NO308311B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid som har evnen til spesifikt Õ danne et kompleks med humant immunsviktviruskappeprotein - Google Patents

Description

Foreliggende søknad er en CIP av US nr. 114.244, Inngitt 23. oktober, 1987, som er en CIP av US nr. 898.587, inngitt 21. august, 1986, og innholdet i disse er herved inkorporert som referanse i foreliggende søknad.

I denne søknaden er flere publikasjoner referert til ved arabiske tall i parenteser. Fullstendige siteringer av disse referansene finnes i slutten av beskrivelsen rett før kravene. Beskrivelsen av disse publikasjonene er i helhet inkorporert som referanse i foreliggende søknad for å mer fullstendig beskrive teknikkens stand.

De forskjellige funksjonelle klassene av T-lymfocytter gjenkjenner antigen på overflaten av distinkte populasjoner av målceller. Hjelper T-celler reagerer hovedsakelig med makrofager og B-celler; cytotoksiske T-celler reagerer med et større antall antigen-bærende målceller. Disse cellulære gjenkjenningshendelsene blir sannsynligvis formidlet ved en spesifikk assosiasjon av overflatemolekyler på både effektor-og målceller. Overflaten til T-cellene er kjennetegnet ved et antall polymorfe samt ikke-pplymorfe proteiner som stort sett er begrenset til T-lymfocytter. Til tross for at de fleste av disse molekylene er like i alle T-cellene er to klasser av overflateproteiner forskjellige på de forskjellige funksjonelle klassene av T-cellene, og disse proteinene er innbefattet til T-celle-målcelleinteraksjoner.

En klasse overflatemolekyler sjeldner de viktigste funksjonelle undergruppene av T-lymfocytter: overflateglyko-proteinene T4 og T8. Tidlig i tymus-utviklingen blir glyko-proteinene T4 og T8 uttrykt sammen på overflaten til tymo-cyttene (1). I det perifere immunsystemet blir T4 og T8 molekylene uttrykt på innbyrdes forskjellige undergrupper av T-celler og blir bare i enkelte tilfeller uttrykt på samme celle (2, 3). T4 molekylet blir uttrykt på T-celler som reagerer med målceller med klasse II hovedhistokompatibili-tetskompleks (MHC) molekyler, mens T8-bærende T-celler reagerer med målceller som uttrykker klasse I MHC proteiner (4, 5, 6, 7, 8, 9). T4 populasjonen av T-lymfocyttene inneholder hjelpeceller, mens T8 populasjonen inneholder hoveddelen av cytotoksiske celler og suppressorceller (6, 10). Cellene T4<+>T-celler kan derimot virke som cytotoksiske celler eller suppressorceller (6, 10), og dette tyder på at ekspresjon av T4 og T8 er mer stringent knyttet til MHC klassegjenkjenning enn med effektorfunksjonen. Betydningen av disse molekylene i T-celle-målcelleinteraksjoner kan demonstreres ved studier med monoklonale antistoffer. Antistoffer rettet mot spesifikke epitoper av T4 molekylet (eller den murine ekvivalenten L3T4) hemmer antigen-indusert T-celle-proliferasjon, lymfokin-frigjøring og hjelpecellefunksjon (7, 8, 11, 12, 13). På lignende måte hemmer monoklonale antistoffer rettet mot T8 (eller murin-ekvivalent Lyt2) cyto-toksisk T-celle-mediert dreping (14, 15). Disse observasjonene sammen med det faktum at T4 og T8 ikke viser signifikant polymorfisme, har ført til hypotesen om at T4 og T8 gjenkjenner ikke-polymorfe regioner av klasse II og klasse I molekylet, respektivt.

En annen klasse proteiner som antas å være forskjellige på forskjellige effektor T-celler er reseptorene som gjenkjenner antigen knyttet til polymorfe regioner til MHC-molekylene (16, 17, 18). Interaksjonene til hjelper T lymfocyttene er stort sett begrenset til antigen-bærende målceller som uttrykker klasse II MHC proteiner, mens cytotoksiske og suppressor T-celler er begrenset til målceller som bærer klasse I ,MHC molekyler (4, 5, 6, 7, 8, 9). Disse spesifikke interaksjonene kan bli formidlet av T-celle reseptoren (eller reseptorer) som gjenkjenner antigen i sammenheng med spesifikke MHC molekyler (17, 18). T-lymfocyttene kan dermed ha to uavhengige reseptorer som kan gjenkjenne både konstante og polymorfe determinanter til MHC proteinene, og disse reseptorene kan være ansvarlige for å være spesifikke mål for funksjonelt distinkte populasjoner av T-celler.

Humant ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) er kjennetegnet ved en reduksjon av T4<+>lymfocytter. En konsekvens av dette er at T-celle-formidlet immunitet er svekket i AIDS-pasienter som resulterer i oppståelse av alvorlige opportunistiske infek-sjoner og uvanlige neoplasmaer. AIDS-resultatene fra infeksjon av T-lymfocytter med en samling nært beslektede retro-viruser (LAV, HTLV-III, eller ARV), nå betegnet human immunsviktvirus (HIV). Området for infektivitet som disse midlene har er begrenset til celler som uttrykker T4 glykoprotein på overflatene deres.

T4 glykoprotein kan dermed virke ikke bare som en reseptor for molekylene på overflaten til målcellene, men også som en reseptor for AIDS-virus. Monoklonale antistoffer rettet mot T4 blokkerer AIDS-virus infeksjon av T4<+>celler in vitro. Senere studier har demonstrert at når T4<+>T-lymfocytter blir utsatt for AIDS-virus er kappeglykoproteinet til viruset på 110 kd assosiert med T4-molekylet på vertcellen. Det lymfo-tropiske kjennetegnet til viruset kan derfor forklares ved den hemmede ekspresjonen av dets reseptor, T4, i subpopulasjoner av T-lymfocytter.

Reduksjonen av T4<+>T-lymfocytter i AIDS resulterer i forringelse av den cellulære immun-responsen. I tillegg fører AIDS ofte til feil ved sentralnervesystemet (CNS), som ofte er en konsekvens av subakutt hjernebetennelse. AIDS-virus RNA og DNA er blitt identifisert i påvirkede hjerner og virus er blitt isolert fra både hjerne og spinalvæske fra pasienter med neurologiske forstyrrelser. Disse observasjoner tyder på at AIDS-viruset infiserer hjerneceller og er direkte ansvarlige for CNS-skadene observert i AIDS-pasientene. AIDS-viruset kan dermed være både neurotroft og lymfotroft. Det er derfor viktig å bestemme om T4 også blir uttrykt i CNS eller om ytterligere hjernespesifikke overflatemolekyler kan virke som en reseptor for AIDS-viruset.

Bestemmingen av de spesifikke interaksjonene til T4 og T8 ville bli gjort lettere ved isolasjon av T4 og T8 genene, bestemming av deres struktur og muligheten av å introdusere dem inn i forskjellige cellulære miljø. Isoleringen og sekvensen til et cDNA kodende T8-molekyl er nylig blitt rapportert (19, 20, 21). Den utledede proteinsekvensen tyder på at T8 er et membran-bundet glykoprotein med en N-terminal domene med homologi til den variable regionen av lette immunoglobulinkjeder.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori polypeptidet omfatter et polypeptid som har aminosyresekvensen vist på sidene 19-20, fra omtrent +1 til omtrent +104 koblet til et andre polypeptid som har aminosyresekvensen fra omtrent +349 til +367, kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsviktvirus kappe glykoprotein, hvori polypeptidet omfattende aminosyresekvensen vist på sidene 19-20 fra omtrent +1 til omtrent +104, kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 19-20 fra omtrent +1 til omtrent +104 koblet til et andre polypeptid forutsatt at det andre polypeptid ikke har sekvensen fra +105 til +369, kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 19-20 fra omtrent +1 til omtrent +104 og et andre polypeptid, hvori det andre polypeptidet er et antigen, kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein med evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 19-20 fra omtrent +1 til omtrent +104 og et andre polypeptid, hvor det andre polypeptidet er et bærerprotein, kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og tranlasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 19-20 fra omtrent +1 til omtrent +104 og et andre polypeptid, hvori det andre polypeptidet er et annet ST4 polypeptid, kjennetegnet ved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1. Cytofluorografiske mønstre av indirekte immuno-fluorescensfarging med 0KT^ 4 og 0KT^8

Cellene (5 x 10^) ble inkubert med musemonoklonale antistoffer 0KT<#>4B eller 0KT<#>8, vasket og deretter inkubert med FITC konjugert geit anti-mus immunoglobulin. Cellene ble analysert på en FACS IV celle-sorterer og plottet av en VAX 11/780 computer som celleantall som funksjon av log-fluorescens. Utransformerte NIH 3T3 celler og L-celler har identiske cytofluorografiske spor. Fro 2.2 er en leukemisk T-cellelinje med phenotype T3~; T4<+>; T8<+>; T11<+.>LTD-4 er en T4<+>primær L-celle transformant tilveiebragt etter overføring av totalt genomisk DNA. 3A+ er en NIH 3T3 cellelinje som ble transformert med T4-pMV6tk/neo retroviral ekspresjonskon-struksjon.

Figur 2. Northern Blot analyse av RNA isolert fra T4± og T4— L- celler og humane celler

Tre mikrogram poly(A)<+>RNA eller 12 ug totalt RNA (perifere T-celler og thymocytter) ble elektroforetisk kjørt gjennom en 0, 8% agarose-formaldehydgel og blottet på GeneScreen (New England Nuclear), og probet med et<32>P-merket 0,6 kb T4 cDNA- innskudd. T4<+>cellene omfatter LTD-4 (T4<+>, T8~ L-celle transformant), SK-7 T-celle hybridom (T4<+>, T8"), OT-CLL leukemi (T4<+>, T8_), Fro 2,2 leukemi (T4<+>, T8"), T4- anrikede perifere T-lymfocytter og humane thymocytter. T4~ cellene omfatter utransformerte celler, tk7 (T8<+>L-celle transformant), HeLa-celler, humane neuroblastom-celler (IME) og T8- anrikede perifere T-lymfocytter. Den humane thymocytt-kolonnen ble utsatt fire timer lenger og fotografert på høykontrastfilm.

Figur 3. Restriks. ions- kart av pT4B og T4- genet. sekvensstrategi og rekombinante vektorer

A. Oppstilling av Barn HI restriksjonsfragmentene til pT4B cDNA og T4-genet. Rekkefølgen til Barn HI fragmentene i T4-genet ble bestemt ved Southern Blot analyse og genomlsk klonkartlegging. Oppstilling av 5' ende til pT4B og T4-genet er vist ved de stiplede linjene og den skraverte region i pT4B korresponderer med den kodende sekvensen. De angitte størrelsene er i kilobaser.

B. Sekvensstrategi. Pilene angir lengden til sekvensen bestemt ved subkloning av fragmentene inn i Ml3 og sekvensering ved dideoksy-termineringsprosedyren (36). C. Eukaryote ekpresjonsvektorer. Disse konstruksjonene inneholder to Moloney murin leukemi-virus lange terminale gjentagelser (LTRs) hvor orienteringene er angitt med piler. pT4B cDNA ble subklonet inn i Eco RI setet til hver vektor i angitt orientering. (a) T4-pVcos7 konstruksjon. (b) T4—pMV6tk/neo konstruksjonen inneholder neomycin fosfo-transferasegenet koblet til HSV thymidin kinasepromoteren.

Figur 4. Southern Blot analyse av DNA fra utransformerte og T4^ L- celler og T. B og ikke- lymfoide humane celler

Ti mikrogram cellulært DNA ble kuttet med Bam HI, kjørt ved elektroforese gjennom en 0,8$ agarosegel, blottet på GeneScreen og probet med en nick-translatert pT4B cDNA innskudd. De angitte størrelsesmarkørene er i kilobaser. Hybridiserende bånd med størrelser på 20 kb, 6,6 kb, 4 kb, 1,8 kb og 1 kb fremkommer i alle humane DNA. DNA fra T4~, ikke-lymfoid opprinnelse omfatter utransformerte L-celler, humane fibroblaster (GM), humane neuroblastom-celler (NB) og HeLa celler. CB, CP58 og CP94 er DNA isolert fra EBV-transformerte humane B-cellelinjer. LTD-4 er T4<+>primær L-celle transformant. RPMI og HSB2 er T4" humane T-celle leukemiske linjer; E<+>cellene og thymocyttene (Thym.) inneholder T4<+>T-celler. OT-CLL, Jurkat (Jurk.), Fro 2,2, CEM og Molt 4 er T4<+>T-celler. g\M4 er en genomisk klon som inneholder sekvensene omfattende 3' end til T4-genet.

Figur 5. Immunpresipitasjon av T4 glykoproteinet fra NIH 3T3 cellene transformert med de retrovirale ekspresjonskonstruk-s. i onene L-[<35>S]-metionin-merkede proteiner fra to uavhengige NIH 3T3 transformanter, perifere T-lymfocytter og utransformerte 3T3 celler ble utsatt for linselektin-kromatografi for å anrike for glykoproteiner. 2,5 x 10^ cpm av hver prøve ble pre-klarert og deretter immunopresipitert med 0KT<*>4 monoklonale antistoffer og Protein A-Sepharose. Kulene ble vasket, løst opp i prøvebuffer og kjørt ved elektroforese gjennom en 10$ SDS-polyakrylamid-gel under reduserende (kolonnene a-d) og ikke-reduserende (kolonnene e og f) betingelser. Kolonne a angir utransformerte NIH 3T3 celler. Kolonne b angir T4C2, en NIH 3T3 celle transformert med T4-pVcos7 konstruksjonen. Kolonne c og e angir 3A+, en NIH 3T3 celle transformert med T4-pMV6tk/neo konstruksjon. Kolonnene d og f angir perifere humane T-lymfocytter. Relative molekylære masser (Mr) er angitt i kilodalton.

Figur 6. Nukleotidsekvensen til T4 cDNA og translatert sekvens til T4 proteinet

Nukleotidet og antatt aminosyresekvenser til cDNA klon pT4B tilveiebragt ifølge sekvenserings-strategien vist i figur 3B. Angitte tall aminosyresekvensen betegner aminosyreresidie- posisjonene. Alle ektracellulære cysteiner er merket med (•) eller (°). Ledersekvensen (L), variabel-lignende (V), koblings-lignende (J), transmembrane (TM) og cytoplasmiske (CYT) regioner er angitt med horisontale piler under sekvensen, til tross for at de nøyaktige grensene er flertydige. To potensielle N-bundne glykosyleringsseter (Asn-Leu-Thr) er også angitt (CHO).

Figur 7. In vitro translas. ion av RNA avledet fra SP6 transkripsjon

Full-lengde T4 cDNA innskudd ble subklonet inn i RNA ekspresjonsvektor pSP65 (Promega Biotec). Linearisert plasmid-DNA ble transkribert med SP6 polymerase (40) og RNA ble translatert i et hvetelinjesystem (Bethesda Research Laboratories) inneholdende L-[<35>S]-metionin. In vitro translasjonsproduktene ble utsatt for elektroforese gjennom en 10% SDS-polyakrylamidgel (kolonne T4). Bovint hjerne-vedheng RNA (BP) ble anvendt som en kontroll. Relative molekylære masser (Mr) er angitt i kilodalton.

Figur 8. Skjematisk diagram av T4 glykoprotein som dekker c e11ememb r ane t

T4 består av fire tandem VJ-lignende domener (V1<J>1-<V>4<J>4), et hydrofobt membran-dekkende segment (skravert område) og en belastet cytoplasmisk region (CYT). To potensielle N-bundne glykosyleringsseter i den ekstracellulære delen er angitt med ( ). Posisjonene til intronene 2-8 i T4 genet er også markert ( ).

Figur 9. Oppstilling av de variable, koblende og transmembrane regioner til T4 med medlemmer fra immunoglobulingen-familien

A. Oppstilling av den variable region aminosyresekvensen til T4 med et musekappe lettkjede-immunoglobulin J606 (66), T8 (20), en human T-celle antigenreseptor p-kjede YT35 (97) og en human T-celle ant igenreseptor a-kjede HPB-MLT oc(98). De invariante residiene i den variable lettkjederegionen er inkludert (Inv.) i oppstillingen. Oppstillingen ble utført for å maksimalisere identitetene og strukturelle homologier med T4 som fremgår som resider i boks. Linjene under sekvensen med bokstavene A, B, C, C, D, E, F og G angir residiene som danner p<->tråder (67). p-tråd G fortsetter inn i J-sekvensen.

B. Oppstilling av aminosyresekvensen til den koblende region (joining region) til T4 med konsensus J-sekvenser til T-celle antigenreseptor p-kjede, immunoglobulin lambda og kappa lettkjedene og J-sekvensen til den humane T-celle reseptor a-kjeden (99). C. Oppstilling av transmembrane regioner til T4 og en MHC klasse II p-kjede (100). Den putative transmembrane domenen (TM) er angitt under sekvensen.

Figur 10. Restriks. ions- kart av T4- genet i humant kromosomalt

DNA

Posisjonene til 9 exoner ble bestemt ved genomisk klonkartlegging, Southern blot analyse og nukleotid sekvensering. Ledersekvensen (L), variable-lignende (V), koblende-1ignende (J), transmembrane (TM) og cytoplasmiske (CYT) regioner er ført opp i bokser. Posisjonene til metionin-kodonet omgitt av initieringskonsensus-sekvensen er angitt (ATG) ved begynnelsen av ledereksonet (L); termineringskodonet TGA er vist i slutten av det andre cytoplasmiske exonet (CYT). De angitte størrelsene er i kilobase.

Figur 11. Rekombinante retrovirale ekspresjonsvektorer og konstruks. ion av transformerte celler

A. Rekombinante retrovirale ekspresjonsvektorer. pMV7 inneholder to direkte gjentatte Moloney murine sarcoma virus lange terminale gjentagelser (LTRer) i orientering angitt med piler. pMV7 inneholder også det bakterielle neomycin fosfor-transferasegenet (neo) koblet til HSV thymidinkinasepro-moteren (tk). Full-lengde cDNA innskudd som koder for T4 (T4B) (70) eller T8 (T8F1) (20) ble subklonet inn i Eco RI setet i samme orientering som angitt med piler, og dannet T4-pMV7 og T8-pMV7 respektivt. De kodende sekvensene er angitt som skraverte regioner. De angitte størrelsene er i kilobase.

B. Retrovirus-formidlet genoverføringsstrategi.

Figur 12. Effektivitet ved infeks. lon av naturlig- isolerte og transformerte T4± celler

Cellene ble inokulert med 10-ganger seriefortynninger av AIDS-virus, inkubert i 18 timer ved 37°C, vasket og sådd ut i mikrokultur. Frekvensen av infiserte kulturer ble bestemt ved en enzym-bundet immunoabsorberende analyse (ELISA) 12 dager etter infeksjon (46). Resultatene ble plottet som % positive kulturer som funksjon av log virus fortynning. Infeksiøs virustiter (ID-50) er definert som det resiproke av fortynningen hvorpå 50$ av kulturene er positive for virus (47). Naturlig isolerte T4<+>celler omfatter phytohemagglutinin (PHA)-stimulerte normale perifere lymfocytter (• •) og T-cellelinje CEM (O O). T4<+>transfekterte cellelinjer omfatter HSB2-T4<+>T-celler (A A) og Raji-T4<+>B-celler De T8<+>transfekterte cellelinjene HSB2-T8<+>og Raji-T8<+>(0 □) var kontroller i disse studiene.

Figur 13. Dannelse av Syncythia i T4± HeLa transformanter

A. 2 x 10<5>monolayer HeLa-T4<+>transformanter ble blandet med 2 x IO<4>AIDS virus-produserende H9 celler og inkubert ved 37° C. Inspeksjon av kulturene etter 18 timer viste at over 90$ av kjernene i monolayer-laget var innbefattet innenfor syncytia.

B. Anti-T4A monoklonalt antistoff (1:20) ble satt til de blandede kulturene ved et tidspunkt for såing. Inspeksjon av kulturene etter 18 timer viste et fullstendig fravær av cellefusjon.

Kulturene ble fotografert ved 160 x forstørring.

Figur 14. Flow Cytometri- analyse av AIDS virus binding til T4± transformerte celler

Kolonne A. Cellene (5 x IO<5>) ble inkubert med fluorescens-konjugert anti-T4A ( ) elller anti-T8 ( ) monoklonale antistoffer, vasket og analysert ved cytofluorometri.

Kolonne B. Cellene (5 x IO<5>) ble inkubert med buffer ( ) eller AIDS virus ( ), vasket, inkubert med fluorescens-konjugert anti-AIDS virus antistoff og analysert ved cytofluorometri.

Kolonne C. Cellene (5 x IO<5>) ble inkubert med buffer ( ) eller med anti-T4A monoklonalt antistoff etterfulgt av AIDS virus ( ) eller med anti-T8 monoklonalt antistoff etterfulgt av AIDS virus (-•-•-). Etter vask ble fluorescens-konjugert anti-AIDS virus antistoff tilsatt og cellene ble analysert ved cytofluorometri.

Fluorescens-histogrammet (celleantall som funksjon av fluorescens-intensitet) for hver cellelinje er oppstilt horisontalt.

Figur 15. Northern Blot- analyse av RNA isolert fra human og museh. ierne. lymfoide celler og myeloid- celler

A. Northern blot-analyse av humane RNA prøver. Et mikrogram poly(A)<+>RNA fra Raj i (T4_B-cellelinje), U937 (T4<+>monocyttisk cellelinje) og Jurkat (T4<+>T-cellelinje) og fem mikrogram poly(A)<+>RNA fra hjernebark ble kjørt elektroforetisk gjennom en 1$ agarose-formaldehydgel, blottet på Hybond (Amersham) og probet med et<32>P-merket T4 cDNA innskudd, pT4B (70).

B. Northern blot-analyse av mus RNA prøver. Fem mikrogram poly(A)<+>RNA fra 3T3 celler (fibroblast cellelinje), forhjerne og bakhjerne, og 20 mikrogram totalt RNA fra thymocytter ble kjørt med elektroforese gjennom en 1% agarose- formaldehydgel, overført på Hybond og probet med et<32>P-merket L3T4 cDNA innskudd, pL3T14B.

Figur 16. Plasmidkart av psT4DHFR

Plasmid psT4DHFR er et pUC18 derivat inneholdende bp 1-1257 av T4 cDNA klon pT4B som koder for leder og ekstracellulært segment til T4. Dette sT4 cDNA blir satt inn mellom en SV40 tidlig promoter og en syntetisk linker inneholdende et TAA termineringskodon (inset) etterfulgt av polyadenyleringsregionen til det bovine veksthormongenet. sT4 ekspresjonskassetten er bundet til en muse-hdfr-ekspresjonskassett bestående av p<->globinpromoter, muse dhfr kodende sekvens og SV40 polyadenyleringsregion.

Figur 17. Fluorescens- histQgram ( celleantall som funksjon av fluorescens- intensitet)

sT4 hemmer HIV binding til T4<+>CEM-celler. Celler ble inkubert med buffer ('-•-'-), HIV preinkubert med sT4 (« ) eller med HIV preinkubert med konsentrert kontrollsupernatant fra utransformerte DXB-11 celler ( ), vasket, utsatt for fluorescens-konjugert anti-HIV antistoff og analysert ved cytofluorometri. Et fluorescens-histogram (celleantall som funksjon av fluorescens-intensitet) er vist.

Figur 18. Hemming av HIV infektivitet ved sT4 Infektivitets-titrering av et HIV inoculum (ID-50 analyse) ble utført. 10-ganger seriefortynnninger av virusinoculum ble inkubert med indikatorceller (PHA-stimulerte humane lymfocytter) i 18 timer. Cellene blir deretter vasket og sådd ut i mikrokultur (1 x IO<5>celler pr. kultur, 10 kulturer pr. fortynning). På dag 4, 8 og 12 ble supernatantene undersøkt for HIV ved antigen oppfangingsanalysen. ID-50 titreringer ble utført i medier inneholdende 8,6 ug/ml sT4 som var tilsatt til HIV-fortynningen 30 minutter før inokuleringen av cellene og ble opprettholdt i kulturmediet gjennom hele eksperimentet ( ■ ). eller i medier inneholdende sT4 introdusert etter det opprinnelige 18 t inokulum ( o )

(forsinket addisjonskontroll) eller i medier uten sT4 (Cl )

(kontroll).

A. Plot av prosent av kulturer positive for HIV på dag 8 som

funksjon av fortynning av virusinokulum.

B. Plot av ID-50 (det resiproke av virusfortynning hvorpå 50$

av kulturene er positive) på dagene 4, 8 og 12.

C. Plot av prosent av kulturer som er positive for HIV på dag 8 som funksjon av varierende konsentrasjoner av sT4 ved anvendelse av en IO"<3>fortynning av HIV.

Karakterisering av de in vitro biologiske og immunologiske egenskapene til sT4 proteinet viser at proteinet har en verdi ved forhindring og behandling av AIDS. Studier viser at sT4 proteinet virker som en hemmer overfor ekstracellulære og celle til celle spredning av virus. På grunn av at sT4 er blitt vist å blokkere virusbinding til T4<+>målcellene i kultur antas det at administrasjon av sT4 til infiserte personer vil virke på en slik måte at det hemmer den ekstracellulære spredningen av viruset. sT4 er derfor av verdi både som et profylaktisk og terapeutisk middel for behandling av

AIDS.

Som et profylaktisk middel blir sT4 administrert til individer med høy risiko for sykdommen eller individer som viser utsetting for HIV ved tilstedeværelse av antistoffer mot viruset. Administrasjon av en effektiv mengde av sT4 ved et tidlig tidspunkt av sykdommen eller før begynnelsen derav virker på en slik måte at den hemmer infeksjon av T4<+>lymfocytter ved HIV. Som et terapeutisk middel virker administrasjon av sT4 til personer infisert med HIV på en slik måte at de hemmer ekstracellulær spredning av viruset.

Fusjon mellom HIV-infiserte celler og andre T4<+>lymfocytter ser også ut til å være en vei for spredning av virus. Fusjon kan delvis være ansvarlig for forringelse av T4<+>lyfocytt-funksjonen og dermed reduksjon av T4<+>lymfocytter i infiserte individer. Cellefusjon er avhengig av både virale kappegen-produkter og T4 reseptor og kan hemmes av 0KT4A eller lignende monoklonale antistoffer (Maber) (120). sT4 inter-fererer med cellefusjon og minsker derfor celle til celle spredning av viruset og tap av T4<+>lymfocyttfunksjon.

T4 reseptoren er monomorf og sT4 antas derfor å være en universal hemmer av virus som gjenkjenner overflatedomenen til T4 reseptoren, inkludert alle HIV.

sT4 kan bli anvendt i kombinasjon med andre midler, for eksempel, sammen med midler rettet mot andre HIV-proteiner, så som revers transkriptase, protease eller tat. Et effektivt terapeutisk middel mot HIV bør forhindre overføring av virus samt celle til celle overføring av infeksjon. sT4 kan også bli anvendt sammen med andre anti-virale midler, for eksempel azidothymidin (AZT).

sT4 proteinet har også anvendelse som en hemmer for T4<+>cellefunksjon. Mange studier foreslår at en kritisk rolle for CD4-reseptoren (CD4 utgjør generelt terminologi for human T4 reseptor og tilsvarende i andre pattedyrceller) i immun toleranse, spesielt ved patogenesen og progresjonen av autoimmune sykdommer og ved vertsspesifikk transplantatavvis-ning. Av spesiell relevanse til sT4 er observasjonene med anti-CD4 Maber. Gjennom deres assosiasjon med CD4-reseptoren forbedrer visse av disse Maber autoimmune responser og transplantasjonsavstøtning. Eksempler på slik virkning omfatter hemming av T-cellefunksjon in vitro. for eksempel, antigen-indusert proliferasjon, lymfokin-utskilling og hjelpecellefunksjon ved visse anti-CD4 Maber; behandling av systemisk lupus erythematosus ved administrasjon av anti-CD4 Maber for å hemme forløpet av murine lupus; og trans-plantasjonsstudier i mus hvori en enkelt dose av murine Mab

rettet mot murine CD4 reseptor resulterer i akseptering av alloltransplantatet.

Den molekylære konsekvensen av bindingen av Mab til CD4 er uklar. Maber kan blokkere assosiasjon av CD4 med dets ligand, idet liganden antakeligvis er en konservert epitope på MHC klasse II antigener (121, 122). Men iallefall noen av disse samme Maber hemmer CD4 celleaktivering ved en tilsynelatende klasse II uavhengig vei.

sT4 antas også å hemme T-celleinteraksjoner som en konkurrent til cellulært T4, kanskje ved binding til ekstracellulære målmolekyler som normalt reagerer med overflatedomenen til T4 reseptor. Denne forskjellen mellom Maber og sT4 kan ha viktige funksjonelle konsekvenser. For eksempel, mens noen Maber rettet mot T4 utøver en respons på T4 celler kan sT4 utøve en respons på celler som uttrykker MHC klasse II antigen. Affiniteten til T4 for dets antatte klasse II ligand ser ut til å være meget lav sammenlignet med de høye affinitetene til Maber rettet mot T4. Dermed, til tross for at Maber og sT4 kan interferere med samme prosesser ville de påvirke forskjellige målmolekyler og forskjellige målceller.

Som et profylaktisk middel eller terapeutisk middel blir sT4 administrert parenteralt, fortrinnsvis intravenøst. Middelet kan bli administrert ved infusjon eller ved injeksjon, f.eks., daglig, hver uke eller hver måned. Mengden og hastighet av sT4 administrasjon blir valgt slik at en effektiv mengde sT4 blir opprettholdt i sirkulasjon. En alternativ måte for administrasjon er ekstrakorporal, ved anvendelse av sT4 som et dialysemiddel.

sT4-proteinet kan også anvendes som et middel for å identifisere naturlige, syntetiske eller rekombinante molekyler som virker som terapeutiske midler eller hemmere av T4<+>cellein-teraksj oner.

sT4-proteinet kan for eksempel anvendes i screenings-analyser, så som analyser for protein-interaksjon målt ved ELISA-baserte metoder, for å tilveiebringe en biologisk ren, vandig oppløselig reagens som kan bli anvendt sammen med andre reagenser for å analysere konkurrenter til T4 reseptor overflatedomeneinteraksjoner. For eksempel, siden sT4 bindes til HIV env protein eller blandinger inneholdende HIV env proteiner, kan det bli anvendt for å screene for hemmere av virusbinding. Basert på in vitro data som viser at sT4 bindes til celler som uttrykker HIV env proteiner kan sT4 også virke som et selektivt målsøkende molekyl for HIV-infiserte celler in vivo. Som et målspesifikt bærerprotein kan sT4 virke for eksempel som bærerproteinet for avgivelse av cytotoksiske midler til de infiserte cellene.

I tillegg, basert på data som viser at T4 reseptoren spesifikt assosierer med MHC klasse II antigener på antigen-presenterende celler som foreslått ved klassehemming av T4+ cellene, kan sT4 bli anvendt sammen med klasse II antigener for å teste for hemmere av T4 lymfocytt-målcelleinteraksjoner. I tillegg til disse eksemplene, som er basert på direkte bindingsanalyse mellom sT4 og dets målmolekyler, kan mere kompliserte analyser konstrueres som er basert på de biologiske responsene overfor sT4 gjenkjenning.

En bakteriell celle kan anvendes som den egnede verten. Bakteriecellen kan være en Escherichia coli celle. Eukaryot-celler som en pattedyrcelle, en gjærcelle eller en insekt-celle kan også anvendes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for produksjon av sT4 bestående av den antatte ekstracellulære domenen til T4 reseptoren. Ved anvendelse av den delen av T4 cDNA som koder for lederen og ekstracellulære domener av T4 reseptoren, d.v.s. pre sT4, blir vektorer konstruert som kan uttrykke store mengder sT4 i pattedyrceller.

Sekvensen til et sT4 er som følger:

Den kodende sekvensen til sT4 blir for eksempel tilveiebragt ved syntetisering av genet ved anvendelse av den kjente DNA-sekvensen ved standard kloningsteknikker basert på sekvensen og ved reisolasjon ved påvisning av protein, d.v.s., transfeksjon av cDNA klonet fra T4 uttrykkende cellelinjer og identifikasjon ved antistoffer rettet mot proteinet. cDNA kloner inneholdende sT4 kodende sekvens blir identifisert ved anvendelse av oligonukleotid hybridiseringsprober. Probene blir konstruert basert på den kjente sekvensen til T4 proteinet. Når en klon inneholdende sT4 kodende sekvens er blitt identifisert blir den kodende sekvensen kuttet ut ved anvendelse av restriksjons-endonukleaser og satt inn i klonings- og/eller ekspresjonsvektorer. I ekspresjonsvektoren blir den sT4 kodende sekvensen operabelt bundet til regulatoriske funksjoner som er nødvendige eller ønskelige for transkripsjon, translasjon og prosessering av den kodende sekvensen.

Regulatoriske funksjoner omfatter, for eksempel, funksjoner nødvendig for RNA-polymerasebinding og transkripsjon, samt andre funksjoner så som polyadenylering og forsterkning av transkripsjonene sekvenser. Promoteren kan være regulerbar slik at for eksempel ekspresjonen ikke blir indusert før etter transfeksjon og seleksjon av transformerte kloner. Promotere som er nyttige for utførelse av oppfinnelsen omfatter for eksempel SV40 tidlig promoteren og de lange terminale gjentagelsene (LTR'ene) fra rous sarcoma-virus, moloney sarcoma-virus eller cytomegalovirus (CMV).

Før transfeksjon blir sT4 minigenet, d.v.s. genet som kode for leder og ekstracellulære domener til T4 reseptoren, fortrinnsvis inkorporert inn i et større DNA-molekyl som omfatter et genetisk seleksjonsmarkørsystem. Seleksjons-markørsystemet består av et hvilket som helst gen eller gener som fører til en lett påvisbar fenotypisk forandring i en transfektert vertscelle. Slike fenotypiske forandringer kan for eksempel være foci-dannelse, medikamentresistens, så som gener for G418 eller hygromycin B resistens; eller andre selekterbare markører så som xantin guanin fosforibosyl transferase (xgprt), tymidinkinase (TK) og galaktokinase (galK). En seleksjonsmarkør som muliggjør genamplifikasjon kan bli anvendt for å øke kopitallet, enten ved øket effektivitet på transfeksjonen eller ved øket intracellulær replikasjon av genet som er av interesse og seleksjons-markøren. Slike markører som også amplifiserer genkopitallet omfatter gener for dihydrofolat reduktase (metotreksat resistens), CAD (N-fosfonacetyl-L-aspartat resistens) og adenosin deaminase (2-deoksycoformycin resistens).

Etter transkripsjon og translasjon i pattedyrceller blir ledersekvensen spaltet og modent sT4 blir utskilt i det kondisjonerte mediet.

sT4 minigenet kan bindes sammen med et humant H- ras eller et musedihydrofolat-reduktase (DHFR) minigen for å danne ekspre-sjonsvektorene.

sT4 minigenet er for eksempel bundet til humant H- ras eller muse DHFR for å tilveiebringe en seleksjonsmarkør og en måte for å selektivt amplifisere genekspresjonen gjennom co-transfeksjon med disse genene. Vanlige seleksjonsmarkører omfatter, for eksempel, DHFR, G418 eller hygromycin som selekterer for integrasjon av så få som en enkelt kopi av genet av interesse. Ampiifikasjon med for eksempel metotreksat (mtx) i DHFR systemet resulterer i overekspresjon av genet.

En alternativ måte for øket ekspresjon av genet omfatter anvendelse av ras proto-onkogenet. Ras gen-familien omfatter H-ras, K- ras og N- ras genene. I en foretrukket anvendelse av oppfinnelsen blir H- ras genet anvendt.

Andre DNA-funksjoner kan bli direkte bundet eller indirekte til sT4 minigenet eller så kan slike funksjoner være ubundne. Se for eksempel Axel, US-patent nr. 4.399.216.

Overekspresjon av genproduktene i pattedyrceller kan oppnås ved transiente eller stabile måte. Transient overekspresjon kan oppnås ved virale metoder så som anvendelse av vaccinia virus-vektorer eller ved genamplifikasjonsmetoder så som SV-40 baserte vektorer i celler som muliggjør SV-40 replikasjon. Disse metodene fører til celledød. Stabil overekspresjon kan oppnås ved dannelse av multiple genkopier så som ved seleksjon for genamplifikasjon eller ved anvendelse av ras proto-onkogener.

Overekspresjon av sT4-proteinet ved co-transfeksjon ved anvendelse av H- ras gensystemet kan oppnås ved anvendelse av et antall forskjellige cellelinjer, idet den foretrukne cellelinjen er NIH-3T3 cellelinjen som er en kontakthemmet musefibroblast cellelinje. Andre cellelinjer omfatter normale rotte-nyrer (NRK) (ATCC 1571) cellelinje og rotteembryo-fibroblast 52 (REF-52) cellelinje (115).

Ved anvendelse av seleksjonmarkørsystemet, for eksempel DHFR med metotreksat (DHFR/MTX teknikken), hvori ampiifikasjon av genkopitallet blir oppnådd ved selektiv amplifikasjon, er kinesisk hamster-ovarycellelinje (CHO) foretrukket. CH0-celler med mangel på DHFR blir spesielt anvendt (116). Andre celletyper som kan anvendes omfatter for eksempel en hvilken som helst pattedyrcelle som er blitt modifisert til DHFR".

Noen DHFR<+>celletyper kan bli anvendt sammen med mutante DHFR-gener som er mindre følsomme for metotreksat enn normal DHFR (Axel, US-patent nr. 4.399.216). I prinsippet kan DHFR<+>celler bli anvendt sammen med normale DHFR-gener og et ytterligere dominant selekterbart gen så som genet for G418 resistens (117). Transfeksjon utføres ved anvendelse av standardteknikker (118, 119). Disse teknikkene omfatter for eksempel kalsiumfosfat-felling, DEAE-dekstran-indusert pinocytose, elektroporasjon og viral transfeksjon.

Etter transfeksjon blir en celle som inneholder sT4 minigenet dyrket i et næringsmedium under betingelser som muliggjør amplifikasjon av det selekterbare genet. Standard pattedyr-cellekulturmedie kan anvendes, for eksempel F12 medium (GIBCO, Grand Island, New York) uten hypoksantin og tymidin og inneholdende 10% fetalt bovinserum. Cellekulturene blir opprettholdt ved omgivelsestrykk ved 30 til 45 °C. Cellene som overlever seleksjon og uttrykker høye nivåer sT4 protein blir valgt for ytterligere dyrkning. Slike celler blir dyrket under selektive betingelser og produktet, sT4 proteinet, blir samlet og renset.

Cellekulturmetoder som kan anvendes ved en utførelse av oppfinnelsen omfatter for eksempel anvendelse av adherente celler eller vekst av celler i suspensjon. Kondisjonert medium (CM) kan samles fra cellene dyrket i suspensjon eller adherert til faste bærere, d.v.s. CN blir preparert fra adhererte celler dyrket i rulleflasker eller dyrket på faste bærere og dyrket i suspensjon eller i fluidiserte eller pakkede lag. CM blir preparert fra suspensjonsceller i rørt-tankbeholdere.

sT4 omfatter derivater av den ekstracellulære domenen til T4. Slike derivater omfatter addisjon, delesjoner eller substitusjoner idet forandringene ikke negativt påvirker utskillingen av proteinet i det kondisjonerte mediet og affiniteten til proteinet for HIV env proteinet, d.v.s. gpl20. For eksempel kan en eller noen få aminosyrer tilsettes til eller deleteres fra den N- eller C-terminale enden. Eller, kan en eller noen få aminosyrer, fortrinnsvis ikke mer enn fire aminosyrer bli satt inn i, deletert eller substituert for indre aminosyrer. Alternativt, kan et hybrid-protein, d.v.s. en translasjonsfusjon, bli konstruert mellom sT4 og en proteinbærer, et annet antigen

eller andre sT4 molekyler for å preparere et poly-sT4 molekyl. I et annet alternativ kan sT4 bli syntetisk konjugert til et bærermolekyl.

En utførelsesform av et sT4 derivat er illustrert i eksemplene nedenfor (se eksempel 3). Affiniteten til sT4 :. or HIV env kan demonstreres ved en konkurrerende bindingsanalyse ved anvendelse av et sT4-molekyl med en kjent affinitet eller ved anvendelse av antistoffer som gjenkjenner T4-resektorer, så som 0KT4 og 0KT4A. Nyttige derivater av sT4-molekyler ifølge oppfinnelsen blir selektivt utfelt fra det kondisjonerte mediet ved 0KT4A som vist i eksempel 3. Derivater kan prepareres kjemisk, etter ekspresjon, eller genetisk, før ekspresjon, ved manipulasjon av den kodende sekvensen for lederen og/eller den ekstracellulære domenen.

sT4 kan bli renset fra det anvendte kulturmediet ved anvendelse av forskjellige proteinrensningsteknikker, for eksempel affinitetskromatografi; ionebyttekromatografi; størrelseseksklusjonskromatografi; hydrofob kromatografi eller revers fasekromatografi.

sT4 kan bli renset ved affinitetskromatografi ved anvendelse av generelle gruppe-spesifikke adsorbanter, for eksempel karbohydratbinding eller fargeaffinitetsligander; eller ved anvendelse av ligander som spesifikt bindes til sT4, for eksempel monoklonale antistoffer eller HIV gpl20 protein eller deler derav.

Eksempel på rensningsskjerna omfatter: (1) dyrking av cellene i et serum-fritt seleksjonsvekstmedium; (2) klaring av det kondisjonerte mediet; og (3) separering av sT4 ifølge oppfinnelsen fra andre proteiner tilstede i det kondisjonerte mediet.

I den foretrukne fremgangsmåten blir sT4 renset fra det serum-frie kulturmediet ved anvendelse av en serie kromato- grafitrinn som mer basert på de fysiske egenskapene til sT4-molekylet. sT4 kan også bli renset fra kulturmediet inneholdende serum ved anvendelse av lignende kromatografi-fremgangsmåter.

I den foretrukne fremgangsmåten for rensing av sT4 blir kulturmediet først sendt gjennom en ionebyttekolonne, fortrinnsvis en S-Sepharose (sulfo-propyl sefarose) kolonne, som binder sT4 mens hovedmengden av de kontaminerende proteinene strømmer gjennom kolonnen. Proteinprøven blir deretter eluert ved anvendelse av en lineær saltgradient. En ytterligere ionebyttekolonne blir anvendt. Denne kolonnen, fortrinnsvis en Q-Sepharose (kvarternær aminoetylsefarose) kolonne har slike egenskaper at de forurensende proteinene tilstede i prøven er bundet til kolonnen mens sT4 ikke blir bundet og blir isolert i kolonnens gjennomstrømningsbuffer. Til slutt blir en gelfiltreringskolonne som virker på en slik måte at den fjerner gjenværende kontaminerende materialer anvendt.

En alternativ fremgangsmåte for rensing av sT4 omfatter anvendelse av monoklonale antistoffer rettet mot sT4. sT4-proteinet kan bli renset i et trinn ved å sende klare kulturmedier gjennom en affinitetsgelbærer hvor monoklonalt antistoff rettet mot sT4 er bundet. sT4 vil bli bundet til kolonnen ved antistoffbindings-setet mens alle kontaminerende proteiner blir vasket gjennom kolonnen. sT4 blir deretter eluert fra kolonnen under betingelser som forhindrer at sT4-proteinet blir inaktivert.

En fremgangsmåte for fremstilling av et hvilket som helst av de ovenfor beskrevne terapeutiske midlene som spesifikt kan danne et kompleks med humant immunsviktvirus-kappeglykoprotein er videre tilveiebragt dersom denne omfatter dyrking av verktsvektorsysten ifølge oppfinnelsen under egnede betingelser som tillater produksjon av det terapeutiske middelet og isolering av det slik produserte terapeutiske middelet.

sT4 kan bli anvendt i diagnostiske analyser for påvisning av T4-proteinene eller molekylene som de reagerer med. For eksempel vil kvantifisering av T4 og T4<+>cellene og antistoffene til T4 være av diagnostisk verdi for AIDS.

I tillegg kan sT4 bli anvendt for å danne nye diagnostiske reagenser, for eksempel Maber eller andre typer av molekyler for anvendelse i standard immunologiske analyser, d.v.s., ELISA, oppfangingsimmunanalyser, radioimmunanalyser. På grunn av at sT4 har 0KT4, 0KT4A og de fleste om ikke alle av de andre overflate-epitopene til T4-reseptoren, er sT4 spesielt nyttig i immundiagnostiske analyser fordi det kan bli anvendt for absolutt kvantifisering av T4-nivåene i et system. Det eksisterer for tiden ingen standarder for kvantifisering av T4-reseptoren.

T4-reseptoren er tilstede i tre forskjellige kjemiske miljøer: den oksiderende, hydrofile celleoverflaten; den hydrofobe membran; og det reduserende, hydrofile cytoplasma. Disse forskjellige miljøene utelukker sannsynligvis isolasjon av reseptoren i fullstendig nativ tilstand. sT4, som består bare av den ekstracellulære domenen, blir utskilt som et oppløselig protein inn i cellesupernatanten og dets konformasjon ser ut til å etterligne overflaten til reseptor-overflatedomenen. sT4 er dermed egnet for detaljert strukturell analyse, spesielt for røntgen-krystallografi. Bestemming av den tredimensjonale strukturen til sT4 alene eller i en kompleksdannet form med andre interaktive molekyler kan tilveiebringe en basis for den rasjonelle konstruksjonen av selektive antagonister og agonister for sT4.

De forskjellige profylaktiske metodene og immuniserings-metodene for AIDS tilveiebragt i foreliggende oppfinnelse er basert på evnen som de nye peptidene, antistoffene og DNA- molekylene beskrevet heri har til å danne komplekser med, eller hybridisere til, spesifikke molekyler og å tenne en immunologisk respons som er effektiv for nøytralisering av AIDS-viruset. Disse molekylene, fremgangsmåtene for fremstilling derav og fremgangsmåtene for AIDS-behandling vil bli bedre forstått med referanse til følgende eksperimenter og eksempler som er tilveiebragt for å illustrere oppfinnelsen og som ikke skal bli konstruert for på noen måte å begrense rammen av foreliggende oppfinnelse.

Materialer og fremgangsmåter

Celler og antistoffer

Perifere blodleukocytter isolert ved Ficoll-hypaque tetthets-gradientsentrifugering ble fraksjonert til saue-erytrocytt rosett-positive (E<+>)-celler. T4<+>og T8<+>undergruppene innenfor E<+>populasjonen ble isolert ved positiv seleksjon av T8-bærende celler med anti-T8 antistoff og humane erytrocytter konjugert med af f in.itets-renset kanin anti-muse IgG (10). Cytofluorometriske analyser av disse undergruppene demonstrerte at T4<+>cellene inneholdt 95% T4<+>og 2% T8<+>, mens T8<+>cellene innehold 95% T8<+>og 2% T4<+>.

Fro 2,2 T-cellelinjen (T3~, T4<+>, T8<+>, T11<+>) ble isolert fra en voksen pasient med udifferensiert akkutt leukemi. Jurkatt er T3-, T4<+>, T8<+>, Til-, RPMI 8402 er T3", T4", T8_, T11<+>. 0T-CLL er en kronisk lymfocyttisk lekemi som er T3<+>, T4<+>, T8" og T11<+>(22). T4<+>cellelinjene CEM og Molt 4 ble tilveiebragt fra American Type Culture Collection. Alle leukemi T-cellelinjene ble kontinuerlig dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 5% fetalt kalveserum. Transformerte B-cellelinjer CB, CP58 og CP94 ble isolert som tidligere beskrevet (23).

Affinitets-renset kanin anti-muse IgG ble konjugert til humane erytrocytter ved kromkloridmetoden (24). Cotransformas. lon av L- cellene og NIH 3T3 cellene Murine L tk~aprt~ cellene ble opprettholdt i Dulbecco's modifiserte Eagle-medium (DME) supplementert med 10$ kalveserum (Gibco) og 50 mikrogram/ml diaminopurin (DAP). L-cellene ble sådd ut i en tetthet på 5 x IO<4>celler pr. 10 cm skål 1 dag før transformasjon. Kalsiumfosfatpresipitåtene ble preparert ved metoden til Graham og van der Eb (25) som modifisert ved V/igler et al. (6) ved anvendelse av 100 ng pTK og 20 mikrogram høymolekylvekt T-celle eller L-celle DNA pr. skål. L-cellene ble plassert under seleksjon i DME med 10$ kalveserum, 15 mikrogram/ml hypoksantin, 1 mikrogram/ml aminopterin og 5 mikrogram/ml tymidin (Hat medium (27)) på den følgende dagen. Etter 12-14 dager HAT-seleksjon ble tk<+>transformantene screenet ved anvendelse av rosetteringsanalysen.

Murine NIH 3T3 cellene ble opprettholdt i DME supplementert med 10$ nyfødt kalveserum (Gibco). NIH 3T3 cellene ble sådd ut i en tetthet på 5 x IO<4>celler pr. 10 cm skål 2 dager før transformasjon. Et kalsiumfosfatpresipitat ble påført cellene ved anvendelse av 10 mikrogram bærer-DNA og enten 10 mikrogram T4-pMV6tk/neo eller 10 mikrogram T4-pVcos7 og 500 ng pSV2neo. Etter 2 dager ble cellene plassert under seleksjon i DME med 10% kalveserum og 500 mikrogram/ml G418 (Geneticin; Gibco). Rosetteringsanalysene ble utført på overlevende kolonier en uke etter vekst i selektivt medium.

Rosetteringsanalyse

Etter en skylding med fosfat-bufferet saltvann (PBS), ble skåle inkubert med 2,5 ml renset monoklonalt antistoff OKT 4A (1 mg/ml) fortynnet i 1/500 i PBS inneholdende 5% fetalt kalveserum i 45 minutter ved romtemperatur. Fritt antistoff ble fjernet fra skålene med tre forsiktige skyldinger i PBS. Seks milliliter humane erytrocytter konjugert med renset kanin anti-muse IgG antistoff (2$ v/v råstoffsuspensjon, fortynnet 1/10 i PBS/5% fetalt kalveserum) ble tilsatt og skålene ble latt stå ved romtemperatur. Etter 45 minutter ble frie erytrocytter forsiktig suget opp og PBS ble tilsatt før granskning for rosett-positive kolonier.

Cytofluorometrisk analyse

Adherente celler ble fjernet med 0,005 M EDTA i PBS og vasket en gang med PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,01% natriumazid (cytowash). Cellene (5 x IO<6>) i 0,1 ml ble tilsatt rørene med hensiktsmessige fortynninger av OKT 4, OKT 8 eller kontroll antistoffer. Celle-antistoffblandingen ble inkubert i 45 minutter ved 4°C og deretter vasket to ganger i cytowash. Fluorescens isotiocyanat (FITC)-konjugert geite anti-muse IgG + A + M (Cappel) ble tilsatt til cellene og inkubert i 1 time ved 4°C. Cellene ble deretter vasket tre ganger i cytowash og resuspendert i 0,5 ml PBS med 0,01% natriumazid. Cellene ble analysert på en Becton Dickinson FACS IV cellesorterer og data ble lagret og plottet ved anvendelse av en VAX 11/780 computer (Digital Equipment Co.)

RNA og DNA isolasjon

Totalt RNA ble isolert fra celler ved homogenisering i 4 M guanidin-tiocyanat, etterfulgt av ultrasentrifugering gjennom en 5,7 M CsCl pute (28). Poly(A)<+>seleksjon ble oppnådd ved oligo(dT)-cellulosekromatografi (type 3, Collaborative Research) (29). Høymolekylvekt genomisk DNA ble preparert som beskrevet av V/igler et al. (26).

cDNA og genomiske bibliotek

Dobbelt-trådet cDNA ble syntetisert fra poly(A)<+>RNA isolert fra perifere humane T-celler (20). Etter behandling med EcoRI metylase og T4 DNA polymerase ble dobbelt-trådet cDNA klonet inn i EcoRI setet til XgtlO (30) ved anvendelse av EcoRI linkere. Charon 4 humant genomisk bibliotek ble tilveiebragt fra Dr. Tom Maniatis (Harvard University) (31).

Syntese av subtrahert cDNA probe

<32->merket cDNA ble syntetisert fra poly(A)<+>RNA isolert fra den primære transformanten, LTD-4, som beskrevet av Davis et

al. (32). Etter sammensmeltning av cDNA til et overskudd utransformerte L-celle poly(A)<+>RNA (Rot = 3.000), ble enkelt-trådede sekvenser som var anriket for humane cDNA isolert ved hydroksyapatit-kromatografi (32). Før filter-hybridiseringen ble den subtraherte cDNA proben konsentrert med sec-butanol og avsaltet på en G-50 Sephadex-kolonne ekvilibrert i TE.

Screening av cDNA og genomiske bibliotek

Det perofere humane T-celle biblioteket ble sådd ut på E. coli C600/HFL og det humane genomiske biblioteket ble sådd ut på E. coli LE392. Screening av duplikate filtre ble utført ifølge standard prosedyre (33), idet hybridisasjonen ble utført i 50% formamid og 5x SSC ved 42°C. Ved screeningen av cDNA biblioteket ble 6 x IO<4>cpm subtrahert probe applisert pr. 137 mm nitrocellulosefilter. Filtrene fra.det genomiske biblioteket ble hybridisert til et nick-translatert (34) cDNA innskudd. Vaskingene ble utført ved 68°C med sluttvask i 0,2 x SCC. Autoradiografi ble utført ved -70°C i nærvær av intensiverende skjermer i 1-2 dager.

DNA- sekvensering

Restr iksj onsf ragmentene til pT4B ble subklonet inn i M13 vektorene mpl8 og mpl9 (35). Sekvenseringsreaksjoner ble utført ved anvendelse av dideoksy-kjedetermineringsteknikken (36) . Sekvenserings-strategien er vist i figur 3B.

Southern og Northern Blot hybridiseringer

Cellulært DNA med høy molekylvekt ble kuttet med 5 enheter restriksjonsnuklease pr. mikrogram DNA ifølge forhandlerens rekommandering (Boehringer Mannheim). Prøvene (10 mikrogram) ble utsatt for elektroforese på en 0,8% agarosegel. DNA-fragmentene ble overført til GeneScreen (New England Nuclear; (37) ) og hybridisert som beskrevet av Church og Gilbert (38).

RNA ble kjørt på en 0,8% agarose-f ormaldehydgel (39) og overført til GeneScreen. Northern hybridisering ble utført ifølge fremgangsmåten til forhandleren. Southern og Northern blots ble hybridisert til nick-translaterte prober.

Syntese og in vitro translasjon av SP6 RNA

kb T4 cDNA ble subklonet inn i EcoRI setet til pSP65 (Promega Biotec) og linearisert med Hindlll. Transkripsjon av linearisert plasmid DNA (1 mikrogram) med SP6 polymerase i fravær av radioaktivt merkede nukleotider ble utført som beskrevet (40), med unntagelse av at GpppG og umerket CTP ble satt til transkripsjonsbufferen. En tiendedel av reaksjonsblandingen ble translatert i et hvetelinje-system (Bethesda Research laboratories) inneholdende L-[<32>S]-metionin (Amersham) og 1 mikromolar S-adenosylmetionin. In vitro translasjonsproduktene ble utsatt for SDS-polyakrylamid-elektroforese under reduserende betingelser som beskrevet nedenfor.

Celle- merking. lektin- kromatografi og immuno- presipitasjon Cellene ble dyrket i 12 timer i metionin-fritt DME medium inneholdende 10% dialysert kalveserum og 1 mCi L-[<32>S]-metionin (Amersham) som tidligere beskrevet (41). Cellene ble oppløst i 10 mM Tris (ph 7,4), 150 mM NaCl (TBS) inneholdende 0,5% nonidet P-40 (Shell) og 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (Sigma). Lysatene ble sentrifugert i 1 time ved 100.000 x g og supernatantene ble utsatt for linselektin-kromatografi (Pharmacia) ifølge fremgangsmåten til Hedop et al. (42). Eluatene ble pre-absorbert en gang med en blanding av kontroll muse-ascites og protein A-sefarose (Pharmacia) i 1 time ved 4°C og to ganger med bare protein A-sefarose i 1 time ved 4°C. 2,5 x IO<4>cpm av hver supernatant ble deretter blandet med 10 mikroliter monoklonalt antistoff (omtrent 1 mg/ml) og protein A-sefarose og inkubert på et dreiebord over natt ved 4°C. Kulene ble deretter vasket fire ganger med kaldt TBS inneholdende 0,5% NP-40 og 0,2% SDS og ble suspendert i elektroforese-prøvebuffer.

Gel- elektroforese

SDS-polyakrylamid gel-elektroforese ble utført ifølge fremgangsmåten til Laemmli (43). Immunopresipitatene og in vitro translasjonsproduktene ble løst opp i prøbebuffer med eller uten 2-merkaptoetanol og ble deretter applisert på 10% polyakrylamid-geler. Autoradiografi ble utført på Kodak XAR-5 film i nærvær av intensiverende skjermer (DuPont Chemical Company).

Cotransformaslon og rosetteringsanalyse

Muse x-2 cellene (44) ble opprettholdt i Dulbecco's modifisert Eagle<*>s medium (DME) supplementert med 10% kalveserum (CS) (Gibco). x-2 cellene ble sådd ut i en tetthet på 5 x IO<5>celler pr. 10 cm skål 2 dager før transformasjon. Kalsium-fosf atpresipitatene ble preparert ifølge metoden til Graham og van der Eb (25), som modifisert av Wigler et al. (27). Presipitatene ble applisert i brønnene ved anvendelse av 10 mikrogram bærer DNA og enten 10 mikrogran T4-pMV7 eller 10 mikrogram T8-pMV7. Etter 2 dager ble cellene plassert under seleksjon i DME/10% CS og 500 mikrogram/ml G418 (Geneticin ;

Gibco).

Rosetteringsanalysene for å identifisere T4<+>eller T8<+>kolonier ble utført på overlevende kolonier en uke etter vekst i selektivt medium. Etter en skylling med fosfat-buffret saltvann (PBS), ble skålene inkubert med 2,5 ml renset monoklonalt antistoff OKT 4A eller OKT 8 (1 mg/ml; Ortho) fortynnet 1/500 i PBS inneholdende 5% fetalt kalveserum (FCS) i 45 minutter ved romtemperatur. Fritt antistoff ble fjernet fra skålene med tre forsiktige skyllinger i PBS.

6 ml human erytrocytter konjugert med renset kanin anti-muse

IgG antistoff ( 2% v/v råstoffsuspensjon, fortynnet 1/10 i PBS/5% FCS) ble tilsatt og skålene ble latt stå ved romtemperatur. Etter 45 minutter ble de frie erytrocyttene forsiktig suget opp og PBS ble tilsatt før granskingen. T4<+>og T8<+>x-2 klonene ble renset ved koloni-isolasjon ogkarakterisert vedflow-cytometri og Northern blot-analyser.

Rekombinant retrovirus- produks. ion og infeksjon

T4<+>og T8<+>x-2 kloner som produserte rekombinante retrovirus-råstoff med titre på IO<5>cfu/ml ble isolert. Viralt råstoff ble preparert ved tilsetning av 10 ml frisk DME/10% CS til et nærmest konfluent monolag av T4<+>eller T8<+>x-2 kloner. Etter 24 timer ble mediet fjernet og filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filter (Millipore). For infeksjon ble 5 x IO<5>celler inkubert med 2 ml viral supernatant (eller en fortynning) i nærvær av 8 mikrogram/ml polybren (Aldrich). Etter 3 timer ble 8 ml friskt medium tilsatt. 3 dager etter infeksjonen ble cellene på ny sådd inn i DME/10% CS inneholdende 500 mikrogram/ml G418, dyrket i 2 uker, registrert for G418<r>kolonier og screenet for overflate T4 eller T8 ekspresjon ved anvendelse av ovennevnte rosetteringsprosedyre eller flow-cytometri.

x-2 kultur-supernatantene ble anvendt for å infisere muse x-AM celler som beskrevet ovenfor. T4<+>eller T8<+>adherente transformanter ble renset ved rosetteringsanalysen etterfulgt av koloni-isolering; T4<+>eller T8<+>ikke-adherente transformanter ble renset ved fluorescens-aktivert celle-sortering (FACS). Ikke-adherente humane lymfoidcellelinjer (HSB2, RPMI—T cellene; Ra j i - B-cellene) og adherente epiteliske celler (HeLa) ble infisert ved co-kultivering med T4<+>eller T8<+>x-AM kloner (forbehandlet med 10 mikrogram/ml mitomycin—C i 2 timer; Sigma) og ble renset.

Cellelinjene ble selektert for G418 resistens til en konsentrasjon på 1,5 mg/ml, med unntagelse av HeLa cellene som måtte ha 1 mg/ml, og fibroblastene som krever 0,5 mg/ml. Alle cellekulturene som produserer rekombinante amfotrofiske virus (4-AM) ble opprettholdt under opprettholdelsesbetingelser for P3.

AIDS- virus

Prototype LAV stammen ETLV-III/LAV ble tilveiebragt fra J.-C. Cherman (Institut Pastuer, Paris; 45)). Virus inocula anvendt i disse studier var fra den andre eller femte passeringen av virus i vårt laboratorium. Inocula er kultur-supernatanter fra HTLV-III/LAV-infiserte, fytotohemagglutinin (PHA)-stimulerte perifere lynfocytter som ble høstet ved sekven-siell sentrifugering (300 x g i 7 minutter etterfulgt av 1.500 x g i 20 minutter), og ble lagret i flytende nitrogen. For bindingsstudiene ble virus konsentrert fra kultur-supernatantene,. høstet som ovenfor ved ultrasentrifugering ved 90.000 x g i 90 minutter over en 15% pute av Renograffin (E.R. Squibb) i 0,01 M Tris, 0,15 M NaCL, 1 mM EDTA, pH 8.0.

Ant i- HTLV- III/ LAV- reagensene

Serum med høye nivåer av antistoff overfor HTLV-III/LAV ble tilveiebragt fra en homoseksuell mann med kronisk lymf-adenopati, og spesifisiteten derav ved immunofluorescens (46), Western blot analyse (47) og radioimmunopresipitasjon (48) er blitt beskrevet. Deler av IgG-fraksjonen ble koblet til fluorescens isotiocyanat (FITC; FITC:proteinforhold på 10,7 mikrogran/ml), pepperrot-peroksidase (HPO; type VI; Sigma) og agarose som beskrevet (47, 49, 50, 51). Konjugater av IgG fra et ikke-immunt serum ble preparert parallelt.

Revers transkriptase- analvse

Magnesium-avhengig, revers transkriptase (RT) aktivitet ble målt med en templat primer av (A )n(dT)12-18 (eller (dA)n-(d<T>)12-18som negativ kontroll) i nærvær av 7,5 mM Mg<2+>(52).

Immunofluorescens- påvisning av cytoplasmisk AIDS- virus

Dyrkede celler (1 x IO<5>i 0,1 ml) ble sentrifugert på objektglass (Shandon Cytocentrifuge), fiksert i 95% etanol og 5% eddiksyre ved -20°C i 30 minutter, og rehydrert med tre 10 minutters skiftinger av PBS (0,01 M P04, 0,15 M NaCl, pH 8.0). Objektglassene ble utsatt for en 1/500 fortynning av FITC-anti-HTLV-III/LAV (19 mikrogram/ml) i 30 minutter ved romtemperatur. Objektglassene ble deretter vasket (tre skift med 10 minutter hver) og plassert under et glass med 50% glycerol i PBS. Objektglassene ble undersøkt med et epi-opplyst Leitz ortoplan-mikroskop ved 630 x forhøying. Under disse betingelsene er FITC-anti-HTLV-III/LAV reagenser spesifikt for HTLV-III/LAV. Uinfiserte PHA-stimulerte celler, Epstein Barr (EB) virus-infiserte B-cellelinjer, en adenovirus-infisisert cellelinje, flere T-cellelinjer, HTLV-I og HTLV-II infiserte cellelinjer ble ikke farvet.

AIDS- virus immunoanalyse ( antigen- oppfangingsanalyse)

Dette er en sandwich-immunoanalyse som i detalj er blitt beskrevet (47). I korte trekk omhandler denne analysen at kultursupernatanten blir satt til mikrotiter-skålbrønnene belagt med anti-HTLV-III/LAV IgG. Etter at skålene er blitt vasket blir bundet virus-antigen påvist med HPO-anti-HTLV-III/LAV. Denne analysen, som er minst like følsom som RT-analysen, er negativ med kultursupernatanter fra PHA-stimulerte lymfocytter fra flere givere, EB virus-infiserte B-cellelinjer, flere T-cellelinjer, polyklonale og klonede IL—2 avhengige T-cellelinjer, myeloidlinje K562 sakt cellelinjene som inneholder HTLV-I eller HTLV-II. OD490begrensningen for diskriminering av en positiv fra en negativ supernatant ble bestemt i hver kjøring fra gjennomsnittlig pluss 2 SD av minst 10 replikative bestemminger på kontroll (uinfisert cellekultur) supernatanter høstet på samme tid.

AIDS- virus infektivitetsanalyse ( ID- 50)

Mikrokultur-analysen for titrering av infeksiør HTLV-III/LAV er i detalj beskrevet (47). PHA-stimulerte lymfocytter eller cellelinjer (2 x IO<6>celler/ml) blir inokulert med 10-ganger seriefortynninger av virusinokulum og inkubert i 18 timer ved 37° C. Cellene ble deretter vasket og sådd ut i mikrokultur (10 til 20 kulturer pr. fortynning: 1 x 10<5>celler pr. kultur i 0,25 ml medium). Hver fjerde dag ble 100 mikroliter supernatant fjernet og erstattet med friskt medium. Supernatantene ble deretter analysert for viral antigen ved antigen-oppfangingsanalysen som beskrevet ovenfor. Infeksiøs virustiter (ID-50) er definert som resiprokal av fortynningen hvor 50% av kulturene er positve for virus (47).

VSV pseudotype- analyse

Vesikulær stomatitis-virus (VSV, Indiana-stamme, vill type) blir propagert i celler som produserte retroviruset nødvendig for kappe-pseudotype som beskrevet (53). Hyperimmun nøytrali-serende saue anti-VSV serum ble satt til høstet VSV for å inaktivere ikke-pseudotypevirus. Pseudotype-titrene var i området mellom. IO<4>og 10<5>PFU/ml. I analysen ble 2 x IO<5>celler som skulle bli infisert med VSV-pseudotyper sådd ut i 30 mm diameter vevskulturbrønner. HeLa, NIH 3T3 og L-cellene var naturlig adherente; alle andre celletyper ble tilknyttet ved forbehandling av substratet med 50 mikrogram/ml poly-L-lysin. Etter virusadsorpsjon i 1 time ble celle vasket og IO<6>mink CCL64 eller bovint MDBK celler ble satt til hver brønn. Disse cellene tilveiebringer gode plakk for sekundær VSV-infeksjon, men er resistente overfor infeksjon ved pseudotype-virus. Etter å la plakkindikator-cellene sette seg og bli spredd (omtrent 90 minutter), ble monolagene overlagt med agarmedium. VSV-plakkene ble talt 2 dager etter infeksjon. Anti-T4A monoklonalt antistoff (1:20), anti-HTLV-III serum (1:10) eller anti-HTLV-I serum (1:10) ble anvendt for å hemme pseudotypeplakkdannelse ved forbehandling av cellene 30 minutter før tilsetning av pseudotypene som beskrevet i (54).

Syncytium induksjonsanalvse

2x IO<5>celler ble samdyrket med 2 x IO<4>H9-celler infisert

av og produserende HTLV-III (55) i 10 mm diameter brønner. Kulturene ble inkubert ved 37°C og undersøkt for dannelse av syncytia etter 18 timer som tidligere beskrevet (54, 56). Celler med fem eller flere syncytia ble registrert som positive. Syncytikum-hemming ble analysert ved tilsetning av anti-T4A monoklonalt antistoff (1:20) til de blandede kulturene ved tidspunkt for såing.

Cytofluorometrisk analyse og AIDS- virus binding Metoden er i detalj beskrevet (46). Celleoverflate T4 eller T8 ekspresjon ble påvist ved direkte immunofluorescens med fluorescens-konjugert anti-T4A eller anti-T8 monoklonale antistoffer (OKT 4A, OKT 8). Fortynningsmiddelet/vaske-bufferen bestod av 0,01 M P04, 0,15 M NaCl, pH 7,4, inneholdende 0,1% bovint serumalbumin, 2% v/v AB<+>humant serum og 0,01% NaN3. Alle reagensene ble fortitrert for optimal (mettende) binding. Cellene (5 x IO<5>) ble inkubert i en 25 mikroliter fortynning av monoklonalt antistoff i 30 minutter ved 4°C. Cellene ble vasket ved sentrifugering (300 x g i 7 minutter), resuspendert i 0,5 ml 1% paraformaldehyd i saltvann og analysert med en fluorescens-aktivert celle-sorterer (FACS IV, Becton Dickinson). For HTLV-III/LAV binding ble 5 x 10<5>celler inkubert med HTLV-III/LAV (500 ng i 10 mikroliter) i 30 minutter ved 37°C. Vaskede celler ble resuspendert i 25 mikroliter fluorescens-konjugert anti-HTLV-III/LAV i 30 minutter ved 4°.C. Celle ble vasket, resuspendert i 1% paraf ormaldehyd og analysert ved FACS som ovenfor. For hemming av NTLV-III/LAV binding ble cellene preinkubert med anti-T4A eller anti-T8 (20 ng i 20 mikroliter) i 30 minutter ved 4"C etterfulgt av tilsetning av HTLV-III/LAV (500 ng i 10 mikroliter) i 30 minutter ved 37°C. Cellene ble vasket og inkubert med fluorescens-konjugert anti-HTLV-III/LAV, vaket, resuspendert i paraformaldehyd og analysert ved FACS som ovenfor.

Celleoverflateradioaktiv iodinering.immunopresipitering og gelelektroforese

T4<+>NIH 3T3 transformantene ble overflate-radioaktivt iodinert ved laktoperoksidase-teknikken (18) som følger: 4 x IO<7>celler ble suspendert i 1 ml PBS inneholdende 0,5 mM EDTA, 2 mCi Na<125>I og 20 mikrogram laktoperoksidase. Ved tidene 0, 1, 5, 10 og 15 minutter ble 10 mikroliter 0,03% HgOg tilsatt. Reaksjonen ble utført ved 23°C og stoppet etter 20 minutter ved 2 sentrifuger inger i 50 volum kald PBS inneholdende 10 mM Nal. Merkede celler ble fordelt i 4 rør og inkubert som angitt med HTLV-III/LAV (2 mikrogram i 20 mikroliter) i 30 minutter ved 37°C. Påfølgende vaskinger og manipulasjoner ble utført ved 0° til 4°C. Vaskede celler ble lysert ved tilsetning av 1 ml detergentlyseringsbuffer (LB; 0,02 M Tris, 0,12 M NaCl, pH 8,0, inneholdende 0,2 mM fenyletylsulfonylfluorid, 5 mikrogram/ml aprotinin, 0,2 mM EGTA, 0,2 mM NaF, 0,2% natr iumdeoksyckolat og 0,5% (v/v) nonidet P-40). Rørene ble holdt på is i 15 minutter og kjernene ble fjernet ved sentrifugering ved 3.000 x g i 20 minutter.

For absorpsjonene ble sepharose-konjugater av humant anti-HTLV-III/LAV IgG, humant ikke-immunt IgG, anti-T4A og anti-T8 antistoffene preparert som beskrevet (48). Lysatene ble preabsorbert med 200 mikroliter sepharose-ikkeimmunt humant IgG i 1,5 timer med rotasjon, og deretter immunopresipitert med 20 mikroliter sepharosekonjugater (som angitt) i 3 timer med rotasjon. Sepharoseabsorbantene ble vasket 3 ganger: en gang med LB; en gang med LB inneholdende 0,5 M NaCl; og en gang med LB inneholdende 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS). Absorbert materiale ble eluert ved 65°C i 30 minutter med 20 mikroliter prøvebuffer (0,01 M Tris, pH 8,0, inneholdende 2% SDS, 5% 2-merkaptoetanol v/v), 25 mikrogram bromfenyl-blå og 10% glyserol (v/v). Elektroforese ble utført i en 3,3-20% gradient polyakrylamin-gel med en 3% opphopingsgel (57), og autoradiografene ble utviklet med Kodak XAR-5 film.

Virusinhibisj onsanalyse

2 x 10<5>T4<+>JM T-celler ble utsatt for AIDS-virus ved 0 minutter. Hemmerene ammoniumklorid (20 mM) eller amantadin (20 mM) ble tilsatt ved forskjellige tidspunkt i løpet av virusinfeksjons-forløpet (0 minutter, 30 minutter og 60 minutter). Etter 6 timer ble cellene vasket og erstattet med friskt medium (RPMI/10%FCS). Effekten av disse midlene på AIDS-virus infeksjonen ble bestemt 5 dager etter infeksjonen. Fraksjonen av infiserte celler i kulturene som uttrykker virale antigener ble bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi som beskrevet ovenfor (58).

RNA- isolasjon og Northern blot hybridisasjoner

Totalt RNA ble isolert fra celler ved homogenering i 4M guanidintiocyanat etterfulgt av ultrasentrifugering gjennom en 5,7 M CsCL pute (28). Poly(A)<+>seleksjon ble oppnådd ved oligo(dT)-cellulosekromatografi (type 3, collaborativ research) (29).

RNA ble kjørt ved elektroforese gjennom en 1% agarose-formaldehydgel (39) og overført til Hypond (Amersham). Northern blot hybridisasjon ble utført ifølge prosedyrene gitt av forhandleren. Probene ble nick-translatert til en spesifikk aktivitet på 0,5-1 x IO<9>cpm/mikrogram med cx<32>P-merkede deoksynukleotidtrifosfater (59).

Resultater

Isolasjon av et T4 cDNA

Strategien anvendt for å isolere et T4 cDNA opprinnelig involvert ved konstruering av L-celletransformanter som uttrykker T4 på deres overflate. cDNA syntetisert fra mRNA til en T4<+>transformert fibroblast ble anriket ved subtra-herende hybridisasjon og anvendt som en probe for å isolere et cDNA kodende T4 fra et cDNA bibliotek laget fra mRNA til perifere T-lymfocytter. Identiteten til T4<+>cDNA klonene ble bestemt ved Northern og Southern blot analyser og til slutt ved evnen som disse klonene har til å overføre T4<+>fenotype til mottakercellene. Lignende teknikker er tidligere blitt anvendt for å isolere genet som kode for T8-proteinet (20).

Muse L-celler uten tymidinkinase (tk) ble cotransformert med genomisk DNA fra T-celleleukemicellelinjen HUT-102 sammen med tk-inneholdende plasmid pTK (25, 26). tk<+>L-celletrans-formantene som uttrykker T-celleoverflateproteinene ble identifisert ved en rosetteringsanalyse. tk<+>koloniene ble utsatt for muse-monoklonale antistoffer rettet mot T4 og ble deretter inkubert med røde blodceller koblet til kanin anti-muse immunoglobulin. T4<+>transformanter er synlig røde i kraft av deres spesifikke assosiasjon med røde blodceller. På denne måten ble en primær T4<+>transformant, LTD-4, tilveiebragt. Ekspresjon av T4 molekylet ved hjelp av denne klonen ble uavhengig verifisert ved cytofluorometrisk analyse (figur 1).

mRNA-populasjonen til T4<+>transformanten, LTD-4, er bare forskjellig fra en utransformert L-celler når det gjelder ekspresjon av nylig transformerte gener. Disse sekvensene ble anriket for ved sammensmeltning av meget radioaktivt cDNA preparert fra poly(A)<+>RNA av T4<+>transformanten med et stort overskudd RNA fra en utransformert L-celle (32, 60). cDNA som ikke kan hybridisere, selv ved høye Rot-verdier, ble isolert ved hydroksyapatit-kromatografi og anvendt for a screene et humant perifert T-celle cDNA bibliotek konstruert i lambda-kloningsvektor gtlO. Fire svakt hybridiserende plakk ble identifisert, plakk-renset og analysert for tilstedeværelse av T4-sekvenser.

For å bestemme om noen av disse klonene kodet for T4 ble Northern blot-analyser utført med RNA fra T4<+>og T4~ perifere T-celler, leukemier, thymocytter, L-celletransformanter og ikke-lymfoid celler (figur 2). En av de fire klonene hybridiserte til et RNA tilstede bare i T4<+>celler. Denne klonen påviser et 3 kb RNA tilstede i T4<+>transformanten, LTD-4, som også er til stede i en populasjon av T4<+>perifere lymfocytter, i forskjellig T4<+>leukemi-cellelinjer og thymocytter. Ingen hybridisasjon ble observert med RNA fra utransformerte fibroblaster, T4" ferifere lymfocytter, HeLa-celler eller humane neuroblastom-celler.

Mønsteret for ekspresjon av RNA påvist av disse klonene er i samsvar med muligheten for at det koder for T4. Dette cDNA er derimot bare 0,6 kb i lengde, men hybridiseres til et 3 kb mRNA. Derfor ble det humane perifere T-celle cDNA biblioteket på ny screenet og en klon (pT4B) ble tilveiebragt som inneholdt et 3 kb innskudd, med nesten lik størrelse som det modne messenger-RNA. Restriksjonskart av denne klonen er vist i figurene 3A og 3B.

Genomisk blot- analyse

Southern blot eksperimentene (37) ble deretter utført for å demonstrere at den isolerte cDNA-klonen hybridiserte med DNA fra T4<+>transf ormanten samt humant DNA, men ikke med utransformert muse L-celle DNA (figur 4). Genomisk DNA fra forskjellige humane celler viser et sett på fem h<y>bridi-serende fragmenter etter spaltning med enzymet BamHI. Som ventet, kan T4-sekvenser bli påvist i transformanten LTD-4, men ikke i utransformert L-celle DNA. BamHI-fragmentet nærmest 3' enden av genet (6,6 kb) er ikke tilstede i LTD-4, sannsynligvis som en konsekvens av integrasjonshendelsen. Ingen større rearrangementer er derimot synlige ved dette analysenivået sammenlignet med DNA fra lymfoide celler og ikke-lymfoide celler. Summen av molekylvektene til de hybridiserende fragmentene er 33 kb og dette tyder på at T4-genet er meget stort. Et fullstendig sett av genomiske kloner som omfatter denne regionen ble tilveiebragt (se under) og BamHI-fragmenter ble ordnet ved restriksjonsanalyse av disse klonene (figur 3A), som bekrefter at genet er større og må inneholde introner med betraktelige lengder.

Ekspresjon av T4 cDNA i transformerte muse- fibroblaster Ytterligere bevis på at isolert cDNA koder for T4 ville bli tilveiebragt hvis denne klonen kunne omdanne fibroblaster til T4<+>fenotypen etter transformasjon. T4-genet i kromosomalt DNA er større og omfatter flere genomiske kloner. Derfor ble cDNA-klonen ført inn i to retrovirale ekspresjonsvektorer, pVcos7 og pMV6kt/neo, som inneholder Moloney murinleukemi-virus lange terminale gjentakelser (LTRer) som flankerer et enkelt EcoRI kloningsete (figur 3C). 5'-LTR fremmer transkripsjon gjennom kloningsetet og 3'-LTR inneholder sekvenser nødvendig for spaltning og polyadenylering. pMV6tk/neo vektoren inneholder også tk-promoteren koblet til den kodende regionen av neomycinfosfotransferase-genet. Konstruksjon som anvender pVcos7 krever transformasjon med en ikke-bundet selekterbar markør, mens pMV6tk/neo bærer neomycinresistens-markøren, som tillater bundet cotransformasjon. Neo<+>koloniene til NIH 3T3 cellene tilveiebragt etter transformasjon ble selektert ifølge deres evne til å vokse i medium inneholdende neomycin-analogen G418, og ble screenet ved anvendelse av rosetteringsprosedyren for å påvise ekspresjon av T4 på celleoverflaten. Omtrent 50% av G418-koloniene tilveiebragt med pVcos7 og 75% av koloniene tilveiebragt med pMV6tk/neo var positive for T4 i denne analysen. Rosett-positive kolonier ble videre analysert ved cytof luorometri for å bekrefte at T4 blir uttrykt på den transformerte celleoverflaten (figur 1).

Metabolske proteinmerkings-eksperimenter ble utført og demonstrerte at den T4<+>transformerte fibroblasten og T-lymfocytten uttrykt et T4-protein med identisk molekylvekt. Utransformerte NIH 3T3 celler, T4<+>transformanter og T-lymfocytter ble merket i 12 timer i nærvær av L-[<35>S]-metionin (41). Cellene ble opplyst med detergent og lysatet ble sendt gjennom linselektin-kolonner for å anrike for glykoproteiner (42). Den bundne glykoproteinfraksjonen ble eluert og immunopresipitert med monoklonale antistoffer rettet mot T4 (figur 5). Under reduserende betingelser blir et glykoprotein migrerende ved en relativ molekylmasse på 55 kd påvist i ekstrakter fra T-lymfocytter og to uavhengige T4<+>transformanter. Dette proteinet blir ikke påvist i kontroll 3T3 fibroblaster. Under ikke-reduserende betingelser blir et 51 kd glykoprotein immunopresipitert med anti-T4 i T-celler og i transformerte fibroblaster.

Disse eksperimentene demonstrerer at transformantene uttrykker et 55 kd glykoprotein immunopresipitert med anti-T4 som er lik i størrelse med det som blir uttrykt på overflaten av T-lymfocytter. Northern og Southern-analyser ved anvendelse av isolert cDNA, sammen med evnen som disse cDNA har til å utvise T4<+>fenotypen til muse-fibroblaster, angir derfor at hele den kodende sekvensen til T-celle overflateproteinet T4 er blitt klonet.

Nukleotidsekvensen til T4 cDNA og den utledete proteinsekvensen

Den fullstendige nukleotidsekvensen til den T4 kodende regionen ble bestemt ved sekvensering av begge trådene til 3 kb cDNA innskuddet ved anvendelse av dideoksy-terminerings-metoden (35, 36). Hele nukleotidsekvensen og den antatte proteinsekvensen er vist i figur 6. Den lengste åpne leserammen begynner i posisjon 76 med et metioninkodon omgitt av initieringskonsensus-sekvensen PurNNATGPur (61). Denne leserammen omfatter 1374 nukleotider og koder for et polypeptid inneholdende 458 aminosyrer. Sammenhengen til denne leserammen ble bekreftet ved innsetting av dette cDNA inn i RNA-ekspresjonsvektor psP6 (40). RNA syntetisert ved denne vektoren, når translatert in vitro, leder syntesen av et ikke-modifisert 51 kd protein, nøyaktig molekylvekt bestemt ut fra nukleotidsekvensen (figur 7).

T4 består av en ledersekvens, fire tandem variable-koblende (VJ)-lignende regioner og en membran-dekkende domene som hver er homologe med korresponderende regioner til forskjellige medlemmer av immunoglobulin-genfamilien (62, 63) (figurene 6 og 8). En rekke hydrofobe residier, korresponderende med et leder-peptid foreslått av et Kyte-Dolittle (64) hydro-patisitetsplott, følger rett etter initieringskodonet. Til tross for at den nøyaktige posisjon hvor det native T4-proteinet blir prosessert ikke kan bli bestemt antas det at spalting oppstår like etter treonin ved posisjonene 1 basert på kjente spaltningsmønstre (65). Derfor inneholder signal-peptidet 23 aminosyrer og prosessert T4-protein 435 residier. Residiene 1-94 til det modne proteinet deler både aminosyre og strukturell homologi med den variable domenen til immuno-globulinlettkjeden (figur 9A). Homologien mellom denne domenen og immunoglobulinvariable regioner er 32%. Sammenligning av sekvensen mellom V-regionene til lettkjedeimmuno-globulinene og den N-terminale V-lignende region (VI) til T4 demostrerer at åtte av 14 invariante residier blir konservert (66). Denne domenen inneholder to cysteinresidier, separert av 67 aminosyrer, hvor posisjonene derav og fordelingen (spacing) er analoge med det som finnes i lette immunoglobul inkjeder og beslektede molekyler (67). Disse cysteinene kan ha evne til å danne den konserverte intrakjede-disulfid-bindingen som er karakteristisk for V domener. Dette er underbyttet av vår observasjon om at T4 migrerer hurtigere under ikke-reduserende betingelser enn under reduserende betingelser og dette er i samsvar med dannelsen av minst en intrakjede-binding (figur 5, kolonnene e og f).

Bortsett fra homologier på det individuelle aminosyre-nivået har VI domenen til T4 strukturelle trekk felles med immunoglobulinvariable regioner. Variable og konstante immunoglobul indomener folder seg i et karateristisk mønster hvori en serie antiparallelle 3-tråder blir foldet og danner to p—ark (67, 68). Disse p-arkene blir holdt sammen med både en disulfidbro og ved hjelp av karakteristiske hydrofobe interaksjoner. For å bestemme hvordan den antatte sekundære strukturen til den V-lignende domenen til T4 kan sammenlignes med strukturen til V domenen til 1immunoglobulin-lette kjeder ble to-dimensjonale strukturelle oppstillinger utført. Et plott av sannsynlige p<->tråder go p<->dreininger i disse sekvensene ble tilveiebragt ved anvendelse av den empirisk avledede algoritmen til Chou og Fasman (69). Disse analysene foreslår tilstedeværelse av syv p<->tråder innenfor den V-lignenden domenen til T4 som nærmest matcher de som blir fundet i immunoglobulin V domenen (figur 9A). De to konserverte cysteinene til T4 finnes i p<->trådene B og F og til-svarer nøyaktig posisjonene til cysteinene i V-regionen som er kjent for å danne den konserverte disulfid-bindingen i immunoglobulinet. Et tryptofan-residie ligger 12 aminosyrer nedstrøms for det første cysteinet og et tyrosin-residie ligger to aminosyrer før det andre cysteinet. Disse residiene er meget karakteristiske i p-trådene C og F, respektivt i lettkjede V regionene. I tillegg finnes et aspartat-residie seks aminosyrer før det andre cysteinet og et arginin-residie ligger i bunden av p-tråden D. Disse ladede residiene er meget karakteristiske for V-domene (67). Deler av alter-nerende hydrofobe residier er tilstede i p<->trådene og dette styrker interaksjonen til de to p-arkene.

Vl-domenen til T4 ble etterfulgt av et antall aminosyre-residier med betraktelig homologi til de koblende (J)-regionene til immunoglobulinene og T-celle antigenresep-torene. I figur 9B er denne J-lignende region til T4 oppstilt med konsensus-koblende sekvenser til innumoglobulin-lettkjedene og de to kjedene til T-celle antigenreseptoren. Denne J-lignende regionen blir etterfulgt av 265 aminosyre som strukturelt kan bli delt inn i tre ytterligere VJ-lignende domener med statistisk signifikant sekvens og strukturell homologi med protype-immunoglobulin VJ-regionene (figurene 6 og 8). I tillegg inneholder denne sekvensen to potensielt N-bundne glykosyleringsseter (Asn-Leu-Thr; figur 6).

The ekstracellulære domene blir etterfulgt av en antatt transmembran-sekvens, forutsatt av et hydropatisitetsplot (64), som bare inneholder hydrofobe og nøytrale aminosyre-residier. Dette segmentet er meget homologt med transmembran-eksonet til p-kjedene til klasse II hoved-histokompatibili-tetsproteinene (figur 9C). Oppstilling av transmembran-regionene til T4 og MHC klasse II p-kjedene viser 48% homologi uten mellomrom. Etter det membran-dekkende segmentet omfatter den cytoplasmiske domenen en meget ladet sekvens på 40 aminosyrer (figurene 6 og 8).

T4- genet: Kromosomal beliggenhet og intro- exon posisjoner

T4 cDNA ble anvendt for å bestemme den kromosomale beliggenheten til T4-genet ved analysering av dets mønster ved segregering i et panel bestående av muse-humane somatiske cellehybrider og ved in situ hybridisering til humane metafase-kromosomer (101). Genomiske blot-eksperimenter og in situ hybridisasjon viser at T4-genet er beliggende på den korte armen av humant kromosom 12, mellom regionene 12pl2 og 12pter.

Et sett overlappende genomiske kloner omfattende T4-genet ble tilveiebragt ved screening av humane genomiske bibliotek konstruert i lambda kloningsvektorene Charon 4 og EMLB-3 (31) med et radioaktivt-merket pT4B cDNA-innskudd (70). Karakterisering av disse klonene ved både restriksjons- og Southern blot-analyser tyder på at de inneholdt hele T4-kodende sekvens. Den fullstendige intron-exon organisasjonen av T4-genet ble deretter bestemt ved sekvensering av spesifikke fragmenter av de genomiske klonene ved anvendelse av dideoksy-termineringsprosedyren (35, 36).

T4-genet består av 9 exoner delt opp med 8 introner som vist i figurene 8 og 10. Det første exonet inneholder den 5'-utranslaterte regionen og ledersegmentet. Den første variable-lignende domenen, , er delt opp av et større intron beliggende i nukleotid-posisjon 289 (figur 6). Derfor blir V-lJ^domenen kodet av den andre og tredje exonen og VgJ2'<V>3<J>3><V>4<J>4 °S transmembran (TM) domenene blir hver kodet av separate exoner (exonene 4-7). Den cytoplasmiske domenen (CYT) er delt opp med et intron og den siste delen av cytoplasma-domenen og den 3'-utranslaterte regionen blir kodet av det niende exonet.

Konstruksjon av T4± og T8± transformerte celler

Den eksperimentelle tilnærmingen anvendt for å studere rollen til T4 i AIDS-virus infeksjon omfattet først innføring av T4-genet inn i T4~ cellelinjer uten evne til å understøtte viralinfeksjon. De transformerte cellene ble derettet testet for mottakelighet for AIDS-virus, etterfulgt av studier av mekanismen som fører til T4-formidlet viralinfeksjon.

En full-lengde cDNA-klon som kode for overflateproteinet T4 ble subklonet inn i den retrovirale ekspresjonsvektoren pMV7. Ekspresjonsvektor, pMV7 (figur 11A), inneholder to direkte gjentatte Moloney-murin sarcomavirus lange terminale gjentakelser (LTRer) som flankerer et enkelt EcoRI-kloningssete. 5'-LTR fremme konstitutivt transkripsjon gjennom klonings-setet, mens 3'-LTR tilveiebringer sekvenser nødvendige for spaltning og polyadenylering av RNA. pMV7 inneholder i tillegg herpesvirus thymidinkinase-promoteren (tk) koblet til den kodende regionen til det bakterielle neomycin-fosfo-transferasegenet (neo), en dominant selekterbar markør som muliggjør bundet cotransformasjon og infeksjon.

T4-pMV7 ble ført inn i x-2 og x-AM celler, NIH 3T3 cellelinjer inneholdende defekte ekotrofiske og amfotrofiske provirus, respektivt (figur 11B) (44, 59). Begge cellelinjene kan ikke føre endogent viralt RNAinn i kappene, men kan tilveiebringe alle nødvendige transvirale funksjoner. Stabil transfeksjon av disse cellelinjene med T4-pMV7 resulterer i produksjon av rekombinante retrovirale masser som koder for T4 som er fri for hjelper-virus. Disse rene virale massene kan deretter bli anvendt for effektivt å introdusere T4-sekvenser inn i både muse og humane celler uten produksjon av retrovirus ved hjelp av målcellen.

T4-pMV7 DNA ble ført inn i x-2 cellene ved anvendelse av DNA-formidlet genoverføringsprosedyren (figur 11B) (25, 27). Neo<+>positive kolonier ble selektert i kraft av deres evne til å vokse i medium inneholdende neomycin-analogen G418 (Geni-ticin) og screenet for ekspresjon av T4 på celleoverflaten ved anvendelse av en ovennevnt rosetteringsanalyse (20, 70). Kolonier av transfiserte x-2 celler som uttrykker T4 ble deretter identifisert og som produserer rekombinante retro virus i titre på IO<5>cfu/ml. T4<+>x-2 klonene ble deretter anvendt for å danne retrovirus som kan infisere muse x-AM celler. T4 uttrykkende x-AM kloner ble isolert og disse ga rekombinante retrovirale titre på IO<4>cfu/ml. T4<+>humane transformanter ble dannet ved co-kultivering av cellene med mitomycin-C behandlede eller x-AM kloner (figur 11B). T4<+>transformantene ble deretter analysert ved Northern blot analyser og flow-cytometri for å bekrefte at T4 blir uttrykt og er tilstede på celleoverflaten. Kontroll-cellelinjer som uttrykker overflateproteinet T8 ble konstruert på analog måte.

T4 er vesentlig for AIDS- virus infeksjon

For først å bestemme om tilstedeværelse av T4-proteinet på overflaten av en human lymfocytt er tilstrekkelig for å gjøre cellen mottakelig for AIDS-virus infeksjon ble transformanter av den primitive T-celle leukemi1injen, HSB2 (71), som bare uttrykker de tidlige T-lymfocyttproteinene Tl og Til på det overflate, konstruert. HSB2 uttrykker verken T4 eller T8 og heller ikke T-celle antigenreseptor eller det assosierte komplekset til T3-proteiner. Transformanter av HSB2 som verken uttrykker T4 eller T8 proteinene på celleoverflaten ble valgt og anvedt for å bestemme mottakeligheten til disse cellelinjene overfor AIDS-virus infeksjon. Flere forskjellige eksperimentelle forsøk ble anvendt for å vurdere AIDS-virus Infeksjon, omfattende ekspresjon av revers transkriptase (52), ekspresjon av virus i cytoplasma til celler ved immunofluorescens-mikroskopi (46), påvisning av virale antigener i kutursupernatanten ved anvendelse av en immunoanalyse (47), samt produksjon av infeksiøse vira ved supernatant subkultur med fytohemagglutinin (PHA)-stimulerte perifere lymfocytter (46). Ved anvendelse av disse analysene ble AIDS-virus infeksjon av HSB2-cellelinjen ikke observert (tabell I). Det har i tillegg tidligere blitt demonstrert at omfattende cellefusjon oppstår når ikke-infiserte human celler som bærer reseptorer for AIDS-virus blir dyrket sammen med celler som produserer AIDS-virus (54). I denne analysen er det ingen induksjon av syncytia når HSB2-cellene blir blandet med AIDS-virus-produserende H9-celelr (tabell I), til tross for at mye syncytia blir dannet med HTLV-I og HTLV-II produserende celler (data ikke vist).

Innføring av virus ble undersøkt ved anvendelse av pseudotyper av visikulære stomatitis-virus (VSV) som bærer kappeproteinene til AIDS-viruset (tabell I) (53, 54). Når cellene som er blitt infisert med AIDS-virus blir superinfisert med VSV danner en del av avkommet tilstrekkelig AIDS-virus kappeglykoprotein til å motstå nøytralisering ved hyperimmunt anti-VSV serum. Vertsomfanget til disse VSV (AIDS) pseudo-typevira er begrenset til celler som uttrykker reseptorer spesifikke for AIDS-viruset. Etter penetrering av cellen og kappefjerning av vira replikerer det transkapsiderte VSV-genomet for å danne ikke-pseudotype partikler. I løpet av den sekundære infeksjonen penetrerer VSV-avkom frigjort fra de infiserte cellene og ødelegger ved siden av liggende indikatorceller resistente overfor VSV (AIDS) pseudotypeinfeksjon (mink CCL64 eller bovine MDBK-celler), som resulterer i dannelsen av VSV-plaque som deretter blir registrert. Infeksjon med VSV (AIDS) pseudotyper tilveiebringer derfor en kvantitativ cytopatisk plaque-analyse for viral innføring (54). I denne analysen ble ingen plaque over bakgrunnen observert når HSB2-cellene ble utsatt for VSV (AIDS) pseudotyper (tabell I). I kontrolleksperimenter med pseudotyper av VSV RNA innkapslet i en HTLV-1 kappe (VSV (HTLV-I)) ble mange plaque observert og dette demonstrerer at HSB2-cellen, som inneholder HTLV-I resektorer, effektivt kan replikere VSV. Disse observasjonene demonstrerer at VSV-genomet innkapslet i en AIDS-virus kappe ikke kan gå inn i HSB2-celler.

Om innføring av et funksjonelt T4 cDNA inn i HSB2 ville gjøre denne cellen mottakelig for AIDS-virus infeksjon ble deretter studert (tabell I). Utsetting av HSB2-T4<+>transformanter for AIDS-virus resulterer i en produktiv viral infeksjon ifølge bestemmelse ved ekspresjon av revers transkriptase-aktivltet (52), ekspresjon av virus i cytoplasmaet til cellen ved immunofluorescens-mikroskopi (46), påvisning av viral antigen i kultursupernatanten ved anvendelse av en immunoanalyse (47), samt produksjon av infeksiøse virus ved supernatant subkultur med PHA-stimulerte lymfocytter (tabell I) (46). Kontroll HSB2-T8"1" cellene var negativ i hver av analysene.

I tillegg ble effektiviteten hvorpå forskjellige T4<+>T-celler ble infisert med AIDS-celler også undersøkt. HSB2-T4<+>og HSB2-T8"1" transf ormanter, det naturlig isolerte T4<+>T-cellelinje CEM, samt PHA-stimulerte perifere lymfocytter utsatt for 10-gangers fortynninger i serie av AIDS-virus, vasket og sådd ut i mikrokultur. Frekvensen av infiserte kulturer ble deretter bestemt ved anvendelse av en immunoanalyse 12 dager etter utsetting for virus (figur 12) (47). På denne måten ble titre til AIDS-viruset nødvendig for å infisere 50% av de utsatte kulturene (ID-50) definert. ID-50 til PHA-stimulerte perifere lymfocytter er 2-3 størrelsesorden høyere enn det som blir observert for enten naturlig-isolerte eller transformerte T4<+>cellelinjer. Effektiviteten av infeksjon av HSB2-T4<+>cellene er omtrent 10.ganger høyere enn det som blir observert for den naturlig-isolerte T4<+>T-cellelinjen CEM (figur 12). Kontroll HSB2-T8<+>celler er ikke mottakelige for infeksjon selv ved de høyeste undersøkte virustitrene.

Evnen som HSB2-T4<+>cellene har til å understøtte både syncytia-dannelsen og replikasjon av VSV (AIDS) pseudotyper ble også undersøkt. Når HSB2-T4<+>cellene blir dyrket sammen med AIDS-virus produserende H9-celler oppdages syncytiadannelse lett i løpet av 18 timer (tabellene I og II). Syncytikum-induksjon blir opphevet ved forbehandling av kulturene med anti-T4A monoklonalt antistoff (tabell II). Når HSB2-T4<+>cellene blir utsatt for VSV (AIDS) pseudotyper blir infeksiøse VSV-partikler som ødelegger ved siden av liggende indikatorceller produsert (tabellene I og III). Videre blir plaque-dannelse hemmet ved forbehandling med enten anti-AIDS virus antistoff eller anti-T4A monoklonalt antistoff (tabell III). Kontroll HSB2-T8<+>cellene er negative i hver av de syv analysene anvendt for å påvise AIDS-virus infeksjon (tabellene I, II og III). Disse observasjonene tilveiebringer genetisk bevis på at i en umoden human T-lymfocytt vil bare tilstedeværelse av T4-proteinet tilveiebringe en vesentlig funksjon nødvendig for AIDS-virus infeksjon.

2 x IO<5>celler ble dyrket sammen med 2 x IO<4>AIDS-virus-produserende H9-celler (H9/AIDS) og inkubert ved 37°C. Kulturene ble undersøkt for syncytiadannelse etter 18 timer. Resultatene er uttrykt som tilnærmet prosentandel kjerner innbefattet innenfor syncytia: - (ikke syncytia); ++ (25%); +++ (50%); +++++ (90%); I.B. (ikke bestemt). Syncytium-hemming ble analysertved tilsetning av anti-T4A monoklonalt antistoff (aT4A; 1:20) til de blandede kulturene ved tids punkt for såing. Naturlig-isolerte T4<+>T-cellelinjene JM og 8166 virket som positive kontroller i disse studiene. 2 xIO<5>celler ble inkubert ved VSV (AIDS) pseudotyper (53, 54) i 1 time ved 37°C. Cellene ble deretter vasket og 1 x IO<6>mink CCCL64 eller bovie MDBK plaque-indikatorceller, mottakelige for VSV-infeksjon, men resistente overfor VSV (AIDS)., ble satt til hver brønn. Kulturene ble deretter belagt med agar-medium og registrert for VSV-plaque to dager etter infeksjon. Anti-T4A monoklonalt antistoff (aT4A; 1:20) eller anti-AIDS virus-serum (ocAIDS; 1:10) ble anvendt for å hemme VSV (AIDS) pseudotype-plaquedannelse ved forbehandling av cellene 30 minutter før utsetting for pseudotyper (54). VSV (HTLV-I) pseudotypene som kan plates ut på mange forskjellige humane celletyper (54), ble anvendt som kontroller i disse eksperimentene. Anti-HTLV-I serum (1:10) ble anvendt for å blokkere VSV (HTLV-I) pseudotype plaque-danning. Resultatene er uttrykt som PFU/ml; I.B. (ikke bestemt).

AIDS- virus infeksjon er ikke begrenset til T- lymfocytter

Et funksjonelt T4 cDNA ble ført inn i to humane ikke-T-cellelinjer: HeLa, en epitelisk cellelinje avledlet fra et servikalt carcinom (72) og Raji, en B-lymfoblastoid cellelinje avledet fra en pasient med Burkitfs lymfom (73) (figur 11B). Før retrovirus-formidlet gen-overføring uttrykker disse cellelinjene ikke overflate T4-protein eller T4 mRNA og de er heller ikke mottakelige for AIDS-virus infeksjon (tabell I). I tillegg understøtter de parentale cellelinjene ikke induksjon av syncytium eller utsåing av VSV (AIDS) pseudotyper (tabellene I, II og III).

I kontrant til dette understøtter T4<+>Raji og HeLa transformantene AIDS-virus infeksjon i alle ovennevnte kriteriene (tabell I). Effektiviteten hvorpå Raji-T4<+>cellene kan bli infisert med AIDS-virus er tilnærmet det samme som for HSB2-T4<+>cellene og er omtrent 10 ganger høyere enn effektiviteten for infeksjon av den naturlig-isolerte T4<+>T-cellelinjen CEM (figur 12). Ved samdyrkning med AIDS-virus-produserende H9-celler understøtter Raji-T4<+>og HeLa-T4<+>cellene induksjon av syncytia som er opphevet i forbehandlede kulturer med anti—T4A monoklonalt antistoff (tabellene I og II; figur 13). Utsetting av disse cellene for VSV (AIDS) pseudotypene resulterer i produksjon av infeksiøs VSV og dannelse av plaque som blir hemmet ved forhandling med anti-AIDS virus antistoff eller anti-T4A monoklonalt antistoff (tabellene I og III). Kontroll Raji-T8<+>og HeLa-T8<+>transformantene er negative i hver av disse analysene (tabellene I, II og III).

Innføring av et funksjonelt T4-gen inn i enten humane T-lymfocytter, B-lymfocytter eller epiteliske celler er derfor tilstrekkelig for å gjøre slike celler mottakelige for AIDS-virus infeksjon. Disse observasjonene viser at T4<+>T-celle-trofisme observert in vivo er en konsekvens av den hemmede ekspresjonen av T4-molekylet og ikke av naturen til celle-typen som den blir uttrykt i.

AIDS- virus bindes til overflate T4 protein

De tidligere eksperimentene tilveiebringer genetisk bevis på at T4 ekspresjon er nødvendig for AIDS-virus infeksjon, men gir ikke noen informasjon når det gjelder rollen til dette molekylet i den virale livssyklusen. Observasjonen at overflateekspresjon av T4 er nødvendig for AIDS-virus infeksjon foreslår at T4 er AIDS-virus reseptoren. Cytofluorometri ble derfor anvendt for å undersøke binding av AIDS-virus til overflatene av T4<+>og T8<+>transformerte humane celler (tabell I; figur 14). HSB2, Raji, HeLa-cellene og T4 + eller T8<+>transformantene ble inkubert med AIDS-virus. Etter viral absorpsjon ble cellene vasket, utsatt for fluorescens-konjugert anti-AIDS virus antistoff og analysert ved flow-cytometri. Denne analysen viste at AIDS-viruset bindes effektivt og spesifikt til de humane transformantene som uttrykker overflate T4, men ikke til T4~ parentale celler eller til T8<+>transformantene (figur 14, kolonne B; tabell I). Binding av AIDS-virus til T4+ cellene blir opphevet ved preinkubasjon med anti-T4A monoklonalt antistoff, men ikke ved preinkubasjon med anti-T8 monoklonalt antistoff (figur 14, kolonne C). Når derimot T4<+>transformerte celler blir utsatt for AIDS-virus copresipiteter T4 glykoproteinet med det virale kappe-glykoproteinet, og dette tyder på en direkte fysiologisk assosiasjon mellom disse molekylene (data ikke vist). Disse resultatene indikerer at AIDS-viruset bindes til T4-molekylet på celleoverflaten og at denne bindingen er uavhengig av andre T celle-spesifikke proteiner på grunn av at bindingen oppstår på alle undersøkte T4<+>celletypene.

Tidligere studier har beskrevet to bestemte ruter for innføring av kappebelagte virus (74, 75, 76, 77). Noen virus kobles direkte til plasmamembranen og frigjør kjernekapsidene inn i cytoplasma, mens andre utfører reseptor-formidlet endocytose. Det sure miljøet til endosome letter deretter fusjonen av viralkappen med den begrensende membranen til vakuolen. Infeksjon av virus som går inn i celler via den endocyttiske ruten kan hemmes ved behandling av cellene med midler så som svake baser som de-surner andosome (58, 78, 79, 80). I nærvær av ammoniumklorid blir fusjonen blokkert i endosomet, men lysosomal degradering foregår enda ved en redusert hastighet (80).

Effekten av ammoniumklorid på AIDS-virus infeksjon av T4<+>T-cellelinjen JM ble derfor undersøkt. I fravær av ammoniumklorid uttrykker over 50% av JM-cellene utsatt for AIDS-virus virale antigener fem dager etter infeksjon, bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi. Dersom JM-cellene blir utsatt for ammoniumklorid (i 6 timer) enten ved tilsetning av virus eller i løpet av 30 minutter etter tilsetning av virus, ble mer enn 95% hemming av viral infeksjon observert. Dersom cellene ble behandlet med ammoniumklorid en time etter tilsetning av virus ble ingen hemming av infeksjonen observert. Dette funnet er i samsvar med kinetikken til viral innførsel beskrevet for andre virus som går inn i cellene via reseptor-formidlet endocytose. Ammoniumklorid-effekten var fullstendig reversibel. Celler utsatt for ammoniumklorid i en time og deretter vasket slik at de ble fri for forbindelsen og utsatt for AIDS-virus, understøttet kontrollnivåene av viral infeksjon. Disse resultatene er i samsvar med tidligere observasjoner at ved fjerning av ammoniumklorid blir pH til endosome igjen redusert til de opprinnelige lave verdiene i løpet av 1-2 minutter (78, 80). Ligningende resultater ble tilveiebragt med amantadin som er en forbindelse som de-surner endosomet.

Disse resultatene er i samsvar med en mekaniske for viral innførsel som omfatter endocytose av T4-AIDS viruskomplekset og lav pH-indusert fusjon av viralkappen med den begrensende membranen til endosomet som frigjør det virale nukleokapsidet inn i cytoplasma til cellen.

T4 mRNA blir uttrykt i hjernen

I tillegg til ødeleggelse av det cellulære immunsystemet medfører AIDS ofte sentralnervesystem (CNS) forstyrrelse som antas å være en konsekvens av den direkte infeksjonen av hjerneceller ved AIDS-viruset (81). Det var derfor av interesse å bestemme om T4 blir uttrykt i cellene innenfor CNS som dermed tilveiebringer en forklaring for de neurotrofiske egenskapene til viruset. Northern blot analyser av RNA preparert fra både humane hjerner og muse-hjerner ble utført for å bestemme om T4 mRNA-sekvenser blir uttrykt i CNS (figur 15). Poly(A)<+>RNA isolert fra human hjernebark inneholder to distinkte T4 mRNA med molekylvekter på omtrent 3 og 1,8 kb (figur 15A). Det svakere 3 kb RNA er identisk i størrelse med mRNA uttrykt av to T4<+>leukemiske cellelinjer, U937 (monocyttisk cellelinje) og Jurkat (T-cellelinje), samt av perifere T-lymfocytter. De mindre, hyppigere 1,8 kb mRNA som ikke er i T-lymfocytter kan oppstå fra alternativ spleising eller alternativ 5' eller 3' terminale ender.

En mer nøyaktig analyse av beliggenheten av T4 mRNA ble utført ved isolering av poly(A)<+>RNA fra spesifikke regioner av musehjernen (figur 15B). Hybridisasjon med radioaktivt merket cDNA som koder for den murine analogen av T4, L3T4, viser et intenst 2,2 kb mRNA i mus forhjerne som er fra-værende fra bakhjerne-prøvene. 2,2 kb L3T4 mRNA kan påvises i barken, hypotalamus og er rikest i striatum, men er fra-værende cerebellum, hjernestamme eller ryggraden (data ikke vist). Dette 2,2 kb mRNA påvist i CNS er omtrent 1 kb mindre enn 3,2 kb mRNA som koder for L3T4 i thymocytter (figur 15B). Disse resultatene indikerer at neurotrofismen tilveiebragt av AIDS-viruset er sannsynligvis resultatet av overflateekspresjon av T4-molekylet på hjerneceller. mRNA-nivået påvist i forhjernen er omtrent 1/30 av nivået i thymocyttene. Dette kan tyde på lavt ekspresjonsnivå i et større antall celler eller høyere ekspresjonsnivåer i små subpopulasjoner av celler. Det er for tiden ikke kjent om T4 blir uttrykt av neuroner eller understøttende celler. Tilstedeværelse av et variant-transkript i CNS gjør det usannsynlig at T4 mRNA i hjernen blir uttrykt av den sjeldne invaderende T-lymfo-cytten .

Segregasjon av T4 og T8 med funksjonelt distinkte undergrupper av T-celler foreslår at disse molekylene kan være viktige ved interaksjon av T-lymfocytter med hensiktsmessige målceller. Som et første trinn for forståelse av den spesifikke rollen til disse proteinene hie cDNA kloner tilveiebragt av både T4 og T8 molekylene og deres nukleotid-sekvenser ble bestemt (20, 70). Sammenligning av de utledede proteinsekvensene til T4 og T8 viser at disse molekylene har betraktelig sekvens og strukturell homologi med de variable (V) immunoglobulin-domener og som medlemmer av immunoglobulin-supergenfamilien. De N-terminale V-lignende domene til T4 og T8 er meget forskjellige: de deler bare 28% homologi og er derfor mindre homologe i forhold til hverandre enn hver er i forhold til immunoglobulin-lettkjedene (figur 9A). Regionen med maksimal konservering mellom T4 og T8 er også de regionene med sterkest homologi til immunoglobulin og T-celle reseptor V-regionene. Immunoglobulin-lignende domener til disse to molekylene viser til tross for at de er strukturelt like betraktelig sekvens-divergens som er i sansvar med hypotesen om at de gjenkjenner forskjellige molekyler på forskjellige undergrupper av målceller.

Den strukturelle homologien i V-lignende region som er felles i de N-terminale domenene til T4 og T8 kan være av spesiell viktighet for funksjonene til disse proteinene. Nesten alle medlemmene av . immunoglobulin-supergenfamilien deltar i immunresponsen (62). De individuelle medlemmene av denne familien viser en sterk tendens til å assosiere med hverandre for å danne dimerer. Denne assosiasjonen er tydelig ved interaksjon av tunge og lette immunoglobulinkjeder, alfa og beta kjedene til T-celle antigenreseptoren, Pg-111*111,0!?!0^1*11og klasse I MHC-proteinene og alfa og beta kjedene til klasse II MHC-molekylene. T8 glykoproteinet danner en disulfid-binding med T6, et antatt MHC-lignende molekyl, på overflaten av thymocytter (82), og eksisterer som multimerer av 32 kd subenheten på perifere T-lymfocytter (83). Tilstedeværelse av fire V-lignende domener i T4 tyder på at disse regionene assosierer seg med hverandre samt med spesifikke ligander på overflaten av andre celler eller virus. Disse spesifikke affinitetene til de immunoglobulin-lignende molekylene kan være viktig for gjenkjennings-funksjonene til T4 og T8.

Evolusjon av T4

I immunoglobulinet og T-celle antigenreseptorgenene er V og J eksonene veldig separert og blir sidestilt bare etter en somatisk rekombinasjon (62, 63). T4 mRNA kode for fire tilstøtende V- og J-lignende elementer uten at DNA rekombinasjon er nødvendig. Det er derfor mulig at T4 reflekterer et mer primitivt gen som ble utviklet før rearrangerings-mekanismene oppstod. Ytterlige støtte for dette kommer fra observasjoner om at den første V-lignende regionen til T4 (VI) er delt av et intron som ikke er til stede i V-genene som koder enten for immunoglobulinene eller T-celle antigen-reseptorene. Akkumulerende spor foreslår at det er mye mer sannsynlig at intronene blir nøyaktig fjernet i løpet av evolusjonen enn at intronene blir satt inn ved tidligere intron-fritt område. T4 kan derfor representere et arvet immunoglobulin-gen som har vært gjenstand for duplikasjoner, divergens og omarrangering for dannelse av nåtidens immunoglobulin-genfamilie. Til tross for at T4 nå er funksjonell i et mye mer omfattende immunsystem kan T4 reflektere reseptorer som er operative i mer primitive cellulære immunresponser. Primitive immunresponser, så som de til de virvelløse dyrene, ser ikke ut til å omfatte et uensartet repertoar av reseptormolekyler, men er i de enkleste tilfel-lene begrenset til en sjeldning mellom selv og ikke-selv (85, 86) og er sannsynligvis innbefattet i et "statisk" sett av gener som ikke er utsatt for rearrangering.

Uansett hvordan T4 har vært i evolusjonen tilveiebringer organiseringen av dette genet et interessant eksempel på exon-skyfling. T4 består av fire V-J-lignende domener, en J-lignende region og et transmembran-segment som hver er homologe med forskjellige medlemmer av immunoglobulin-supergenfamilien. De V- og J-lignende domenene er homologe til de ekvivalente regionene til begge immunoglobulinene og T-celle antigenreseptorkjedene; den transmembrane domenen viser betraktelig homologi med denne region i p-kjedene til klasse II MHC molekylene (figur 9C). T4 består derfor av en samling exoner som er konservert i flere ledd av immunoglobulin-supergenfamilien som blir flyttet på forskjellige måter for å danne et stort antall forskjellige molekyler som deltar i immunresponsen.

T4 er AIDS- virus reseptoren

Data tilveiebragt heri foreslår en mekaniske for AIDS-virus infeksjon som opprinnelig omfatter spesifikk assosiasjon av AIDS-viruset med T4-molekyler på celleoverflaten. Denne assosiasjonen kan demonstreres på T-lymfocytter, B-lymfocytter og epiteliske celler og krever derfor ikke deltakelse av ytterligere T-celle-spesifikke proteiner. I tillegg tilveiebringer dataene at T4-AIDS-virus komplekset blir tatt inn via reseptor-formidlen endocytose og viralkappen kobles deretter til den begrensende membran til endosomet som frigjør nukleokapsidet inn i cytoplasma. Viral replikasjon og transkripsjon kan deretter oppstå i både lymfoide og ikke-lymfoide cellelinjer. T4-genet blir videre uttrykt i hjernen samt i lymfocytter og tilveiebringer forklaringen for den doble neurotrofiske og lymfotrofiske karakteren til AIDS-viruset. På denne måten er et T-lymfocytt overflateprotein som er viktig for formidling av effektor celle-målcelleinteraksjoner blitt utnyttet av et humant retrovirus for føring av AIDS-viruset til populasjoner av T4<+>celler.

Celleoverflatereseptorer er blitt identifisert for et antall kappebelagte virus og mønstre for ekspresjon til disse reseptorene er ofte ansvarlige for vertsomfanget og trofiske egenskaper til de spesifikke virusene (74, 76 ). Noen virus vil bare infisere et snevert antall celletyper som viser ekspresjonen av den virale reseptoren på spesifikke popula sjoner av målceller. Rabies-virus reagerer for eksempel med nikotinacetylcholin-reseptoren (87) og infiserer skjelett-muskler og neuroner, mens Epstein-Barr virus reagerer med C3d komplementreseptortype 2 (88) og infiserer B-lymfocytter. Andre virus, så som myksoviruser, reagerer med allesteds-nærværende fordelte sialensyreresidier på celleoverflaten og infiserer et bredere antall celletyper.

Den hemmede ekspresjonen av celleoverflate-reseptorer tilveiebringer bare en forklaring for viral trofisme. Noen virus vil bare replikere i et mindre sett av differensierte celletyper mens andre bare blir effektivt transkribert i spesifikke celletyper. Moloney murin leukemi-virus (Mo-MuLV) induserer T-celle lymfomer i nyfødte mus, mens det nær beslektede Friend helper murin leukemi-virus (Fr-MuLV) induserer hovedsakelig erytroleukemier (89, 90, 91). Denne trofismen antas å være et resultat av forskjeller i LTRene som letter den effektive transkripsjonen av Mo-MuLV genomet i T-lymfocyttene og Fr-MuLV genomet i erytroid-forløperene (92, 93, 94).

Som angitt heri er den primære trofiske determinanten til AIDS-viruset ekspresjon av T4-proteinet på overflaten av målcellene. In vivo infeksjon er begrenset til lymfoidceller og myeloidceller samt hjerneceller: tre populasjoner som uttrykker T4. In vitro demonstrasjoner indikerer at introduksjon av T4 i T4~ humane B-lymfocytter og epitel i ske celler, celler som ikke er naturlige mål for AIDS-virus, gjør disse cellene mottakelige for produktiv infeksjon med AIDS-virus .

Eksempel 1: Oppløselige T4- fragmenter

Oppløselige T4-glykoproteinfragmenter blir preparert ved anvendelse av begrenset protease-spaltning fra celle-preparater. DNA-ekspresjonsvektorer som koder for T4-fragmenter som mangler den transmembrane domenen, en region inneholdende naturlige og hydrofobe residier, kan bli konstruert og anvendt for å produsere slike T4-fragmenter. Disse fragmentene er oppløselige i vandige oppløsninger og inneholder leder (signal) sekvenser. Når de blir uttrykt i pattedyr-cellene blir disse fragmentene transportert til det grove endoplasma-retikulum/golgi-komplekset og til slutt utskilt fra cellene.

Eksempel 2: Behandling av AIDS- pasienter

Oppløselige T4-glykoproteinfragmenter er beskrevet i eksempel 1 vanligvis i en farmasøytisk akseptabel bærer, blir administrert i pasienter infisert med et humant immunsvikt-virus slika at det blir bundet til virus til stede i blodet til individet og andre kroppsvæsker og blokkerer infeksjon av T4<+>cellene in vivo. Alternativt eller i tillegg blir pasientens blod sendt gjennom en kolonne inneholdende enten immo-biliserte T4-glykoproteiner er oppløselige T4-fragmenter slik at viruset kan bli separert fra blodet. Slike målinger tillater at immunsystemet oppnår en mer effektiv immunologisk respons overfor viruset, d.v.s. tillater at uinfiserte T4<+>T-celler prolifererer.

Oppløselige T4-fragmenter blir anvendt som et preparat, d.v.s. en hemmer for ekstracellulær og celle-celle spredning av HIV-infeksjon. Det er oppdaget at oppløselige T4-fragmenter hemmer HIV-binding in vitro til, og infeksjon av, T4<+>målcellene (se eksempel 4). Administrasjon av oppløselige T4-fragmenter til personer infisert med HIV hemmer ekstracellulær spredning av virusinfeksjonen. Kobling av HIV-infiserte T4<+>celler og uinfiserte T4<+>celler, som også utgjør en vei hvorved viruset blir spredd, blir hemmet av administrasjon av oppløselige T4-fragmenter.

Administrasjon av oppløselige T4-fragmenter gjør at forløpet av sykdommen fremskrider saktere, lindrer flere symtomer knyttet til AIDS og forhindrer at nye patologiske forandringer oppstår.

Oppløselige T4-fragmenter som er biologisk rene og vandige oppløselige reagenser blir sammen anvendt med andre reagenser for å analysere etter konkurrenter til T4-HIV interaksjonen. Oppløselige T4-fragmenter i kombinasjon med HIV kappeproteinene eller biologiske blandinger inneholdende HIV kappeproteinene blir dermed anvendt for å screene for hemmere av viral binding.

Eksempel 3: Produksjon av oppløselige T4- fragmenter

Et cDNA kodende for det membran-bundne T4-proteinet (pT4B) er blitt isolert,karakterisertog uttrykt i mange pattedyr celletyper (70). Oppløselige T4-fragmenter blir produsert i bakterielle, gjær-, insekt- og pattedyrsystemer. På grunn av at T4-proteinet foldes på en kompleks måte og blir glykosylert er ekspresjon i pattedyrsystemer foretrukket. Opplø-selige T4-fragmenter blir produsert av forkortet pT4B etter V4J4-domenen. Slike DNA-fragmenter terminerer før transmembran-segmentet som begynner ved omtrent nukleotid-posisjon 1264 (figur 6). Dette rekombinante DNA-molekylet mangler både transmembran-domene og cytoplasma-domenene. EcoRI-Hpall fragmentet som omfatter nukleotidene 1 til og med 1252 blir isolert ved å fjerne de fra mindre pT4B fragmenter. Alternativt blir bare det membran-dekkende segmentet deletert og etterlater V4J4-domenen koblet til den cytoplasmiske domenen. En måte er å deletere fragmentet omfattende Hpall-setene fra nukleotidene 1252-1342 fra pT4B. Slik konstruksjoner opprettholder T4-signalsekvensen nødvendig for innføring inn i det rue endoplasmiske retikulum/golgi-komplekset og blir deretter utskilt fra cellen. Disse konstruksjonene opprettholder i tillegg den ekstracellulære delen av TG4-proteinet hvori bindingsdomenen for humant immusvikt-virus kappeglykoprotein eksisterer.

For å uttrykke oppløselige T4-fragmenter i pattedyrsystemer blir det modifiserte T4 cDNA-fragmentet subklonet inn i vektorene inneholdende sterke eukarote promotere/"enchancer" samt polyadenylerings-setene nødvendig for spaltning og polyadenylering av RNA. Simianvirus (SV40) tidlig promoter og enhancer er for eksempel beliggende oppstrøms fra det oppløselige T4 cDNA-fragmentet. Transkripsjonsterminering og RNA polyadenylering ble oppnådd ved plassering av poly-adenuleringssetet av enten SV40 eller det humane veksthormongenet nedstrøms fra det oppløselige T4 cDNA-fragmentet. Introduksjon av en konstruksjon inneholdende disse elementene sammen med en selekterbar markør inn i eukarote celler ved bruk av noen av de kjente metodene fører til stabil integrasjon av eksogent DNA. Transformanter valgt med hensyn på deres evne til å vokse i selektivt medium utskiller opp-løselige T4-fragmenter inn i kultursupernatanten. Oppløselige T4-fragmenter er påvist i supernatanten ved hjelp av en av flere analyser, f.eks. radioimmunopresipitasjon og deretter renset.

Rensing og karakterisering av oppløselige T4-fragmenter blir meget forbedret ved konstruering av en cellelinje som overuttrykker det utskilte proteinfragmentet. Strategier som tillater overekspresjon av proteinene er blitt anvendt i bakterier, gjær, insekt og pattedyrsystemer. Induserbare ekspresjonssystemer er også blitt anvendt i bakterier og gjær for å overprodusere proteinene som kan være toksiske hvis de blir konstitutivt uttrykt. Overekspresjon av oppløselige T4-fragmenter blir tilveiebragt ved amplifisering av en opp-løselig T4-ekspresjonsvektor som resulterer i konstitutiv overekspresjon. Ampi ifikasjonen av dihydrofolat reduktase (dhfr) genene ved vekst i progressivt økende konsentrasjoner av medikamentet metotreksat som er en antagonist av dhfr, er blitt meget anvendt. På grunn av at den amplifiserte enheten ikke er begrenset til dhfr kodende sekvenser resulterer denne tilnærmelsen til coamplifikasjon av sekvenser ved siden av disse, dhfr blir derfor anvendt som en selekterbar markør og som en måte for coamplifisering av nye innførte sekvenser. Denne strategien er blitt anvendt for å øke ekspresjonen av flere forskjellige gener cotransformert med dhfr-plasmider. Et alternativt ampiifikasjonsskjerna omfatter cotransfeksjon av den oppløselige T4 cDNA-ekspresjonsvektoren med plasmid pdLAT-3 etterfulgt av et seleksjonsskjema som tidligere beskrevet (102).

Den oppløselige T4 cDNA ekspresjonskonstruksjonen blir derfor cotransfektert med et dhfr-ekspresjonsplasmid. Alternativt ligger dhfr-genet på samme plasmidet som det oppløselige T4 cDNA-fragmentet som muliggjør bundet cotransformasjon. Transfeksjon av disse konstruksjonene inn i dhfr-manglende (dhfr-) kinesisk hamster-ovarie (CHO) celler og påfølgende seleksjon i metotreksat tillater isolasjon av stabile transformanter som uttrykker nye introduserte sekvenser. Flere kloner er blitt renset og kultursupernatanter oppsamlet og analysert for tilstedeværelse av oppløselige T4-fragmenter. Kloner som produserer det høyeste nivået av opp-løselige T4-fragmenter blir ytterligere kjennetegnet ved Northern og Southern blot analyser. Disse cellelinjene blir deretter dyrket i selektivt medium inneholdende trinnvise økede konsentrasjoner av metotreksat. Dette selektive trykket resulterer i amplifikasjon av det nye introduserte dhfr-genet og ved siden av liggende T4-sekvenser. Etter oppnåelse av den høyeste metotreksat-konsentrasjonen blir overlevende celler utsatt for Northern og Southern blot analyser for å bestemme grad av amplifikasjon og kultursupernatantene blir undersøkt for tilstedeværelse av oppløselige T4-fragmenter.

For å karakterisere de oppløselige T4-fragmentene i kultursupernatanten blir flere transformanter metodisk merket med (<35>S)-metionin. Cellelysater og supernatanter blir deretter analysert ved radioimmunoresipitasjon og Western blot analyse ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige anti-T4 antistoffer. SDS-polyakrylamid-gelelektroforese blir utført på presipitater og et bånd med antatt relativ molekylmasse (Mr) av den utskilte, forkortede formen av T4 blir observert. På grunn av at det blir syntetisert i et pattedyrsystem er dette proteinet glykosylert og foldet, d.v.s. disulfid-broene er dannet. For å rense de oppløselige T4-fragmentene fra kultursupernatanten blir immunoaffinitetskolonne-kromatografi anvendt ved anvendelse av anti-T4 antistffer. Protein bundet til kolonnen blir eluert ved høye saltkonsentrasjoner og lav pH. SDS-polyakrylamid-gelelektroforese av det eluerte materialet blir utført for å bestemme Mr og renheten av den eluerte proteinfraksjonen. I tillegg blir radioimmunopresipitasjon og Western blot analyse også utført for å ytterligere karakterisere det affinitets-rensede materiale.

Lignende tilnærmelser kan utføres i bakterier, gjær og insekter for å produsere oppløselige T4-fragmenter. I tillegg kan fragmenter som har mindre størrelse enn det som er beskrevet heri, f.eks. inneholdende bare V^J^domenen bli produsert.

Konstruksjon av vektorer

Ved anvendelse av rekombinante DNA-manipulasjoner ble baseparene (bp) 1-1257 til den humane T4 cDNA-sekvensen plassert mellom SV-40 tidlig promoter og et TAA termineringskodon etterfulgt av polyadenyleringsregionen til det bovine veksthormongenet. Denne sekvensen av T4 cDNA koder for lederen og den forutsatte ekstracellulære domenen til T4-reseptoren. Dette sT4 minigenet ble koblet til et humant li-ras eller et muse-dihydrofolat-reduktase minigen for å danne vektorene pST4CHras og pST4DHFR respektivt. Konstruksjon av disse vektorene var som følger: Konstruksjon av pST4sal: Plasmid pST4sal ble konstruert fra to andre plasmider, JRT4 og pUCsT4. Konstruksjon av disse plasmidene er beskrevet i detalj nedenfor.

Konstruksjon av plasmid JRT4: For å danne plasmid JRT4 ble plasmid DSP1 (103) kuttet med Xhol, SV40 polyA tidlig regionen ble deletert og Xho I setene ble ifylt ved anvendelse av Klenow-fragmentet til DNA-polymerase. Bovin vekst-hormonpolyadenyleringsregionen (113) ble kuttet med PvuII og Kpnl, og Kpnl setet ble gjort butt ved behandling med T4 DNA polymerase. Dette 230 bp fragmentet ble ligert til DSP1 for å danne DSP1BGH.

DSP1BGH ble kuttet mes Smal og Sali og galK kassetten (bestående av SV40 tidlig promoter, galK kodende region og BGH polyA region) ble ligert inn i pUC19 (107) i Sali setet ved anvendelse av en syntetisk linker bestående av en Sali ende, et Bglll sete og en Smal ende. Denne ligeringen bestående av tre deler resulterte i plasmid DSP1BZBGH.JT.

DSP1BZBGH.JT, som ble kuttet med Stul og Bell for å deletere galK kodende regionen ble ligert til et 1,7 kb EcoRI (ifylt)-BamHI-fragment, inneholdende T4 cDNA fra plasmid pT4B (70) for å danne plasmid JRT4.

Konstruksjon av plasmid pUCsT4: For å danne plasmidet pUCsT4 ble et Haell og Hpall fragment (1125 bp) av T4 cDNA fra plasmid pT4B ligert ved anvendelse av syntetiske linkere til vektor pUC18 som var blitt kuttet med Kpnl og Xbal. Haell enden til T4 cDNA ble ligert til Kpnl setet i pUC18 ved anvendelse av en syntetisk linker med en Kpn I ende og en Haell ende. Hpall enden til T4 cDNA ble ligert til Xbal setet til pUC18 ved anvendelse av en syntetisk linker med en Hpall ende og en Xbal ende. Denne linkeren inneholdt også et TAA stopkodon etter nukleotid 1257 av den T4-kodende regionen. Det resulterende plasmidet var pUCsT4.

For å danne plasmid pST4sal ble plasmid JRT4 kuttet med Bglll og SacI og 959 bp fragmentet (bestående av SV40 tidlig promoter av de første 602 nukleotidene til T4 cDNA) isolert. Plasmid pUCsT4 ble kuttet med SacI og Xbal og et 660 bp fragment (bestående av T4 cDNA fra nukleotidene 603-1257 etterfulgt av TAA kodonet fra den syntetiske linkeren) ble isolert. Disse to fragmentene ble ligert inn i DSP1BZBGH.JT som var blitt kuttet med Bglll og Xbal for å deletere SV40 tidlig promoteren og full-lengde T4 kodende region. Det resulterende plasmidet var pST4sal.

Konstruksjon avPST4DHFR: For å danne plasmid pST4DHFR ble et Bglll-BamHI fragment inneholdende en p-globin DHFR ekspresjonskassett ligert inn i BamHI-setet til pST4sal. p<->globin DHFR ekspresjonskassetten består av: muse p<->globin promoter (550 bp HincII fragmentet fra plasmid pPK288 (108) modifisert ved 5' end med en syntetisk linker for å inneholde et Bglll sete; muse DHFR kodende region (735 bp Hindlll (ifylt) fragment fra plasmid pSV2-DHFR (109); Nhel (ifylt) BamHI (ifylt) SV40 polyA tidlig region fra DSP1 (103); og msue DNFR terminatorregion (907 bp Hindlll (ifylt fragment fra plasmid mDH9 (110), modifisert ved 3' enden med en syntetisk linker for å danne et BamHI sete. Plasmidkartet til pST4DHFR er vist.

Konstruksjon av<p>ST4cHras: Plasmid pMERcHras ble dannet ved kutting av plasmid pSVI (111) med EcoRV og Hindlll (ifylt), for å fjerne galK-regionen og ligert i et 870 bp Ndel (ifylt)-SalI (gjort butt av mungbønnenuklease) fragment, inneholdende den kodende regionen for cHras fra plasmid pSKcHras (112).

Den oppløselige T4 transkripsjonskassetten ble fjernet fra pST4sal via et Bglll-BamHI fragment og ligert inn i BamHI setet (3<*>for SV40 polyA tidlig) til pMERcHras for å danne pST4cHras.

Ekspresjon av oppløselige T4 ( sT4) minigener i pattedyrceller Ekspresjon av psT4cHras i NIH- 3T3 cellene: Plasmid pST4cHras (10 jjg) ble co-presipitert ved kalsiumfosfat-presipitasjons-metoden med 10 ug plasmid pTKneo, en vektor som utviser G418 resistens, i nærvær av 10 ug bærer DNA (NIH-3T3 genomisk DNA) på NIH-3T3 celler (sådd ved 5 x IO<5>celler pr. 60 mm kulturskål på den påfølgende dagen). Cellene ble inkubert med utfelt DNA i 6 timer ved 37° C. Utfylt DNA ble fjernet og friskt medium (DMEM, 5% Nu-Serum° (Collaborative Research, Inc., Lexington, Massachusetts)) ble tilsatt til skålene. Cellene ble trypsinbehandlet 16 timer senere og sådd ut på tre 100 mm skåler og opprettholdt i ovennevnte medium. Foci (omtrent 50 pr. skål) oppstod innen 12-14 dager. Elleve av de transformerte foci ble selektert, ekspandert og deretter sådd ut ved 5 x IO<5>celler pr. 100 mm skål for seleksjon i ovennevnte medium pluss 500 ug/ml GENETICIN G418 (Gibco Laboratories, Grand Island, New York). Alle 11 klonene overlevde G418 seleksjon (500 ug/ml) og ble screenet for Ei-ras (p21) nivåene ved standard protein immunoblot-analyse.

Klonene som uttrykte de høyeste nivåene av p21 (omtrent 2 ng p21/ug triton-oppløselig protein) ble analysert for ekspresjon av sT4. Konfluente kulturer ble inkubert i 18 timer med<35>S-merket metionin og cystein. Kultursupernatantene og cellelysatene ble immunopresopitert med monoklonale antistoffer spesifikke for T4 (0KT4, 0KT4A) og T8 (0KT8) reseptorer, polyklonalt antistoff spesifikke for ras proteiner eller uspesifikt muse IgG. Et protein på omtrent 45 kd, antatt størrelse til sT4, ble spesifikt presipitert fra kulturmediet ved begge monoklonale antistoff rettet mot T4-reseptoren. sT4-båndet ble ikke observert i cellelysatene. Som ventet ble p21 felt ut fra cellen, men ikke fra kultur-supernatantene. Påfølgende kvantitering viser, sammenlignet med renset sT4, at disse cellene produserer relativt lave nivåer sT4, d.v.s. omtrent 100 ganger lavere enn med CHO-celler som beskrevet i eksempel 2B.

Ekspresjon av pST4DHFR i kinesisk hamsterovarie ( CHO) celler: DXB-11 cellene, en DHFR-manglende CHO-cellelinje (104) ble transfektert ved kalsiumfosfat-presipitasjon med 10 til 30 ug pST4DHFR i nærvær av 10 ug bærer DNA (NIH-3T3 genomisk DNA) en dag etter såing av 60 mm skåler med 5 x 10<5>celler. Cellene ble inkubert med utfelt DNA i 6 timer ved 37°C og mediet ble fjernet og friskt medium (F12, 10% FBS, 100 enheter/ml penicillin og streptomycin) ble satt til skålene. Mediet ble igjen byttet etter 16 timer og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter trypsinert, sådd ut på 100 mm skåler og selektert i nukleo sid-fritt medium (F-12 uten hypoksantin og tymidin, 10% dialysert FBS og 100 enheter/ml penicillin og streptomycin). Kolonier (omtrent 100 pr. skål) framkom i løpet av 7-10 dager. Kolonier fra hver skål ble slått sammen, utvidet og deretter sådd ut i 5 x IO<3>og i 5 x IO<4>celler pr. brønn i 24 brønners kulturplater eller i 5 x IO<5>celler pr. 100 mm skål. Cellene ble latt stå i 3 dager før påbegynnelse av seleksjon i nukleosidfritt medium inneholdende 20 nM metotreksat (mtx). Individuelle brønner eller kloner ble analysert ved konfluens for sT4 ekspresjon og de som ble valgt for videre amplifikasjon ble sådd ut på 24 brønn kulturplater ved tetthetene beskrevet ovenfor. Seleksjon ved 800 nM mtx i nukleosid-fritt medium ble påbegynt 3 dager etter utsåingen. Denne selek-sjonsprosedyren ble gjentatt for seleksjoner ved 8 uM mtx og 80 uM mtx.

Flere cellelinjer ble isolert ved anvendelse av denne metoden som uttrykker oppløselig T4 i et minimum på 3 pg/celle/25 t.

Rensing av sT4: Kondisjonert medium (CM) ble fremstilt serum-fritt fra adherente cellekulturer ekspandert i 850 cm<2>rulleflasker under mtx selektive betingelser. Ved konfluens ble cellene vasket to ganger med fosfatbufferet saltvann (PBS) uten Mg<2+>og Ca<2+>og vekstmediet (Ham's F12 uten hypoksantin og tymidin, 10% fetalt bovint serum, 100 enheter/ml penicillin og streptomycin og mtx ved selektiv konsentrasjon) ble erstattet med det samme mediet minus serum og mtx og pluss 1 x ITS (insulin, transferrin selenium (Collaborative Research Inc.)). Etter 24-48 t. ble mediet fjernet og erstattet med selektivt vekstmedium. Serum-fritt medium ble deretter på ny tilført i løpet av 3-5 dager og denne syklusen ble gjentatt i det uenderlige, d.v.s. i omtrent to måneder. CM ble klargjort ved sentrifugering ved 8.000 x g. En proteasehemmer PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid) ble satt til 0,5 mM og CM ble konsentrert omtrent 10-ganger ved trykkmembranfiltrering. Dette konsentrerte CM ble gjort klart ved sentrifugering ved 2.000 x g og aprotinin, proteasehemmer (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) ble tilsatt til en final konsentrasjon på 5 ug/ml. Prøven ble behandlet direkte eller etter lagring ved -70°C.

Den konsentrerte CM-prøven ble fortynnet 2-ganger med 50 mM MES [2-(N-morfolino)-etansulfonsyre], pH 6,0 og filtrert gjennom et 0,45 um filter. Prøven ble deretter behandlet med 100 um pAPMSF (p-amidinofenylmetylsulfonylfluorid) (Cal-Biochem-Behring, San Diego, California) og applisert på en S-Sepharose (Sulfo-propyl) (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscateway, New Jersey) kolonne ekvilibrert i 50 mM MES, pH 6,0 ved en proteinkonsentrasjon på 1,5-2,0 mg/ml gel. Prøven ble eluert ved anvendelse av en lineær gradient på 0-0,5 M NaCl i 5 0 mM MES, pH 6,0. Toppfraksjoner som eluerte ved omtrent 0,2 M NaCl ble slått sammen og behandlet med pAPMSF til 100 jjM. Fraksjoner inneholdende sT4 ble bekreftet ved SDS-PAGE og immunoblot-analyser. Etter henstand ved 4°C i 1 time ble prøven dialysert mot 50 mM Bis-Tris propan [1,3-bis[tris-(hydroksymetyl)-metyl amino]propan], pH 6,0.

Prøven ble behandlet med 100 uM pAPMSF og 0,1% tiodiglykol, pH 9,0 og deretter applisert på en Q-Sepharose (kvartenær aminoetyl) kolonne (Pharmacia) (5 ml prøve/ml gel) ekvilibrert i 50 mM Bis-Tris propan (BTP), pH 9,0. sT4-prøven blir ikke bundet til Q-Sepharose og ble isolert i den ubundne fraksjonen og i kolonne-vaskevannet. Den ubundne prøven ble med en gang jusert til pH 6,0.

Det endelige trinnet var kromatografi på en 30 uM Superose 12 kolonne (2,5 x 46 cm) (Pharmacia) ekvilibrert i 50 mM fosfat, 0,15 M NaCl pH 7,0. Kolonnen ble kjørt med en strømningshastighet på 3,0 ml/min. Ti ml injeksjoner ble laget og 42 minutt-toppen ble samlet i porsjoner. Fremgangsmåten ga omtrent 1,0 mg av produktet pr. 20,0 mg totalt protein for en cellelinje som omtrent produserer 3 pg/celle/- dag.

Karakterisering av sT4

Fysiske egenskaper: Total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved anvendelse av kolormetrisk BCA-proteinanalyse (Bicin-choninic Acid, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). Absolutte konsentrasjoner ble bestemt ved kvantitative amonisyreanalyser. Den målte aminosyre-sammensetningen til renset sT4 ble utført ved anvendelse av standard aminosyre-analyseteknikker og var i samsvar med den antatt sekvensen for molekylet opp til den eksperimentelle feilverdien (+/— 15%). Til og med de første 20 residiene var sekvensen som antatt og begynner med lys-lys-val-val . Den modne aminoterminale enden begynner ved posisjon +3 med hensyn på det antatte lederkutt-setet og er forskjellig fra den antatte sekvensen ved den posisjonen ved en asn til lys forandring. Posisjonen til den modne aminoterminale ende er i samsvar med den bestemte terminale enden til muse og saue CD4-proteinene. asn til lys forandringen kan representere en sekvenserings-feil (enkelt baseforandring) eller en mutasjon som oppstår i løpet av rekombinante prosedyrer).

Immuno- epitoper: De monoklonale antistoffene 0KT4 og 0KT4A gjenkjenner ikke-interfererende overflate-epitoper til T4 reseptoren (114). Disse antistoffene er spesifikke for den native konformasjonen i det at det ikke vil bli bundet til redusert, SDS denaturert protein i immuno-plot analyser. Det ble vist at begge antistoffene spesifikt fyller ut ST4 fra<35>S-merkede kultursupernatanter ved anvendelse av følgende immunopresipitasjonsprosedyre: Kulturer av sT4-produserende celler inneholdende 1 x IO<6>celler pr. 60 mm kulturskål ble merket i 16 timer ved 37°C i 1,5 ml metionin og cystein-fritt F12-medium inneholdende ITS og 170 uCi/ml [<35>S]metionin og 30 uCi/ml [<35>S]cystein (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, California). Klare medium (100 ul) ble fortynnet med et likt volum presipitasjonsbuffer (10 uM natriumfosfat pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% NP-40°, 0,5% ikke-fettholdig tørrmelk) og inkubert med 3 ug kanin IgG i 15 min. ved 4°C etterfulgt av 30 ul (pakket volum) protein A sepharose-kuler (Pharmacia P-L Biochemicals) i 30 min. ved 4°C. Den for-klarede supernatanten ble inkubert med 5 ug 0KT4, 0KT4A og 0KT8 (gave fra P. Rao, Ortho Pharmaceuticals Corp., Raritan, New Jersey), muse IgG (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania) eller kanin a-muse IgG (Cooper Biomedical) i 30 min. ved 4°C. 0KT4, 0KT4A, 0KT8, muse IgG og kanin a-muse IgG ble utfelt ved inkubasjon med 20 pl (pakket volum) protein A sepharose-kuler i 30 min. ved 4°C. Etter utfelling ble kulene vasket to ganger med 200 ul presipitasjonsbuffer og en gang med 200 ul presipitasjonsbuffer minus NP-40° og ikke-fettholdig tørrmelk. De vaskede kulene ble kokt i 5 min. i 20 ul prøvebuffer (125 mM Tris-HCl pH 6,8, 20% glycerol, 1,4 M p<->mercaptoetanol) og supernatantene ble analysert ved elektroforese på en 12,5 SDS-polyakrylamid-gel. Lignende resultater ble tilveiebragt med 0KT4B, 0KT4C, 0KT4D, 0KT4E, OKT4F og andre Maber spesifikke for T4. Disse resultatene foreslår at konformasjon til sT4 nøyaktig etterligner overflatedomenen til T4-reseptoren.

For å bestemme om sT4 kan assosiere med HIV gpl20 og om denne assosiasjonen kan hemme binding av HIV til T4-cellene ble omtrent 5 mikrogram renset sT4 absorbert til sepharose-kulene belagt med 0KT4 eller kontroll antistoff. Kulene ble deretter blandet med et<35>S-metionin merket HIV-lysat. Komplekset av sT4 med 0KT4 copresipiterer bare 120 kd kappe glykoproteinet. Ingen virale proteiner blir utfelt av 0KT4-kulene i fravær av sT4 eller i nærvær av kontroll-supernatantene fra utrans-fekterte CHO-celler. Viralt protein blir ikke utfelt dersom sepharose-kulene belagt med kontroll muse immunoglobulin (isotype i samsvar med 0KT4) blir inkubert med sT4. Disse studiene viser at tilveiebragt sT4, som er frie for andre celleoverflate-komponenter tilstede på overflaten av T-lymfocytter, kan spesifikt assosiere med kappe-glykoproteinet på AIDS-viruset.

Cytofluorometri ble utført for å demonstrere at interaksjonen av T4 med gpl20 til intakt HIV opphever binding av AIDS-viruset til overflaten av T4<+>cellene. T4<+>CEM-cellene ble utsatt for HIV i nærvær eller fravær av sT4. Etter viral absorpsjon ble cellene vasket, utsatt for fluorescens-konjugert anti-HIV antistoff og analysert ved flow cytometri (figur 17) (48). I fravær av sT4 bindes HIV effektivt til T4<+>CEM-cellene. Dersom HIV blir preinkubert med sT4 blir binding av virus til T4<+>cellene opphevet (figur 17). Ti nanogram renset sT4 er tilstekkelig for å hemme binding av 100 nanogram viralt protein. Dersom kappe-glykoproteinet omfatter 5% av det totalt virale proteinet kan et 5:1 molart forhold av T4 og gpl20 fullstendig hemme HIV-binding til T4<+>cellene.

Evnen som sT4 har til å hemme infeksjon av T4<+>cellene med HIV ble også studert. Fytohemagglutinin-stimulerte humane lymfocytter ble utsatt for ti-ganger fortynninger i serie av et HIV-inokulum i nærvær eller fravær av sT4, vasket og sådd ut i mikrokultur. Frekvensen av infiserte kulturer ble bestemt ved anvendelse av en immunoanalyse 4,8 og 12 dager etter utsetting for virus (47). På denne måten er det infeksiøse virustitre, ID-50 definert som resiprokke verdien av fortynningen nødvendig for å infisere 50% av de utsatte cellekulturene på dag 12. I fravær av sT4 er ID-50 observert med viralt inokulum omtrent 10<5>. I nærvær av 8 mikrogram/ml renset oppløselig T4 blir infektiviteten redusert med nesten 4 log til en ID-50 på 10<1-5>(figur 18). Denne dramatiske reduksjonen i infeksjonstendens med HIV blir observert i hele forløpet til infeksjonen. Som en kontroll for ikke-spesifikk hemming eller toksiske effekter av sT4 blir sT4 satt til kulturene 18 timer etter den opprinnelige utsettingen for virus. Kulturer utsatt for sT4 18 timer etter infeksjon viser bare en 1 log hemming i ID-50 som sannsynligvis er et resultat av hemming av virus-spredning etter begynnende inokulasjon. Reduksjonen på 4 log for virusinfeksjonstendens observert når virus blir preinkubert med sT4 ser ut til å være et resultat av spesifikk assosiasjon av sT4 med gål20 på overflaten av viruset. Disse partiklene kan derfor ikke reagere med T4-reseptoren på celleoverflaten. Hemming på fire log ble observert når IO<5>infeksiøse partikler/ml ble preinkubert med 8 mikrogram/ml sT4. De virale preparatene på IO<5>infeksiøse partikler/ml ble beregnet å innehoilde 10^ partikler/ml. Dersom hver partikkel inneholder 1.000 kappe-glykoproteiner blir hemmingen tilveiebragt som et forhold på 100 T4 molekyler/molekyl til kappe-protein.

Tilgjengeligheten av relative store mengder strukturelt intakt sT4 letter studiet av mekanismen for interaksjoner mellom T4 og overflaten av både antigen-presenterende celler samt HIV-virus. Spesifisiteten til interaksjonen av T4<+>hjelpeceller med antigen-presenterende celler (B-celler og makrofager) kan i hvert fall delvis være et resultat av assosiasjon av T4 med klasse II MHC-molekyl er (105, 106). Tilgjengeligheten av betraktelige mengder renset sT4 mulig-gjør en direkte demonstrasjon av fysisk assosiasjon mellom T4 og klasse II MHC-molekylene.

Evnen som sT4 har til å binding gpl20 og hemme viralinfeksjon in vitro tyder på at sT4 er et effektivt anti-viralt middel for behandling av AIDS-pasienter.

Eksempel 4: Produksjon av oppløselige V1V2J4 oppløselige T— 4 f ragmenter

Konstruksjon av vektorer

Konstruksjon av psT4BBVIDHFR: For å danne plasmid psT4B-BVIDHFR ble plasmid pST4DHFR (beskrevet i eksempel 3) kuttet med EcoRI og Xbal og det mindre fragmentet inneholdende sT-4 kodende regionen ble deletert. Plasmid sT4sal ble kuttet med Xbal og Bbvl og et 1120 base-par kodende fragment inneholdende sekvensen for oppløselig T-4 minus leder-regionen ble isolert. Dette fragmentet ble ligert til EcoRI/Xbal-kuttet pST4DHFR ved anvendelse av en syntetisk linker med en EcoRI ende, et Kpnl sete og en Bbvl ende. Dette fragmentet er kompatibelt med Bbvl-overhenget på sT-4 fragmentet isolert ovenfor. Det resulterende plasmidet ble betegnet pST4-BBVIDHFR.

Konstruksjon av 0MPAST4: For å danne plasmid 0MPAST4 ble plastmid OMPA.GS spaltet med Ncol og Sali og det mindre fragmentet inneholdende 1inkerregionen ble deletert. OMPA.GS er et derivat av pASI (Rosenberg et al., Meth. Enz<y>mol. 101:123 (1983); U.S. Patent 4.578,-355) med en syntetisk sekvens satt inn i Ndel-setet ved 3' enden av ell robosom-bindende sekvens. Den syntetiske sekvensen omfatter OMPA-lederen etterfulgt av en multilineær sekvens. Den syntetiske sekvensen var hovedsakelig som følger: 5' -T ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGC TCT AGA GTC GAC CTA GTT AAC

TAG-3'

Plasmid pUCsT4 ble kuttet med Ncol og Sali og 1149-basepar-fragmentet inneholdende SCD-4 sekvensen (T-4 nukleotidene 124-1257) ble isolert. Dette fragmentet ble ligert til Ncol/SalI kuttet OMPA-GS for å danne 0MPAST4.

Konstruksjon av 0MPAST4BbvI: For å danne plasmid 0MPAST4BbvI ble plasmid 0MPAST4 kuttet med Nael og XBal. Det mindre fragmentet som resulterte fra denne kuttingen inneholdende sT-4 kodende regionen ble deletert. Plasmid ST4BBVIDHFR ble kuttet med Kpnl og det resulterende 3' overhenget ble gjort butt med T4 DNA-polymerase. Butt endede DNA ble deretter kuttet med XBal og 1124 baseparfragmenter inneholdende nukleotidene 145-1257 til CT4 cDNA ble isolert. Det isolerte fragmentet ble ligert til Nael/Xbal kuttet 0MPAST4 plasmid for å danne plasmid 0MPASTI4BbVI.

Konstruksjon avPUCGT4184: For å danne plasmid pucSt4184 ble et EcoRI-Nhel fragment fra T-4 cDNA (et 682 bp fragment kodende for aminosyrene (-23) til (+178)) ligert til den syntetiske linkeren sk727/725 (Nhel og Aval endene) ved Nhel setet. sk727/725 koder for T-4 aminosyrene 179-185). Aval enden til sk727/725 ble ligert til et Aval-Xba 1 fragment til pUcST4 (omfattende bp 1198-1257 til humant cDNA og som koder for aminosyrene 351-369 til T-4 reseptoren etterfulgt av et TAA termineringskodon). Denne sekvensen som er flankert av EcoRI og Xbal endene ble satt inn i pUC19 ved EcoRI og Xba 1 endene til puC19 polylinker (sk727/725). sk727/725 er vesentlig som følger: 5'gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac 3'

gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5'

Konstruksjon av<p>UCST4106: For å danne plasmid pUCST4106 ble et EcoRI-Ava II fragment (omfattende bp 1-413 og som koder for aminosyrene (-) 25-87) av T-4 cDNA koblet til syntetisk linker sk791/792 (Ava II-Aval endene) til Avall setet. sk791-792 koder for T-4 aminosyrene 88-104. Aval enden til sk791/792 ble ligert til et Aval-Xbal fragment til pUCST4 (omfattende bp 1198-1257 til humant cDNA og som koder for aminosyrene 351-369 til T-4 reseptoren etterfulgt av et TAA termineringskodon). Denne sekvensen som er flankert av EcoRI og Xbal endene ble satt inn i pUC19 ved EcoRI og Xbal endene til puC19 polylinkeren. sk791/792 er vesentlig som følger: 5' gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac

gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5'

Konstruksjon avST4184DHFR: For å danne plasmidST41-84.DHFR ble et EcoRI-Xbal fragment til pucST4184 (kodende for aminosyrene -25 til 183 koblet til 355 til 373) ligert til EcoRI og Xbal endene til psT4DHFR i stedenfor EcoRI-Xbal fragmentet som koder for sT-4.

Konstruksjon av sT4106DHFR: For å danne plasmidST4106.DHFR ble et EcoRI-Xbal fragment til pucST4106 (kodende for aminosyrene -23 til 106 koblet til 351 til 369) ligert til EcoRI og Xbal endene til psT4DHFR i stedenfor EcoRI -Xba 1 fragmentet som koder for sT-4.

Ekspresjon av pST4184DHFR i kinesisk hamster ovare ( CHO) cellene: DXB-11 cellene, en DHFR manglende CHO-cellelinje (Urlaub, et al., ovenfor) ble transfektert ved kalsiumfosfat-utfelling med 10 til 30 ug pST-4184DHFR i nærvær av 10 ug bærer DNA (NIH-3T3 genomisk DHA), en dag etter utsåing av 60 mm skåler med 5 x 10<5>celler. Utfellingene ble fjernet etter 6 timer og erstattet med F12 medium uten hypoksantin eller tymidin, inneholdende 10% dialysert fetalt bovint serum. Kolonier (omtrent 100 pr. skål) framkom i løpet av 16 dager. Kolonier fra hver skål ble slått sammen, ekspandert og deretter sådd ut ved 3 x IO<4>celler pr. brønn i 24 brønnkulturskåler. Disse cellene ble dyrket i nukleosidfritt medium inneholdende 80 nM metotreksat (mtx) for å selektere for potensiell amplifikasjon av det transfekterte dhfr og V1V2J4 minigenet. Etter to uker i 8 nM mtx var aktivt voksende celler klart synlige. Individuelle celler eller kloner ble analysert ved konfluens for ekspresjon av delesjonsmutantene og de som ble selektert for videre amplifikasjon ble sådd inn i 24 brønnkulturplater i en tetthet som beskrevet ovenfor. Et antall subpopulasjoner som uttrykte høye V1V2J4-nivåer ble dyrket i økende nivåer mtx for å selektere for ytterligere amplif ikasjon av dhfr-transkripsjonsenheten og T4184s(V1V2-J4) minigenet.

Flere cellelinjer ble avledet ved anvendelse av denne metoden som uttrykker delesjonsmutanter i mengder på minst omtrent 2 pg/celler/24 timer.

Kondisjonert medium (CM) ble preparert i serum-fri tilstand fra adherente cellekulturer dyrket i 850 cm<2>rulleflasker under mtx selektive betingelser. Ved konfluens ble cellene vasket to ganger med fosfatbufferet saltvann (PBS) uten Mg<2+>og Ca<2+>og vekstmediet (Ham's F12 uten hypoksantin og tymidin, 10% fetalt bovint serum, 100 enheter/ml penicillin og streptomycin og mtx ved den selektive konsentrasjonen) ble erstattet med det samme mediet minus serum og mtx og pluss 1 x ITS (insulin, transferrin og selen (Collaborative Research Inc.)- Etter 24-48 timer ble mediet fjernet og erstattet med selektivt vekstmedie. Serum-fritt medium ble deretter på nytt tilsatt i løpet av 3-5 dager og denne syklusen ble gjentatt i lang tid, d.v.s. i mer enn to måneder. CM ble klaret ved sentrifugering ved 8.000 x g. En proteasehemmer PMSF (fenyl-metylsulf onylf luorid) ble tilsatt til 0,5 mM og CM ble konsentrert omtrent 10 ganger ved trykk membranfiltrering. Dette konsentrerte CM ble klaret ved sentrifugering ved 2.000 x q og aprotinin, en proteasehemmer, (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 5 ug/ml. Prøven ble behandlet direkte eller etter lagring ved -70°C.

Western Blot analyse: Kondisjonert medium fra V1V2J4 produserende CHO-celler ble konsentrert og kjørt i en 15% polyakrylamid-reduserende gel. Protein ble overført til nitrocellulose-papir og probet med polyklonalt antisera oppnådd mot et denaturert E. coli avledet T-4-NSI fusjons-molekyl. Dette antisera gjenkjenner spesifikt en V1V2J4 dublett migrerende ved omtrent 25 Kd. Dette korresponderer med den antatte størrelsen til V1V2J4 kodende sekvensen etter prosessering av lederen. Den fysiske basisen for dubletten er ikke kjent. Det er ikke et resultat av forskjellene ved N-bundet glykosylering på grunn av at de to konsensus-sekvensene i T-4 for denne glykosyleringen ikke er til stede i V1V2J4 .

Immuno- epitoper: De monoklonale antistoffene OKT-4 og 0KT-4A, 0KT4B, 0KT4C, 0KT4D, 0KT4E og OKT4F gjenkjenner spesifikt overflate-epitoper på den native, membranbundne T-4 reseptoren (Rao, et al., Cell Immonol. 80:310 (1983)). Disse antistoffene er spesifikke for den native konformasjonen på grunn av at de ikke vil bli bundet til redusert, SDS-denaturert protein i immuno-blot analysene. Det ble vist at begge antistoffene spesifikt feller ut V1V2J4 fra<35>S-merkede kultursupernatanter ved anvendelse av følgende immuno-presipiteringsprosedyre.

Kulturer av V1V2J4 produserende celler inneholdende 1 x IO<6>celler pr. 60 mm kulturskål ble merket i 16 timer ved 37°C i 1,5 ml metionin og cystein-fritt F12 medium inneholdende ITS, og 170 uCi/ml[3<5>S]metionin og 30 uCi/ml [<35>S]cystein (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA). Klaret medium (100 ul) ble fortynnet med et likt volum presipiteringsbuffer bestående av 10 mM natriumfosfat pH 7,5 (100 mM NaCl, 0,1% NP-40°, 0,5% ikke-fettholdig tørrmelk) og inkubert med 3 ug kanin IgG i 15 min. ved 4°C etterfulgt av 30 ul (pakket volum) protein A sepharosekuler (Pharmacia P-L Biochemicals) i 30 min. ved 4°C. Den for-klarete supernatanten ble inkubert ved 5 ug av hver av 0KT4 antistoffene referert ovenfor, muse IgG (Cooper Biomedical, Malvern, PA) eller kanin a-muse IgG (Cooper Biomedical) i 30 min. ved 4°C. 0KT4 antistoffene, muse IgG og kanin a-muse IgG ble utfelt ved inkubasjon med 20 ul (pakket volum) protein A sepharosekuler i 30 min. ved 4°C. Etter utfellingen ble kulene vasket to ganger med 200 ul presipitasjonsbuffer og en gang med 200 ul presipitasjonsbuffer minus NP-40° og ikke-fettholdig tørrmelk. De vaskede kulene ble kokt i 5 min. i 20 ul prøvebuffer (125 mM Tris-HCL pH 6,8, 20% glycerol, 1,4 M p-mercaptoetanol), og supernatantene ble analysert ved elektroforese på en 12,5% SDS-polyakrylamdigel. Med unntagelse av 0KT4 felte hver av de monoklonale antistoffene spesifikt V1V2J4 fra 35S-merkede kultursupernatanter.

Konkurranse om HIV- binding: Gjenkjenning av V1V2J4 ved 0KT4A indikerte at V1V2J4 ville hemme binding av AIDS-viruset til mottakelige celler. CM inneholdende eller som mangler V1V2J4 ble anvendt i de opprinnelige analysene. HIV ble inkubert med CM og virusbinding til T-4<+>CEM-cellelinjen ble kvantifisert ved inkubasjon med et FITC-konjugert, anti-HIV antistoff og FACS (fluorescens-aktivert cellesorterer) analyser som beskrevet av McDougal, et al., ovenfor (1985). CM fra den V1V2J4 produserende cellelinjen hemmet HIV-binding på en fortynningsavhengig måte mens det ikke ble oppdaget noen respons med CM fra tilsvarende ikke-produserende (DXB-11) celler.

Proteinet V1J4 ble på lignende måte uttrykt i CHO-celler. I disse preliminære eksperimentene ble proteinet tilsynelatende ikke eksportert inn i mediet. Basert på andre studier som viser at V1J4 produsert i andre rekombinante organismer binder 0KT4A ser det ut for at V1J4 uttrykt i pattedyrcelle-kultur vil hemme HIV-binding.

Eksempel 5: Preparering av anti- oppløselige T4- fragment antistoffer

Åtte uker gamle Balb/c mus ble injisert intraperitonialt med 50 mikrogram av et renset oppløselig T4-fragment ifølge foreliggende oppfinnelse (preparert som beskrevet ovenfor) i Freund's fullstendige adjuvant, 1:1 i volum. Mus blir deretter "boosted", i månedlige intervaller, med det opp-løselige T4-fragmentet blandet med ufullstendig Freund's adjuvant og latt blø gjennom halevenen. Immunoglobulin-kutt av sera ble dannet ved ammoniumsulfat-utfelling og spesifikke anti-oppløselig T4-fragment antistoffer blir renset ved affinitets-kromatografi ved anvendelse av et immobilisert T4-f ragment.

Eksempel 6: Preparering av oppløselige T4- fragment anti-idiotypiske antistoffer

Syngeniske og kongeniske mus blir injisert intraperitonialt med 50 mikrogram av et renset anti-oppløselig T4-fragment antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse (preparert som beskrevet ovenfor) i Freund's fullstendige adjuvant og "boosted" med anti-oppløselig T4-fragment antistoff fra et ufullstendig adjuvant hver måned. På dagene 4, 3 og 2 før fusjon blir musene "boosted" intravenøst med 50 mikrogram immunoglobulin i saltvann. Splenocytter blir deretter koblet med P3X63 AG8.653 ikke-utskillende myeloma-celler ifølge prosedyrer som er blitt beskrevet og som er kjent innenfor samme fagområde som foreliggende oppfinnelse. To uker senere blir hybridom-supernatanter screenet for bindingsaktivitet og for anti-oppløselig T4-fragment antistoffer ved radioimmuno-analyse. Positive kloner blir deretter analysert for evne til å bli bundet til et humant immunsvikt-virus kappe glykoprotein og AIDS-virus. Alternativt, ved anvendelse av "ett-trinns" prosedyren blir mus injisert intraperitonialt med et oppløselig T4-fragment i Freund's fullstendige adjuvant og "boosted" intravenøst med det oppløselige T4-fragmentet i saltvann og musemilt-celler kondensert med myelomer som ovenfor. Hybridom-supernatantene blir deretter analysert direkte for oppløselige T4-fragment anti-idiotypiske antistoffer .

Referanser

1. E.L. Reinherz et al., "Discrete Stages of Human Intrathymic Differentiation: Analysis of Normal Thymocyte and Leukemic Lymphoblasts of T Cell Lineage", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77: 1588-1592 (1980 ). 2. E.L. Reinherz og S.F. Schlossman, "The Differentiation and Function of Human T Lymphocytes", Cell 19: 821-827 (1980). 3. M.L. Blue et al., "Coexpression of T4 and T8 on Peropheral Blood T Cells Demonstrated by Two-color Fluoroescence Flow Cytometry", J. Immunol. 134: 2281-2286 (1985). 4. E.G. Engleman et al., "Activation of Human T Lymphocyte subsets: Helper and Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize and Respond to Distinct Histocompatibility Antigens", J. Immunol. 127: 2124-2129 (1981). 5. A.M. Krensky et al., "Long-term Human Cytolytic T-cell Lines Allospecific for HLA-DR6 Antigen Are 0KT4<+>", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_9: 2365-2369

(1982). 6. S.C. Meuer, S.F. Schlossman og E. Reinherz, "Clonal Analysis of Human Cytotoxic T Lymphocytes T4<+>og T8<+>Effector T Cells Recognize Products of Different Major Histocompatibility Complex Regions", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 4395-4399 (1982). 7. W.E. Biddison et al., "Possible Involvement of the 0KT4 Molecule in T Cell Recognition of Class II HLA Antigens", J. Exp. Med. 156: 1065-1076 (1982). 8. D.R. Wilde et al., "Evidence Implicating L3T4 in Class II MHC Antigen Reactivity Monoclonal Antibody GK 15 (Anti-L3T4) Blocks Class II MHC Antigen-Specific Proliferation, Release of Lymphokines and Binding by Cloned Murine Helper T Lymphocyte Lines", J. Immunol. 131: 2178-2183 (1983). 9. S.L. Swain, "T Cell Subsets and the Recognition of MHC Class", Immunol. Rev. 74: 129-142 (1983). 10. Y. Thomas et al., "Functional Analysis of Human T Cell Subsets Defined by Monoclonal Antibodies. IV. Induction of Suppressor Cells Within the 0KT4<+>Population", J. Exp. Med. 154: 459-467 (1981). 11. E.G. Engleman et al., "Antibodies to Membrane Structures that Distinguish Suppressor/Cytotoxic and Helper T Lymphocyte Subpopulations Block the Mixed Leukocyte Reaction in Man", J. Exp. Med. 154: 193-198

(1981). 12. P. Marrack et al., "The Major Histocompatibility Complex-restricted Antigen Receptor on T Cells. II. Role of the L3T4 Product", J. Exp. Med. 158: 1077-1091 (1983). 13. L. Rogozinski et al., "The T4 Surface Antigen is Involved in the Induction of Helper Function", J. Immunol. 132: 735-739 (1984). 14. S.L. Swain, "Significance of Lyt Phenotypes: Lyt2 Antibodies Block Activities of T Cells that Recognize Class I Major Histocompatibility Complex Antigens Regardless of Their Function", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78: 7101-7105 (1981). 15. U. Landegren et al., "Selective Inhibition of Human T Cell Cytotoxicity at Levels of Target Recognition of Initiation of Lysis by Monoclonal 0KT3 and Leu-2a Antibodies", J. Exp. Med. 155.: 1579-1584 (1982). 16. R.M. Zinkernagel og P.C. Doherty, "MHC-restricted Cytotoxic T Cells: Studies on the Biological Role of Polymorphic Major Transplantation Antigens Determining T Cell Restriction, Specificity, Function, and Responsiveness", Adv. Immunol. 27: 52-177 (1979). 17. J. Kappler et al., "The Major Histocompatibility Complex-Restricted Antigen Receptor on T Cells in Mouse and Man: Identification of Constant and Variable Peptides", Cell 35= 295-302 (1983). 18. 0. Acuto et al.: "The Human T Cell Receptor: Appearance in Ontogeny and Biochemical Relationship of Alpha and Beta Subunits on IL-2 Dependent Clones and T Cell Tumors", Cell 34: 717-726 (1983). 19. P. Kavathas et al., "Isolation of the Gene Coding for the Human T Lymphocyte Antigen Leu-2 (T8) by Gene Transfer and cDNA Subtraction", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 7688-7692 (1984). 20. D.R. Littman et al., "The Isolation and Sequence of the Gene Encoding T8: A Molecule Defining Functional Classes of T Lymphocytes", Cell 40: 237-246 (1985). 21. V.P. Sukhatma et al., "The T Cell Dif f erent iat ion Antigen Leu-2/T8 is Homologous to Immunoglobulin and T Cell Receptor Variable Regions", Cell 40: 591-597

(1985).

22. S.M. Friedman et al., "OT-CLL: A Human T Cell Chronic Lymphocytic Leukemia That Produces IL-2 in High Titer", J. Immunol. 128: 935-940 (1982). 23. D.A. Thurley-Lawon, L. Chess og J.L. Strominger, "Suppression of In Vitro Epstein-Barr Infection: A New Role for Adult Human T Cells", J. Exp. Med. 146: 495-508 (1977).

24. J.W. Goding, "The Chromic Chloride Method of Coupling Antigens to Erythrocytes: Definition of Some Impor-tant Parameters", J. Immunol. Methods 10: 61-66

(1976). 25. F.L. Graham og A.J. van der Eb, "A New Technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus DNA", Virology 52: 456-467 (1973). 26. M. Wigler et al., "Biochemical Transfer of Single-Copy Eucaryotic Genes Using Total Cellular DNA as Donor", Cell 14: 725-731 (1978). 27. M. Wigler et al., "Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene to Cultured Mouse Cells", Cell 11: 223-232 (1977). 28. J.M. Chirgwin et al., "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochemistry 18: 5294-5299 (1979). 29. H. Aviv og P. Leder, "Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic Acid-Cellulose", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69= 1408-1412 (1972). 30. T. Huynh, R.A. Young og R.W. Davis, "Construetion and Screening cDNA Libraries in gtlO and gtll", DNA

Cloning Techniques - A Practical Approach. D.M. Glover, red. (Oxford: IRL Press), in press. 31. T. Maniatis et al., "The Isolation of Structural Genes from Libraries of Eucaryotic DNA", Cell 15: 687-701 (1978). 32. M.M. Davis et al., "Cell-Type-Specific cDNA Probes and the Murine I Region: the Localization and Orientation of Ad Alpha", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 2194-2198 (1984). 33. T. Maniatis, E.F. Fritch og J. Sambrook, "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) (1982). 34. P.V.J. Rigby et al., "Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity In Vitro by Nick Trans-lation with DNA Polymerase I", J. Mol. Biol. 113: 237-251 (1977). 35. J. Vieira og J. Messing, "The pUC Plasmids, an M13mp7-Derived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers", Gene 19: 259-268 (1982). 36. F. Sanger, S. Nicklen og A. Coulson, "DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467 (1977). 37. E. Southern, "Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoroesis", J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975). 38. G.M. Church og W. Gilbert, "Genomic Sequencing", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 1991-1995 (1984). 39. E.H. Scheller et al., "A Family of Genes that Codes for ELH, A Neuropeptide Eliciting a Stereotyped Pattern of Behavior in Aplysia", Cell 28: 707-719

(1982). 40. K. Zinn, D. DiMaio og T. Maniatis, "Identification of Two Distinct Regulatory Regions Adjacent to the Human Beta-Interferon Gene", Cell 34: 865-879 (1983). 41. C. Terhorst et al., "Further Structural Studies of the Heavy Chain of HLA Antigens and Its Similarity to Immunoglobulins", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 4002-4006 (1977). 42. J.A. Hedo, L.C. Harrison og J. Roth, "Binding of Insulin Receptors to Lectins: Evidence for Common Carbohydrate Determinants on Several Membrane Receptors", Biochemistry 20: 3385-3393 (1981). 43. U.K. Laemmli, "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature 227: 680-685 (1070). 44. R. Mann, R.C. Mulligan og D. Baltimore, "Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus", Cell 33, 153-159 (1983). 45. F. Barre-Sinoussi, et al., "Isolation of a T lympho-tropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS), Science 220. 868-871 (1983). 46. J.S. McDougal, et al., "Cellular tropism of the human retrovirus HTLV-III/LAV. I. Role of T cell activation and expression of the T4 antigen", J. Immol. 135, 3151-3162 (1985). 47. J.S. McDougal, et al., "Immunoassay for the detection and quantltation of infectious human retrovirus, lymphadenopathy-associated virus (LAV)", J. Immunol. Meth. 76, 171-183 (1985). 48. J.S. McDougal, et al., "Binding of HTLV-III/LAV to T4<+>T cells by a complex of the HOK viral protein and the T4 molecule", Science 231, 382-385 (1986). 49. C.B. Reimer, et al., "Standardization of ligand binding assays for alpha-fetoprotein. In Immuno-fluorescence and Related Staining Techniques". W. Knapp, K. Holubar og G. Wick, red. (Amsterdam:

Elsevier/North Holland Press) s. 189 (1978).

50. M.B. Wilson og P.K. Nakane, "Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. In Immunofluores-cence and Relating Staining Techniques", W. Knapp, K. Holubar og G. wick, red. (Amsterdam: Elsevier/North Holland Press), s. 215 (1978). 51. J. Porath, R. Axen og S. Ermback, "Chemical coupling of proteins to agar", Nature 215. 1491-1493 (1967). 52. B.J. Poiesz, et al., "Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T cell lymphoma". Proe. Nati. Acad. Aci. USA 77, 7415-7419 (1980 ). 53. P. Clapham, K. Nagy og R.A. Weiss, "Pseudotypes of human T-cell virus types 1 and 2: Neutralization by patients' sera", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 2886-2889 (1984). 54. A.G. Dalgleish, et al., "The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus", Nature 312, 763-766 (1984). 55. M. Popovic, et al., "Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retorviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and Pre-AIDS", Science 224. 497-500 (1984). 56. K. Nagy, et al., "Human T-cell leukemia virus type 1: induction of sycytia and inhibition by patients' sera", Int. J. Cancer 32, 321-328 (1983). 57. D.M. Neville og H. Glossman, "Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein subunits by discontinuous gel electrophoresis in dodecyl sulfate", Methods Enzymol. 32, 92-102 (1974). 58. A. Helenius, et al., "On the entry of Semliki Forest virus into BHK-21 cells", J. Cell. Biol. 84. 404-420

(1980).

59. R.D. Cone og R.C. Mulligan, "High-ef f iciency gene transfer into mammalian cells: Generation of helper-free recombinant retroviruses with broad mammalian host range", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 6349-6353

(1984). 60. F.W. Alt et al., "Probes for Specific mRNAs by Subtractive Hybridization: Anomal§us Expression of Immunoglobulin Genes", i Eucaryotic Gene Regulation, R. Axel, T. Maniatis og CF. Fox, red. (New York:

Academic Press), s. 407-419 (1979).

61. M. Kozak, "Comparison of Initiation of Protein Synthesis in Procaryotes, Eucaryotes and Organelles", Microbiol. Rev. 47: 1-45 (1983). 62. L. Hood, M.Kronenberg og T. Hunkapiller, "T Cell Antigen Receptors and the Immunoglobulin Supergene Family", Cell 40: 225-229 (1985). 63. S. Tonegawa, "Somatic Generation of Antibody Diversity", Nature 302: 575-581 (1983). 64. J. Kyte og R.F. Doolittle, "A Simpled Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein", J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). 65. G. von Heijne, "Patterns of Amino Acids Near Signal-Sequence Cleavage Sites", Eur. J. Biochem. 133: 17-21

(1983). 66. E.A. Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immuno-logical Interest" (Washington, D.C.; U.S. Department of Health and Human Services), s. 281 (1983). 67. A.F. Williams et al., "Cell Surface Glycoproteins and the Origins of Immunity", In the Proceedings of the Sigrid Juselius Sumposium, L.C. Andersson, C.G. Gahmberg og P. Ekblom, red. (New York: Academic Press), in press (1984). 68. L.M. Amzel og R.J. Poljak, "Three-Dimensional Structure of Immunoglobulins", Ann. Rev. Biochem. 48: 961-997 (1979).

69. P.Y. Chou og G.D. Fasman, "Empirical Predictions of Protein Conformation", Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276

(1978).

70. P.J. Maddon, et al., "The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4: A new member of the immunoglobul in gene famili", Cell 42, 93-104 (1985).

71. R.A. Adams, A. Flowers og B.J. Davis, "Direct implantation and serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in hamsters" SB-2, Can. Res. 28, 1121-1125 (1968). 72. G.O. Gey, w.D. Coffman og M.T. Kubicek, "Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium", Cancer Res. 12, 264-265 (1952). 73. R.J.V. Pulvertaft, "Cytology of Burkitfs tumor (African lymphoma)", Lancet I, 238-240 (1964). 74. N.J. Dimmock, "Initial stages of infection with animal viruses", J. Gen. Virol. 59, 1-22 (1982). 75. J. White, M. Kielian og A. Helenius, "Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses", Quart. Rev. Biophys. 16, 151-195 (1983). 76. M. Marsh, "The entry of enveloped viruses into cells by endocytosis", Biochem. J. 218. 1-10 (1984). 77. M. Kielian og A. Helenius, "Entry og alphaviruses. In the Togaviridae and Flaviviridae", S. Schlesinger og M.J. Schlesinger, red. (Plenum Publishing Corp.), s. 91-119 (1986). 78. S. Ohkuma og B. Poole, "Fluorescence probe measure-ments of the intralysosomal pH inliving cells and the pertubation of pH by various agents", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 3327-3331 (1978). 79. F.R. Maxfield, "Weak bases and ionophore rapidly and reversibly raise the pH of endocytic vesicles in cultured mouse fibroblasts", J. Cell. Biol. 95_, 676-681 (1982). 80. A. Helenius, M. Marsh og J. White, "Inhibition of Semliki Forest virus penetration by lysosomotropic weak bases", J. Gen. Virol. 58, 47-61 (1982). 81. R.T. Johnson og J.C. McArthur, "AIDS and the brain", TINS 9, 91-94 (1986). 82. P.M. Snow, M. Van de Rijn og C. Terhorst, "Asso-ciation Between the Human Thymic Differentiation Antigens T6 and T8", Eur. J. Immunol., in press (1985 ). 83. P.M. Snow og C. Terhorst, "The T8 Antigen is a Multimeric Complex of Two Distinct Subunits on Human Thymocytes but Consists of Homomultimeric Forms on Peripheral Blood T Lymphocytes", J. Biol. Chem. 258: 14675-14681 (1983). 84. C. Terhorst et al., "Biochemical Analysis of Human T Lymphocyte Differentiation Antigens T4 and T5", Science 209: 520-521 (1980). 85. W.H. Hildemann, "Immunocompetance and Allogeneic Polymorphism Among Invertebrates", Transplantation 27: 1-3 (1979). 86. V.L. Scofield et al., "Protochordate Allorecognition is Controlled by a MHC-like Gene System", Nature 295: 499-502 (1982). 87. T.L. Lentz, et al., "Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor?", Science 215. 182-184 (1982). 88. J.D. Fingeroth, et al., "Epstein-Barr virus receptor of human B lymphocytes is the C3d receptor CR2", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 4510-4514 (1984). 89. P.E. Tambourin, et al., "The physiopathology of Friend leukemia", Leukemia Res. 3, 117-129 (1979). 90. A. Oliff, et al., "Isolation of transplantable erythroleukemia cells from mice infected with helper-independent Friend murine leukemia virus" Blood 58, 244-254 (1981). 91. J.E. Silver og J.M. Fredrickson, "Susceptibility to Friend helper virus leukemias in CXB recombinant inbred mice", J. Exp. Med. 158, 1693-1702 (1983). 92. P.A. Chatis, et al., "Role for the 3' end of the genome in determining disease specificity of Friend and Moloney murine leukemia viruses", Proe. Nati. Acad. Sei, USA. 80, 4408-4411 (1983). 93. P.A. Chatis, et al., "A 3<*>end fragment encompassing the transcriptional enchancers of nondefective Friend virus confers erthuro-leukemogenicity on Moloney leukemia virus", J. Virol. 52, 248-254 (1984).

' 94. A. Bosze, H.J. Thiesen og P. Charnay, "A transcriptional enchancer with specificity for erythoroid cells is located in the long terminal repeat of the Friend murine leukemia virus", EMB0 J. 5., 1615-1623

(1986). 95. A.N. Barclay, et al., "Immunoglobulin-related structures associated with vertebrate cell surface", in press. 96. M.O. Dayhoff, W.C. Barker og L.T. Hunt, "Establishing homologies in protein sequences. In Methods in Enzymology. Enzyme Structure Part I", C.H.W. Hirs og S.N. Timasheff, red. (New York: Academic Press), s. 524-545 (1983). 97. Y. Yanagi, et al., "A human T cell-specif ic cDNA clone encodes a protein håving extensive homology to immunoglobulin chains", Nature 308. 145-149 (1984). 98. G.K. Sim, et al., "Primary structure of human T-cell receptorchain" Nature 312, 771-775 (1984). 99. H. Saito, et al., "A third rearranged and expressed gene in a clone of cytotoxic T lymphocytes", Nature 312, 36-40 (1984).

100. H. Saito, et al., "Complete primary structure of the E chain and gene of the mouse major histocompatibility complex", Proe. Nati. Acad. USA 80, 5520-5524

(1983).

101. M. Isobe, et al., "The gene encoding the T-cell surface protein T4 is located on human chromsome 12", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83, 4399-4402 (1986).

102. J.M. Roberts og R. Axel, "Gene Ampiification and Gene Correction in Somatic Cells", Cell 29., 109-119 (1982 ).

103. D.S. Pfarr, G. Sathe og M.E. Reff, "A Highly Modular Cloning Vector for the Analysis of Eucaryotic Genes and Gene Regulatory Elements" DNA, 4, 461-467 (1985).

104. G. Urlaub og L.A. Chasin, "Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient In Dihydrofolate

Reductase Activity", Proe. Nati. Acad. Sel. USA, 77, 4216-5220 (1980).

105. D. Gay et al. "Nature" 328: 626-629 (1987).

106. B.D. Sleckman et al., "Nature" 328: 351-353 (1987).

107. Yanisch-Perron, et al., "Gene" 33: 103 (1985).

108. P. Berg, et al., "Mol. Cell" Biol. 3: 246 (1983).

109. Subramani, et al., "Mol. Cell" Biol. 1: 854 (1981).

110. Frayne, et al., "Mol. Cell" Biol. 4: 2921 (1984).

111. Schumperli, et al.,- Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79: 257 (1982).

112. Gross, et al., "Mol. Cell." Biol. 5: 1015 (1985).

113. Pfarr, et al., DNA 5: 115 (1986).

114. Rao, et al., "Cell Immunol." 80: 310 (1983).

115. McClure, et al., "Cold Spring Harbor Conference on

Cell Proliferation" 9: 345 (1982).

116. Urlaub, et al., Cell 33: 405 (1983).

117. Kim, et al., Cell 42: 129 (1987).

118. Wigler, et al., PNAS USA 76: 1373 (1979).

119. Copeland, et al., Cell 17: 993 (1979).

120. Sattentau, et al., Science 234: 1120 (1986).

121. Greenstein, et al., Ann. Inst. Pasteur 138: 134

(1987 ).

122. Gay, et al., Ann. Inst. Pasteur 138: 127 (1987).

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori polypeptidet omfatter et polypeptid som har aminosyresekvensen vist på sidene 18-19, fra omtrent +1 til omtrent +104 koblet til et andre polypeptid som har aminosyresekvensen fra omtrent +349 til +367,karakterisert vedå dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsviktvirus kappe glykoprotein, hvori polypeptidet omfattende aminosyresekvensen vist på sidene 18-19 fra omtrent +1 til omtrent +104,karakterisert vedå dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 18-19 fra omtrent +1 til omtrent +104 koblet til et andre polypeptid forutsatt at det andre polypeptid ikke har sekvensen fra +105 til +369,karakterisertved å dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 18-19 fra omtrent +1 til omtrent +104 og et andre polypeptid, hvori det andre polypeptidet er et antigen,karakterisert vedå dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein med evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 18-19 fra omtrent +1 til omtrent +104 og et andre polypeptid, hvor det andre polypeptidet er et bærerprotein,karakterisert vedå dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og tranlasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et hybridprotein som har evne til spesifikt å danne et kompleks med human immunsvikt virus kappe glykoprotein, hvori hybridproteinet omfattende et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen vist på sidene 18-19 fra omtrent +1 til omtrent +104 og et andre polypeptid, hvori det andre polypeptidet er et annet sT4 polypeptid, karakterisert vedå dyrke en egnet vertscelle som inneholder en DNA sekvens kodende for nevnte polypeptid i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som har evne til å dirigere ekspresjonen av nevnte DNA sekvens, hvorpå polypeptidet blir isolert og renset.