PT89838B - Processo para a preparacao de agente terapeutico susceptivel de formar um complexo com glicoproteina de involucro de virus de imunodeficiencia humana - Google Patents

Description

TÍVEL DE FORMAR UM COMPLEXO COM GLICOPROTEÍNA DE INVÓLUCRO DE VÍRUS DE IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Neste pedido de patente de invenção faz-se referência a diversas publicações, utilizando numerais árabes entre parênteses. Podem encontrar-se as indicações completas destas referências no fim da especificação, imediatamente antes das reivindicações. Neste pedido de patente de invenção indica-se como referência a descrição destas publicações na sua totalidade, no sentido de se descrever de um modo mais completo o estado da técnica a que a presente invenção diz respeito.

As diferentes classes funcionais de linfócitos T reconhecem os antigeneos na superfície de populações distin tas de células alvo. As células auxiliares T interactuam largamente com macrófagos e células B; As células citotóxicas T interactuam com uma gama mais ampla de células alvo portadoras de antigenes. Estes fenómenos de reconhecimento celular são mediados, provavelmente, pela associação específica de mo léculas de superfície quer nas células efectoras , quer nas cé lulas alvo. A superfície das células T caracteriza-se por diversas proteínas polimórficas bem como não polimórficas, as quais são reduzidas pela maior parte dos linfócitos T. Apesar da maioria destas moléculas ser comum a todas as células T, existem duas classes de proteínas que diferem substancialmente das diferentes classes funcionais de células T, e estas pro teínas têm sido relacionadas com as interacções célula T-célu la alvo. Uma classe de moléculas de superfície distingue-se da maioria dos sub-grupos funcionais de linfócitos T: as glicoproteínas de superfície T4 e T8. Inicialmente, no desenvolvimento do timo, as glicoproteínas T4 e T8 expressam-se conjuntamente na superfície dos timócitos (1). No sistema imunológico periférico, as moléculas T4 e T8 expressam-se nos sub-grupos de mutualidade exclusiva das células T e, raramente se expressam apenas na mesma célula (2,3). A molécula T4 expressa-se nas células T que interactuam com alvos portadores da maioria das moléculas complexas de histocompatibilidade, da classe II (NHC), enquanto as células T portadoras de T8 interactuam com alvos que expressam as proteínas MHC da classe I (4,5,6,7,8 e 9). A população T4 dos linfócitos T contém células auxiliares, enquanto a população T8 contém a maior parte das células citotóxicas e supressoras (6,10). No entanto, raras células T, T4⁺, podem funcionar como células citotó xicas ou supressoras (6, 10), sugerindo que a expressão de T4 ou T8 se encontra mais estreitamente ligada ao reconhecimento da classe MHC do que à função efectora. A importância destas moléculas nas interacções célula T-célula alvo, podem demonstrar-se mediante estudos com anticorpos monoclonais. Os anti

corpos dirigidos contra epítopes específicos da molécula T4 (ou a L3T4 equivalente, do murino), inibem a proliferação das células T induzida pelo antigene, libertação de linfoquina e a função celular auxiliar (7,8,11,12,13). De um modo semelhante, os anticorpos monoclonais dirigidos contra T8 (ou o Lyt2 equivalente, do murino) inibem a destruição mediada pelas células T citotóxicas (14,15). estas observações conjunta mente com o facto de que T4 e T8 não revelarem polimorfismo significativo, conduz à hipótese de T4 e T8 reconhecerem, res pectivamente, as regras não polimórficas das moléculas da classe I e da classe II.

Uma segunda classe de proteínas que se pensa, diferirem de células T efectoras distintas são as receptoras que reconhecem o antigene em associação com as regiões polimórficas das moléculas MHC (16,17,18). As interacções dos lin fócitos auxiliares T limitam-se em grande parte às proteínas MHC da classe II que expressam as células alvo portadoras de antigene, enquanto as células citotóxicas e supressoras T se limitam a moléculas MHC da classe I portadoras de alvos (4,5, 6,7,8,9). Estas interacções específicas podem ser mediadas pelo receptor das células T (ou receptores) que reconhecem o antigene no contexto de moléculas MHC específicas (17,18). Assim, os linfócitos T, podem possuir dois receptores indepen dentes capazes de reconhecer ambos os determinantes constante e polimórfico das proteínas MHC e, estes receptores podem ser responsáveis pelo alvejamento específico de populações funcio nalmente distintas de células T.

síndroma de imunodificiência humana adquiri da SIDA caracteriza-se por uma deplecção dos linfócitos T4 . Como consequência, a imunidade mediada pelas células T, encontra-se comprometida nos pacientes com SIDA, de que resulta o aparecimento de infecções oportunistas e de neoplasmas pouco comuns, graves. A SIDA resulta da infecção dos linfócitos T por uma quantidade de retrovírus estreitamente relacionados (LAV, HTLV-III ou ARV), actualmente denominados vírus da imunodeficiência humana (HIV). A amplitude de infecção destes agentes limita-se às células que expressam na sua superfície a glicoproteína T4.

Deste modo, as glicoproteínas T4 podem servir não só como um receptor para as moléculas na superfície das células alvo, mas, também, como um receptor para o vírus da SIDA. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra as células T4 bloqueiam a infecção das células T4 pelo vírus da SIDA, in vitro. Para além disto, estudos recentes demonstraram que quando se expõem os linfócitos T, T4⁺, ao vírus da SIDA a glicoproteína de 110 Kd que envolve o vírus se associa com a molécula T4 da célula hospedeira. Por consequência, pode explicar-se o carácter linfotrópico do vírus pela expressão limitada do seu receptor, T4 , nas subpopulações dos linfócitos T. A deplecção de linfócitos T, T4⁺, na SIDA origina o enfraquecimento da resposta imunológica celular. Para além disto, a SIDA é frequentemente acompanhada por disfunções do sistema nervoso central (SNC), a maioria das vezes, como consequência duma encefalite sub-aguda. Tem-se identificado o ARN e o ADN do vírus da SIDA nos cérebros afectados e tem-se isolado o vírus a partir do cérebro e do líquido cerobrospinal dos pa cientes com destúrbios neurológicos. Estas observações sugerem que o vírus da SIDA infecta as células cerebrais e é directamente responsável pelas lesões do SNC observadas nos pacientes com SIDA. Assim, o vírus da SIDA pode ser neurotrópico ou linfotrópico. Deste modo, é importante determinar se T4 também se expressa no SNC ou se moléculas de superfície específicas do cérebro, adicionais, podem funcionar como um receptor para o vírus da SIDA.

A elucidação das interacções específicas de T4 e TB seriam facilitadas pelo isolamento dos genes T4 e T8, a determinação da sua estrutura e a possibilidade de introduzi-los em diferentes meios celulares. Referiu-se, recentemente, o isolamento e a sequência do cDNA que codifica a molécula T8 (19,20,21). A sequência da proteína deduzida indica que T8 é uma proteína ligada a uma membrana com um domínio N-terminal que cria homologia com a região variável das cadeias leves de imunoglobulina.

RESOMO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona um agente terapêutico capaz de formar um complexo de um modo específico com a glicoproteína de invólucro do vírus da imunodeficiência humana, que compreende um polipeptido. Num aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácidos do polipéptido consiste na sequência de aminoácidos apresentada na Figura 6, desde cer ca de +3 até cerca de +185 fundida com a sequencia de aminoáci dos desde cerca de +351 até cerca de +369. Num outro aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácidos do polipéptido compreende a sequência de aminoácidos apresentada na Figu ra 6 desde cerca de +3 a cerca de +185.

A presente invenção também proporciona um método para tratamento de um paciente infectado com o vírus da imunodeficiência humana. 0 método consiste na administração ao paciente de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do agente terapêu tico da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Diagramas Citof1uorográficos De CQlQraçSo_Por Imunofluorescência Indirecta com OKT 4 e OKTx 8

Incubaram-se as células (5x10^) com os anticor-

pos monoclonais ΟΚΊχ 4B ou OKT*^8 do rato, lavaram-se e, depois, incubaram-se com anti-imunoglobulina do rato desenvolvida na cabra conjugada com FITC. Analisaram-se as células num Seleccionador Celular FRCS IV e traçou-se o seu diagrama num computador VAX 11/780 com o número de células em função da fluorescência tabelada. As células não transformadas, NIH 3T3 , e as células L proporcionaram citofluorográficos idênticos. Fro 2.2 é uma linha de células T leucemias com fenótipo T3 ;

T4⁺; T8⁺, Tll⁺. LTD-4 é um transformante primário T4⁺ da célula L obtido a seguir à transferência do ADN genómico total.

3A⁺ é uma linha de células NIH 3T3 transformada com a construção de expressão retroviral T4-pMV6tk/neo.

Figura 2. Análise da mancha Northern do ARN derivado das células L, T4⁺ e T4 e de células Humanas

Efectuou-se a electroforese de três microgramas de ARN de poli(A)⁺ ou de 12 Hg do ARN total (células T e

Ί r

ί timócitos periféricos), através de um gel de agaroseformaldeído a 0,8%, manchou-se sobre GeneScreen (New England Nuclear), e sondou-se com uma inserção de cADN de T4 de 0,6 Kb marcada com P. As células T4 incluem LTD-4 (transformantes das células L, T4⁺ e T8 ), hibridomas das células T, SK-7 (T4⁺ e T8 ) células leucémicas QT-CLL (T4⁺, T8 ), células leucémicas Fro 2.2 (T4⁺, T8 ), linfócitos T periféricos enriquecidos com

T4 e timocitos humanos. As células T4 incluem células não transformadas, tK7 (transformantes das células L, T8⁺) células Hela, células do neuroblastoma humano (IMR), e linfócitos T periféricos enriquecidos com T8. Expôs-se a pista dos timócitos humanos durante um período quatro vezes maior e fotografaram-se com película de alto contraste.

Figura 3. Mapas das Nucleases de_Restrição de pT4B e do Gene

T4, Estratégia de Seguenciação e Vectores Recombinantes

A. Alinhamento dos fragmentos de restrição Bam Hl do cADN e do pT4B e do gene T4. A ordem dos fragmentos Bam Hl no gene T4 determinou-se por análise da mancha Southern e cartografia do clone genómico. 0 alinhamento da extremidade 5' de Pt4B e do gene T4 indica-se por linhas ponteadas e a região a sombrea do no pT4B corresponde à sequência de código. Indicam-se as dimensões em quilobases.

B. Estratégia de Seguenciação. As setas indicam a extensão da sequência determinada pelos fragmentos de sub-clonagem no interior de M13 e a sequênciaçãosegundo o procedimento de terminação didesoxi (36).

C. Vectores de expressão eucarióticos. Estas construções contêm duas repetições terminais longas do vírus de leucemia do

- s - / ί

murino de Moloney (LTRs) cujos sentidos se indicam por setas. Subclonou-se o cADN de pT4B no sítio Eco RI de cada vector no sentido indicado, a) A construção T4-pVcos7. b) A construção T4-pMV6tk/neo contém o gene da neomicina-fosfotransferase fundido com o promotor da timidino-quinase de HSV.

Figura 4. Análise da Mancha Southern do ADN das células não transformadas e das células L T4-⁺-e das Células Humanas T, B e_não_L in f ói de s

Efectuou-se a digestão de 10 microgramas de

ADNs celulares com Bam Hl, efectuou-se a sua electroforese através de gel de agarose a 0,8%, manchou-se sobre GeneScreen e sondou-se com uma inserção de cADN de pT4B marcado radioactivamente. As dimensões indicam-se em quilobases. Aparecem em todos os ADNs humanos bandas híbridas com as dimensões de 20 Kb, 6,6 Kb, 4 Kb , 1,8 Kb e 1 Kb. Os ADNs de T4 , de origem não linfóide, incluem células L não transformadas, fibroblastos humanos (GM), células do neuroblastoma humano (NB), e células Hela. CB, CP58 e CP94 são ADNs derivados de linhas de células humanas B transformadas por EBV . LTD-4 é o transformante primário da célula L,T4⁺. RPMI e HSB2 são linhas leucémicas de células T humanas T4 ; as células E⁺ e os timócitos (Tim.) contêm células T, T4⁺. OT-CLL , JurKat (Jurk.), Fro 2.2, CEM e Molt 4 são células T, T4⁺. O gÀM4 é um clone genómico que contém sequências que abarcam a extremidade 3' do gene T4.

Figura 5. Imunoprecipitação da Glicoproteína T4 a partir das células_3T3 NIH Transformadas can Construções De Expressão Retroviral

Submeteu-se a cromatografia com lectina de len9 / i tilha para enriquecer com, glicoproteínas, proteínas marcadas ,35, . .

com L-[ Sj-metionina , a partir de dois transformantes NIH 3T3 independentes, linfócitos T periféricos e células 3T3 não trans formadas. Limparam-se previamente 2,5 χ 10⁶ cpm de cada uma das amostras e, depois, procedeu-se à imunoprecipitação com os anticorpos monoclonais OKT 4 e Proteína A-Sefarose. Lavaram-se as gotas, dissolveram-se em tampão de amostra e efectuou-se a electroforese das mesmas através de gel de poliacrilamida -SDS a 10% sob condições redutoras (pistas a-d) e não redutoras (pistas e e f). Pista a, células NIH 3T3 não transformadas. Pista b, T4C2, uma célula NIH 3T3 transformada com a construção T4-pVcos7. Pistas c e e, 3A⁺, uma célula NIH 3T3 transformada com a construção T4-pMV6tk/neo. Pistas d e f, linfócitos humanos T, periféricos. As massas moleculares relativas (M ) são expressas em quilodaltons.

Figura 6. Sequêcia de Nucleótidos do_cADN de T4 e Sequência

Transferida da Proteína T4

As sequências de nucleótidos e as sequências de aminoácidos previsíveis do clone pT4B de cADN obtido de acrdo com a estratégia de sequenciação representada na Figura 3B. Os números indicados acima das sequências de aminoácidos designam as posições dos resíduos aminoácidos. Os números do lado direito indicam as posições dos nucleótidos. Todas as cisteínas extra-celulares estão assinaladas por (·) ou (o). A sequência principal (L), as regiões semelhantes à região variável (V), as regiões semelhantes às regiões de união (J), as regiões da transmembrana (TM) e as regiões citoplásmicas CIT) indicam-se por setas horizontais colocadas por debaixo /

ί das sequências, embora sejam ambíguos os limites exactos. Também se indicam dois sítios potenciais de glicosilação ligados a N (Asn-Leu-Thr) (CHO).

Figura 7. Transferência In Vitro do ARN derivado da Transcri£ão_de_SP£

Subclonou-se no interior do vector de expressão pSP65 (Promega Biotec) a extensão total da inserção de cADN de T4. Efectuou-se a transcrição do ADN plasmídico linearizado com polimerase SP6 (40), e transferiu-se o ARN num sistema de gérmen de trigo (Bethesda Research Laboratories) contendo D-[³]-metionina. Submeteram-se os produtos da transferência in vitro a electroforese , através de um gel de poliacrilamida-SDS a 10% (pista T4 ) . Utili2ou-se como controlo o ARN de pituitária de bovino (BP). Exprimem-se as massas moleculares relativas (M^) em quilodaltons.

Figura 8. Diagrama Esquemático da Glicoproteína T4 que Abarca a Membrana Celular

T4 consiste em quatro domínios semelhantes a VJ dispostos de modo encadeado (V^ ^v ₄ J₄), num segmento hidrofóbico que abarca a membrana (área a sombreado) e numa região citoplásmica carregada (CIT). Indicam-se (---), dois sítios potenciais de glicosilação N-ligada, na porção extracelular. Também se encontram assinaladas ( ) as posições dos intrões 2-8 do gene de T4.

Figura 9. Alinhamento das regiões Variável, de União e de

Transmembrana de T4 com Membros da Família do Gene da imunoglobulina

A. Alinhamento da sequência de aminoácidos da região variá11

vel de T4 com uma imunoglobulina J606 de cadeia leve K do rato (66) , com T8 (20) , com uma cadeia YT35 do receptor do antigéne da célula T humana (97) e com uma cadeiae<HPB-MLT do receptor do antigene da célula T humana o<(98). Os resíduos invariáveis da região variável de cadeia leve incluem-se (INV.) no alinhamento. Efectuou-se o alinhamento tendo em vista maximizar as identidades e homologias estruturais com T4, as quais aparecem como resíduos no interior de pequenos compartimentos. As linhas abaixo das sequências com as letras A, B, C, C', D, E, F e G indicam os resíduos que formam cordões )b(67). O cordão Τ’ da sequência G continua no interior da sequência J.

B. Alinhamento da sequência de aminoácidos da região de união de T4 com as sequências J de consenso da cadeia Τ’ do receptor do antigene das células T, com as cadeias leves Kapa e lambda da imunoglobulina e com a sequência J da cadeia ck do receptor da célula T humana (99).

C. Alinhamento das regiões de transmembrana de T4 e de uma cadeia Jb da classe II de MHC (100). Abaixo da sequência indica-se o domínio suposto da transmembrana (TM).

Figura 10. Esquema da Nuclease de Restrição do Gene de T4 no ADN Cromossómico Humano

Determinou-se a posição dos 9 exões pela cartografia do clone genómico , por análise de mancha Southern e por sequenciação nucleotídica. Encontram-se dentro de pequenos compartimentos a sequência principal (L), a região semelhante à região variável (V),a região semelhante à região de união (J), a região de transmembrana (TM) e a região citoplásmica (CYT). A posição do codão de metionina circundado pela sequência de iniciação de consenso indica-se (ATG) no início do exão principal (L); o codão de terminus TGA apresenta-se na extremidade do segundo exão citoplásmico (CYT). Indicam-se as dimensões em quilobases.

Figura 11. Vectores Recombinantes de Expressão Retroviral e Construção de células Transformadas

A. Vectores Recombinantes de Expressão Retroviral. 0 pMV7 contém duas repetições terminais longas do vírus do sarcoma de murino de Moloney (LTRs), repetidas directamente no sentido indicado pelas setas. 0 pMV7 também contém o gene bacteriano da neomicina-fosfotransferase (neo) fundido com o promotor HSV da timidinoquinase (tk). Subclonou-se no sítio Eco RI no sentido indicado pelas setas, a extensão total das inserções de cADN que codificam T4 (T4B) (70) ou T8 (T8F1) (20), originando, respectivamente, T4-pMV7 e T8-pMV7. As sequências de código indicam-se como regiões a sombreado. Indicam-se as dimensões em quilobases.

B. Estratégia de Transferência do Gene Mediada pelo retrovírus .

Figura 12. Eficácia da Infecção das células T4⁺ Transformadas e Isoladas Naturalmente

Inocularam-se as células com diluições de dez vezes em série, do vírus de SIDA, incubaram-se durante 18 hoo ras a 37 C, lavaram-se e plaquearam-se em microculturas. Deter minou-se a frequência das culturas infectadas por um ensaio imunoabsorvente ligado a uma enzima (ELISA) 12 dias após a infecção (46). Traçou-se o diagrama das culturas como a % de

culturas positivas em função do logaritmo da diluição do ví rus. 0 título do vírus infeccioso (ID-50) define-se como o recíproco da diluição para a qual 50% das culturas apresentam reacção positiva ao vírus (47). As células T4⁺ isoladas natu ralmente incluem os linfócitos periféricos normais estimulados pela fitohemaglutinina (PHA) (* - ) e a linha de células

T, CEM (o----O). As linhas de células T4⁺ transfectadas incluem células T,HSB2-T4⁺ (Λ----O e células B, Raji-T4⁺ (·----·).

As .Minhas de células Τθ⁺ trans fectadas, HSB2-T8⁺ e Raji-T8 ⁺ (θ---) servem como controlos nestes estudos.

Figura 13. Formação de Sincicia nos Transformantes T4⁺__Hela

A. Misturaram-se 2 x 10^ transformantes Hela-T4⁺ dispostos em mono-camada com 2 x 10 células H9 que produzem vírus de SIDA e incubaram-se a 37°C. A inspecção das culturas após 18 horas, revelou que para cima de 90% dos núcleos na lâmina com a mono-camada se encontravam no interior de sincicia.

B. Adicionaram-se anticorpos monoclonais anti-T4A (1:20) às mistas culturas na altura da sementeira. A inspecção das culturas após 18 horas revelou uma ausência completa de fusão celular .

Fotografaram-se as culturas com uma ampliação de 160 X.

Figura 14. Análise de Citometria de Fluxo dos vírus de SIDA gue se ligam às Células Transformadas T4⁺

Coluna A. Incubaram-se células (5 x 10^) com anticorpos monoclonais anti-T4 (-----) ou anti-T8 ( ), conjugados com fluoresceína, lavaram-se e analisaram-se por citofluorometria.

Coluna B. Incubaram-se as células (5 x 10 ) com tampão (---) ou com o vírus da SIDA (--), lavaram-se, incubaram-se com anticorpo anti-vírus de SIDA conjugado com fluoresceína e, analisaram-se por citof1uorometria.

Coluna C. Incubaram-se as células (5 χ 10 ~* ) com tampão (---) ou com o anticorpo monoclonal anti-T4A seguido do vírus da SIDA (--), ou com anticorpo monoclonal anti-T8 seguido do vírus da

SIDA ( * ♦ ) . Após uma lavagem, adicionou-se o anticorpo anti-vírus da SIDA conjugado com fluoresceína e, analisaram-se as células por citofluorometria.

Os histogramas de fluorescência (número de células versus intensidade de fluorescência) de cada uma das linhas de células encontram-se dispostos horizontalmente.

Figura 15. Análise de Mancha Northern do ARN Derivado do

ÇérebrosedeRato.de Células Linfóides e Mielóides

A. Análise de mancha Northern de amostras de ARN humano. Efec tuou-se a electroforese de 1 micrograma de ARN de poli(A)⁺ de Raji (linha de células Β, T4 ), U937 (linha de células monocíticas T4⁺) e Jurkat (linha de células T, T4⁺), e de 5 microgramas de ARN de poli(A)⁺ do córtex cerebral, através de gel de agarose-formaldeído a 1 % ,manchou-se sobre Hybond (Amersham) e sondou-se com pT4B (70), uma inserção de cADN de T4 marcado ³²n com P.

B. Análise da Mancha Southern de amostras de ARN de rato. Efec tuou-se a electroforese de 5 microgramas de poli(A)⁺ a partir de células 3T3 (linha de células fibroblásticas), da parte frontal e ocipital do cérebro e 20 microgramas do ARN total dos timócitos, através de gel de agarose-formaldeído a 1%, transferiu-se para um Hybond e sondou-se com pL3T4B, uma inser-

2 ção de cADN de L3T4 marcada com P,

Figura 16. Esquema do Plasmídeo psT4DHFR plasmídeo psT4DHFR é um derivado de pUC18 que contém de 1 a 1257 pb do plasmídeo pT4B do clone de cADN de T4 que codifica o segmento extracelular e principal de T4. Este CADN de sT4 insere-se entre um promotor inicial SV40 e um ligante de síntese que contém um codão de terminação TAA (inserido) seguido da região de poliadenilação do gene da hormona do crescimento de bovino. A sequência de expressão sT4 encontra-se ligada a uma sequência de expressão hdfr do rato que consiste no promotor ^)-globina, na sequência que codifica a dhfr do rato e na região da poliadenilação SV40.

Figura 17. Histograma de Fluorescência (número de células em função da intensidade_de fluorescência)

A sT4 inibe a ligação de HIV às células CEM T4⁺. Incubaram-se as células com tampão (·—·—·—), com HIV previamente incubado com sT4 ( ---- ), ou com HIV previamente incubado com sobrenadantes de controlo concentrados, das células não transformadas Dxb~H (—--) , lavaram-se, exposeram-se ao anticorpo anti-HIV conjugado com uma substância fluorescente e analisaram-se por citofluorometria. Apresenta-se um histograma fluorescente (número de células em função da intensidade de fluorescência).

Figura 18. Inibição do Contaqiq de HIV por sT4

Efectuou-se uma titulação da contágios idade duma inoculação de HIV (ensaio ID-50). Incubaram-se com células indicadoras (linfócitos humanos estimulados com PHA) séries de 10 diluições do vírus, durante 18 horas. Depois, lavaram-se as células e plaquearam-se em microcultura (lxlO⁵ células por cultura, 10 culturas por diluição). Testaram-se os sobrenadantes no 42, 82 e 12® dias, quanto a HIV, por um ensaio de captura de antigene. Efectuaram-se as titulações ID-50 em meios que continham 8,6 jig/ml de sT4 , que se adicionaram à diluição de HIV 30 minutos antes da inoculação das células e que se manteve no meio de cultura ao longo da experiência ( ), ou em meio contendo sT4 introduzido apcs as 18 horas iniciais de inoculação ( O ) (controlo adicional retardado), ou em meio sem sT4 ( □ ) (controlo).

A. Diagrama da percentagem de culturas positivas para HIV ao dia, em função da diluição do vírus inoculado.

B. Diagrama de ID-50 (inverso da diluição do vírus para a qual 50% das culturas foram positivas), ao 42, 82 θ 122 dias .

C. Diagrama da percentagem de culturas positivas para HIV ao dia, em função da variação das concentrações de sT4 utilizando uma diluição de 10 de HIV.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A presente invenção, proporciona um agente terapêutico capaz de formar, de um modo específico, um complexo com a glicoproteína de invólucro do vírus da imunodeficiência humana que compreende um polipéptido. Num aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácidos do polipéptido compreende a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 6, a par17 tir de +3 a aproximadamente,até +185 fundida com a sequência de aminoácidos a partir de +351 aproximadamente, aproximadamente. Num outro aspecto da presente invenção, a sequência de aminoácidos do polipéptido consiste na sequência de aminoácidos apresentada na Figura 6 a partir de cerca de + 3 a +106 ,aproximadamente, fundida com a sequência de aminoáeidos a partir de cerca de +351 a +369 aproximadamente. Ainda num outro aspecto da presente invenção a sequência de aminoácidos do polipéptido consiste na sequência de aminoácidos apresentada na

Figura a partir de cerca de +3 até aproximadamente + 18 5.

Também se proporciona uma composição farmacêutica utilizável como agente terapêutico, para o tratamento de pacientes infectados com um vírus da imunodeficiência humana. Esta composição farmacêutica compreende uma sequência de aminoácidos da presente invenção que é capaz de formar especificamente um complexo com a glicoproteína de invólucro do vírus da imunodeficiência humana e que é solúvel numa solução aquosa e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Tais veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são conhecidos na especialidade a que pertence a presente invenção e incluem, mas não se limitam, tampão fosfato 0,01-0,lM, de preferência 0,05 M, ou solução salina a 0,8%.

Também se proporciona um método para o trata mento dum paciente infectado humana. Este método consiste uma quantidade eficaz de uma tém um veículo aminoácidos da farmaceuticamente presente invenção com o vírus da imunodeficiência na administração ao paciente de composição farmacêutica que conaceitável e uma sequência de , é capaz de formar um cotnple xo específico com a glicoproteína de invólucro do vírus da

imunodeficiência humana e solúvel em soluçab aquosa, capaz de tornar os vírus da imunodeficiência humana (também aqui referidos como os vírus da SIDA) e com os quais o paciente se encontra infectado, incapazes de infectar as células T4⁺.

A caracterização, in vitro, das propriedades biológicas e imunobiológicas da proteína sT4 indicam que a proteína tem importância na prevenção e tratamento da SIDA. Os estudos indicam que a proteína sT4 actua como um inibidor da propagação extracelular e célula a célula, do vírus. Devido ao facto de sT4 ter demonstrado bloquear a ligação do vírus às células alvo T4⁺ em culturas, crê-se que a administração de sT4 a pacientes infectados, inibiria a propagação extracelular do vírus. Por isso, sT4 é importante como um agente profiláctico e terapêutico para o tratamento da SIDA.

Como agente profiláctico, administra-se sT4 a indivíduos com predisposição de alto risco para a doença ou a indivíduos que apresentam exposição a HIV pela presença de anticorpos para o vírus. A administração de uma quantidade eficaz de sT4 num estádio precoce da doença ou antes do aparecimento dos primeiros sintomas inibe a infecção por HIV dos linfócitos T4⁺. Como ím agente terapêutico, a administração de sT4 a pessoas infectadas com HIV inibe a propagação extracelular do vírus.

A fusão entre as células infectadas por HIV e outros linfócitos T4⁺, parece, também, ser uma via de propagação dos vírus. Para além disto, a fusão pode ser, em parte, responsável pelo enfraquecimento da função dos linfócitos T4⁺ e, finalmente, pela deplecção dos linfócitos T4⁺ nos indiví19

duos infectados. A fusão celular depende tanto dos produtos genéticos de invólucro virai como do receptor T4 e pode ser inibida pelo 0KT4A, ou anticorpos monoclonais semelhantes (Mabs) (120). A sT4 interfere na fusão celular e, espera-se, por isso, que diminua a propagação do vírus célula a célula e a perda da função dos linfócitos T4⁺.

receptor T4 é monomórfico e, por isso, crê-se que sT4 seja um inibidor universal do vírus, que reconhece o domínio de superfície do receptor T4 , incluindo todos os HIV.

Pode utilizar-se sT4 em associação com outros agentes, por exemplo, com agentes dirigidos coritra outras proteínas HIV, tais como a transcriptase inversa, a protease ou tat. Um agente terapêutico eficaz contra HIV deveria prevenir a infecção medidada por vírus, bem como a transmissão da infecção célula a célula. Também se pode utilizar a sT4 em combinação com outros agentes anti-virais, por exemplo, a azidotimidina (AZT).

A proteína sT4 , da presente invenção, também é utilizável como um inibidor da função das células T4⁺. Numerosos estudos sugerem uma função crítica para o receptor CD4 (CD4 é a terminologia geral utilizada para o receptor T4 humano e para os receptores que lhe correspondem nas outras células de mamíferos) na tolerância imunológica, especialmente na patogenia e progressão das doenças de auto-imunidade e na rejeição de enxertos específicos de um hospedeiro. De particular revelância para sT4 são as observações efectuadas com anti-CD4 Mabs. Através da sua associação com o receptor CD4, al guns destes Mabs aperfeiçoam as suas respostas de auto-imuni

/ !

dade e rejeição aos enxertos. Exemplos de tal actuação incluem a inibição das funções das células T, in vitro , por exemplo, a proliferação induzida pelo antigene, a secreção de linfoquinas e a função auxiliar celular por determinados anti-CD4 Mabs; o tratamento do lupus eritematoso sistémico pela administração de anti-CD4 Mabs para retardar o aparecimento dos primeiros sintomas de lupus no murino; e estudos de enxertia nos ratos, em que uma dose única de Mab de murino dirigida contra o receptor CD4 do murino resulta na aceitação do alo-enxerto.

Não é clara a consequência molecular da ligação de Mab a CD4. Os Mabs podem bloquear a associação de CD4 com o seu ligando, ligando este que, segundo o que sugere a evidência, é um epítope que se conservou nos antiegenes MHC da classe II (121,122). Contudo, pelo menos alguns destes mesmos Mabs inibem a activação celular de CD4 por uma via aparentemente independente da classe II.

Também se crê que a sT4 iniba as interacções das células T como um competidor do T4 celular, ligando-se, talvez, às moléculas alvo extracelulares que normalmente interactuam com o domínio superficial do receptor T4. Esta distinção entre Mabs e sT4 pode ter consequências funcionais importantes. Por exemplo, quando alguns Mabs dirigidos contra T4 provocam uma resposta nas células T4, sT4 pode despoletar uma resposta nas células que expressam os antigenes MHC da classe II. A afindade de T4 para os seus presumíveis ligantes da classe II, também parece ser bastante inferior quando comparada com a alta afinidade de Mabs dirigido contra T4. Assim, apesar de Mabs e sT4 poderem interferir nos mesmos processos,

afectariam diferentes moléculas alvo e diferentes células alComo agente profiláctico ou terapêutico, administra-se sT4 por via parentérica ou, de preferência, por via intravenosa. Pode administrar-se o agente por infusão ou por injecção, por exemplo, diária, semanal ou mensalmente. A quantidade e a proporção de administração de sT4 selecciona-se de modo a manter uma quantidade eficaz de sT4 em circulação. Um modo de administração alternativo poderia ser o extracorporal , empregando sT4 como um agente de diálise.

Também se pode utilizar a proteína sT4, da presente invenção, como um reagente para identificar moléculas naturais, de síntese ou recombinantes as quais actuam como agentes terapêuticos ou inibidores das interacções das células

Pode utilizar-se a proteína sT4 , por exemplo, em ensaios de rastreio, tais como ensaios da interacção da proteína medidos de acordo coma as metodologias baseadas no ELISA, para proporcionar um reagente solúvel em água, bioqui micamente puro que se pode utilizar em associação com outros reagentes para ensaios de competição das interacções do domínio da superfície do receptor T4, por exemplo, uma sT4 se liga às proteínas HIV env ou a misturas que vez que contem proteínas HIV env, também se pode utilizar para se efectuar o rastreio da ligação dos vírus. Com base em dados in vitro , que demonstram que sT4 se liga às células que expressam proteínas HIV env, sT4 também pode servir como uma molécula de alvejamento selectivo para as células HIV infectadas, in vi vo

Como uma proteína mediadora especifica para um alvo, sT4 pode servir, por exemplo para o fornecimento de agentes citotóxicos às células infectadas.

Para além disto, com base nos dados que demonstram que o receptor T4 se associa especificamente com os antigenes MHC da classe II nas células que apresentam antigenes conforme sugerido pela restrição da classe das células T4⁺, pode utilizar-se sT4 em associação com antigenes da classe II para os ensaios de inibidores das interacções das células alvo com os linfócitos T4. Para além destes exemplos que se baseiam em ensaios de ligação directa entre sT4 e as suas moléculas alvo, podem conceber-se ensaios mais complexos que se baseiam na resposta bioquímica ao reconhecimento de sT4.

Proporciona-se, ainda, um vector de expressão que codifica um polipeptido, cuja sequência de aminoácidos compreende a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 6 a partir de aproximadamente +3 a aproximadamente +185, fundida com a sequência de aminoácidos a partir de aproximadamente +351 até aproximadamente +369. Noutro aspecto da presente invenção, o vector de expressão codifica um polipeptido, cuja sequência de aminoácidos compreende a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 6 a partir de cerca de +3 até cerca de +369 fundida com a sequência aminoácida a partir de cerca de +351 a cerca de +369. Ainda num aspecto adicional da presente invenção, o vector de expressão codifica um polipeptido cuja sequência de aminoácidos compreende a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 6 a partir de cerca de +3 até cerca de +185.

A presente invenção proporciona, ainda, uma célula hospedeira compreendendo os vectores de expressão de acor do com a invenção. Num aspecto da presente invenção, o hospedeiro adequado consiste numa célula bacteriana. Num outro aspecto da presente invenção, a célula bacteriana é uma célula de Escherichia coli. Ainda num outro aspecto da presente invenção, o hospedeiro adequado é uma célula eucariótica. Num outro aspecto da presente invenção, a célula eucariótica é uma célula de um mamífero. Ainda num outro aspecto da presente invenção, a célula eucariótica é uma célula de levedura. Ainda num outro aspecto da presente invenção, o hospedeiro adequado é uma célula de insecto.

A presente invenção proporciona também, meios para a produção de sT4 , que consistem no domínio extracelular previsível do receptor T4 . Utilizando aquela porção do cADN de T4 que codifica os domínios extracelular e principal do receptor T4, isto é, pre sT4 , construiram-se vectores capazes de sobrexpressar sT4 em células de mamíferos.

A sequência de uma sT4 é a seguinte:

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/ q Obtém-se a sequência de sT4, por exemplo, por síntese do gene, utilizando a sequência de ADN conhecida, por técnicas de clonagem normalizadas baseadas na sequência e por reisolamento por detecção da proteína, isto ê, transfecção de clones de cADN de linhas de células que expressam T4 e identificação por anticorpos dirigidos contra a proteína. Identificam-se os clones de ADN portadores da sequência que codifica sT4 utilizando sondas de hibridação de oligonucleótidos. Projectam-se as sondas com base na sequência conhecida da proteína T4. Tendo-se identificado um clone portador da sequência que codifica sT4 , efectua-se a excisão da sequência de código utilizando endonucleases de restrição e insere-se no interior de vectores de clonagem e/ou expressão. No vector de expressão, a sequência que codifica sT4 liga-se de modo operacional às funções reguladoras necessárias ou desejáveis para a transcrição, transferência e processamento da sequência de código.

As funções reguladoras incluem, por exemplo, funções necessárias para a ligação da ARN polimerase e transcrição, bem como outras funções tais como a poliadenilação e o aumento das sequências de transcrição. O promotor pode ser regulável, pelo que, por exemplo, a expressão não é induzida até se ter efectuado a transfecção e selecção dos clones transformados. Os promotores utilizáveis na prática da presente invenção, incluem, por exemplo, o promotor inicial SV40, e as repetições terminais longas (LTR's) do vírus do sarcoma de Rous, o vírus do sarcoma de Moloney ou do citomegalovírus (CMV).

Antes de se efectuar a transfecção, incorpora-se, de preferência, no interior de uma grande molécula de ADN

7 que compreende um sistema indicador de selecção genética, um minigene sT4, isto é, o gene que codifica os domínios principal e extracelular do receptor T4. 0 sistema indicador de selecção consiste em qualquer gene ou genes que originem uma alteração fenotípica facilmente detectável numa célula hospedeira transfectada. Essas alterações fenotípicas podem ser, por exemplo, formação de focos, resistência aos fármacos, tais como os genes de resistência a G418 ou à higromicina B; ou outros indicadores de selecção tal como a xantina-guanina

-fosforibosilo-transferase (xgprt), a timidino-quinase ( TK ) e a galactoquinase (galK). Pode empregar-se para aumentar o número de cópias um indicador de selecção que permita a amplificação genética quer por aumento da eficácia de transfecção, quer por aumento da replicação intracelular do gene com interesse e do indicador de selecção. Estes indicadores que servem, também,para amplificar o número de cópias do gene incluem os genes da di-hidrofolato-reductase (resistência ao metotrexato) , CAD (resistência ao N-fosforoacetil-L-aspartato ) e adenosina-desaminase (resistência a 2-desoxicoformicina).

Após a transcrição e a tradução nas células dos mamíferos, a sequência principal parece clivar-se e a sT4 madura é segregada no meio condicionado.

Na prática preferida da presente invenção, liga-se o minigene sT4 com um H-ras humano ou com um minigene de di-hidrofolato-redutase do rato (DHFR) para originar vectores de expressão.

O minigene sT4 liga-se, por exemplo, com o

H-ras humano ou com a DHFR do rato para proporcionar um in28 dicador de selecção e meios para ampliar de um modo selectivo a expressão do gene através da transfecção conjunta com estes genes. Os indicadores de selecção usuais, incluem, por exemplo, DHFR, G418 ou higromicina, os quais seleccionam para integração apenas uma única cópia do gene com interesse. A amplificação com, por exemplo, metotrexato (mtx) no sistema DHFR origina a sobrexpressão do gene. Uma via alternativa para aumentar a expressão do gene inclui a utilização de ras-proto-oncogene. A família do gene ras inclui os genes H-ras , K-ras e N-ras. Numa aplicação preferida da presente invenção, utiliza-se o gene H-ras.

Outras funções do ADN podem estar ligadas directa ou indirectamente com o mini-gene sT4 ou podem não ter qualquer ligação. Ver,por exemplo, Axel, patente de invenção norte-americana 4 399 216.

Pode conseguir-se a sobrexpressão dos genes nas células dos mamíferos por meios transitórios ou estáveis. Pode conseguir-se a sobrexpressão transitória por métodos virais, tal como a utilização dos vectores dos vírus de vacina ou por métodos de amplificação tais como com vectores à base de SV40 nas células que suportam replicação de SV40. Estes métodos, conduzem, por fim, à destruição celular. Pode conseguir-se a sobrexpressão estável originando múltiplas cópias de genes tal como através da selecção para amplificação do gene ou através da utilização de ras-proto-oncogenes.

Pode conseguir-se a sobrexpressão da proteína sT4 por transfecção conjunta utilizando o sistema do gene H-ras, utilizando um número de linhas de células diferentes, sendo a linha de células preferida a linha de células NIH-3T3 que é uma linha de células fibroblásticas de rato com inibição de contacto. Outras linhas de células incluem a linha de células (ATCC 1571) do rim de ratazana normal (NRK) e a linha de células (REF-52) 52 de fobroblastos embrionários da ratazana (115) .

Quando se utiliza o sistema indicador de selecção, por exemplo, DHFR com metotrexato (técnica DHBR/MTX), em que se consegue a amplificação do número de cópias do gene por amplificação selectiva, dá-se preferência à linha de células do ovário do hamster Chinês (CHO). Utilizam-se em especial as células CHO com deficiência de DHFR (116). Outros tipos de células que se podem utilizar incluem, por exemplo, quaisquer células de mamíferos que tenham sido modificados de modo a serem DHFR .

Podem utilizar-se alguns tipos de células DHFR⁺ em associação com genes DHFR mutantes que são menos sensíveis ao metotrexato do que as DHFR normais (Axel, patente de invenção norte-americana N® 4 399 216). Em princípio, as células DHFR⁺ podem utilizar-se em associação com genes DHFR norrais e com um gene adicional dominante de selecção, tal como o gene para a resistência à G418 (117). Efectua-se a transfecção utilizando técnicas normalizadas (118,119). Estas técnicas incluem, por exemplo, precipitação com fosfato de cálcio, pinocitose induzida por dextrano-DEAE, electroporação e transfecção virai.

A seguir à transfecção, a célula que transporta o mini-gene de sT4 é desenvolvida num meio nutritivo sob condições que permitem a amplificação do gene seleccionável. Podem

empregar-se meios de cultura normalizados de células de mamí feros, como, por exemplo, o meio F12 (GIBCO, Grand Island, New York) sem hipoxantina e timidina e contendo soro de feto de bovino a 10%. Mantêm-se as culturas celulares à pressão ambiente a 30° - 45°C. Seleccionam-se para posterior cultura as células que sobrevivem à selecção e que exprimem altos níveis da proteína sT4 . Cultivam-se estas células sob condições selectivas e o produto, a proteína sT4, é recolhido e purificado .

Os métodos de cultura de células que se podem utilizar na prática da presente invenção, incluem, por exemplo, a utilização de células aderentes ou o desenvolvimento de células numa suspensão. Pode recolher-se o meio condicionado (CM) a partir das células desenvolvidas em suspensão ou aderentes a suportes sólidos, isto é, prepara-se o CM a partir de células aderentes desenvolvidas em recipientes de vidro cilíndricos ou desenvolvidas em suportes sólidos e cultivadas em suspensão ou em feitos fluidisados ou de enchimento. Prepara-se o CM a partir das células em suspensão em tanques agitados.

A proteína sT4 da presente invenção, inclui derivados do domínio extracelular de T4. Tais derivados compreendem adições, eliminações ou substituições, não afectando estas alterações de modo significativamente adverso a secreção da proteína no meio condicionado e a afinidade da proteína para a proteína HIV eηv, isto é, gpl20. Podem adicionar-se ou suprimir-se, por exemplo, um ou alguns aminoácidos a partir da extremidade N ou da extremidade C. Ou, podem inserir-se, suprimir-se ou substituir por aminoácidos internos um ou al31

guns aminoácidos, de preferência não mais do que quatro aminoácidos. De um modo alternativo, pode construir-se uma proteí na híbrida, isto é, uma fusão de transferência, entre sT4 e uma proteína de transporte, um outro antigene ou outras moleculs sT4 para preparar uma molécula poli-sT4. Ainda como uma outra alternativa, pode conjugar-se por síntese sT4 com uma mo lécula de transporte.

Ilustra-se um aspecto dos derivados de sT4 nos Exemplos a seguir (ver Exemplo 3). Pode demonstrar-se a afinidade de sT4 para HIV env por um ensaio de ligação competitiva utilizando uma molécula sT4 que possui uma afinidade conhecida ou utilizando anticorpos que reconhecem o receptor T4, tais como os 0KT4 e 0KT4A. Precipitaram-se selectivamente as molécuas líteis dos derivados de sT4 , da presente invenção, a partir do meio condicionado, com OKT4A, conforme se indica no Exemplo 3. Podem preparar-se os derivados quimicamente após expressão ou, geneticamente, antes da expressão, por manipulação das sequências de código para o domínio principal e/ou extracelular.

A proteína sT4 da presente invenção, pode ser purificada a partir do meio de cultura exausto utilizando diversas técnicas de purificação de proteínas, como, por exemplo, cromatografia de afinidade; cromatografia de permuta iónica; cromatografia de exclusão de tamanho; cromatografia hidrofóbica ou cromatorafia de fase inversa.

Pode purificar-se sT4 por.cromatografia de afinidade utilizando adsorventes gerais específicos de grupo, por exemplo, ligação de hidratos de carbono ou ligandos de afinidade crómatica; ou utilizando ligandos que se liguem especificamente a sT4, por exemplo anticorpos monoclonais ou proteína HIV gpl20 ou suas porções.

Um esquema de purificação que serve como exemplo, consiste em: 1) desenvolver as células num meio de crescimento selectivo isento de soro; 2) clarificação do meio condicionado; e, 3) separação da proteína sT4, da presente invenção, das outras proteínas presentes no meio condicionado.

Segundo o método preferido, purifica-se sT4 a partir do meio de cultura isento de soro utilizando uma série de passos de cromatografia que se baseiam nas propriedades físicas da molécula sT4. Pode, também, purificar-se a molécula sT4 a partir do meio de cultura contendo soro, utilizando métodos semelhantes de cromatografia.

De acordo com o método preferido de purificação de sT4 , faz-se passar, em primeiro lugar, o meio de cultura, através de uma coluna de permuta iónica, de preferência, uma coluna de S-Sepharosff-’ (sulfo-propil-sefarose) que retém sT4, enquanto a maioria das proteínas de contaminação flui através da coluna. Efectua-se, então, a eluição da amostra de proteína, utilizando um gradiente linear de sal. Utiliza-se uma segunda coluna de permuta iónica. Esta coluna, de preferência uma coluna Q-Sepharose^v-^> (amino-etil-Sef arose quaternária) possui propriedades tais que as proteínas de contaminação presentes na amos tra se liguem à coluna enquanto sT4 não se liga e é recuperada no tampão que flui através da coluna. Utiliza-se, finalmente, uma coluna de filtração de gel que serve para remover os materiais de contaminação remanescentes.

Um método alternativo de purificação de sT4 en-

volve a utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra sT4. Pode purificar-se a proteína sT4 num só passo, fazendo passar o meio de cultura clarificado através de um suorte de gel de afinidade ao qual se ligam os anticorpos monoclonais dirigidos contra sT4 . A proteína sT4 liga-se à coluna no local de ligação do anticorpo enquanto todas as proteínas de con taminação se movimentam através da coluna. Depois, elui-se a proteína sT4 da coluna sob condições que protejem a proteína sT4da inactivação.

Proporcionou-se, ainda, um método para a produção de qualquer um dos agentes terapêuticos descritos antes capazes de formar um complexo especificamente com a glicoproteína do invólucro do vírus da imunodeficiência humana e que consiste no desenvolvimento do sistema vector hospedeiro da presente invenção sob condições adequadas que permitem a produção do agente terapêutico e a recuperação do agente terapêutico assim produzido.

Pode utilizar-se sT4 em ensaios de diagnóstico para a detecção de proteínas T4 ou de moléculas com as quais estas interactuam. A quantificação das células T4 e T4⁺ e dos anticorpos para T4, por exemplo, teriam valor no diagnóstico da SIDA.

Para além disso, pode utilizar-se sT4 para gerar novos reagentes de diagnóstico, por exemplo Mabs ou outros tipos de moléculas para utilização em ensaios imunológicos normalizados, isto é, ELISA, ensaios imunológicos de captura, ensaios radio-imunológicos. Devido ao facto de sT4 expressar ο OKT4, ο OKT4A e a maioria se não a totalidade dos outros r ί' í __,y epítopes da superfície do receptor T4, a sT4 é especialmente útil nos ensaios de imunodiagnóstico uma vez que pode ser utilizado para a quantificação absoluta dos níveis de T4 num sistema. Correntemente não há padrões para a quantificação do receptor T4 .

receptor T4 reside em três meios químicos distintos: a superfície celular oxidante, hidrofílica; a membrana hidrófoba; e o citoplasma redutoi; hidrófilo. Estes meios distintos evitariam muito provavelmente o isolamento do receptor no seu estado integralmente nativo. A proteína sT4, que consiste apenas no domínio extracelular, é segregada como uma proteína solúvel no sobrenadante celular e a sua conformação parece simular a superfície do domínio de superfície do receptor. Assim, sT4 é adequada para análise estrutural pormenorizada, especialmente para cristalografia de raios X. A determinação da estrutura tridimensional de sT4 sozinho ou sob a forma de um complexo com outras moléculas interactivas podia proporcionar uma base racional para construir os antagonistas e agonistas selectivos de sT4.

Os diversos métodos de profilaxia e imunização proporcionados pela presente invenção, têm como base as capacidades dos novos peptidos, anticorpos e moléculas de ADN aqui descritos para formar complexos ou para se hibridarem com moléculas específicas e provocarem uma resposta imunológica eficaz na neutralização dos vírus de SIDA. Compreender-se-ão melhor estas moléculas, os métodos para a sua preparação e os métodos para o tratamento da SIDA tomando como referência as experiências e Exemplos que se seguem e que se fornecem com fins ilustrativos e que não limitam de qualquer modo o âmbito da presente invenção que se encontra definido pelas reivindicações em anexo.

Materiais e Métodos

Células e Anticorpos

Fraccionaram-se em lâminas de células (E⁺) positivas de rosetas de eritrócitos, os leucócitos do sangue periférico isolados por centrifugação de gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. Isolaram-se os sub-grupos T4 ⁺ e T8⁺, da população E⁺, por selecção positiva das células portadoras de T8 com o anticorpo anti-T8 e com os eritrócitos humanos conjugados com o anti-IgG do rato desenvolvida no coelho e purificada por afinidade (10). A análise por citof1uorometria destes subgrupos demonstrou que as células T4 eram 95% T4⁺ e 2% T8⁺, enquanto as células T8⁺ eram 95% T8⁺ e 2% T4⁺.

A linha de células Fro 2.2 T (T3 , T4⁺, T8⁺, Tll⁺) foram derivadas de um paciente adulto com leucemia aguda indiferenciada. Jurkatt é T3 , T4⁺, T8⁺, Til , RPMI 8402 é T3 , T4 , T8 , Tll⁺. OT-CLL é uma leucemia linfocítica crónica que é T3 , T4 , ΤΘ e Til (22). Obtiveram-se as linhas de células T4⁺, CEM e Molt 4 na American Type Culture Collection Desenvolveram-se continuamente todas as linhas de células T leucémicas em meio RPMI 1640 que continha soro de feto de vitela a 5%. As linhas de células B transformadas CB, CP58 e CP94 derivaram-se conforme se descreveu antes (23).

Conjugou-se a anti-IgG do rato desenvolvida no coelho e purificada por afinidade com os eritrócitos humanos pelo método de cloreto de crómio (24).

Transformação Conjunta das Células L e das células NIH 3T3

Mantiveram-se as células L tk apart do murino em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DME) enriquecido com soro de vitela a 10% (Gibco) e com 50 microgramas/ml de diaminopurina (DAP). Plaqueram-se as células L a uma densidade de 5 χ IO⁴ células por 10 cm de prato 1 dia antes da transformação. Prepararam-se precipitados de fosfato de cálcio segundo o método de Graham e var der Eb (25) modificado por Wigler et al. (26) utilizando 10 ng de pTK e 20 microgramas de células T de alto peso molecular ou de ADN de células L, por prato. No dia seguinte colocaram-se as células sob selecção em DME com soro de vitela a 10%, 15 microgramas/ml de hipoxantina, 1 micrograma/ml de aminopterina e 5 microgramas/ml de timidina [meio HAT (27)]. Decorridos 12 a 14 dias de selecção HAT, efectuou-se o rastreio dos transformantes tk⁺ utilizando o ensaio de aderência imunocita (rosetting).

Conservaram-se as células NIH 3T3 de murino em

DEM enriquecido com soro de vitela recém-nascida a 10% (Gibco). Colocaram-se as células NIH 3T3 a uma densidade de 5 χ 10⁴ células por 10 cm de caixa, 2 dias antes da transformação. Aplicou-se às células um precipitado de fosfato de cálcio utilizando 10 microgramas de ADN de transporte e ou 10 microgramas de T4-pMV6tk/neo ou 10 microgramas de T4-pVcos7 e 500 ng de pSV2neo. Decorridos 2 dias, colocaram-se as células para selecção em DEM com soro de vitela e 10% e 500 microgramas/ml de G418 (Genecitin ; Gibco). Efectuaram-se os ensaios de aderência imunocita nas colónias sobreviventes uma semana após o crescimento em meio selectivo.

Ensaio de aderência imunocita

Após uma lavagem com uma solução salina de tampão fosfato (PBS), incubaram-se as placas com 2,5 ml do anticorpo monoclonal ΟΚ'ί^Α purificado (1 mg/ml) ,di1uído de 1/500 em PBS contendo soro de feto de vitela a 5%, durante 45 minutos, à temperatura ambiente. Removeram-se das placas os anticorpos livres, com três lavagens cuidadosas em PBS. Adicionaram-se seis mililitros de eritrócitos humanos conjugados com o anticorpo anti-IgG do rato desenvolvido no coelho, purificado (suspensão de reserva a 2% v/v, diluída de 1/10 em PBS/so ro de feto de vitela a 5%), e deixaram-se as placas à temperatura ambiente. Decorridos 45 minutos, aspiraram-se cuidadosamente os eritrócitos livres e, adicionou-se PBS antes de se proceder à verificação das colónias positivas para o ensaio de aderência imunocita.

Análise Citofluorométrica

Removeram-se as células aderentes com EDTA, 0,005 M em PBS e lavaram-se uma vez com PBS contendo albumina de soro de bovino (BSA) a 1% e azida de sódio a 0,01% (banho citológico). Adicionaram-se as células (5 x 10⁶) em 0,1 ml, a tubos com as diluições adequadas de ou anticorpos de controlo. Incubou-se a mistura de células e anticorpos, durante 45 minutos a 4°C e depois lavaram-se duas vezes em banho citológico. Adicionou-se às células a anti-IgG de rato desenvolvida na cabra +A+M (Cappel) conjugada com isotiocinato de fluoresceína (FITC) e incubaram-se durante 1 hora a

O * A

C. Lavaram-se, então, as células tres vezes num banho citológico e, efectuou-se nova suspensão em 0,5 ml de PBS com azi da de sódio a 0,01%. Analisaram-se as células num Seleccionador Celular Becton Dickinson FACS IV e registaram-se os dados e efectuou-se o diagrama utilizando um computador VAX 11/780 (Digital Equipment Co.).

Isolamento de ARN e de ADN

Isolou-se o ARN total a partir das células por homogeneização em tiocinato guanidínico 4M, seguida de ultracentrifugação através de uma almofada de CsCl 5,7 M (28). Conseguiu-se a selecção de poli(A)⁺ por cromatografia de celulose de oligo(dt) (Tipo 3, Collaborative Research) (29). Preparou-se o ADN genómico de elevado peso molecular, de acordo com o descrito por Wigler et al (26).

cADN E Bibliotecas Genómicas

Sintetizou-se o ADN de cordão duplo a partir do ARN de poli(A)⁺ derivado das células T humanas periféricas (20). Após tratamento com EcoRI metilase e ADN polimerase T4 , efectuou-se a clonagem do cADN de cordão duplo no sítio EcoRI de gtlO (30) utilizando ligantes EcoRI. A biblioteca genómica humana Charon 4 foi fornecida generosamente pelo Dr. Tom Maniatis (Harvard University) (31).

Síntese de uma Sonda de cADN Subtraída

Sintetizou-se o cADN marcado com P a partir do ARN de poli(A)⁺ derivado do transformante primário, LTD-4, conforme descrito por Davis et al.(32). Após união do cADN a um excesso de ARN de poli(A)⁺ de células L não transformadas (Rot = 3000) isolaram-se as sequências de cordão simples, enriquecidas com cADNs humanos, por cromatografia de hidroxiapa3 9 tite (32). Antes de se hibridarem os filtros, concentrou-se a sonda de cADN subtraída com s-butanol e dessalinizou-se nutra coluna Sephadex G-50 equilibrada com TE.

Rastreio de cADN e das Bibliotecas Genómicas

Plaqueou-se em C600/HFL de E. çoli a biblioteca de células T humanas, periféricas e plaqueou-se a biblioteca genómica humana em LE 392 de E. coli. Efectuou-se o rastreio dos filtros duplicados de acordo com os procedimentos normalizados (33) , Qfectuando-se a hibridação em formamida a 50% e 5 x SSC, a 42°C. No rastreio da biblioteca de cADN, aplicaram-se 6 x 10 cpm de sonda subtraída por 137 mm de filtro de nitrocelulose. Hibridaram-se os filtros das bibliotecas genómicas com uma inserção de cADN marcado radioactivamente. Efectuaram-se as lavagens a 68°C, com uma lavagem final em 0,2 x SSC. Efectuou-se a auto-radiografia a -70°C na presença de écrans de amplificação, durante 1 ou 2 dias.

Sequenciação de ADN

Subclonaram-se os fragmentos de restrição de pT4B no interior dos vectores mp!8 e mpl9 de M13 (35). Efectuaram-se as reacções de sequenciação utilizando a técnica de terminação da cadeia didesoxi (36). Na Figura 3B apresenta-se a estratégia de sequenciação.

Hibridações das Manchas Southern e Northern

Efectuou-se a digestão de ADNs de elevado peso molecular com 5 unidades de nuclease de restrição por micrograma de ADN,de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim). Submeteram-se as amostras (10 microgramas) a electroforese em gel de agarose a 0,8%. Transferiram-se os

- / '— / ( fragmentos de ADN para um GeneScreen [New England Nuclearj (37) ] e hibridaram-se segundo descrito por Church e Gilbert (38) . Verteu-se o ARN num gel de agarose-formaldeído a 0,8% (39) e transferiu-se para um GeneScreen. Efectuou-se a hibridação Northern de acordo com os procedimentos fornecidos pelo fabricante. Hibridaram-se as manchas Southern e Northern com sondas marcadas radioactivamente.

Síntese e Transferência In Vitro do ARN de SP6

Efectuou-se a subclonagem do cADN Kb de T4 no sítio de EcoRI pSP65 (Promega Biotec) e linearizou-se com HindIII. Efectuou-se a transcrição do ADN do plasmídeo linearizado (1 micrograma ) com polimerase SP6 na ausência de nucleótidos marcados radioactivamente, conforme descrito antes (40),com excepção de se ter adicionado GpppG e CTP não marcado ao tampão de transcrição. Um décimo da mistura reaccional transferiu-se para um sistema de gérmen de trigo (Bethesda Research Labo3 2 ratories) contendo L-[ S]-metionina (Amersham) e S-adenosilmetionina 1 micromolar. Submeteram-se os produtos de transferência in vitro a electroforese em gel de poliacrilamida-SDS sob condições redutoras, conforme adiante se descreve.

Marcação Celular, Cromatografia e Imunoprecipitação de Lectina Desenvolveram-se as células, durante 12 horas em meio DME isento de metionina, contendo soro de vitela dia3 2 lisado a 10% e1mCi de L-[ S]-metionina (Amersham) conforme previamente descrito (41). Solubilizaram-se as células em Tris 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM (TBS) contendo Nonidet P-40 a 0,5% (Shell) e fluoreto de fenilmetil-sulfonilo 0,2 mM (Sigma).Centrifugaram-se os lisados durante 1 hora a 100 000 x g e submeteram-se os sobrenadantes a cromatografia de letina de lentilha (Pharmacia) de acordo com os procedimentos de Hedo et al . (42). Absorveram-se previamente os produtos de eluição uma vez com uma mistura de fluido ascítico do rato, de controlo, e de proteína A-Sepharose (Pharmacia), durante 1 hora a 4°C e duas vezes com apenas proteína A-Sepharose, durante 1 o 4 hora a 4 C. Misturaram-se, então 2,5 x 10 cpm de cada sobrenadante com 10 microlitros de anticorpo monoclonal (1 mg/ml , aproximadamente) e com proteína A-Sepharose e incubou-se nuna mesa giratória durante uma noite a 4°C. Lavaram-se, então, as placas quatro vezes com TBS frio contendo NP-40 a 0,5% e SDS a 0,2% e efectuou-se nova suspensão em tampão de amostra de electroforese.

Electroforese em Gel

Efectuou-se a electroforese em SDS-gel de poliacrilamida de acordo com o procedimento de Laemmli (43). Dissolveram-se os imuno-precipitados e os produtos de transferência in vitro , em tampão de amostra com ou sem 2-mercapto-etanol e aplicaram-se sobre geles de poliacrilamida a 10%. Efectuou-se a auto-radiografia numa película Kodak XAR-5 na presença de écrans de amplificação (DuPont Chemical Company).

Transformação Conjunta e ensaio de aderência imunocita

Conservaram-se as células ψ-2 do rato (44) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) enriquecido com soro de vitela a 10% (CS) (Gibco). Colocaram-se as células ψ -2 a uma densidade de 5 x 10^ células por 10 cm de placa, 2 dias antes da transformação. Prepararam-se os precipitados de fosfato de cálcio pelo método de Graham e van der Eb

2 ( 25 ) modificado por Wigler et al (27) .

Aplicaram-se os preci-

pitados às células utilizando 10 microgramas de ADN de transporte e ou 10 microgramas de T4-pMV7 ou 10 microgramas de T8-pMV7. Decorridos 2 dias, colocaram-se as células em selecção em DME/CS a 10% e 500 microgramas/ml de G418 (Geneticin^;

Gibco).

Efectuaram-se os ensaios de aderência imunocita para identificar as colónias T4 e T8 nas colónias sobreviventes 1 semana após desenvolvimento em meio selectivo. Após uma lavagem com uma solução salina de tampão fosfato (PBS), incubaram-se as placas com 2,5 ml do anticorpo monoclonal purificado, OKi®4A ou ΟΚ'ί^ (lmg/1 ml; Ortho) diluído de 1/500 em PBS contendo soro de feto de vitela (FCS) a 5%, durante 45 minutos, à temperatura ambiente. Removeram-se os anticorpos livres das placas com três lavagens cuidadosas com PBS. Adicionaram-se 6 ml de eritrócitos humanos conjugados com o anticorpo purificado anti-IgG de rato desenvolvido no coelho (suspensão de reserva a 2% v/v, diluída de 1/10 em PBS/FCS a 5%) e deixaram-se as placas à temperatura ambiente. Decorridos 45 minutos, aspiraram-se, cuidadosamente, os eritrócitos livres e adicionou-se PBS antes de se efectuar a inspecção. Purificaram-se os clones \^-2, de T4⁺ e T8 ⁺ , isolando a colónia, e caracterizaram-se por citometria de fluxo e análise da mancha Northern.

Produção e Infecção do Retrovírus Recombinante

Isolaram-se os clones ^-2, de T4⁺ e T8⁺, que produzem reservas de retrovírus recombinantes com títulos de

ΙΟ^ cfu/ml. Prepararam-se as reservas virais adicionando 10 ml

Í .s>

_ .. r de DME/CS a 10%, recentemente preparadas, a uma monocamada quase confluente dos clones -2 de T4⁺ ou T8⁺. Decorridas 24 horas, removeu-se o meio e filtrou-se através de um filtro de 0,45 micron (Millipore). Para infecção, incubaram-se 5 χ 10⁵ células com 2 ml de sobrenadante virai (ou uma diluição) na presença de 8 microgramas/ml de polibrene (Aldrich). Decorridas 3 horas , adicionaram-se 8 ml de meio recentemente preparado. Três dias após a infecção, colocaram-se, de novo, as células em DME/CS a 10% contendo 500 microgramas/ml de G418, desenvolveram-se durante 2 semanas, efectuou-se o registo das colónias G418^r e efectuou-se o rastreio da expressão da superfície de T4 ou de T8, utilizando procedimentos in situ de aderência imunocita ou de citometria de fluxo.

Utilizaram-se os sobrenadantes da cultura de

-2 para infectar as células \^-AM do rato conforme se descreveu antes. Purificaram-se os transformantes aderentes T4⁺ ou T8⁺, pelo ensaio de aderência imunocita in situ, seguindo-se o isolamento da colónia. Purificaram-se os transformantes não aderentes T4⁺ou T8⁺, por selecção de células activadas por fluorescência (FACS). Contaminaram-se as linhas de células linfóides, humanas, não aderentes (células HSB2 , RPMI-T; células B-RAji) e células epiteliais aderentes (HeLa) por cultivação com clones ^Q-AM de T4⁺ ou T8⁺ (previamente tratados com 10 microgramas/ml de mitomicina C, durante 2 horas; Sigma) e purificaram-se.

Seleccionaram-se as linhas de células resistentes a G418, a uma concentração de 1,5 mg/ml, excepto as células HeLa que necessitaram de 1 mg/ml e os fibroblastos que necessitaram de 0,5 mg/ml. Mantiveram-se todas as culturas celulares que produzem vírus (4-AM) anfotrópicos recombinantes, sob condições de contenção P3 .

Vírus de SIDA

Obteve-se a estirpe protótipo LAV de HTLV-III/ /LAV, por intermédio de J.-C. Cherman [Institut Pasteur, Paris; (45)]. As inoculações de vírus utilizadas nestes estudos obtiveram-se a partir da segunda à quinta passagem do vírus pelo laboratório da Requerente. As inoculações são constituídas por sobrenadantes de cultura de HTLV-III/LAV infectados, linfócitos periféricos estimulados por fitohemaglutinina (PHA) que se recolheram por centrifugação sequencial (300 x g durante 7 minutos, seguida de 1500 x g durante 20 minutos) e que se armazenaram em azoto líquido. Para estudos de ligação, concentrou-se o vírus a partir dos sobrenadantes decultura, recolheram-se, conforme descrito antes, por ultracentrifugação a 90 000 x g durante 90 minutos sobre uma almofada de Renograffin (E.R. Squibb) a 15%, em Tris 0,01 M, NaCl 0,15 M e EDTA 1 mM a pH 8,0.

Reagentes Anti-HTLV-III/LAV

Obteve-se o soro com níveis elevados de anticorpos para HTLV-III/LAV, a partir de um indivíduo do sexo masculino, homossexual can linfadenopatia crónica e descreveu-se a sua especificidade por imunof1uorescência (46), análise da mancha Western (47) e radio-imunoprecipitação (48). Acoplaram-se porções da fracção IgG com isotiocianato de fluoresceína (FITC; relação FITC: proteína de 10,7 microgramas/ml), peroxidase de rábano silvestre (HPO; tipo VI; Sigma) e agaro

5

se, conforme descrito (47, 49, 50, 51). Prepararam-se paralelamente conjugados de IgG a partir de um soro não imune.

ENSAIO DE TRANSÇRIPTASE INVERSA

Mediu-se a actividade de transcriptase inversa (RT) dependente de magnésio com um iniciador de matriz de (A)

+ sença de Mg 7,5 mM (52).

Detecção por Imunofluorescência do vírus Citoplasmático da SIDA

Centrifugaram-se as células de cultura

em 0,1 ml), sobre lâminas de vidro (Shandon Cytocentrifuge) , fixaram-se em etanol a 95% e ácido acético a 5%, durante 30 minutos a -20°C e hidrataram-se novamente com três mudanças de 10 minutos de PBS (P0₄ 0,01 M, NaCl 0,15 M a pH 8,0). Exposeram-se as lâminas a uma diluição de 1/500 de FITC-anti-HTLV-III/LAV (19 microgramas/ml), durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Lavaram-se, então, as lâminas (três mudanças de 10 minutos cada) e fixaram-se na platina do microscópio sob uma cobertura de glicerol a 50% em PBS. Observaram-se as lâminas com um microscópio epi-iluminado Leitz Orthoplan com uma ampliação de 603 vezes. Nestas condições, o reagente FITC-anti-HTLV-III/LAV é específico para HTLV-III/LAV. As células estimuladas por PHA não infectadas, as linhas de células B infectadas pelo vírus Epstein Barr (EB), uma linha de células infectadas pelo adenovirus, diversas linhas de células T e as linhas de células infectadas HTLV-I e HTLV-II não se tingiram.

ENSAIO IMUNOLÓGICO DO VÍRUS DA SIDA (ENSAIO DE CAPTURA DE ANTIGENES)

Este e um imune-ensaio intercalado (sandwich)

que foi descrito pormenorizadamente (47). Resumidamente, adiciona-se o sobrenadante da cultura a tubos de placas de microtitulação cobertas com IgG anti-HTLV-III/LAV. Depois de se terem lavado as placas, detecta-se a ligação do antigene do vírus com HPO-anti-HTLV-III-LAV. Este ensaio que é, no mínimo, tão sensível quanto o ensaio RT, manifesta-se negativo para os sobrenadantes de culturas de linfócitos, de numerosos doadores , estimulados com PHA, para as linhas de células B infectadas pelo vírus EB, para diversas linhas de células T, para linhas de células T policlonais ou de clonagem, dependentes de IL-2, para as linhas mielóides K56 2 , assim como para as linhas de células que suportam HTLV-I ou HTLV-II. Determinou-se o grau de admissão OD490 para se efectuar a discriminação entre um sobrenadante negativo e um sobrenadante positivo, em cada processamento a partir da média mais 25 D de, pelo menos, 10 determinações de replicação nos sobrenadantes de controlo (cultura de células não infectadas) recolhidas ao mesmo tempo.

Ensaio de Contaminação do vírus de SIDA (ID-50)

Foi descrito pormenorizadamente o ensaio de microcultura para titulação do grau de infecção de HTLV-III/ /LAV (47) . De um modo resumido, inocularam-se linhas de células ou linfócitos estimulados por PHA (2 x 10^ células/ml) com diluições em série de dez vezes, do vírus a ser inoculado e incubaram-se durante 18 horas a 37°C.

Depois, lavaram-se as células e colocaram-se em microcultura (10 a 20 culturas por diluição: 1 χ 10⁵ células por cultura em 0,25 ml de meio). De quatro em quatro dias,

removeram-se 100 microlitros de sobrenadante e substituiram-se por meio recente. Ensaiaram-se os sobrenadantes para o antigene do vírus, por um ensaio de captura do antigene, conforme se descreveu antes. Definiu-se a titulação infecciosa do vírus (ID-50), como o inverso da diluição para a qual 50% das culturas são positivas para o vírus (47).

Ensaio do Pseudotipo VSV

Propagou-se o vírus da estomatite vesicular (VSV, estirpe indiana de tipo primitivo) em células produtoras do retrovírus necessário para o invólucro do pseudotipo, conforme já descrito (53). Adicionou-se soro anti-VSV de ca-

bra de	neutralização,	hiperimune,	ao VSV recolhido para	inac-
t i var	os vibriões que	não são	do	pseudotipo. Os	títulos	dos
pseudotipos situaram-	se entre	io4	e 105 PFU/ml.	Para se	pr o-
ceder	ao ensaio, colocaram-se	2 x	1 0 5 células a	serem infec-

tadas com os pseudotipos VSV em cavidades de cultura de tecidos de 30 mm de diâmetro. As células Hela, NIH 3T3 e L, foram, naturalmente, aderentes; todos os outros tipos de células se ligaram por tratamento prévio do substrtos com 50 microgramas/ml de poli-L-1isina. Após a adsorção do vírus, durante 1 hora, lavaram-se as células e adicionou-se a cada cavidade 10θ células CCL64 de marta ou MDBK de bovino. Estas células proporcionam placas excelentes para infecção secundária por VSV mas são resistentes à infecção pelos vibrões do pseudotipo. Depois de se deixar que as células indicadoras da placa se ordenassem e dispersassem (90 minutos, aproximadamente), cobriram-se as monocamadas com meio de agar. Utilizou-se o anticorpo monoclonal anti-T4A (1:20), o soro anti-HTLV-III / 7 t

(1:10) ou o soro anti-HTLV-I (1:10) para inibir a formação da placa do pseudotipo, por tratamento prévio das células 30 minutos antes da adição dos pseudotipos, de acordo com o descrito em (54).

Ensaio de Indução Siniciçial

Procedeu-se à cultura conjunta de 2 x 10⁵ células e 2 x 10⁴ células H9 infectadas por HTLV-III e produtoras do mesmo (55), em cavidades de 10 mm de diâmetro. Incubaram-se as culturas a 37°C e examinaram-se 18 horas depois, conforme previamente descrito (54,56), para se observar a formação de sincicias. Consideraram-se positivas as células que possuiam 5 vezes ou mais sincicia. Ensaiou-se a inibição sincicial, adicionando o anticorpo monoclonal anti-T4A (1:20) às células da mistura na altura da sementeira.

Análise Citof1uorométrica e Ligação do vírus da SIDA

Este método já foi descrito em pormenor (46).

Resumidamente, a expressão de T4 ou T8 na superfície celular detectou-se por imunofluorescência directa com os anticorpos monoclonais anti-T4 ou anti-T8 conjugados com fluoresceína ( OK 1^4 A , OK7®8). 0 diluente/tampão de lavagem, foi PO^ 0,01 M, NaCl 0,15 M, a pH 7,4, contendo albumina de soro de bovino a 0,1%, soro humano AB ⁺ a 2% v/v, e, NaN^ a 0,01%. Efectuou-se a titulação de todos os reagentes para uma ligação óptima (saturação). Incubaram-se as células (5 x 10⁵) em 25 microlitros de diluição do anticorpo monoclonal, durante 30 minutos a 4°C. Lavaram-se as células por centrifugação (300 x g, durante 7 minutos), efectuou-se nova suspensão celular activado por fluorescência (FACS IV, Becton Diskinson). Para a ligação de

9

HTLV-III/LAV, incubaram-se 5 χ 10⁵ células com HTLV-III/LAV ( 500 ng em 10 microlitros ), durante 30 minutos a 37°C. Procedeu-se a nova suspensão das células lavadas, em 25 microlitros de anti-HTLV-111/LAV conjugado com fluoresceína , durante 30 minutos a 4°C. Lavaram-se as células, efectuou-se nova suspensão das mesmas em paraformaldeído a 1% e, analisaram-se nun. FACS , como antes. Para inibição da ligação de HTLV-III/ /LAV, incubaram-se previamente as células com anti-T4A ou anti-T8 (20 ng em 20 microlitros) durante 30 minutos a 4°C seguindo-se a adição de HTLV-III/LAV (500 ng em 10 microlitros), durante 30 minutos a 37°C. Lavaram-se as células, incubaram-se com anti-HTLV-111/LAV conjugado com fluoresceína , lavaram-se novamente, efectuou-se nova suspensão em paraformaldeído e analisaram-se num FACS, conforme se descreveu antes.

Radioiodização, Imunoprecipitação e Electroforese sobre_Gel da Superfície Celular

Procedeu-se à radioiodização da superfície dos transformantes T4⁺ NIH 3T3, de acordo com a técnica da lactoperoxidase (18),do seguinte modo: efectuou-se a suspensão de 4 x 10^ células em 1 ml de PBS contendo EDTA 0,5 mM, 2 mCi de 12 5

Na I e 20 microgramas de lactoperoxidase. Aos 0, 1, 5, 10 e 15 minutos, adicionaram-se 10 microlitros de H2°2 ^a θ'θ3%. Efectuou-se a reacção a 23°C e, aos 20 minutos, interrompeu-se a reacção por duas centrifugações em 50 volumes de PBS frio contendo Nal 10 mM. Distribuiram-se as células marcadas radioactivamente por 4 tubos e incubaram-se, conforme indicado, com HTLV-III/LAV (2 microgramas em 20 microlitros), durante 30 minutos a 37°C. As lavagens e manipulações subseguentes

efectuaram-se entre 0° e 4°C. Procedeu-se à lise das células lavadas, adicionando 1 ml de tampão detergente de lise [LB; Tris 0,02 M, NaCl 0,12 M, a pH 8,0, contendo fluoreto de feniletil-sulfonilo 0,2 mM, 5 microgramas/ml de aprotinina, EGTA 0,2 mM, NaF 0,2 mM, desoxicolato de sódio a 0,2% e, Nonidet P-40 a 0,5% (v/v)]. Mantiveram-se os tubos em gelo durante 15 minutos e removeram-se os núcleos por centrifugação a 3 000 x g durante 20 minutos.

Para as absorções, prepararam-se conjugados dos anticorpos IgG humana anti-HTLV-III/LAV, IgG humana não imune, anti-T4A e anti-T8 com Sepharose, conforme descrito (48). Absorveram-se previamente os lisados com 200 microlitros de IgG humana não imune conjugada com Sepharose, durante 1,5 horas, com rotação e, depois, imunoprecipitaram-se com 20 microlitros de conjugados de Sepharose (conforme indicado), durante 3 horas com rotação. Lavaram-se os absorventes de Sepharose 3 vezes: uma vez com LB; uma vez com LB contendo NaCl 0,5 M; e uma vez com LB contendo dodecil-sulfato de sódio (SDS) a 0,1%. Eluiu-se o material absorvido a 65°C, durante 30 minutos com 20 microlitros de tampão de amostra [Tris 0,01 M, a pH 8,0, contendo SDS a 2%, 2-mercaptoetanol a 5% (v/v), 15 microgramas de azul de bromofenol e glicerol a 10% (v/v)]. Efectuou-se a electroforese num gel de gradiente de poliacrilamida a 3,3 - 20% com um gel de aglomeração a 3% (57) e efectuaram-se as auto-radiografias com película Kodak XAR-5.

Ensaio de Inibição dos vírus

Exposeram-se 2 x 10⁵ células T4⁺ JMT ao vírus

- / da SIDA no minuto zero. Adicionaram-se, em diversas alturas (0 minutos, 30 minutos e 60 minutos) da progressão da infecção pelo vírus, os inibidores cloreto de amónio (20 mM) ou amantadina (20 mM). Decorridas 6 horas, lavaram-se as células e recolocaram-se em meio recentemente preparado (RPMI/FCS a 10%). Determinou-se o efeito destes agentes sobre a infecção do vírus da SIDA 5 dias após a infecção. Determinou-se a fracção de células infectadas nas culturas que expressam os antigenes virais, por microscopia de imunof1uorescência, conforme anteriormente descrito (58).

Isolamento do ARN e Hibridações da Mancha Northern

Isolou-se o ARN total das células por homogeneização em tiocianato de guanidinio 4M, seguida de ultracentrifugação através de uma almofada de CsCl 5,7 M (28). Efectuou-se a selecção de poli(A)⁺ por cromatografia em oligo(dt)-celulose (Tipo 3, Collaborative Researche) (29).

Efectuou-se a electroforese do ARN através de um gel de agarose-formaldeído a 1% (39) e transferiu-se sobre Hybond (Amersham). Efectuou-se a hibridação da mancha Northern de acordo com os procedimentos fornecidos pelo fabricante. Mar caram-se as sondas radioactivamente a uma actividade especí9 fica de 0,5 - 1 x 10 cpm/micrograma com trifosfatos desoxi3 2 nucleotídicos marcados com o< P (59).

RESULTADOS

Isolamento do cADN de T4

A estratégia que se utilizou para se isolar o cADN de T4 inicialmente compreendeu a construção de transformantes da célula L que expressam T4 na sua superfície. Enri queceu-se por hibridação do substrato, o cADN sintetizado a partir do mARN dos fibroblastos transformados de T4⁺ e utilizou-se como uma sonda para isolar o cADN que codifica T4, a partir da biblioteca de cADN construída a partir do mARN dos linfócitos T periféricos. Determinou-se a identidade dos clones de cADN de T4⁺, por análises das manchas Northerna e Southern e, finalmente, pela capacidade desses clones para transferir o fenótipo T4⁺ para células receptoras. Foram utilizadas previamente técnicas semelhantes para se isolar o gene que codifica a proteína T8 (20).

Transformaram-se células L de rato deficientes em timidina quinase (tK) com ADN genómico das células T da linha de células leucémicas HUT-102 com o plasmídeo pTK (25,26), que contém tK. Identificaram-se os transformantes da célula L, tK⁺, que expressam as proteínas da superfície da célula T por um ensaio de aderência imunocita, in situ. Exposeram-se as colónias tK⁺ a anticorpos monoclonais do rato dirigidos contra T4 e, depois, incubaram-se com eritrócitos acoplados com anti-imunoglobulina do rato desenvolvida no coelho. Os transformantes T4⁺ apresentaram-se visivelmente vermelhos devido à sua associação específica com os glóbulos vermelhos. Deste modo, obteve-se um transformante primário T4 , o LTD-4. Verificou-se independentemente a expressão da molécula T4 por este clone , por análise citof1uorométrica (Figura 1).

A população de mARN do transformante T4⁺, LTD-4, deveria diferir da das células L não transformadas apenas na expressão dos genes novamente transformados. Estas sequências foram enriquecidas por junção de cADN altamente radioactivo preparado a partir do ARN de poli(A)⁺ do transformante T4⁺ com um grande excesso de ARN a partir de uma célula L não transformada (32, 60). O cADN incapaz de se hibridar, mesmo a valores Rot elevados, isolou-se por cromatografia de hidroxi-apatite e utilizou-se para se proceder ao rastreio de uma biblioteca de cADN da célula T periférica humana, construída no vector lambda gtlO de clonagem. Identificaram-se quatro placas de hidridação fraca, purificaram-se as placas e analisaram-se quanto à presença de sequências T4.

Para se determinar se algum destes clones codifica T4, efectuaram-se , inicialmente, análises de mancha Northern com ARN de células T periféricas T4⁺ e T4 , células leucémicas, timócitos, transformantes das células L e células não linfóides (Figura 2). Um dos quatro clones hibridou-se com um ARN presente apenas nas células T4⁺. Este clone detecta um ARN de 3 Kb presente no transformante T4⁺, LTD-4, que também se encontra presente numa população de linfócitos penfericos T4 , numa variedade de linhas de células leucemicas T4⁺ e de timócitos. Não se observou hibridação com ARN dos fibroblastos não transformados, dos linfócitos periféricos cos T4 , das células Hela ou das células do neuroblastoma humano.

O diagrama de expressão do ARN detectado por este clone é consistente com a possibilidade deste clone codificar T4. Contudo, este ADN possui uma extensão de apenas

0,6 Kb mas hibrida-se com um mARN de 3 Kb. Por isso, se efectuou novamente o rastreio da biblioteca de cADN das células T

periféricas humanas e obteve-se um clone (pT4B) que continha uma inserção de 3 Kb, muito aproximado em tamanho ao ARN mensageiro maduro. Nas Figuras 3A e 3B apresentam-se os mapas de restrição deste clone.

Análise da Mancha Genómica

Efectuaram-se a seguir experiências de mancha Southern (37) para demonstrar que o clone de cADN isolado se hibridava com o ADN dos transformantes T4⁺, assim como com o ADN humano, mas não com o ADN das células L do rato não transformadas (figura 4). 0 ADN genómico de uma diversidade de células humanas revelou um conjunto de cinco fragmentos de hibridação após clivagem com a enzima BamHI. Conforme se esperava, podem detectar-se as sequências T4 no transformante LTD-4, mas não nas células L não transformadas. 0 fragmento BamHI, mais próximo da extremidade 3' do gene (6,6 Kb) não se encontra presente em LTD-4, provavelmente como consequência de um fenómeno de integração. Para além disto, não parecem existir grandes rearranjos a este nível de análise grosseiro quando se compara o ADN das células linfóides e não linfóides. A soma dos pesos moleculares dos fragmentos de hibridação é de 33 Kb, o que sugere que o gene T4 é bastante grande. Obteve-se um conjunto completo dos clones genómicos que abarcam esta região (ver adiante) e ordenaram-se os fragmen tos BamHI por análise de restrição destes clones (Figura 3A) o que confirmou que o gene é grande e deve conter intrões de extensões consideráveis.

Expressão do cADN de T4 nos Fibroblastos Transformados do Rato

A evidência ulterior de que o cADN isolado co dificava T4 , seria fornecida se este clone pudesse converter os fibroblastos para o fenótipo T4⁺,após transformação. O gene T4 no ADN cromossómico é grande e abarca diversos clones genómicos. Para além disto, introduziu-se o clone de cADN em dois vectores de expressão retroviral, pVcos7 e o pMV6Kt/neo, que contêm as repetições terminais longas do vírus de leucemia de murino de Moloney (LTRs) flanqueando um sítio de clonagem EcoRI (Figura 3C). 0 LTR de 5' promove a transcrição através do sítio de clivagem e o LTR de 3' contém as sequências necessárias para a clivagem e polidenilação. 0 vector pMV6tK/neo também contém o promotor tK fundido com a região de código do gene da neomicina-fosfotransferase. As construções em que se utiliza pVcos7 necessitam de transformação com um indicador de selecção não ligado, enquanto o pMV6TK/neo transporta o indicador de resistência à neomicina, o que permite uma transformação conjunta ligada. Seleccionaram-se as colónias Neo⁺ das células NIH 3T3, obtidas após transformação, pela sua capacidade para se desenvolverem em meio contendo o análogo da neomicina, G418, e efectuou-se o seu rastreio utilizando o procedimento de aderência imunocita para detectar a expressão de T4 na superfície celular. Neste ensaio, foram positivas para T4 aproximadamente 50% das colónias G418 obtidas com pVcos7 e 75% das colónias obtidas com pMV6tk/neo. Analisaram-se depois as colónias positivas ao ensaio de aderência imunocita, por citofluorometria para confirmar que T4 se expressa na superfície das células transformadas (Figura 1).

Efectuaram-se ensaios de marcação radioactiva de proteínas metabólicas, os quais demonstraram que os fibro

blastos transformados T4 e os linfócitos T expressam uma proteína T4 de idêntico peso molecular. Marcaram-se radioactivamente, durante 12 horas, na presença de L-[³⁵S]-metionina (41) as células NIH 3T3 não transformadas, os transformantes T4⁺ e os linfócitos T. So1ubi1izaram-se as células com detergente e passou-se o lisato através de colunas de lectina de lentilha para o enriquecer com glicoproteínas (42). Eluiu-se a fracção de glicoproteína ligada e imunoprecipitou-se com anticorpos monoclonais dirigidos contra T4 (Figura 5). Sob condições de redução, detectou-se nos extractos de linfócitos T e de dois transformantes T4⁺ independentes, uma glicoproteína que migrava com uma massa molecular relativa de 55 Kd.

Não se detectou esta proteína nos fibroblastos 3T3 de controlo. Sob condições não redutoras, imunoprecipitou-se uma glicoproteína de 51 Kd com anti-T4 nas células T e nos fibroblastos transformados.

Estas experiências demonstram que os transformantes expressam uma glicoproteína de 55 Kd, imunoprecipitada com anti-T4, que é idêntica em tamanho à que se expressa na superfície dos linfócitos T. Assim,as análises Northern e Southern utilizando o cADN isolado, tomadas em conjunto com a capacidade deste cADN para conferir o fenótipo T4⁺ aos fibroblastos do rato, indicam que a sequência de código completa da proteína T4 da superfície da célula T foi clonada.

Sequência de Nucleótidos do cADN de T4 e_Dedução da Sequência da_Proteína

Determinou-se a sequência de nucleótidos completa da região de código de T4, por sequenciação dos dois

5.7 cordões da inserção de cADN de 3 Kb utilizando o método de terminação didesoxi (35,36). Na Figura 6, apresenta-se a sequência de nucleótidos completa e a sequência previsível da proteína. A sequência de interpretação, aberta, mais longa, inicia-se na posição 76 com um codão de metionina circundado pela sequência de iniciação de consenso PurNNATGPur (61). Esta sequência de interpretação de 1374 nucleótidos de extensão, codifica um polipeptido que contém 458 aminoácidos. Confirmou-se a continuidade desta sequência de interpretação inserindo este cADN no interior do vector de expressão de ARN, pSP6 (40). 0 ARN sintetisado a partir deste vector, quando transferido, in vitro, comanda a síntese de uma proteína de 51 Kd não modificada, que possui precisamente, o peso molecular previsível a partir da sequência de nucleótidos (Figura 7). T4 compreende uma sequência principal, quatro regiões semelhantes às regiões de união (VJ)- de variação encadeadas e um domínio que abrange a membrana, partilhando cada uma delas da homologia das regiões correspondentes nos diferentes membros da família dos genes de imunoglobulina (62.63), (Figuras 6 e 8). Seguindo-se imediatamente ao codão inicial, encontra-se uma extensão de resíduos hidrófobos que correspondem a um peptido principal que se previu por diagrama de hidropadia de Kyte-Dolittle (64). Apesar de não ser possível determinar a posição exacta em que se processou a proteína T4 primitiva, estabeleceu-se que a clivagem teve lugar imediatamente depois da treonina na posição-1, com base nos diagramas de clivagem (65). Para além disso o peptido principal contém 23 aminoácidos e a proteína T4 que se processou contém 435 resíduos.

Os resíduos 1-94 da proteína madura partilham

a homologia aminoácida e estrutural com o domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina (Figura 9A). A homologia total deste domínio com as regiões variáveis da imunoglobulina é de 32%. A comparação das sequências entre as regiões V das imunoglobulinas de cadeia leve e a região semelhante a V, N-terminal (Vl) de T4 , demonstrou que se conservaram 8 de 14 resíduos invariáveis (66). Este domínio contém dois resíduos de cisteína separados por 67 aminoácidos, cujas posições e espaçamento são análogos aos encontrados nas imunoglobulinas de cadeia leve e moléculas com elas relacionadas (67). Estas cisteínas podem ser capazes de formar a ponte dissulfídica que se conservou entre os cordões, característica dos domínios V. Esta sugestão tem como suporte o facto de se ter observado que T4 migra mais rapidamente sob condições não redutoras do que sob condições redutoras, o que é consistente com a formação de, pelo menos, uma ligação entre os cordões (Figura 5, pistas e e f). Com excepçâo das homologias ao nível dos aminoácidos individuais, o domínio V de T4 compartilha as mesmas características estruturais com as regiões variáveis da imunoglobulina. Os domínios constante e variável da imunoglobulina entrelaçam-se num diagrama característico no qual uma série de cordões jb não paralelos se dobra para formar duas camadas Jò (67,68). Estas camadas mantêm-se juntas por uma ponte dissulfídica e por interacções características hidrófobas. Para se determinar até que ponto a estrutura secundária previsível do domínio semelhante a V, de T4, era comparável à estrutura dos domínios V das imunoglobulinas de cadeia leve, efectuaram-se alinhamentos estruturais

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bi-dimensionais. Também se obteve um diagrama de cordões jb e configurações jb prováveis nestas sequências, utilizando o algoritmo de Chou e de Fasman empiricamente derivado (69).

Estas análises sugerem a presença de sete cordões ”jb no domínio semelhante a V de T4 que correspondem perfeitamente aos que se encontram no domínio V da imunoglobulina (Figura 9A). Descobriram-se nos cordões , B e F, as duas cisteínas conservadas de T4 que correspondem exactamente às posições das cisteínas na região V, que se sabe formarem a ponte dissulfídica conservada, da imunoglobulina. Um resíduo de triptofano situa-se 12 aminoácidos a jusante da primeira cisteína e um resíduo de tirosina encontra-se situado dois aminoácidos antes da segunda cisteína. Estes resíduos são altamente característicos dos cordões jb , C e F, respectivamente nas regiões V da cadeia leve. Para além disto, descobriu-se um resíduo de aspartato seis aminoácidos antes da segunda cisteína e um resíduo de arginina que se situa na base do cordão , d. Estes resíduos carregados são altamente característicos dos domínios V (67). Finalmente, encontram-se presente de uma extremidade à outra dos cordões ^b, fragmentos de resíduos hidrófobos alternados, que reforçam a interacção das duas camadas jb .

Ao domínio VI de T4 , segue-se uma sequência de resíduos aminoácidos que possuem homologia significativa com as regiões de união (J) das imunoglobulinas e com os receptores dos antigenes das células T. Na Figura 9B, esta região semelhante a J de T4 encontra-se alinhada com as sequências de união de consenso das cadeias leves da imunoglobulina e com as duas cadeias do receptor dos antigenes das células T.

Esta região semelhante a J é seguida por uma sequência de 265 aminoácidos que pode ser estruturalmente dividida em três domínios adicionais semelhantes a VJ com uma sequência estatisticamente significativa e homologia estrutural para as regiões VJ de imunoglobulina modelo (Figura 6 e 8). Adicionalmente esta sequência contém dois sítios potenciais de glicosilação N-ligada (Asn-Leu-Thr; Figura 6).

O domínio estracelular encontra-se seguido por uma suposta sequência de transmembrana, previsível por um diagrama de hidropaticidade (64), que contém apenas resíduos aminoácidos neutros e hidrófobos. Este segmento apresenta notável homologia com o exão de transmembrana das cadeias ^b das proteínas de histocompatibilidade principal da classe II (Figura 9C). 0 alinhamento das regiões de transmembranas de T4 e das cadeias jb de MHC da classe II, revelou 48% de homologia sem lacunas. A seguir ao segmento que abarca a membrana, uma sequência altamente carregada de 40 aminoácidos compreende o domínio citoplásmico (Figuras 6 e 8).

O Gene_T4_; Situação Cromossómica e Posições Intrão-Exão

Utilizou-se o cADN de T4 para se determinar a localização cromossómica do gene T4 por análise dos seus diagramas de segregação num painel de células somáticas híbridas de ser humano e de rato, por hibridação, in situ , com cromossomas do metafose humanos (101). Experiências de marcação genómica e hibridação yn situ, indicaram que o gene de T4 reside na pequena extremidade do cromossoma humano 12, entre as regiões 12pl2 e 12pter.

Obteve-se um conjunto de clones genómicos im bricantes que abrangem o gene T4, por rastreio das bibliotecas genómicas humanas construídas nos vectores de clonagem lambda, Charon e EMLB-3 com uma inserção de cADN de pT4B marcada radioactivamente (70). A caracterização destes clones por análises de restrição e de mancha Southern indicaram que eles continham a sequência completa de código de T4 . Determinou-se a organização completa intrão-exão do gene T4 por sequenciação de fragmentos específicos de clones genómicos utilizando o método de terminação didesoxi (35,36).

gene T4 é constituído por 9 exões separados por 8 intrões, conforme se indica nas Figuras 8 e 10. 0 primeiro exão contém a região não transferida da extremidade 5' e o segmento principal. O primeiro domínio semelhante ao variável, V , encontra-se separado por um grande intrão localizado na posição nucleotídica 289 (Figura 6). Para além disso, o domínio é codificado pelo segundo e terceiro exões e os domínios V_J_ , V,J₁₍ V, J . e de transmembrana (TM) são

2 j J 4 4 cada um deles codificados por exões separados (exões 4-7). O domínio citoplásmico encontra-se dividido por um intrão e a última porção do domínio citoplásmico e a região não transferida da extremidade 3' são codificados pelo nono exão.

Construção das Células T4 e T8~_Transformadas

A abordagem experimental utilizada para se estudar a função desempenhada por T4 na infecção do vírus da SIDA envolveu inicialmente, a introdução do gene T4 nas linhas de células T4 incapazes de suportar a infecção virai. Testou-se então a susceptibilidade das células transformadas ao vírus da SIDA, seguindo-se-lhe estudos do mecanismo segundo o

2

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X. qual T4 actua como mediador da infecção virai.

Subclonou-se um clone completo de cADN que codifica a proteína de superfície T4 no interior de um vector de expressão retroviral , pMV7. 0 vector de expressão, pMV7 (Figura 11 A), contém duas repetições na extremidade longa do vírus do sarcoma de murino de Moloney directamente repetidas (LTRs) que flaqueiam um único sítio de clonagem EcoRI. 0 LTR da extremidade 5' promove de modo constitutivo a transcrição através do sítio de clonagem, enquanto o LTR da extremidade 3' proporciona as sequências necessárias para clivagem e poliadenilação do ARN. Para além disto, o pMV7 contém o promotor da timidina-quinase do vírus herpes (tk) fundido com a região de código do gene bacteriano da neomicina-fosfotransferase (neo), um indicador de selecção dominante, o qua permite a ligação da transformação conjunta e a infecção.

Intr ·. ziu-se T4-pMV7 no interior das células ^f-2 e -AM, linhas de células NIH-3T3 contendo provírus ecotrópi cos e anfotrópicos defectivos, respectivamente (Figura 11B) (44,59). Ambas as linhas de células são incapazes de encapsidar o ARN virai endógeno, mas todas elas podem proporcionar funções transvirais obrigatórias. A transfecção estável destas linhas de células com T4-pMV7 origina a produção de reservas retrovirais recombinantes que codificam T4 - que se encontra isenta do vírus auxiliar. Estas reservas virais puras podem depois, ser utilizadas para introduzir eficazmente sequências T4 no interior de células de rato e humanas sem produção do retrovirus pelas células alvo.

De um modo resumido, introduziu-se o ADN de T4-pMV7 nas células \V-2, utilizando o procedimento de trans6 3 ferência do gene por ADN (Figura 11 B) (25, 27). Seleccionaram-se as colónias positivas neo⁺ pela sua capacidade para se desenvolverem em meio que contém o análogo da neomicina G418 (Geneticiri ) e efectuou-se o seu rastreio para se verificar a expressão de T4 na superfície celular utilizando um ensaio de aderência imunocita in situ, (20, 70). Identificaram-se então, as colónias de células ψ -2 transfectadas que expressam T4, as quais produzem retrovírus recombinantes com títulos de 10^ cfu/ml. Utilizaram-se, então os clones ^-2 de T4⁺ para originar retrovírus capazes de infectar as células V^-AM do rato. Isolaram-se os clones \^-ΑΜ que expressam T4, que proporcionaram títulos de retrovírus recombinantes de 10^ cfu/ml. Originaram-se os transformantes T4 ⁺ humanos por cultura conjunta das células tratadas com mitomicina C ou com clones Ύ- AM (Figura 11 B). Analisaram-se subsequentemente os transformantes T4 ⁺ por análise da mancha Southern e por citometria de fluxo para se confirmar que T4 se expressa e se encontra presente na superfície das células. Construiram-se de modo análogo as linhas de células de controlo que expressam a proteína T8 de superfície.

T4 é Essencial para a Infecção Provocada pelos vírus da SIDA

Para se determinar inicialmente, se a presença da proteína T4 na superfície celular de um linfócito humano era suficiente para tornar a célula susceptível à infecção pelo vírus da SIDA, construiram-se transformantes da linha primitiva de células leucémicas T, HSB2 (71), que apenas expressam na sua superfície as proteáinas primitivas dos linfócitos T, TI e Til. HSB2 não expressa nem T4 nem T8, nem ex64 pressa o receptor de antigene da célula T nem os complexos associados às proteínas T3 . Os transformantes de HSB2 que expressam T4 ou T8 na superfície celular, seleccionaram-se e utilizaram-se para determinar a susceptibilidade destas linhas à infecção provocada pelo vírus da SIDA. Seguiram-se diferentes abordagens experimentais para se avaliar a infecção provocada pelo vírus da SIDA, incluindo a expressão da transcriptase inversa (52) a expressão do vírus no citoplasma da célula por microscopia de imunofluorescência (46 ), detecção dos antigenes virais nos sobrenadantes de cultura utilizando um ensaio imunológico (47), bem como a produção de vibriões infecciosos por uma subcultura de sobrenadantes com linfócitos periféricos estimulados por fito-hemaglutinina (PHA) (46). Não se observou, utilizando estes ensaios, a infecção pelo vírus da SIDA da linha de células HSB2 (Quadro 1).

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Para além disto, demonstrou-se, previamente que a fusão extensiva das células ocorre quando se cultivam en conjunto células humanas não infectadas que suportam recep tores para o vírus da SIDA, com células produtoras do vírus da SIDA (54). Neste ensaio, não há indução sincicial quando se misturam as células HSB2 com células H9 que produzem o vírus da SIDA (Quadro I), apesar de se formar abundantemente sincicia com HTLV-I e células produtoras de HTLV-II (não se apresentam os dados).

Finalmente, ensaiou-se a entrada dos vírus utilizando pseudotipos do vírus da estomatite vesicular (VSV) que suportam as glicoproteínas de invólucro do vírus da SIDA (Quadro I) (53, 54). Quando se hiperinfectam com VSV células infectadas com o vírus da SIDA uma proporção da progénie VSV reune glicoproteínas do invólucro do vírus da SIDA suficiente para resistir à neutralização pelo anti-soro VSV hiperimune. 0 âmbito das células hospedeiras destes vibriões de pseudotipo VSV da SIDA limita-se às células qu expressam receptores específicos para o vírus da SIDA. Seguindo-se à penetração da célula e da perda do invólucro do vibrião, o genoma de VSV transcapsidado , replica-se para produzir particulas não pertencentes ao pseudotipo. Durante a infecção secundária, a progénie VSV libertada a partir das células infectadas penetra e destrói as células indicadoras vizinhas resistentes à infecção pelo pseudotipo VSV (SIDA) (células CCL64 de marta ou MDBK de bovino), de que resulta a formação de placas VSV que depois se contam. Assim, a infecção com pseudotipos de VSV (SIDA) proporciona um ensaio quantitativo de placa cito

Ί pático para entrada de vírus (54). Neste ensaio, não se observaram placas sobre o fundo quando se expuseram as células HSB2 a pseudotipos VSV (SIDA) (Quadro I). Nas experiências de controlo com ARN de VSV encapsidado num invólucro HTLV-I [VSV(HTLV-I) ] , observaram-se numerosas placas, o que demonstra que as células HSB2 que suportam os receptores HTLV-I, são capazes de replicarem VSV de um modo eficaz. Estas observações demonstram que o genoma de VSV encapsidado num invólucro do vírus da SIDA é incapaz de penetrar nas células HSB2.

Seguidamente, estudou-se a possibilidade de se introduzir um cADN de T4 funcional no interior de HSB2 para tornar esta célula susceptível de infecção pelo vírus da SIDA (Quadro I). A exposição dos transformantes HSB-T4⁺ ao vírus da SIDA resulta numa infecção virai produtiva, consoante se determinou por expressão da actividade da transcriptase inversa (52), expressão do vírus no citoplasma da célula por micros copia de imunof1uorescência (46), detecção dos antigenes virais nos sobrenadantes de cultura utilizando um ensaio imunonológico (47), bem como a produção de vírus infecciosos por sbcultura de sobrenadantes com linfócitos estimulados por PHA (Quadro I) (46). Em cada um destes ensaios, as células HSB2-T8⁺ de controlo foram consistentemente negativas.

Para além disto, também se examinou o grau de eficácia segundo o qual as diferentes células T, t4⁺, foram infectadas pelo vírus da SIDA. Exposeram-se os transformantes HSB2-T4⁺> e HSB2-T8⁺, a linha de células CEM, T, T4⁺, naturalmente isolada, assim como linfócitos periféricos estimulados com PHA a uma série de 10 diluições do vírus da SIDA, lavaram-se e colocaram-se em microcultura. Determinou-se então, a fre

quência das culturas infectadas utilizando um imuno-ensaio, 12 dias após a exposição ao vírus (Figura 12) (47). Segundo este procedimento, definiu-se o título do vírus da SIDA ne cessário para infectar 50% das culturas expostas (ID-50). O

ID-50 dos linfócitos periféricos estimulados por PHA é 2 a 3 vezes superior em amplitude ao observado para as linhas de células T4 ⁺ naturalmente isoladas ou transformadas. A eficácia da infecção das células HSB2-T4⁺ é, aproximadamente, 10 vezes superior à que se observa na linha CEM de células T, T4⁺, iso ladas naturalmente. (Figura 12). As células de controlo HSB2-T8⁺ não se mostraram susceptíveis à infecção, mesmo com os títulos máximos de vírus, que se observaram.

Também se estudou a capacidade das células HSB2+

-T4 para suportar a formação de sincicia e a replicação dos pseudotipos (SIDA) de VSV. Quando se procedeu à cultura de células HSB2-T4⁺ conjuntamente com células H9 produtoras de vírus da SIDA, observou-se facilmente a formação de sincicia dentro de 18 horas (Quadros I e II).

Para além disto, a indução sincicial é abolida por tratamento prévio das culturas com o anticorpo monoclonal anti-T4A (Quadro II). Finalmente, quando se expõem as células HSB2-T4⁺ aos pseudotipos VSV (SIDA), produzem-se partículas VSV infecciosas que destroem as células indicadoras vizinhas (Quadros I e III). Para além disto, a formação da placa é inibida por tratamento prévio com anticorpo anti-vírus da SIDA ou com o anticorpo monoclonal anti-T4A (Quadro

III). As células HSB2-T8⁺ foram negativas, de um modo consistente, em cada um dos sete ensaios utilizados para detec-

tar a infecção originada pelo vírus da SIDA (Quadros I, II e III). Estas observações proporcionam a evidência genética de que un linfócito T humano imaturo, a simples presença da proteína T4 proporciona uma função essencial, necessária para a infecção pelo vírus da SIDA.

Quadro II

Indução Sincicial nos Transformantes_Humanos T4

Indução Sincicial

Células

Humanas

JM(T4⁺) 8166(T4⁺)

H9/SIDA

H9/SIDA + o< T4A

HSB2

HSB2-T8HSB2-T4⁺

ND

ND +-HRa j i

Raji-T8⁺

Ra j i-T4 ⁺

ND

ND

HeLa

He La-T8 ⁺

HeLa-T4 ⁺

ND

ND

Efectuou-se uma cultura de 2 x 10 células conjun tamente com 2 x 10 células H9 produtoras de vírus da SIDA (H9/SIDA) e incubou-se a 37°C· Decorridas 18 horas,examinaram-se as culturas para se verificar a formação de sincicia. Exprimiram-se os resultados como a percentagem de núcleos que continham sincicia: -(sem sincicia); ++(25%); +++ (50%), +++++(90%); ND(não determinada). Ensaiou-se a inibição sincicial adicionando o anticorpo monoclonal anti-T4A (οζΤ4Α;1:20) às culturas mistas na altura

da sementeira. Serviram como controlos neste estudo, as linhas JM e 8166 de células T T4⁺ que se isolaram naturalmente.

Quadro II^I

Ensaio de Placa Citopática do Pseudotipo VSV nos_Transformantes + +

Humanos T4 e T8

TÍTULO DO PSEUDOTIPO VSV (PFU/ml)

Células	Humanas		VSV(HTLV-I)	VSV(SIDA)
			+ o< HTLV-I	+«SIDA	+o<T4 A
						——--—
CEM(T4 )			2 0 , 000	50	42,000 50	200
HSB2-T8+			10 ,000	50	0 ND	ND
HSB2-T4+			12,000	50	1,000 100	300
Ra j i-T8 +			5,000	ND	0 ND	ND
Ra j i-T4 +			5,000	50	1 , 500 2 5	150
He La			10,000	ND	0 ND	ND
He La-T4 +			10,000	50	17,000 50	200
	Incubaram-se 2 x 1Q5	células com	pseudo-
	tipos	VSV (SIDA) (53,	54) durante	1 hora
	a 37°	C .	Lavaram-se, então, as células e
	adicionou-se a cada cavidade 1 x	1 A6 10 ce-
	lulas	indicadoras de	placa CCL64	de marta
	ou MDBK	de bovino que	permitem a	infecção
	por VSV	mas resistentes a VSV (SIDA). Co-

briram-se as culturas com meio de agar e registaram-se as placas de VSV dois dias após a infecção. Utilizaram-se anticorpos monoclonais anti-T4A (<*T4A;l:20) ou soro anti-vírus da SIDA (<*SIDA ; 1:10 ) para inibir a formulação da placa do pseudotipo

VSV (SIDA) por tratamento prévio das células, 30 minutos antes da exposição aos pseudotipos (54). Uti1izaram-se como con trolos nestas experiências os pseudotipos VSV (HTLV-I) que formaram placas numa ampla gama de tipos de células humanas (54). Utilizou-se soro anti-HTLV-I (1:10) para bloquear a formação de placas do pseudotipo VSV (HTLV-I). Os resul tados expressam-se em PFU/ml; ND (não de terminado).

4

A infecção pelo vírus da SIDA não se limita aos Linfócitos T

Introduziu-se um cADN funcional de T4 em duas linhas de células humanas não T: HeLa, uma linha de células epiteliais derivada do carcinoma cervical (72) e Raji, uma linha de células linfoblastóides derivada de um paciente com linfoma de Burkitt (73) (Figura 11 B). Antes da transferência do gene mediador do retrovírus, estas células não expressam a proteína de superfície T4 ou o mARN de T4, nem são susceptíveis à infecção pelo vírus da SIDA (Quadro I). Além disso, as linhas de células da mesma família não suportam a indução sincicial nem a disposição em placas dos pseudotipos VSV(SIDA) (Quadros I, II e III).

Como contraste, os transformantes t4⁺ Raji e HeLa suportam a infecção dos vírus da SIDA segundo todos os critérios previamente descritos (Quadro I). A eficácia segundo a qual se podem infectar as células Raji-T4⁺ com o vírus da SIDA aproxima-se da das células HSB2-T4⁺ e é cerca de 10 vezes superior á eficácia da infecção da linha CEM de células T, T4⁺ naturalmente isoladas (Figura 12). Além disto, após cultura conjunta com células H9 produtoras de vírus da SIDA, as células Raji-T4⁺ e HeLa-T4⁺ servem de suporte à indução sincicial que é abolida por tratamento prévio das culturas com o anticorpo monoclonal anti-T4A (Quadros I, II; Figura 13). Também, a exposição destas células a pseudotipos VSV(SIDA) resulta na produção de VSV infecciosos e na formação de placas que são inibidas por tratamento prévio com o anticorpo anti-vírus da SIDA ou com o anticorpo monoclonal anti-T4A (Quadros I e III). Os transformantes de controlo ( Raji-T8⁺ e HeLa-T8 foram consistentemente negativos em cada um destes ensaios (Quadros I, II e III). Por este motivo, a introdução de um gene T4 funcional nos linfócitos humanos T, nos linfócitos B ou nas células epiteliais, é suficiente para tornar tais células susceptíveis à infecção pelo vírus da SIDA. Tomadas em conjunto estas observações indicam que o tropismo das células T, T4⁺ que se observa in yi^yo, é uma consequência da expressão limitada da molécula T4 e, não da natureza do tipo de célula no qual se expressa.

Ligações do vírus da SIDA às proteínas T4 de Superfície

As experiências anteriores proporcionaram a evidência genética de que a expressão de T4 é necessária para a infecção pelo vírus da SIDA mas não proporciona qualquer informação sobre o papel desta molécula no ciclo de vida do vírus. A observação de que é necessária a expressão de T4 na superfície celular, para que haja infecção pelo vírus da SIDA, sugere que T4 é o receptor do vírus da SIDA. Por esse motivo, utilizou-se a citofluorometria para se examinar a ligação do vírus da SIDA às superfícies das células humanas transformadas T4 e T8 (Quadro I; Figura 14). Incubaram-se células HSB2, Raji e Hela e os transformantes T4⁺ e T8⁺ com vírus da SIDA. A seguir à absorção dos vírus, lavaram-se as células, expuseram-se ao anticorpo anti-vírus da SIDA conjugado com fluoresceína e analisaram-se por citometria de fluxo. Este ensaio indicou que os vírus da SIDA se ligam eficaz e especificamente aos transformantes humanos que expressam T4 na sua superfície, mas não às células T4 da família de origem nem aos transformantes T8⁺ (Figura 14, coluna B; Quadro I).

- /

J

Elimina-se a ligação do vírus da SIDA às células T4 por incubação prévia com o anticorpo monoclonal anti-T4A, mas não por incubação prévia com o anticorpo monoclonal anti-T8 (Figura 14, coluna C). Além disso, quando as células T4⁺ transformadas são expostas ao vírus da SIDA, a glicoproteína T4 precipita conjuntamente com a glicoproteína de invólucro do vírus, o que sugere uma associação física directa entre estas moléculas (não se apresentam os dados). Estes resultados indicam que o vírus da SIDA se liga à molécula T4 na superfície celular e que esta ligação é independente de outras proteínas especificas da célula T uma vez que se observou a ligação para todos os tipos de células T4⁺ examinadas.

Em estudos anteriores descreveram-se duas vias distintas de entrada para os vírus com invólucro (74, 75, 76, 77). Alguns vírus fundem-se directamente com a membrana plasmática , libertando as suas nucleocapsides no citoplasma, enquanto outros penetram por endocitose mediada pelo receptor. Depois, o meio ácido do endossoma facilita a fusão do invólucro virai com a membrana que limita o vacúolo. A infecção das células por vírus que penetram através da via endocítica pode ser inibida pelo tratamento das células com agentes tais como bases fracas que desacidificam o endossoma (58, 78, 79, 80). Na presença de cloreto de amónio, a fusão é bloqueada no endossoma mas a degradação lisossómica ainda se dá a uma velocidade reduzida (80).

Analisou-se, por este motivo, o efeito do cloreto de amónio na infecção provocada pelos vírus da SIDA na linha JM das células T, T4⁺. Na ausência de cloreto de amónio, mais de 50% das células JM expostas ao vírus da SIDA expres sam antigenes virais cinco dias após a infecção, conforme se determinou por microscopia de imunof 1 uorescência . Se se expuserem as células JM ao cloreto de amónio (durante 6 horas) , que na altura da adição do vírus, quer 30 minutos após a adição do vírus, observa-se uma inibição da infecção virai superior a 95%. No entanto, se se tratarem as células com cloreto de amónio uma hora antes da adição do vírus, não se observa qualquer inibição da infecção, uma constatação consistente com os efeitos cinéticos da entrada do vírus, que já se descreveu para outros vírus que penetram nas células através de endocitose mediada pelo receptor. Finalmente, o efeito do cloreto de amónio foi completamente reversível. As células expostas ao cloreto de amónio durante uma hora e, depois, lavadas para se libertarem do composto e expostas ao vírus da SIDA, admitiram os níveis de controlo da infecção virai. Estes resultados são consistentes com as observações prévias de que após a remoção do cloreto de amónio, o pH do endossoma regressa aos valores baixos iniciais dentro de 1 a 2 minutos (78, 80). Obtiveram-se resultados semelhantes com a amantadina, um composto que desacidifica o endossoma.

Estes resultados são consistentes com um mecanismo de entrada virai que envolve a endocitose do complexo T4-vírus da SIDA e a fusão do invólucro do vírus com a membrana que limita o endossoma, induzida a pH baixo, levando à libertação da nucleocapside do vírus no citoplasma da célula.

O mARN de T4 Expressa-se no cérebro

Em adição à ruptura do imuno-sistema celular, a SIDA é, frequentemente, acompanhada por distúrbios do sis

tema nervoso central (SNC) que se pensa serem uma consequência da infecção directa das células do cérebro pelo vírus da SIDA (81). Por isso, é interessante determinar se T4 se expressa nas células do SNC, proporcionando, desse modo, uma explicação para as propriedades neurotrópicas do vírus. A aná lise de mancha Northern preparada a partir dos cérebros de rato e humano, efectuou-se para determinar se as sequências de mARN de T4 se expressam no SNC (Figura 15). 0 ARN de poli(A)⁺ derivado do córtex cerebral humano, contém dois mARNs de T4 distintos, com pesos moleculares de 3 e 1,8 Kb (Figura 15A). 0 ARN de 3 Kb mais frágil, é idêntico em tamanho ao mARN expressado pelas duas linhas de células leucémicas T4⁺, U937 (linha de células monocíticas) e Jurkat (linha de células Τ) , assim como peloslínfócitos periféricos Τ. O mais pequeno e mais abundante mARN de 1,8 Kb ausente nos línfócitos T podia resultar de uma união alternativa ou de uma extremidade 5' ou 3' alternativa.

Efectuou-se uma análise mais cuidadosa da localização do mARN de T4, isolando o ARN de poli(A)⁺ a partir de regiões específicos do cérebro do rato (Figura 15B). A hibridação com cADN marcado radioactivamente que codifica o homólogo de T4 do murino, L3T4, revelou um intenso mARN de 2,2 Kb na porção frontal do cérebro do rato, que não se encontra presente nas amostras da porção occipital do cérebro. 0 mARN de L3T4, de 2,2 Kb detecta-se no córtex, no hipotálamo e é mais abundante no corpo estirado, mas não se encontra presente no cerebelo, no pedúnculo cerebral ou na medula espinal (não se apresentaram os dados). Este mARN detectado no

Ί9 /

SNC é inferior, em aproximadamente 1Kb ao mARN de 3,2 Kb que codifica os timócitos L3T4 (Figura 15B). Estes resultados indicam que o neurotropismo manifestado pelos vírus da SIDA é provavelmente o resultado da expressão de superfície das moléculas T4 nas células cerebrais. 0 nível de mARN detectado na porção anterior do cérebro é cerca de 1/30 do nível nos timócitos. Isto pode ser o reflexo de uma expressão a baixo nível por um grande número de células ou a expressão a alto nível de uma pequena subpopulação de células. Não se sabe actualmente, se T4 é expresso pelos neurónios ou pelas células de suporte. A presença no SNC de uma transcrição variante, torna, no entanto, improvável que o mARN de T4 no cérebro seja expresso pelos raros linfócitos T, invasores.

OBSERVAÇÕES

A segregação de T4 e de T8 por sub-grupos funcionalmente distintos de células T sugere que estas moléculas podem ser importantes na interacção dos linfócitos T com as células alvo adequadas. Como um primeiro passo na compreensão da função específica destas proteínas, obtiveram-se clones de cADN das moléculas T4 e T8 e determinaram-se as suas sequências de nucleótidos (20, 70). A comparação das sequências proteicas deduzidas de T4 e de T8 indicou que estas moléculas partilham uma homologia estrutural e sequencial significativa com os domínios variáveis (V) da imunoglobulina e com membros da superfamília dos genes da imunoglobulina. No entanto, os domínios semelhantes a V, N-terminais de T4 e de T8 são bastante diferentes: eles compartilham apenas 20% de homologia e, por esse motivo, são menos homólogos um do outro do _ / / que o são, cada um deles cadeias leves da imunoglobulina (Figura 9A). Para além disto, as regiões de conservação máxima entre T4 e T8 são também as regiões de mais forte homologia para a imunoglobulina e as regiões V do receptor da célula T. Assim, os domínios semelhantes a imunoglobulina destas duas moléculas, embora estruturalmente semelhantes, apresentam divergências sequenciais consistentes com a hipótese de que elas reconhcem moléculas diferentes em sub-grupos diferentes de células alvo.

A homologia estrutural compartilhada pelos domínios N-terminais de T4 e de T8 podem ser de particular importância para as funções destas proteínas. Todos os membros da superfamília dos genes da imunoglobulina participam, virtualmente, na resposta imunológica (62). Para além disso, os membros desta família apresentam, individualmente, uma forte tendência para se associarem uns aos outros com formação de dímeros. Esta associação surge na interacção das cadeias leves e pesadas da imunoglobulina, nas cadeias alfa e beta dos receptores dos antigenes das células T, nas proteínas microglobulina jb 2 e MHC da classe I e nas cadeias alfa e beta das moléculas MHC da classe II. A glicoproteína T8 forma uma ponte dissulfídica com T6, uma presumível molécula semelhante a MHC, na superfície dos timócitos (82) e existem como multímeros de sub-unidades de 32 Kd nos linfócitos periféricos T (83). A presença de quatro domínios semelhantes a V em T4 indica que estas regiões se associam uma à outra assim como com ligantes específicos na superfície de outras células ou vírus. Estas afinidades específicas de moléculas semelhantes a imunoglobulina podem ser essenciais para as funções de re conhecimento de T4 e de T8.

Evolução de T4

Nos genes da imunoglobulina e dos receptores de antigenes das células T, os exões V e J encontram-se amplamente separados e só se tornam justapostos após fenómenos de recombinação somática (62, 63). 0 mARN de T4 codifica quatro elementos contíguos semelhantes a J e a V, sem que sejam neces sários fenómenos de recombinação do ADN. Deste modo, é possível que T4 reflicta um gene mais primitivo que se desenvolveu antes do aparecimento de mecanismos de rearranjo. Suportes adicionais para estas teorias são as recentes observações de que a primeira região semelhante a V de T4 (VI) se encontra cindida por intrão que não está presente nos genes V que codificam as imunoglobulinas ou os receptores de antigenes das células T. A acumulação de factos sugere que é muito mais provável que os intrões tenham sido removidos precisamente durante a evolução do que tenham sido inseridos num meio previamente isento de intrões. Assim, T4 pode representar um gene ancestral de imunoglobulina que sofreu duplicações, divergências e rearranjos para originar a actual família dos genes da imunoglobulina. Apesar de funcional num sistema imunológico actualmente mais complexo, T4 pode reflectir receptores operativos numa resposta imunológica celular mais primitiva. As respostas imunológicas primitivas, tais como as dos invertebrados, não parecem envolver um reportório diversificado de moléculas receptoras, mas, nos casos mais simples, limitam-se a uma distinção entre próprios e não próprios (85, 86) e são provavelmente providos por conjunto estatático de genes que não sofrem rearranjos.

Qualquer que seja a ordem de aparecimento de

T4 na fase evolutiva, a organização destes genes representa um exemplo interessante de dissimulação de um exão . T4 consiste em quatro domínios semelhantes a V-J , uma região semelhante a J e um segmento de transmembrana, compartilhando todos eles homologia com diferentes membros da superfamília dos genes da imunoglobulina. Os domínios semelhantes a V e a J, são homólogos das regiões equivalentes das cadeias de imunoglobulinas e dos receptores dos antigenes das células T; o domínio de transmembrana apresenta considerável homologia com esta região nas cadeias jb das moléculas MHC da classe II (Figura 9C). Deste modo, T4 consiste numa colecção de exões que se conservaram em diversos membros da superfamília dos genes da imunoglobulina, os quais se dissimularam de diferentes modos para originar um grande número de diferentes moléculas, que participam na resposta imunológica.

T4 é_o Receptor do Vírus da SIDA

Os dados que aqui se proporcionaram sugerem um mecanismo de infecção pelo vírus da SIDA que envolve, inicialmente, a associação específica do vírus da SIDA com moléculas T4 na superfície das células. Pode demonstrar-se esta associação nos linfócitos T, nos linfócitos B e nas células epiteliais e, por isso, não necessita da participação de proteínas adicionais específicas das células T. Os dados aqui fornecidos indicam, adicionalmente, que o complexo T4-vírus da SIDA penetra no interior da célula pela endocitose medidada pelo receptor e que depois o invólucro do vírus se funde com a membrana

que limita o endossoma, libertando a nucleocapside no citoplasma. A replicação e transcrição dos vírus pode ocorrer nas células linfóides e não linfóides. Além disso, o gene T4 expressa-se no cérebro bem como nos linfócitos, proporcionando uma explicação para o carácter dualista, neurotrópico e linfotrópico do vírus da SIDA.Deste modo, tirou-se partido, por intermédio de um retrovírus humano , de uma proteína da superfície dos linfócitos T, imporante como mediadora nas interacções célula efectora-cé1ula alvo, para se projectarem especificamente os vírus da SIDA para as populações de células T4⁺.

Têm-se identificado os receptores da superfície celular para diversos vírus com invólucro e o diagrama de expressão destes receptores é, muitas vezes, responsável pela diversidade de hospedeiros e das propriedades trópicas de vírus específicos (74, 76). Alguns vírus infectarão apenas uma pequena variedade de tipos de células, reflectindo a expressão do receptor do vírus em populações específicas de células alvo. 0 vírus da raiva, por exemplo, interactua com o receptor de acetilcolina nicotínico (87) e infecta largamente o músculo esquelético e os neurónios, enquanto o vírus de Epstein-Barr actua com o receptor complementar de tipo 2, C3d (88) e infecta os linfócitos B. Outros vírus, tais como os mixovírus , interactuam com os resíduos de ácido siálico distribuídos dum modo ubíquo na superfície das células e infectam uma variedade muito maior de tipos de células.

A expressão limitada dos receptores na superfície das células proporciona apenas uma explicação para o tropismo virai. Alguns vírus replicar-se-ão apenas num grupo restrito de tipos de células diferenciadas, enquanto outros

transcrever-se-ão de um modo eficaz em tipos específicos de células. Por este motivo, o vírus da leucemia do murino de

Moloney (Mo-MuLV) induz os linfomas de células T em ratos recém-nascidos enquanto o vírus auxiliar da leucemia de muri no de Friend, estreitamente relacionado (Fr-MuLV), com aquele induz eritroleucemias primárias (89, 90, 91). Pensa-se que este tropismo resulte das diferenças nos LTRs que facilitam a transcrição eficaz do genoma Mo-MuLV nos linfócitos T e do genoma Fr-MuLV nos precursores eritróides (92, 93, 94).

Conforme aqui se indica o determinante primário de tropismo do vírus da SIDA é a expressão da proteína T4 na superfície da célula alvo. A infecção, in vivo, limita-se às células linfóides e às células mielóides assim como às células cerebrais: três populações que expressam T4. As demonstrações, in vitro , que a introdução de T4 nos linfócitos B humanos, T4 , e nas células epiteliais, células que não constituem alvos naturais para o vírus da SIDA, tornam estas células susceptíveis à infecção originada pelos vírus da SIDA.

Exemplo 1: Fragmentos Solúveis de T4

Prepararam-se os fragmentos solúveis de glicoproteína T4 utilizando digestão por protease limitada de preparações celulares. Em alternativa, podem construir-se vectores de expressão do ADN que codifica os fragmentos de T4 que perderam o domínio de transmembrana , uma região contendo resíduos hidrófobos e neutros e utilizarem-se para produzir os referidos fragmentos T4 . Estes fragmentos são solúveis em solução aquosa e contêm sequências principais (de sinal). Quando se expressam nas células dos mamíferos, estes fragmentos são

transportados para o retículo endoplásmico rugoso/complexo de Golgi e segregados, eventualmente, pelas células.

Exemplo 2: Tratamento dos Doentes com SIDA

Administraram-se os fragmentos solúveis de glicoproteína T4, conforme descrito no Exemplo 1, usualmente num veículo farmaceuticamente aceitável, aos doentes infectados com o vírus da imunodeficiência humana, com o objectivo de se ligarem aos vírus presentes no sangue dos doentes e em outros fluídos orgânicos e bloquearem a infecção jin vi^vo, das células T4⁺. Como alternativa ou, em adição, faz-se circular através de uma coluna contendo ou glicoproteínas T4 imobilizadas ou fragmentos solúveis de T4 , para que o vírus possa ser separado do sangue. Estas medidas permitem ao imuno-sis tema montar uma resposta imunológica mais eficiente contra o vírus, isto é, permite que as células T, T4⁺, não infectadas proliferem.

Os fragmentos solúveis de T4 utilizam-se como um agente terapêutico, isto é, como um inibidor da propagação extracelular e célula a célula da infecção provocada por HIV. Os requerentes demonstraram que os fragmentos solúveis de T4 inibem, .in vitro, a ligação de HIV às células alvo T4⁺ e a infecção das células alvo T4⁺ (ver Exemplo 4). A administração de fragmentos solúveis T4 a indivíduos infectados com HIV inibe a propagação extracelular da infecção originada pelo vírus. Adicionalmente, a fusão de células T4⁺ infectadas por HIV e de células T4⁺ não infectadas, que também é uma via segundo a qual os vírus se propagam, inibe-se pela administração de fragmentos solúveis de T4.

Deste modo, a administração de fragmentos so lúveis de T4 abranda o curso da doença, alivia diversos sintomas associados à SIDA e previne a ocorrência de novas alterações patológicas.

Utilizam-se os fragmentos solúveis de T4 , bioquimicamente puros, reagentes solúveis em água, em associação com outros reagentes para ensaios de competição da interacção T4-HIV. Assim, os fragmentos solúveis de T4, em associação com proteínas de invólucro de HIV ou com misturas bioquímicas que contêm proteínas de invólucro de HIV, utilizam-se para efectuar rastreios de inibidores da ligação virai.

Exemplo 3: Produção dos Fragmentos Solúveis de T4

Isolou-se um cADN que codifica a proteína T4 ligada à membrana (pT4B), caracterizou-se expressou-se numa diversidade de tipos de células de mamíferos (70). Produziram-se fragmentos solúveis de T4 em sistemas bacterianos, de leveduras, de insectos e de mamíferos. Devido ao facto da proteína T4 se entrelaçar, provavelmente de um modo complexo e de ser glicosilada, prefere-se a expressão nos sistemas de mamíferos. Produzem-se os fragmentos solúveis de T4 truncando o pT4B a seguir ao domínio V₄J^. Tais fragmentos de ADN terminam antes do segmento de membrana, o qual se inicia aproximadamente na posição nucleotídica 1264 (Figura 6). Esta molécula de ADN recombinante não possui os domínios de transmembrana e citoplásmico. 0 fragmento EcoRI-HpalI que encerra os nucleótidos de 1 a 1252, isola-se, montando-o a partir dos fragmentos mais pequenos de pT4B. Alternativamente, elimina-se apenas o domínio que abrange a membrana, deixando o domínio fundido com o domínio citoplásmico. Uma abordagem / χ ,χ consiste em eliminar o fragmento que abarca os sítios Hpall dos nucleótidos 1252-1342 de pT4B. Estas construções mantêm a sequência principal T4 necessária para a entrada no retículo endoplásmico/complexo de golgi e eventual secreção a partir das células. Para além disso, estas construções mantêm a porção extra-celular da proteína T4 na qual existe o domínio de ligação para a glicoproteína de invólucro do vírus da imunodeficiência humana.

No sentido de se expressar os fragmentos solúveis de T4 nos sistemas dos mamíferos, subclonou-se o fragmento de cADN de T4 no interior de vectores contendo promotores/ /intensificadores eucarióticos fortes bem como os sítios de poliadenilação necessários para a clivagem e poliadenilação do ARN. Por exemplo, o promotor primário (SV40) e o intensificador do símio encontram-se posicionados a montante do fragmento de cADN do fragmento solúvel de T4. Efectuou-se o terminus de transcrição e a poliadenilação do ARN, colocando o sítio de poliadenilação de SV40 ou do gene da hormona do crescimento humano a jusante do fragmento solúvel de cADN de T4. A introdução de uma construção contendo estes elementos, conjuntamente com um indicador selectivo dentro das células eucariotas, segundo qualquer um dos métodos conhecidos na especialidade, conduz à integração estável do ADN exógeno. Os trans f ormantes que se seleccionaram devido à sua capacidade para se desenvolverem em meios selectivos, segregam fragmentos solúveis de T4 nos sobrenadantes de cultura. Detectaram-se os fragmentos solúveis de T4 nos sobrenadantes, de acordo com diverssos ensaios, por exemplo, radio-imunoprecipitação e, depois, purificaram-se. A purificação e caracterização dos

fragmentos solúveis de T4, foi grandemente aumentada pela cons trução de uma linha de células que sobre-expressa o fragmento de proteína segregado. Empregaram-se as estratégias que permitem a sobre-expressão das proteínas em sistemas bacterianos, de leveduras, de insectos e de mamíferos. Também se empregaram os sistemas indutores de expressão para produzir em maior quantidade proteínas que podem ser tóxicas quando expressas constitutivamente. Tem sido amplamente empregue a amplifica ção dos genes de di-hidrofolato-redutase (dhfr), por crescimento em concentrações progressivamente mais elevadas do fár maco metotrexato, um antagonista da dhfr. Uma vez que a unidade amplificada não se limita às sequências que codificam dhfr, esta abordagem resulta na amplificação conjunta das sequências adjacentes a elas. Por esse motivo, se utiliza dhfr como um indicador selectivo e como um meio para amplificação conjunta das sequências introduzidas de novo. Empregou-se esta estratégia com sucesso para aumentar a expressão de diversos e diferentes genes transformados conjuntamente com plasmídeos dhfr. Um esquema alternativo de amplificação envolve a transfecção conjunta do vector de expressão do cADN do fragmento solúvel de T4 com o plasmídeo pdLAT-3, seguido do esquema de selecção previamente descrito (102).

Para além disso, efectua-se a transfecção conjunra da construção cbexpressão do cADN do fragmento solúvel de T4 com um plasmídeo de expressão dhfr. Em alternativa, o gene dhfr reside no mesmo plasmídeo que o fragmento solúvel decADN de T4 , o que permite a transfecção conjunta da conexão. A transfecção destas construções no interior das células do ovário do hamster chinês (CHO) com deficiência de dhfr (dhfr ), e a selecção { subsequente em metotrexato permite o isolamento dos transformantes estáveis que expressam as sequências novamente introduzidas. Purificaram-se diversos clones e, recolheram-se os sobrenadantes de cultura e ensaiaram-se para se verificar a presença de fragmentos solúveis de T4. Caracterizaram-se depois os cloenes que produziram níveis mais elevados de fragmentos solúveis T4, por análises de manchas Northern e Southern. Cultivaram-se, então, estas linhas de células em meio selectivo que continha concentrações de metotrexato gradualmente crescentes. Desta pressão selectiva, resulta na amplificação do gene dhfr e das sequências de T4 adjacentes, novamente introduzidos. Depois de se ter atingido a concentração mais elevada de metotrexato, submeteram-se as células sobreviventes a análises de manchas Northern e Southern para determinar a extensão da amplificação e examinaram-se os sobrenadantes da cultura quanto à presença de fragmentos solúveis de T4 .

No sentido de se caracterizarem os fragmentos solúveis de T4 nos sobrenadantes de cultura marcaram-se meta3 5 bolicamente diversos transformantes com [ S]-metionina. Analisaram-se, então os lisados celulares e os sobrenadantes por radio-imunoprecipitação e por análise de mancha Western utilizando anticorpos anti-T4 comercialmente disponíveis. Efectuou-se a electroforese SDS-gel de poliacrilamida sobre os precipitados e observou-se uma banda de massa molecular relativa previsível (Mr) da forma truncada de T4 que foi segregada. Devido ao facto de ser sintetizada num sistema mamífero, esta proteína é adequadamente glicosilada e dobrada, isto é, formam-se pontes dissulfureto. No sentido de se purificar os fragmentos solúveis de T4 a partir dos sobrenadantes de cultu90

ras efectuou-se uma cromatografia em coluna de imuno-afini dade, utilizando anticorpos anti-T4. Eluiram-se as proteínas que se ligaram à coluna, a elevadas concentrações de sais e a baixo pH. Efectuou-se a electroforese do material eluído, em SDS-gel de poliacrilamida, para determinar a Mr e o grau de pureza da fracção de proteína eluída. Para além disso, também se efectuaram análises de radio-imunoprecipitação e de mancha Western com o objectivo de se caracterizar melhor o material purificado por afinidade.

Podem efectuar-se abordagens semelhantes em bactérias , leveduras e insectos para produzir fragmentos solúveis de T4. Para além disso, podem produzir-se fragmentos de dimensões mais reduzidas do que aquele que aqui se descreveu, por exemplo, contendo apenas o domínio V^J^.

Construção de Vectores

Utilizando manipulações de ADN recombinante, colocaram-se os pares de bases de 1 a 12 57, da sequência de cADN de T4 humano, entre o promotor primitivo SV-40 e o codão de terminus TAA, seguido da região de poliadenilação do gene da hormona do crescimento dos bovinos. Esta sequência de cADN de T4 codifica o domínio principal e o domínio extra-celular previsível do receptor T4. Juntou-se este mini-gene sT4 com o H-ras humano ou com um mini-gene da di-hidrofolato-redutase do rato, para criar os vectores pST4Hras e pST4DHFR, respectivamente. Construíram-se estes vectores do seguinte modo :

Construção de pST4sal: Construiu-se o plasmídeo pST4sal a partir de dois outros plasmídeos, JRT4 e pUCsT4. Os pormeno τ» res da construção destes plasmídeos apresentam-se adiante.

Construção do plasmídeo JRT4: Para criar o plasmídeo JRT4, cortou-se o plasmídeo DSP1 (103) com Xhol, eliminou-se a região primária poliA de SV40 e complementarizaram-se os sítios Xhol utilizando o fragmento Klenow de ADN. Cortou-se a região de poliadenilação da hormona do crescimento de bovino (113) com PvuII e Kpnl e complementarizou-se o sítio Kpnl por tratamento com ADN polimerase T4. Ligou-se este fragmento de 230 pb a DSP1 para originar DSP1BGH. Cortou-se DSP1BGH com Saml e SA1I e a sequência galK (que consiste no promotor primário SV40, a região que codifica galK e a região PoliA de BGH) ligou-se no interior de pUC19 (107) no sítio Sall utilizando um ligante de síntese que consiste de uma extremidade Sall, de um sítio BglII e de uma extremidade Smal. Esta ligação a três passos originou o plasmídeo DSP1B2BGH.JT.

O plasmídeo DSP1BZBGH.JT., cortado com StuI e Bcll para se eliminar a região que codifica galK, ligou-se a um fragmento EcoRI (complementarizado)-BamHI de 1,7 kb contendo o cADN de T4 do plasmídeo pT4B (70) para formar o plasmídeo JRT4 .

Construção do plasmídeo pUCsT4; Para criar o plasmídeo pUCsT4 , ligou-se um fargmento HaelI e Hpall (1125 pb) do cADN de T4 do plasmídeo pT4B mediante a utilização de ligantes de síntese ao vector pUC18 que tinha sido cortado com Kpnl e Xbal. Ligou-se a extremidade HaelI do cADN de T4 ao sítio Kpnl de pUC18 utilizando um ligante de síntese com uma extremidade Kpnl e uma extremidade HaelI. Ligou-se a extremidade Hpall do cADN de T4 ao sítio Xbal de pUC18 utilizando um ligante de sín

tese com uma extremidade Hpal e uma extremidade Hbal. Este ligante também inseriu um codão de paragem TAA após o nucleótido 1257 da região que codifica T4. O plasmídeo resultante designou -se por pUCsT4.

Para se originar o plasmídeo psT4sal, cortou-se o plasmídeo JRT4 com BglII e Saci e isolou-se o plasmídeo de 959 pb (que consiste no promotor primário SV40 e nos primeiros 602 nucleotidos do cADN de T4). Cortou-se o plasmídeo pUCsT4 com Saci e Xbal e isolou-se um fragmento de 660 pb (que consiste do cADN de T4 dos nucleotidos 6 03-12 57 seguido pelo codão TAA do ligante de síntese). Ligaram-se estes dois fragmentos no interior de DSP1BZBGH.JT. que se havia cortado com BglII e Xbal para eliminar o promotor primário SV40 e a extensão completa da região que codifica T4. O plasmídeo resultante foi o pST4sal.

Construção do pST4DHFR: Para se originar o plasmídeo pST4DHFR, ligou-se um fragmento BglII-BamHI que continha uma sequência de expressão DHFR de B-globina, no sítio BamHI do pST4sal. A sequência de expressão DHFR de globina B compreende o promotor da -globina do rato, um fragmento de HincII de 550 pb do plasmídeo pPK288 (108) modificado na sua extremidade 5' com um ligante de síntese para conter um sítio BglII; a região que codifica a DHFR do rato, um fragmento HindIII de 735 pb (complementarizado) do plasmídeo pSV2 - DHFR (109); a região primária de poliA de SV40 de Nhel-BamHI (complementarizados) (103); e a região de terminus de DHFR do rato, um fragmento HindIII (complementar i zado) do plasmídeo mDH9 (110), modificado na sua extremidade 3' com um ligante de síntese para criar ί

ί um sítio BamHI. Apresenta-se um esquema do plasmídeo pST4DHFR.

Construção de pST4cHras: Criou-se o plasmídeo pMERcHras cortando o plasmídeo pSVK (111) com EcoRV e HindIII (complementarizado), para remover a região galK e lingando-o a um Ndel (complementarizado)-SalI (nivelado por MUNG BEAN nuclease) contendo a região que codifica cHras, do plasmídeo pSKcHras (112 ) .

Removeu-se do pST4sal a sequência de transcrição de T4 solúvel por intermédio de um fragmento BglII-BamHI e ligou-se ao sítio BamHI (3' para o promotor primário poliA SV40) de pMERcHras para originar o pST4cHras.

Expressão dos Mini-genes_( sT4 )__de T4 Solúvel nas Células dos

Mamí feros

Expressão de psT4cHras nas células NIH-3T3: Efectuou-se a precipitação conjunta do plasmídeo pST4cHras (10 pg), pelo método de precipitação com fosfato de cálcio, com 10 ^pg do plasmídeo pTKneo, um vector que confere resistência a G418, na presença de 10 jig de ADN de transporte (ADN genómico de NIH-3T3) sobre células NIH-3T3 (cuja sementeira se efectuou no dia anterior, a 5 x 10^ células por 60 mm de recipiente de cultura). Incubaram-se as células com o ADN precipitado durante 6 horas, a 37°C. Removeu-se o ADN precipitado e adicionou-se aos recipientes meio recente (DMEM, Nu-Serunr a 5%) (Collaborative Research, Inc., Lexington, Massachussets). Submeteram-se as células à acção da tripsina 16 horas depois e efectuou-se a sua sementeira em três recipientes de 100 mm e conservaram-se no meio referido antes. Dentro de 12-14 dias surgiram os focos (aproximadamente 50 por recipiente). Selec

cionaram-se onze dos focos transformados, expandiram-se e depois efectuou-se a sua sementeira a 5 x 10⁵ células por 100 mm de recipiente para selecção no meio anterior acrescido de 500 ^ig/ml de GENETICIl·^ G418 (Gibco Laboratories, Grand Island, New York). Os 11 clones sobreviveram todos à selecção por G418 ( 500 pg/ml ) e efectuou-se o seu rastreio para os níveis, de H-ras (p21) por análise normalizada de imunomarcação de proteína.

Ensaiaram-se para se verificar a expressão de sT4 , os clones que expressaram os níveis mais elevados de p21 (aproximadamente 2 ng de p21/pg de proteína solúvel Triton). Incubaram-se as culturas confluentes durante 18 horas com metionina marcada com S e cisteína. Imunoprecipitaram-se os sobrenadantes de cultura e os lisados celulares com anticorpos monoclonais específicos para os receptores T4 (OKT4, OKT4A) e T8 (OKT8), anticorpos policlonais específicos para proteínas ras ou IgG não específica do rato. Precipitou-se espeeificamente, a partir do meio de cultura por ambos os anticorpos monoclonais dirigidos contra o receptor T4, uma proteína de cerca de 45 Kd, o tamanho previsível de sT4. Não se observou a banda de sT4 nos lisados de células. Conforme se esperava, precipitou-se p21 a partir da célula mas não a partir dos sobrenadantes de cultura. A quantificação subsequente demonstrou que, quando comparadas com sT4, estas células produzem níveis relativamente baixos de sT4, isto é, aproximadamente 100 vezes mais baixos do que com as células CHO, consoante se descreveu no Exemplo 2B.

Expressão de psT4DHFR nas Células de Ovário do Hamster Chinês (CHD)

Efectuou-se a transfecção de células DXB-11 ,

uma linha de células CHO com deficiência de DHFR (104), por precipitação com fosfato de cálcio, com 10 a 30 jig de psT4DHFR na presença de 10 pg de ADN de transporte (ADN genómico de NIH-3T3), um dia após a sementeira de recipientes de cultura de 60 mm com 5 x 10⁵ células. Incubaram-se as células com o ADN precipitado, durante 6 horas a 37°C, removeu-se o meio e adicionaram-se aos recipientes meio fresco (F12, FBS a 10%, 100 unidades/ml de penicilina e de estreptomicina). Decorridas 16 horas, mudou-se novamente o meio e incubaram-se as células durante mais 24 horas. Depois, submeteram-se as células à acção da tripsina, efectuou-se a sua sementeira em três recipientes de cultura de 100 mm e seleccionaram-se em meio isento de nucleósidos (F-12 sem hipoxantina e timidina, FBS dialisado a 10% e 100 unidades/ml de penicilina e de estreptomicina). As colónias (aproximadamente 100 por recipiente) surgiram ao fim de 7 a 10 dias. Reuniram-se as colónias de cada recipiente, expandiram-se e, depois, efectuou-se a sua sementeira a 5 x 10³ células e a 5 x 10⁴ células por cavidade em placas de 24 cavidades, ou a 5 x 10³ células por recipiente de 100 mm. Deixaram-se as células em repouso durante 3 dias antes de se iniciar a selecção em meio isento de nucleósidos contendo metotrexato 20 nM (mtx). Ensaiaram-se os clones ou cavidades individuais de conferência para a expressão de sT4 e, aqueles que se seleccionaram para amplificação posterior, semearam-se em placas de cultura de 24 cavidades às densidades anteriormente referidas. A selecção com mtx 800 nM em meio isento de nucleósidos teve início 3 dias após a sementeira. Repetiu-se este procedimento de selecção para as selecções com mtx 8 e com mtx 80 . Derivaram-se, utilizando

este método, diversas linhas de células, que expressam T4 solúvel, a um mínimo de 3 pg/célula/24 horas.

Purificação de sT4: Preparou-se meio condicionado (CM), isento de soro, a partir das culturas de células aderentes que se expandiram em balões cilíndricos de 850 cm sob condições de selecção com mtx. Na confluência, lavaram-se as células duas vezes com solução salina tamponizada com fosfato (PBS) sem + 2 +

Mg e Ca e substituiu-se o meio de crescimento (Ham's

F12 sem hipoxantina e timidina, soro de feto de bovino a 10%, 100 unidades/ml de penicilina e de estreptomicina e mtx a uma concentração selectiva) com o mesmo meio isento de soro e mtx e mais 1 x ITS (insulina, transferrina e selénio (Collaborative Research Inc.). Decorridas 24-48 horas, removeu-se o meio e substituiu-se com meio de crescimento selectivo. Voltou a aplicar-se o meio isento de soro durante 3 a 5 dias e repetiu-se indefinidamente este ciclo, isto é, durante mais de dois meses.

Clarificou-se o CM por centrifugação a 8 000 x x g. Adicionou-se um inibidor da protease PMSF (fluoreto de fenilmeti1-sulfoni1o) 0,5 mM e concentrou-se cerca de 10 vezes o meio por filtração em membrana de pressão. Clarificou-se este CM concentrado por centrifugação a 2 000 x g e adicionou-se Aprotinina, um inibidor da protease (Sigma Chemical, ST. Louis , Missouri) a uma concentração final de 5 pg/ml. Processou-se directamente a amostra ou após armazenamento a -70°C.

Diluiu-se duas vezes a amostra de CM concentrado, com MES [ácido 2-(N-morfolino)-etano-sulfónico], 50 mM, a pH 6,0 e filtrou-se através de um filtro de 45 micron. De- 97 pois, tratou-se a amostra com pAPMSF (fluoreto de p-amidino-feni1-meti1-sulfonilo ) (CalBiochem-Behring, San Diego, California) 100 aM e aplicou-se a uma coluna de S-Sepharose^ (Sulfo-propilo) (Pharmacia P-L Biochemicals , Piscataway, New Jersey) equilibrada em MES 50 mM, a pH 6,0 a uma concentração proteica de 1,5-2,0 mg/ml de gel. Eluiu-se a amostra utilizando um gradiente linear de NaCl 0-0,5 M em MES 50 mM, a pH 6,0. As fracções de pico que se eluiram a aproximadamente, NaCl 0,2 M, agregaram-se e trataram-se com pAPMSF 100 jiM. Confirmaram-se as fracções que continham sT4 por ensaios imunológicos de manchas e SDS-PAGE. Após ter permanecido a 4°C, durante uma hora, efectuou-se a diálise da amostra contra Bis-Tris propano 50 mM [1,3 - bis(Tris-(hidroximeti1)-metilamino]-propano], a pH 6,0.

Tratou-se a amostra com pAPMSF 100 pM e tiodiglicol a 0,1%, a pH 9,0 e, depois, eplicou-se a uma coluna (r) de Q-Sepharose (etilamino quaternário) (Pharmacia) (5 ml de amostra/ml de gel) equilibrada com Bis-Tris-propano (BTP),

0 mM a pH 9,0.

amostra de sT4 não se liga à Q-Sepharos e recupera-se na fracção não ligada e na lavagem da coluna.

Ajustou-se	imediatamente a fracção que não se ligou para
pH 6,0.	0 passo final foi a cromatografia numa coluna
(2,5x46 cm)	de Superosí^l2 de 30 micron equilibrada com fos-

fato 50 mM, NaCl 0,15 M a pH 7,0. Processou-se a coluna a um débito de 3,0 ml/minuto. Efectuaram-se injecções de 10 ml e o pico aos 42 minutos foi recolhido sob a forma de lote. O processo produziu aproximadamente 1 mg de produto por 20,0 mg de proteína total para uma linha de células que produzem pg/cé1ula/dia , aproximadamente.

Características de sT4

P£22£Í6âades_FÍsicas: Determinou-se a concentração da proteína total utilizando o ensaio colorimétrico de proteína BCA (Bicinchoninic Acid , Pierce chemical Co., Rockford, Illionis). Determinou-se a concentração absoluta por análise de aminoácidos quantitativa. Efectuou-se a determinação da composição de aminoácidos da sT4 purificada utilizando técnicas de análise de aminoácidos normalizadas e descobriu-se que estava de acordo com a sequência prevista para a molcula com uma margem de erro experimental (+/- 15%). Ao longo dos primeiros 20 resíduos a sequência estava de acordo com o anteriormente previsto, excepto no facto de ter início em lis-lis-val-val---.

Assim, o terminal amino maduro tem início na posição +3 no que respeita ao sítio de ligação principal previsível e difere da sequência prevista naquela posição devido à alteração de uma asn para lis. A posição das extremidades amino maduras está em concordância com as extremidades das proteínas CD4 do rato e da cabra. A alteração de asn para lis, pode representar um erro de sequenciação (alteração de uma única base) ou uma mutação que ocorreu durante os procedimentos de recombinação.

Epítopes_Imunológicos: Os anticorpos monoclonais OKT4 e

OKT4A reconhecem os epítopes de superfície não intervenientes do receptor T4 (114). Estes epítopes são específicos da configuração primária pelo que não se ligariam a proteínas desnaturadas por SDS reduzidas em ensaios de manchas imunológicas. Demonstrou-se que ambos os anticorpos precipitavam es-

pecificamente sT4 a partir de sobrenadantes de cultura marcados com ³⁵S, utilizando os procedimentos de imunoprecipitação que se seguem:

Marcaram-se as culturas de células que produ6 zem sT4 , contendo 1x10 células por recipiente de cultura de mm, durante 16 horas a 37°C, em 1,5 ml de meio F12 isento

5 de metionina e cisteína e contendo ITS e 170 pCi/ml de [ Sj-metionina e 30 pCi/ml de [ ^{3 5}S ] -c isteí na (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Califórnia). Diluiu-se o meio clarificado (100 pl ) com um volume igual de tampão de precipitação (fosfato de sódio 10 mM, a pH 7,5, NaCl 100 mM, NP-4(^a 0,1%, leite em pó não gordo a 0,5%) e incubou-se com 3 pg de IgG de coelho durante 15 minutos a 4°C. Incubaram-se os sobrenadantes previamente clarificados com 5 pg de OKT4, OKT4A e OKT8 (uma oferta de P. Rao, Ortho Pharmaceutica1s Corp., Raritan, New Jersey), IgG do rato (Cooper Biomedical, Malvern, Pensilvânia), ou IgG do rato desenvolvida no coelho (Cooper Biomedical) durante 30 minutos a 4°C. Precipitou-se OKT4 , OKT4A, OKT8 , IgG do rato desenvolvida no coelho com 20 pl (volume da embalagem) de proteína A sefarose em gotas, durante 30 minutos a 4°C.

A seguir à precipitação, lavaram-se as gotas duas vezes com

200 pl de tampão de precipitação sem NP-4(P^e leite em pó não gordo. Ferveram-se as gotas lavadas durante 5 minutos em 20 pl de tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM, a pH 6,8, glicerol a 20%, -mercapto-etanol 1,4 M) e analisaram-se os sobrenadantes por electroforese sobre gel de poliacrilamida-SDS a 12,5%. Obtiveram-se resultados semelhantes com OKT4B, OKT4C, OKT4D, OKT4E, OKT4F e outros Mabs específicos para T4. Estes resultados sugerem que a configuração de sT4 imita perfeita

100 mente o domínio da superfície do receptor T4 .

Para se determinar se sT4 se pode associar a

HIV gpl20 e se essa associação pode inibir a ligação de HIV às células T4 , fez-se a absorção de aproximadamente 5 microgramas de sT4 purificada por gotas de Sepharose cobertas com

OKT4 ou com o anticorpo de controlo. Misturaram-se, depois,

5 as gotas com um lisado de HIV marcado com S-metionina.

O complexo de sT4 com OKT4 apenas precipitou conjuntamente a glicoproteína de invólucro de 120 Kd. Não se precipitaram proteínas virais por intermédio das gotas de OKT4 na ausência de sT4 ou na presença de sobrenadantes de controlo a partir das células CHO não transfectadas. Para além disso, as proteínas virais não se precipitaram quando as gotas de Sepharose cobertas com imunoglobulina de controlo, de rato, (isotipo correspondente a OKT4 ) se incubaram com sT4. Estes estudos indicam que a sT4 obtida, que se encontra livre dos outros componentes da superfície celular na superfície dos linfócitos T, é capaz de se associar espeeificamente com a glicoproteína de invólucro do vírus da SIDA.

Efectuou-se a citof1uorornetria para demonstrar que a interaeção de T4 com gpl20 de HIV intacto abole a ligação do vírus da SIDA à superfície das células T4⁺. Expuseram-se células CEM T4⁺ a HIV, na presença ou na ausência de sT4. A seguir à absorção virai, lavaram-se as células, expuseram-se ao anticorpo anti-HIV conjugado com fluoresceína e analisaram-se por citofluorometria de fluxo (Figura 17) (48). Na ausência de sT4, HIV liga-se eficazmente às células CEM,T4⁺. Se se incubar previamente HIV com sT4, a ligação do vírus às células T4⁺ é abolida (Figura 17). Dez nanogramas

101 de sT4 purificada são suficientes para inibir a ligação de 100 nanogramas de proteína virai. Se o invólucro glicoproteico compreende 5% da proteína total do vírus, uma proporção molar estimada em 5:1 de T4 para gpl20 é capaz de inibir completamente a ligação de HIV às células T4⁺.

Também se estudou a capacidade de sT4 para inibir a infecção das células T4” pelo HIV. Expuseram-se linfócitos humanos estimulados por fitohemaglutinina a diluições em série de 10 vezes de um inoculo de HIV na presença ou ausência de sT4, lavaram-se e colocaram-se em microcultura. Determinou-se a frequência das culturas infectadas utilizando um ensaio imunológico 4, 8 e 12 dias após a exposição ao vírus (47).

Neste procedimento, o título do vírus infeccioso, ID-50, definiu-se como o inverso da diluição necessária para infectar 50% das culturas celulares expostas, no 12o dia. Na ausência de sT4, o ID-50 observado com o inoculo do vírus foi de 10⁵, aproximadamente. Contudo, na presença de 8 microgramas/ml de T4 solúvel purificada, o grau de infecção diminuiu cerca de 4 unidades logarítmicas para um ID-50 de 10^'^ (Figura 18). Esta redução dramática no grau de infecção de HIV observou-se ao longo do curso da infecção. Como um controlo da inibição não específica ou de efeitos tóxicos de sT4, adicionou-se sT4 às culturas 18 horas após a infecção apresentar uma inibição de 1 unidade logarítmica no ID-50 que resulta, provavelmente da inibição da dispersão do vírus a seguir à inoculação inicial. Assim, a redução de 4 unidades logarítmicas no grau de infecção do vírus que se observa quando o vírus se incuba previamente com sT4 resulta, provavelmente, da associação específica de sT4 com gpl20 na superfície do vírus. No entanto,

102 estas partículas são capazes de interferir, passado pouco tempo com o receptor T4 na superfície celular. Observou-se uma inibição de quatro unidades logarítmicas quando se incubaram previamente 10^ partículas infecciosas/ml com 8 microgramas/ml de sT4. Estimou-se que as preparações de vírus de 10^ partícu~ g las infecciosas/ml, contem 10 partículas/ml. Se cada partícula contiver 1 000 glicoproteínas de invólucro, então, a inibição obtém-se a uma proporção de 100 moléculas de T4/molécula de proteína de invólucro.

A disponibilidade ou as quantidades relativamente grandes de sT4 estruturalmente intacta facilitam o estudo do mecanismo da interacção de T4 com a superfície das células que apresentam antigenes assim como com o vírus HIV. A especificidade de interacção das células auxiliares T4⁺ com as células que apresenam antigenes (células B e macrófagos), pode resultar, pelo menos, em parte, da associação de T4 com moléculas MHC da classe II (105, 106). A disponibilidade de quantidades significativas de sT4 purificada, permite uma demonstração directa de uma associação física entre T4 e as moléculas MHC da classe II.

A capacidade de sT4 para se ligar a gpl20 e inibir a infecção virai, in vitro, indica que sT4 é um agente anti-viral eficaz para o tratamento dos pacientes com SIDA. Exemplo 4: Produção dos_Fragmentos SolúveisVIV 2J4 e T-4

Construção de_Vectores

Construção de psT4BBVIDHFR: Para criar o plasmídeo pST4BBVI DHFR, cortou-se o plasmídeo psT4DHFR (descrito no Exemplo 3) com

EcoRI e Xbal e suprimiu-se o fragmento mais pequeno que con103 tinha a região codificante de sT-4. Cortou-se o plasmídeo sT4sal com Xbal e Bbvl e isolou-se um fragmento de 1120 pb, codificante, contendo a sequência para o fragmento de T4 solúvel com excepção da região principal. Ligou-se este fragmento ao fragmento pST4DHFR cortado com EcoRI/Xbal, utilizando um ligante de síntese com uma extremidade EcoRI , um sítio Kpnl e uma extremidade Bbvl. Este fragmento é compatível com a extremidade coesiva Bbvl do fragmento sT-4 isolado antes. O plasmídeo resultante designou-se por pST4BBVIDHFR.

Construção de OMPAST4: Para originar o plasmídeo OMPAST4, efectuou-se a digestão do plasmídeo OMPA.GS com Ncol e Sall e, suprimiu-se o fragmento mais pequeno que continha a região ligante. O plasmídeo OMPA.GS é um derivado de pASI (Rosenberg et al., Meth. Enzymol^ 101 123 (1983); patente de invenção norte-americana N« 4 578 355), que possui uma sequência de síntese inserida no sítio Ndel na extremidade 3' da sequência de lic^ção ao ribossoma cil. A sequência de síntese compreende a sequência principal de OMPA, seguida de uma sequência de revestimento múltiplo. A sequência de síntese é, essencialmente, conforme se segue:

5' -T ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG

GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGC TCT AGA GTC GAC CTA GTT AAC TAG-3'

Cortou-se o plasmídeo pUCsT4 com Ncol e Sall e isolou-se o fragmento de 1149 pares de bases que continha a sequência de SCD-4 (nucleótidos 124-1257 de T-4). Ligou-se este fragmento ao OMPA.GS. cortado com Ncol/Sall para criar

104

OMPAST4.

Construção de OMPAST4BbVI: Para se criar o plasmídeo OMPAST4BbvI cortou-se o plasmídeo OMPAST4 com Ndel e X al. Suprimiu-se o fragmento mais pequeno, que resultou deste corte e que continha a região que codifica sT-4. Cortou-se o plasmídeo ST4BBVIDHPR com Kpnl e nivelou-se a extremidade coesiva 3' com ADN polimerase de T4. Cortou-se o ADN nivelado nas extremidades, com X al, e isolou-se o fragmento de 1124 pares de bases, contendo os nucleótidos 145-1257 de cADN de CT4. Ligou-se o fragmento isolado ao plasmídeo OMPAST4 cortado com Nael/Xbal para criar o plasmídeo OMPASTI4BbVI.

Construção de pucGT4184: Para se originar o plasmídeo pucST4184 ligou-se um fragmento EcoRI-Nhel de cADN de T-4 (um fragmento de 682 pb que codifica os aminoácidos que se estendem da posição -23 à +178) a um ligante de síntese SK727/725 (extremidades Nhel e Aval) no sítio Nhel. O ligante sK 727/725 codifica os aminoácidos 179-1 85) . Ligou-se a extremidade Aval de sK727/72 5 a um fragmento Aval-Xba depUCST4 (que compreende os pares de bases de 1198 a 1257 do cADN humano e que codifica os aminoácidos 351-369 do receptor de T4, seguido de um codão de terminus TAA). Inseriu-se esta sequência que se encontra flanqueada por extremidades EcoRI e Xbal, no plasmídeo pUC19 nas extremidades EcoRI e XabI da região de ligação múltipla de puC19 (sK727/725). O ligante SK727/725 é, essencialmente, como se segue:

5'gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac 3' »

gtcttcctcctccacgtta³cgatcacaagcctaactgacggttgagc 5'

105

Construção de pucST4106: Para se originar o plasmídeo pucST-4106, uniu-se um fragmento EcoRI-AvalI (que compreende os pares de bases 1-413 e que codifica os aminoácidos (-) 25-87) de cADN de T4 com o ligante de síntese sk791/792 (extremidades Avall-Aval) no sítio Avall. 0 ligante SK791-792 codifica os aminoácidos 88-104 de T-4 . Ligou-se a extremidade Aval de SK791/792 a um fragmento Aval-Xbal de pucST4 (que compreende os pares de bases desde 1198 a 1257 do cADN humano e que codificam os aminoácidos 351-369 do receptor de T-4, seguido de um codão de terminus (TAA). Inseriu-se esta sequência flanqueada pelas extremidades EcoRI e Xbal no pUC19 nas extremidades EcoRI e Xbal da região de ligação múltipla de puC19.

O ligante sK791/792 é, essencialmente, conforme se segue:

5' gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5'

Construção de_sT4184 DHFR: Para criar o plasmídeo ST4184.DHFR, ligou-se um fragmento EcoRI-Xbal de pucST4184 (que codifica os aminoácidos desde -25 a 183 fundidos com os aminoácidos desde 355 a 373) com as extremidades EcoRI e Xbal de psT4DHFR em vez do fragmento EcoRI-Xbal que codifica sT-4 .

Construção de ST4106DHFR: Para se criar o plasmídeo ST4106.DHFR, ligou-se um fragmento EcoRI-Xbal de pucST4106 (que codifica os aminoácidos desde -23 a 106 fundidos com os aminoácidos desde 351 a 369), nas extremidades EcoRI e Xbal do psT4DHFR em vez do fragmento EcoRI-Xbal que codifica sT-4 .

106

Expressão de pST4184DHFR nas Células do Ovário do Hamster Chi nês (CHO):

Efectuou-se a transfecção de células DXB-11, uma linha de células CHO que não possui DHFR (Urlaub et al., supra), por precipitação com fosfato de cálcio, com 10 a 30 pg de pST-4184DHFR na presença de 10 pg de ADN de transporte (ADN genómico de NIH-3T3), um dia após ter-se efectuado a sementei5 ra de recipientes de cultura de 60 mm com 5 x 10 células.

Removeram-se os precipitados, decorridas 6 horas e substituiu-se por meio F12 sem hipoxantina ou timidina, que continha soro de feto de bovino dialisado a 10%. Deccoridos 16 dias surgiram as colónias (aproximadamente 100 por recipiente). Reuniram-se as colónias de cada recipiente, expandiram-se e depois, efectuou-se a sua sementeira a 3 x 10 células por cavidade em placas de cultura de 24 cavidades. Desenvolveram-se estas células em meio isento de nucleósidos que continha metotrexato (mtx) 80 nM para se seleccionar a potencial amplificação de dhfr transfectado e do mini-gene V1V2J4 . Após duas semanas em mtx 8 nM, as células que se desenvolveram activamente mostraram-se claramente visíveis. Ensaiaram-se cavidades ou clones individuais na confluência para se observar a expressão dos nutantes obtidos par s upressão e os que se seleccionaram para subsequente amplificação foram semeados em placas de cultura de 24 cavidades à densidade anteriormente referida. Desenvolveram-se diversas sub-populações que expressam níveis elevados de V1V2J4 em níveis progressivamente crescentes de mtx, para se seleccionarem para amplificação posterior da unidade de transcrição de dhfr e do mini-gene T418s(V1V2J4).

Derivaram-se diversas linhas de células utili107 zando este método que expressa os mutantes de delecção em quan tidades de, pelo menos, cerca de 2 pg/célula/24 horas.

Preparou-se o meio condicionado (CM) isento de soro a partir de culturas de células aderentes que se expandiram em recipientes de vidro, cilíndricos, de 850 cm sob condições selectivas de mtx. Na confluência, lavaram-se as células duas vezes com solução salina de fosfato tampão (PBS) sem + 2 + . ,

Mg e Ca e substιtuiu-se o meio de crescimento (Ham's F12 sem hipoxantina nem timidina, soro de feto de bovino a 10%, 100 unidades/ml de penicilina e de estreptomicina e mtx a uma concentração selectiva), pelo mesmo meio sem soro nem mtx e com 1 x ITS (insulina, transferrina e selénio (Collaborative Research Inc.). Decorridas 24 a 48 horas, removeu-se o meio e substituiu-se por meio de crescimento selectivo. Voltou, então, a aplicar-se meio isento de soro dentro de 3 a 5 dias e repetiu-se este ciclo indefinidamente, isto é, durante mais de dois meses. Ciarificou-se o CM por centrifugação a 8 000 x g. Adicionou-se um inibidor de protease, PMSF (fluoreto de fenilmetil-sulfonilo) 0,5 mM e concentrou-se o CM cerca de dez vezes por intermédio de filtração através de membrana sob pressão. Clarificou-se este CM concentrado, por centrifugação a 2 000 x g, e adicionou-se Aprotinina, um inibidor de protease (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri até uma concentração final de 5 jig/ml . Processou-se a amostra directamente ou após o armazenamento a -70 C.

Análise de Mancha Western: Concentrou-se o meio condicionado a partir de células CHO que produzem V1V2J4 e verteu-se sobre um gel redutor de poliacrilamida a 15%. Transferiu-se a pro

108 teína para papel de nitrocelulose e efectuou-se a sua sondagem com anti-soros policlonais contra uma molécula de fusão de T-4-NSI derivada de E coli desnaturada. Estes anti-soros reconhecem, especificamente o dupleto V1V2J4 que migra a 25Kd, aproximadamente. Isto corresponde ao tamanho preconizado para a sequência que codifica V1V2J4 a seguir ao processamento prin cipal. Desconhece-se a base física do dupleto. Não parece provável que resulte das diferenças na glicosilação N-ligada, uma vez que as duas sequências de consenso em T-4 para esta glicosilação não se encontram presentes em V1V2J4.

Imuno-epítopes: Os anticorpos monoclonais OKT-4 e OKT-4A, OKT4B, OKT4C, OKT4E e OKT4F reconhecem espeeificarnente os epítopes de superfície no receptor primitivo ligado à membrana de T-4 [Rao et al·, Cell Immunol. 8 0 ·. 3 10 (1983)]. Estes anticorpos são específicos da configuração primitiva na qual eles não se ligariam à proteína reduzida, desnaturada por SDS, em ensaios de manchas imunológicas. Demonstrou-se que ambos os anticorpos precipitam espeeificamente V1V2J4 a partir

5 de sobrenadantes de cultura marcados com S utilizando o procedimento de imunoprecipitação que se segue.

Marcaram-se culturas de células produtoras de V1V2J4 que continham 1 x 10^ células por recipiente de cultura de 60 mm, durante 16 horas a 37°C em 1,5 ml de meio F12 isento de metionina e cisteína, contendo ITS e 170 pCi/ml de [ Sjmetionína e 30 pCi/ml de [ Sjcisteína (ICN Biomedicals, Inc., Costa mesa, CA). Diluiu-se o meio clarificado (100 jil ) em igual volume de tampão de precipitação de fosfato de sódio 10 mM, a pH 7,5 (NaCl 100 mM, NP-4(í^a 0,1%, leite em pó não

109

gordo a 0,5%) e incubou-se com 3 pg de IgG do coelho durante . o minutos a 4 C segumdo-se-lhe 30 pl volume embalado de gotas de Proteína A-Sepharose (Pharmacia P-L Biochemicals), durante 30 minutos a 4°C.

Incubaram-se os sobrenadantes previamente clarificados com 5 pg de cada um dos anticorpos OKT4 anteriormente referidos, IgG do rato (Cooper Biomedical, Malvern, PA), ou com IgG ck do rato desenvolvida no coelho (cooper Biomedical), durante 30 minutos a 4°C. Precipitaram-se os anticorpos OKT4 , IgG do rato e IgG o< do rato desenvolvida no coelho, incubando-os com 20 pl (volume embalado) de gotas de proteína A-Sepharose durante 30 minutos a 4°C. A seguir à precipitação, lavaram-se as gotas duas vezes com 200 pl de tampão de precipitação sem NP-4(0^ e leite em pó não gordo. Ferveram-se as gotas lavadas durante 5 minutos em tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM, a pH 6,8, glicerol a 20%, 'jb-mercaptoetanol 1,4 M) e ana1isaram-se os sobrenadantes por intermédio de electroforese sobre gel de poliacrilamida SDS a 12,5%. Com excepção de OKT, cada um dos anticorpos precipitou, especificamente , V1V2J4 a partir dos sobrenadantes de uma cultura marcada com

Competição da Ligação de HIV; O reconhecimento de V1V2J4 por OKT4 indicou que V1V2J4 poderia inibir a ligação dos vírus da SIDA às células que lhes eram susceptíveis. Utilizou-se CM que continha V1V2J4 nos ensaios iniciais. Incubou-se HIV com o CM e quantificou-se a ligação do vírus à linha de células CEM, T-4⁺, por incubação com um anticorpo anti-HIV conjugado com FITC e análise FACS (seleccionador celular activa-

110 do por ss upr a fluoresceína) , conforme descrito por McDougal et al . ,

CM da linha de células produtoras de V1V2J4 inibiu a ligação a HIV de um modo dependente da diluição,ao passo que não se observou qualquer resposta com CM das célu las (DXB-11) correspondentes não produtoras de V1V2J4.

A proteína V1J4 expressou-se de um modo semelhante nas células CHO. No entanto, nestas experiências preliminares, a proteína não foi, aparentemente, transportada para o meio. Com base noutros estudos que demonstram que V1J4 produzida noutros organismos recombinantes se liga a OKT4A, parece que V1J4 expressa em culturas de células de mamíferos inibiria a ligação de HIV.

Exemplo 5: Preparação de Anticorpos Anti-Fragmento Solúvel T4

Injectou-se intraperitonealmente ratos Bal/c, com oito semanas de idade, com 50 microgramas de um fragmento solúvel de T4 purificado, da presente invenção (preparado conforme anteriormente referido), em adjuvante completo de Freund, num volume de 1:1. Efectuaram-se, depois inoculações de reforço, a intervalos mensais, com o fragmento solúvel de T4 misturado com adjuvante incompleto de Freund extraiu-se o sangue através da veia da cauda. Separou-se a imunoglobulina dos soros por precipitação com sulfato de amónio e purificaram-se os anticorpos específicos anti-fragmento solúvel de T4, por cromatografia de afinidade, utilizando um fragmento de T4 imobilizado.

Exemplo 6: Preparação de_Anticorpos Idiotípicos Anti-Fragmento Solúvel T4

Injectaram-se intraperitonealmente ratos singe

111 nésicos e congenésicos , com 50 microgramas de um anticorpo anti-fragmento solúvel de T4 purificado, da presente invenção (preparado conforme anteriormente, em adjuvante completo de Freund e efectuaram-se mensalmente inoculações de reforço com o anticorpo anti-fragmento solúvel de T4 em adjuvante incompleto de Freund. Ao 4a, 3a _e 2a dias antes da fusão, inocularam-se os ratos com um reforço intravenoso de 50 microgramas de imunoglobulina em solução salina. Fundiram-se, então, as células do baço, com células de mieloma não secretoras, P3X36 AG8.653, de acordo com procedimentos que têm sido descritos e que são conhecidos na especialidade à qual pertence a presente invenção. Duas semanas mais tarde, efectuou-se o rastreio dos sobrenadantes de hibridoma no que respeita à actividade de ligação aos anticorpos anti-fragmento solúvel de T4,através de um radio-imunoensaio. Depois, ensaiaram-se os clones positivos quanto à sua capacidade para se ligarem à glicoproteína de invólucro do vírus da imunodeficiência humana e ao vírus da SIDA. De um modo alternativo, utilizando um procedimento de um só passo, injectaram-se intraperitonealmente os ratos com um fragmento solúvel de T4 em adjuvante completo de Freund, efectuou-se uma inoculação de reforço por via intravenosa com o fragmento solúvel de T4 em solução salina e fundiram-se as células do baço dos ratos com células de mieloma, conforme anteriormente referido. Ensaiaram-se, então, directamente os sobrenadantes de hibridoma no sentido de se detectarem os anticorpos idiotípicos anti-fragmento T4 solúvel.

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130-

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. - Processo para a preparação de um agente terapêutico susceptível de formar especificamente um complexo com glicoproteína de invólucro de vírus de imunodeficiência humana, caracterizado pelo facto de se desenvolver o sistema de vectores de hospedeiro sob condições adequadas que permitem a produção do agente terapêutico e de se recuperar o agente terapêutico assim produzido.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o agente terapêutico obtido compreender um polipeptídeo, cuja sequência de aminoácidos inclui a sequência