に室温に４５分間保温した。　ＰＢＳで３回穏 やかに濯いで、プレートから遊離抗体を除去した。精製ウサギ抗マウスＩｇＧ抗 体と結合したヒト赤血球（２％ｖ／ｖストック懸濁液、ＰＢＳ／　５％ウシ胎児 血清で１／１０に稀釈）６−１を添加し、プレートを室温に放置した。 ４５分後、遊離赤血球を穏やかに吸い取り、ロゼツト陽性コロニー検査前にＰＢ Ｓを添加した。 ゛　量゛ 付着細胞をＰＢＳ中で０．００５Ｍ　ＥＤＴ＾によって取り、１％ウシ血清アル ブミン（ＢＳ＾）及び０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ　（細胞洗 浄液（ｃｙｔｏｗａｓｈ））で１回洗浄した。　０．１ｍｌ中の細胞（５Ｘ１０ ’個）を、０にＴ４．０にＴ８あるいは対照抗体の適当な稀釈液の入った試験管 に加えた。細胞−抗体混合物を４℃に４５分間保温し、その後細胞洗浄液で２回 洗浄した。フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合したヤギ抗マ ウスＩｇＧ　＋　Ａ　＋　Ｍ　（Ｃａｐｐｅ　ｌ　）を細胞に添加し、４℃に１ 時間保温した０次に細胞を細胞洗浄液で３回洗浄し、０．０１％アジ化ナトリウ ム含有のＰＢＳ　０．５ｍｌに再び懸濁させた。細胞をＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳ　■Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅｒで分析し、ＶＡＸ１１／７８ ０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏ、）を用いてデ ータを蓄積し、かつ作図した。 団尤叉グｙ情見亙− ４Ｍグアニジニウムチオシアネート中で均質化し、続いて５．７Ｍ　ＣｓＣｌ層 によって超遠心を行なうことによって、細胞から全ＲＮ＾を単離した（２８）、 オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィー（タイプ３、Ｃｏ１１ａｂｏｒａ ｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）によってポリ（＾）゛選択を実施した（２９）、 高分子量ゲノムＤＮ＾を、Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（２６）が述べているよ うにして製造した。 ｃＤＮ＾　び　ノムーイブラ１− 二重ｇｃＤＮ＾を、ヒト末梢子細胞由来のポリ（＾）”ＲＮＡ力）ら合成した（ ２０）、　Ｅｃｏ　ＲＩメチラーゼ及びＴ４　ＤＮ＾ポリメラーゼで処理後、Ｅ ｃｏＲＩリンカ−を用いて二重鎖ｅＤＮ＾をλｇｔｌ。 のＥｅｏＲ１部位にクローニングした（３０）、Ｃｈａｒｏｎ　４ヒトゲノムラ イブラリーは、Ｄｒ、　Ｔｏｍ　Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖ ｅｒ−ｓｉｔｙ）が大量に供与してくれた（３１）。 ブトラクティドｃＤＮ＾プローブのΔ成３２Ｐで標識したｃＤＮ＾を、Ｄａｖｉ ｓ　ｅｔ　ａｌ、が述べているように一次形質転換細胞ＬＴＤ−４由来のポリ（ ＾）’ＲＮ＾から合成した（３２）、　ｅＤＮ＾を過剰量の未形質転換し細胞ポ リ（＾）”ＲＮＡ（Ｒｏｔ−３０００）にアニーリング後、ヒトｃＤＮ＾を豊富 に持つ単鎖配列をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって単離した（ ３２）、フィルターハイブリダイゼーションの前に、サブトラクチイドｃＤＮ＾ プローブを第二ブタノールで濃縮し、かつＴＥで平衡化したに−５０５ｅｐｈａ ｄｅｘカラムで脱塩した。 ｃＤＮ＾　びゲノムライブラリーのスクリーニングヒト末梢Ｔ細胞ライブラリー を大腸菌Ｃ６００／ＩＩＦＬ上で、またヒトゲノムライブラリーを大腸菌ＬＥ３ ９２上で培養（ｐｌａｔｅ）した、二重フィルターのスクリーニングを標準的な 操作（３３）で実施し、５０％ホルムアミド及び５ＸＳＳＣにおいて４２℃でハ イブリダイゼーションを行なった。　ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーのスクリーンでは、 １３７１ニトロセルロ一スフイルター１個当たり６Ｘ　１０’ｃｐｍのサブトラ クチイドプローブを適用した。 ゲノムライブラリーからのフィルターを、ニックトランスレーションで製造した （３４）ｃＤＮ八イフィンサートイブリダイズした。６８℃で複数回洗浄し、最 後の洗浄は０．２ＸＳＳＣにおいて行なった。１〜２日間、増感板を用いつつ一 ７０℃でオートラジオグラフィーを実施した９ 肪人配刀ｍ ｐＴ４Ｂの制限フラグメントを８１３ベクター＋＊ｐ１８及びｍｐ１９にサブク ローニングした（３５）、ジデオキシチェインターミネーション法を用いて、配 列決定反応を生起させた（３６＞、配列決定法は第３Ｂ図に示す。 ンゝ　び）　ン゛−ハイブリダイゼーション高分子量の細胞ＤＮＡを、製造者の 薦めに従いＤＮＡ１μｇ当たり５単位の制限ヌクレアーゼで消化した（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅｉね）、試料（１０ｕｇ）を０．８％アガロース ゲルで電気泳動させた。ＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（Ｎｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ；（３７））に移し取り、Ｃｈｕｒｃｈ及びＧ １１ｂｅｒｔが述べているようにしてハイブリダイズした（３８）。 ＲＮＡを０．８％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上に流しく３９）、にｅｎ ｅＳｃｒｅｅｎに移し取った。製造者の提示する操作に従ってノザン法ハイブリ ダイゼーションを実施した。サチン法でもノザン法でも、ハイブリダイゼーショ ンはニックトランスレーションで製造したプローブとの間で行なった。 ＳＦ３　ＲＮＡの合　び１ｎｖｉｔｒｏ１ｋｂ　Ｔ４　ｃＤＮ＾をｐＳＰ６５（ Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅａ）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、かつ Ｈｉｎ　ｄｌｌで直線化した。直線化したプラスミドＤＮＡ（ｂ＋ｇ）を、既に 述べられている（４０）ように放射性同位体で標識したヌクレオチドの不在下に ＳＰ６ボリメラーゼを用いて転写し、ただしその際ｃｐｐｐｃ並びに標識してい ないＣＴＰを転写用Ｍ街液に添加した０反応混合物の１７１０を、１−［３２Ｓ コメチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びｉ、ＮＳ−アデノシルメチオニンを含有 する小麦胚系（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）において翻訳した。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物に、後述のような還元条件下 での５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行なわせた。 紋見見１　レフ　ンクロマトグλフゴニー又でＪＪＬ丈鷹工細胞を先に述べた（ ４１）ようにして、１０％透析仔ウシ血清並びにｌ＋ｍｃｉのＬ−［３２Ｓ］メ チオニン（＾輸ｅｒｓｈａ納）を含有するメチオニンフリーのＤＭＥ培地中で１ ２時間増殖させた。　１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐ）１７．４）、０．５％Ｎｏｎ１ｄ ｅｔ　Ｐ−４０（Ｓｈｅ！ｌ）含有の１５０ｍｔ４ＮａＣＩ（ＴＢＳ）、並びに ０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｓｉｇｍａ）に細胞を溶解さ せた。細胞溶解物を１００．０００　ｘｇで１時間遠心分離し、上澄み液をＨｅ ｄｏ　ｅｔ、　ａｌ、の操作（４２）に従ってレンズマメレクチンクロマトグラ フィー（Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ）に掛けた。溶出液に、対照マウス腹水とプロテ ィン＾−５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）との混合物を用いた４℃で １時間の予吸収（ｐｒｅａｂｓｏｒｐｔ　１ｏｎ）を１回、プロティン＾−３ｅ ｐｈａｒｏｓｅのみを用いた４℃で１時間の予吸収を２回施した１次に、各上澄 み液２．５Ｘ　１０’ｃｐ−を１０μｍのモノクローナル抗体（約１ｍｇ／ｍｌ ）及びプロティン＾−５ｅｐｈａｒｏｓｅと混合し、ターンテーブル上で一晩４ ℃に保温した。その後ビーズを、０．５％ＮＰ−４０及び０．２％ＳＯＳを含有 する冷たいＴＢＳで４回洗浄し、電気泳動試料緩衝液に再び懸濁させた。 乞［ｉ１火１ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、Ｌａｅｖ＋ａｌｉの操作（４３） に従って実施した。免疫沈降物及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物を試料Ｍ衝液に、 ２−メルカプトエタノールを用いてかあるいは用いずに溶解させ、その７，４１ ０％ポリアクリルアミドゲルに載せた。増悪板（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いつつ、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルム上にオート ラジオグラフィーを実施した。 匝片ｍ強２及ヅＰエユ」−形式Ｌ・月日−マウス？−２細胞（４４）を、１０％ 仔ウシ血清（ＣＳ）　（Ｃｉｂｅｏ）　ヲ補ったＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇ ｌｅ培地（ＤＭＥ）中に維持した。形質転換の２日前に、？−２細胞を１０ｃｍ 皿１個当たり５Ｘ１０５個の密度で播種（ｐｌａｔｅ　ｏｕｔ）した、　Ｗｉｇ ｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、の改良した（２７）Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅ ｂの方法（２５）によってリン酸カルシウム沈降物を製造した。沈降物を、１１ ０１ＩのキャリアＤＮＡと、１０ｕｇノＴ４−ｐＭＶ７かあルイハ１０ＩＪｇノ Ｔ８−ｐＭｖ７トヲ用いて細胞に付与した。２日後、細胞をＤＭＥ／　１０％Ｃ Ｓ及び５００ｕｇ／鋤１　に４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；　Ｇｉｂｃｏ）中で の選択下に置いた。 選択培地での増殖の１週間後、生存コロニーにおいてＴ４゜あるいはＴ８”コロ ニーを同定するロゼツト形成アッセイを実施した。ホスフェート緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）で１回濯いだ後、プレートを、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有のＰ ＢＳで１１５００に稀釈した精製モノクローナル抗体０ＫＴ４＾あるいはＯＫＴ ８（１ｍｇ／ｍｌ；　０ｒｔｈｏ）２．５ｍｌと共に室温に４５分間保温した。 　ＰＢＳで３回穏やかに濯いで、プレートから遊離抗体を除去した。精製ウサギ 抗マウスＩｇＧ抗体と結合したヒト赤血球（２％ｖ／ｖストック懸濁液、ＰＢＳ ／　５％ＦＣＳで１７１０に稀釈）６ｍｌを添加し、プレートを室温に放置した 。４５分後、遊離赤血球を穏やかに吸い取り、検査前にＰＢＳを添加した。Ｔ４ ゛及びＴ８”！−２クローンをコロニー単離によって精製し、流動細胞計測法（ フローサイトメトリー）及びノザン法で分析した。 え　レトロウィルス　告　び感 力価１０５ｃｆｕ／ｍｌの組換え体レトロウィルス株を産生するＴ４＋及びＴ８ °？−２クローンを単離した。Ｔ４”あるいはＴ８”ψ−２クローンの集密的細 胞単層に１０ｍ１の新鮮ＤＭＥ／　１０％Ｃ５を加えることによって、ウィルス ストック（株）を製造した。２４時間後培地を除去し、０．４５．輸フィルター （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で？過した。検査のため、５Ｘ　１０’個の細胞を８回 ｇ／ｍｌポリブレン（＾１ｄｒｉｃｈ）の存在下に２１のウィルス上澄み液（あ るいは稀釈液）と共に保温した。３時間後、８ｍｌの新鮮培地を添加した。感染 の３日後、５００しｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含有するＤＭＥ／　１０％ＣＳ特表千 １−５００８７９　（１１） に細胞を再播種し、２週間増殖させ、Ｇ４１８’コロニーについて評価し、かつ 川崎（ｉｎ　５ｉｔｕ）ロゼツト形成法あるいは流動細胞計測法を用いて表面Ｔ ４あるいはＴ８発現に関しスクリーニングを実施した。 先に述べたようなマウスψ−へＭ細胞の感染に、？−２培養上澄み液を用いた。 Ｔ４”あるいはＴ８”付着形質転換細胞を、川崎ロゼツト形成アッセイ、続いて コロニー単離を実施することによって精製した。付着しないＴ４”あるいはＴ８ ”形質転換細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製した。 非付着性ヒトリンパ球系（ＨＳＢ２、ＲＰＭＩ−Ｔ細胞；　Ｒａｊｉ−Ｂ、ｉｉ ｌ胞）及び付着性上皮細胞（ＨｅＬａ）をＴ４°あるいはＴ８”ψ−ＡＭクロー ン（ｌｈｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２時間予処理；　Ｓｉｇｍａ）との同時培 養（ｃｏ−ｅｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）によって感染させ、精製した。 濃度１．５＋Ｂ／ｍｌのＧ４１８に耐性な細胞系を選択した。ただし、ＨｅＬａ 細胞はｌａｇ／ｍｌを必要とし、繊維芽細胞は０．５＋ａｇ／ｍｌを必要とした ０組換え体アンフオトロフイツクウイルス（Ｖ−八Ｈ）を製造する全細胞培養物 を、Ｐ３封じ込め条件下に維持した。 Ｍｌ江し仁ルメエ ＨＴＬＶ−１［［／ＬＡＶのプロトタイプＬＡＶ株を、　Ｊ、−Ｃ，Ｃｈｅｒｍ ａｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ、　Ｐａｒｉｓ；　（４５））から得 た０本研究で用いたウィルス接種材料は、本発明者の研究室におけるウィルスの 第二〜第五継代から得た。接種材料は、ＨＴＬＶ−１［［／ＬＡＶに感染させ、 かつフィトヘマグルチニン（ｐＨ八）で刺激した末梢リンパ球の培養上澄み液で あり、この上澄み液は連続遠心法（３００ｘｇで７分間、続いて１５００ｘｇで ２０分間）で収穫し、かつ液体窒素中に貯蔵した。結合研究のため、０．ＯＩＭ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴ＾、ｐＨ８，０においてＲｅ ｎｏｇｒａｆｆｉｎ（Ｅ、　Ｒ，５ｑｕｉｂｂ）の１５％クッション上で９０． ＯＯＯＸｇで９０分間超遠心法を実施することにより、上記のように収穫した培 養上澄み液からウィルスを濃縮した。 ）ＩＴＬＶ−ＬＡＹ”　２ ＨＴＬＶ−１［［／ＬＡＶに対する抗体を高レベルで有する血清を、リンパ節障 害を有する男性同性愛者から得た。この血清の蛍光抗体法による特異性（４６） 、ウェスタン法分析（４７）及びラジオイムノ沈降（４８）については既に述べ られている。 ■ｇｃフラクションの一部を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ， ＦＩＴＣ：タンパク質比は１０．７回ｇ／ｍｌ）、セイヨウワサビペルオキシダ ーゼ（ＨＰＯ，タイプ■；　Ｓｉｇｍａ）並びに既に述べられている（４７．４ ９．５０．５１）アガロースと結合させた。非免疫血清からの１．Ｇの結合体を 並行して製造した。 ７、アッセイ マグネシウム依存性粒状逆転写酵素（ＲＴ）活性を、７．５ｍＭＭ、、２４の存 在下に（＾）、（６丁）＋２−＋ｓ（あるいは陰性対照としての（ｄ＾）−（ｄ Ｔ）、１−１ｓ）の鋳型プライマーで測定した（５２）。 細　ＡＩＤＳウィルスの蛍゛　２ 培養細胞（０，１ｍｌ中にＩ×１０５個）をスライドグラス上へ遠心分離しく５ ｈａｎｄｏｎ　Ｃｙｔｏｅｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）、９５％エタノール及び５％酢 酸中で一２０℃で３０分間固定し、かつＰＢＳ（０，ＯＩＭ　ＰＯ，，０，１５ Ｍ　ＮａＣ１，ｐ）１８．０）を１０分毎に３回換えて再水和させた。 スライドグラスをＦＩＴＣ−抗ＨＴＬＶ−ｍ　／ＬＡＶノ１１５ｏｏ稀Ｒ液（１ ９１Ｊｇ／ｍｌ）に、室温で３０分開暴露した。その後、スライドグラスを洗浄 しく１０分毎に３回交換）、ＰＢＳ中の５０％グリセロールと共にカバーグラス を載せた。スライドグラスをエビ照射型Ｌｅｉｔｚ　０ｒｔｈｏｐｌａｎ顕微鏡 で、倍率６３０倍で調べた。上記条件下ニ、ＦＩＴＣ−抗１１ＴＬＶ−１［１／ ＬＡＶ試薬はＨＴＬＶ−Ｉ［１／ＬＡＶニ特異的である。　ＰＨ＾で刺激した未 感染細胞、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（ＥＢ）ウィルス感染Ｂ細胞系、アデノウ ィルス感染細胞系、幾つかのＴ細胞系、並びにＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ 感染細胞系は染色これは、既に詳細に述べられている（４７）サンドイッチイム ノアッセイである０手短に言えば、抗ＨＴＬＶ−１１１／ＬＡＶ　ＩｇＧで被覆 したマイクロタイタープレートウェルに培養上澄み液を添加する。プレート洗浄 後、結合したウィルス抗原をＨＰＯ−抗１１ＴＬＶ−１［１／ＬＡＶで検出する 。少なくともＲＴアッセイと同様の感度を有するこのアッセイは、多数のドナー から得たＰＩＩＡ刺激リンパ球、ＥＢウィルス惑染Ｂ細胞系、幾っがのＴ細胞系 、ポリクローナル及びクローン化ＩＬ−２依存性ＴＭＪ胞系、骨髄細胞系に５６ ２、並び４：　ＨＴＬＶ−１，１？＋　ルイＬｔ　ＩＩＴＬＶ−１１保有細胞系 から得られる培養上澄み液に関しては陰性である。 陽性上澄み液を陰性上澄み液がち区別するカットオフＯＤ＝＊ｏは、毎回のアッ セイにおいて、同時に収穫した対照（未感染細胞培養物）上澄み液に対して少な くとも１０回繰返した測定値の平均＋２ＳＤがら決定した。 ＡＩＤＳウィルス　、（１０−５０アッセイ感染性ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　／ＬＡＶ の滴定のためのマイクロカルチャーアッセイは、既に詳細に述べられている（４ ７）、手短に言うと、ＰＨ＾で刺激したリンパ球あるいは細胞系（細胞２Ｘ　１ ０’個／−１）に、ウィルス接種材料を１０倍ずつ連続的に稀釈した稀釈液を接 種し、３７℃に１８時間保温する。その後細胞を洗浄し、マイクロカルチャープ レート（各稀釈液毎に培養基１０〜２０個：　０．２５ｍ１培地において培養基 １個につき細胞ｌＸｌ０’個）で培養した。３日おきにｔｏｏｕ　ｌの上澄み液 を除去し、新鮮培地に換えた。上澄み液を、先に述べたような抗原捕捉アッセイ によってウィルス抗原に関し評価した。感染性ウイルス力価（ＩＤ−５０）は、 培養物の５０％がウィルスについて陽性となる稀釈の逆数と定義する（４７）。 翔呈偽ｆｌ二±コー 水痘性口内炎ウィルス（ＶＳＶ；　Ｉｎｄｉａｎａ株、野生型）分、既に述べら れている（５３）エンベロープ偽型に必要なレトロウィルスを産生ずる細胞内で 増殖させた。収穫したｖｓｖに高度免疫中和性ヒツジ抗ｖＳｖ血清を添加し、偽 型でないピリオンを不活化した。偽型力価は、１０４〜１０’ＰＦＵ／ｓｌであ った。 評価のため、ｖＳｖ偽型に感染させるべき細胞２Ｘ　１０’個を直径３０ＩＩＩ ＩＩの組織培養ウェルに接種した。　ＨｅＬａ、　ＮＩＨ３Ｔ３及びＬ細胞はそ のままで付着性であった。その他の種類の細胞は総て、５０ＩＩｇ／ａｌポリＬ リシンで基質を予め処理することによって付着した。１時間のウィルス吸着後細 胞を洗浄し、１０６個のミンクＣＣＬ６４あるいはウシＭＤＢＫ細胞を各ウェル に添加した。これらの細胞は、二次ＶＳｖ感染のための優れたプラークを提供す るが、偽型ピリオンによる感染に耐性である。 プラーク指示細胞を定着及び拡散させた後（約９０分後）、単分子層を寒天培地 で覆った。１ｓ染２日後、ｖＳｖプラークを計数した。細胞を（５４）に述べら れているように偽型添加３０分前に予め処理することによって偽型プラークの形 成を抑制すルノニ、抗Ｔ４Ａモ／　りＯ−ナル抗体（Ｌ　：　２０）、抗１（Ｔ ＬＶ−１［［血清（１：　１０）あルイハ抗ＨＴＬＶ−１血清（１：　１０）を 用イタ。 シンシ　ラム・　・・セイ 細胞２ｘ　１０’個を、ＨＴＬＶ−１［［４，：感染し、カッＨＴＬＶ−１［を 製造するＨ９細胞（５５）２ｘ　１０’個と、１０ｍｍ直径ウェルで同時培養し た。培養物を３７℃に保温し、先に述べたように１８時間後シンシチウム形成に ついて調べた（５４．５Ｂ）、５個以上のシンシチウムを有する細胞を陽性であ ると判定した。シンシチウム抑制は、播種時に混合培養物に抗Ｔ４＾モノクロー ナル抗体（１：　２０）を添加することによってアッセイした。 ゛　＾ｒｏｓ　ルス　４ この方法は、既に詳細に述べられている（４６）、手短に言えば、細胞表面Ｔ４ あるいはＴ８発現を、フルオレセインと結合した抗Ｔ４＾あるいは抗Ｔ８モノク ローナル抗体（ＯＫＴ４＾、０ＫＴ８）を用いた直接蛍光抗体法によって検出し た。稀釈／洗浄ｗｉｆｒ液は、０．１％ウシ血清アルブミン、２％Ｖ／シ八Ｂ４ へト血清及び０．０１％Ｎａｐｓを含有する０、０ＩＨＰＯ，，０，１５８Ｎａ Ｃｌ、ｐＨ７，４であった。試薬は総て、最適（飽和）結合について予め力価を 測定した。ＩＩＩ胞（５Ｘ１０’個）を２５μｌのモノクローナル抗体稀釈液中 で４℃に３０分間保温した。遠心法（３００Ｘｇで７分間ンで細胞を洗浄し、生 理食塩水中の１％バラホルムアルデヒド０．５ｍｌに再び懸濁させ、蛍光活性細 胞選別ＩＩ（ＦＡＣＳ　ＥＶ；Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した 。　ＨＴＬＶ−１［［／ＬＡＶ結合のため、細胞５Ｘ１０’個をＨＴＬＶ−ｍ　 ／ＬＡＶ（ｌｈｌ中４：：５００ｎｇ）、！：共ニ３７℃に３０分間保温した。 洗浄した細胞を、フルオレセインと結合シタ抗１１ＴＬＶ−１［［／ＬＡＶ　２ ５ｍ１に４℃で３０分間再懸濁させた。細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒ ドに再び懸濁させて、上記同様ＦＡＣ５によって分析した。　ｆｌＴＬＶ−１［ ［／ＬＡＶ結合の抑制のため、細胞を抗Ｔ４＾あるいは抗Ｔ８（２ｈｌ中に２０ ｎｇ）と共に４’Ｃに３０分間予メ保温し、続イテＨＴＬＶ−ｍ　／ＬＡＶ（１ ０ｕ　Ｉ中４：１：５００ｎｇ）を３７℃で３０分間添加した。細胞を洗浄し、 フルオレセインと結合した抗ＨＴＬＶ−Ｉ［［／ＬＡＹと共に保温し、洗浄し、 パラホルムアルデヒドに再懸濁させ、上記間［ＦＡＣＳによって分析した。 の　・　ヨ　ル　 Ｔ４”Ｎｌｌ１３Ｔ３形質転換細胞の表面を、ラクトペルオキシダーゼ法（１８ ）によって次のように放射性同位体でヨウ素化した。細胞４Ｘ１０’個を、０． ５ｍＭ　ＥＤＴ＾、２ｍＣ１Ｈａ１２’Ｉ及び２０ｕｇラクトペルオキシダーゼ を含有するＰＢＳ　１■１に懸濁させた。 懸濁の０．１．５．１０及び１５分後に１０．　Ｉの０．０３％Ｈ２Ｏ２を添加 した。２３℃で反応を生起させ、この反応を、ＩＯＪ　ＮａＩ含有の冷たいＰＢ Ｓ　５０容量部中で２回遠心分離することにより懸濁後２０分に停止させた。標 識した細胞を分けて４本の試験管に入れ、上記のようにＢＴＬＶ−１［１八＾ｖ （２０μＩ中に２ｕｇ）と共に３７℃に３０分間保温した。その後の洗浄及び取 り扱いは０〜４℃で行なった。洗浄した細胞を、１論１の界面活性剤含有溶解用 緩衝液（ＬＢ；　０．２ｍＭフェニルエチルスルホニルフルオリド、５１ｇ／ｍ ｌアプロチニン、０．２ｍＭ　ＥＧＴ＾、０．２ｍＭ　ＮａＦ、　０．２％ナト リウムデオキシコーレート及び０．５％（ｖ／ｖ）　ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０含 有の０．０２ＨＴｒｉｓ、０．１２Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ８，０）の添加によって 溶解させた。試験管を氷上に１５分間維持し、３０００ｘｇで２０分間の遠心分 離によって核を除去した。 吸収のため、ヒト抗ＨＴＬＶ−■ルＡＶ　１ｇに、ヒト非免疫ｒｇｃ、抗Ｔ４＾ 抗体及び抗Ｔ８抗体の５ｅｐｈａｒｏｓｅ結合体を、既に述べられている（４８ ）ように製造した。溶解物を、２００ｐ　ｌの５ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ−非免疫ヒ ト■ｇＧで回転下に１．５時間予め吸収し、次いでｚｏｕ　ｌの（上記のような ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合体を用いて回転下に３時間免疫沈降させた。　５ｅｐ ｈａｒｏｓｅ吸収体を、ＬＢ、０．５ＭＮａＣＩ含有ＬＢ及び０．１％ナトリウ ムドデシルスルフェート（ＳＯＳ＞含有ＬＢで１回ずつ、都合３回洗浄した。吸 収された物質を、試料緩衝液（２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール（Ｖ ／Ｖ）、２５．、ブロムフェノールブルー及び１０％グリセロール（ｖ／ｖ）含 有の０．０ＩＭ　丁ｒｉｓ、　ｐＨ８，０）２０ｕｌを用いて６５℃で３０分間 溶離した。３％スタッキングゲルを伴った３、３〜２０％勾配のポリアクリルア ミドゲル中で電気泳動を生起させ（５７）、オートラジオダラムをＫｏｄａｋ　 ＸＡＲ−５フイルムを用いて現像した。 ルス　ッセ ０分に、Ｔ４”　ＪＭ　Ｔ細胞２Ｘ　１０’個をＡＩＤＳウィルスに暴露した。 インヒビター塩化アンモニウム（２０ｍＭ）あるいはアマンタジン（２０ｍＭ） を、ウィルス感染の間の様々な時点に添加しな（０分、３０分及び６０分）、６ 時間後細胞を洗浄し、新鮮な培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）に再び接種した。 これらの薬剤のＡＩＤＳウィルス惑染へ０影響を感染５日後に測定した。ウィル ス抗原を発現する培養物中の感染細胞のフラクションを、先に述べたように蛍光 抗体法での顕微鏡観察（５８）によって決定した。 ＲＮＡ゛　びノ゛ンゞバイブ１　イゼーション４Ｍグアニジニウムチオシアネー ト中で均質化し、続いて５．７Ｍ　ＣｓＣｌ層を用いて超遠心法を実施すること によって細胞から全ＲＮ＾を単離した（２８）、ポリ（＾）０選択を、オリゴ（ ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（タイプ３；　Ｃｏ１１ａｂｏ−ｒａｔ ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）によって行なった（２９）。 ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動させ（３９）、Ｈ ｙｂｏｎｄ（＾ｍｅｒｓｈａｍ）に移し取った。製造者の提示する操作に従いノ ザン法ハイブリダイゼーションを実施した。α３２ｐ標識デオキシヌクレオチド トリホスフエートでプローブをニックトランスレーションして、０．５〜１ｘｌ Ｏ’ｃｐｍ／ｕｇの比活性とした（５９）。 ロー０凡９と１艦− Ｔ４　ｃＤＮ＾の単離に用いた方法ではまず、表面にＴ４を発現するし細胞形質 転換体を形成する。■４′″形質転換繊維芽細胞のｍＲＮ＾から合成したｃＤＮ ＾を消去式（ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーションによって富化 し、Ｔ４をコードするｃＤＮ＾を末梢Ｔリンパ球のｍＲＮ＾から成るｃＤＮ＾ラ イブラリーから単離するプローブとして用いた。　Ｔ４”ｃＤＮ＾クローンの存 在をノザン法及びサザン法分析によって決定し、最終的には該クローンのＴ４” 表現型を受容細胞に転移する能力によって決定した。これと同様の技術が、Ｔ８ タンパク質をコードする遺伝子の単離に以前用いられた（２０）。 チミジンキナーゼ（ｔｋ）を欠損したマウスＬ細胞を、ｔｋ含有プラスミドｐＴ ＫとＴ細胞白血病細胞系ＢＡＩＴ−１０２由来ゲノムＤＮＡとで同時形質転換さ せた（２５．２６）、　Ｔｉ１ｌ胞表面タンパク質を発現するｔｋ″Ｌ細胞形質 転換体を、川崎ロゼツト形成アッセイによって同定した。　ｔｋ”コロニーをＴ ４に対するマウスモノクローナル抗体に暴露し、その後ウサギ抗マウス免疫グロ ブリンと結合した赤血球と共に保温した。Ｔ４′″形質転換細胞は、赤血球と特 異的に結合するために目に見える赤色を呈する。こうして、一つの一次Ｔ４’形 質転換細胞ＬＴＤ−４が得られた。このクローンによる１４分子の発現は、細胞 蛍光定量性分析によって独立に確認した（第１図）。 Ｔ４’形質転換細胞ＬＴＤ−４のｍＲＮＡ＆団は形質転換していないＬＳＩ胞の ｍＲＮ＾ＲＮＡ、新たに形質転換した遺伝子の発現以外相違しない、これらの配 列は、Ｔ４’形質転換細胞のポリ（＾）”ＲＮＡから製造した高放射性ｃＤＮ＾ を未形質転換し細胞がら得たきわめて過剰な量のＲＮＡと共ににアニーリングす ることによって富化した（３２．６０）、　Ｒｏｔ値が大きくてもハイブリッド 形成し得ないｃＤＮ＾をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーで単離し、λ クローニングベクターｇｔｌｏ中で構成されたヒト末梢Ｔ細胞ｃＤＮ＾ライブラ リーをスクリーニングするのに用いた。僅かにハイブリッド形成する４個のプラ ークを同定し、プラーク精製し、Ｔ４配列の存在について分析した。 上記クローンのいずれかがＴ４をコードしているかどうか決定するため、まずＴ ４°及びＴ４−末梢Ｔ細胞、白血病細胞、胸腺リンパ球、し細胞形質転換体及び 非リンパ球がら得たＲＮＡを用いてノザン法分析を実施した（第２図）、４個の クローンのうち１個は、Ｔ４”細胞にのみ存在するＲＮＡとハイブリッド形成し た。このクローンは、丁４３形質転換細胞ＬＴＤ−４に存在し、かつ丁４４末梢 リンパ球集団、様々なＴ４°白血病細胞系並びに胸腺リンパ球にも存在する３ｋ ｂ　ＲＮＡを検出する。形質転換していない繊維芽細胞、Ｔ４−末梢リンパ球、 ［１ｅＬａ細胞あるいはヒト神経芽細胞腫からのＲＮＡとのハイブリ・ンド形成 は観察できなかった。 上記クローンによって検出されるＲＮＡの表現型は、該ＲＮ＾がＴ４をコードす る可能性を損なわない、しがし、このｃＤＮ＾は０．６ｋｂの長さしか有しない が３ｋｂの＋ａＲＮ＾とハイブリッド形成する。従って、ヒト末梢Ｔ細胞ｅＤＮ ＾ライブラリーを再びスクリーニングして、成熟メツセンジャーＲＮ＾とほぼ同 じ長さの３ｋｂのインサートを有する１個のクローン（ｐ７４Ｂ）を得た。この クローンの制限マツプを、第３八図及び第３Ｂ図に示す。 ノムパ　−ン 次に、単離したｅＤＮ＾ＤＮＡンが７４”形質転換細胞からのＤＮＡ並びにヒト ＤＮＡとはハイブリッド形成したが形質転換していないマウスＬ細胞ＤＮＡとは ハイブリッド形成しなかったことを示すべくサザン法実験（３７）を行なった（ 第４図）、様々なヒト細胞からのゲノムＤＮ＾は酵素ＢａｍＦＩＩでの開裂後、 ５個のハイブリッド形成フラグメントの組を呈示する。予測どおり、Ｔ４配列は 形質転換細胞ＬＴＤ−４において検出することができるが、形質転換していない しｍ胞のＤＮＡでは検出できない、遺伝子（６，６ｋｂ）の３′末端に最も近い Ｂａ５ａｌフラグメントは、恐らくは組込み事象の結果としてＬＴＤ−４には存 在しない、そのうえ、リンパ球及び非リンパ球からのＤＮＡと比較した場合、こ のような低い分析レベルでは著しい転位は明らかにならない、ハイブリッド形成 フラグメントの分子量の合計は３３ｋｂであり、このことはＴ４遺伝子が相当大 きいことを示唆している。上記領域を構成するゲノムクローンの完全な組が得ら れ（ｆ＆段参照）、これらのクローンの制限分析によってＢａｍＨＩフラグメン トの順序をめ（第３八図）、遺伝子が大きいこと、及び相当の長さのイントロン を有するはずであることを確認した。 ン　−したマウス　−細　でのＴ４　ｅＤＮ＾の単離したｃＤＮ＾がＴ４をコー ドすることは、このクローンが繊維芽細胞を形質転換後Ｔ４’４’型に変換し得 れば、それによっても証明されよう、染色体ＤＮＡのＴ４遺伝子は大きく、かつ 幾つかのゲノムクローンにわたる、従って、ｃＤＮ＾ＤＮＡンを、単−Ｅｃａｌ クローニング部位を挟んで位置するＭｏ１ｏｎｅｙマウス白血病ウィルス長末端 繰返し配列（ＬＴＲ）を有する二つのレトロウィルス発現ベクターｐＶｃｏｓ７ 及びｐＭＶ６ｋｔ／ｎｅｏに導入した（第３Ｃ図）、　５’−ＬＴＲはクローニ ング部位を通しての転写をプロモートし、また３’−ＬＴＲは開裂及びポリアデ ニル化に必要な配列を含む、ベクターｐＨＶ６ｔｋ／ｎｅｏは、ネオマイシンホ スホトランスフェラーゼ遺伝子のコード領域と融合したｔｋプロモーターも含む 、ｐＶｃｏｓ７を用いた構成体は連鎖していない選択可能マーカーでの形質転換 を必要とし、一方ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏは連鎖型同時形質転換を可能にするネオ マイシン耐性マーカーを保持する。形質転換後に得られた旧■３Ｔ３細胞のｎｅ ｏ”コロニーを、ネオマイシン類似物Ｃ４１８を含有する培地で増殖する可能性 によって選択し、かつロゼツト形成法を用いてスクリーニングして、細胞表面で のＴ４の発現を検出した。このアッセイでは、ｐＶｃｏｓ７を用いて得られたＧ ４１８コロニーの約５０％並びにｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏを用いて得られたコロニ ーの７５％がＴ４について陽性であった。 ロゼツト陽性コロニーを細胞蛍光定量法によって更に分析し、形質転換細胞表面 にＴ４が発現していることを確認した（第１図）。 Ｔ４°形質転換繊維芽細胞及びＴリンパ球が同じ分子量のＴ４タンパク質を発現 させることを示す代謝タンパク質標識実験を行なった。形質転換していないＮＩ Ｂ　３Ｔ３細胞、Ｔ４’形質転換細胞及びＴリンパ球を１．［３９Ｓ］メチオニ ンの存在下に１２時間標識した（４１）、細胞を界面活性剤に溶解させ、溶液を レンズマメレクチンカラムに通して糖タンパク質を増量した（４２）　、結合し た糖タンパク質フラクションを溶離し、Ｔ４に対するモノクローナル抗体を用い て免疫沈降させたく第５図）、還元条件下に、■リンパ球並びに２個の独立の７ ４”形質転換細胞からの抽出物において、相対分子量５５ｋｄで移動する糖タン パク質を検出する。このタンパク質は、対照３Ｔ３繊維芽細胞では検出できない 、非還元条件下では、Ｔ細胞及び形質転換繊維芽細胞において抗Ｔ４を用いて５ １ｋｄ糖タンパク質を免疫沈降させた。 これらの実験は、形質転換細胞は抗Ｔ４によって免疫沈降する５５ｋｄ糖タンパ ク質を発現させ、この糖タンパク質はＴリンパ球表面に発現する糖タンパク質と 同じ大きさを有することを示す、即ち、単離ｅＤＮ＾を用いたノザン法及びサザ ン法分析の結果、並びに上記ｃＤＮ＾のマウス繊維芽細胞に７４’″表現型を付 与する能力から、Ｔ細胞表面タンパク質Ｔ４のコード配列全体がクローニングさ れたことが判明する。 （以下余白） Ｔ４　ｃＤＮ＾のヌ　レオ　ド　び　ソバクジデオキシターミネーション法（３ ５，３６）を使用して３ｋｂｅＤＮ＾インサートの二本の鎖を配列決定すること によって、Ｔ４コード領域の完全ヌクレオチド配列を決定した。完全ヌクレオチ ド配列及び推定タンパク質配列を第６図に示す。 最も長い読取枠は、開始コンセンサス配列ＰｕｒＮＮＡＴＧＰｕｒで包囲された 位置７６のメチオニンコドンに始まる（６１）、この読取枠はヌクレオチド１３ ７４個を含む長さであり、４５８個のアミノ酸を含むポリペプチドをコードして いる。このｃＤＮ＾をＲＮ＾発現ベクターｐｓＰ６（４０）に挿入することによ ってこの読取枠の連続性（ｃｏｎｔｉｇｕｉｔｙ）を確認した。このベクターが ら合成されたＲＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳されると５１ｋｄの非変性タンパ ク質を合成する（第７図）、正確な分子量はヌクレオチド配列から予想された。 Ｔ４は、リーダー配列と、タンデム形の４つの可変−接合（Ｖ−Ｊ）様領域と膜 横断部（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎｅ）とから成り、 各領域は、免疫グロブリン遺伝子族（ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ）に属する種々の メンバーの対応領域と相同性をもつ（６２，６３＞（第６図及び第８図）、開始 コドンの直後には、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｌｉｔ−ｔｌｅ疎水性基分布（ｈｙｄｒｏｐ ａｔｈｉｅｉｔｙ）プロット（６４）によって予想されたリーダーペプチドに対 応する疎水性残基の連鎖が続く、天然Ｔ４タンパク質がプロセシングされる正確 な位置を決定することはできないが、既知の開裂パターンに基づいて、位置（− １）のスレオニンの直後で開裂が生じると推定される（６５）、従って、シグナ ルペプチドは２３個のアミノ酸を含み、プロセシングされたＴ４タンパク質は４ ３５個の残基から成る。 成熟タンパク質の残基１〜９４は、免疫グロブリンＬＭ可変部とアミノ酸的にも 構造的にも相同である（第９図）、このドメインと免疫グロブリン可変部とは全 体として３２％の相同性をもつ、ＬＭ免疫グロブリンのＶ領域とＴ４のＮ−末端 Ｖ様領域（ｖｌ）との配列を比較すると、１４個の不変残基のうちの８個が保存 されていることが判明した（６６）、このドメインは６７個のアミノ酸によって 隔てられた２つのシスティン残基を含み、これらの位置及び間隔はＬＭ免疫グロ ブリン及び関連分子で観察される位置及び間隔に類似している（６７）、これら のシスティンが、保存されたＶドメインに特有の鎖内ジスルフィド結合を形成し 得るのであろう、この推論は、Ｔ４が還元性条件下よりも非還元性条件下でより 速く泳動する（これは少なくとも１つの鎖内結合の形成と一致する。第５図、レ ーンｅ及びｆ）というわれわれの観察によって支持される。 個々のアミノ酸レベルでの相同以外にも、Ｔ４のｖ１ドメインは免疫グロブリン 可変部と構造的特徴を共有している。 免疫グロブリンの可変部及び不変部は、一連の逆平行β鎖が特徴的パターンに折 り畳まれて２つのβシートを形成する（６７．６８）、これらのβシートはジス ルフィドブリッジと特徴的疎水性相互作用との双方によって相互保持されている 。　Ｔ４のＶ様ドメインの予想二次構造がＬＭ免疫グロブリンのＶドメインの構 造とどの程度似ているかを決定するために、平面上で構造の位置合わせを行なっ た。また、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（６９）の実験に由来のアルゴリズムを使 用し、これらの配列中のβ鎖及びβターンの予想プロットを作成した。これらの 分析は、免疫グロブリンの■ドメインで検出されたβ鎖と密接に対応する７つの β鎖がＴ４のＶ様領域に存在することを示唆する（第９八図）、Ｔ４の２つの保 存システィンはβ鎖Ｂ及びＦの内部で検出され、免疫グロブリンの保存ジスルフ ィド結合を形成する既知のＶ領域のシスティンの位置と正確に対応している。ト リプトファン残基が第１システインの下流の１２個目のアミノ酸として存在し、 チロシン残基が第２システインより２つ前のアミノ酸として存在する。これらの 残基は夫々、ＬＩＶ領域のβＭＣ及びＦに極めて特徴的である。更に、アスパラ ギン残基が第２システインの６つ前のアミノ酸として存在し、アルギニン残基が βＭＤのベースとして存在する。これらの荷電残基はＶ領域に極めて特徴的であ る（６７）、最後に、交互的疎水性残基のパッチがβ鎖全体に存在し、これは２ つのβシートの相互作用を強化する。 Ｔ４のｖ１ドメインに続いて、免疫グロブリン及び丁細胞抗原レセプターの接合 （Ｊ）領域と有意な相同性をもつアミノ酸残基の連鎖が存在する。第９Ｂ図にお いてはＴ４のこのＪ様領域が免疫グロブリンＬ鎖とＴ細胞抗原レセプターの２つ の鎖とのコンセンサス接合配列に位置合わせされている。 このＪ様領域に続いて２６５個のアミノ酸連鎖が存在し、これは更に、３つのＶ Ｊ様ドメインに構造的に分割され得、これらのドメインは、始原型免疫グロブリ ンＶＪ領域に対して統計的に有意な配列と構造上の相同性をもつ（第６図及び第 ８図）、更に、この配列は、Ｎ結合グリコシレージョンが可能な部位を２つ含む （＾５ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ；第６図）。 細胞外ドメインに続いては疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈ　ｉｃ　１ｔｙ）プロッ ト（６４）で予想された、疎水性及び中性のアミノ酸残基だけを含む推定膜透過 （ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ、膜結合）配列が存在する。このセグメントは、 クラスＨの主要組織適合性（ＭＢＣ）タンパク質のβ鎖の膜透過エキソンに顕著 な相同性をもつ（第９Ｃ図）、Ｔ４とＭＨＣクラス■のβ鎖との膜透過領域を位 置合わせするとギャップがなく４８％の相同性をもつことが判明する。膜横断セ グメントに後続する高電荷の４０個のアミノ酸の配列は細胞質ドメインを含む（ 第６図及び第８図）。 ′ｒＪＬＬＬ：゛　の１　びイントロンーエ　ソンのＴ４　ｃＤＮ＾を使用して マウス−ヒト体細胞ハイブリッドのパネルの分離パターンを分析し、ヒト中期染 色体にｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイズすることによって（１０１）、染色体上の １４遺伝子の位置を決定した。ゲノムプロット実験とｉｎ　５ｉｔｕハイブリダ イゼーシヨンとによって、Ｔ４遺伝子がヒト染色体１２の短腕の上の領域１２ｐ １２と１２ｐｔｅｒとの間に存在することが判明した。 λクローニングベクターＣｈａｒｏｎ４及びＥＭＬＢ−３（３１）中で放射性標 識ｐＴ４Ｂ　ｃＤＮ＾ＤＭＡ−ト（７０）を用いて構築されたヒトゲノムライブ ラリーをスクリーニングすることによって、■４遺伝子を含むようにオーバーラ ツプする一連のゲノムクローンが得られた。制限分析及びサザンプロット分析の 双方によってこれらのクローンの特性決定を行なうと、これらのクローンが完全 Ｔ４コード配列を保有することが判明した０次に、ジデオキシターミネーション 法（３５，３６）を使用しゲノムクローンの特異的フラグメントの配列決定を行 なってＴ４遺伝子の完全なイントロンーエキソン編成を決定した。 Ｔ４遺伝子は第８図及び第１０図に示すごとく８個のイントロンによって分割さ れた９個のエキソンを含む、第１エキソンは５′−非翻訳領域とリーダーセグメ ントとを含む、第１可変様部ｖ１はヌクレオチド２８９に存在する大きいイント ロンによって分割されている（第６図）、従って、ＶＩＪＩドメインは第２及び 第３のエキソンによってコードされ、Ｖ２Ｊ２、Ｖ３Ｊ３、Ｖ４Ｊ４及び膜透過 （ＴＭ）ドメインの各々は別々のエキソン（エキソン４〜７）によってコードさ れる。ｍ脂質ドメイン（ＣＹＴ）はイントロンによって分割され、細胞質ドメイ ンの最終部分及び３°−非翻訳領域は９番目のエキソンによってコードされる。 Ｔ４”　びＴ８”多　−４の ＡＩＤＳウィルス感染におけるＴ４の役割を研究するために使用した実験方法で は、まず、ウィルス感染を支持できない（ウィルスに感染することのない）Ｔ４ −細胞系にＴ４遺伝子を導入した０次に形質転換細胞のＡＩＤＳウィルス感受性 を試験し、Ｔ４によるウィルス感染媒介のメカニズムを研究した。 表面タンパク質Ｔ４をコードする完全ｃＤＮ＾ＤＭＡンをレトロウィルス発現ベ クターｐ１４Ｖ７中でサブクローニングした。 発現ベクターｐＭＶ７（第１１八図）は、直接反復しているＭｏ１ｏｎｅｙマウ ス肉腫ウイルスの長い末端リピー）　（ＬＴＲ）を２つ含んでおり、これらは単 一のＥｃｏＲＩクローニング部位で結合（ｆｌａｎｋ）シている。５°−ＬＴＲ は、クローニング部位を通過する転写を構成的に（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌ ｙ）促進（プロモート）し、３’−ＬＴＲはＲＮＡの開裂及びポリアゾニレ−ジ ョンに必要な配列を与える。更に、ｐＮＶ７は、優性の選択可能マーカーである 細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）のコード領域に 融合したヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーター（ｔｋ）を含み、これ によって連鎖した同時形質転換（ｌｉｎｋｅｄ　ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ ｏｎ）と感染とが可能になる。 Ｔ４−ｐＮＶ７を、欠陥ｅｅｏｔｒｏｐｉｅ（同種指向性）及びａｍｐｈｏｔｒ ｏｐｉｃ（両指向性）プロウィルスを夫々含むＮＩＢ　３Ｔ３＋ｔｆｆｆ胞系で あるψ−２及びψ−八へ細胞に導入した（第１１Ｂ図）（４４，５９）、両方の 細胞系は、内因性ウィルスＲＮ＾をキャプシド内封入（ｅｎｃａｐ−ｓｉｄａｔ ｉｏｎ、パッケージング）することはできないが、絶対のトランスに働くウィル ス機能（ｏｂｌｉｇａｔｅ　ｔｒａｎｓ　ｖｉｒａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ）を全て 与えることはできる。これらの細胞系に対するＴ４−ｐＭＶ７の安定なトランス フェクションの結果として、ヘルパーウィルスを含まずにＴ４をコードする組換 体レトロウィルス株が産生される。これらの純粋ウィルス株は標的細胞でレトロ ウィルスを産生ずることなくマウス及びヒトの双方の細胞にＴ４配列を有効に導 入すべく使用され得る。 要するに、ＤＮＡ媒介遺伝子運搬手順を使用してψ−２＃ｌＩ胞にＴ４−ｐＮＶ ７　ＤＭＡを導入した（第１１Ｂ図）（２５，２７）、ネオマイシン類似体Ｇ４ １８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））を含有する培地中での増殖能に基づい てＮｅｏ＋陽性コロニーを選択し、ｉｎ　５ｉｔｕロゼツト形成アツセイを使用 し細胞表面でのＴ４の発現に関してコロニーのスクリーニングを行なった（２０ ．７０）、　Ｔ４を発現するトランスフェクトチー２細胞のコロニーのうちから 、１０’ｃｆｕ／ｘ１の力価で組換体レトロウィルスを産生ずるコロニーを同定 した０次にＴ４”ψ−２クローンを使用し、マウスψ−ＡＨＭＢ胞に感染し得る レトロウィルスを生成した。１０’ｅｆｕ／ｍｌの組換体レトロウィルス力価を 生じるＴ４発発現−へＨクローンを単離した。マイトマイシン−〇処理した（又 は）ψ−＾Ｈクローンと（ヒト）細胞との同時培養によって７４”ヒト形質転換 体を産生じた（第１１Ｂ図）０次にＴ４°形質転換体をノザンプロット分析及び 流動細胞計測法によって分析し、Ｔ４が発現していること、及びＴ４が細胞表面 に存在していることを確認した０表面タンパク質Ｔ８を発現するコントロール細 胞系を同様にして構築した。 Ｔ４　ＡＩＤＳ　ルス早′九こ、゛、ノ　・小細胞を＾ＩＤＳウィルス感染に感 受性にするにはヒトリンパ球の表面にＴ４タンパク質が存在するだけで十分であ るか否かを決定するなめに、表面に初期Ｔリンパ球タンパク質Ｔ１及びＴｌｌだ けを発現する原始Ｔ細胞白血病細胞系ＨＳＢ２（７１）の形質転換体をまず構築 した。　ＨＳＢ２はＴ４及びＴ８のいずれをも発現せず、子細胞抗原レセプター 又は関連Ｔ３タンパク質複合体も発現しない、細胞表面でＴ４又はＴ８タンパク 質を発現するＨＳＢ２の形質転換体を選択し、これらを使用してＡＩＤＳウィル ス感染に対するこれらの細胞系の感受性を決定した。 ＡＩＤＳウィルスの感染を評価するアッセイとして、逆転写酵素の発現（５２） 　、免疫蛍光鏡検による細胞の紺胞質中のウィルス発現（４６）、イムノアッセ イを使用した培養上清中のウィルス抗原の検出（４７）及びフィトヘマグルチニ ン（ＰＨ＾）−刺激末梢リンパ球との上滑サブカルチャーによる感染性ピリオン の産生（４６）を含むいくつかの異なる実験方法を使用した。これらのアッセイ を使用してＨＳＢ２細胞系のＡＩＤＳウィルス感染の証拠は観察されなかった（ 表１）また、ＡＩＤＳウィルスレセプターを保有する非感染ヒト細胞をＡＩＤＳ ウィルス産生細胞と共に培養すると広範囲の細胞融合が生じることはこれまでに 既に判明していた（５４）、このアッセイによれば、１ｌｓＢ２＋ｉｆ！ｌ胞を ＡＩＤＳウィルス産生Ｈ産生ｌｌ胞と混合してもシンシチウムの誘発は生じない が（表■）、ＨＴＬＶ−１及びＩＩＴＬＶ−１産生細胞と混合すると多量のシン シチウムが形成される（データ図示せず）。 最後に、ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ糖タンパク質を保有する水胞性口内炎 ウィルス（ＶＳＶ）の偽型を使用してウィルス侵入を試験した（表１　）（５３ ，５４）、ＡＩＤＳウィルス感染細胞がｖＳｖで重複感染されると、ある程度の 割合の後代ｖＳｖが十分なＡＩＤＳウィルスエンベロープ糖タンパク質と結合し て超免疫−ｖＳｖ血清による中和に抵抗した。これらのＶＳＶ（ＡＩＤＳ）偽型 とリオンの宿主域はＡＩＤＳウィルスに特異的なレセプターを発現する細胞に限 定されている。細胞への侵入及びピリオンの脱外被後にキャプシドから放出され た（ｔｒａｎｓｃａρ−５ｉｄａｔｅｄ）ＶＳＶゲノム、が複製され非偽型粒子 を産生する。二次感染中には、感染細胞から遊離した後代ｖＳｖがＶＳＶ　（Ａ ＩＤＳ）偽型感染に耐性の指示細胞（ミンクＣＣＬ６４又はウシＨＤＢＫ紹胞） に侵入してこれを破壊し、その結果形成されたｖＳｖブラーり数を測定する。従 って、ＶＳＶ（ＡＩＤＳ）偽型による感染は、ウィルス侵入に対する定量的細胞 変性プラークアッセイを与える（５４）、コノアッセイニオイテ、ｌｌ５Ｉ１２ ＡＩ胞ヲＶＳＶ（ＡＩＤＳ）偽型に暴露したときにバックグラウンド以上のプラ ークは観察されなかった（表■）、　ＨＴＬＶ−Ｉエンベロープ中にキャプシド 化されたＶＳＶ　ＲＮＡの偽型を用いたコントロール実験によれば（ＶＳＶ（Ｈ ＴＬＶ−Ｉ　））、多数のプラークが観察され、これはＨＴＬＶ−ルセプターを 保有するＨＳＢ２細胞がＶＳＶを有効に複製し得ることを示す、これらの観察は 、ＡＩＤＳウィルスエンベロープ中にキャプシド化されたｖＳｖゲノムがＨＳＢ ２細胞に侵入できないことを示す。 次に、機能的Ｔ４　ｃＤＮ＾を１１ＳＢ２に導入するとこの細胞が＾１０Ｓウィ ルス感染に感受性になるか否かを試験した（表１）、ＨＳＯ２−７４”形質転換 体をＡＩＤＳウィルスに暴露し、その結果生じた増殖性ウィルス感染を逆転写酵 素活性の発現（５２）、免疫蛍光鏡検による細胞の細胞質中のウィルスの発現（ ４６）、イムノアッセイを使用した培養上滑中のウィルス抗原の検出（４７）、 及びＰＨＡ−刺激リンパ球との上清サブカルチャーによる感染性ウィルスの産生 （表１　）（４６）によって決定した。 コントロールＨＳＢ２−７８”細胞はどのアッセイにおいても終始陰性であった 。 更に、別のＴ４”　Ｔ細胞のＡＩＤＳウィルス感染効率についても試験した。　 ＨＳＯ３−７４”及び１（ＳＢ２−７８“形質転換体、天然単離Ｔ４◆Ｔ細胞系 ＣＥＭ及びＰＨＡ−刺激末梢リンパ球を系列１０倍希釈のＡＩＤＳウィルスに暴 露し、洗浄し、マイクロカルチャープレートに播種（ｐｌａｔｅ）　した、ウィ ルス暴露の１２日後に感染培養物の頻度をイムノアッセイによって測定した（第 １２図）（４７）、このようにして、暴露培養物の５０％を感染させるために必 要なＡＩＤＳウィルスの力価（１０−５０）を決定した。　ＰＨＡ−刺激末梢リ ンパ球のＩＤ−５０は天然単離Ｔ４”細胞又は形質転換Ｔ４”細胞系で観察され た値より２〜３桁大きい、　ＨＳＯ３−７４”細胞の感染効率は、天然単離Ｔ４ “Ｔ細胞系ＣＥＭで観察される値の約１０倍である（第１２図）、コントロール ＨＳＢ２−７８”細胞は試験された最高ウィルス力価でも感染に感受性でない。 また、ＶＳＶ（ＡＩＤＳ）偽型のシンシチウム形成と複製との双方を支持するＨ ＳＯ３−７４”細胞の能力を試験した。　ＨＳＯ３−７４”細胞を＾ＩＤＳウィ ルス産生Ｈ産生胞と共生培養すると、１８時間以内にシンシチウム形成が容易に 観察される（表Ｉ及び■）。 更に、培養物を抗Ｔ４＾モノクローナル抗体で処理することによってシンシチウ ム誘発が阻止される（表■）、最後に、ＨＳＯ２−７４＋細胞をＶＳＶ（＾Ｉ　 Ｏ５）偽型に暴露すると、隣接の指示細胞を破壊する感染性ｖＳｖ粒子が産生さ れる（表Ｉ及びＩ［［）。 更に、抗＾ＩＤＳウィルス抗体又は抗Ｔ４＾モノクローナル抗体で予処理すると グラーク形成を阻害し得る（表■）、ＡＩＤＳウィルス感染の検出に使用された ７つのアッセイのすべてにおいてコントロールＨＳＢ２−７８’細胞は終始陰性 である（表■、Ｈ及びＩ）、これらの観察は、未成熟しトＴリンパ球中にＴ４タ ンパク質が存在するだけでＡＩＤＳウィルス感染に必要な必須機能が与えられる ことを遺伝的に証明する。 人」− Ｔ４”ヒト３−　のシンシ　ウム； シンシ　ラム： 見上１１−　肚ハ刀臣　肢〃刀匿＋ａＴ４五ＪＭ（Ｔ４”）　＋＋＋＋＋　− ８１６６（Ｔ４”）　＋◆＋十十− Ｈ５Ｂ２　ＮＤ ＨＳＢ２−７８’　−ＮＤ ＨＳＢ２−７４”　− Ｒａｊｉ　ＮＤ Ｒａｊｉ−７８”　−ＮＤ Ｒａｊｉ−Ｔ４”　＋＋＋　− ＨｅＬａ　ＮＤ ＨｅＬａ−７８”　−ＮＤ ＨｅＬａ−７４”　＋＋＋＋＋　− ２Ｘ　１０’細胞を２ｘ　１０’ｉＤＳウィルス産生Ｈ９Ｍｊ胞（Ｈ９／ＡＩＤ Ｓ）　ト共生培養し、３７℃でインキュベートした。１８時間後に培養物のシン シチウム形成を検査した。結果をシンシチウム内部に含すれた核のパーセンテー ジの概数で示す、−（シンシチウム無）；”（２５％）；＋＋＋（５０％　）； ＋＋＋＋＋（９０％）：ＮＤ（ｍ定不能）、播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）のときに混 合培養物に抗Ｔ４＾モノクローナル抗体（αＴ４＾；１：２０）を添加するシン シチウム阻害アッセイも行なった。天然単離したｒｔ”　Ｔａ胞系ＪＭ及び８１ ６６をこれらの試験のポジティブコントロールとして使用した。 宍」し Ｔ４”　びＴ８’ヒト　ン　に　るＶＳＶ　型組　１　プテークア、セイＶＳＶ 　’　（ＰＦＵ／ｚｊ’ ｈ−ニド：ＪｉｌＬ　ＶＳＶΩＷＬＬ！二」−と＋ごスーＪ二に１２）にニーＪ −ＶＳＶズニｂ２Ｊ−ｐ［５≧）−＋　ａ　Ａ　ＩＤＳ＋　＝@Ｔ４Ａ工 ＣＥＭ（Ｔ４”）　２０，０００　５０　４２，０００　５０　２００ＨＳＢ２ −Ｔ８”　１０．０００　５０　０　ＮＤ　ＮＤ）１ｓＢ２−７４”　１２，０ ００　５０　１，０００　１００　３００Ｒａｊｉ−Ｔ８”　５，０００　ＮＤ 　ＯＮＤ　ＮＤＲａｊｉ−Ｔ４’　５，０００　５０　１，５００　２５　１５ ０ＨｅＬａ　１０，０００　ＮＤ　ＯＮＤ　ＮＤＨｅＬａ−Ｔ４”　１０，００ ０　５０　１７，０００　５０　２００２Ｘ１０’細胞をＶＳＶ（ＡＩＤＳ）偽 型（５３，５４）　ト共に３７℃で１時間インキュベートした０次に細胞を洗い 、ｖＳｖ感染に感受性でＶＳＶ（ＡＩＤＳ）！ｍＩｔ性ノ１×１０６ノミンクＣ ＣＬ６４又ハウシＭＤＢＫノフラーク指示細胞を各ウェルに添加した。培養物を 寒天培地に重ね、感染２日後にｖＳｖプラーク数を測定した。ＶＳＶ（ＡＩＤＳ ）偽型プラーク形成を阻害するために偽型（５４）に暴露する前に抗Ｔ４＾モノ クローナル抗体（αＴ＾＾；１：２０）又は抗ＡＩＤＳウィルス血清（αＡＩＤ Ｓ；１：１０）で細胞を３０分間予処理した。これらの実験では種々のヒト細胞 型（５４）に接種（ｐｌａｔｅ）したＶＳＶ（ＨＴＬＶ−１＞偽型をコンドロー ルドして使用しり、　ＶＳＶ（ＩＩＴＬＶ−■）偽型プラーク形成を阻害するた めに抗ＨＴＬＶ−１血清（１：１０）を使用した。結果をＰＦＵ／ｚ１で示す、 　ＨＤは測定不能を示す。 （以下余白） ＾ＴＤＳウィルス　はＴ１ンパ・に　されｔい機能的Ｔ４　ｃＤＮ＾を２つのヒ ト非Ｔ細胞系、即ち子宮頚癌に由来の上皮細胞系であるＨｅＬａ細胞（７２）、 及び、バーキットリンパ腫患者に由来のＢリンパ芽球様細胞系であるＲａｊｉ（ ７３）に導入した（第１１Ｂ図）、レトロウィルス媒介遺伝子運搬以前にはこれ らの細胞系は表面Ｔ４タンパク質又はＴ４　ｍＲＮ＾を発現せず、また、ＡＩＤ Ｓウィルス感染に感受性でない（表り。 更に、親細胞系はシンシチウムの誘発を支持せず、またｖＳｖ（ＡＩＤＳ）偽型 の感染・増殖（ｐｌａｔｉｎｇ）も支持しない（表Ｉ、■及びＩ［［）。 対照的に、Ｔ４”　Ｒａｊｉ及びＨｅＬａの形質転換体は先に記載したどの項目 （表りを基準にして判断してもＡＩＤＳウィルス感染を支持する。　Ｒａｊｉ− Ｔ４＋細胞に対する＾ＩＤＳウィルスの感染効率は、ＨＳＢ２−Ｔ４＋の場合と ほぼ等しく、天然単離Ｔ４”　Ｔ！ＩＢ胞系ＣＥＭに対する感染効率の約１０倍 である（第１２図）、更に、Ｒａｊｉ−７４’及び１１ｅＬａ−７４”細胞はＡ ＩＤＳウィルス産生Ｈ産生胞と同時培養されると、抗Ｔ４＾モノクローナル抗体 で培養物を予処理することによって阻害されるシンシチウムの誘発を支持する（ 表■及び■；第１３図）、更に、これらの細胞をｖＳｖ（ＡＩＤＳ）偽型に暴露 すると感染性ｖＳ■が産生され、抗ＡＩＤＳつイルス抗体又は抗Ｔ４＾モノクロ ーナル抗体で予処理することによって阻害されるプラーク形成が生じる（表Ｉ及 びＩ［ｌ）。 これらのアッセイのいずれにおいても、コントロールとして試験したＲａｊｉ− Ｔ８”及びＨｅＬａ−Ｔ８”の形質転換体は終始陰性である（表Ｉ、■及び■） 。 従って、機能的Ｔ４遺伝子をヒトＴリンパ球、Ｂリンパ球又は上皮細胞に導入す るためには、かかる細胞を＾ＴＤＳウィルス感染に感受性にするだけでよい、こ れらの観察から総合的に判断すると、ｉｎ　ｖｉｖｏで観察されたＴ４”　Ｔ細 胞指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）は、１４分子の制限発現の結果として生じたもので あり、内部で該分子の発現が生じた細胞型の性質には左右されない。 ＡＩＤＳウィルスは表面Ｔ４タンパク　に１合　る上記の実験は、■４発現がＡ ＩＤＳウィルス感染に必要であるという遺伝的証明を与えるが、該ウィルスのラ イフサイクルにおけるこの分子の役割に関する情報は与えない、ＡＩＤＳウィル ス感染にＴ４の表面発現が必要であるという観察は、Ｔ４がＡＩＤＳウィルスレ セプターであることを示唆する。従って、サイトフルオメトリイ（細胞蛍光光度 測定）を使用し、１４°及びＴ８”の形質転換ヒト細胞に表面に対するＡＩＤＳ ウィルスの結合を試験したく表■；第１４図＞、　ＨＳＢ２、Ｒａｊｉ及びＨｅ Ｌａ細胞のＴ４＋又はＴ８’形質転換体をＡＩＤＳウィルスと共にインキュベー トした。ウィルス吸収後、細胞を洗浄し、フルオレセイン結合抗ＡＩＤＳウィル ス抗体に暴露し、流動細胞計測法で分析した。このアッセイは、ＡＩＤＳウィル スが表面Ｔ４を発現するヒト形質転換体に有効に且つ特異的に結合するが丁４− 親細胞及びＴ８”形質転換体には結合しないことを証明したく第１４図、８列； 表１）、Ｔ４”細胞に対するＡＩＤＳウィルスの結合は、抗Ｔ４＾モノクローナ ル抗体とのブレインキュベーションによって阻止することはできるが、抗Ｔ８モ ノクローナル抗体とのブレインキュベーションによって阻止することはできない （第１４図、０列）、更に、Ｔ４”形質転換細胞をＡＩＤＳウィルスに暴露する と、Ｔ４１！タンパク質がウィルスエンベロープ糖タンパク質と共に沈降し、こ れらの分子面の物理的な直接結合を示唆する（データ図示せず）、これらの結果 は、ＡＩＤＳウィルスが細胞表面で１４分子に結合することを示し、また、この 結合は試験したｒ４”細胞型すべてにおいて生じるのでこの結合がその他のＴ細 胞特異的タンパク質と無関係であることを示す。 これまでの研究によって、エンベロープ被覆ウィルスの異なる２つの侵入経路が 説明されている（７４，７５，７６．７７）。 ある種のウィルスは原形質膜と直接融合し、ヌクレオキャプシドを細胞質中に放 出する。ある種のウィルスはレセプター媒介エンドサイト−シスによって取り込 まれる。エンドソームの酸性環境はウィルスエンベロープと液胞の境界膜との融 合を促進する。エンドサイト−シス経路によって細胞に侵入するウィルスによる 感染は、エンドソームを脱酸性化する弱塩基のごとき物質で細胞を処理すること によって阻害できる（５８．７８，７９．８０）、塩化アンモニウムの存在下で エンドソーム中での融合は遮断される。しかしながら、リソソーム分解は減速は されるが依然として進行する（ＳＯ）。 従って、Ｔ４”　Ｔ細胞系ＪＭのＡＩＤＳウィルス怒染に対掌る塩化アンモニウ ムの効果を試験した。塩化アンモニウムが存在しない場合、ＡＩＤＳウィルスに 暴露されたＪＭ細胞の５０％以上が感染５日後にウィルス抗原を発現しているこ とが免疫蛍光鏡検で観察された。ウィルス添加と同時又はウィルス、添加後３０ 分以内にＪＭ細胞を塩化アンモニウムに暴露（６時間）すると９５％を上回るウ ィルス感染阻害が観察された。しかしながら、ウィルス添加の１時間後に塩化ア ンモニウムで細胞を処理しても感染阻害は全く観察されなかった。この観察は、 レセプター媒介エンドサイト−シスを介して細胞に侵入する別のウィルスで説明 されたウィルス侵入動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）と完全に一致する。また、塩化ア ンモニウムの効果は完全に可逆的である。１時間塩化アンモニウムに暴露し次に この化合物がなくなるまで洗浄しＡＩＤＳウィルスに暴露した細胞は、コントロ ールレベルのウィルス感染を支持した。これらの結果は、塩化アンモニウムを除 去するとエンドソームのｐｉｔが１〜２分以内に初期の低い値に戻るというこれ までの観察（７８，８０）と一致する。エンドソームを脱酸性化する化合物であ るアマンタジンに関しても同様の結果が得られた。 これらの結果は、ウィルス侵入のメカニズムと一致する。 即ち、Ｔ４−ＡＩＤＳウィルス複合体のエンドサイト−シスが生じ且つ低ｐ■で ウィルスエンベロープとエンドソームの境界膜との融合が誘発され、細胞の細胞 質中にウィルスヌクレオキャプシドが放出される。 Ｔ４鵬ＲＮ＾は　において　される ＡＩＤＳは細胞免疫系を破壊する以外にしばしば中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患を 生起する。これは脳細胞にＡＩＤＳウィルスが直接感染するためであると考えら れている（８１）、従って、Ｔ４がＣＮＳ内部の細胞中で発現するが否がを決定 することは極めて重要であり、これがウィルスの向神経性の説明を与える。ヒト 及びマウスの脳から得られたＲＮＡのノザンプロット分析を行なって、７４　ｍ ＲＮ＾ＲＮＡＣＮＳ中で発現しているか否かを決定した（第１５図）、ヒト大脳 皮質由来のＰｏ１ｙ（＾）ＲＮ＾は、夫々分子量約３及び１．８ｋｂの異なる２ つのＴ４　ｍＲＮ＾を含む（第１５八図）、より少ない３ｋｂ　ＲＮＡのサイズ は、２つのＴ４÷白血病細胞系、即ち０９３７　（単球細胞系）及びＪｕｒｋａ ｔ（Ｔ細胞系）並びに末梢Ｔリンパ球によって発現される＋ａＲＮΔのサイズに 等しい、Ｔリンパ球には存在せずより多いがより小さい１．８ｋｂ　ｍＲＮ＾は 、５′もしくは３”末端の選択的スプライシングによって生じたものであろう。 マウスの脳の特定領域からｐｏｌバ＾）”　ＲＮＡを単離することによってＴ４ 　ｍＲＮ＾の局在をより精密に分析した（第１５Ｂ図）。 ネズミのＴ４相同体、Ｌ３Ｔ４をコードする放射性標識ｃＤＮ＾と共にハイブリ ダイゼーションを行なうと、マウス後層サンプル中には存在しない２．２ｋｂ　 ｍＲＮ＾がマウス前脳サンプルから集中的に検出される。２，２ｋｂ　Ｌ３Ｔ４ 　ｍＲＮ＾は大脳皮質、視床下部で検出され、線状体中に最も豊富に存在し、小 脳、脳幹又はを髄には存在しない（データ図示せず）、　ＣＮＳ中で検出される この２．２ｋｂ　ｍＲＮ＾は胸腺細胞中のＬ３Ｔ４をコードする３、２ｋｂ　ｍ ＲＮ＾より約１ｋｂ小さい（第１５Ｂ図）、これらの結果より、ＡＩＤＳウィル スが示す向神経性は脳細胞における１４分子の表面発現に起因すると推定できる 。前脳で検出されるｍＲＮ＾のレベルは胸腺細胞中の値の約１７３０である。こ れは、多くの細胞による低レベルの発現、又は、少さい細胞並集団によるより高 いレベルの発現を反映する。Ｔ４がニューロン又は支持細胞によって発現される か否かは今の処わかっていない、しかしながらＣＮＳ中の変異転写物の存在は、 侵入し難いＴリンパ球によって脳のＴ４　ｍＲＮ＾が発現されるという仮説を否 定する。 Ｔ細胞の機能的に異なるサブセットをもつＴ４及びＴ８の分離は、■リンパ球と 適当な標的細胞との相互作用においてこれらの分子が重要な役割を果たすことを 示唆する。これらのタンパク質の特異的機能を理解する第１段階として、１４分 子及び１８分子の両方からｃＤＮ＾クローンを取り出し、これらのクローンのヌ クレオチド配列を決定した（２０．７０）、Ｔ４及びＴ８の推定タンパク質配列 を比較すると、これらの分子は免疫グロブリン可変部（Ｖ）との間に有意な組列 的及び構造的相同をもち、免疫グロブリン超遺伝子系列（ｆａｍｉｌｙ）に所属 すると考えられる。しかしながら、Ｔ４と１８とは全く異なるＮ−末端Ｖ様ドメ インをもつ、これらのドメインは２８％だけの相同性をもち、従って、これらの ドメイン相互間の相同性は免疫グロブリンに対する夫々の相同性よりも小さい（ 第９Ａ図）、更に、Ｔ４とＴ８との双方の最大不変部は、免疫グロブリン及びＴ 細胞レセプター■領域に対して最も強い相同性をもつ、従って、これらの２つの 分子の免疫グロブリン様ドメインは構造的には同様であるが有意な配列分岐（ｄ ｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）を示し、これらが標的細胞の異なるサブセットの異なる分 子を認識するという仮説と一致する。 Ｔ４及びＴ８のＮ末端ドメインが共有するＶ様領域の構造的相同はこれらのタン パク質の機能に特に関連があるらしい。 免疫グロブリン超遺伝子系列に所属する遺伝子の実質的に全部が免疫応答に関与 する（６２）、更に、該遺伝子の各々は互いに結合して二量体を形成する傾向を 強く示す、この結合は、免疫グロブリンのＨ鎖及びＬ鎖、並びに、Ｔｌ１Ｉ胞抗 原レセプター、β、−マイクログロブリン及びクラスＩのＭＨＣタンパク質のα 鎖及びβ鎖、並びに、クラス■のＭＨＣ分子のα鎖及びβ鎖の相互作用において 明らかである。　Ｔ８糖タンパク質はＭＨＣ様分子分子定されるＴ６と胸腺細胞 の表面でジスルフィド結合を形成しく６２）、末梢Ｔリンパ球に３２ｋｄのサブ ユニットの多量体として存在する（８３）、　Ｔ４中の４つのＶ様ドメインの存 在は、これらの領域が互いに結合しまた別の細胞又はウィルスの表面で特異的配 位子と結合することを示す、免疫グロブリン様分子のこれらの特異的親和性はＴ ４及びＴ８の認識機能に必須であろう。 旺へｌ似 免疫グロブリン及びＴ細胞抗原レセプター遺伝子において、Ｖ様エキソン及びＪ 様エキソンはかなり隔たって存在しており、体細胞組換事象後にのみ並列する（ ６２．６３）、Ｔ４　ｍＲＮ＾はＤＮ＾組換事象を要せずに連続する４つのＶ様 及びＪ様エレメントをコードする。従って、Ｔ４は再配列メカニズムの出現以前 に発生したより原始的な遺伝子を反映すると考え得る。この推定の裏付けとして 、Ｔ４の第１ｖ様領域（Ｖ　Ｉ　）が免疫グロブリン又はＴ細胞抗原レセプター をコードするＶ遺伝子中に存在しないイントロンで分割されているという最近の 観察がある。これらの証拠の積み重ねによって、イントロンが予め存在しない環 境にイントロンが挿入される可能性よりも、進化中にイントロンが正確に除去さ れる可能性のほうがはるかに大きいことが示唆される。従ってＴ４は、複製、発 散（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）及び再配列によって通常の免疫グロブリン遺伝子系 列を生成する祖先免疫グロブリン遺伝子を示すと考えることができる。実際には Ｔ４は極めて複雑な免疫系で機能するが、Ｔ４がより原始的な細胞免疫応答にお いて機能するレセプターを反映すると考えることもできる。 無を椎動物のごとき原始的な免疫応答では多岐にわたるレセプター分子がなく、 最も簡単な場合にはセルフとノンセルフとの区別しかなく、再配列を生じない遺 伝子の「静止ｊセットによって調節されると推測される。 進化中のＴ４の経時的出現順序にかかわりなく、この遺伝子の編成はエキソンシ ャッフリングの重要な例を示す、Ｔ４は４つのＶ−Ｊ様ドメインと１つのＪ様領 域と１つの膜横断セグメントとから成り、各部が、免疫グロブリン超遺伝子系列 に属する種々の遺伝子の対応部に対する相同性をもつ。 このＶ様及びＪ様ドメインは免疫グロブリン及びＴ細胞抗原レセプター鎖の対応 する領域と相同である。膜横断ドメインはクラス■のＭｌ（Ｃ分子のβ鎖中の対 応領域とかなり相同である（第９Ｃ図）、従ってＴ４は、免疫応答に関与する多 数の異なる分子を生成すべく種々の方法でシャツフルされる免疫グロブリン超遺 伝子系列に属するいくつかの遺伝子中に保持された一群のエキノンから成る。 Ｔ４はＡＩＤＳウイルスレセプ　−で　る本文中に与えられたデータは、ＡＩＤ Ｓウィルスと細胞表面の１４分子との特異的結合から始まるＡＩＤＳウィルスの 感染メカニズムを示唆する。この結合は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及び上皮細胞 で観察され、従って、付加的なＴ細胞特異的タンパク質の関与は不要である。更 に、本文中に与えられたデータから判断すると、Ｔ４−ＡＩＤＳウィルス複合体 がレセプター媒介エンドサイト−シスを介して取り込まれ、次にウィルスエンベ ロープがエンベロープの境界膜と融合し、細胞質にヌクレオキャプシドを放出す る０次に、リンパ系細胞株及び非リンパ系細胞株の双方においてウィルスの複製 及び転写が生じ得る。更に、Ｔ４遺伝子は脳においてもリンパ球においても発現 される。これがＡＩＤＳウィルスの向神経性と向リンパ球性との二重性を説明す る。このように、ヒトレトロウィルスがエフェクター細胞−標的細胞の相互作用 の媒介に重要なＴリンパ球表面タンパク質を利用することによって、ＡＩＤＳウ ィルスが７４”！Ｅｌ胞の集団を特異的標的とする。 多数のエンベロープ被覆ウィルスで細胞表面レセプターが同定されている。これ らのレセプターの発現パターンが特定ウィルスの宿主域と指向性とをしばしば決 定する（７４゜７６）、いくつかのウィルスは狭い範囲の細胞型にのみ感染し、 これは特定の標的細胞集団に対するウィルスレセプターの発現を反映する０例え ば、狂犬病ウィルスはニコチン性アセチルコリン受容体と相互作用しく８７）、 骨格筋及びニューロンに大いに感染するが、エプスタインーノ＜−ルウイルスは Ｃ３ｄ補体レセプタータイプ２（８８）と相互作用しＢリンノ（球に感染する。 別のウィルス、例えばミクソウィルスζよ細胞表面に普遍的に分布したシアル酸 残基と相互作用し、番よるかに広い範囲の細胞型に感染する。 細胞表面レセプターの制限発現は向ウィルス性の説明の１つにすぎない、ある種 のウィルスは限られたセ・ントの分化細胞型中でのみ複製され、別のウィルスは 特定細胞型中でのみ有効に転写されるであろう、従って、Ｍｏ１ｏｎｅｙマウス 白血病ウイルス（Ｎｏ−Ｍｕ−ＬＶ）は新生マウスのＴ細胞リンノ（腫を誘発す る。また、極めて近縁のフロインドヘル）（−マウス白血病ウィルス（Ｆｒ−Ｍ ｕＬＶ）は主として赤白血病を誘発する（８９，９０．９１）、このような指向 性の違いは、有効な転写を容易に生起するためにＴリンパ球中のＮｏ−ＭｕＬＶ ゲノムがもつＬＴＲと赤血球系前駆物質中のＦｒ−ＭｕＬＶゲノムがもつＬＴＲ とが違うことに起因すると考えられている（９２，９３．９４＞。 本文中で示したごとく、ＡＩＤＳウィルスの指向性決定−次要因は標的細胞の表 面におけるＴ４タンパク質の発現である。 Ｉｎ　ｖｉｖｏ感染はリンパ系細胞、骨髄系細胞及び脳細胞に限定される。これ らがＴ４を発現する３つの集団である。　Ｉｎｖｉｔｒｏ試験では、ＡＩＤＳウ ィルスの天然標的でない細胞、即ちＴ４−ヒトＢリンパ球及び上皮細胞にＴ４を 導入するとこれらの細胞がＡＩＤＳウィルスによる増殖性感染に感受性になるこ とが判明した。 実施例１：１ｔｔｕフー　メント 限定プロテアーゼ消化を使用して細胞調製物から可溶Ｔ４糖タンパク質フラグメ ントを調製する。又は、前記のごときＴ４フラグメントを産生するために、膜横 断ドメイン、すなわち中性残基及び疎水性残基を含む領域の欠如したＴ４フラグ メントをコードするＤＮ八へ現ベクターを構築して使用してもよい、これらのフ ラグメントは水溶液に可溶であり、リーグ−（シグナル）配列を含む、哺乳類細 胞中で発現されると、これらのフラグメントは平滑でない小胞体／ゴルジ複合体 に運搬され任意に細胞がら分泌される。 実施例２：什坦１１α九ｉ 実施例１に記載の可溶Ｔ４糖タンパク質フラグメントを、典型的には薬剤として 許容される担体と混合してヒト免疫不全ウィルス感染者に投与し、感染者の血液 及びその他の体液中に存在するウィルスに結合させ、Ｔ４＋細胞のｉｎ　ｖｉｖ 。 感染を遮断する。及び／又は、固定したＴ４糖タンパク質又は可溶Ｔ４フラグメ ントをいれたカラムに患者の血液を循環させウィルスを血液から分離してもよい 、かかる処置によってウィルスに対する免疫系のより有効な免疫応答が増進され る。即ち、非感染Ｔ４”　Ｔａｌ胞が増殖する。 可溶Ｔ４フラグメントは治療薬として、即ち、ＨＩＶ感染の細胞外伝播及び細胞 間伝播を阻害するインヒビターとして使用され得る。出願人等は、可溶Ｔ４フラ グメントがＨＩＶウィルスによるＴ４”標的細胞へのｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合及び 感染を阻害することを証明した（実施例４参照）。 ＨＩＶ感染者に可溶Ｔ４フラグメントを投与するとウィルス感染の細胞外伝播が 阻害される。更に、ＨＩＶ感染Ｔ４”細胞と非感染Ｔ４”ｌｌｌ胞との結合もウ ィルス伝播の経路となり得るが、可溶Ｔ４フラグメントの投与によって該結合も 阻害される。 従って、可溶Ｔ４フラグメントの投与は病気の進行を遅くし、ＡＩＤＳ関連症候 群のいくつかの症状を軽減し、新しい病的変化の発生を阻止する。 生化学的に純粋な水溶性物質たる可溶Ｔ４フラグメントは、Ｔ４−ＨＩＶ相互作 用の拮抗物質（ｃｏ＋５ｐｅｔｉｔｏｒ）アッセイ用の別の試薬と共に使用され 得る。従って、可溶Ｔ４フラグメントは、ウィルス結合のインヒビターをスクリ ーニングするために、ＨＩＶエンベロープタンパク質と共に使用されるか又はＨ ＩＶエンベロープタンパク質を含有する生化学的混合物と共に使用される。 実施例３：ｐ″Ｔ４Ｔ４フーグメ ント合したＴ４タンパク質をコードするｃＤＮ＾を含有するプラスミド（ｐ７４ Ｂ）を単離し、特性決定し、種々の哺乳類細胞型において発現させた（７０）、 可溶Ｔ４フラグメントは細菌、酵母、昆虫、哺乳類の系で産生される。天然Ｔ４ タンパク質は複雑に折り畳まれグリコジル化され易いので哺乳類系中で発現させ るのが好ましい、ｐＴ４ＢをＶ４Ｊ４ドメインの後で切断することによって可溶 Ｔ４フラグメントが産生される。かかるＤＮＡフラグメントはヌクレオチド位置 的１２６４（第６図）で始まる膜横断セグメントの前で終結する。 分泌されたタンパク質フラグメントを過剰発現する細胞系の構築によって可溶Ｔ ４フラグメントの精製及び特性決定は大いに進歩する。細菌、酵母、昆虫及び哺 乳類の系でタンパク質を過剰発現させる戦略が使用された。また、構成的に（ｃ ｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）発現されると有毒になり得るタンパク質を過剰産 生ずるために、細菌及び酵母中で誘発可能な発現系が使用された。可溶Ｔ４フラ グメントの過剰発現に伴って、可溶Ｔ４発現ベクターが増幅され、その結果、構 成的な過剰発現が生じる。漸増濃度の薬剤メトトレキセート中の増殖によって得 られるジしドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子の増幅が広く使用されてい る。メトトレキセートはｄｈｆｒのアンタゴニストである。増幅ユニットがｄｈ ｆｒコード配列に限定されないので、この方法では該配列に隣接の配列の共増幅 （ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が生じる。従って、ｄｈｆｒを選択可能マ ーカー及び新しく導入された配列の同時増幅手段として使用する。この戦略を使 用してｄｈｆｒプラスミドと共形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ） された複数の異なる遺伝子の発現を増加させることに成功した。別の増幅スキー ムでは、可溶Ｔ４　ｃＤＮ＾発現ベクターとプラスミド９ｄＬＡＴ−３とのコト ランスフェクションと前記のごとき選択スキームとを順次用いる（１０２）　。 組換ＤＮ＾技術を使用し、ヒトｃＤＮ＾クローンｐＴ４Ｂ（７０）によってコー ドされたＴ４の分泌された可溶細胞外フラグメントの発現ベクターを産生ずる。 塩基対１〜１２５２のｐＴ４Ｂ　（第６図）は分泌タンパク質の合成に必要なＴ ４のリーダーペプチドと、４つのＶＪ様トドメインｖＩＪ１〜Ｖ４Ｊ４）を保有 する細胞外部分とをコードするが、膜内にタンパク質を固定する膜横断領域及び 細胞質領域をコードしない、このベクターはＨＩＶ結合ドメインを含むＴ４タン パク質の細胞外部分をコードする配列を含む、これらの配列はＳＶ４０早期領域 プロモータから下流に位置する。更に、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアゾニレ −ジョン領域の直前のＴ＾＾終結コドンは、頭を切断したＴ４　ｅＤＮ＾から下 流に位置しており、タンパク質の合成終了、転写終了及びＲＮ八へ写物のポリア ゾニレ−ジョンに必要なシグナルを与える。得られた可溶Ｔ４ミニ遺伝子を次に マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子に結合し、ｄｈｆｒ欠失（ ｄｈｆｒ−）のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＩＯ＞細胞に導入後に増幅さ れ得るプラスミドを生成する。 例えば、完全Ｔ４コード配列を含むｐＴ４Ｂの１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｂａ ５Ｈｌフラグメントを哺乳類発現ベクターＤＳＰ（１０３）の５ｔｕ１部位とＢ ｇｌ　１部位との間に挿入する。該ベクターは、ｓ■−４０早期プロモータとウ シ成長ホルモンポリアゾニレ−ジョン配列とを含むように変性されている０合成 リンカーを使用し、ｐＴ４ＢのＨａｅ　ＩＩ　（ｂｐ１２４）−Ｈｐａ　ＩＩ　 （ｂｐ１２５２）フラグメントをプラスミドｐＵｃ１８のＫｐｎ　１部位とＸｂ ａ　１部位との間に挿入する。可溶Ｔ４発現ベクターは以下のフラグメントの結 合によって得られる。 １　、　ｐＴ４Ｂの１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｂａｍ＋Ｈｌフラグメントを含 む変性ＤＳＰの０．９５ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　−５ａｃ　ｌフラグメント（この セグメントはＳＶ４０早期プロモーターとＴ４リーダー配列と細胞外Ｔ４配列の アミノ末端部分とを含む）： ２　、　ｐＴ４Ｂのｌ１ａｅ　］ｌ　−Ｈｐａ　ｆＪｌフラグメント含むプラス ミドｐＵＣ１８の０．６６ｋｂのＳａｃ　Ｉ−χｂａｉフラグメント（このセグ メントは細胞外Ｔ４配列のカルボキシ末端部分と、該末端部分に続いておりバリ ン３７１（第６図）の後に挿入されたＴ＾＾終結コドンとを含む）；及び ３、ウシ成長ホルモンポリアゾニレ−ジョン配列を含む変性ＤＳＰの２．４８ｋ ｂのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｘｂａ　ｌフラグメント。 最後に、Ｂｇｌ　ＩＩ及びＢａｍＨ１部位に結合（ｆｌａｎｋ）されたマウスｄ ｈｆｒ発現カセットを含む別の変性ＤＳＰがら得られた２、２ｋｂのＢｇｌ　Ｉ Ｉ　−ＢａＩＩＩＨｌフラグメント（βグロブリン７０モーター−マウスｄｈｆ ｒコード領域−５Ｖ４０ポリアゾニレ−ジョン領域）を、プラスミドのＢａｗｌ 　１部位に挿入して可溶Ｔ４発現プラスミドを生成させる。 ｄｈｒｒの欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞のクローンＤＸＢ−１１（ １０４）に可溶Ｔ４発現プラスミドをトランスフェクトする。　ＤＸＢ−１１形 質転換体を次に、１０％の透析ウシ胎児血清を含むヒボキサンチン又はチミジン 欠失のＦＩＺ培地で増殖する。クローンを選択し、ｄｈｆｒのアンタゴニストで ある段階増加濃度のメトトレキセート（ｍｔｘ）を使用し、新しく導入されたｄ ｈｆｒ遺伝子と隣接の可溶Ｔ４配列とを増幅した安定な形質転換体を選択する。 ｍｔｘ中で増殖した選択クローンの培養上清を放射性免疫沈降処理（ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）　して可溶Ｔ４フラグメントを検出 する０選択クローンの集密的培養物を３ｓＳ−メチオニン及びシスティンで１８ 時間放射性標識し、培養上清をＴ４特異的モノクローナル抗体（ＯＫＴ４．０Ｋ Ｔ４＾）とコントロール抗体０ＫＴ８と非特異的マウス■ｇＣと共に免疫沈降さ せる。 免疫沈降液を５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけフィルムに露光す る。　０ＫＴ４及び０ＫＴ４＾を用いた場合、可溶Ｔ４フラグメントの予想サイ ズに相当する分子量約４５ｋｄのタンパク質が培養上清から特異的に免疫沈降す る。 状態調整した培地（ＣＭ）を選択クローンの培養物がら無血清で収集し、低速遠 心で透明にし、１０倍に濃縮する。濃縮サンプルを２倍に希釈して塩濃度を下げ 、ｐＨ６に調整し、Ｓ−Ｓｅｐｈ５−５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｂａｒで処理する 。可溶Ｔ４フラグメントをこのｐｔｔで樹脂に保持し塩濃度勾配で溶出する。 細菌、酵母及び昆虫中でも同様に処理して可溶Ｔ４フラグメントを得ることが可 能である。更に、前記フラグメントより小さいサイズのフラグメント、例えばＶ ＩＪＩドメインだけを含むフラグメントを産生することも可能である。 実施例３に記載のごとく調製した可溶Ｔ４フラグメントが示すＴ４”ｌＨ胞に対 する拮抗能及び該Ｔ４’ｍ胞に対するＩＩＩＶ結合の阻害能を試験した。標的Ｔ ４”　Ｔ細胞系ＣＥＮに添加する前に、選択された可溶Ｔ４フラグメント産生細 胞から得た系列希釈度の１０倍濃縮ＣＭを系列希釈度のＨＩＶウィルスと共にブ レインキュベートした。　ＦＩＴＣ結合抗１１１Ｖ抗体とのインキュベーション 及びサイトフルオロメトリイー分析を原次行なうことによってＣＥＭ細胞に対す るＨＩＶの結合を定量した０選択された可溶Ｔ４フラグメント産生細胞系からの ＣＭは、ＣＥＮ細胞の表面に対するＨＩＶ結合を希釈度依存的に阻害した。 対応する非産生細胞からのＣＭは応答を全く示さなかった。 また、可溶Ｔ４フラグメントがもつＴ４”細胞に対する■ＩＶ感染の阻害能をｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ試験した０選択された可溶Ｔ４フラグメント産生細胞系からのＣ Ｍを、系列希釈度のＨＩＶを接種したＰ）Ｉ＾−刺激Ｔ４”　Ｔ細胞の培養物に 添加した。前記抗原捕獲アッセイを使用し、４．８及び１２２ａｃ培養物中のＨ ！ν複製をモニターした。各モニタ一時期に可溶Ｔ４フラグメントはｔｌｌＶ感 染を約ｆｌｏｇ倍ずつ阻害していた。 実施例５：ａ”ｒ４−　′　！ 等容の完全フロインドアジュバントと混合した５０ｐｆの（前記のごとく調製さ れた）本発明の精製可溶Ｔ４フラグメントを、８週齢のＢａ１ｂ／ｃマウスの腹 膜組織内に注射した０次にブースターとして、不完全フロインドアジュバントと 混合した可溶Ｔ４フラグメントを毎月１回マウスに注射し、尾の静脈から瀉血し た。ＶＸ酸アンモニウム沈降によって血清の免疫グロブリン分画を生成し、固定 Ｔ４フラグメントを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって特巽的抗 可溶Ｔ４フラグメント抗体を精製する。 実施例６：ロ５Ｔ４フーグメント　イーイオタイブ　の；同遺伝子型及び類似遺 伝子型のマウスの腹膜組織内に完全フロインドアジュバントと混合した５０μｓ の（前記のごとく調製された）本発明の精製抗可溶Ｔ４フラグメント抗体を注射 し、ブースターとして不完全フロインドアジュバントと混合した抗可溶Ｔ４フラ グメント抗体を毎月１回注射する。 融合の４．３及び２日前にブースターとして５０Ｉ１ｇの免疫グロブリン生理食 塩水溶液をマウスに靜注する１次に当業界で公知の手順で牌細胞をＰ３Ｘ６３＾ に８．６５３非分泌骨髄腫細胞と融合させる。２週間後、ラジオイムノアッセイ を用いた抗可溶Ｔ４フラグメント抗体に対する結合活性に基づいてハイブリドー マ上清をスクリーニングする。陽性クローンについて、ヒト免疫不全ウィルスエ ンベロープ糖タンパク質及びＡＩＤＳウィルスに対する結合能の測定アッセイを 行なう。 又は、「１段階」手順を使用し、完全フロインドアジュバントと混合した可溶Ｔ ４フラグメントをマウスの腹膜組繊内に注射し、生理食塩水と混合した可溶Ｔ４ フラグメントをブースターとして靜注し、マウスｆｆ＃１ｌＪｌを前記のごとき 骨ｆ！腫と融合させる８次にハイブリドーマ上清に対して、可溶Ｔ４フラグメン ト抗イディオタイプ抗体の測定アッセイを直接性なう。 （以下余白） Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕ＝＝　２ 目　・　會　・　ＭψσＦｆｆし Ｌ ・　・　ＬＴＤ−４ ・　・　ＲＰＭｌ ｌ・　・ａｌｌ　Ｍ ２０〇− ２５，７− ：＋ｑｕ＋＠　フ 特表千１−５００８７９　（４ ９２，５− ６６，２− （ｔｏ、ａ：：Ｃへ ｚ×　山ト− ＸＩ　ＺａＣＪ ＋Ｑ　αへ〉 ×＜３：←〉 う ２１１暑（Ｊ−１ ０冒　Ｉ　ψψ Ｚ（１）　Ｅ−閲　１ １〜　Ｏｏ４　鴇 １：）　、Ｊ：Ｊ：１ １　（ｊ（、）（ｊりり ＩＩ　Ｉ（１）（／Ｉ ＩＩ（ｄｉ　Ｈ １１＜ＱＣｄ 璽Ｏく口２ ０Ｘ＋０ ＩｃＩＪ　Ｑ、Ｑ、Ｃｔ） Ｘ＋　ＺＺＣＬ。 匣コ　０７回 こ っンψン可スＪに ＨＰら→り、ＴαＪ ＦｉｇｕＣｅ　９Ｂ 、口 Ｘ ■ ■ 、口 × す 、Ω ヱ 、ロ ヱ ｒｉｇｕｒ＝　１２ ＬＯ９１０（フィルス希距ｇｉ　） ７ｉｑｇ（＠　１３Ａ ＝”ｉｇＬ！ｒａ　１３Ｂ ＦＬｑ＊ｃ＝　１４．− Ｆ二；と；嘘　１４３ ＡＩＤＳ／ａＡＩＤｓ Ｅ’１ｑｕｒｅ　１４ｃ ａＴ４Ａｘ＋ｉ　ａＴ８／ ＡＩＤＳ／αＡＩＤＳ Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ｂ 茜 国際調査報告 ｌｅｍＲ＆ｌｌＩＭＩ　Ａｔｓ４ｃＪｍ°”’　ＰＣＴ／１ｌｓＩｌ＋７１０２ ０５０＋−＋、、＋１．＋−１１−＋Ａｏｏ−、ｃ畦ｏｌＩｓｏＰＣＴ／ＵＳＩ ｌ１７１０２０５０

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｔ糖タンパク質の少なくとも一部分を含むアミノ酸配列をコードする単鎖核 酸分子。
2. ２．アミノ酸配列がヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質との複合体 を特異的に形成し得ることを特徴とする請求項１記載の核酸分子。
3. ３．請求項２記載の核酸分子に対して少なくとも９０％の相同性をもつことを特 徴とする核酸分子。
4. ４．アミノ酸配列が水溶液に可溶であることを特徴とする請求項３記載の核酸分 子。
5. ５．Ｔ４糖タンパク質がヒトＴ４糖タンパク質であることを特徴とする請求項１ 記載の核酸分子。
6. ６．請求項１記載の核酸分子に相補的な核酸分子。
7. ７．検出可能マーカーで標識された請求項６記載の核酸分子。
8. ８．請求項１記載のＤＮＡ分子。
9. ９．第１０図の制限酵素地図によって示されるゲノムＤＮＡ分子の少なくとも一 部分を含む請求項７記載のＤＮＡ分子。
10. １０．第６図に示す核酸配列の少なくとも一部分を含む請求項１記載のｃＤＮＡ 分子。
11. １１．第６図に示す核酸配列の少なくとも一部分を含む請求項４記載のｃＤＮＡ 分子。
12. １２．請求項１記載のＲＮＡ分子。
13. １３．Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部分に相当するアミノ酸配列をコードす る単鎖核酸分子を検出する方法において、相補的単鎖核酸分子のハイブリダイゼ ーションが可能な条件下に単鎖核酸分子を請求項７の核酸分子と接触させ、形成 されたハイブリッド核酸分子を単鎖核酸分子から分離し、これによりＴ４糖タン パク質の少なくとも一部分に相当するアミノ酸をコードする単鎖核酸分子を検出 することを特徴とする方法。
14. １４．Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部分に相当するアミノ酸配列をコードす る単鎖核酸分子が、染色体ＤＮＡに由来のＤＮＡ分子であることを特徴とする請 求項１３記載の方法。
15. １５．染色体ＤＮＡが、リンパ様細胞、骨髄様細胞及び脳細胞から成るグループ の細胞に由来することを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. １６．リンパ様細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
17. １７．リンパ様細胞がＢ細胞であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
18. １８．骨髄様細胞が顆粒球であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
19. １９．骨髄様細胞がマクロファージであることを特徴とする請求項１５記載の方 法。
20. ２０．請求項１の核酸分子によってコードされＴ４糖タンパク質の少なくとも一 部分を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
21. ２１．請求項２の核酸分子によってコードされヒト免疫不全ウイルスエンベロー プ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得ることを特徴とするアミノ酸配列 。
22. ２２．請求項２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の相同性をもつアミ ノ酸配列。
23. ２３．請求項４の核酸分子によってコードされ水溶液に可溶でありヒト免疫不全 ウイルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特異的に形成し得ることを特徴 とするアミノ酸配列。
24. ２４．請求項２０のアミノ酸配列を少なくとも１つ含むペプチド。
25. ２５．請求項２４のペプチドを少なくとも２つ含むポリペプチド。
26. ２６．後天性免疫不全症候群治療のための治療薬として有効な請求項２３記載の アミノ酸配列。
27. ２７．第６図のアミノ酸−２３からアミノ酸＋３７４までのアミノ酸配列を含む 請求項２６記載のアミノ酸配列。
28. ２８．第６図のアミノ酸＋２８７からアミノ酸＋３７４までのアミノ酸配列を含 む請求項２７記載のアミノ酸配列。
29. ２９．第６図のアミノ酸＋１８２からアミノ酸＋２８６までのアミノ酸配列を含 む請求項２７記載のアミノ酸配列。
30. ３０．第６図のアミノ酸＋１１２からアミノ酸＋１８１までのアミノ酸配列を含 む請求項２７記載のアミノ酸配列。
31. ３１．第６図のアミノ酸＋１からアミノ酸＋１１１までのアミノ酸配列を含む請 求項２７記載のアミノ酸配列。
32. ３２．請求項２６記載のアミノ酸配列と薬剤として許容される担体とを含む薬剤 組成物。
33. ３３．請求項３２記載の薬剤組成物をヒトに有効量で投与することを特徴とする ヒト免疫不全ウイルス感染者の処置方法。
34. ３４．請求項１０のｃＤＮＡ分子でコードされる精製ポリペプチド。
35. ３５．請求項１０のｃＤＮＡ分子を含むベクター。
36. ３６．プラスミドから成る請求項３５記載のベクター。
37. ３７．ウイルスから成る請求項３５記載のベクター。
38. ３８．適当な宿主中に請求項３６記載のプラスミドを含むことを特徴とするＴ４ 糖タンパク質の少なくとも一部分に相当するアミノ酸配列産生用の宿主ベクター 系。
39. ３９．適当な宿主が細菌細胞であることを特徴とする請求項３８記載の宿主ベク ター系。
40. ４０．細菌細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする請求項３９記載の宿主ベク ター系。
41. ４１．適当な宿主が真核細胞であることを特徴とする請求項３８記載の宿主ベク ター系。
42. ４２．真核細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項４１記載の宿主ベク ター系。
43. ４３．真核細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項４１記載の宿主ベクタ ー系。
44. ４４．適当な宿主が昆虫細胞であることを特徴とする請求項３８記載の宿主ベク ター系。
45. ４５．Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部分を産生させ得る適当な条件下に請求 項３８の宿主ベクター系を増殖させ、得られたＴ４糖タンパク質部分を回収する ことを特徴とするＴ４糖タンパク質の少なくとも一部分に相当するアミノ酸配列 の製造方法。
46. ４６．適当な宿主中に請求項３７のウイルスを含むＴ４糖タンパク質の少なくと も一部分に相当するアミノ酸配列を産生するための宿主ベクター系。
47. ４７．適当な宿主が細菌細胞であることを特徴とする請求項４６記載の宿主ベク ター系。
48. ４８．細菌細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする請求項４７記載の宿主ベク ター系。
49. ４９．適当な宿主が真核細胞であることを特徴とする請求項４６記載の宿主ベク ター系。
50. ５０．真核細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項４９記載の宿主ベク ター系。
51. ５１．真核細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項４９記載の宿主ベクタ ー系。
52. ５２．適当な宿主が昆虫であることを特徴とする請求項４６記載の宿主ベクター 系。
53. ５３．Ｔ４糖タンパク質の少なくとも一部分を産生きせ得る適当な条件下に請求 項４６の宿主ベクター系を増殖させ、得られたＴ４糖タンパク質部分を回収する ことを特徴とするＴ４糖タンパク質の少なくとも一部分に相当するアミノ酸配列 の製造方法。
54. ５４．請求項２３のアミノ酸配列との複合体を特異的に形成し得る物質。
55. ５５．請求項５４記載の抗体。
56. ５６．請求項５５記載のモノクローナル抗体。
57. ５７．請求項５６記載のヒトモノクローナル抗体。
58. ５８．請求項５６のモノクローナル抗体と薬剤として許容される担体とを含むこ とを特徴とする後天性免疫不全症候群に対するヒトの免疫に有効なワクチン。
59. ５９．有効免疫量の請求項５８のワクチンをヒトに投与することを特徴とするヒ ト免疫不全ウイルスに対するヒトの免疫方法。
60. ６０．請求項５６のモノクローナル抗体との複合体を特異的に形成し得る物質。
61. ６１．ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質との特異的複合体を更に 形成し得る請求項６０記載の物質。
62. ６２．Ｔ４糖タンパク質抗イディオタイプ抗体を含むことを特徴とする請求項６ １記載の物質。
63. ６３．請求項６２のＴ４糖タンパク質抗イディオタイプ抗体と薬剤として許容さ れる担体とを含むことを特徴とする薬剤組成物。
64. ６４．有効量の請求項６３記載の薬剤組成物をヒトに投与することを特徴とする ヒト免疫不全ウイルス感染者の処置方法。