JPH02503269A - 可溶性ｔ４の誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １溶性Ｔ４の・　　　　　　゛ 本出願は１９８７年１０月２３日出願の米国特許出願第１１４，２４４号の一部 継続出願であり、該出願は１９８６年８月２１日出願の米国特許出願第８９８， ５８７号の一部継続出願であり、これらの特許出願の記載内容は本出願に含まれ るものとする。 光１と１１一 本明細書ではいくつかの参考文献を括弧内にアラビア数字で示し、これらの参考 文献の一覧を明細書の末尾に添付した０本発明が属する分野の現状を十分に理解 するために引用されたこれらの参考文献の記載内容は本出願に含まれるものとす る。 Ｔリンパ球の異なる機能クラスは、異なる標的細胞気団の表面の抗原を認識する 。ヘルパーＴ細胞は主としてマクロファージ及びＢ細胞と相互作用する。細胞障 害性Ｔ細胞はより広い範囲の抗原保有標的細胞と相互作用する。これらの細胞認 識事象は、エフェクター細胞及び標的細胞の双方の表面分子の特異的会合によっ て媒介されると推定できる。Ｔ細胞の表面の特徴は、多数の多形及び非多形タン パク質を有することであり、これらのタンパク質の大部分はＴリンパ球に限定さ れている。これらの分子の多くはすべてのＴ細胞に共通であるが、２つのクラス の表面タンパク質の違いは常にＴ細胞の機能クラスの違いに基づく、これらのタ ンパク質はＴｉ胞−標的細胞相互作用に関与していた。 １つのクラスの表面分子はＴリンパ球の主要な機能サブセット即ち表面糖タンパ ク質Ｔ４及びＴ８を識別する。胸腺発達の初期に糖タンパク質Ｔ４及びＴ８は胸 腺細胞の表面で同時発現される（１）、末梢免疫系において、１４分子及び１８ 分子はＴ細胞の相互排除的サブセットにおいて発現され、同じ細胞においてで発 現されることはめったにない（２，３）、７４分子はクラス■の主要組織適合性 遺伝子複合体（ＭＩＩＣ）分子を保有する標的細胞と相互作用するＴ細胞におい て発現される。他方、Ｔ８を担うＴ細胞はクラスｌのＭＨＣタンパク質を発現す る標的と相互作用する（４．５．６，７．８．９）、Ｔリンパ球のＴ４気団はヘ ルパー細胞を含み、他方、１８１！、団は細胞障害性及びサプレッサー細胞の大 部分を含む（６，１０）。 しかしながら、希少な１４°のＴ細胞は細胞障害性またはサプレッサー細胞とし て機能でき（６，１０）、これはＴ４またはＴ８の発現がエフェクター機能より もＭＢＣクラスの認識に緊密に（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｌｙ）関連していることを 示唆する。Ｔ細胞−標的細胞相互作用におけるこれらの分子の重要性はモノクロ ーナル抗体を用いた研究によって証明され得る。　１４分子（または対応するマ ウスの分子Ｌ３Ｔ４）の特異的エピトープに対する抗体は、抗原誘発Ｔ＃胞増殖 、リンフ才力イン遊離及びヘルパーＴ細胞機能を阻害する（７．８．１１．１２ ．１３）。 同様に、Ｔ８（または対応するマウスの分子Ｌｙｔ２）に対するモノクローナル 抗体は細胞障害性Ｔ細胞媒介キラー作用を阻害する（１４．１５）、これらの観 察及びＴ４とＴ８とが有意な多形性を表わさない事実に基づいて判断すると、Ｔ ４及びＴ８がクラス■及びクラスＩの分子の非多形領域を夫々認識すると推定し 得る。 異なるエフェクターＴ細胞に基づく違いを有すると考えられる第２のクラスのタ ンパク質は、ＭＨＣ分子の多形領域と会合する抗原を認識するレセプターである （１６．１７．１８）。 ヘルパーＴ細胞機能の相互作用は主としてクラス■のＭＨＣタンパク質を発現す る抗原保有標的細胞に限定され、他方、細胞障害性及びサプレッサーＴ細胞はク ラスｌのＭＭＣ分子を担う標的細胞に限定される（４．５．６．７．８．９）、 これらの特異的相互作用は、特異的ＭＢＣ分子に関連して抗原を認識する（１つ または複数の）Ｔ細胞レセプターによって媒介され得る。従って、Ｔリンパ球は ＭＨＣタンパク質の不変決定基及び多形決定基を認識し得る独立の２つのレセプ ターを有するであろう、これらのレセプターは機能的に異なるＴ細胞集団を特異 的標的とする役割を果たす。 ヒト後天性免疫不全症候群（エイズ、ＡＩＤＳ）の特徴は、Ｔ４４リンパ球が欠 失していることにある。その結果として、エイズ患者ではＴ細胞媒介免疫性が損 傷され、重大な日和見感染及び異常な新生物が発生する。エイズは、ヒト免疫不 全ウィルス（旧Ｖ）と命名された類縁レトロウィルス（ＬＡＶ、ＨＴＬＶ−７１ ）または＾ＲＶ）の集団がＴリンパ球に感染することによって発症する。これら の病原体の感染力の範囲は、その表面にＴ４糖タンパク質を発現する細胞に限定 されている。 従って、Ｔ４糖タンパク質は標的細胞の表面の分子のレセプターとして機能する だけでなく、エイズウィルスのレセプターの機能も果たす、　Ｔ４に対するモノ クローナル抗体は、Ｔ４”細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏエイズウィルス感染を阻止す る。更に、最近の研究から、Ｔ４”　Ｔリンパ球がエイズウィルスに接触すると ウィルスの１１０ｋｄのエンベロープ糖タンパク質が宿主細胞の１４分子と会合 することが判明した。従ってウィルスの向リンパ性はＴリンパ球のサブ集団中の レセプターＴ４の限定された発現によって説明できた。 エイズではＴ４”　７９２８球の欠失によって細胞性免疫応答が損なわれる。ま た多くの場合にはエイズに伴って、殆どが亜急性脳炎（ｓｕｂｅｕｔｅ　ｅｎｃ ｅｐｈｉｌｉｔｉｓ）に起因する中枢神経系（ＣＮＳ）の機能障害が生じる。エ イズウィルスのＲＮＡ及びＤＮＡは感染脳から同定され、神経系疾患に罹患した 患者の脳及び脳を髄液からウィルスが単離された。これらの観察は、エイズウィ ルスが脳細胞に感染し、該ウィルスがエイズ患者で観察されるＣＮＳ病変の直接 原因であることを示唆する。従って、エイズは向リンパ性であると同時に向神経 性である。従って、Ｔ４がＣＮＳ中で発現されたのかまたは付加的な脳特異的表 面分子がエイズウィルスのレセプターとして機能するのかを判断することが重要 である。 丁４及びＴ８の特異的相互作用の解明は、Ｔ４及びＴ８遺伝子を単離でき、それ らの構造を決定し、種々の細胞環境に導入できれば容易に行なわれるであろう、 　Ｔ８分子をコードするｃＤＮ＾の単離及び配列が最近報告された（１９．２０ ．２１）、推定されたタンパク質配列は、Ｔ８が免疫グロブリンＬＭの可変部と の相同性を含むＮ末端ドメインをもつ膜結合糖タンパク質であることを示す。 几」しλ！」１ 本発明は、ポリペプチドを含有するヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパ ク質との複合体を特異的に形成することが可能な治療剤を提供する１本発明の１ 態様によると、ポリペプチドのアミノ酸配列は約＋３５１〜約＋３６９のアミノ 酸配列に融合した約＋３〜約＋１８５の第６図に示すアミノ酸配列を含む０本発 明の別の態様によると、ポリペプチドのアミノ酸配列は約＋３５１〜約＋３６９ のアミノ酸配列に融合した約＋３〜約＋１０６の第６図に示すアミノ酸配列を含 む。 本発明の更に別の態様によると、ポリペプチドのアミノ酸配列は約＋３〜約＋１ ８５の第６図に示すアミノ酸配列を含む。 本発明は更に、ヒト免疫不全ウィルスに感染した患者の治療方法も提供する。該 方法は、有効量の本発明の治療剤と医薬上許容可能なキャリヤーとを含有する有 効量の医薬組成物を患者に投与することから成る。 の　　ゝ　ｆ５　日 第１図、　０ＫＴ４　　び０ＫＴ８　　　いｔ−ヨ　　　　゛　　の　イトフル 　ログ−フィーバ　−ン 細胞（５ｘ　１０’）をマウスモノクローナル抗体０Ｋ７４Ｂ又は０ＫＴ８と共 にインキュベートし、洗浄し、その後、ＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス免疫グ ロブリンと共にインキュベートした０ｍ胞をＦＡＣＳ　Ｎ　Ｃｅｌ　Ｉ　５ｏｒ ｔｅｒで分析し、ＶＡＸ　１１／７８０コンピユーターにより蛍光の対数値に対 する細胞数としてプロットした。非形質転換Ｎ１１ｌ　３Ｔ３細胞及び［１胞は 同一のサイトフルオログラフィーパターンを示した。　Ｆｒｏ　２．２はＴ３− １Ｔ４”、Ｔ８”、Ｔ１１゛の表現型を有する白血病Ｔ細胞系であり、ＬＴＴＩ −４は全ゲノムＤＮ＾の転移後に得られるＴ４°−次り細胞の形質転換体である 。３＾＋ｌまＴ４−ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏレトロウィルス発現構築物で形質転換 したＮＩＨ３Ｔ３細胞系である。 第２図、Ｔ４′″　びＴ４−Ｌ　　　　　ヒト　　に　　　るＲＮＡのノー　ン ブロ・・ ３＋１１１のポリ（八）’ＲＮ＾又は１２ＩＩｇの全ＲＮ＾（末梢Ｔ細胞及び胸 腺リンパ球）を０．８％アガロース−ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動させ、 にｅｎｅｓｃｒｅｅｎ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｅｌｅａｒ）に吸着さ せ、３２ｐで標識した０、６ｋｂ　Ｔ４　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トでプローブした。 Ｔ４゛細胞はＬＴＤ−４（Ｔ４°、Ｔ８−Ｌ細胞の形質転換体）、５Ｋ−７７細 胞ハイブリドーマ（Ｔ４′″、Ｔ８−）、０Ｔ−ＣＬＬ白血病（Ｔ４′″、Ｔ８ −）、Ｐｒｏ　２．２白血病（Ｔ４′″、Ｔ８−）、Ｔ４沃化末梢Ｔリンパ球、 及びヒト胸腺リンパ球を含む、　Ｔ４−＋ｉｌ胞は、非形質転換細胞、ｔｋ７（ Ｔ８”″Ｌ細胞の形質転換体）、ＨｅＬａ細胞、ヒト神経芽■細＠　（ＩＭＲ） 、及び丁８沃化末梢Ｔリンパ球を含む、ヒト胸腺リンパ球レーンを４倍の時間で 露光し、硬調フィルムで写真撮影した。 第３図、Ｔ４Ｂ　　びＴ４　−　の　　　　レアーゼ　゛　　び　　　　　ベ　 　　− ＾、　ｐＴ４Ｂ　ｅＤＮ＾及びＴ４遺伝子のＢａｍＨＩ制限フラグメントのアラ インメント、７４遺伝子におけるＢａ＋ｓＨＩフラグメントの順序はサザンプロ ット分析及びゲノムクローンマツピングにより決定した。　ｐ７４Ｂ及びＴ４遺 伝子の５°末端のアラインメントを点線により示し、ｐ７４Ｂの塗りつぶし領域 はコーディング配列に対応する。指示した寸法の単位はキロベースである。 Ｂ、配列決定方法、矢印はフラグメントをＭ１３にサブクローニングし、チェー ンターミネータ−法（３６）により配列決定することにより決定した配列範囲を 示す。 Ｃ０真核細胞発現ベクター、これらの構築物は、矢印により示すような配向を有 する２つのモロニーマウスウィルスの長い末端反復（ＬＴＲ）を含む、　ｐＴ４ Ｂ　ｅＤＮ＾を指示した配向で各ベクターのＥｃｏＲ１部位にサブクローニング した。　（１）Ｔ４−ｐＶｅｏｓ７ｆｌｌ築物、　（ｂ）Ｔ４−ｐＭＶ６ｔｋ／ ｎｅｏ楕築物はＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターに融合したネオマイシンホ スホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。 第４図、　　ン　　　　びＴ４°Ｌ　　　びにＴＢ　　び　驚ンパ　ヒト　　か 　のＤＮＡの　　ンプロット１０■の細胞ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、０．８ ％アガロースゲル中で電気泳動させ、ＣｅｎｅＳｅｒｅｅｎに吸着させ、ニック 翻訳したｐＴ４Ｂ　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トでプローブした。指示した寸法の単位は キロベースである。全てのヒトＤＮＡには２０ｋｂ、６．６ｋｂ、４ｋｂ、１． ８ｋｂ及びｌｋｂの寸法のハイブリダイジングバンドが現れている。非リンパ性 起源のＴ４−からのＤＮＡは非形質転換し細胞、ヒト線維芽細胞（ＣＭ）、ヒト 神経芽腫細胞（ＮＢ）、及びＢｅＬａ細胞を含む、　ＣＢ、　ＣＰ５８及びＣＰ ９４はＥＢＶで形質転換したヒトＢ細胞系に由来するＤＮＡである。ＬＴＤ−４ はＴ４°−次り細胞の形質転換体である。　ＲＰＭ！及びＨＳＢ２はＴ４−ヒト Ｔ細胞白血病系であり、Ｅ゛細胞び胸腺リンパ球（Ｔｈｙｍ、）はＴ４”Ｔ細胞 を含む、０Ｔ−ＣＬＬ、Ｊｕｒｋａｔ（Ｊｕｒｋ、）、Ｆｒｏ２．２、ＣＥＭ及 びＭｏ１ｔ４はＴ４’″細胞である０ｇλＭ４はＴ４遺伝子の３′末端に位置す る配列を含むゲノムクローンである。 第５図、レトロウィルス　　　　　で６　　　　　ｔ−ＮＩＢ３Ｔ３か　のＴ４ 　　　ンパ　　の　　２つの独立したＮ１１ｌ　３７３形質転換細胞、末梢Ｔリ ンパ球及び非形質転換３７３Ｍ胞からのタンパク質をＬ−［３ＳＳ］−メチオニ ンで標識し、ヒラマメレクチンクロマトグラフィーにかけ、糖タンパク質を沃化 した。各サンプル２．５ｘ　１０’ｅｐ−を予め清澄化し、その後、０ＫＴ４モ ノクロ一ナル抗体及びタンパク質＾−セファロースで免疫沈降させた。ビーズを 洗い、サンプル緩衝液に溶解させ、還元（レーンａ　＝　ｄ　）及び非還元（レ ーンｅ及びｆ）条件下に１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動さ せた。レーンａは非形質転換ＮＩＢ　３Ｔ３細胞に関する。レーンｈは、Ｔ４Ｃ ２、即ちＴ４−ｐＶｃｏｓ７楕築物で形質転換したＮＩＢ　３Ｔ３細胞に関する 。レーンＣ及びｅは、３＾◆、即ちＴ４−ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏ楕築物で形質転 換したＮ１１ｌ　３Ｔ３細胞に関する。 レーンｄ及びｆは末梢ヒトＴリンパ球に関する。相対分子量（Ｍｒ）をキロダル トンで表す。 第６図、　Ｔ４　ｅＤＮ＾の　　し　　ド　　　びＴ４　　ンパ　　の乱え【１ 本図は、第３Ｂ図に要約した配列決定方法に従って得られたｅＤＮ＾クローンｐ Ｔ４Ｂのヌクレオチド及び予想されるアミノ酸配列図である。アミノ酸配列の上 に示した数字はアミノ酸残基の位置を表す、右側の数字はヌクレオチド位置を表 す、全細胞外システィンには（・）又は（０）を付した。リーダー配列領域（Ｌ ）、可変領域（Ｖ）、結合領域（Ｊ）、トランスメンブラン領域（ＴＮ）及び細 胞周辺（ＣＹＴ）領域を配列の下の水平方向の矢印により示したが、正確な境界 ははっきりしていない、２つの可能なＮ結合グルコシル化部位（＾５ｎ−Ｌｅｕ −Ｔｈｒ）も示した（ＣＨＯ）　。 第７図、　ＳＦ３　　　か　・　　れるｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　’　ＲＮ＾完全な 長さのＴ４　ｃＤＮ＾ＤＮＡ−トをＲＮ＾発現ベクターｐＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅ ｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）にサブクローニングした。開環したプラスミドＤＮＡをＳ Ｐ６ポリメラーゼ（４０）で転写し、ｌ−［３８幻−メチオニンを含有する小麦 筋系（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）で 翻訳した。　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳生成物を１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル中で電気泳動させた（レーンＴ４）、ウシ下垂体ＲＮ＾（ＢＰ）を対照とし て使用した。相対分子量（Ｍｒ）をキロダルトンで示す。 第８図：　　　にまたがるＴ４グリコプローインの、　・Ｔ４ハタンテムｖＪａ Ｉドメイン（ＶＩＪＩ−Ｖ４Ｊ４）と、膜にまたがる（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｐ ａｎｎｉｎｇ）疎水性セグメント（影の部分）と、荷電（ｃｈａｒｇｅｄ）細胞 質領域（ＣＹＴ）とからなる、細胞外部分の２つの潜在的Ｎ結合グリコジル化部 位は（−−−）で示されている。　Ｔ４遺伝子中のインドロン２−８の位置も（ ）で示されてムノ　ロブ１ン　−　　メンバー　の　−インメンートー Ａ、Ｔ４の可変領域アミノ酸配列と、マウスカッパＬ鎖イムノグロブリンＪ６０ ６（６６）、ＴＢ（２０）、ヒトＴ細胞抗原レセプターβ−鋼ＹＴ３５（９７） 及びヒトＴｍ胞抗に１ｙセフ９−ａ−鎖ＨＰＢ−ＭＬＴα（９８）とのアライン メント、Ｌｔｉｉ可変領域内の不変残留物（Ｉｎｖ、）はこのアラインメント中 に含まれる。このアラインメントは、箱で囲まれた残留物として現れるＴ４に対 するアイデンティティ−と構造ホモロジーとを最大化するために行った０文字＾ 、Ｂ、　Ｃ，Ｃ’、Ｄ、Ｅ、及びＣを付した配列の下の線はβ−ストランドを形 成する残留物を示す、β−ストラフトＣはＪ配列中に続いている。 Ｂ、Ｔ４の接続領域（ｊｏｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列とＴ細胞抗 原レセプターβ−鎖のコンセンサスＪ配列、イムノグロブリンラムダ及びカッパ Ｌ鎖、及びヒトＴ細胞しセプターα−鎖のＪ配列とのアラインメント（９９）。 Ｃ，Ｔ４のトランスメンプラン領域とＭＢＣクラスＩＩβ−鎖とのアラインメン ト（１００）　、推定上のトランスメンブランドメイン（ＴＭ）は配列の下に示 されている。 ９つのエキソンの位置をゲノムクローンマツプの作成、サザンプロット分析及び ヌクレオチド配列によって調べた。 リーダー配列（Ｉ、）、可変領域と思われる領域（ｖ）、接続領域と思われる領 域（Ｈ）、トランスメンブラン領域（ＴＭ）及び細胞質（ＣＹＴ）領域は箱で囲 まれている。開始コンセンサス配列で包囲されたメチオニンコドンの位置はリー ダーエキソン（Ｌ）の冒頭部分に示されている（＾Ｔ（：）、終結コドンＴＧ＾ は第２細胞質エキソン（ＣＹＴ）の末尾に示されている。ここに示した大きさの 単位はキロベースである。 第１１図：　　えレトロウィルス　　ベクター　び３Ｆ但１ト１影」【 Ａ１組換えレトロウィルス発現ベクター、　ｐＭＶ７は矢印の方向で直接的に繰 り返される２つのＭｏ１ｏｎｅｙネズミｓａｒｃｏｍａウィルスＬＴＲ（ｌｏｎ ｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｓ）を含む、　ｐＭＶ７はまた、Ｈ５■チ ミジンキナーゼプロモーター（ｔｋ）に融合された細菌ネオマイシンホスホトラ ンスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ）も含む、Ｔ４（Ｔ４Ｂ）（７０）又はＴ８（７ ８Ｆ１）（２０）をコードする完全な長さのｅＤＮ＾インサートを矢印の方向に 従ってＥｃｏ　Ｒ１部位にサブクローンした。夫／Ｊ　Ｔ４−ｐＭＶ７及びＴ８ −ｐＭＶ７が形成された。 コーディング配列は影の部分で示されている。ここに示した大きさの単位はキロ ベースである。 Ｂ、レトロウィルスを介する遺伝子トランスファーの方法細胞に、１０倍ずつで 希釈した一連のエイズウィルス希釈物を接種し、３７℃で１８時間インキュベー トし、洗浄後にマイクロカルチャーでル−ティングした（ｐｌａｔｅｄｉｎｍｉ ｃｒｏｃυ１ｔｕｒｅ）、感染後１２日Ｂｋ、感染培養物の頻度をＥＬＩＳ＾（ ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｏｔ　ａｓｓａｙ） によって調べた（４６）　、結果を、陽性培養物％対つィルス希釈度ｌｏｇとし てプロットした。感染ウイルスカ価（１０−５０）は、培養物の５０％がウィル スに関して陽性を示す時の希釈度の逆数として示す（４７）、自然に単離したＴ ４”細胞は、フィトヘマグルチニン（ＰＩ（＾）で刺激された正常抹消リンパ球 （ト一）とＴ細胞系ＣＥ　Ｍ　（「１）とを含む、トランスフェクションにかけ られた１４′″細胞系はＢ５Ｂ２−７４’Ｔ細胞虻ｊ）とＲａｊｉ−Ｔ４”Ｂ細 胞（１−１１）とを含む、トランスフェクションにかけられたＴ８”細胞系ＨＳ Ｂ２−７８”及びＲａ　ｊ　ｉ　−７８”　（Ｉ）−（，１）は、これらの検査 の対照として使用した。 Ａ、２ｘｌＯ’の単層ＨｅＬａ−Ｔ４’形質転換細胞を２ｘｉＯ’のエイズウィ ルス産生Ｈ９細胞と混合し、３７℃でインキュベートした。 １８時間後に培養物を調べたところ、単層シート中の核の９０％以上がシンリチ ウム中に含まれていた。 Ｂ、接種時に抗Ｒ４＾モノクローナル抗体（１：２０）を前記混合培養物に加え た。１８時間後に培養物を調べたところ、細胞融合は全く見られなかった。 培養物を倍率１６０ｘで撮影した。 第１４図：Ｌ４］　　　　　　へのエイズウィルスｒへの′　細鳳１」■目１ コラムＡ、細胞（５ｘｌＯ％）をフルオレセイン結合抗Ｔ４屓−−−）又は抗Ｔ Ｂ（−−−）モノクローナル抗体と共にインキュベートし、細胞蛍光定量法（ｃ ｙｔｏｆ　ｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ）によって分析した。 抗体Ｂ、細胞（５ｘｌＯ’）をバッファ（−−−）又はエイズウィルス（−）と 共にインキュベートし、洗浄し、フルオレセイン結合抗エイズウイルス抗体と共 にインキュベートし、細胞蛍光定量法によって分析した。 コラムＣ４Ｈ胞（５ｘｌＯ’）をバッファ（−−−）又はエイズウィルスの前の 抗Ｔ４＾モノクローナル抗体（□）もしくはエイズウィルスの前の抗ＴＢモノク ローナル抗体（−−−）と共にインキュベートした。洗浄後、フルオレセイン結 合抗エイズウイルス抗体を加え、細胞を細胞蛍光定量法によって分析した。 各細胞系の蛍光ヒストグラム（細胞数対蛍光強度）は水平にアレンジされる。 第１５図：ヒト　びマウス′　　　１ンパ・　　Ａ　　　から；シｔ−ＲＮ＾の ノー　ンプロット Ａ、ヒトＲＮ＾試料のノーザンプロット分析、　Ｒａｊｉ（Ｔ４−Ｂ細胞系）、 Ｕ９３７（Ｔ４’単球細胞系）及びＪｕｒｋａｔ（Ｔ４”Ｔ細胞系）がらのポリ （＾）”ＲＮＡ　１マイクログラムと、大脳皮質からのボ上にプロットし、）２ Ｐ−標ｍＴ４ｃＤＮ＾インサート、ｐＴ４Ｂ（７０＞でプローブした。 Ｂ、マウスＲＮＡ試料のノーサンプロット分析。前脳及び後脳３Ｔ３細胞（線維 芽細胞系）からのポリ（＾）”ＲＮ＾５マイクログラムと、胸脹からの総ＲＮ＾ ２０マイクログラムとを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルを介して電気泳 動にかけ、１ｙｂｏｎｄ上に移し、コ２Ｐ標識Ｌ３Ｔ４ｅＤＮ＾インサート、ｐ Ｌ３Ｔ４ＢでプラスミドｐｓＴ４ＤＨＦＲは、Ｔ４のリーダー及び細胞外セグメ ントをコードするＴ４ｃＤＮ＾クローンｐ７４Ｂのｂｐ　１−１２５７を含むｐ Ｕｃ１８誘導体である。このｓＴ４　ｅＤＮ＾をＳＶ４０初期（ｅａｒｌｙ）プ ロモーターとウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化領域の前のＴ＾＾終結コ ドン（インセット）を含む合成リンカ−との間に挿入する。　ｓＴ４発現カセッ トは、β−グロビンプロモーターとマウスｄｈｆｒコーディング配列とＳＶ４０ ポリアデニル化領域とで構成されたマウスｈｄｆｒ発現カセットに結合する。 第１７１二　゛ヒストゲーム（細　　　　゛　　）ｓＴ４はＴ４°ＣＥＭ細胞へ のＨＩＶの結合を阻止する。細胞をバッファ（・−・−・−）か、ｓＴ４と共に 予めインキュベートしたＩＩＩＶ（〜）か又は非形質転換ＤＸＢ−１１細胞（− −−）からの濃縮対照上澄みと共に予めインキュベートした［］ＩＶと共にイン キュベートし、洗浄し、フルオレセイン結合抗１１１Ｖ抗体に＆露し、細胞蛍光 定量法によって分析した。蛍光ヒストグラム（細胞数対蛍光強度）を示す。 第１８図：ｓＴ４に　　ＵｔＶ＃−の ＨＩＶイノキュラムの感染性滴定（ＩＤ−５０アツセイ）を行った。 １０倍ずつ希釈した一連のウィルスイノキュラム希釈物をインジクーター細胞（ Ｐ）Ｉ＾で刺激したヒトリンパ球）と共に１８時間インキュベートする９次いで 細胞を洗浄し、マイクロカルチャーでブレーティングする（培養当たり１ｘｌＯ ５の細胞、希釈物当たり１０の培養）、４日目、８日目及び１２２日目、抗原捕 捉アッセイによって上澄みを検査し、ＨＩＶを調べた。 ａｒｍの接種の３０分前にＨＩＶ希釈物に加え且つ実験の間中培養培地中に維持 した９、６ｐｇ／ｍｌのｓＴ４　を含む媒質（０）、又は最初の１８時間のイノ キュラムの後で導入したｓＴ４を含む培地（Ｑ）、あるいはｓＴ４を含まない培 地（ロ）（対照）中でＩＤ−５０滴定を行った。 Ａ、８日目にＢＩＶに関して陽性を示した培養物％対つィルスイノキュラム希釈 度のプロット。 ８．４日目の、８日目及び１２２日目ＩＤ−５０（培養物の５０％が陽性を示す 時のウィルス希釈度の逆数）のプロット。 Ｃ，ＢＩＶの１０−　’希釈物を使用した場合の、８日目に旧Ｖに関して陽性を 示した培養物％対種々のｓＴ４濃度のプロット。 （以下余白） 光浬ｍ農 本発明は、ポリペプチドを含有するヒト免疫不全ウィルスエンベロープグリコプ ロティンと複合体を特異的に形成し得る治療薬を提供する０本発明の１つの実施 Ｂ１１１におけるポリペプチドのアミノ酸配列は、第６図に示したアミノ酸配列 約＋３５１から約＋３６９に融合したアミノ酸配列約＋３から約＋１８５を含む ０本発明の別の実施態様におけるポリペプチドのアミノ酸配列は、第６図に示し たアミノ酸配列約＋３５１から約＋３６９に融合したアミノ酸配列約＋３から約 ＋１０６を含む１本発明の更に別の実施態様におけるポリペプチドのアミノ酸配 列は、第６図に示したアミノ酸配列約＋３から約＋１８５を含む。 更に本発明は、ヒト免疫不全ウィルスに感染した患者を治療するための治療薬と して有効な医薬的組成物を提供する。この医薬的組成物は、ヒト免疫不全ウィル スエンベロープグリコプロティンと複合体を特異的に形成し得て且つ水溶液に可 溶性を示す本発明のアミノ酸配列と、医薬的に許容可能なキャリヤとを含有する 。かかる医薬的に許容可能なキャリヤは、本発明が関与する分野では公知であり 、限定的ではないが、０．０１〜０．ＩＭ、好ましくは０．０５Ｍのホスフェー トＭ街液または０．８％生理食塩水を含む。 更に本発明は、ヒト免疫不全ウィルスに感染した患者の治療方法を提供する。こ の方法は、患者に感染した免疫不全ウィルスを７４”細胞に感染できないように するために、患者に、医薬的に許容可能なキャリヤと、ヒト免疫不全ウィルスエ ンベロープグリコプロティンと複合体を特異的に形成し得て且つ水溶液に可溶性 を示す本発明のアミノ酸配列とを含有する医薬的組成物を有効量投与することか らなる。 ｓＴ４タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏ生化学的及び免疫学的特性の特性化は、こ のタンパク質がＡＩＤＳの予防及び治療に価値があることを示した。研究によっ て、ｓＴ４タンパク質はウィルスの細胞外及び細胞から細胞への伝播の阻害剤と して作用することが判った。培養において、ｓＴ４はウィルスがＴ４゜標的細胞 に結合するのを遮断することが判ったので、ｓＴ４を感染者に投与すると、ウィ ルスの細胞外伝播を阻害するように作用するであろうと考えられる。従ってｓＴ ４は、ＡＩＤＳ治療の予防薬及び治療薬の両方として価値がある。 予防薬としてのｓＴ４は、この病気に対して高い危険性を有する個体、またはウ ィルスに対する抗体の存在によってＢＩＶに暴露されたことが判る個体に投与さ れる。病気の早期段階または徴候が現れる前に有効量のｓＴ４を投与すると、Ｔ ４°リンパ球の旧Ｖ感染を阻害するように作用する。治療薬としては、旧Ｖに感 染した人にｓＴ４を投与すると、ウィルスの細胞外伝播を阻害するように作用す る。 ）１１Ｖ感染細胞と他のＴ４°リンパ球との融合もまたウィルス伝播の経路であ るらしい、更に融合は、感染個体におけるＴ４’リンパ球機能の損傷及び最終的 にはＴ４°リンパ球の喪失の一部原因となり得る。細胞融合は、ウィルスエンベ ロープ遺伝子産生物及びＴ４レセプタの両方に依存し、０ＫＴ４Ａまたは類似の モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）（１２０）によって阻害され得る。　ｓＴ４は 細胞融合に干渉し、従ってウィルスの細胞から細胞への伝播及びＴ４’″リンパ 球機能の損失を減少させることが期待される。 Ｔ４レセプタは同一構造であって、ｓＴ４は、全てのＩＩＩＶを含む、Ｔ４レセ プタの表面ドメインを認識するウィルスの共通の阻害剤であると思料される。 ｓＴ４は他の薬剤と組み合わせて、例えば逆転写酵素、プロテアーゼまたは世の ごとき他のＨＩＶタンパク質に対する薬剤と共同して使用することができる。　 ＨＩＶに対する有効な治療薬は、ウィルス媒介の感染及び細胞から細胞への伝播 を防止すべきである。更にｓＴ４は、他の抗ウィルス剤、例えばアジドチミジン （＾ＺＴ）と組み合わせて使用してもよい。 本発明のｓＴ４タンパク質は、Ｔ４”細胞機能の阻害剤としての有効°性も有す る。多くの研究によって、免疫耐性、特に自己免疫疾患の発病及び進行並びに宿 主特異的移植片拒否反応におけるＣＤ４レセプタ（ＣＤ４はヒトＴ４レセプタ及 び他の哺乳動物細胞におけるそΩ該等物質に対する一般用語である）の重要な役 割が示された。　ｓＴ４に特に関係するのは抗ＣＤ４８ａｂｓを用いた観察であ る。これらのＣＤ４レセプタとの会合によって、これらのＭａｂｓの特定のもの は自己免疫応答及び移植片拒否反応改善する。かかる作用の例としては、Ｔ細胞 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ機能、例えば特定の抗ＣＤ４８ａｂｓによる抗原誘導性増殖、 リンホカイン分泌及びヘルパー細胞機能の障害、マウス狼癒の徴候を阻害するた めの抗ＣＤ４８ａｂｓの投与による全身性狼癒紅斑（ｓｙｓｔｅｍｉｅ　Ｉｕｐ ｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）の治療、並びに、マウスＣＤ４レセプタに 対するマウスＭａｂを１回投与することにより同種移植が受容されるマウスにお ける移植研究を挙げることができる。 ＮｍｂがＣＤ４に結合した結果の分子は明確ではないが、Ｎｉｂ５はＣＤ４とそ の配位子との会合を遮断することができる。この配位子はＭＢＣクラス■抗原（ １２１，１２２）における保存エピトープであることが立証されている。しかし ながら、これらの同じＭａｂｓの少なくとも幾つかは、見掛けのクラス■独立経 路によってＣＤ４細胞活性化を阻害する。 更にｓＴ４は、恐らく、通常はＴ４レセプタの表面ドメインと相互作用する細胞 外標的分子に結合することにより、Ｔ４細胞の拮抗物質としてＴ細胞相互作用を 阻害すると思料される。　ＭａｂｓとｓＴ４との区別は、重要な機能車結果をも たらした１例えば、Ｔ４に対する幾つかのＮｉｂ５はＴ４細胞において応答を引 き出す一方、ｓＴ４は、ＮｌＩＣクラス■抗原を発現する細胞において応答を引 き出すことができる。また、Ｔ４のその推定クラス■配位子に対する親和性は、 Ｔ４に対するＭａｂｓの親和性が高いのと比較すると極めて低いようである。従 って、Ｍａｂｓ及びｓＴ４は同じ過程に干渉し得るが、異なる標的分子及び異な る標的細胞に影響を及ぼす。 予防薬または治療薬として、Ｔ４は非経口、好ましくは静脈内投与される。薬剤 は、点滴または注射によって、例えば毎日、毎週または毎月投与することができ る。ｓＴ４投与の量及び割合は、血液中に有効量のｓＴ４が維持されるよう゛　 　に選択される。別の投与態様としてはｓＴ４を透析剤として使用する体外投与 がある。 更に本発明のｓＴ４タンパク質は、Ｔ４’細胞相互作用の治療薬または阻害剤と して作用する天然、合成または組換え分子に対する試薬として使用することがで きる。 例えば、ｓＴ４タンパク質は、Ｔ４レセプタの表面ドメイン相互作用の拮抗物質 を分析するための他の試薬と組み合わせて使用することができる、生化学的に純 粋な水溶性試薬を提供するための、ＥＬＩＳ八に基づく方法によって測定される タンパク質相互作用の分析といったふるい分は分析に使用することができる０例 えば、ｓＴ４はＩＩＩＶ　ｅｎｖタンパク質又はＨＩＶ士タンパク質を含有する 混合物に結合するので、これは、ウィルス結合の阻害剤のふるい分けに使用する ことができる。　ｓＴ４がＨＩＶ　ｅｒ＋ｖタンパク質を発現する細胞に結合す ることを示すｉｎ　ｖｉ工臼データに基づき、ｓＴ４も、ＩＩＩＶｉｎ　ｖｉｖ ｏ感染細胞に対する選択的標的分子として作用することができる。標的特異的キ ャリヤタンパク質として、ｓＴ４は、例えば、感染細胞に対する細胞障害剤の分 配のためのキャリヤタンパク質として作用することができる。 更にＴ４レセプタが、Ｔ４’細胞のクラス制限によって示されるような抗原提供 細胞におけるＭＨＣクラス■抗原と特異的に会合することを示すデータに基づき 、Ｔ４のリンパ球−標的細胞相互作用の阻害剤をテストするために、ｓＴ４をク ラス■抗原と組み合わせて使用することができる。　ｓＴ４とその標的分子との 間の直接結合分析に基づいた上記例に加え、ｓＴ４認識に対する生化学的応答に 依存するより複雑な分析を行なうことができる。 更に本発明は、そのアミノ酸配列が第６図に示したアミノ酸配列約＋３５１から 約＋３６９に融合したアミノ酸配列約＋３から約＋１８５を含むポリペプチドを コードする発現ベクターを提供する０本発明の別の実施態様においては、発現ベ クターは、そのアミノ酸配列が第６図に示したアミノ酸配列約＋３５１から約＋ ３６９に融合したアミノ酸配列約＋３から約＋１０６を含むポリペプチドをコー ドする０本発明の更に別の実施態様においては、発現ベクターは、そのアミノ酸 配列が第６図に示したアミノ酸配列約＋３から約＋１８５を含むポリペプチドを コードする。 更に本発明は、本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する０本発明の １つの実施態様においては適当な宿主は細菌細胞である０本発明の別の実施態様 においては細菌細胞はＥｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　Ｃｏ１１細胞である０本発明の 更に別の実施態様においては適当な宿主は真核細胞である０本発明の更に別の実 施態様においては、真核細胞は哺乳動物細胞である０本発明の更に別の実施態様 においては真核細胞は酵母細胞である０本発明の更に別の実施態様においては適 当な宿主は昆虫細胞である。 更に本発明は、Ｔ４レセプタの予測される細胞外ドメインで構成されるｓＴ４を 生産する手段を提供する。　Ｔ４　ｃＤＮＡのＴ４レセプタのリーダードメイン 及び細胞外ドメインをコードする部分、即ち前ｓＴ４を使用し、哺乳動物におい てｓＴ４を過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）できるベクターが構成さ れる。１つのｓＴ４の配列は以下の通りである。 ｇ”ｉｊＥ”３５；″３ミＥ″Ｍ５ａ″Ｕ七　　　吋　　　七ぶ　　　七二　　 　ごご）４　　　　　　ｕ＜　　　　　　＜Ｉ−Ｉ　　　　　ｃ＜　　　　　　 ｕａｌ　ロ喫ＩＪ＊　　０１Ｃ５−０喫ｕＯｏ喫ｓｓ　　０４Ｃり５　０４＋（ Ｊ＃１’　　”：’＋　　＜Ｏ’：　　３５　　”：　　、；＝　　Ｘ　　’７ ２：　　ｇ　　５３　　”Ｓ　　ｌ：ｉｅトへ　　　トロ　　　０−（Ｊｌ−＋ 　　　　＜Ｏ←へご謂　　　＝５　　　七）　　　ミよ　　　８よ　　　ご５ｓ ＴＡ用コーディング配列は、例えば公知のＤＮＡ配列を使用する遺伝子の合成、 配列に基づく標準クローニング技術及びタンパク質の探知による再単離、即ちｃ ＤＮ＾ＤＮＡンのＴ４発現細胞系からのトランスフェクション及びタンパク質に 対する抗体による識別により得られる。　ｓＴ４コーディング配列を担うｃＤＮ ＾ＤＮＡンはオリゴヌクレオチドハイプリゼーションプローブの使用により識別 される。プローブはＴ４タンパク質の公知の配列に基づき設計されている。ｓＴ ４コーディング配列を担うクローンを識別したコーディング配列は制限エンドヌ クレアーゼを使用して削除され（ｅｘｅ　１ｓｅｄ）、クローニング及び／又は 発現ベクターに挿入される０発現ベクターでは、ｓＴ４コーディング配列はコー ディング配列の転写、翻訳及び処理に必要な又は所望される調節機能に有効に（ ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合されている。 調節機能は、例えば転写配列のポリアゾニレ−ジョン及び増進のような他の機能 と同様に、ＲＮ＾ポリメラーゼ結合及び転写に必要な機能を含んでいる。プロモ ーターは、例えば発現が形質転換クローンの転写及び選択後まで誘発されないよ うに調整し得る０本発明の実施に有効なプロモーターは例えばＳＶ４０初期プロ モーター及びラウス肉種ウィルス、モロニー肉種ウィルス又はサイトメガロウィ ルス（ＣＭＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ’　ｓ）を含んでいる。 転写に先立ち、ｓＴ４ミニ遺伝子、即ちＴ４受容体のリーダーと細胞外ドメイン とをコードする遺伝子は、遺伝子選択マーカー系を含むより大きいＤＮＡ分子内 に組み込まれるのが好ましい０選択マーカー系は、トランスフェクトされた宿主 細胞内に検知し得る表現型変化を容易に引き起こす任意の遺伝子からなる。かか る表現型の変化は、例えばフォーカス形成又は薬剤耐性であってもよい、このよ うな遺伝子として例えばＧ４１８又はハイグロマイシンＢに対して耐性の遺伝子 がある。又は、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｘｇｐ ｒｔ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）及びガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）のような 他の選択マーカーがある。遺伝子増幅を可能とする選択マーカーは、トランスフ ェクション効率を増して、又は問題の遺伝子及び選択マーカーの細胞内複製を増 進させてコピー数を増大させるために使用され得る。遺伝子のコピー数の増幅に も役立つこのようなマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（メトトレキセート 耐性）、ＣＡ　Ｄ　（Ｎ−ホスホンアセチル−し−アスパルテート耐性）及びア デノシンデアミナーゼ（２−デーオキシコホルミシン（ｏｘｙｃｏｆｏｒＢｅｉ ｎ）耐性）用遺伝子を含んでいる。 哺乳頂の細胞での転写及び翻訳の後に、リーダー配列が開裂して現れ、成熟Ｔ４ がならし培地内に生成される。 本発明の好ましい実施例では、ｓＴ４ミニ遺伝子は人間のト工又はマウスのジヒ ドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のミニ遺伝子に結合されて発現ベクターを作 製する。 ｓＴ４ミニ道伝子は、例えば選択マーカー及びこれらの遺伝子とのコートランス フェクションを通じて遺伝子発現を選択的に増幅する手段を提供するために、人 間のＨ−ｒａｓ又はマウスのＤＨＦＲに結合されている。共通の選択マーカーは 、例えば問題の遺伝子の単一コピーと同じように少ない組み込みのために選択す るＤＩＩＦＲ，に４１８又はハイグロマイシンを含んでいる０例えばＤＨＦＲ系 のメトトレキセート（ｍｔｘ）との増幅の結果、遺伝子が過剰発現する。 遺伝子の増大した発現の代替手段は、■１０トー腫瘍遺伝子の使用を含んでいる 。■遺伝予科は■−ｒａｓ、に一μ及びＮ−±遺伝子を含んでいる０本発明の好 ましい実施例では、Ｈ−黒遺伝子を使用する。 他のＤＮＡ機能をｓＴ４ミニ遺伝子に直接的に若しくは非直接的に結合すること ができ、又はこのような機能を結合しないこともできる。＾ｘｅｌの米国特許第 ４，３９９，２１６号を参照のこと。 哺乳類細胞での遺伝子生成物の過剰発現は、一時的な又は安定した手段により行 われ得る。一時的な過剰発現は、ワクシニアウィルスベクターの使用のようなウ ィルス方法又は５Ｖ−４０複製を支持する細胞内の５Ｖ−４０ベースのベクター を使用するような遺伝子増幅方法により行うことができる。 これらの方法は最終的に細胞の死につながる。安定した過剰発現は、マルチプル 遺伝子コピーの世代、例えば遺伝子増幅用選択又はエプロトー腫瘍遺伝子の使用 を通じて行われ得る。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子系を使用するコートランスフェクションによるｓＴ４タンパク 質の過剰発現は、多くの異なる細胞系を使用して行われ得る。好ましい細胞系は 接触阻止したマウスの繊維芽細胞の細胞系であるＮ１１ｌ−３Ｔ３細胞系である 。他の細胞系は正常ラットの腎臓（ＮＲＫ）（ＡＴＣＣ１５７１）の細胞系及び ラットの胚の繊維芽細胞５２（ＲＥＦ−５２）の細胞系（１１５）を含んでいる 。 選択マーカー系、例えば遺伝子コピー数の増幅が選択的増幅により行われるメト トレキセートを有するＤＩＩＦＲ（ＤＨＦＲ／ＭＴＸ技術）を使用するとき、中 国のハムスターの卵巣の細胞系（ＣＨＯ）が好ましい、特に、ＤＩＩＦＲの欠如 したＣＯＯ細胞が使用される（１１６）、使用し得る他の細胞の型は、例えばＤ ＨＦＨになるように変えられた任意の哺乳類の細胞を含んでいる。 あるＤＨＦＲ’細胞の型は、メトトレキセートに対して正常ＤＨＦＲ（＾×ｅ１ ．米国特許第４，３９９，２１６号）はど感受性のない突然変異ＤＨＦＲ遺伝子 と組み合わせて使用し得る。一般に、ＤＨＦＲ”細胞は正常ＤＢＦＲ遺伝子及び 付加的優性選択可能遺伝子例えば６４１８耐性用遺伝子（１１７）を使用し得る 。トランスフェクションは標準技術を使用して実施する（１１８，１１９）　。 これらの技術は、例えばリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストリン誘発ピ ノサイトシス、エレクトロポレーション及びウィルストランスフェクションを含 んでいる。 トランスフェクションの後に、選択可能な遺伝子の増幅を可能とする条件下で、 ｓＴ４ミニ遺伝子を担う細胞を普通培地で培養する。標準の哺乳類細胞の培養基 、例えばヒボキサンチン及びチミジンがなく１０％のウシ胎児血清を含むＦ１２ 培地（ＧｆＢＣＯ，グランドアイランド、ニューヨーク）を使用し得る。細胞培 養は３０〜４５℃の常圧で維持する０選択後生き残り、また高レベルのｓＴ４タ ンパク質を発現する細胞は、更に培養を行うために選択される。このような細胞 を選択的条件下で培養し、製品であるｓＴ４タンパク質を採取して精製する。 本発明の実施例で使用し得る細胞培養方法は、例えば付着細胞の使用又は浮遊さ せた細胞の培養を含んでいる。ならし培地（ＣＭ）は浮遊させて又は固形支持体 に付着させて培養した細胞から採取することができる。即ち、ＣＭは回転瓶で又 は固形支持体で成長させ、また浮遊させて又は流動体化した若しくはパックした ベッドで培養した付着細胞から準備する。ＣＭは撹拌したタンク容器の浮遊細胞 がち準備する。 （以下余白） 本発明のｓＴ４は、Ｔ４の細胞外ドメインの誘導体を含む。 そのような誘導体は付加、欠失及び置換を含み、これらの変更はならし培地中へ のタンパク質分泌及びタンパク質のＨＩＭ　ｅｎｖタンパク質即ちｇｐ１２０へ の親和性に甚だしい悪影響を及ぼさない０例えば、１個または数個のアミノ酸を Ｎ末端またはＣ末端に付加し、またはこれらの末端から除去し得る。あるいはま た、１個または数個のアミノ酸、好ましくは４個未満のアミノ酸を内部アミノ酸 に挿入し、内部アミノ酸から除去し、または内部アミノ酸と置換し得る。他の場 合には、ｓＴ４とタンパク質キャリヤ、別の抗原または他のｓＴ４分子との間に ハイブリッドタンパク質即ち翻訳融合体を形成してポリｓＴ４分子を実現するこ とも可能である。 更には、ｓＴ４はキャリヤ分子に合成的に結合させ得る。 ｓＴ４誘導体の一例を後出の実施例に示す〈実施例３参照）。 ｓＴ４のＨＩＶ　ｅｎｖ−親和性は、既知の親和性を有するｓＴ４分子を用いる かまたは０ＫＴ４及び０ＫＴ４＾のようなＴ４レセプターを識別する抗体を用い る競合的結合測定法によって指示することができる。有用な本発明の誘導体ｓＴ ４分子は、実施例３に示したように０にＴ４＾によってならし培地から選択的に 析出させることができる。誘導体は発現後化学的に、またはリーダー及び／また は細胞外ドメインのためのコーディング配列を操作することによって発現前に遺 伝学的に製造し得る。 本発明のｓＴ４は使用済み培地から、様々なタンパク質精製技術、例えば親和性 クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラ フィー、疎水性クロマトグラフィー琥たは逆相クロマトグラフィーを用いて精製 し得る。 ｓＴ４は通常の基特異的吸着剤、例えば炭水化物結合リガンドまたは染料親和性 リガンドを用いるか、またはｓＴ４と特異的に結合するリガンド、例えばモノク ローナル抗体またはＨＩＶ　ｇｐ１２０タンパク質もしくはその一部を用いる親 和性クロマトグラフィーで精製できる。 精製は例えば、（１）無血清選択成長培地で細胞を成長させること、（２）なら し培地を澄明にすること、及び（３）本発明のｓＴ４をならし培地中に存在する 他のタンパク質から分離することを含む。 好ましい方法において、ｓＴ４は無血清培地から、ｓＴ４分子の物理特性に基づ く一連のクロマトグラフィー操作を用いて精製する。同様のクロマトグラフィー 法を用いてｓＴ４を血清含有培地から精製することも可能である。 ｓＴ４精製の好ましい一方法では、初めに培地をイオン交換カラム、好ましくは Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅゝ（スルホプロピルセファローズ）カラムに通し、この カラムはｓＴ４と結合する一方で大部分の汚染タンパク質を通過させる０次いで 、線形塩勾配を用いてタンパク質試料を溶離させる。第２のイオン交換カラムを 用いる。好ましくはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ’　（第四アミノエチルセファロー ズ）カラムであるこのカラムは、試料中に存在する汚染タンパク質が該カラムと 結合し、一方ｓＴ４は結合せず、カラムを貫流緩衝剤から回収されるような特性 を有する。最後に、残留汚染物質を除去するべく機能するゲルが過カラムを用い る。 ｓＴ４精製の別の方法では、ｓＴ４に対するモノクローナル抗体を用いる。　ｓ Ｔ４に対するモノクローナル抗体と結合する親和性ゲル支持体に澄明にした培地 を通すことにより、ｓＴ４タンパク質を１操作で精製できる。　ｓＴ４は抗体結 合部位でカラムに結合し、一方汚染タンパク質は総てカラムを通過する。その後 、ｓＴ４をカラムから、ｓＴ４タンパク質の不活性化を防ぐ条件下に溶離する。 本発明は更に、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパク質との複合体を特 異的に形成し得る上述の治療剤のうちのいずれかを製造する方法で、治療剤の製 造を可能にする適当条件下に本発明のホストベクター系を成長させること、及び 製造した治療剤を回収することを含む方法を提供する。 ｓＴ４は、Ｔ４タンパク質または該タンパク質と相互に作用する分子を検出する 診断測定法に用いることができる１例えば、Ｔ４及び■４°細胞並びにＴ４に対 する抗体の定量はＡＩＤＳ治療において価値が有る。 ｓＴ４はまた新規な診断試薬、例えば標準的な免疫測定法、即ちＥＬＩＳ＾、捕 獲イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ用のＭａｂまたは他の種類の分子の発 生に用いることもできる。　ｓＴ４は、０にＴ４．０ＫＴ４＾、及びＴ４レセプ ターの他の表面エピトープのほとんどかまたは総てを指示するので、系中のＴ４ レベルの絶対的定量に適用できる免疫診断測定法で特に有用である。現在、Ｔ４ レセプタ一定量のための基準は無い。 Ｔ４レセプターは、三つの異なる化学的環境、即ち酸化親水性細胞表面、疎水性 膜、及び還元親水性細胞質に存在する。これらの異なる環境がレセプターの、そ の完全な自然状態での単離を防止すると考えられる。細胞外ドメインのみから成 るｓＴ４は可溶性タンパク質として細胞表面物質中に分泌され、そのコンホーメ ーションはレセプター表面ドメインの表面を模倣するようにみえる。即ち、ｓＴ ４は詳細な構造分析、特にＸ線結晶学に適当である。ｓＴ４単独、または他の相 互作用分子との複合形態を取るｓＴ４の三次元構造を決定することによって、ｓ Ｔ４に関する選択的拮抗物質及び作用物質の理論的設計のための基礎が提供され る。 本発明の提供する様々なＡＩＤＳ予防及び免疫法は、ここに開示した新規なタン パク質、抗体及びＤＮＡ分子が特定分子との複合体またはハイブリッドを形成し 、ＡＩＤＳウィルスの中和に有効な免疫学的応答を実現する能力に基づく１本発 明の分子、該分子の製造方法及びＡＩＤＳ治療方法は、説明のなめに提示したも ので請求の範囲各項に規定した本発明の範囲を全く限定しない次の実験及び実施 例を参照することによって更に良く理解されよう。 材料および方法 細胞および抗体 Ｆｉｃｏｌｌ　Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離した末梢自白血球 はヒツジ赤血球細胞ロゼツト陽性（Ｅ”）１１１１に分画した。 このＥ＋集団内のＴ４”サブセットとＴ８＋サブセットを、抗−Ｔ８抗体と、ア フィニティー１ｆｊウサギ抗−マウスＩｏＧ（１０）に結合したヒト赤血球を用 いたＴ８担持細胞の陽性選択によって単離した。これらのサブセットをサイトフ ルオロメトリーで分析したところ、Ｔ４＋細胞はＴ４＋が９５％、Ｔ８”が２％ で、Ｔ８”細胞はＴ８＋が９５％、Ｔ４＋が２％であることが示された。 Ｆｒｏ　２．２　Ｔセルライン（Ｔ３−１Ｔ４＋、Ｔ８＋、Ｔ１１＋）は、未分 化型急性白面病の成人患者から得た。ＪＬｌｒｋａｔｔはＴ、ｌ　、Ｔ４”　、 Ｔ８”　、Ｔ１１−であり、ＲＰＭＩ８４０２はＴ３−　、Ｔ４’−、Ｔ８−　 、Ｔ１１＋である。０Ｔ−ＣＬＬは慢性のリンパ性白血病であり、Ｔ３＋、Ｔ４ ＋、Ｔ８−１Ｔ１１＋である（２２）。Ｔ４＋セルラインのＣＥＨとＭｏ１ｔ　 ４はＡＩｅｒｉＣａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１−ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎか ら入手した。白血病Ｔセルラインはすべて、５％ウシ胎児血清を含有するＲ　Ｐ Ｍ　Ｉ　１６４０培地で連続的に増殖させた。形質転換したＢセルラインＣＢＳ ＣＰ５８およびＣＰ９４は既に記載されている（２３）ようにして得た。 アフィニティー精製したウサギ抗マウスＩＯＣは塩化クロム法（２４）によって ヒト赤血球に結合した。 し細胞とＮＩＨ３Ｔ３細胞の同時形」亙１ネズミＬ　ｔｋ−ａｐｒｔ−細胞は、 １０％ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）と５０埒／Ｉ１１ジアミノプリン（ＤＡＰ）を補 充したＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥ）中に維持した。Ｌ細胞を 、形質転換の１日前に１０ｃｍの皿毎に５　ｘ　１０’の細胞密度でプレートア ウトした。 リン酸カルシウム沈澱物は、Ｗｉ（ｌｌｅｒら（２６）によって改変されたＧｒ ａｈａｉとｖａｎ　ｄｅｒ　［ｂの方法（２５）により、回当たり１００　ｎｇ のｐＴＸと２０〜の高分子ＩＴ細胞またはし細胞ＤＮＡを用いて調製した。次の 日、Ｌ細胞を１０％ウシ血清、ｔｓｐ９／ｄヒボキサンチン、１１１１／ＩＩ＆ アミノプテリンおよび５ｔａ／ｄチミジンを含むＤＭＥ　（ＨＡＴ培地（２７） ）中で選択下に配置した。ｔｋ＋形質転換体は、１２〜１４日のＨＡＴ選択の後 ロゼツトアッセイを用いてスクリーニングした。 ネズミＭＩＮ　３Ｔ３細胞は、１０％新生ウシつＷ１（Ｇｉｂｃｏ）を補充しＤ ＭＥ中に維持した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、形質転換の２日前に１０備の皿毎に５ 　Ｘ　１０’の細胞密度でプレートアウトした。これらの細胞に、１０１５のキ ャリヤーＤＮＡならびに１０Ｊ！ｓのＴ４−１）ＨＶ６ｔｋ／ｎｅｏまたは１０ Ｉ４のＴ４−ｐＶｃｏｓ７および５００　ｎｇのｐＳＶ２ｎｅｏを用いてリン酸 カルシウム沈澱物を適用した。２日後、これらの細胞を１０％ウシ血清とｓｏｏ ＃／ｄの０４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ■、Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥ中で選択 下に配口した。選択培地中で１週間増殖させた後生き残るコロニーに対してロゼ ツトアッセイを実施した。 ロゼツトアッセイ プレートをリン酸！ｌ衝生理食塩水（ＰＢＳ）で−回すすいだ後、そのプレート を、５％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳに１１５００に希釈した精製モノクロー ナル抗体ＯＫ　Ｔ　ｌ８１４Ａ（１η／ｄ）２．５ｄと共に室温で４５分間イン キュベートした。このプレートをＰＢＳで五目穏やかにすすいで遊離の抗体を除 いた。精製したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体に結合したヒト赤血球（２％Ｖハスド ック懸濁液、ＰＢＳ１５％ウシ胎児血清中に１７１０に希釈）６−を加え、その プレートを室温に放置した。４５分優、ロゼツト陽性コロニーの検査に先立って Ｔ１＃ｌの赤血球を穏やかに吸引し、ＰＢＳを加えた。 サイトフルオロメトリー分析 接着性細胞をＰＢＳ中の０．００５　ＭのＥＤＴＡで取出し、１％ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）と０．０１％ナトリウムアジド（（ｙｔｏｗａｓｈ）を含有す るＰＢＳで一回洗った。０．１ｄ中の細胞６　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　■（５ｘ１０　　）　を適当に−Ｎ釈したＯＫＴ　　４、ＯＫ　Ｔ 　Ｏ８ｔ　ｔｃ　ハコントロール抗体と共にチューブに入れた。この細胞−抗体 混合物を４℃で４５分間インキュベートした後ｃｙｔｏｗａｓｈで三回洗った。 細胞にフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウスＩ　ＯＧ＋ Ａ＋Ｍ　（Ｃａｐｐｅｌ）を加え、４℃で１時間インキュベ、−トした。次いで 、細胞をｃｙｔｏｗａｓｈ中で五目洗い、０．０１％ナトリウムアジドを含むＰ ＢＳｏ、Ｓｄ中に再懸濁した。 この細胞をＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣ３■セルソーターで分析 し、データをためてＶＡＸ　１１／７８０Ｄンビユーター（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｅ ｑｕｉｐｍｅｎｔＣＯ８）を用いてプロットした。 ＲＮＡとＤＮＡの単離 細胞を４Ｍチオシアン酸グアニジニウム中でホモゲネーションして全ＲＮＡを単 離した後、５．ＩＭのＣａＣＮ２を通して超遠心した（２８）。オリゴ（ｄＴ） −セルロースクロマトグラフ−ｒ−（Ｔｙｐｅ３、Ｃ０１ｌａｂＯｒａｔｉＶｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　（２９）によってポリ（Ａ）＋を選択した。−１ｇ１ｅ ｒら（２６）により記載されているようにして高分子壊のゲノムＤＮＡを：Ｉ製 した。 ＣＤＮＡおよびゲノムライブラリー ヒト末梢ＴＩＢＩｎから得たポリ（Ａ）”ＲＮＡから二本鎖のＣＤＮＡを合成し た（２０）。ＥＣ０ＲＩメチラーゼと７４ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、二 本鎖のＣＤＮＡをＥＣ０ＲＩリンカ−を用いてλ（ｌｔｌｏ（３０）のＥＣｏＲ Ｉ部位にクローン化した。Ｃｈａｒｏｎ　４ヒトゲノムライブラリーは、Ｔｏｇ ｉ　Ｈａｎｔａｔｔｓ博士（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）　（３１ ）から寛大に分与して戴いた。 一部を切取ったＣＤＮＡプローブの合成りａｖｉｓら（３２）により記載されて いるようにして、初期形質転換体ＬＴＤ−４から得たポリ（ＡビＲＮＡから３２ ＰでＩｍされたｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを過剰の未形質転換し細胞の ポリ（Ａ＞“ＲＮＡ　（ロフト−３０００）に対してアニーリングした後、ヒト ＣＤＮＡに富んだ一本鎖の配列をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（３ ２）によって重鐘した。この一部ヲ欠＜　（５ｕｂｔｒａｃｔｅｄ）　ｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａプローブをフィルターハイブリダイゼーションにかける前に５ｅｃ−ブタ ノールで濃縮し、ＴＥで平衡化したＧ　−５０５ｅｐｈａｄｅｘカラムで脱塩し た。 ヒトゲノムライブラリーをＥ　、Ｃｏ１ｔ　ＬＥ３９２上に播いた。ふたつ（ｄ ｕｐｌｉｃａｔｅ）のフィルターを標準法（３３）に従ってスクリーニングした 。この際、ハイブリダイゼーションは５０％ホルムアミドおよび５ＸＳＳＣ中で ４２℃で行なった。このＣＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおいて、１３ ７ａ１１１ニトロセルロースフイルター当たり６　ｘ　１０’　ｃｐｓの一部を 欠くプローブを適用した。 ゲノムライブラリーから得たフィルターをニック翻訳した（３４）ＣＤＮＡ挿入 物にハイブリダイズした。６８℃で洗浄し、最後に０．２ｘＳＳＣで洗浄した。 増感スクリーンを存在させて一１０℃で１〜２日オートラジオグラフィーにかけ た。 １父ん星且且１ １）７４Ｂの制限断片をＭ１３ベクターｍｐ１ｇおよび−ｐ１９（３５）中にサ ブクローン化した。配列決定反応はジデオキシチェインターミネーション法（３ ６）を用いて行なった。配列決定の方策（ｓｔｒａｔｅｇｙ＞を第３Ｂ図に示す 。 ５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＮｏｒｔｈｅｒｎプロットハイブリダイゼーション高分 子量の細胞ＤＮＡを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａｎｎｈｅｉｇ＋） の推奨するところに従ってＤＮＡ１埒当たり５単位の制限ヌクレアーゼで消化し た。サンプル（１０ｘ＞を０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。ＤＮ Ａ断片をＧｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　（ＮｅｗＥｎｏｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ） 　（３７）に移し、ＣｈｕｒｃｈとＧ１１ｂｅｒｔ（３８）により記載されてい るようにしてハイブリダイズした。 ＲＮＡを０．８％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（３９）上に流し、Ｇｅｎ ｅＳｃｒｅｅｎに移した。Ｎｏｒｔｈｅｒｎハイブリダイゼーションは製造業者 の提供する手順に従って実施した。５ｏｕｔｈｅｒｎプロツトもＮ０ｒｔｈｅｒ ｎプロツトもニック翻訳したプローブにハイブリダイズした。 ５Ｐ６ＲＮＡの合成およびＩｎ　Ｖｉｔｒｏｌｌ訳ｋｂのＴ４ＣＤＮＡをｐｓＰ ６５（ＰｒＯｍｅＱａ　８ｉ（ｌｔｅｃ）のＥＣｏＲＩ部位にサブクローン化し 、＠　ｉｎｄ　ＩＩＩで線状化した。放射標識したヌクレオチドを存在させずに ＳＰ６ポリメラーゼを用いた線状化したプラスミドＤＮＡ　（ｌｘ）を転写する には既に記載（４０）の通りにしたが、転写バッファーにはＧｐｐｐＧと未標識 のＣＴＰを添加した。反応混合物の１／１０を、Ｌ−［３２Ｓ］−メチオニン（ Ａｍｅｒｓｈａｉ）と１バのＳ−アデノシルメチオニンを含有する麦芽系（Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で翻訳した。こ の１ｎｖｉｔｒｏ翻訳産物を下記の還元条件下で５ＤＳ−ポリアクリルアミド電 気泳動にかけた。 細胞標識、レクチンクロマトグラフィーおよび免疫沈降既に記載（４１）されて いるようにして、１０％の透析したウシ血清と１　　ｓＣｉのＬ−［３２Ｓ］− メチオニン（Ａｇ＋ｅｒｓｈａｍ）を含有しメチオニンを含まないＤＭＥ培地中 で１２時間細胞を増殖させた。 この細胞を、０．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｓｈｅｌｌ）および０．２１ ８７　ｘ　ニルメチルスルホニルフルオライド（Ｓｉｇ■ａ）を含有する１ｏ■ ＨのＴｒｉｓ（ｐＨ７，４）　、１５０　ｍＮ（１）ＮａＣ１（ＴＢＳ）中ニ可 溶化した。 溶解物を１００，０００　Ｘ　９で１時間遠心し、上清をＨｅｄｏら（４２）の 手順に従ってレンズ豆レクチンクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）にか けた。溶離液を、コントロールのマウス腹水およびプロティンＡ−セファ０−ズ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の混合物を用いて一回４℃で１時間、そしてプロティン Ａ−セファローズだけを用いて二面４℃で１時間予備吸着させた。次に、各上清 のうち２．５×１０’　ｃｐｓを１０ｇのモノクローナル抗体（約１■／−）お よびプロティンＡ−セファローズと混合し、ターンテーブル上で４℃で一部イン キユベートした。次いで、ビーズを０．５％のＭＰ−４０と０．２％のＳＤＳを 含有する冷ＴＢＳで四回洗い、電気泳動サンプルバッファー中に再度懸濁した。 ゲル電気泳動 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＬａｅｍｍｌｉ（４３）の手順に従 って実施した。免疫沈降−とｉｎ　ｖｉｔｒｏｉｌｌ訳産物を２−メルカプトエ タノールを含むかまたは含まないサンプルバッファー中に溶かした後、１０％ポ リアクリルアミドゲルにかけた。 オートラジオグラフィーは、増悪スクリーン（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）の存在下でにｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルムを用いて行なった 。 同時形質転換およびロゼツトアッセイ マウスψ−２＠胞（４４）は、１０％ウシ血清（ＣＳ　）　（Ｇｉｂｃｏ）を補 充したＤｕｌｂｅｃｃｏの変性Ｅａｇｕｅ培地（ＤＭＥ＞中にｍ持した。 ψ−２細胞は、形質転換の２日前に１０αの回当たり５×１０５の細胞密度でプ レートアウトした。リン酸カルシウム沈澱物は、Ｗｉｇｌｅｒら（２７）によっ て改変されたＧｒａｈａｉとｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂの方法（２５）によって調製 した。１０ｔＩ９のキャリヤーＤＮＡおよび１０埒のＴ４−ｐＨＶ７または１０ ｐｓのＴ８−ｐＨＶ７を用いて沈澱物を細胞に適用した。２日後、これらのＩＩ 胞をＤＭＥ／１０％Ｃ８と５００埒／ＩＩｌのＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ■ 、Ｇｉｂｃｏｌ中で選択下に配置した。 Ｔ　＋又はＴ８＋コロニーを同定するためのＲｏｓｅｔｔｌｎｇアツセイは、特 定培地中での生育から１週間後生存コロニで実施した。リン酸緩衝食塩液（Ｐ　 Ｂ　Ｓ）を用いて１回リンスした後、プレートを５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）含 有ＰＢＳ中で１１５００希釈した精製モノクローナル抗体ＯＫＴ■４Ａ又はＯＫ Ｔ＠８　（１ｍｇ／ｍｌ　；０ｒｔｈｏ　）　２．５　ｍｌと一緒に室温で４５ 分間インキニベートした。プレートをＰＢＳ中で３回やさしくリンスして、遊離 の抗体を除去した。精製ウサギ坑−マウスＩｇＧ抗体（２％ｖ／ｖストック懸濁 液、Ｐ　Ｂ　Ｓ１５％ＦＣＳ中で１／１０希釈）を接合したヒト赤血球を添加し 、プレートを室温で放置した。４５分後、遊離の赤血球をゆっくり吸引し、検査 の前にＰＢＳを添加した。Ｔ　”及びＴｇ　′″ψ−２ψ−２クロンニー単離に より精製し、その特性をフローサイトメトリー及びノーザンプロット分析により 調べた。 組換えレトロウィルスの産生及び感染 １０５ｃｆｕ／ｍｌの力価を有する組換えレトロウイルスストックルスストック を、Ｔ　＋又はＴ８＋ψ−２クローンの近融合性（ｎｅａｒ　ｃｏｎｆｌｕｅｎ ｔ）単層に新鮮なりＭＥ／１０％Ｃ８Ｃ８１Ｏを添加して作成した。２４時間後 、培地を取り除き、０．４５μｍフィルター　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）を用い て濾過した。感染のために、５×１０５細胞を、８　μｇ　／ｍｌ　ｐｏｌｙｂ ｒｅｎｅ　（ＡＩｄｒｌｃｈ）の存在下でウィルス上清（又は希釈液）２ｍｌと 一緒にインキュベートした。３時間後、新鮮な培地３ｍｌを添加した。感染から ３日後、細胞を５００μｇ／ｍｌ　　Ｇ４１Ｂ含有ＤＭＥ／１０％ｃｓに再接種 し、２週間生育させ、Ｇ４１ｇ　’コロニーを計数し、ｉｎ　５ｌｔｕ　ｒｏｓ ｅｔｔｉｎｇ法又はフローサイトメトリーを用いて表面Ｔ４又はＴ８発現につい て調べた。 ψ−２培養土清を用いて、上記したマウスφ−ＡＭ細胞を感染した。Ｔ　＋又は Ｔ８＋粘着トランスフォーマントを、几５ｌｔｕ　ｒｏｓｅｔｔｌｎｇアッセイ 後コロニー単離により精製した。 Ｔ　＋又はＴ８＋非粘看性トランスフォーマントを、フルオレセンス励起セルソ ーチイング（ＦＡＣＳ）により精製した。非粘着性ヒトリンパ球細胞系（ＨＳＢ ２．ＲＰＭＩ−Ｔ細胞。 Ｒａｊｌ−Ｂ細胞）及び粘着性上皮細胞（ＨｅＬａ）を、Ｔ４　又はＴ８＋ψ− ＡＭクローン（１０μｇ　／　ｍｌマイトマイシン−〇で２時間予備処理、Ｓｉ ｇｍａ　）と共培養して感染させ、精製した。 細胞系を１．５　ｍｇ／ｍｌの濃度での０４１８耐性について選択した。 但し、ＨｅＬａ細胞では１■／　ｍｌ　ｓ腺維芽細胞については０．５ｇｇ／ｍ ｌとした。組換え両性ウィルス（４−ＡＭ）を産生ずる全ての細胞培養物をＰ３ 拘束条件下で保持した。 Ａ　Ｉ’＄Ｓウィルス ＨＴＬＶ−Ｉ［［／ＬＡＶ（７）プロトタイプＬＡＶ菌株をＪ、−Ｃ。 Ｃｈｅｒｍａｎ　　（Ｉｎｓｔｌｔｕｔ　Ｐａ５ｔｕｅｒｓ　Ｐａｒｉｓ　　； 　（４５））から入手した。 本研究で使用したウィルス接種物は、我々の実験室の第２〜第５継代ウィルス由 来のものであった。接種物は、ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ−感染植物性血球凝集素（ ＰＨＡ）−刺激末梢白血球［逐次遠心（３００Ｘ　ｇで７分間実施した後１５０ ０Ｘ　ｇで２０分間実施）により集めた］の培養上清であり、液体窒素中で保存 した。結合研究のために、ウィルスを、上記の如＜　９０．０００Ｘ　ｇで９０ 分間の超遠心により集めた培養上清から０．ＯＩＭ　　Ｔｒｌｓ、　０．１５Ｍ ＮａＣｊｌ、１　ｔａＮ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中のＲｅｎｏｇｒａｆｆｌｎ 　　（Ｅ、Ｒ。 ５ｑｕ１ｂｂ）　１５％クッションを用いて濃縮した。 抗−ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ試Ｊ ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶに対する抗体を多く含む血清を慢性リンパ節疾患を患って いるホモの男性から得、螢光抗体法（４Ｂ）、ウェスタンプロット分析（４７） 及び放射免疫沈降（４８）によりその特異性を調べた。ＩｇＧ分画の一部を、上 記した如＜　（４７，４９゜５０．５１）フルオレセインイソチオシアネート（ ＦＩＴＣ；ＦＩＴＣ：たんばく質比−１０，７μｒ／ｍｌ）、ホースラディッシ ニベルオキシダーゼ（ＨＰＯ、タイプ■、Ｓｉｇｍａ　）及びアガロースとカッ プリングさせた。非免疫血清からのＩｇＧ接合体も平行して作Ｍｇ依存の粒子逆 トランスクリブターゼ（ＲＴ）活性を、２＋ ７．５ｍＭ　　Ｍ　ｇ　　（５２）の存在下で（Ａ）　　　（ｄＴ）　　　　　 ［負のｎ　　　　　　　　１２−Ｉｌｌ コントロールとして（）（ｄＴ）］の鋳型プライマｎ　　　　　１２−１８ −を用いて測定した。 細胞質ＡＩＤＳウィルスのけい光抗体検出培養細胞（０，１ｍｌ中ｌＸｌ０５） をガラススライド上で遠心しく５ｈａｎｄｏｎ　ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｌｆｕｇｅ ）　％　９５％エタノール−５％酢酸中−２０℃で３０分間固定し、ＰＢＳ　（ ０，ＯＩＭ　　ＰＯ４，０，１５ＭＮａＣｊｌ、ｐＨ８゜０）を用いて１０分間 ３回再水和した。スライドをＦＩＴＣ−抗ＨＴＬＶ−Ｉ１１／ＬＡＶの１１５０ ０希釈液（１９μｇ／ｍｌ）に室温で３０分間露した。次いで、スライドを洗浄 しく１０分間Ｘ３）　、ＰＢＳ中５０％グリセロールを用いてカバースリップの 下に載置した。６３０×パワーの落射照明のＬａ１ｔＺｏｒｔｈｏｐｌａｎ顕微 鏡で、スライドを検査した。これ谷の条件下で、ＦＩＴＣ−抗ＨＴＬＶ−ｍ／Ｌ ＡＶ試薬１１ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＹに対して特異である。非感染のＰＨＡ刺激細 胞、Ｅｐｓｔｅｆｎ　Ｂａｒｒ（Ｅ　Ｂ）ウィルス感染Ｂ細胞系、アデノウィル スル感染細胞系、Ｔ細胞系並びにＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＴＩ感染細胞系は 染色されなかった。 感染ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶの力価測定のための微小培養アッセイは（４７）に詳 記されている。概略的には、Ｐ）ＩＡ−刺激リンパ球又は細胞系（２Ｘ　１０６ 細胞／　ｍｌ　）をウィルス接種物の連続１０培稀釈により接種し、３７℃で１ ８時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、微小培養物（稀釈あたりｌ Ｏ〜２０カルチャ；０．２５ｍ１培地中のカルチャあたり１×１０５細胞）中に プレートした。４日毎に、上清１００μｇを取り除き、新鮮な培地と取り換えた 。次いで、上清を、上記した如き抗原捕捉アッセイによりウィルス抗原について アッセイした。感染ウィルス価（ＩＤ−５０）は、培養物の５０％がウィルスに 対して陽性を示す希釈のレシプロカルとして定義される。 ＶＳｖシニードタイブアッセイ 水胞性０炎ウィルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ、　Ｉｎｄ１ａｎａ菌株、野生型）を、上記し た如＜　（５３）エンベローブシニードタイプに必要なレトロウィルスを産生ず る細胞中で増殖させた。高度免疫の中性化羊抗−ｖＳＶ血清を集めたｖＳｖに添 加して、非シュードタイプウィルス粒子を不活化した。シ二−ドタイブ伍は１０ ’〜１０５ＰＦＵ／ｍｌの範囲であった。アッセイのために、ｖＳｖシュードタ イプで感染させるべき２ｘ１０５細胞を直径３０■ｌの組織培養ウェルに導入し た。ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ’３及びＬ細胞は本来粘着性であり、他のタイプの細 胞は下層を５０Ｍｇ　／　ｍｌのポリーＬ−リジンを用いて予処理することによ り付着した。１時間ウィルスを吸着させた後細胞を洗浄し、各ウェルに１０６ミ ンクＣＣＬ６４又は牛ＭＤＳＫ細胞を添加した。これらの細胞は二次ｖＳＶ感染 のための優れたプラークを提供するが、シニードタイプビリオンによる感染に対 しては耐性を有している。プラーク指示細胞を固定、拡散させた後（約９０分） 、単層を寒天培地で覆った。感染後２日目に、ｖＳＶプラークをカウント（た。 抗−Ｔ　４　Ａ　モノクローナル抗体（１：２０）、抗−ＨＴＬＶ−ｍ血ｆｆ１ （１：１０）又は抗−ＨＴＬＶ−１血清（１：１０）を使用し、（５４）に記載 されている如く細胞を予処理してから３０分後シニードタイプを添加することに よりシニードタイプブシークの形成を抑制した。 シンシチウム誘発アッセイ ２　Ｘ　１０５細胞を、直径ｌＯ關のウェルにおいてＨＴＬＶ−ＩＩＩ（５５） により感染かつＨＴＬｖ−■を産生する２×１０４Ｈ９細胞と一緒に共培養した 。培養物を３７℃でインキュベートし、前記した如＜　（５４，５６）　１８時 間後にシンシチウム形成について調べた。 ５個もしくはそれ以上のシンシチウムを含む細胞を正と判定した。接種時に混合 培養物に抗−Ｔ４λモノクローナル抗体（１：２０）を添加してシンシチウム抑 制を調べた。 細胞けい光分析及びＡＩＤＳウィルス結合方法は（４６）に詳説されている。概 略的には、フルオレセインＯＫＴ■８）を用いる直接けい光抗体法により、細胞 表面Ｔ４又はＴ８発現を検出した。希釈／洗浄バッファは、０．１％牛血清アル ブミン、２％ｖ／ｖＡＢ＋ヒト血清及び０．Ｏ１％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓを含む０．Ｏ ＩＭ　　Ｐ　Ｏａ　、Ｏ−１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｆｌ　、ｐＨ７，４であった。 全ての試薬を最適（飽和）結合のために予備滴定した。細胞（５Ｘ１０５）をモ ノクローナル抗体希釈物２５μｇ中４℃で３０分間インキュベートした。細胞を 遠心（３００Ｘｒで７分間）により洗浄し、食塩液中１％パラホルムアルデヒド ０．５　ｍｌ中に再懸濁し、フルオレセンス励起セルソータ（Ｆ　Ａ　ＣＳ　Ｉ Ｖ、　ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｊｎｓｏｎ　）を用いて分析した。ＨＴＬＶ−ｍ／ ＬＡＶ結合のために、５　Ｘ　１０５細胞をＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ　（１０μＮ 中５０ｎｇ）を−緒に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄した細胞をフ ルオレセンス接合抗−ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ２５μｐ中に４℃で３０分間再懸濁 させた。細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中に再懸濁し、上記した如＜ ＦＡＣＳについてアッセイした。 ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ結合の抑制のために、細胞を抗−Ｔ４Ａ又はＴ８（２０Ｍ ｇ中２０ｎｇ）と−緒糸に４℃で３０分間予備インキユヘートシタ後ＨＴＬＶ− ｍ／ＬＡＶ　（１０μＮ中５００ｎｒ）を３７℃で３０分間に亘り添加した。細 胞を洗浄し、フルオレセンス接合抗−ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶと一緒にインキ ュベートし、洗浄し、バラホルムアルデヒドに再懸濁し、上記した如＜ＰＡＣＳ について分析した。 細胞表面の放射性ヨウ素化、免疫沈降及びゲル電気泳動”ｒ４”ＮＩＨ３Ｔ３） ランスフォーマントの表面を、ラクトペルオキシダーゼ法（１８）により放射性 ヨウ素化した（ｒａｄｉｏ　Ｉｏｄｉｎａｔｅｄ）。４Ｘ１０７細胞を０．５ｍ Ｍ　　ＥＤＴＡ。 ２ｍＣ１Ｎａ１２５１及び２０Ｍｇのラクトペルオキシダーゼを含むＰＢＳ１ｍ ｌ中に懸濁した。０，１，５．１０及び１５分目に０．０３％Ｈ２Ｏ２１Ｏμｇ を添加した。反応を２３℃で実施し、１０５ＭＮａ１を含む冷ＰＢＳ５０容量中 で２回遠心することにより２０分目に反応を停止させた。標識細胞を４本のチュ ーブに分け、ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ　（２０μＮ中２ｕｔｒ）と−緒ニ３７℃テ ３０分間インキュベートした。続いて、０〜４℃で洗浄し、検査した。 洗浄した細胞を、洗浄溶解バッファ（Ｌ　Ｂ　；　０．２ｍＭフェニルエチルス ルホニルフルオライド、５μｇ　／　ｍｌアプロチニン、−ｍ−′、 ＃；＃；イ９０．２ｍＭ　　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａ　、　０．２ｍＭ　　Ｎ　ａ　Ｆ　 、　０．２％デオキシコール酸ナトリウム及び０．５％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎ１ｄｅ ｔ　Ｐ　−４０含有０．０２Ｍ　　Ｔｒｌｓ、　０．１２Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｆｌ 　、　ｐＨ８，０）　１〜Ｉを添加して溶解させた。チューブを氷上で１５分間 保持し、５ｏｏｏｘ　ｇで２０分間遠心して核を除去した。 吸収処理用ニ、ヒト抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ　　ＩｇＧ、ｌニド非免疫１ｇ Ｇ、抗ＴＡ及び抗Ｔ８抗体のセファロース結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を既述 のようにして調製した（４８）。分解物（Ｌｙｓａｔｅ）を撹拌下１．５時間、 ２００　ｕｆｌのセファ０−スー非免疫ヒトＩｇＧに予備吸収させたのち、撹拌 下３時間で２０Ｍｇのセファロース結合物（上記のもの）を用いて免疫析出させ た。 セファロース吸収物を、ＬＢで１回、０．５Ｍ　　ＮａＣ１１を含むＬＢで１回 、そして０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）を含むＬＢで１回の 合計３回洗浄した。吸収物質を６５℃にて３０分間、２０Ｍｇのサンプルバッフ ァー（０，０１Ｍ−）リス、ｐＨ８，０。 ２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）、２５ｕｔｒのブロモフ ェノールブルー及び１０％のグリセリン（Ｖ／Ｖ）を含有）により溶離した。電 気泳動は、３．３〜２０％のグラジェントの、３％の結合ゲルを含むポリアクリ ルアミドゲルで行ない、オートラジオグラフはコダックＸＡＲ−５フィルムを用 いて現像した。 ウィルス阻害アッセイ ２ｘ１０５Ｔ　＋３Ｍ　Ｔ細胞を０分にエイズウィルスに暴露した。阻害剤であ る塩化アンモニウム（２０ｍＭ）又はアマンタディン（ａｉａｎｔａｄｎｅ）　 （２０■Ｍ）を、ウィルス感染の種々の時間に（０分、３０分、及び６０分）加 えた。６時間後、細胞を洗浄し、新鮮な媒質（ＲＰＭＩ／ｌｏ％ＦＣＳ）で置換 した。エイズ感染におけるこれらの試剤の作用を感染５日後に評価した。ウィル ス抗原を発現する培養物中の感染細胞のフラクションを、上記のように免疫ケイ 光分析法によって測定した（５８）。 ＲＮＡ単離及びノーザンプロットハイプリダイゼーション全１２ＮＡを細胞から 、４Ｍのグアニジンチオシアネートにホモジナイズし、その後５．７Ｍ　　Ｃａ Ｃｌクッションを介して超遠心して単離した（２８）。ポリ（Ａ）　　セレクシ ョンは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（タイプ３、コラボレ ーティブリサーチ（Ｃｏｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ））によって 行なった（２９）。ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（３９）上 で電気泳動し、ハイボンド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に移した。ノーザンプロット ハイブリダイゼーシジンを製造者からもたらされた方法に従って行なった。プロ ーブをα３２Ｐラベルデオキシヌクレオチドトリホスフエートで比活性０．５〜 Ｉ　Ｘ　１０９ｃｐｓ／微Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　Ａの単離に用いたストラテジーは 、その表面でＴ４を発現するＬ細胞形質転換体を構築することを最初に含む。 Ｔ４＋形質転換フィブロブラスト（腺維芽細胞）のｍＲＮＡから合成されたｃＤ ＮＡを消去的ハイブリダイゼーシヨンにより濃縮し、外縁のＴリンホサイトのｍ ＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラリーからＴ４をコードするｃＤＮＡを単離 するためのプローブとして用いた。Ｔ　４　”　ＣＤ　Ｎ　Ａクローンの同一性 は、ノーザン及びサザンプロット分析法により、そして究極的にはこれらのクロ ーンがＴ４＋フェノタイプをレシピエンド細胞に移す能力により決定した。同様 の手法は、先に、Ｔ８タンパクをコードしている遺伝子を単離するために用いら れている（２０）。 チミジンキナーゼ（ｔｋ）欠損マウスＬ細胞を、ｔｋを含むプラスミド、ｐＴＫ 　（２５，２８）に沿ってＴ細胞白血病セルラインＨＵ　Ｔ−１０２からゲノム ＤＮＡと共に形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｓ）した。Ｔ細胞の表面タンパク を発現するｔｋ”Ｌ細胞形質転換体は、系内でのロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔ ｌｎｇ）分析により同定した。ｔｋ＋クローンをＴ４に対するマウスモノクロー ナル抗体に暴露し、その後ウサギ抗マウス免疫グロブリンとカップルした赤血球 と共にインキユベートした。Ｔ４形質転換形は、赤血球との特異的な結合により 、赤色を呈した。このようにして、１つの一次Ｔ４＋形質転換体、ＬＴＤ−４を 得た。このクローンによる１４分子の発現は、サイトフルオロメトリック（ｃｙ ｔｏｆ　ｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）分析により、独立に変化した（第１図）。 胞（３２，６０）からの大過剰のＲＮＡと共にＴ４＋形質転換体のポリ（Ａ）” 　ＲＮＡから調製された高度にラジオアクティブなｃＤＮＡをアニールすること により濃縮される。高ロフト（Ｒｏｔ）値においてすらハイブリダイズできない ｃＤＮＡをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより単離し、Ｉａ■ｂｄ ａクローニングベクターｇｔｔｏ中で構築されるヒト外縁Ｔ細胞ｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングするのに用いた。４つの弱いノーイブリダイズブシーク （ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ　ｐｌａｑｕｅ）が同定され、プラーク精製され、Ｔ ４シーケンスの存在について分析された。 これらのクローンのどれがＴ４をコードするか決定するために％Ｔ　　＋とＴ４ ″″外縁（ｐｅｒｌｐｈｅｒａｌ）　Ｔ細胞、白血病細胞、胸腺細胞、Ｌ細胞形 質転換体及び非すンホイド（ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｉｄ）細胞を用いて、ノーザン プロット分析を最初に行なった（第２図）。４つのクローンのうちじは、Ｔ４＋ 細胞中にのみ存在するＲＮＡにハイブリダイズした。このクローンはＴ４＋形質 転換体、ＬＴＤ−４中に存在する３　ｋｂＲＮ　Ａを検知し、また、Ｔ４＋外縁 リンホサイト、多種のＴ４＋白血病セルライン、及び胸腺細胞のボビュレーシジ ン中に存在する。非形質転換フィブロブラスト、Ｔ４−外縁リンパ細胞、ＨｅＬ ａ細胞、あるいはヒトニューロブラストーマ（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）細 胞からのＲＮＡではハイブリダイゼーションは認められなかった。 このクローンにより検知されるＲＮＡの発現パターンは、それがＴ４をコードし ている可能性と一致する。しかしながら、このｃＤＮＡは単に０．６ｋｂの長さ であり、３　ｋｂ　　ｍ　ＲＮ　Ａにハイブリダイズする。従って、ヒト外縁Ｔ 細胞ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングし、３ｋｂインサートを含む１つ のクローン（ｐＴ４Ｂ）が得られ、このものはサイズ的に成熟した（■ａｔｕｒ ｅ）メツセンジャーＲＮＡに近似していた。このクローンの制限地図（ｒｅｓｔ ｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａｐ）を第３Ａ図及び第３Ｂ図に示す。 ゲノムプロット分析 サザンプロット実験（３７）を次に行ない、単離したｃＤＮＡクローンがヒトＤ ＮＡと同様にＴ４＋形質転換体からのＤＮＡとハイブリダイズし、非形質転換マ ウスＬ細胞ＤＮＡとはハイブリダイズしないことを明らかにした（第４図）。種 々のヒト細胞からのゲノムＤＮＡは、Ｂａ５ＨＩ酵素での開裂の後、５つのハイ ブリダイズしたフラグメント群を示す。予期されたように、Ｔ４シーケンスが形 質転換体、ＬＴＤ−４中に検出することができるが、非形質転換し細胞ＤＮＡ中 には検出できない。遺伝子（６，６ｋｂ）の３′末端に最も近いＢａ■Ｈｌフラ グメントはＬＴＤ−４中に存在せず、恐らくインテグレーションインベントの結 果と思われる。さらに、リンパ様及び非リンパ様細胞からのＤＮＡと比較すると 、このような粗い分析レベルでは、全体の再配列は明らかではない。ハイブリダ イズしたフラグメントの分子量の合計は３３ｋｂであり、Ｔ４遺伝子が大層大き いことを示唆している。この領域をスパンするゲノムクローンの完全なセットが 得られ（下記参照）　、Ｂａ５Ｈ１フラグメントはこれらのクローンの制限分析 によって秩序化され、遺伝子が大きくかつかなりの長さのイントロンを含むに違 いないことが確かめ単離したｃＤＮＡがＴ４をコードすることは、さらにこのク ローンが形質転換の後、腺維芽細胞をＴ４＋フェノタイプに変換しうるかどうか によって実証される。染色体ＤＮＡ中のＴ４遺伝子は大きく、さらにいくつかの ゲノムクローンにスパン（ｓｐａｎ）　する。従って、ｃＤＮＡクローンを２つ のレトロウィルス発現ベクター、ｐＶｃｏｓ７およびｐＭＶ６ｋｔ／ｎｅｏに導 入する。これらのベクターは、単一のＥｃｏＲＩクローニング部位の側にあるモ ロニーマウス白血病ウィルスの長い末端リビー）　（ＬＴＲｓ）を含んでいる。 ５’　−ＬＴＲはクローニング部位を通しての転写を促進し、３’　−ＬＴＲは 開裂及びボリアデニレーシッンに必要なシーケンスを含む。ベクターｐＭＶ６ｔ ｋ／　ｎｅｏはまた、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子のコード 領域に融合したｔｋプロモーターを含んでいる。 ｐＶｃｏｓ７を用いる構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は非結合選択可能マーカー と共に形質転換することを必要とする。一方、ｐＭＶ６ｔｋ／ｎｅｏは、結合（ ｌｉｎｋｅｄ）共形質転換を許容するネオマイシン耐性マーカーを有する。形質 転換役得られるＮＩＨ３Ｔ３細胞のＮｅｏ＋コロニーを、ネオマイシン類縁体Ｇ ４１８を含む媒質中で成育する能力によって選択し、細胞表面でのＴ４の発現を 検出するロゼッティング法を用いてスクリーニングした。 ｐＶｃｏｓ７で得られた０　４１ｇコロニーの約５０％及びｐＭＶ６１に／ｎｅ ｏで得られたコロニーの７５％がこのアッセイでＴ４について陽性であった。ロ ゼツト陽性コロニーをさらにサイトフルオメロメトリーで分析して、Ｔ４が形票 質転換細胞の表面で発現されているこを確認した（第１図）。 代謝タンパクラベル実験を行ない、Ｔ４＋形質転換腺維芽細胞及びＴリンパ細胞 が同一の分子量のＴ４タンパクを発現することを明らかにした。非形質転換ＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞、Ｔ４＋形質転換体及びＴ１ルバ細胞をＬ−［３５Ｓｌ−メチオニ ンの存在下に１２時間ラベルした（４１）。これらの細胞を洗剤で可溶化し、溶 解物（ｌｙｓａｔｅ）をレンズ豆レクチンカラムに通して糖タンパクを濃縮した （４２）。結合糖タンパクフラクシジンを溶離し、Ｔ４に対するモノクローナル 抗体で免疫析出（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｌｔａｔｅ）させた（第５図）。還 元条件下、相対分子量５５ｋｄで泳動する糖タンパクを、Ｔリンパ細胞と２つの 独立したＴ４＋形質転換体からの抽出物中で検出する。このタンパクはコントロ ールである３７３腺維芽細胞中では検出されない。非還元条件下では、５１ｋｄ 糖タンパクが、Ｔ細胞中及び形質転換腺維芽細胞中で抗Ｔ４により免疫析出され る。 これらの実験から、形質転換体が抗Ｔ４により免疫析出される５５ｋｄ糖タンパ クを発現し、このものはサイズ的にＴリンパ細胞の表面で発現されるものと同一 であることが明らかとなった。 従って、単離ｃＤＮＡを用いるノーザン及びサザン分析、さらにはＴ４＋フェノ タイプをマウス叉格腺維芽細胞に付与するこのｃＤＮＡの能力の両者の結果は、 Ｔ細胞表面タンパクＴ４の全てのフードシーケンスがクローニングされたことを 示している。 Ｔ４コード領域の完全ヌクレオチドシーケンスを、ジデオキシ終止法（ｔｅｒｓ ｌｎａｔｌｏｎ％　５ｅｔｈｏｄ）を用いて、３ｋｂｃＤＮＡイン禮Ｊ サート両方のストランドをシーケンシングすることにより決定した（１５．３Ｅ ｉ）。完全ヌクレオチドシーケンス及び予測タンパクシーケンスを第６図に示す 。最長のオーブン読み取りフレームは、開始コンセンサスシーケンスＰ　ｕｒＮ 　Ｎ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｐ　ｕｒによって取り囲まれたメチオンニンコドンを有する る部位７６から始まる（６１）。この読み取りフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒ ａｍｅ）は１３７４ヌクレオチドに及び、４５８アミノ酸を含むポリペプチドを コードしている。この読み取りフレームの広がりは、このｃＤＮＡをｌ？ＮＡ発 現ベクターｐＳＰ６９にインサートすることにより確認した（４７）。このベク ターから合成したＲＮＡは、生体外で翻訳された場合、非修飾（ｕｒ＋＋５ｏｄ ｉｆ１ｅｄ）　５１ｋｄタンパク（ヌクレオチドシーケンスから予測された正確 な分子ｆｆ１）の合成を支配する（第（以下余白） Ｔ４は、リーダー配列、４つのタンデム可変−結合（ＶＪ）様領域、及び膜伸展 領域から成り、各部分はイムノグロブリン遺伝子族（６２，ｆｉ８）の異なる構 成メンバーとの対応する領域と相同性を有している（第６及び８図参照）　ｏ　 Ｋｙｔｅ−Ｄｏｌｉｔｔｌｅ（６４）疎水性プロットにより予測されるリーダー ペプチドに対応する疎水性残基の一群（Ｓｔｒｅｔｃｈ）は、開始コドンの直後 に位置している。天然Ｔ４タンパクがプロセス処理される正確な位置は決定する ことができないが、既知の開裂パターン（６５）に基づくと一１位置のスレオニ ンの直後で開裂が生起するものと考えられる。従って、シグナルペプチドは２３ 個のアミノ酸を含有しており、プロセス処理されたＴ４は４３５個の残基から成 るタンパクである。 成熟タンパクの１−９４残基部分は、イムノグロブリンのＬ鎮可変領域とアミノ 酸及び構造上の相同性を有している（第９Ａ図）。 該イムノグロブリン可変領域とこの領域との全体の相同性は３２％になる。イム ノグロブリンＬ鎖のＶ領域とＴ４のＮ末端Ｖ様領域（ｖｌ）との配列の比較から 、不変残基１４のうちの８残基が保存されていることが判る（６６）。この領域 には、２つのシスティン残基があり、６７コのアミノ酸残基分離れており、この 位閏 置と距離はイムノグロブリンＬ鎖及び階連分子に見出される対応部分に類似して いる（６７）。これらのシスティンｉヨｖ領域に特徴的な保存されている鏡開の ジスルフィド結合を形成することができる。この予想は、還元条件下よりも非還 元条件下での方がＴ４の移動速度が大きいこと、これは少なくとも１つの鏡開結 合が形成されていることを意味する、という我々の観察結果によって、支持され るものである（第５図、レーンｅ及びｆ）。 個々のアミノ酸レベルに於る相同性以外にも、Ｔ４のｖ１領域はイムノグロブリ ン可変領域と構造的な特徴を共有するものである。イムノグロブリンの可変及び 不変領域は、連続する抗て 平行β−鎖が折りたたまれ★２つのβ−シートを形成するという特徴的なパター ンで折りたたみこまれている（６７．６８）。これらのβ−シートは、ジスルフ ィド結合及び特徴的な疎水性相互作用の両者によって、−緒になっている。Ｔ４ のＶ様領域がイムノグロブリンＬ鎖のＶ領域と２次構造上でどのような相関を有 しているかを決定するために、二次元構造アライメントを行った。同様に、これ らの配列における予想可能なβ−鎖及びβ−ターンのプロットもＣｈｏｕ及びＦ ａｓａａｎの経験的に誘導されたアルゴリズムを用いて行った。これらの分析に よって、Ｔ４のＶ様領域内に存在する７つのβ鎖の存在はイムノグロブリンＶ領 域内に見出される対応領域と非常に良く一致していることが判る。第９Ａ図参照 。Ｔ４の保存された２つのシスティンはβ鎖Ｂ及びＦ内にあり、イムノグロブリ ンの保存ジスルフィド結合を形成することが知られているＶ領域内のシスティン の位置と正確に合致する。第１のシスティンの１２個アミノ酸分下流にトリプト ファンがあり、第２のシスティンの２個アミノ酸分前にはチロシンが位置する。 これらの残基は、Ｌ鎖Ｖ領域のβ鎖Ｃ及びＦに夫々非常に特徴的なものである。 更に、アスパルテート残基が第２のシスティンの６個アミノ酸分上流にあり、ア ルギニン残基はβ鎖りのベースに位置する。これらの荷電残基はＶ領域に非常に 特異的なものである。最後に、疎水性残基がβ鎖をつうじて交互に存在しており 、これによって、二つのβ−シートの相互作用が強化される。 Ｔ４のｖ１領域の後には、イムノグロブリンの結合（Ｊ）領域及びＴセル抗原レ セプターと顕著な相同性を有するアミノ酸残基が続いている。第９Ｂ図において 、このＴ４Ｊ様領域伏イムノグロブリンのし鎖のコンセンサスＪ配列及びＴセル 抗原レセプターの二つの鎖と整列させて記載しである。このＪ様領域に続いて、 統計的に重要な配列であってイムノグロブリン可変領域のポリペプチドに構造的 相同性を有する、三つの付加ＶＪ様領領域構造的に分けることができる２６５個 のアミノ酸配列がある。第６及び８図参照。更に、この領域には、Ｎ−結合型グ リコシル化部位が二つ存在する可能性がある（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ；第６図 ）。 細胞外領域に続いて、疎水性プロット（６４）による予測で可能性のある膜透過 ＜ｍ通過）配列があり、この配列は、疎水性及び中性アミノ酸残基のみを含むも のである。このセグメントは、■型主要組織適合抗原タンパクのβ鎖の膜通過エ クソンと極めて相同性が高い（第９Ｃ図）。これらの配列をならべて比較すると 、ギャップなしに４８％の相同性が認められる。この膜通過セグメントに続いて 、４０個の高荷電性アミノが細胞質領域を構成する（第６及び８図）。 Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　Ａを用いて、そのマウス−ヒト体細胞ハイブリッドのパネル における凝集パターン及びヒトメタフェーズ染色体とのｉｎ　５ｉｔｕハイブリ ダイゼーシヨンによって、Ｔ４遺伝子の染色体上における位置を分析した（１０ １）。遺伝子プロット及び１ｎ　５ｌｔｕハイブリダイゼーシジンによって、Ｔ ４遺伝子がヒト染色体１２の短腕、１２ｐ１２及び１２ｐｔｅｒの間にあること が判明した。 Ｔ４遺伝子を有する重複ゲノムクローン組を、ラムダクローニングベクターｃｈ ａｒｏｎ４及びＥ　Ｍ　Ｌ　Ｂ　−３（３１）内に構築されたヒトゲノムライブ ラリーをラジオ化ｐ　Ｔ　４　Ｂ　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物でスクリーニングす ることによって得た（７ｏ）。これらのクローンの特徴は、制限酵素及びサザン プロット分析によって明らかにされ、全Ｔ４コード領域が含有されていることが 判明した。 ジデオキシ停止法を用いて、ゲノムクローンの特異的フラグメントを配列決定す ることによって、Ｔ４遺伝子の完全なインドロブ〒クソン構造が決定された（３ ５．３８）。 第８及び１０図に示したように、Ｔ４遺伝子は、８つのイントロンによって分割 された９このエクソンから成る。第１のエクソンは５′非翻訳領域及びリーダー セグメントを含む。第１番目のＶ様領域ｖ１は残基２８９に位置する大きなイン トロンによって分断されている（第６図）。従って、ｖｌＪｌ領域は、第２及び 第３番目のエクソンにコードされており、ｖ２Ｊ２、ｖ３　Ｊ３”４　’４及び 膜通過（ＴＭ）領域は、それぞれ別のエクソンにコードされている（エクソン４ −７）。細胞質領域（ＣＹＴ）は、イントロンによって分断され、この領域の最 後の部分は３′非翻訳領域とともに第９番目のエクソンにコードされている。 Ｔ４　＋及びＴ８＋形質転換細胞の構築ＡＩＤＳウィルス感染におけるＴ４の役 割に関する研究において、最初に用いられた実験手法は、ウィルス感染を助ける ことのできないＴ４″″細胞系内にＴ４遺伝子を導入することから成る。こうし て得られた形質転換細胞はＡＩＤＳウィルスに対する感受性にってい試験し、次 いで、Ｔ４がウィルス感染を媒介するメカニズムについて研究した。 Ｔ４の表面抗原をコードする全長ｃＤＮＡクローンをレトロウィルス発現ベクタ ー、ｐＭＶ７にサブクローン化した。発現ベクターｐＭＶ７　（第１１Ａ図）は 、単−ＥｃｏＲＩクローニング部位を端に有する二つの直接に反復される、モロ ニーネズミサルコーマウィルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐ ｅａｔ）を含有している。５’　−ＬＴＲはクローニング部位をつうじて構成的 （ｃｏｎｓｔｌｔｕｔｉｖｅｌｙ）に転写を促進し、一方、３’　−ＬＴＲはＲ ＮＡの切断及びポリアデニル化に必要な配列である。更に、ｐＭＶ７には、細菌 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎ　ｅ　ｏ）のコード領域に融 合したヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモーター（ｔｋ）、ドミナント選 択マーカーごとを可能にしている。 （ａｎｐｈｏｔｒｏｐｌｃ）プロウィルスを含む（４４，４＝１）　、φ−２及 びφ−ＡＭ細胞、及びＮＩＨ３７３細胞系に導入された。第１１Ｂ図参照。両細 胞系は、内因性ウィルスＲＮＡのキャプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａＨｎｇ）を 起こさせることは出来なかったが、真正の全てのトランスウィルス機能を提供し 得た。”ｒ４−ｐＭｖ７によるこれら細胞系の安定した形質導入（トランスフェ クシヨン）によって、ヘルパーウィルスフリーのＴ４をコードする組換レトロウ ィルスストックの生産が生起された。これら純粋なウィルスストックは、次いで 、マウス及びヒト細胞に、レトロウィルスの標的細胞による生産なしに、Ｔ４配 列を効率的に導入するために使用された。 簡単に述べると、ＤＮＡ−媒介遺伝子移入操作を用いてＴ４−ｐＭＶ７　　ＤＮ Ａをφ−２細胞内に導入した（第１１Ｂ図、２５゜２７）。ネオマイシンアナロ グ０４１ｇ　（Ｇｅｎｅｔｌｃｉｎ）を含む培地中で増殖し得る能力を有するＮ ｅｏ＋陽性コロニーを選択し、１ｎ　５ｉｔｕロゼツト形成アツセイを用いて細 胞表面上のＴ４発現についてスクリーニングを行った（２０．７０）。Ｔ４を発 現している形質転換φ−２細胞は、１０５ｃｆｕ／ｍｌの力任で組換えレトロウ ィルスを産生ずるものとして同定した。この７４＋−φ−２クローンハ次にマウ スφ−ＡＭ細胞感染することのできるレトロウィルスを生み出す為に使用された 。組換レトロウィルスを１０’　ｃｆｕ／ｍｌの力任で産生ずるＴ４発発現−Ａ Ｍクローンを単離した。Ｔ４＋ヒト形質転換体は、マイトマイシンＣ処理又はφ −ＡＭクローンとの共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）によって得られた （第１１Ｂ図）。Ｔ４＋形質転換体は次いでノーザンプロット分析にかけ、フロ ーサイトメトリーによってＴ４が発現されて細胞表面に存在していることが確認 された。１８表面タンパクを発現するコントロール細胞系も同様の方法で作製し た。 ヒトリンパ球表面にＴ４タンパクが充分に存在し該細胞をＡＩＤＳウィルス感染 に対して感受性にし得るか否かについてまず決定するために、プリミティブなＴ 細胞白血病細胞系、ＨＳＢ２の形質転換体、即ち、初期１９２８球タンパクＴｌ 及びＴ　のみを表面に発現するものを構築した。ＨＳＢ２はＴ４又はＴ８のいず れも発現せず、Ｔ細胞抗原レセプター又は関連Ｔ　タンパク複合体のいずれをも 発現しない。Ｔ４又はＴ８りンバクを発現するＨＳＢ２の形質転換体を選択し、 ＡＩＤＳウィルスに対する感受性について決定した。ＡＩＤＳウィルス感染を評 価するために、幾つかの異なる実験手法が採用された。 例えば、逆転写酵素の発現（５２）、イムノフルオレッセンスマイクロスコピー による細胞質内におけるウィルス発現（４６）、イムノアッセイによる培養上溝 中のウィルス抗原の検出（４７）、フィ木 トヘマグルチニン（ＰＨＡ）−刺激喫梢すンバ球を用いたスーパネート（ｓｕｐ ｅｒｎａｔｅ）サブ力ルチュアによる感染ピリオンの産生（４６）などが挙げら れる。これらのアッセイを用いて、ＨＳＢ２細胞系のＡＩＤＳウィルス感染の証 拠は得られなかった（表Ｉ）。 さらに、ＡＩＤＳウィルスに対するレセプターを有する非感染ヒト細胞をＡＩＤ Ｓウィルス産生細胞と共に培養すると広範囲な細胞融合が起ることが以前に示さ れている（５４）。このアッセイにおいては、ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩ 産生細胞により多量のシンシチウムが生成されているにもかかわらず（データは 示していない）　、ＨＳＢ２細胞をＡＩＤＳウィルス産生Ｈ９細胞と混合した場 合シンシチウムの誘導は起らない（表１）。 最後に、ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ糖タンパクを有する小胞状口内炎ウィ ルス（Ｖ　Ｓ　Ｖ）のシェードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）を使用して、ウ ィルスの侵入（ｅｎｔｒｙ）を試験した（表１）　（５３，５４）。ＡＩＤＳウ ィルスに感染した細胞をｖＳｖにより重感染すると、高度免疫抗ＶＳＶ血清によ る中和に抵抗するのに充分なＡＩＤＳウィルスエンベロープ糖タンパクが一部の 子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）Ｖ　Ｓ　Ｖにより得られた。これ等のＶＳＶ（ＡＩＤＳ ）シュードタイプピリオンの宿主範囲は、ＡＩＤＳウィルスに特異的なレセプタ ーを発現する細胞に制限される。細胞の侵入及びピリオンの脱被覆の後、トラン スカプシド化されたｖＳｖゲノムが複製し、非シニードタイプ粒子が生成する。 二次感染の間に、感染細胞から放出された子孫ＶＳＶが近くのＶＳＶ　（ＡＩＤ Ｓ）シュードタイプ感染に抵抗性を示す指示細胞（ミンクＣＣＩＪ４またはウシ ＭＤＢＫ細胞）に侵入し、破壊する。その結果得られるｖＳｖプラークの形成を カウントする。このようにＶＳｖ　（Ａ　Ｉ　ＤＳ）シュードタイプの感染によ り、ウィルスの侵入の定量的細胞病理（ｃｙｔｏｐｕｔｈｉｃ）プラークアッセ イが得られる（５４）。このアッセイにおいては、Ｈ５Ｂ２細胞をＶＳＶ　（Ａ ＩＤＳ）シュードタイプにさらした場合、バックグラウンドに対するプラークは 観察されなかった（表１）。ＨＴＬＶ−１エンベロープ中にカプシド化されたＶ ＳＶ　　ＲＮＡのシュードタイプ（ＶＳＶ（ＨＴＬＶ−１））による対照実験で は多数のプラークが観察され、これはＨＴＬＶ−ルセプターを有するＨ５Ｂ２細 胞がｖＳｖを効率的に複製できることを示している。これ等の観察は、ＡＩＤＳ ウィルスエンベロープ中にカプシド化されたｖＳ■ゲノムはＨＳＢ２細胞中に侵 入できないことを示している。 機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）　Ｔ４ｃ　ＤＮＡのＨＳＢ２への導入がこの細 胞をＡＩＤＳウィルス感染に対して感受性にするかどうかについて調べた（表１ ）。Ｈ５Ｂ２−７４＋形質転換体をＡＩＤＳウィルスにさらすと、逆転写酵素活 性の発現により（５２）、免疫蛍光顕微鏡観察による細胞の細胞質中のウィルス の発現により（４Ｂ）、イムノアッセイを使用しての培養浮遊物中のウィルス抗 原検出により（４７）、モして％ＨＡ刺激リンす球との浮遊物（ｓｕｐｅｒｎａ ｔｅ）副培養による感染性ウィルスの産生により（表１）（４Ｂ）ｉｍ定される 、有為なウィルス感染が生起する。対照Ｈ８Ｂ２−７８＋細胞はそれぞれのアッ セイにおいて一貫して陰性であった。 さらに、異なるＴ４”Ｔ細胞がＡＩＤＳウィルスに感染される効率も測定した。 ＨＳＢ２−Ｔ４＋及びＨ３Ｂ２−Ｔ８＋形質転換体、天然に単離されたＴ、”Ｔ 細胞系ＣＥＭ、並びにＰＨＡ刺激末梢リンパ球を、連続的に１０倍希釈したＡＩ ＤＳウィルスにさらし、洗浄し、プレート化して微量培養した。ウィルスに愛す る曝露後１２日に、イムノアッセイを使用して感染培養の頻度を測定した（第１ ２図）　（４７）。このようにして、さらしセ た培養の５０％を感染さ輯るのに必要なＡＩＤＳウィルスの力価（ＩＤ−５０） を決定した。ＰＨＡ刺激末梢リンパ球のＩＤ−５０は、天然に単離されたものあ るいは形質転換Ｔ４＋細胞系について見られたものの２〜３乗倍の大きさである 。ＨＳＢ２−Ｔ　＋細胞の感染効率は、天然に単離されたＴ４４″Ｔ細胞系ＣＥ Ｍについて見られたものより約１０倍高い（第１２図）。対照ＨＳＢ２−７８＋ 細胞は、調べた最高のウィルス力価においても感染に対して非感受性である。 シンシチウム形成及びＶＳＶ（ＡＩＤＳ）シェードタイプの複製の両方を維持す るＨＳＢ２−Ｔ４＋細胞の能力も調べた。 ＨＳＢ２−Ｔ、＋細胞をＡＩＤＳウィルス産生Ｈ産生胞と共に培養すると、１８ 時間以内にシンシチウム形成が容易に観察される（表１及び表■）。さらに、シ ンシチウム誘導は培地を抗Ｔ、Ａモノクローナル抗体で前処理することにより消 滅する（表ｎ）、　そｔ、てＨ５Ｂ２−Ｔ、＋細胞をＶＳＶ（ＡＩＤＳ）シュー ドタイプにさらすと、感染性ＶＳｖ粒子が生成され、近くの指示細胞を破壊する （表１及び■）。さらにプラーク形成は、抗ＡＩＤＳウィルス抗体または抗Ｔ４ Ａモノクローナル抗体による前処理により阻害される（表■）。対照Ｈ５Ｂ２− Ｔ８＋細胞は、ＡＩＤＳウィルス感染の検出に用いた７つのアッセイのそれぞれ において、−貫して陰性であった（表１．　　ＩＩ及びｍ）。これ等の観察は、 ヒト未成熟Ｔリンパ球においては、Ｔ４タンパクが単に存在することがＡＩＤＳ ウィルス感染に必要な本質的機能をもたらすという遺伝学的証拠を与えるもので ある。 表　　　■ Ｔ４＋ヒト形質転換体におけるシンシチウム誘導Ｈ８Ｂ２　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　ＮＤＲａｊ　ｉ　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　ＮＤＨｅＬａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　ＮＤ２Ｘ１０５細胞を２ＸｌＯ’のＡＩＤＳウィルス産生Ｈ産生胞（Ｈ ９／Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ）と共に培養し、３７℃でインキユベートした。 １８時間後にシンシチウム形成について培養を調べた。結果はシンシチウムに含 まれる核の概算パーセンテージで示す。−（シンシチウムなし）；　＋＋　（２ ５％）　　；　＋＋＋（５９％）　　；＋＋＋＋◆（９０％）；ＮＤ（測定せず ）。シンシチウム阻害は、抗Ｔ４Ａモノクローナル抗体（αＴ４Ａ　；　１　： ２０）を接種時に混合培地に加えて測定した。天然に単離されたＴ４”Ｔ細胞系 ＪＭ及び８１６６をこれ等の研究の陽性コントロールとして使用した。 ２Ｘ１０５細胞をＶＳｖ（ＡＩＤＳ）シュードタイプ（５３，５４）と共に１時 間３７℃でインキュベートした。次に細胞を洗浄し、１×１０６ミンクＣＣＬ６ ４またはウシＭＤＢＫプラーク指示細胞を各ウェルに加えた。これ等はｖＳｖ感 染を許容するが、ｖＳｖ（ＡＩＤＳ）に対して抵抗性である。培地を寒天培地で 覆い、感染後２日にｖＳｖプラークをカウントした。抗Ｔ４Ａモノクローナル抗 体（αＴ４Ａ　；　１　：　２０）または抗ＡＩＤＳウィルス血清（αＡＩＤＳ ；１：１０）を使用してシュードタイプ（５４）にさらす３０分前に細胞を前処 理することによりＶＳＶ（ＡＩＤＳ）シュードタイププラーク形成を阻止した。 広範囲な種類のヒト細胞型（５４）上にプレートするＶＳＶ　（ＨＴＬＶ−１） ’／ニードタイプをこれ等の実験の対照として用いた。ｖＳｖ（ＨＴＬＶ−１） シュードタイププラーク形成を阻止するのに抗−ＨＴＬＶ−１血清（１：１０） を用いた。結果はＰＦＵ／ｍｌ及びＮＤ（測定せず）で表す。 （以下余白） ＡＩＤＳウィルスの感染は１９２８球へのみに制限されない機能性Ｔ　４ｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａを２種のヒト非Ｔ細胞系に導入した。即ち、子宮癌に由来する上皮細胞 系であるＨｅ１ａ（７２）及びバーキットリンパ腫の患者に由来するＢリンパ芽 球様細胞系であるＲａｊ　１（７３）である（第１１Ｂ図）。レトロウィルス媒 介の遺伝子転移の前は、これ等の細胞系は表面Ｔ４タンパクあるいは１４ｍＲＮ Ａを発現せず、ＡＩＤＳウィルス感染に対し感受性ではない（表Ｉ）。さらに親 細胞系はシンシチウムの誘導及びｖｓｖ　（Ａ　Ｉ　ＤＳ）シュードタイプのブ レーティングを維持しない（表１．■及び■）。 これに対しｓ　Ｔ４　”　Ｒａｊｉ及びＨｅ１ａ形質転換体は、前記した全ての 基準によりＡＩＤＳウィルス感染を保持した（表１）。 （第１２図）。さらに、ＡＩＤＳウィルス産生Ｈ産生胞との共培養においては、 １ａｊｉ−Ｔ４＋及びＨｅ１ａ−Ｔ４＋細胞はシンシチウム誘導を保持し、これ は抗Ｔ４Ａモノクローナル抗体での前処理培養により消滅する（表１及び■、第 １３図）。さらに、これ等の細胞をＶＳＶ（ＡＩＤＳ）シュードタイプにさらす と、感染性■ｈ（産生され、プラークが形成されるが、これは抗ＡＩＤＳウィル ス抗体または抗Ｔ４Ａモノクローナル抗体での前処理による阻止される（表１及 び■）。対照Ｒａ　Ｊ　ｉ−Ｔ　ｓ＋及びＨｅ１ａ−Ｔ８＋形質転換体はこれ等 の測定のそれぞれにおいて一貫して陰性である（表１．■及び■）。 従って、機能性Ｔ４遺伝子のヒトＴリンパ球、８９２８球あるいは上皮細胞への 導入は、これ等の細胞をＡＩＤＳウィルス感染に感受性にするに充分なものであ る。まとめると、これ等の観察はｉｎ　ｖｉｖｏで観察されるＴ４＋Ｔ細胞の指 向性は１４分子の制限された発現の結果であり、それが発現された細胞型の性質 ではないことを示している。 （以下余白） ｈ工；ＤＳウィルスは表面Ｔ４！白質に結合する前記の実験はＴ４発現がＡＩＤ Ｓウィルス感染に必要とされる遺伝的証拠を提供するが、ウィルス生活環におけ るこの分子の役割に関する知見は与えない。Ｔ４の表面発現がＡＩＤＳウィルス 感染に必要であるという観察は、Ｔ４がＡＩＤＳウィルス受容体であることを示 唆している。従ってＴ　＋及びＴ８＋形質転換ヒト細胞の表面に対するＡＩＤＳ ウィルスの結合を吟味するにはフルオロサイトメトリーが使用された（表Ｉ；第 １４図）　。ＨＳＢ２．　Ｒａｊｌ、及びＢｅｔａ細胞、並びにＴ４＋又はＴ８ ＋形質転換体をＡＩＤＳウィルスと共に定温培養した。ウィルス吸収に次いで、 細胞を洗浄し、フルオレセイン共役した抗ＡＩＤＳウィルス抗体に曝露して、フ ローサイトメトリーにより解析した。この試験によりＡＩＤＳウィルスは表面Ｔ ４を発現するヒト形質転換体には有効で特異的に結合するが、Ｔ４−親細胞にも Ｔ８＋形質転換体にも結合しないことを示した（第１４図Ｂ欄９表１）。ＡＩＤ ＳウィルスのＴ４＋細胞に対する結合は抗Ｔ４Ａモノクローナル抗体と予備培養 することにより制止されるが、抗Ｔ８モノクローナル抗体との予備培養では止め られない（第１４図、Ｃ欄）。更に、Ｔ４＋形質転換細胞をＡＩＤＳウィルスに 曝露するばあい、Ｔ４糖蛋白質はウィルス外膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）糖蛋白質と 共同沈降するのであって、これはこれらの分子間の直接の物理的結合を示唆して いる（データは示さない）。これらの結果はＡＩＤＳウィルスが細胞表面上の１ ４分子に結合することと、この結合は試験したＴ４＋細胞のすべての型に生起す るのでＴ細胞特異性の他の蛋白質には無関係であることを示している。 以前の研究では包み込まれたウィルスについて２つの別個の進入経路が記載され ている（７４．７５．７８．７７）若干のウィルスは原形質膜と直接融合するも のがあり、そのヌクレオカプシドを細胞質中に放出するのであって、その際ウィ ルスの他のものは受容体仲介のエンドサイトシスにより取り込まれてしまう。そ の際、エンドソームの酸性環境は液胞の境界膜とのウィルス外膜の融合を容具に する。細胞封入体経路を経由して細胞に入るウィルスによる感染は、エンドソー ムから脱酸する弱塩基のような薬剤を用いて細胞を処理することによって抑制す ることができる（５８．７ｇ、７９．８０）。塩化アンモニウムの存在で、エン ドソーム中では融合が遮断されるがリソソーム低下はなおも低下した速さで進行 する（８０）。 かような訳で７４”　Ｔ細胞系ＪＭのＡＩＤＳウィルス感染に対する塩化アンモ ニウムの影響を試験した。塩化アンモニウムのないばあいは、ＡＩＤＳウィルス に曝露したＪＭ細胞の５０％以上が、感染後５日でウィルス抗体を発現すること は免疫蛍光性鏡検により測定された通りである。ウィルスの添加時が又はウィル ス添加後３０分以内かのいずれかで、ＪＭ細胞を塩化アンモニウムに（６時間） 曝露するばあい、ウィルス感染の９５％より大きな阻害が認められた。しかし、 ウィルス添加後１時間で細胞を塩化アンモニウムで処理したばあいは、感染の阻 害は認められず、受容体仲介のエンドサイト−シスを経て細胞に入る他のウィル スに対し記載したウィルス侵入の速度論と一致する発見であった。結局、塩化ア ンモニウム効果は完全に可逆的であった。塩化アンモニウムに１時間曝露した後 、洗浄により同化合物を無くしてＡＩＤＳウィルスに曝露した細胞は、ウィルス 性感染の制御水準を支持した。これらの結果は、塩化アンモニウムの除去の際、 エンドソームのｐＨが１〜２分以内で当初の低い値に戻るという以前の観察と矛 盾しない（７８，１１０）。エンドソームを脱酸する化合物であるアマンタジン を用いて同様な結果が得られた。 これらの結果は、Ｔ４−ＡＩＤＳウィルス複合体のエンドサイト−シス及びエン ドソーム境界膜とのウィルス外膜の、低ｐＨ誘発融合してかかわり、細胞の細胞 質中にウィルス性ヌクレオカプシドを放出するウィルス侵入の機序と整合する。 細胞性免疫系統の破壊に加えて、ＡＩＤＳがしばしば伴うのは、中枢神経系（Ｃ ＮＳ）障害であって、それはＡＩＤＳウィルスによる脳細胞の直接感染の結果と 考えられる（８１）。従ってＴ４がＣＮＳ内の細胞に発現し、これによりウィル スの向神経性の説明を提供するかどうかを決定することに関心があった。 Ｔ　４ｍ　ＲＮ　Ａ配列がＣＮＳに発現するかどうかを決定するためへヒトとマ ウスの両方の脳から調整したＲＮＡのノーザンやプロット解析を実施した（第１ ５図）。ヒト大脳皮質由来のポリ（Ａ）”　ＲＮＡはほぼ３及び１．８ｋｂの分 子量を持つ２つの別個のＴ　ｔ、　ｍ　ＲＮ　Ａを含む（第１５Ａ図）。より弱 い３　ｋｂＲＮ　Ａは２つのＴ４１白血病細胞系、即ちＵ９３７　　（単球細胞 系）及びＪｕｒｋａｔ　（Ｔ細胞系）、並びに末梢性Ｔリンパ球によって発現す るメツセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）と大きさが同じである。 小さい方の、より豊富な１．１！ｋｂ　ｍＲＮＡはＴリンパ球を欠き、別法のス プライシング又は代替の５′又は３′未満から生成することができた。 Ｔ　４　ｍ　ＲＮ　Ａの局在の更に慎重な解析はマウス脳の特定領域からポリ（ Ａ）”　ＲＮＡを単離することにより実施した（第１５Ｂ図）。Ｔ　のネズミ相 同染色体であるＬ　ｓ　Ｔ　４を記号化する放射性標識ｃＤＮＡによるハイブリ ッド形成は、後脳試料には存在しないマウス前脳中の強度の２．２ｋｂ　ｍ　Ｒ Ｎ　Ａを明らかにした。２．２ｋｂ　Ｌ８Ｔ４ｍＲＮＡは皮質、視床下部に検出 が可能で、線状体にもっとも豊富にあるが、小脳、脳幹、又はを髄には存在しな い（データは示さない）。ＣＮＳ中に検出される２、２ｋｂ　ｍ　ＲＮ　Ａは脚 線細胞中のＬ　ｓ　Ｔ　４を記号化する３、２ｋｂｍＲＮＡよりも小さく、約１ ｋｂである（第１５Ｂ図）。これらの結果は、ＡＩＤＳウィルスが発揮する向神 経性が脳細胞に及ぼす１４分子の表面発現の結果と思われる。前脳で検出される ｍＲＮＡの水準は脚線細胞中の水準の約１／３０である。このことは大多数の細 胞による低水準の発現又は小さい部分集団の細胞による比較的高水準の発現を反 映するともいえる。Ｔ４が神経細胞又は支持細胞により発現されるかどうかは現 在知られていない。しかしながらＣＮＳ中の異形転写体（ｖａｒｉａｎｔｔｒａ ｎｓｃｒｉｐｔ）の存在は、脳のＴ　４ｒｒ＋　ＲＮ　Ａが稀少な侵入Ｔリンパ 球により発現することを確からしくしている。 討論 Ｔ細胞の機能的に別個なサブセットを用いるＴ　及びＴ８の分離はこれらの分子 が適当な標的細胞とＴリンパ球の相互作用において重要になり得ることを示唆し ている。これらの蛋白質の特異的役割を理解する第一歩として、ｃＤＮＡクロー ンがＴ　及びＴ８の両分子について得られ、それらの核酸塩配列が決定された（ ２０．７０）。Ｔ　及びＴ８の演鐸した蛋白質配列の比較は、これらの分子が免 疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインをの構成員としての有意性配列と構造上の相同 性を共有することを示している。しかしながら、Ｔ　及びＴ８のＮ−末端Ｖ一様 領域は全く異なっている。すなわち、それらの分子は２８％の相同性を共有して いるに過ぎず、従って各分子の免疫グロブリン軽鎖に対する相同性よりも分子相 互の相同性の方が低い（第９Ａ図）。更に、Ｔ４とＴ８との間の最大維持（ｃｏ ｎ（ｅｒｖａｔｉｏｎ）領域はまた免疫グロブリンに対する最も強力な相同領域 及びＴ細胞リセブタ−■領域でもある。従ってこれらの二つの分子の免疫グロブ リン様領域は、構造的に類似しているけれども、それらが標的細胞の異なるサブ セット上の異なる分子を認識するという仮説と矛盾しない意味のある配列相違（ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）を示している。 Ｔ　及びＴ８のＮ−末端領域によって共有されるＶ一様領域の構造的相同部分は 、これらの蛋白質の機能に特に関連したちのであるかも知れない。免疫グロブリ ン超遺伝子系統群の実質的にすべての種類は、免疫応答に関係している（６２） 。更に、この系統群の個々の種類は互いに強力に会合して二量体を形成する傾向 を示す。この会合は免疫グロブリンの重鎮と軽鎖、Ｔ細胞抗原リセブターのα鎖 とβ鎖、β２−ミクログロブリンとクラスＩ　Ｍ　ＨＣ蛋白質、並びにクラスＩ ＩＭＨＣ分子のα鎖とβ鎖を形成し、また末梢Ｔリンパ球上の３２ｋｄサブユニ ツトの多重体として存在している（８３）。Ｔ４中の４つの■一様領領域存在は 、これらの領域が相互に、及び他の細胞又はウィルスの表面上の特異的リガンド と会合することを示している。免疫グロブリン一様分子のこれらの特異的親和性 は、Ｔ　及びＴ８の認識機能にとって重要であるのかも知れない。 免疫グロブリン及びＴ細胞抗原レセプター遺伝子において、■及びＪエクソンは 広く分離され、体細胞の組換えイベント（ｓｏａａｔｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ ｔｉｏｎ　ｅｖｅｎｔ）の後にのみ１並置されるようになっている（８２．８３ ）　−Ｔ　４　ｍ　ＲＮ　Ａは、ＤＮＡ組換えイベントを必要とすることなく、 連続的（ｃｏｎｔｉｇυｏｕｓ）　Ｖ−及びＪ一様エレメントを４つコードする 。従って、Ｔ４は再配列（ｒｅａｒａｎｇｅｍｅｎｔ）メカニズムの発生以前に 生じたより原始的な遺伝子を反映している可能性がある。このことはさらに、最 初のＴ４のＶ一様領域（ｖｌ）が、免疫グロブリンもしくはＴ細胞抗原レセプタ ーのいずれかをコードするＶ遺伝子中に存在しないイントロンによって分割され ているという最近の知見によって支持される。イントロンが進化過程で注意深く 除かれること及び、イントロンが以前にはイントロンのない環境中に挿入される ことは極めてありうることであるということは、変型なる証拠から示唆されてい る。このように、Ｔ４は先祖の免疫グロブリン遺伝子を表わしていると思われ、 この遺伝子が複製、分岐、及び再配列（転位）して現在の免疫グロブリン遺伝子 ファミリーを形成したと考えられる。現在の極めて複雑な免疫系においても機能 しているが、Ｔ４はより原始的な細胞系免疫応答において機能するレセプターを 反映しているであろう。無を推動物のもののように、原始的な免疫応答は、レセ プター分子の逸脱し″−トイヤー（ｄｉｖｅｒｓｅ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を 含まないと考えられるが、最も単純な場合には、自己及び非自己の間の区別に限 定され（Ｉｉ５．８６）　、さらに再配列を起こさない「静的な」遺伝子群によ って説明されると思われる。 Ｔ４は４つのＶ−Ｊ一様領域から成っており、Ｊ一様領域及び膜間セグメント（ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｅｇｍｅｎｔ）は１スーパー遺伝子フアミリー の異なるメンバーでの相同性を各々分は合っている。 ■−及びＪ一様領域は、免疫グロブリンとＴ細胞抗原レセプター鎖の両方の相応 する領域と相同である。膜間領域は、クラスＩＩ　　ＭＨＣ分子のβ−鎖におけ るこの領域とかなりの相同性を示す（第９Ｃ図）。従って、Ｔ４は免疫グロブリ ンのスーパー遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーにおいて保存されたエクソ ンの集合から成っており、この遺伝子ファミリーは異なった様式で混合されて、 免疫応答に関与する種々の多くの分子を生木明細書で提供したデータは、先ず細 胞表面においてＡＩＤＳウィルスと１４分子との特異的会合を伴うＡＩＤＳウィ ルス感染のメカニズムを示す。この会合は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及び上皮細 胞において証明され得、従ってＴ細胞特異的タンパクの関与を必要としない。更 に、本明細書に提供するデータは、Ｔ４−ＡＩＤＳウィルス複合体はレセプター 仲介エンドサイト−シスによりインターザリネーションされ、次いでウィルスエ ンベロープはエンソームの制限膜と融合し、ヌクレオキ中ブシドを細胞質に放出 することを示す。ウィルス複製及び転写は、リンパ系及び非リンパ系細胞株の両 者で起こり得る。更に、Ｔ４遺伝子は脳並びにリンパ球において発現し、ＡＩＤ Ｓウィルスの二重向神経性（ｄｕａｌ　ｎｅｕｔｒｏｐｉｃ）及びリンフオトロ ビック（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｌｃ）特性に対する一つの説明を提供する。この やり方において、特にＴ４細胞の集団に対するＡＩＤＳウィルスを標的とするた め、エフェクター細胞−標的細胞相互作用を仲介するのに重要なＴリンパ球表面 タンパクが、ヒトレトロウィルスによって利用されてきた。 細胞表面レセプターは多数のエンペローブト拳つィルスについて同定されてきて おり、しばしば宿主の範囲及び特定ウィルスの指向（ｔｒｏｐｌｃ）性はこれら のレセプターの発現のパターンのせいである（７４．７６）。あるウィルスはご く狭い範囲の細胞タイプに感染し、標的細胞の特定集団におけるウィルスレセプ ターの発現に影響する。例えば狂犬病ウィルスはニコチン性アセチルコリンレセ プターと相互作用し、骨格筋とニューロンに大きく感染する（８７）。ところが Ｅ　Ｂ　（Ｅｐｓｔｅｌｎ−Ｂａｒｒ）ウィルスはＣ３ｄ補体レセプター・タイ プ２と相互作用しく８ｇ）、Ｂリンパ球に感染する。ミクソウィルスのような他 のウィルスは細胞表面上に偏在的に分布するシアル酸残基と相互作用し、より広 範囲の細胞タイプに感染する。 細胞表面レセプターの制限された発現は、ウィルスの向性に対する唯一の説明を 提供する。あるウィルスは、分化した細胞タイプの制限された１つのセットにお いてのみ複製する。従って、Ｍｏ１ｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｎｏ−Ｍｕ ＬＶ）はマウス新生児においてＴ細胞リンパ腫を誘導し、更に、きわめて関連す るＦｒ１ｅｎｄヘルパーマウス白血病ウイルス（Ｆｒ−ＭｕＬＶ）は主としテ赤 を促進するＬＴＲｓにおける相違の結果と思われる（９２，９３．９４）。 本明細書に示したように、ＡＩＤＳウィルスの一次向性決定因子は標的細胞の表 面におけるＴ４タンパクの発現である。リンパ系細胞及び骨髄性細胞並びに脳細 胞へのＩｎ　ｖｉｖｏ感染は制限される：３つの集団はＴ　を表す。ｉｎ　ｖｌ ｔｒｏ実験はＴ４の４　　　　　　　□ Ｔ４″″ヒトＢリンパ球及び上皮細胞（これらの細胞はＡＩＤＳウィルスにとっ ての天然の標的ではなく、ＡＩＤＳウィルスによる生産性感染に感受性にする） への誘導を示す。 可溶性Ｔ４糖タンパク質フラグメントを細胞標品から制限プロテアーゼ消化を使 用して調製する。代わりに、トランスメンブラン・ドメイン（領域が中性及び疎 水性残基を含む）を欠くＴ４フラグメントをコードするＤＮＡ発現ベクターを構 築し、そのようなＴ４フラグメントを作るのに使用してもよい。これらのフラグ メントは水溶液で可溶であり、リーダー（シグナル）配列を有する。哺乳類細胞 で発現する場合、これらのフラグメントはラフ小胞体／ゴルジ複合体に輸送され 、結局は細胞から分泌される。 実施例２：ＡＩＤＳ患者の治療 患者の血液及び他の体液中に存在するウィルスに結合して、Ｉｎ　ｖｌｖｏでＴ ４＋細胞の感染をブロックするため、実施例１に記載した可溶性Ｔ４糖タンパク 質フラグメントは、典型的には医薬的に許容可能なキャリヤー中で、ヒト免疫不 全症ウィルスに感染した患者に投与される。代わりに又は更に、ウィルスが血液 から分離し得るように患者の血液は固定化Ｔ４糖タンパク質又は可溶性Ｔ４フラ グメントのいずれかを含むカラムを介して循環される。そのような処置は免疫シ ステムがウィルスに対しより効果的な免疫応答をすることを可能にする。即ち非 感染Ｔ４＋細胞を増殖させる。 可溶性Ｔ４フラグメントは治療学的なもの、即ち使用するＨＩＶ感染の細胞外及 び細胞−細胞拡散の阻害剤として使用する。本出願人は、可溶性Ｔ４フラグメン トがｉｎ　ｖｉｔｏｒｏでＨＩＶがＴ４＋標的細胞に対して結合、感染するのを 阻害することを示した（実施例４参照）。可溶性Ｔ４フラグメントのＨＩＶに感 染したヒトへの投与は、ウィルス感染の細胞外拡散を阻害する。更に、ＨＩＶ− 感染Ｔ４＋細胞及び非感染Ｔ４＋細胞の融合（これはウィルスが拡散するルート である）は可溶性Ｔ４フラグメントの投与により阻害される。 従って、可溶性Ｔ４フラグメントの投与は病気の進行を遅らせ、ＡＩＤＳに伴う いくつかの症状を軽減し、新しい病理学的変化の発生を防ぐ。 生化学的に純粋で水溶性試薬である可溶性Ｔ４フラグメントは、Ｔ４−ＨＩＶ相 互作用の競合体（ｃｏ■ｐｅ出ｏｒｓ）を分析する他の試薬と組み合わせて使用 する。ＨＩＶ、ｚンベローブタンパク又はＨＩＶエンベロープタンパクを含有す る生化学的混合物と組み合わせた可溶性Ｔ４フラグメントを、ウィルス結合の阻 害剤をスフリーリングするのに使用する。 膜結合したＴ　タンパク（ｐＴ４Ｂ）をコードするｃ　ＤＮＡを単離し、特徴化 し、哺乳類細胞タイプの変種で発現させた（７０）。可溶性Ｔ４フラグメントは バクテリア、酵母、昆虫及び哺乳類の系で産生ずる。恐ら＜７４タンパクは複雑 に折り重なっているため、哺乳類の系における発現が好ましい。可溶性Ｔ　フラ グメントはＶ４Ｊ４ドメインの後でｐ　７４　Ｂの端を切り取ることにより産生 ずる。このようなりＮＡフラグメントはトランスメンブレンセグメントの前で終 結し、ヌクレオチド位置的１２６４で開始する（第６図）。この組み換えＤＮＡ 分子はトランスメンブレンと細胞質ドメイン両者を欠く。ＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ Ｉフラグメント（ヌクレオチド１〜１２５２を包含する）をｐＴ４Ｂのより小さ いフラグメントから構築することにより、単離する。代わりに、膜−スパニング （ｓｐａｎｎｉｎｇ）のみを除去し、細胞質ドメインに融合したｖ４Ｊ４ドメイ ンを脱離する。 １つのアプローチは、ｐ　Ｔ　ｉ、　Ｂ由来ヌクレオチド　１２５２〜１３４２ からＨｐａ１１部位を補うフラグメントを除去することである。このような構築 物は、ラフ小胞体／ゴルジ複合体に進入し、結果として細胞から分泌するのに必 要なＴ４シグナル配列を維持するさらに、これらの構築物はＴ４タンパクの細胞 外部分を維持し、ここでヒト免疫不全症ウィルスエンベロープ糖タンパク質が存 在する。 哺乳類系で可溶性Ｔ４フラグメントを発現するために、修飾したＴ　４　ＣＤ　 Ｎ　Ａフラグメントを、強い真核生物プロモーター／エンハンサ−並びにＲＮＡ のポリアデニル化及び切断に必要なポリアデニル化部位を含むベクターにサブク ローンする。例えば、シミアンウィルス（ＳＶ４０）の初期プロモーター及びエ ンハンサ−は、可溶性Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　Ａフラグメントから上流に位置する。 ＳＶ４０又は可溶性Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　Ａフラグメントから下流のヒト成長ホル モン遺伝子のいずれかのポリアデニル化部位を配置することにより、転写終結及 びＲＮＡポリアデニル化が達成する。当業者に公知の任意の方法により選択マー カーと一緒にこれらのエレメントを含有する構築物の真核生物への導入は、外因 性ＤＮＡの安定な組み込みを導く。選択培地におけるその成長能力により選択さ れる形質転換体は、培養上溝液へ可溶性Ｔ４フラグメントを分泌する。可溶性Ｔ ４フラグメントはいくつかのアッセイの内の１つ（例えば、ラジオイムノ沈降法 ）により上清液中で検出し、精製する。可溶性Ｔ４フラグメントの精製及び特徴 化は細胞株を構築することにより著しく増強され、これは分泌したタンパクフラ グメントを発現過多にする。タンパクの発現過多にさせる方法が、バクテリア、 酵母、昆虫及び哺乳類の系で使用された。もし構造的に発現したなら有毒である タンパクを生産過多にするため、誘導可能な発現系もバクテリアと酵母において 使用された。可溶性Ｔ４フラグメントの発現過多は可溶性Ｔ４発現ベクターを増 幅することにより完成され、構造的発現過多になる。薬剤メトトレキセート（ｄ ｈｆｒの拮抗剤）の連続的に増す濃度の成長によりジヒドロ葉酸レダクターゼ（ ｄｈｆｒ）遺伝子の増幅が広く用いられた。配列をフードするｄｈｆｒに対し増 幅されたユニットは制限されないので、このアプローチはそれらに隣接する配列 の同時増幅（ｃｏａｓｐｌ’１ｆｉｃａｔｉｏｎ）する結果になった。従って、 ｄｈｆｒを選択的マーカーとして、及び新たに導入した配列を同時増幅する手段 として使用する。この方法は、ｄｈｆｒプラスミドでコトランスフオーメーショ ンされた種々の遺伝子の発現を増加するのに首尾よく使用した。別の増幅スキー ムはプラスミドｐｄＬＡＴ−３と可溶性７４　ＣＤ　Ｎ　Ａ発現ベクターのコト ランスフェクシジン、次いで既に記載した選択を伴う（１０２）。 従って、可溶性Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　Ａ発現構築物は、ｄｈｆｒ発現プラスミドと コトランスフエクションされる。代わりに、可溶性Ｔ　　ｃＤＮＡフラグメント と同じプラスミド上にｈｆｒ遺伝子が存在し、リンクしたコトランスフオーメー ションを許す。これらの構築物のｄｈｆｒ−欠失（ｄｈｆｒ″″）チャイニーズ ノ１ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのトランスフェクシヨン及び続くメトトレキ セートにおける選択は、新たに導入した配列を発現する安定な形質転換体を分離 させる。いくつかのクローンを精製し、培養土清液を回収し、可溶性Ｔ４フラグ メントの存在を分析する。可溶性Ｔ４フラグメントの最大レベルを産生ずるクロ ーンはノーザンプロット及びサザンプロット分析により更に特徴化される。次い でこれらの細胞株は、徐々に濃度が増したメトトレキセートを含む選択培地で培 養される。この選択的圧力は新たに導入したｄｈｆｒ遺伝子及び隣接Ｔ４配列を 増幅した。メトトレキセート最大１度に達した後、生き残った細胞をノーザンプ ロット及びサザンプロット分析して、増幅の程度を決定し、可溶性Ｔ４フラグメ ントの存在について培養上清液を調べた。 培養土清液中の可溶性Ｔ４フラグメントの特徴化のため、いくつかの形質転換体 を（３５Ｓ）−メチオニンで代謝的にラベルする。細胞溶解物（１ｙｓａｔｅｓ ）及び上清液を次いで市販の抗−Ｔ４抗体を使用するラジオイムノ沈降法及びウ ェスタンプロット分析で分析する。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を 沈澱物上で実施し、分泌され、端を切った形のＴ４の予想相対分子量（Ｍｒ）を 観察する。哺乳類系で合成されるので、このタンパクは適当にグリコジル化し、 折り重なっており、即ちジスルフィドブリッジが形成する。培養土清液から可溶 性Ｔ４フラグメントを精製するため、抗−Ｔ４抗体を使用するイムノアフニティ ー力ラムクロマトグラフイーを実施する。カラムに結合したタンパクを高い塩濃 度及び低ｐＨで溶出する。Ｍ「及び溶出したタンパクフラクションの純度を決定 するため、溶出した物質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施する 。 アフィニティー精製した物質をより特徴化するため更に、ラジオイムノ沈降及び ウェスタンプロット分析をも実施する。 可溶性Ｔ４フラグメントを産生ずるために同様のアプローチをバクテリア、酵母 、昆虫で行ってもよい。更に、本明細書で記載したより小さいサイズのフラグメ ント（例えばｖｌＪ１ドメインのみを含有するような）を産生じてもよい。 （以下余白） ベクターの構築 組換えＤＮＡ操作を使用して、ヒトＴ　４　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の塩基対（ｂｐ ）　１−１２５７を、５Ｖ−４０初期プロモーターとウシ成長ホルモン遺伝子の ポリアデニル化領域に従属するＴＡＡ終止コドンとの間に配置した。Ｔ　　ｃＤ ＮＡのこの配列はＴ４リセブタ一のリーダー及び予言された細胞外ドメーンをコ ードしている。 このｓＴ４ミニ遺伝子をヒトＨ−ｒａｓ又はマウスジヒドロ葉酸リダクターゼと 結合して、夫々ベクターｐＳＴ４ＣＨｒａｓ及びｐＳＴ４ＤＨＦＲを作製した。 これらのベクターの構築を以下のように行った。 Ｌ且工４　ｓａｌの構築ニ プラスミドｐ　Ｓ　Ｔ　４　ｓａｌを、他の２つのプラスミドＪＲＴ４及びｐ　 Ｕ　Ｃｓ　Ｔ　４から構築した。これらのプラスミドの構築を以下に詳述する。 の プラスミドＪ　ＲＴ４Ｇｒｉｍニ プラスミドＪＲＴ４を作製するために、プラスミドＤＳＰ１（１０３）をＸｈｏ ｌで切断し、ＳＶ４０ポリＡの初期領域を欠失し、Ｘｈｏ１部位をＤＮＡポリメ ラーゼのクレノー（Ｘｌｅｎｏｖ）断片を領域（１１３）をＢｇｌＩＩ及びＫｐ ｎＩで切断し、Ｋｐｎ１部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑化した。 この２３０ｂｐ断片をＤＳＰＩに結合してＤＳＰＩＢＧＭを作製した。ＤＳＰＩ ＢＧＨをＳ　ｍａ　Ｉ及び５ａ１１で切断しくＳＶ４０初期プロモーター、ｇａ ｌＫコード領域及びＢＧＭポリＡ領域から成る）　ｇａｌＫカセット（ｃａｓｓ ｅｔｔｅ）を、５ａｌＩ末端、　ＢｇｌＩＩ末端及びＳ　ａａ　Ｉ末端から成る 合成リンカ−を使用することにより、ｐ　Ｕ　Ｃ１９（１０７）中の５ａｉ１部 位に結合した。この３つの部分結合の結果、プラスミドＤＳＰＩＢＺＢＧＭ、Ｊ Ｔが得られた。 ＤＳＰＩＢＺＢＧＨ，ＪＴを５ｔｕｌ及びＢｅ１ｌで切断してｇａｌＫコード領 域を欠失させたものを、プラスミドｐＴ４Ｂ（７０）由来Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　Ａ を含む１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ（フィールトーイン）−Ｂａ■Ｈ１断片に結合し て、プラスミドＪＲＴ４を作製した。 プラスミドｐ　Ｕ　Ｃｓ　Ｔ　４を作製するために、プラスミドｐＴ　Ｂ由来Ｔ 　４　ＣＤ　Ｎ　ＡのＨａｅＩＩおよびＨｐａＩＩ断片（１１２５ｂｐ）を、Ｘ ｐｎｌ及びＸｂａｌで切断されたベクターｐＵｃ１ｇに合成リンカ−を使用して 結合した。Ｔ　４　ＣＤ　Ｎ　ＡのＨａｅＩＩ末端を、Ｋｐｎｌ末端及びＨａｅ Ｕ末端をもつ合成リンカ−を用いてｐＵｃｌｌのＫｐｎ１部位に結合した。Ｔ　 ４　ＣＤ　Ｎ　ＡのＨｐａＩＩ末端を、ＨｐａＩＩ末端及びＸｂａｌ末端をもつ 合成リンカ−を用いてｐＵｃｌｇのＸｂａ１部位に結合した。このリンカ−もＴ ４コード領域のヌクレオチド１２５７の後のＴＡＡ停止コドンに挿入した。 得られたプラスミドはｐＵＣｓＴ４であった。 プラスミドｐＳ７４ｓａｌを作製するために、プラスミドＪＲＴ４をＢｇｌＩＩ 及びＳ　ａｃ　Ｉで切断して（ＳＶ４０初期プロモーターとＴ　４　ＣＤ　Ｎ　 Ａの最初の６０２個のヌクレオチドどから成る）、９５９ｂｐ断片を単離した。 プラスミドｐ　Ｕ　Ｃ’ｓ　Ｔ　４をＳ　ａｃ　Ｉ及びＸｂａＩで切断して（合 成リンカ−由来ＴＡＡコドンに従属するヌクレオチド６０３−１２５７に由来す るＴ　４ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから成る）、６６０ｂｐ断片を単離した。これらの２つ の断片を、ＢｇｌＩ［及びＸｂａｌで切断してＳＶ４０初期プロモーター及びフ ルレングスＴ４コード領域を欠失させたＤＳＰＩＢＺＢＧＭ、ＪＴ中に結プラス ミドｐＳＴ４ＤＨＦＲを作製するために、β−グロビンＤＨＦＲ発現カセットを 含むＢｇｌＩＩ−Ｂａｓａｌをｐ　Ｓ　Ｔ　４　ｓａｌのＢａｍＨ１部位に結合 した。β−グロビンＤＨＦＲ発現カセットは、マウスβ−グロビンプロモーター （Ｂｇ１１１部位を含有させるために合成リンカ−を用いてプラスミドｐ　Ｐ　 Ｋ　２８８（Ｊｏｌｔ）の５′末端を修飾した。該プラスミド由来の５５０ｂｐ 　Ｈｌｎｄ　ＩＩ断片）、マウスＤＨＦＲコード領域（プラスミドｐＳＶ２−Ｄ ＨＦＲ（１０９）由来の７３５ｂｐ　Ｈｌｎｄ　ＩＩ　（フィル−イン、　ｆｌ ｌｌ−１ｎ））　、Ｄ　Ｓ　Ｐ　１　＜１０３）由来のＮｈｅｌ　　（フィル− イン）−Ｂａ−Ｈｌ（フィル−イン）ＳＶ４０ポリＡ初期領域、及びマウスＤＨ ＦＲ終止領域ＣＢａ５Ｈ１部位を作製するために合成リンカ−を用いてプラスミ ドｍ　Ｄ　Ｈ９（１１０）の３′末端を修飾した該プラスミド由来の９０７ｂｐ 　Ｈｌｎｄ　ｍ　（フィル−イン）断片）から成る。ｐＳＴ４ＤＨＦＲのプラス ミドマツプは図示のとおりである。 プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　Ｋ　（１１１）をＥＣ０Ｒｖ及びＨＩｎｄ■（フィル− イン）で切断してｇａｌＫ領域を除去し、さらにプラスミドｐ　Ｓ　Ｋ　ｃ　Ｈ ｒａｓ（１１２）由来の、ｃＨｒａｓに関するコード領域を含む８７０ｂｐ　Ｎ ｄｅｌ　　（フィル−イン）−（ヤエナリ（ｓｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ によって平滑化された）ＳａｌＩ断片中に結合することによってプラスミドｐＭ ＥＲｃＨｒａｓを作製した。 可溶性Ｔ４転写カセットをＢｇｌｌｌ　−Ｂａ＊ＨＩ断片を経てｐ　Ｓ　Ｔ　４ ｓａｌから取り出し、ｐＭＥＲｃＨｒａｓのＢａｍＨ１部位（ＳＶ４０初期ポリ Ａに対して３′）中に結合してｐｓ’ｒ４ｃＨｒａｓを作製した。 ｌＯμｇの担体ＤＮＡ　（ＮＩＨ−３ＴＳゲノムＤＮＡ）の存在中、０４１８耐 性を有するベクターであるプラスミドｐＴ　Ｋ　ｎｅｅ１０μｇを用いて、リン 酸カルシウム沈澱法により、プラスミドｐ　Ｓ　Ｔ４ｃ　Ｈｒａｓ（１０μｇ） をＮＩＨ−３Ｔ３細胞（前日、６０ｍ５培養皿当たり５Ｘ１０５細胞を接種した もの）上に共沈澱させた。 この細胞を沈澱ＤＮＡと一緒に３７℃で６時間インキニベーションした。ＤＮＡ 沈澱物を取り出し、新鮮な培地（ＤＭＥＭ、５％Ｎｕ−９ｅｒｕｍＲ（Ｃｏｌｌ ａｂｏｒａｔｊｖｅ　ＲＥｓｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、、　Ｌａｘｌｎｇｔｏｎ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））を該皿に加えた。１６時間後、細胞をトリプシ ン処理し、３つの１００　ｍｍ皿中に接種し、次いで上記培地中に維持した。ｆ ｏｃｉ　（約５０／皿）が１２−１４日以内に現われた。形質転換されたｆｏｃ ｉのうち１１個を選択し、広く引き伸ばした後、上記培地＋５００　μｇ／ｍｌ 　ＧＥＮＥＴＩＣＩＮＲＧ４１１１　　（Ｇｌｂｃｏ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＩｅ ｓ。 Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ）中に選択用の細胞５　Ｘ　１ ０５個／１００ｍｍ皿を接種した。１１個のクローン全てが６４１８選択（５０ ０μｇ／ｍｌ）に生き残ったが、次に該クローンを標準タンパク質イムノプロッ ト分析によりＨ−ｒａｓ　　（ｐＺｌ）に関してスクリーニングした。 最も高いレベルのｐＺｌ　（約２　ｎｇｐ　Ｚ　１　／　ｕ　ｇ　−Ｔｒｉｔｏ ｎ可溶性タンパク質）を発現したクローンを、８５Ｓ−標識メチオニン及びシス ティンと一緒に１８時間インキュベーションした。培養上清及び細胞溶解物を、 Ｔ　　（ＯＫＴ４．ＯＫＴ、Ａ）及びＴ　　（ＯＫＴ８）リセブターに対して特 異的なモノクローナル抗体、ｒａＳタンパク質に対して特異的なポリクローナル 抗体、又は非特異的マウスＩｇＧを用いて免疫沈降させた。ｓＴ４の予言された サイズである約４５ｋｄのタンパク質を、Ｔ４リセブターに対するモノクローナ ル抗体の両方を用いて培養培地から特異的に沈降させた。細胞溶解物中に、ｓ　 Ｔ　４バンドは観察されなかった。期待どうり、ｐＺｌを該細胞から沈降させた が、培養上清からは沈降しなかった。これに続く定量は、精製ｓ　Ｔ　４と比較 して、これらの細胞が、実施例２Ｂに記載のＣＨＯ細胞を使用した場合よりも約 １００倍低い比較的低レベルのｓ　Ｔ　４を産生ずることを示している。 ＤＸＢ−１１細胞、すなわちＤＨＦＲ分化ＣＨＯ細胞系（１０４）を、１０μｇ の担体ＤＮＡ　（ＮＩＨ−３Ｈ３ゲノムＤＮＡ）の存在中、１０〜３０μｇのｐ ｓＴ４ＤＨＦＲを用いてリン酸カルシウム沈澱によりトランスフェクションし、 １日後、６０ｍ■皿に５×１０５細胞を接種した。この細胞をＤＮＡ沈降物と一 緒に３７℃で６時間インキュベーションし、培地を取り除き、次いで新鮮な培地 （Ｆ１２．１０％ＦＢＳ、１００ユニット／　ｍｌペニシリン及びストレプトマ イシン）を該皿に添加した。１６時間後、培地を再び交換し、細胞をさらに２４ 時間インキュベーションした。次に、細胞をトリプシン処理し、３つの１００　 ｗ皿中に接種し、ヌクレオシド非含有培地（ヒボキサンチン及びチミジンを含ま ないＦ−１２，１０％透析ＦＢＳ、並びに１００ユニツト／ｍ＋ペニシリン及び ストレプトマイシン）中で選択した。７−１０日以内でコロニー（約１００７皿 ）が現われた。容器からコロニーをプールし、広く引き伸ばした後、２４穴培養 プレート中に５Ｘ１０３細胞／ウエル及び５Ｘ１０’細胞／ウエルを、又は５× １０５細胞／１００１皿を接種した。２０ｎＭメトトレキセート（園ｔｘ）を含 有するヌクレオシド非含有培地中で選択を開始する３日前に細胞を回収した。個 々のウェル又はクローンをｓ　Ｔ　４発現に関して集合的にアッセイし、さらに 増幅用に選択したクローンを上記の密度で２４穴培養プレート中に接種した。接 種後３日目に、ヌクレオシド非含有培地中の８００ｎＭ　ｓｔｘでの選択を開始 した。この選択法を８μＭ　ｍｉｘ及び３０μＭ　ｍｔｘでの選択に繰り返し使 用した。この方法を用いて、最小３　ｐｇ／細胞／２４時間で可溶性Ｔ４を発現 する数個の細胞系を誘導した。 ＩｔＸ選択条件下、８５０　ｃ−ローラーボトル中に拡散させた付着性細胞培養 物から、血清非含有のコンディショニング培地（ＣＭ）を調製した。集合的に、 Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まないリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で細胞を２ 回洗浄し、生育培地（ヒポキサンチン及びチミジンを含まないＨａｌｓ　Ｆ１２ ．１０％ウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシ ン、並びに選択濃度のｍ１ｘ）を、同様の培地から血清とｍｉｘとを取り除いた 培地＋１ｘｌＴＳ（インシニリン、トランスフェリン及びセレン（Ｃｏｌｌａｂ ｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、））と置換した・２４−４８時間 後、この培地を取り除き、選択生育培地と置換した。 次いで、３−５日以内に、血清非含有培地を置換し、さらにこのサイクルを２ケ 月以上の間、無期限に繰り返した。ｓ、ｏｏｏ　ｘｇでの遠心分離によってＣＭ を清澄させた。プロテアーゼ阻害剤ＰＭｓＦ（フェニルメチルスルホニルフルオ リド）を０．５ｍＭとなるように添加し、加圧膜濾過によりＣＭを約１０倍に濃 縮した。この濃縮ＣＭを２．０００　Ｘ　ｇでの遠心分離により清澄させ、プロ テアーゼ阻害剤アプロチニン（ＳｉｇＩｌａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｓｔ、Ｌｏ ｕｉｓ。 Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加した。このサンプル を直接又は−７０℃での保存後に加工した。 濃縮したＣＭサンプルを５０ｍＭ　　Ｍ　Ｅ　Ｓ　［２−（Ｎ−モルホリノ）− エタンスルホン酸］　、　ｐ）１８．０で２倍に希釈し、０．４５ミクロンフィ ルターを通して濾過した。次に、このサンプルを１００μ會ｐＡＰＭＳＦ　Ｃｐ −アミジノフェニルメチルスルホニルフルオリド）　　（Ｃａｌ１３１ｏｃｈｅ ｍ−Ｂｅｈｒｌｎｇ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）で処 理し、５０ｍＭ　　Ｍ　Ｅ　Ｓ　、　ｐＨ８，０で平衡化したＳ−８ｅｐｈａｒ ｏｓｅ”　　（スルホ−プロピル）　　（Ｐｈａｒｓａｃｌａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｌｏ ｃｈｅｍｌｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ。 Ｎｅｗ　Ｊａｒｓｅｙ）カラムに１．５−２．０　ｕ／ｍｌ−ゲルのタンパク質 濃度で適用した。５０＋ａＭ　　Ｍ　Ｅ　Ｓ　、　ｐＨ６，０中、０−０．５Ｍ 　　Ｎ　ａ　Ｃｊ）の直線的濃度勾配を用いて、このサンプルを溶出させた。約 ０．２Ｍ　　ＮａＣｆＩで溶出したピークフラクションをプールし、ｐＡＰＭｓ Ｆ１００μＸで処理した。Ｓｒ１を含むフラクシヨンを５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイ ムノプロットアッセイによって確認した。４℃に１時間放置した後、５０ＩＩＭ ビスートリスプロパン［１，３−ビス［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル アミノコプロパン］　、　ｐ）ｌＢ、０に対して該サンプルを透析した。 このサンプルを１００μＭ　ｐＡＰＭＳＦで処理した後、５０ｍＭビス−トリス プロパン（ＢＴＰ）、ｐＨ９，０で平衡化したＱ−８ｅｐｈａｒｏｓｅＲ（第四 級アミノエチル）カラム（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）　（５ｍｌサンプル／　ｍｌ− ゲル）に適用した。ｓ　Ｔ　４サンプルはＱ−９ｅｐｈａｒｏｓｅＲに結合せず に、非結合フラクション及びカラム洗浄液中に回収された。非結合サンプルをす ぐにＩ））１８．０に調整した。 最終ステップとして、５０１リン酸塩、０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ４）　。 ｐ）１７．０で平衡化した３０ミクロン５ｕｐａｒｏｓｅ”　１２カラム（２， ５Ｘ４Ｂｃｍ）（ｐｈａｒｍａｃｔａ）上でクロマトグラフィーを行った。カラ ムは３．０ｍｌ／ｍｌの流速で移動操作された。１０ｍ１ずつ分画され、４２分 目のピークをバッチ操作により採取した。この方法によって、約３ｐｇ／細胞／ 日を産生ずる細胞系に関し、全タンパク質２０．０ｍｇ当たり約１．０■の生成 物が得られた。 土工４４！懲 物理的性質：全蛋白質濃度は、カラーメトリックＢＣＡ蛋自分析法（ビシンコニ ニック酸、イリノイ州ロックフォード市のＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅａｌｃａｌ　Ｃ ｏ、提供）を用いて決定した。絶対濃度は定量的アミノ酸分析法で決定した。精 製ｓ　Ｔ　４のアミノ酸組成は標準的なアミノ酸分析法により測定したが、実験 誤差（±１５％）の範囲内で当該分子の予想したシーフェンスと一致しているこ とが判った。最初の２０残基については、そのシーフェンスは予想どおりであっ たが、ただｌ）’Ｓ−１ｙＳ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−−−で初まっていた。 すなわち、成熟アミノ末端は予想したリーダークリップサイトに対して＋３の位 置から初まりでおり、当該位置で予想したシーフェンスとはａｓｎからｌｙｓ変 化で異なっていた。成熟アミノ末端の位置は、マウスおよびシーブＣＤ４蛋白質 の決定しておいた末端とよく一致している。ａｓｎからＩｙｓへの変化は、シー フェンシング上のエラー（単一の塩基変化）又は組み換え操作中に生じた突然変 位のためであると思われる。 イムノエピトープ：モノクローナル抗体０ＫＴ４及び０ＫＴ４Ａは、Ｔ４レセプ ターの非干渉表面エピトープを認識する（１１４）。これらの抗体は、イムノ− プロット分析において還元ＳｐＳ変性蛋白質に結合しないことから、ネイティブ なコンホーメーシッンで特異的である。次に記載するような免疫沈澱法を使うと 、前記両方の抗体は３５Ｓ−ラベル培養上清からｓ　Ｔ　ｉ、を特異的に沈澱さ せることが明らかにされている。 ６０＋ａｍ培養皿１つあたり１×１０６個の細胞を含有するｓＴ　　−生産細胞 の培養物を、１．５　ｍｌのメチオニンとシスティンを含まナイｈ＜　Ｉ　Ｔ　 Ｓ、　１７０　μＣＩ／ｍ１（７）　［”５Ｓコメチオニント３０μｃ１／ｍ！ の［３５Ｓ］　システィンを含むＦ１２培地（カリフォルニア州コスタメサ市の Ｉ　ＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、）において、１６時間３７℃で ラベルした。精製培地（１００μｇ）を等容量の沈澱バッファー　（１０ＭＭの リン酸ナトリウムｐ）１７．５　、１００１ＭのＮａＣＮ、０．１％ＮＰ−４［ １，０，５％の脂肪非含有乾燥ミルク）で稀釈し、１５分間４℃で３μｇのウサ ギＩｇＧとともにインキュベートし、更に３０分間４℃で３０Ｍｇ　（充填容量 ）のプロティンＡセファロ−と゛ ズーーズ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ　Ｔ’−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ）ととも にインキュベートシた。プレクリアーした上滑を５μｇのＯＫ　Ｔ　４　。 ＯＫＴ　　ＡおよびＯＫ　Ｔ　ｇ　　（二、Ｓ−シャーシー州Ｒａｒｉｔａｎ市 の０ｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｅｅｕｔｌｃａｌｓ　Ｃｏｒｐ、のＰ、Ｒａｏ氏か ら提供を受けた）−マウスＩｇＧ（ペンシルバニア州Ｍａｌｖｅｒｎ市のＣｏｏ ｐｅｒＢｉｏｍｃｄｉｃａｌ）　、又はウサギのα−マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｃｏ ｏｐｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）と３０分間４℃でインキュベートした。ＯＫＴ 、。 ＯＫＴ　　Ａ、０ＫＴ８．マウスＩｇＧおよびウサギα−マウスＩｇＧは、２０ μｆ！（充填容ｊｌ）のプロティンＡセファローズビーズとともに３０分間４℃ でインキュベートすることにより、沈澱させた。沈澱に続いて、ビーズを２回２ ００μｇの沈澱バッファーで洗浄し、その後ＮＰ−４０と非脂肪乾燥ミルクを除 いた２００μｇの沈澱バッファーで１回洗浄した。洗浄ビーズを２０ｔｔＤのサ ンプルバッフｙ　−（１２５ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｌ　　ｐ）ＩＢ、８．２０ ％グリセロール、１．４　Ｍ　　β−メルカプトエタノール）中で５分間沸騰し 、１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でその上清の電気泳動を分析し た。同じような結果が、０ＫＴ４Ｂ。 ＯＫＴ　　Ｃ，ＯＫＴ　　Ｄ、ＯＫＴ　　Ｅ、０ＫＴ４Ｆお、、及びＴ４に特異 的な他のＭａｂｓについても得られた。これらの結果から、ｓＴ　　のコンホー メーシッンは正確にＴ４レセプターの表面領域を模倣していることが判る。 Ｓｒ１がＨＩ　Ｖｇｐ１２０と協働し得るか否か及びこの協働がＨＩＶのＴ４細 胞への結合を阻止し得るか否かを確かめるため、約５μｇの精製ｓＴ　　を、０ ＫＴ４もしくはコントロール抗体で被覆したセファローズビーズに吸着させた。 次いでこのビーズを３５８−メチオニンラベルＨＩＶの溶解物と混合した。 ｓＴ　　と０ＫＴ４の結合体は１２０ｋｄのエンベロープ糖蛋白質のみを共沈さ せる。Ｓｒ１が存在しないか又はトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞か らのコントロール上清が存在する場合には、ＯＫＴ、ビーズで沈澱するウィルス 性蛋白質は何もない。また、コントロールとしてのマウス免疫グロブリン（ＯＫ Ｔ４に調和させたアイソトーカで被覆したセファローズビーズをＳｒ１とともに インキュベートしても、ウィルス性蛋白質は沈澱しない。これらの研究は、１９ ２３球の表面に存在する他の細胞表面成分をもたないＳｒ１がＡＩＤＳウィルス のエンベロープ糖蛋白質と特異的に共働し得ることを示している。 サイトフルオロメトリーを使って、完全なＨＩＶのｇｐ１２０とＴ４との相互作 用によりＡＩＤＳウィルスのＴ４＋４＋細胞への結合が阻止されることが判った 。Ｔ４”ＣＥＭ細胞をＳｒ１を存在させるかさせないでＨＩＶにさらした。ウィ ルス吸着の後、細胞を洗浄し、フルオレスセイン結合抗−ＨＩＶ抗体にさらし、 フローサイトメトリーで分析した（第１７図）　（４ｇ）。 ｓＴ　　が存在しないと、ＨＩＶはＴ４”ＣＥＭ細胞に有効に結合する。ＨＩＶ をＳｒ１でブレインキュベートすると、ウィルスのＴ４＋細胞への結合は阻止さ れる（第１７図）。ｌＯナノグラムの精製ｓ　Ｔ　４は、ウィルス性蛋白質１０ ０ナノグラムの結合を阻止するのに充分である。エンベロープ糖蛋白質が全ウィ ルス性蛋白質の５％を含むなら、Ｔ４４ｇ＋）１２０のモル比が計算値で５：１ ならＨＩＶのＴ４＋細胞への結合を完全に阻止し得る。 ＨｌｖによるＴ　÷細胞の感染を阻止し得るｓ　Ｔ　４の能力も調べた。フォト へマグルチニン刺激ヒトリンパ球をＳｒ１を存在させるか又は存在させないでＨ ＩＶ接種材料の逐次１０倍稀釈にさらし、洗浄し、そしてマイクロカルチャーに 接種した。ウィルスにさらした後４日、８日および１２日０にイムノアッセイを 用いて感染培養の頻度を決定した（４７）。このようにして、　１２日０に露出 細胞培養の５０％を感染するのに必要な稀釈の逆数を感染性ウィルス力価ＩＤ５ ０とした。Ｓｒ１が存在しないとき、ウィルス接種材料を用いて観察したＩＤ− ５０は約１０５である。 しかしながら、精製した可溶性Ｔ４を８マイクログラム／ｍｌ存在させると、感 染性は略４１０ｇ５だけｌｏｌ、！＞のＩＤ−５０に減少する（Ｍ２Ｒ図）。こ の）ＩＩＶによる感染性の激減は、感染の全コースに亘って認められる。非特異 的な阻止又はｓ　Ｔ　４の毒性影響に対するコントロールとして、ウィルスへの 初期露出後１８時間たってｓ　Ｔ　４を培養物に添加した。感染後１８時間たっ てｓ　Ｔ　４に露出した培養物はＩＤ−５０においてｌｌｏｇ阻止しが示さない 。このことはおそらく初期感染の後ウィルス拡散が阻止されたためであろう。こ のように、ウィルスをｓ　Ｔ　４とブレインキュベートした際にみられるウィル ス感染性の４１０ｇ減少は、ウィルス表面上でのｓ　Ｔ　４とｇｐ１２０との特 異的な協働によるものであると思われる。したがってこれらの粒子はもはや細胞 表面上のＴ４レセプターと相互作用することができない。１ｍｌあたり１０５個 の感染性粒子をｓＴ　　の８マイクログラム／　ｍｌとブレインキュベートする ときにも、４１ｏｇｓ阻止が認められた。 １０　　個の感染炸粒子／ｍ＋のウィルス調製物は、１０９粒子／ｍｌを含有す ると計算される。仮に各粒子が１０００のエンベロープ糖蛋白質を含むなら、エ ンベロープ蛋白質１モル当り１００個の１４分子の割合で阻止が認めらることに なる。 構造的にインタクトなｓ　Ｔ　４が比較的大量に利用できるなら、Ｔ　と抗原細 胞の表面およびＴ４とＨＩＶウィルスの各相互作用のメカニズムに関する研究を 前進させることができる。 Ｔ４＋ヘルパー細胞と抗原細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｃｅ ｌｌｓ）（Ｂ細胞およびマクロファージ）との相互作用の特異性は、少なくとも 部分的には、Ｔ４とクラスＩＩＭＨＣ分子との協働によるものと思われる（１０ ５．１０６）。かなりの量の精製ｓ　Ｔ　４が利用できるなら、Ｔ４とクラスｎ ＭＨＣ分子との間の物理的な協働を直接調べることができる。 ｓＴ　　がｇｐ１２０と結合し得る能力およびｓ　Ｔ　４が１ｎ　ｖｉｔｒｏで ウィルス感染を阻止し得る能力は、ｓ　Ｔ　４がＡＩＤＳ患者の治療に有力な抗 −ウィルス剤であることを示している。 実施例４：可溶性ＶＩＶ２Ｊ４可溶性Ｔ−可溶性グー４フラグメントＦＲをつく るため、プラスミドｐｓＴ４ＤＨＦＲ（実施例３に記載）をＥｃｏＲＩおよびＸ ｂａｌで切断し、５Ｔ−４ニア−ｓ　Ｔ　４　ｓａｌをＸｂａｌおよびＢｂｖＩ で切断し、リーダー領域を除いた可溶性Ｔ−４シークエンスを含む１１２０塩基 対のコードフラグメントを単離した。ＥｅｏＲＩエンド、Ｋｐｎｌサイト、Ｂｂ ｖｌエンドをもつ合成リンカ−を使って、前記フラグメントをＥｃｏＲＩ／Ｘｂ ａｌ切断ｐＳＴ、ＤＨＦＲに結合させた。このフラグメントは、上で単離した５ Ｔ−４フラグメントにあるＢｂｖＩと相補的である。得られたプラスミドをｐＳ Ｔ４ＢＢＶＩＤＨＦＲという。 リンカ−領域を含む小さいフラグメントを除去した。ＯＭＰＡ。 ＧＳは、Ｃ■リボゾーム結合シークエンスの３′末端でＮｄｅｌサイトに挿入さ れている合成シーフェンスをもつＰＡＳ　１（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１　：　１２ｇ（１９８３）　　； 米国特許第４．５７８，３５５号明細書）の誘導体である。合成シーフェンスは 、ＯＭＰＡリーダーとそれに続くマルチリニアーシーフェンスとを含む。合成シ ーフェンスは実質的に次のものである。 ５’　−Ｔ　ＡＴＣＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＧＣＧ　ＡＴＴ　 ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＣＴＧＧ（：Ｔ　ＧＧＴ　ＴＴＣＧＣＴ　Ａｃｅ　Ｇ ＴＡ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＧＣＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＧＡＣＣＴＡ　Ｇ ＴＴ　ＡＡＣＴＡＧ−３’ プラスミドｐ　Ｕ　Ｃｓ　Ｔ　４をＮｃｏＩおよび５ａＩＩで切断し、５ＣＤ− ４シークエンス［Ｔ−４ヌクレオチド１２４−１２５７１を含む１１４９塩基対 フラグメントを単離した。このフラグメントをＮｃｏｌ／５ａＩＩ切断ＯＭＰＡ 、Ｇ切断０含ＰＡてＯＭ　Ｐ　Ａ　ＳＴ４を調製した。 Ｂ　ｂｖ　ＩをつくるためプラスミドＯＭＰＡＳＴ４をＮａｅＩおよびＸｂａｌ で切断した。この切断によって得られた５Ｔ−４コード領域を含む小さいフラグ メントを除去した。プラスミドＳ　Ｔ　４ＢＢＶＩＤＨＦＲをＫｐｎｌで切断し 、得られた３′オーバーハングをＴ、ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。こ の平滑末端ＤＮＡを次いでＸｂａｌで切断し、ＣＴ　４ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのヌクレ オチド１４５−１２５７を含む１１２４塩基対フラグメントを単離した。単離フ ラグメントをＮａｅｌ／Ｘｂａｌ切断ＯＭＰＡＳＴ切断０スＰＡＳＴ４プラスミ ドミドＯＭＰＡＳＴ　１４Ｂｂｖｌを調製した。 ｐ　ｕ　ｃ　Ｇ　Ｔ４１８４の構築ニブラスミドｐ　ｕ　ｃ　Ｓ　ｔ　４１８４ をつくるため、Ｔ−４ｃＤＮＡ　［アミノ酸（−２３）から（＋１７８）をコー ドする［１８２ｂｐフラグメント〕からＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＮ ｈｅＩサイトで合成リンカ−５ｋ７２７／７２５　　（Ｎ　ｈｅ　ＩとＡｖａｌ 末端）に結合させた。５ｋ７２７／７２５はＴ−４アミノ酸１７９−１８５をコ ードする。５ｋ７２７／７２５のＡｖａＩ末端を、ｐ　Ｕ　ｃ　Ｓ　Ｔ　４　　 （ヒトｃＤＮＡの１１９８−１２５７ｂｐを含み、Ｔ−４レセプター続いてＴＡ Ａ終結コドンのアミノ酸３５１−３６９をコードする）のＡｖａｌ−ＸｂａＩフ ラグメントに結合した。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ末端でフランクしたこのシー フェンスを、ｐＵｃ１９ポリリンカー（ｓｋ７２７／７２５）のＥｃｏＲＩおよ びＸｂａｌ末端でｐＵｃ１９に挿入した。５ｋ７２７／７２５は実質的に次のも のである。 ５’　ｇａｃｃａｇａａｇｇａｇｇａｇｇｔｇｃａａｔｔｇｃｔａｇｔｇｔｔｃ ｇｇａｔｔｇａｃｔｇｃｃａａｃ　ｓ’ｇｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃａｃｇｔｔ ａａｃｇａｔｃａｃａａｇｃｃｔａａｃｔｇａｃｇｇｔｔｇａｇｃ　５’ｐ　ｕ 　ｃ　Ｓ　Ｔ４１０６の構築ニブラスミドｐ　ｕ　ｃ　Ｓ　Ｔ４１０Ｂをつくる ため、Ｔ−４ｃＤＮＡのＥｃｏＲ１−ＡｖａＩＩフラグメント（１−４１３ｂｐ からなり、アミノ酸（−）　　２５−８７をコードする）をＡｖａＩＩサイトで 合成リンカ−５ｋ７９１／７９２　　（Ａｖａｎ−Ａｖａｌ末端）に結合した。 ５ｋ７９１−７９２はＴ−４アミノ酸８ｇ−１０４をコードする。５ｋ７９１／ ７９２のＡｖａｌ末端をｐ　ｕ　ｃ　Ｓ　Ｔ４　　（ヒトｃＤＮＡの１１９８− １２５７ｂｐからなり、Ｔ−４レセプター続いてＴＡＡ終結コドンのアミノ酸３ ５１−３ｆ１９をコードする）のＡｖａｌ−ＸｂａＩに結合させた。ＥｅｏＲＩ およびＸｂａＩ末端でフランクしたこのシーフェンスを、ｐＵｃ１９ポリリンカ ーのＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ末端でｐＵｃ１９に挿入した。５ｋ７９１／７９ ２は実質的に次のものである。 ５’　ｇａｃｃａｇａａｇｇａｇｇａｇｇｔｇｃａａｔｔｇｃｔａｇｔｇｔｔ＊ ｇｇａｔｔｇａｅｔｇｃｃａａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｃａｃｇｔｔａａｓ ｇａｔｃａｃａａｇｅｅｔａａｃｔｇａｅｇｇｔｔｇａｇｃ　ｓ’５Ｔ４１８４ ＤＨＦＲの構築ニブラスミドｓ　Ｔ４１８４Ｄ　ＨＦ　Ｒをつくるため、ｐ　ｕ 　ｃ　５７４１８４　（アミノ酸３５５〜３７３に融合したアミノ酸−２５〜１ ８３をコードする）のＥｃｏＲＩ　−ＸｂａＩ　７ラグメントを、５Ｔ−４をコ ードするＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメントの代わりに、ｐｓＴ４ＤＨＦＲのＥ ｃｏＲＩおよびＸｂａｌ末端に詰るため、ｐｕｃｓＴ４１０Ｂ（アミノ酸３５１ −３６９に融合したアミノ酸−２３から１０８をコードする）のＥｅｏＲＩ−Ｘ ｂａｌフラグメントを、５Ｔ−４をコードするＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌフラグメン トの代わりに、ｐ　ｓ　Ｔ　４　Ｄ　ＨＦ　ＲのＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌ末端 に結ＤＨＦＲ欠ｔｒｉ　ＣＨＯ細胞系（Ｕｒｌａｕｂ　ｅｔ　ａｌ、上記文献） であるＤＸＢ−１１細胞に、６０ｍ＋ｓ皿に５　Ｘ　１０５個の細胞をシーディ ングしてから一日経過した後に、ｌＯμｇのキャリヤーＤＮＡ（ＮＩＨ−３Ｔ３ ゲノムＤＮＡ）を存在させて、リン酸カルシタム沈澱法によりｌＯ〜３０μｇの ｐＳＴ−４１８４ＤＨＦＲをトランスフェクションした。沈澱物を６時間後に取 り出し、ｌＯ％透析１’１８児 ウシ書拾血清を含むがハイポキサンチン又はチミジンを含まないＦ１２培地に置 き換えた。コロニー（１つの皿あたり約１００）が１６日後に表われた。６皿の コロニーをプールし、拡張し、２４ウエルの培養プレートに１ウェル当り３　Ｘ 　１０’個の細胞をシードした。これらの細胞を、ヌクレオシドを含まないが８ ０ｎＨのメトトレキセート（腸ｔｘ）を含む培地で成長させ、トランスフェクシ ョンしたｄｈｆｒとｖ１ｖ２Ｊ４ミニ遺伝子の可能性ある増幅のために選択した 。８ｎＭのｍｔｘ中で２週間後、活発的に成長する細胞を明らかに認めた。欠失 変異株（ｄｅｌｅｔｉｏｎ■ｕｔａｎｔｓ）の発現を調べるため各ウェル又はコ ロニーる集密的に分析し、更に増幅のために選択した６゛のを上に記載したのと 同じ密度で２４ウエル培養プレートにシードした。高レベルのＶＩＶ２Ｊ４を発 現する多数のサブポビニレーションをｌｔＸのレベルを増加しなカラ成長させ、 ｄｈｆｒ転写単位と７４１８４（ＶＩＶ２−Ｊ４）ミニ遺伝子を更に増幅させる ため選択した。いくつかの細胞系を二のようにして誘導した。これらは少なくと も約２ｐｇ／ｃｅｌｌ／２４ｈｒｓの量で欠失変異株を発現する。 ｍｔｘ選択条件下に８５０　ｃＪローラシートル中に拡張した付着細胞培養物か ら血清を含まないならし培地（ＣＭ）を調製した。 集密的に細胞を、Ｋ１ｇ２＋＆Ｃａ２＋を含まないリン酸緩衝すリーン（ＰＢＳ ）で２回洗浄し、成長培地（）１イボキサンチンとチミジンを含まないＨａｌｓ Ｆ　１２．１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、ストレプトマ イシン、および選択的濃度のｍｔｘ）を、血清とｍｔｘを除き１ｘｌＴｓ（イン シュリン、トランスフェリン、セレニウム（Ｃｏｌａｂｏｒａｔｌｖｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）　）を加えた同じ培地に置き換えた。２４〜４８時間後 培地を取り除き、選択的成長培地に変えた。血清非含有培地を次いで３〜５日間 以内に再び加え、このサイクルを無限に、すなわち２ケ月以上繰り返した。ＣＭ をｇｏｏｏ　ｇの遠心分離にかけてきれいにした。 プロテアーゼ阻止剤ＰＭＳＦ　（フェニルメチルスルホニルフルオライド）を０ ．５ｓＭに加え、圧力膜フィルターでＣＭを１０倍に濃縮した。この濃縮ＣＭを ２０００．の遠心分離にかけてきれいにし、プロテアーゼ阻害剤であるアブａチ ニン（ミズーリー州セントルーイス市のＳｌｇｍａ　Ｃｈｅｍｌｃａｌ）を５μ ｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。サンプルを直接処方するか又は−７０℃で貯蔵し た後処方した。 ウェスターンプロット分析：ｖ１ｖ２Ｊ４生産ＣＨＯ細胞からのならし培地を濃 縮し、１５％ポリアクリルアミド還元ゲルにかけた。蛋白質をニトロセルロース 紙に移し、編成Ｅ、　Ｃｏ１１誘導た。この抗血清は、約２５ｋｄで移動するＶ ＩＶ２Ｊ４ダブレットを特異的に認識する。これは、リーダープロセシング後の ＶＩＶ２Ｊ４コードシークエンスの予想されたサイズに相当する。 このダブレットの物理的な根拠は明らかでない。これはＮ−リンクしたグリコシ レージョンの差から生じたものとも思われない。ただし、このグリコシレージョ ンめためのＴ−４における２つのコンセンサスシーフェンスはＶＩＶ２Ｊ４に存 在しないからである。 免疫エピトープ：モノクローナル抗体０ＫＴ−４及び。 ０ＫＴ−４Ａ、０ＫＴ−４Ｂ、０ＫＴ４Ｃ，０ＫＴ４Ｄ。 ０ＫＴ４Ｅと０ＫＴ４Ｆは、生来の膜結合Ｔ−４レセプター上の表面エピトープ を特異的に認識する（　Ｒａｏら、Ｃｅ１ｌアツセイにおいて、還元された、Ｓ ＤＳ変性変性タンクに結合しない生来のコンフオメーシツンに対して特異的であ る。以下の免疫析出法を用いて３５Ｓ−ラベル培養上清から、双方の抗体が特異 的にＶＩＶ２Ｊ４を析出することが明らかになった。 ＶＩＶ２Ｊ４を生成する細胞を１３０＋ｏ■の培養皿あたり１ｘ１０６細胞含有 する培養物を、１．５　ｍｌのメチオニン及びシスティンを含まず、ＩＴＳ及び １７０μＣ１／ｍｌの［３５Ｓコメチオニンと３０ｕＣｉ／ｍｌの［３５Ｓ］　 システィン（Ｉ　ＣＮ　Ｂｉｏｉｅｄｉｃａｌｓ。 Ｉｎｃ、、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）を含むＦ１２培地中、３７℃で１ ６時間ラベル処理した。透明培地（１００μｇ）を等量の析出ノくツファー１０ １Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，５（１００ｓＭ　Ｎ　ａ　Ｃｉ）　、　０．１％ Ｎｐ−４０”。 ０．５％無脂肪ドライミルク）で希釈し、３μｇのウサギＩｇＧと共に４℃で１ ５分間インキュベートした。その後、３０μｇ　（充填容ｆｆ１）のタンパクＡ セファ０−スビーズ（Ｐｈａｒｓａｃｉａ　Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｓｉｃａｌｓ） で４℃にて３０分間処理した。予め清澄化した上滑を、各々５μｇの上記した０ ＫＴ４抗体、マウスＩｇＧ（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｍａｌｖ ｅｒｎ、　ＰＡ）　、あるいはウサギα−マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｃｏｏｐｅｒ　 Ｂｌｏｓｅｄｉｃａｌ）と共に４℃にて３０分間インキュベートした。０ＫＴ４ 抗体、マウスＩｇＧ及びウサギα−マウス１ｇＧを、２０μｇ　（充填容量）の タンパクＡセファロースビーズと共に４℃で３０分間インキニベートして析出さ せた。析出ののち、ビーズを、２００７１ｊＪの析出バッファーで２回、２００ μｇの析出バッファーからＮ　Ｐ　−４０’及び無脂肪ドライミルクを除いた溶 液で１回洗浄した。洗浄したビーズを２０μｇのサンプルバッファー（１２５ｍ Ｎ　トリス−ＨＣ１、ｐＨ６，８、２０％グリセリン、１．４Ｍ　　β−メルカ プトエタノール）中で５分間煮沸し、その上清を１２．５％５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル上で電気泳動により分析した。０ＫＴ４を除いて、モノクローナル 抗体の各々は、３５Ｓでラベルした培養上清からＶＩＶ２Ｊ４を特異的に析出さ せた。 ＯＫ　Ｔ　４　Ａ　ｌ：　ヨルＶ　Ｉ　Ｖ　２　簀４　（’）　認ｍ　ハ、ＶＩ Ｖ２Ｍ４＞＜ＡＩＤＳウィルスの感受性細胞に対する結合を阻害するであろうと いうことを示した。ＶＩＶ２′ｆ４を含有するかまたはそれを欠如するＣＭを最 初のアッセイに使用した。ＨＩＶをＣＭと共にインキュベートし、Ｔ−４”　Ｃ ＥＭセルラインに対するウィルスの結合は、ＭｃＤｏｕｇａ　Ｉら、５ｕｐｒａ （１１８５）に記載のようにして、ＦＩＴＣ結合抗−ＨＩＶ抗体とのインキュベ ーションおよびＦＡＣＳ　（フルオレセイン活性化セルソーター）分析により定 量化した。ＶＩＶ２Ｊ４を生産するセルラインに由来するＣＭは希釈度依存的に ＨＩＶ結合を阻害したが、調和した（ｍａｔｃｈｅｄ）非生産（ＤＸＢ−Ｈ）細 胞に由来するＣＭではなんらの応答も見られなかった。 タンパクＶユＪ４はＣＨＯ細胞細胞間様に発現した。しかし、これらの予備実験 において、明らかにこのタンパクは培地中には輸送されなかった。他の組換え有 機体で生産されたＶＩＪ４が０ＫＴ４Ａに結合することを示す別の研究によると 、哺乳動物の細胞培養で発現されたＶＩ　Ｊ４はＨＩＶ結合を阻害するだろうと 思われる。 完全フロインドアジュバントに１：１の容量で入れた本発明の精製可溶性Ｔ４断 片（上記のようにして調製）５０μｇを８週齢のＢａ１ｂ／ｃマウスの腹腔内に 注射する。その後−月毎に不完全フロインドアジュバントと混合した可溶性Ｔ４ 断片をマウスにブーストし、尾清脈を通して採血する。血清のイムノグロブリン 画分を硫酸アンモニウム沈澱により作成し、固定化したＴ４断片を用いるアフィ ニティークロマトグラフィーによって特定の抗−可溶性Ｔ４断片抗体を精製する 。 Ｔ４断片抗体（上記のようにして調製）　５Ｄｕｇを遺伝子組成が同じで同属の マウスの腹腔内に注射し、不完全フロインドアジュバントに入れた抗−可溶性Ｔ ４断片抗体を毎月ブーストする。 融合の４日前、３日前および２日前に、生理食塩水に入れたイムノグロブリン５ ０μｇをマウスの清脈内にブーストする。次に、−１１央 既に記載されており本発明が係る分野で公知の手段に従って、牌細胞をＰ３Ｘ８ ３　ＡＣ３，６５Ｓ非分泌性ミエローマ細胞と融合する。 ２週間後、ハイブリドーマの上清の抗−可溶性Ｔ４断片抗体に対する結合能をラ ジオイムノアッセイによってスクリーニングする。次いで、陽性のクローンにつ いて、ヒト免疫不全ウィルスエンベロープ糖タンパクおよびＡＩＤＳウィルスに 対して結合する能力を検定する。また、「ワンステップ」法を用いて、完全フロ インドアジュバントに入れた可溶性Ｔ４断片をマウスの腹腔内に注射し、生理食 塩水に入れた可溶性Ｔ４断片を静脈内にブーストし、そして上記のようにしてマ ウス牌細胞をミエローマと融合する。その後、ハイブリドーマの上清を、可溶性 Ｔ４断片抗−イディオタイプ抗体に関して検定する。 下記の文献は明ｉｓ中に引用されたものである：λ三ＦΣ只：％＋ｊＳ １、Ｅ、Ｌ、　　Ｒｅ１ｎｈａｒｚ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　”Ｄｉｓｃｒｅｔ ｅ　　Ｓｔａｇｅｓ　　ｏｆＨｕ：Ｉａｎ　　工ｎセｒａセｈｙｅ＋ｉｃ　　Ｃ ）ｉｆｆｅｒｅｎセｉａセｉ口ｎ：　　　入ｎａｌｙｓｉｓｏｆ　Ｎａ口ａｌ　 Ｔｈｙｚｏｃｙセａ　ａｎｄ　Ｉａｕｋａｚｉｃ　Ｌｙｐｐｈｏｂｌａｓｔｓｏ ｆ　　Ｔ　　Ｃａ１ｌ　　Ｌｉｎｅａｇｅ”、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　 　λｃａｄ、　　Ｓｃｉ。 υＳ入２二乙：１５１ａ＆−１５９２（１９１１０）。 ｅｙｔｅｓ”、　Ｃａ１ｌ　１９：　８２１−８２７　　（１９８０）。 ３、　　　　　　Ｍ−Ｌ、　　Ｂｌｕａ　ａｔ　ａｌ、、　　”Ｃｏｅｘｐｒ＠ ５ｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ４　　ａｎｄ　Ｔ８ｏｎ　　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　　Ｂ ｌｏｏｄ　　Ｔ　　Ｃｅ１ｌｓ　　Ｄａｚｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｂｙＴｗｏ−ｃ ｏｌｏｒ　　Ｆｌｕｏｒｏｅｓｃｅｎｅ＊　　Ｆｌｏｗ　　Ｃｙｔｏｍａセｒｙ ”、　　Ｊ。 ニーｕｎ口１．ｙ区：　　２２８１−２２８６　　（１９８５）４、　　　　　 Ｅ、Ｇ、　ＥｎｇＬａｍａｎ　ａｔ　ａＬ、、　”Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ 　）！ｕｍａｎτＬｙｍｐｈｏｃｙｔ＊　　５ｕｂｓｅｔｓ：　　　１（ｅｌｐ ｅｒ　　ａｎｄ　　５ｕｐｐｒｅｓ−ｓｏｒ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　　Ｃａ １ｌｓ　　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ　　ａｎｄ　　Ｒｅ５ｐｏｎｄｔｏ　　Ｄｉｓｔ ｉｎｃｔ　　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａセ１ｂｉｌｉｔｙ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ”、　 　Ｊ。 Ｉｍｐｕｎｏｌ、　　１２７：　　２１２４−２１２９　　（１９８１）５、　 　　　　　入、Ｍ、　　Ｘｒａｎ、５３ｃｙ　　ξＦ＋　ａｌ、、　　”Ｌｏｎ ｇ−ヒｅｒｍ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｃｙｔｏ−ＶＳ入　ヱ２：　２コロ５−２コロ ９　　（１９５１２）。 ｐ＋；：＋；Ｃ；５　　；　？　Ｄ　ｉ：：　豐：＠７，２　　Ｍｌ　角；　　 −Ｈ４ｓ２　二二：＝ｐ１？ｉ’Ｈ’−Ｌ５−；’２　　Ｃ：＝；Ｌａ：　　？ 、ａ三ユ；乙Ｓ”、　　　？：：＝、　　Ｎｔ＝−１λ；ｔｉ、　　５：ｉ。 Ｕ５λ　ヱ旦：　４コシ５−４コｉｓ　　（Ｌ５ａ２）。 ？、　　　　　　　　　Ｗ、Ｅ、　　　ＢｉｄｄｉｓＯｎ　　ａｔ　　ａｌ、、 　　　”Ｐｏ５ｓｉｂｌｅ　　Ｉｎｖｏｌｖｅｐｅｎ＝ｏｆ　　ｔｈａ　　０Ｋ Ｔ４　　Ｍｏ１ａｃｕｌａ　　ｉｎ　　Ｔ　　Ｃａ１ｌ　　Ｒａｃｏｇｎｉセｉ ｏｎ　　ｏｆＣｌａｓｓ　　Ｉ工　ＨＬ入　入ｎセｉｇａｎｓ’、　　　Ｊ、　 　　Ｅｘｐ、　　Ｍｅｄ、　　　１互互：１０６５−１０７６　　（１９Ｂ２） 。 ａ、　　　　　　　　　　０．Ｒ二　ＷｉＬｃｌａ　　ａｔ　　ａｌ、、　　” ＥｖＬｄｔｎｃａ　　工＝ｐＬｉｃａｔｉｎｇ　　Ｌ）τ４ｉｎ　Ｃ１ａｓｓエ エ圏Ｃ劫ｔｉｇａｎ　Ｆｔｅａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌλｎｔｉ ｂ口ａｙ　　　ＧＷ　　　１５　　　（λＪ１セｉ−Ｌ：１Ｔ４）　　　Ｂｌ口 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２２、　　　　　Ｓ、Ｍ、　　Ｆｒ１ｅｄｈａｎ　ａｔ　ａｌ、、　　吻’０Ｔ −ＣＬＬ：　　λＨｕｘａｎ　ＴＣａｌｌ　Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙ ｔｉｃ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｔｈａｔ　Ｐｒｏ−ｄｕｃｔｓ　工Ｌ−２ｉｎ　Ｈ ｌｑｈ　Ｔｉｔｅｒ’、　Ｊ、　　ニーｕｎｏＬ　　１２８：９コ５−９４０　 　（１９１！２）。 ２３、　　　　　　Ｄ、入、　　Ｔｈｕｒｌａｙ−Ｌａｗｏｎ、　　Ｌ、　　Ｃ ｈｅｓｓ　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｌ、　　Ｓセｒｏ−ｍｉｎｇ＠ｒ、　　”５ｕｐｐ ｒａｓｓｉｏｎ　　ｏｆ　　工ｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　Ｅｐｓｔｇｉｎ−Ｂａｒｒ 工ｎｆｅｃｔｉｏｎ：　　　　λ　Ｎａｗ　　Ｒｏｌｅ　　ｆｏｒ　　入ｄｕｌ ｔ　　Ｈｕｍａｎ　　ＴＣｎｌｌｓ”、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、　１４６： 　４９５−５０８　（１９７７）。 ２４、　　　　　　　　ＪｊＪ、　　Ｇｏｄｉｎｇ、　　”Ｔｈｅ　　Ｃｈｒｏ ｎｉｃ　　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　　Ｍａｔｈｏｄ　　ｏｆｃｏｕｐｌｉｎｇ　　Ａ ｎｔｉｇｅｎｓ　　ｔＱ　Σｒｙｔｈｒ口ｃｙｔｅｓ：　　　　Ｄｅｆｉｎｉ− ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｓｏｍｅ　　工ｚｐｏｒｔａｎｔ　　Ｐａｒａｍｅｔａｒ ｓ”、　　Ｊ、　　　Ｉｍ−：：ｕｎＯｌ　、　Ｗ、ｌ”−？、Ｃ：Ｓ　　Ａ！ ≧；　εＬ−６６（１９７６）。 Ｔ＋Ｌ、　Ｃτ乙り二し：″、己　　λ、：；、　Ｖａｎ　　ｄ七：　　三ｂα １λ　Ｎ会ν　τｅＣ’Ｑ−ｎｉｒ＝ａ　　二：：　　＝”　　λ５ｓａｙ　　 ｃ？　　工ｎｆｔＣ；：”Ｌ”−ｙ　ｅ−人ｄａｎｏｖｉ：′ｕｓ　　ＤＮ入ｎ 、　　Ｖｉｒｏｌｃｇｙ　　５．ヱ：　　４５６−４６フ　（１９７コ）。 ２６、　　　　　　Ｍ、　　Ｗｉｇｌｅｒ　　ａｔ　　ａｌ、、　　”Ｂｉｏｃ ｈａｏｉｃａｌ　　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　　ｏｆＳｉｎｇｌｅ−Ｃｏｐｙ　　Ｅ＊ ｃａｒｙｏセｉｃ　　Ｇｅｎｅｓ　　Ｕｓｉｎｇ　　Ｔｏｔａｌ　　Ｃａｌ−１ ｕｌａｒ　　ＤＮＡ　　ａｓ　　Ｄｏｎｏｒ”、　　Ｃｅ１ｌ　　ｒ４：　　７ ２５−７コｌ　　（１９７ｇ）。 ２７、　　　　　　　Ｍ、　　Ｗｉｇｌｅｒ　　ａｔ　　ａｌ、、　　”Ｔｒａ ｎｓｆｅｒ　　ｏｆ　　Ｆ’ｕｒｉｆｉａｄ　　Ｈｅｒ−ｐ＠ｓ　　Ｖｉｒｕｓ 　　Ｔｈｙｍｉｄｉｎａ　　Ｋｌｎａｓａ　　Ｇａｎｇ　　ｔｏ　　（ｕｌ−ｔ ｕｒｅｄＭｏｕｓ＠　Ｃａ１ｌｓ”、　　Ｃａ１ｌ　　Ａλ：　２２コー２コ２ 　　（１９７７）。 ２８、　　　　　　　　　Ｊ、Ｍ、　　Ｃｈｉｒ７ｙｉｎ　　ａｔ　　ａｌ、、 　　”工５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌｌｙ　　入ｃｔ ｉｖ＠　Ｒｉｂｏｎｕｅｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　ｆｒｏｍ　　５ｏｕｒｃｅｓ Ｅｎｒｉｃｈｅｄ　　ｉｎ　Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ”、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　　１８：５２９４−５２９９　　（１９７９）。 ２９、　　　　　　Ｈ，λｖｉｖ　　ａｒ、ｄ　　Ｐ、　　Ｌａｄｅｒ、　　” Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａｌｌｙ　　　λｃ ｔｉｖ＠　　Ｇｌｏｂｉｎ　　　Ｍｅｓｓａｎｇｅｒ　　　ＲＮ入　　ｂｙＣｈ ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　　ｏｎ　　Ｏ：ｔｉｇｏｔｈｙｍｉｄｙｌｉｃ　　 Ａｃｉｄ−Ｃｅｌｌｕ−ｔｏｇａ″、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　入ｃａ ｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳλ　６９：　　１４ｏａ−１４１２（１９７２）。 コＯ，Ｔ、　　Ｈｕｙｎｈ、　　Ｒ，入、　　Ｙｏｕｎｇ　　ａｎｃｌ　　Ｒ， Ｗ、　　Ｄａｖｉｓ、　　”Ｃｏｎ−５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｓｃｒ ｅｅｎｉｎｇ　　ｃＤＮ入　　Ｌｉｂ、ｒａｒｉａｓ　　　ｉｎｇｔｌｏ　ａｎ ｄ　ｇｔｌｌ”、　ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎｃｒ　Ｔｅｃｈｎｉｃｒｕｅｓ−人Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｏｏｒｏａｃｈ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、ａｄ、（Ｏｘｆ ｏｒｄ：工ＲＬ　ｐｒａｓｓ）　、　　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。 コＬ　　　　　　　　Ｔ、　　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　”Ｔ ｈｅ　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　５ｔｒｕｃ−ｔｕｒａｌ　　　Ｇｅｎ ＠ｓ　　　ｆｒｏｍ　　　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　　　ｏｆ　　　Ｅｕｃａｒｙｏ セ１ＣＤＮ入−０色１１１互：　　６８７−７０１　　（Ｌ９７１ｉ１）＋３２ −　　　　　　　　Ｍ−Ｍ−Ｄ＆”／ｌＳ　　ａｔ　　ａＬ−ｒ　　　”Ｃｅ１ １−Ｔ”／ｐ）＠−５ｐ＠Ｃ１ｆＬＣＣＤ）ＩλＮと；１．　λＣとＡ、　　５ Ｈｉ、　υＳλ　且Ａ：　　２−ｇ４−２ｚｇＢ　　＜ｚヲ８４）。 ：１３．　　　　　　　　Ｔ、　　　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　　Ｅ、Ｆ、　　　 Ｆｒ１ｔｃｈ　　　ａｎｄ　　Ｊ、　　　Ｓａ！ｒｏｏｋ。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎ工ｒ４　　　（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　 Ｆ、ａｒｂｏｒ、　　　ＮＹ；Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｒ＝ｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　　（１９８２）。 ３４、　　　　　　　　Ｐ、Ｗ、Ｊ、　　　Ｒｉｇｂｙ　　　ｅｔ　　ａｌ、、 　　　”Ｌａｂａｌｉｎｇ　　　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ−ｎｕｃｌａｉｃ　　入ｃ ｉｄ　　ｔｏ　　Ｈｌｇｈ　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　入ｃｔｔｖｉｔｙ　　工ｎ Ｖｉｔｒｏ　　ｂｙ　　Ｎ１ｃｋ　　Ｔｒａｎｓｌａｔｉ口ｎ　　ｗｉｔｈ　　 ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅニー　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏ１．　λλユ ニ　２コフ−２５１（１９７））。 コ５．　　　　　　　　Ｊ、　　Ｖｉａｉｒａ　　ａｎｄ　　Ｊ、　　Ｍｅｓｓ ｉｎｇ、　　’１Ｔｈａ　　ｐυｃ　　Ｐｌａｓｉｉｄｓ。 ａｎ　　Ｍｌコーｐ７−Ｄｅｒｉｖｅｄ　　Ｓｙｓｔｅｍ　　ｆｏｒ　　工ｎ５ ｅｒｔｉｏｎ　　Ｍｕｔａ−ｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｃｉ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ 　ｗｉｔｈ　５ｙｎｔｈａｔｉｅ　ｔ７ｎｉｖｅｒ−ｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒｓ’ 、　Ｇ＠ｎ＠１９：　２５９−２６１ｉ　　（１９８２）。 ３Ｇ、　　　　　　　　Ｆ、　　Ｓａｎｇｅｒ、　　Ｓ、　　Ｎ１ｃｋｌａｎ　 　ａｎｄ　　入−Ｃ０ｕｌＳＯｎｔ　　　”ＤＮ入Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　　ｗ ｉｔｈ　　（ｈａｉｎ−Ｔｅｒｎｉｎａｔｉｎｇ　　工ｎｈｉｂｉ−ｔｏｒｓ″ 、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳ入　ヱ４ −：　　５４６３−５４６７　　（１９７７）。 コア＋　　　　　　　　Σ、　　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　　”Ｄａｔａｃｔｉｏｎ 　　ｏｆ　　５ｐａｃｉｆｉｃ　　５ｅｑｕ＠ｎｃｅｓλニロｎｇ　　ＤＮＡ　 Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　　５ｅｐａｒａｔｅｄ　　ｂｙ　　Ｇｅｌ　　Ｅｌｅｃｔ ｒｏ−ｐｈｏｒｏｅｓｉｓ”、　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　９旦： 　５０３−５１７　　（１９７５）。 ３８、　　　　　Ｇ、Ｍ、　　Ｃｈｕｒｃｈ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｇ１１ｂｅｒｔ、 　　”Ｇｅｎｏｍｉｃ　５ｅｑｕａｎｃ　−ｉｎｇ”、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ ｔｌ、　　入ｃａｄ＋　Ｓｃｉ、　　υＳ入　且ｉ：　　１９９Ｌ・−１９９５ （１９８４）。 コ９．　　　　　　　　Ｒ，！（、５ｃｈｅｌｌＣｒ　　ａｔ　　ａｌ、、　　 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Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質と特異的に結合体形成可 能な治療剤であって、ポリペプチドから成り、そのアミノ酸配列は表６に示すア ミノ酸配列の約＋３から約＋１８５までが約＋３５１から約＋３６９までのアミ ノ酸配列に融合したものであることを特徴とする治療剤。
2. （２）ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質と特異的に結合体形成可 能な治療剤であって、ポリペプチドから成り、そのアミノ酸配列は表６に示すア ミノ酸配列の約＋３から約＋１０６までが約＋３５１から約＋３６９までのアミ ノ酸乳列に融合したものであることを特徴とする治療剤。
3. （３）ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖タンパク質と特異的に結合体形成可 能な治療剤であって、ポリペプチドから成り、そのアミノ酸配列は表６に示すア ミノ酸配列の約＋３から約＋１８５までのものであることを特徴とする治療剤。
4. （４）請求項１，２又は３のいずれかに記載の治療剤の有効量と医薬的に適用可 能な担体とから成る医薬組成物。
5. （５）請求項４の医薬組成物の有効量を患者に処方することから成るヒト免疫不 全ウイルスに感染した患者の治療方法。
6. （６）請求項１，２ヌは３のいずれかに記載のポリペプチドをエンコードする発 現ベクター。
7. （７）請求項６の発現ベクターから成る宿主細胞。
8. （８）細菌宿主細胞である請求項７の宿主細胞。
9. （９）大腸菌宿主細胞である請求項８の細菌宿主細胞。
10. （１０）真核宿主細胞である請求項７の宿主細胞。
11. （１１）哺乳類宿主細胞である請求項１０の真核宿主細胞。
12. （１２）酵母宿主細胞である請求項１０の真核宿主細胞。
13. （１３）昆虫宿主細胞である請求項７の宿主細胞。
14. （１４）請求項６の発現ベクター系を適する条件で育成し、治療剤を生産させ、 かくして得られた治療剤を回収することから成る請求項１，２又は３のいずれか に記載の治療剤の生産方法。