DK175816B1 - Terapeutisk middel, der specifikt kan danne et kompleks med et kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, og som omfatter et polypeptid - Google Patents

Description

DK 175816 B1 I

Den foreliggende opfindelse angar et terapeutisk middel, som er i stand til specifikt I

I at danne et kompleks med viruskappeglycoproteinet af humant defektvirus omfat*

tende et polypeptid. Opfindelsen angar endvidere et farmaceutisk præparat, der I

omfatter en virksom mængde af et terapeutisk middel samt en farmaceutisk I

5 acceptabel bærer. Det farmaceutiske præparat er især egnet til anvendelse ved I

behandling af infektion med et humant immundefektvirus. Opfindelsen angår I

endvidere en ekspressionsvektor, der koder for et polypeptid som anført ovenfor. I

Den foreliggende opfindelse angår også en værtscelle, som omfatter ekspressions- I

vektorerne ifølge opfindelsen. I én udførelsesform for opfindelsen er en egnet vært I

10 en bakteriecelle. I en anden udførelsesform af opfindelsen er bakteriecellen en I

Escherichia coli-celle. I en yderligere .udførelsesform af opfindelsen er en egnet I

vært en eukaryot celle. I endnu en udførelsesform af opfindelsen er den eukaryote I

celle en pattedyrcelle eller en gærcelle. I yderligere en udførelsesform af opfindel- I

sen er en egnet vært en insektcelle. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde I

15 til fremstilling af et terapeutisk middel som ovenfor angivet, hvilken fremgangs- I

måde går ud på, at et værtsvektorsystem som ovenfor angivet dyrkes under I

hensigtsmæssige betingelser, der tillader produktion af det terapeutiske middel, I

hvorefter det således fremstillede terapeutiske middel isoleres. I

20 1 nærværende beskrivelse henvises der til flere publikationer med arabertal i I

parenteser. En liste over disse publikationer er angivet i slutningen af beskrivelsen I

umiddelbart før patentkravene. Der henvises til disse publikationer i deres helhed, I

således at der kan gives en mere omfattende beskrivelse af standpunktet af den I

teknik, hvortil opfindelsen hører. I

De forskellige funktionefle klasser af T-lymfocytter genkender antigen på overfla- I

den af bestemte målcellepopulationer. T-hjælperceller samvirker i høj grad med makrofager og B-celler; cytotoxiske T-celler samvirker med et bredere område af antigenbærende målceller. Disse cellulære genkendelsesbegivenheder medieres 30 sandsynligvis af den specifikke forbindelse mellem overflademolekyler på både effektor- og målceller. Overfladen på T-celler er karakteriseret ved en række polymorfe samt ikke-polymorfe proteiner, som for størstedelens vedkommende er begrænset til T-lymfocytter. Selv om de fleste af disse molekyler er fælles for alle T-celler, er to klasser af overfladeproteiner konstant forskellige på de forskellige H DK 175816 B1

^R

^R

funktionelle klasser af T-celler, og disse proteiner er impliceret i T-celle-målcelle-^R interaktioner.

^R Én klasse overflademolekyler adskiller de vigtigste funktionelle underklasser af T- .

^R 5 lymfocytter: overfladeglycoproteinerne T4 og T8. Tidligt i udviklingen af thymus ^R udtrykkes glycoproteinerne T4 og T8 sammen på overfladen af thymocytter (1). 1 det perifere immunsystem udtrykkes T4- og T8-molekylerne på fælles eksklusive ^R underklasser af T-celler og udtrykkes kun sjældent på den samme celle (2, 3). T4- ^R molekylet udtrykkes pi T-celler, der samvirker med målceller, som bærer mole- ^R 10 kyler af klasse Π hoved-histokompatibilitetskompleks (MHC), mens T8-bærende T- H celler samvirker med målceller, der udtrykket klasse I MHC-proteiner (4, 5, 6, 7, 8, ^R 9). T4-populationen af T-lymfocytter indeholder hjælperceller, mens T8-popula- H tionen indeholder hovedparten af cytotoxiske celler og suppressorceller (6, 10).

H Imidlertid kan sjældne T4+-T-celler fungere som cytotoxiske celler eller suppres- 15 sorceller (6, 10), hvilket tyder på, at ekspressionen af T4 eller T8 er mere stringent H forbundet med MHC-klassegenkendelse end med effektorfunktion. Disse molekylers betydning for T-celle-mål-celle-interaktioner kan påvises ved undersøgelser med monoklonale antistoffer. Antistoffer rettet mod specifikke epitoper på T4-molekylet (eller muse-ækvivalenten L3T4) inhiberer antigeninduceret T-celle-proliferation, H 20 lymfokinafgivelse og hjælpercellefunktion (7, 8, 11, 12, 13). På lignende måde inhiberer monoklonale antistoffer rettet mod T8 (eller muse-ækvivalenten Lyt2) cytoxisk T-cellemedieret drab (14, 15). Disse observationer har sammen med det H faktum, at T4 og T8 ikke udviser polymorfisme af betydning, ført til den hypotese, at T4 og T8 genkender ikke-polymorfe regioner på molekyler af henholdsvis klasse 25 II og klasse I.

En anden klasse af proteiner, som formodes at være forskellige på forskellige effektor-T-celler, er de receptorer, som genkender antigen i forbindelse med R polymorfe regioner på MHC-molekyler (16, 17, 18). Interaktionerne af hjælper-T- I 30 lymfocytter er stort set begrænset til antigenbærende målceller, der udtrykker klasse II MHC-proteiner, hvorimod cytotoxiske celler og suppressor-T-celler er I begrænset til målceller, der bærer klasse I MHC-molekyler (4, 5, 6, 7, 8, 9). Disse I specifikke interaktioner kan medieres af den T-cellereceptor (eller -receptorer), I som genkender antigen i sammenhæng med specifikke MHC-molekyler (17, 18).

I 35 Således kan T-lymfocytten have to uafhængige receptorer, som er i stand til både 3 DK 175816 B1 at genkende konstante og polymorfe determinanter af MHC-proteiner, og disse receptorer Icon veers ansvarlige for specifik målre^n'n0 fijr»irHr»npir fnr^kpiiicie t-cellepopulationer.

5 Erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) hos mennesker er karakteriseret ved en mangel på T4+-lymfocytter. Som følge heraf er T-cellemedieret immunitet svækket hos AIDS-patienter, hvilket medfører forekomst af alvorlige opportunistiske infektioner og usædvanlige neoplasmer. AIDS skyldes infektion af T-lymfocytterne med en række nært beslægtede retrovirus (LAV, HTLV-II1 eller ARV), der nu betegnes 10 humant immundefektvirus (HIV). Disse agens' infektionsområde er begrænset til celler, der udtrykker T4-glycoproteinet på deres overflade.

Derfor kan T4-glycoproteinet ikke blot tjene som receptor for molekyler på overfladen af målceller, men også som receptor for AIDS-virus. Monoklonale antistoffer 15 rettet mod T4 blokerer AIDS-virusinfektion af T4+-celler in vitro. Desuden har nylige undersøgelser vist, at når T4'l-T-lymfocytter udsættes for AIDS-virus, er det 110 kD lange kappeglycoprotein på viruset forbundet med T4-molekylet på værtscellen. Virusets lymfotrope karakter kan derfor forklares ved den begrænsede ekspression af dets receptor, T4, i subpopulationer af T-lymfocytter.

20

Manglen på T4+-T-lymfocytter ved AIDS bevirker en svækkelse af det cellulære immunrespons. Desuden ledsages AIDS hyppigt af centralnervesystem-(CNS)-dysfunktion, hvilket som oftest er en følge af en subakut encephalitis. RNA og DNA fra AIDS-virus er blevet identificeret i angrebne hjerner, og virus er blevet isoleret 25 fra både hjernen og cerebrospinalvæsken fra patienter med neurologiske.lidelser.

Disse iagttagelser antyder, at AIDS-virus inficerer hjerneceller og er direkte ansvarligt for de CNS-læsioner, der ses hos AIDS-patienter. AIDS-virus kan således være neurotropisk såvel som lymfotropisk. Det er derfor vigtigt at bestemme, om T4 også udtrykkes i CNS, eller om yderligere hjernespecifikke overflademolekyler 30 kan tjene som receptor for AIDS-virus.

Opklaringen af de specifikke interaktioner mellem T4 og T8 ville blive lettere, hvis man kunne isolere T4- og T8-generne, bestemme deres struktur og indføre dem i forskellige cellulære omgivelser. Isolering og sekventering af cDNA, som koder for 35 T8-molekylet, er for nylig beskrevet (19, 20, 21). Den udledte proteinsekvens indi-

I DK 175816 B1 I

Η I

H kerer, at T8 er et membranbundet glycoprotein med et N-terminalt område, som er I

H homologt med det variable område af de lette immunglobulinkæder. I

H Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere forklaret under henvisning til teg- 1 I

5 ningen, hvor: I

H Fig. 1 viser cytofluorografiske mønstre over indirekte I

H immunfluorescensfarvning med ΟΚΤ·4 og ΟΚΤ·8Ρ I

10 Celler (5x10s) blev inkuberet med de muse-monoklonale antistoffer ΟΚΤ·4Β eller I

OKT*8, vasket og derpå inkuberet med FITC-konjugeret gede-antimuse-immun- I

globulin. Cellerne blev analyseret på en FACS IV Cell Sorter og plottet med en VAX I

11/780-computer som celletal i forhold til log fluorescens. Utransformerede NIH I

3T3-celler og L-celler gav identiske cytofluorografiske spor. Fro 2.2 er en leukæ- ‘ I

15 misk T-cellelinje med fænotypen T3'; T4+; T8+; Tll+. LTD-4 er en T4+-primær I

L-celletransformant vundet efter overførsel af totalt genomisk DNA. 3A+ er en NIH I

3T3-cellelinje, som blev transformeret med en T4-PMV6tk/neo retroviral ekspres- I

sionskonstruktion. I

20 Fig. 2 viser northern blot-analyse af RNA fra T4+- og T4 -L-celler I

og humane celler I

I 3 pg poly(A)+ RNA eller 12 pg totalt RNA (perifere T-celler og thymocytter) blev I

I underkastet elektroforese gennem en 0,8% agaroseformaldehydgel, blottet på I

I 25 GeneScreen (New England Nuclear) og probet med en 32P-mærket 0,6 kb lang I

I T4-cDNA-indsætning. T4+-celler omfatter LTD-4 (T4+-, T8'-L-celletransformant), I

I SK-7 T-cellehybridom (T44, T8 ), OT-CLL leukæmi (T4+, T8 ), Fro 2.2 leukæmi I

I (T44, T8), T4-berigede perifere T-lymfocytter og humane thymocytter. T4'-celler I

omfatter utransformerede celler, tk7 (T8+-L-celletransformant), HeLa-celler, hu- I

H 30 man neuro-blastomceller (IMR) og T8-berigede perifere T-lymfocytter. Banen for I

I human thy-mocyt blev eksponeret 4 gange længere og fotograferet på højkon- I

I t rastfilm. I

Fig. 3 viser restriktionsnukleasekort over pT4B og T4-genet, I

35 sekventeringsstrategi og rekombinante vektorer I

5 DK 175816 B1 Δ RamHl-rp<;tTiliHnr>c:fr;*nrr\f»nfrprr\o af r>T4R rHNft nn Td-nonpf ctillpf nå limp Rækkefølgen af BamHI-fragmenter i T4-genet blev bestemt ved Southern blotanalyse og genomisk klonkortlægning. 5'-enden af pT4B og T4-genet stillet på linje 5 er vist med stiplede linjer, og det mørke område i pT4B svarer til den kodende sekvens. De angivne størrelser er i kilobaser.

B. Sekventeringsstrategi. Pilene viser længden af sekvensen bestemt ved subkloning af fragmenter i M13 og sekventering ved dideoxyterminerings- 10 proceduren (36).

C. Eukaryote ekspressionsvektorer. Disse konstruktioner indeholder to Moloney museleukæmivirus-"long terminal repeats" (LTR), hvis orientering er vist med pile. pT4B cDNA'et blev subklonet i EcoRI-stedet på hver vektor i den viste orientering.

15 (a) T4-pVcos7-konstruktionen.

(b) T4-pMV6tk/neo-konstruktionen indeholder neomycin-phosphotransferasegenet fusioneret med HSV-thymidinkinase-promotoren.

Fig. 4 viser Southern blot-analyse af DNA fra utransformerede L-celler og 20 T4+-L-celler og T-, B- og ikke-lymfoide humane celler 10 pg cellulære DNA'er blev skåret med BamHI, underkastet elektroforese gennem en 0,8% agarosegel, blottet på GeneScreen og probet med en nick-translateret pT4B cDNA-indsætning. De anførte størrelsesmarkører er i kilobaser. Hybridise-25 rende bånd med en størrelse på 20 kb, 6,6 kb, 4 kb, 1,8 kb og 1 kb fremkommer i alle humane DNA’er. DNA'er af T4‘, ikke-lymfoid oprindelse omfatter utransformerede L-celler, humane fibroblaster (GM), human neuroblastomceller (NB) og HeLa-celler. CB, CP58 og CP94 er DNA'er afledt af EBV-transformerede humane B-cel-lelinjer. LTD-4 er den T4+-primære L-celletransformant. RPMI og HSB2 er T4'-hu-30 mane T-cefleleukæmilinjer; E+-celler og thymocytter (Thym.) indeholder T4+-T-celler. OT-CLL, Jurkat (Jurk.), Fro 2.2, CEM og Molt 4 er T4+-T-celler. g?.M4 er en genomisk klon, som indeholder sekvenser, der strækker sig over 3'-enden af T4-genet.

I DK 175816 B1 I

I 6 I

I Fig. 5 viser immunudfældning af T4-glycoproteinet fra NIH 3T3-celler I

B transformeret med de retrovirale ekspressionskonstruktioner

I L-[3SS]-methioninmærkede proteiner fra to uafhængige NIH 3T3-trans-formanter, I

B 5 perifere T-lymfocytter og utransformerede 3T3*celler, blev underkastet linselectin- I

B kromatografi for at isolere glycoproteiner. 2,5xl06 cpm af hver prøve blev klaret og I

B derefter immunudfældet med monoklonale OKT»4-antistoffer og Protein A-Sepha- I

B rose. Kuglerne blev vasket, opløst i prøvebuffer og underkastet elektroforese i en I

B 10% SDS-polyacrylamidgel under reducerende (bane a-d) og ikke-reducerende I

B 10 (bane e og f) betingelser. Bane a, utransformerede NIH 3T3-celler. Bane b, T4C2, I

B en NIH 3T3-celle transformeret med T4-pVcos7-konstruktionen. Bane c og e, 3A+, I

B en NIH 3T3-celle transformeret med T4-pMV6tk/neo-konstruktionen. Bane d og f, I

B perifere humane T-lymfocytter. Relative molekylvægte (Mr) er angivet i kilodalton; I

B 15 Fig. 6 viser nukleotidsekvensen af T4-cDNA og den translaterede I

B sekvens af T4-proteinet I

B Nukleotidsekvensen og den forventede aminosyresekvens af cDNA-klonen pT4B I

B opnået ved den i fig. 3B viste sekventeringsstrategi. Tal over aminosyresekvensen I

B 20 betegner aminosyreresternes stillinger. Tallene til højre angiver nukleotidstillinger.

B Alle ekstracellulære cysteiner er markeret med (·) eller (o). Ledersekvensen (L), I

B variabel-lignende (V), forbindelses-lignende (J), transmerhbrane (TM) og cytoplas- I

B miske (CYT) områder er vist med horisontale pile under sekvensen, selv om de I

B nøjagtige grænser er uklare. To potentielle N-forbundne glycosyleringssteder (Asn-

B 25 Leu-Thr) er også vist (CHO). I

B Fig. 7 viser in vitro translateret RNA stammende fra SP6-transkription I

B T4-cDNA-indsætningen med fuld længde blev subklonet i RNA-ekspressionsvek- I

B 30 toren pSP65 (Promega Biotec). Lineariseret plasmid-DNA blev transkriberet med

B SP6-polymerase (40), og RNA blev translateret i et hvedekimsystem (Bethesda I

B Research Laboratories) indeholdende L-[35S]-methionin. In v/fro-translationspro- I

B dukterne blev underkastet elektroforese gennem en 10% SDS-polyacrylamidgel I

B (bane T4). Bovin hypofyse-RNA (BP) blev anvendt som kontrol. Relative molekyl- I

B 35 vægte (Mr) er angivet i kilodalton. I

i 7 DK 175816 B1

Fig. 8 viser skematisk et diagram over det T4-glycoprotein, der j strækker sig over cellemembranen i 5 T4 består af fire tandem VJ-lignende områder (V1J1-V4J4). et hydrofobt segment, ! der strækker sig over membranen (skraveret areal), og et ladet cytoplasmisk område (CYT). To potentielle N-forbundne glycosyleringssteder i den ekstracellulære del er vist (·—). Positionerne af intronerne 2-8 i T4-genet er også markeret (A).

10 Fig. 9 viser T4's variable, forbindende og transmembrane område stillet på linje med medlemmer af immunglobulin-genfamilien A. T4’s variable områdes aminosyresekvens er stillet på linje med en muselet-kap-pa-immunglobu)inkæde J606 (66), T8 (20), en human T-celleantigenreceptors β- 15 kæde YT35 (97) og en human T-celleantigen-receptors α-kæde HPB-MLT a (98).

De invariante rester i det lette kædevariable område er også stillet på linje (Inv.). Aminosyresekvenserne blev stillet på linje for at maksimere identiteter og strukturelle homologier med T4, som er vist som rester i kasser. Linjerne under sekvensen med bogstaverne A, B, C, C, D, E, F og G angiver de rester, som danner β-20 strenge (67). β-streng G fortsætter ind i J-sekvensen.

B. Aminosyresekvensen af T4‘s forbindende område stillet på linje med consensus-J-sekvenserne af T-celleantigenreceptorens β-kæde, immunglobulin λ og κ lette kæder og J-sekvensen af den humane T-cellereceptors «-kæde (99).

25 C. T4‘s transmembrane områder stillet på linje med en MHC klasse II β-kæde (100). Det formodede transmembrane område (TM) er angivet under sekvensen.

Fig. 10 viser restriktionsnukleasekort over T4-genet i humant 30 kromosomalt DNA

Positionerne af de 9 exoner blev bestemt ved genomisk klonkortlægning, Southern blot-analyse og nukleotidsekventering. Ledersekvensen (L), variabel-lignende (V), forbindelses-lignende (J), transmembrane (TM) og cytoplasmiske (CYT) områder er 35 vist med kasser. Positionen af methioninkodonen omgivet af initieringsconsensus-

DK 175816 B1 I

sekvensen er vist (ATG) ved begyndelsen af lederexonen (L); terminationskodonen I

TGA er vist ved enden af den anden cytoplasmiske exon (CYT). De angivne størrel- I

ser er i kilobaser. H

5 Fig. li viser rekombinante retrovirale ekspressionsvektorer og konstruktion I

af transformerede celler H

A. Rekombinante retrovirale ekspressionsvektorer. pMV7 indeholder to direkte gen- H

tagne Moloney musesarkomvirus "long terminal repeats" (LTR) i den med pile viste I

10 orientering. pMV7 indeholder også det bakterielle neomycin-phosphotransferasegen I

(neo) fusioneret til HSV-thymidinkinasepromotoren (tk). cDNA-indsætninger i fuld H

længde, der koder for T4 (T4B) (70) eller T8 (T8F1) (20), blev subklonet i EcoRI- I

stedet i den med pile viste orientering, hvilket gav henholdsvis T4-pMV7 og T8- H

pMV7. De kodende sekvenser er vist som sorte områder. De angivne størrelser er i I

15 kilobaser. H

B. Retrovirusmedieret genoverførselsstrategi. H

Fig. 12 viser effektiviteten af infektion af naturligt isolerede og I

20 transformerede T4+-celler I

Celler blev inokuleret med 10-ganges seriefortyndinger af AIDS-virus, inkuberet i I

18 timer ved 37°C, vasket og udpladet i mikrokultur. Frekvensen af inficerede kul- H

turer blev bestemt ved et enzymbundet immunabsorbentassay (ELISA) 12 dage H

25 efter infektion (46). Resultaterne blev plottet som procent positive kulturer i for- I

hold til log virusfortynding. Infektiøst virustiter (ID-50) defineres som det reciprok-

ke af den fortynding, ved hvilken 50% af kulturerne er viruspositive (47). Naturligt I

j isolerede T4+-celler omfatter phytohæmagglutinin (PHA)-stimulerede normale peri- H

fere lymfocytter (·-·) og T-cellelinjen CEM (o-o). T4+-transficerede celle- I

30 linjer omfatter HSB2-T4+-T-celler (▲-a) og Raji-T4+-B-celler (-). De I

! T8+-transficerede cellelinjer HSB2-T84 og Raji-T8+ (□-□) tjente som kontroller I

ved disse undersøgelser. H

Fig. 13 viser dannelse af syncytier i T4+-HeLa-transformanter I

9 DK 175816 B1 A. 2xl05 enkeltlags HeLa-T4+-transformanter blev blandet med 2x10° AIDS-virus- α**λ/<πλλι·λλ/Ιλ UH /«λΙΙλγ λλι inLiiKArnk wqH 7 “70/” lanff Analco af l/ι ilfifrorna off o r 18 timer viste, at over 90% af kernerne i enkeltlagsarket var indeholdt i syncytier.

5 B. Anti-T4A-monoklonalt antistof (1:20) blev sat til de blandede kulturer ved tidspunktet for podning. Iagttagelse af kulturerne efter 18 timer viste fuldstændig fraværelse af cellefusion.

Kulturerne blev fotograferet ved 160 X forstørrelse.

10

Fig. 14 viser flow-cytometrisk analyse af AIDS-virusbinding til T4+- transformerede celler

Diagram A. Celler (5x10s) blev inkuberet med fluoresceinkonjugerede anti-T4A- 15 (-) eller anti-T8- (—) monoklonale antistoffer, vasket og analyseret ved cyto- fluorometri.

Diagram B. Celler (5xl05) blev inkuberet med buffer (—) eller AIDS-virus (-), vasket, inkuberet med fluoresceinkonjugeret anti-AIDS-virusantistof og analyseret 20 ved cytofluorometri.

Diagram C. Celler (5xl05) blev inkuberet med buffer (—) eller med anti-T4A- monoklonalt antistof efterfulgt af AIDS-virus (-) eller med anti-T8 monoklonalt antistof efterfulgt af AIDS-virus (-·-·-). Efter vask blev der tilsat fluoresceinkonju-25 geret anti-AIDS-virus-antistof, og cellerne blev analyseret ved cytofluorometri.

Fluorescenshistogrammer (celletal i forhold til fluorescensintensitet) af hver cellelinje er opstillet horisontalt.

30 Fig. 15 viser northern blot-analyse af RNA afledt af menneske- og musehjerne, lymfoide og myeloide celler A. Northern blot-analyse af humane RNA-prøver. 1 ug poly(A)·* RNA fra Raji (T4'-B-cellelinje), U937 (T4+-monocytisk cellelinje) og Jurkat (T4+-T-cellelinje) og 5 pg 35 poly(A)+ RNA fra cerebral cortex blev underkastet elektroforese gennem en 1%

I DK 175816 B1 I

I I

I I

agarose-formaldehydgel, blottet på Hybond (Amersham) og probet med en 32P- B

mærket T4-cDNA-indsætning, pT4B (70). B

B B. Northern blot-analyse af muse-RNA-prøver. 5 pg poly(A)+ RNA fra 3T3-celler B

B 5 (fibroblastcellelinje), forhjerne og baghjerne og 20 pg totalt RNA fra thymocytter B

B blev underkastet elektroforese gennem en 1% agarose-formaldehydgel, overført til B

I Hybond og probet med en 32P-mærket L3T4 cDNA-indsætning, pL3T4B. ' B

Fig. 16 viser et plasmidkort over psT4DHFR B

I 10 I

B Plasmidet psT4DHFR er et pl)C18-derivat, der indeholder baseparrene 1-1257 af B

T4-cDNA-klonen pT4B, som koder for T4’s ledersegment og ekstracellulære seg- B

ment. Dette sT4-cDNA indsættes mellem en tidlig SV40-promotor og en syntetisk I

linker, som indeholder en TAA-termineringskodon (indsætning) efterfulgt af poly- B

B 15 adenyleringsregionen af det bovine væksthormongen. sT4-ekspressions-kassetten B

B er forbundet med en muse-dhfr-ekspressionskassette, som består af |t-globinpro- B

B motoren, muse-dhfr-kodende sekvens og SV40-polyadenyleringsregionen. B

B Rg. 17 viser fluorescenshistogram (celletal i forhold til fluorescensintensitet B

B 20 B

B sT4 inhiberer HIV-binding til T4+-CEM-celler. Celler blev inkuberet med buffer B

B HIV præinkuberet med sT4 (-) eller med HIV præinkuberet med kon- B

B centreret kontrolsupernatant fra utransformerede DXB-ll-celler (—), vasket, B

B udsat for fluorescenskonjugeret anti-HIV-antistof og analyseret ved cytofluoro- fl

B 25 metri. Der er vist et fluorescenshistogram (celletal i forhold til fluorescensinten- B

B sitet). B

B Fig· 18 viser inhibering af HIV-infektivitet med sT4 B

B 30 Der blev udført infektivitetstitrering af et HIV-inokulum (ID-50-assay). 10 ganges B

B seriefortyndinger af virusinokulum inkuberes med indikatorceller (PHA-stimulerede B

B humane lymfocytter) i 18 timer. Cellerne vaskes derefter og udplades i mikrokultur B

B (1 x 105 celler pr. kultur, 10 kulturer pr. fortynding). På dag 4, 8 og 12 testes su- B

B pernatanterne for HIV ved antigenbindingsassayet. ID-50-titrerin-ger blev udført i B

B 35 medier indeholdende 8,6 pg/ml sT4, som blev tilsat HIV-fortyndingen 30 minutter B

11 DK 175816 B1 før inokulering af cellerne og holdt i dyrkningsmedierne under hele forsøget (), eiici i meuiei iiiuciiOiucinjc: ST*t, uci νόϊ ΐΓιΐίίαϊ~ι cftci- dc irid!eder»uG IC t;~.Cr3 ΙΓ.Ο kulum (o) (forsinket tilsætningskontrol), eller i medier uden sT4 (□) (kontrol).

5 A. Plot over procent kulturer, der var HIV-positive pi dag 8, i forhold til fortynding af virusinokulum.

B. Plot over ID-50 (den reciprokke virusfortynding, ved hvilken 50% af kulturerne er positive) på dag 4, 8 og 12.

10 C. Plot over procent kulturer, der var HIV-positive på dag 8, i 1 forhold til varierende koncentrationer af sT4 under anvendelse af en 10'3 fortynding af HIV.

15 Den foreliggende opfindelse angår et terapeutisk middel, som er i stand til specifikt at danne et kompleks med viruskappeglycoproteinet af humant immundefektvirus omfattende et polypeptid. I én udførélsesform af opfindelsen omfatter polypepti-dets aminosyresekvens den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til ca. +185, hvilken sekvens er fusioneret til aminosyresekvensen fra ca. +351 til ca. +369.

20 I en anden udførelsesform af opfindelsen omfatter polypeptidets aminosyresekvens den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til ca. +106, hvilken sekvens er fusioneret til aminosyresekvensen fra ca. +351 til ca. +369. I en yderligere udførelsesform af opfindelsen omfatter polypeptidets aminosyresekvens den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til ca. +185.

25

Opfindelsen angår også et farmaceutisk præparat, som kan anvendes som terapeutisk middel til behandling af et individ, der er inficeret med et humant immundefektvirus. Dette farmaceutiske præparat omfatter en aminosyresekvens ifølge den foreliggende opfindelse, hvilken sekvens er i stand til specifikt at danne et kom-30 pleks med et kappeglycoprotein af humant immundefektvirus og er opløselig i en vandig opløsning, samt en farmaceutisk acceptabel bærer. Sådanne farmaceutisk acceptable bærere er kendte inden for det område, som den foreliggende opfindelse tilhører, og omfatter, men er ikke begrænset til, 0,01-0,1M, fortrinsvis 0,05M, phosphatbuffer eller 0,8% saltopløsning.

35

DK 175816 B1 I

Med det farmaceutiske præparat kan man behandle et individ, der er inficeret med H

et humant immundefektvirus. Behandlingen omfatter, at der til individet admini- I

streres en virksom mængde af et farmaceutisk præparat, som indeholder en far- I

maceutisk acceptabel bærer og en aminosyresekvens ifølge den foreliggende I

5 opfindelse, hvilken sekvens er i stand til specifikt at danne et kompleks med et I

kappeglycoprotein af humant immundefektvirus og er opløselig i en vandig op- løsning, med henblik på at gøre de humant immundefektvirus (også betegnet AIDS-virus), som individet er inficeret med, ude af stand til at inficere T4+-celler.

10 Karakterisering af sT4-proteinets biologiske og immunologiske egenskaber in vitro H

viser, at proteinet har værdi til forebyggelse og behandling af AIDS. Undersøgelser H

viser, at sT4-proteinet virker som inhibitor af ekstracellulær spredning og celle-til- H

celle-spredning af viruset. Da sT4 er blevet påvist at blokere virusbinding til T4+- H

målceller i kultur, antages det, at administration af sT4 til inficerede personer vil H

15 inhibere virusets ekstracellulære spredning. Derfor har sT4 værdi både som et pro- H

fylaktisk og terapeutisk middel til behandling af AIDS. I

Som profylaktisk middel administreres sT4 til individer fra højrisikogruppen eller til I

individer, som udviser udsættelse for HIV på grund af tilstedeværelsen af antistof- H

20 fer mod viruset. Administration af en virksom mængde sT4 på et tidligt stadium i H

sygdommen, eller før den sætter ind, inhiberer infektion af T4+-lymfocytter med H

HIV. Som terapeutisk middel virker administration af sT4 til personer, der er infi- H

ceret med HIV, på en sådan måde, at virusets ekstracellulære spredning inhiberes. H

25 Fusion mellem HIV-inficerede celler og andre T4+-lymfocytter ser også ud til at H

være en vej for virusspredning. Desuden kan fusion til dels være ansvarlig for H

svækkelsen af T4+-lymfocytfunktion og i sidste ende mangel på T4+-lymfocytter i H

inficerede individer. Cellefusion er både afhængig af virale kappegenprodukter og H

T4-receptoren og kan inhiberes af OKT4A eller lignende monoklonale antistoffer H

30 (Mabs) (120). sT4 griber ind i cellefusionen og formodes derfor at formindske celle- H

til-celle-spredningen af viruset og tab af T4+-lymfocytfunktion. H

T4-receptoren er monomorf, og sT4 antages derfor at være en universel inhibitor H

af virus, som genkender T4-receptorens overfladeområde, herunder alle HIV'er. H

13 DK 175816 B1 sT4 kan anvendes i kombination med andre midler, fx i forbindelse med midler rcttøt mod H!V*prctdn?r såsorp AfT!V9r,d^ franclrin^cp rvrnhPAcP ρΙΙργ Αλ/. Ft virksomt terapeutisk middel mod HIV bør forhindre virusmedieret overførsel såvel som celle-til-celle-overførsel af infektionen. sT4 kan også anvendes i kombination 5 med andre antivirale midler, fx azidoth'ymidin (AZT).

sT4-proteinet ifølge opfindelsen kan også anvendes som inhibitor af T4+-cellefunk-tion. Flere undersøgelser tyder på, at CD4-receptoren (CD4 er den generelle terminologi for den humane T4-receptor og dens modstykker i andre pattedyrceller) spil-10 ler en kritisk rolle for immuntolerance, især for patogenese og progression af autoimmune sygdomme og i værtsspecifik transplantatafstødelse. Af særlig relevans for sT4 er de iagttagelser, der er gjort med anti-CD4-Mabs. På grund af deres forbindelse med CD4-receptoren forbedrer visse af disse Mabs autoimmune responser og transplantatafstødelse. Eksempler på sådanne virkninger omfatter visse anti-CD4-15 Mabs’ inhibering af T-cellefunktion in vitro, fx antigeninduceret proliferation, lymfo-kin-udskillelse og hjælpercellefunktion; behandling af systemisk lupus erythematosus ved administration af anti-CD4-Mabs for at forsinke indtræden af muselupus; og transplantationsundersøgelser i mus, hvor en enkelt dosis muse-Mab rettet mod muse-CD4-receptoren resulterer i accept af allotransplantatet.

20

Den molekylære konsekvens af bindingen af Mab til CD4 er uklar. Mabs kan blokere forbindelsen mellem CD4 og dens ligand, hvilken ligand formodentlig er en bevaret epitop på MHC klasse Il-antigener (121, 122). I det mindste nogle af disse samme Mabs inhiberer imidlertid CD4-ceileaktivering via en tilsyneladende klasse 11-uaf-25 hængig vej.

Det antages også, at sT4 inhiberer T-celleinteraktioner som en konkurrent til cellulær T4, måske ved binding til ekstracellulære målmolekyler, der normalt samvirker med T4-receptorens overfladeområde. Denne skelnen mellem Mabs og sT4 kan 30 have betydelige funktionelle konsekvenser. Mens nogle Mabs rettet mod T4 fremkalder et respons på T4-cellen, kan sT4 fx fremkalde et respons på celler, der udtrykker MHC klasse Il-antigener. T4's affinitet for dens formodede klasse Il-ligand ser også ud til at være temmelig lav i sammenligning med de høje affiniteter hos Mabs rettet mod T4. Selv om Mabs og sT4 kan gribe ind i de samme processer, 35 påvirker de således forskellige målmolekyler og forskellige målceller.

I DK 175816 B1 I

I 14 I

I Som profylaktisk eller terapeutisk middel administreres sT4 parenteralt, fortrinsvis I

intravenøst. Midlet kan administreres ved infusion eller ved injektion, fx dagligt, I

ugentligt eller månedligt. Mængden og hastigheden af sT4-administration vælges I

5 på en sådan måde, at der holdes en virksom mængde af sT4 i kredsløbet. En alter- I

nativ administrationsmåde er uden for kroppen, hvor sT4 anvendes som dialyse- I

middel. I

sT4-proteinet ifølge opfindelsen kan også anvendes som reagens til at identificere I

I 10 naturlige, syntetiske eller rekombinante molekyler, der virker som terapeutiske I

midler eller inhibitorer af T4+-celleinteraktioner. I

Fx kan sT4-protein anvendes i screeningsassays såsom assays for protein-interak- I

tion, der måles ved ELISA-baserede metoder, til tilvejebringelse af et biokemisk I

15 rent, vandigt opløseligt reagens, som kan anvendes i kombination med andre rea- I

genser til analyse for konkurrenter til T4-receptoroverfladeområde-interak-tioner. I

H Da sT4 binder til HIV env-protein eller blandinger indeholdende HIV env-proteiner, I

kan det fx anvendes til at screene for inhibitorer af virusbinding. Baseret på in I

vitro-data, der viser, at sT4 binder til celler, som udtrykker HIV env-proteiner, kan I

20 sT4 også tjene som et selektivt målretningsmolekyle for HIV-inficerede celler in I

I vivo. Som et målspecifikt bærerprotein kan sT4 fx tjene som bærerprotein til afgi- I

velse af cytotoxiske midler til de inficerede celler. I

I Baseret på data, der viser, at T4-receptoren specifikt associerer med MHC klasse I

I 25 Il-antigener på antigenpræsenterende celler, hvilket antydes af T4+-cellers klasse- I

I begrænsning, kan sT4 desuden anvendes i kombination med klasse Il-antigener til H

at teste for inhibitorer af interaktioner mellem T-lymfocytter og målceller. Ud over H

I disse eksempler, som er baseret på direkte bindingsassays mellem sT4 og dets H

I målmolekyler, kan der udformes mere komplekse assays, hvor de biokemiske res- I

I 30 ponser på sT4-genkendelse udnyttes. I

I Opfindelsen angår endvidere en ekspressionsvektor, der koder for et polypeptid, I

hvis aminosyresekvens omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til H

I ca. +185 fusioneret til aminosyresekvensen fra ca. +351 til ca. +369. I en anden I

I 35 udførelsesform af opfindelsen koder ekspressionsvektoren for et polypeptid, hvis I

a 15 DK 175816 B1 aminosyresekvens omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til ca.

+ 106 fusioneret til aminosvresekvensen fra ca. +351 til ca. +369. I en yderligere udførelsesform af opfindelsen koder ekspressionsvektoren for et polypeptid, hvis aminosyresekvens omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til ca.

5 +185.

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af sT4, ! som består af T4-receptorens forventede ekstracellulære område. Under anvendel- i 1 se af den del af T4-cDNA’et, som koder for lederområdet og det ekstracellulære 10 område i T4-receptoren, dvs. præ sT4, konstrueres der vektorer, som kan overudtrykke sT4 i pattedyrceller. Sekvensen af én sT4 er som følger:

I DK 175816 B1 I

I I

I 10 20 30 40 80 60 I

I I

I -CAA ccc oc aoc ær ccc xrr ter cro ooc to ocr ccc txc tcc tca oac ocfTtr rr I

I 70 80 90 100 110 120 I

I

I CTC GGC AAG GOC ACk ATC AAC GOS GGA CTC CCT TIT ACG OC TIC CTT CIO CTC CTC OA I

tiet Asn Arj Gly Val Pro R* Arg His Lau Lau Lau Val Lau Gin I

UO 140 130 100 170 180 · +1 · ·

I CTG GCG CTC CTC CO GCA CCC ACT OC GGA AAG AAA GIG CTC CTC GDC AAA AAA GOC GAT I

Leu Ala Lau Lau Pro Ala Ala ΊΠτ Gin Gly Lys Lys val Val Lau Gly Lys Lys Gly Asp I

I 190 200 210 220 230 240 I

I

I ACA GIG GAA CTG ACC TCT ACA GCT TCC CAG AAG AAG AGC ATA CAA TTC OsC TOG AAA AAC I

Thr Val Glu Leu Thr Cys ΤΛr Ala Sar Gin Lys Lys Sar Zla Gin R» His Trp Lys Asn

I 250 260 270 280 290 300 I

I

TCC AAC OG ΑΣλ AAG ATI CTG QGA AKT CAG QGC TCC TCC ΤΛ ACT AM GCT CCA TCC AAG I

Ser Asn Gin Ila Lys 11a Lau Gly Asn Gin Gly Sar R* Lau Ost Lys Gly Pro Ser Lys I

I 310 320 330 340 350 360 I

·»···» H

CTG AAT GAT CCC GCT GAC TCA ACA AGA AGC CIT TOG GAC CAA OCA AAC TIC OCE CTG ATC I

H Leu Asn Asp Arg Ala Asp Sar Arg Arg Sar Lau Trp Asp Gin Gly Asn (ts Pro Lou Ila I

I 370 380 390 400 UO 420 I

I

I ATC AGC AAT CXT AAG ΑΊΛ GAA GAC lt> GAT ACT UC A1C TOT GAA CTG GAG GAC CSC AAG I

Ile Lys Asn Lau Lys Ila Glu Asp Sar Asp Thr Tyr 11· cys Glu Val Glu Asp Gin Lys I

430 440 450 460 470 480 I

a * · 104 I

GAG GAG CTC CAA TIG CIA GIG TIC GGA TIG ACT GOC AAC TCT GAC ACC CAC CIG CTT CSC

Glu Glu Val Gin Lau Lau Val Rs Gly Lau Hu: Ala Asn Sar Asp Hir His Lau Lau Gin

I 490 500 510 520 530 540 I

Η I

I GGG OG AGC CIG ACC CTG AGC TIG GAS ACC CCC CCT GCT AGT AGC CCC TCA CTG CAA TCT I

ciy Gin Sar Lau Dir Lau Thr Lau Glu Sar Pro Pro Gly Sar Sar Pro Sar val Gin Cys I

550 560 570 530 590 600 I

I ACG AGT OCA AGG GCT AAA AAC Αϊλ OG COS GGG AAC ACC CTC TCC GTG TCT OG CTG GAG I

Acg Sar Pro Arg Gly Lys Asn Ha Gin Gly Gly Lys Hir Lau Sar val Sar Gin Lau Glu I

I 610 620 630 640 650 660 I

H ··**»· I

I CTC OG GAT ACT QGC ACC TOG AOt TCC ACT CTC TIG OG AAC OG AAG AAG CTG GAG TTC ' I

Lau Gin Asp Sar Gly Hor Trp Ihr cys Thr Val Lau Gin Asn Gin Lys Lys Val Glu Ri· I

17 DK 175816 B1 «70 680 690 710 720 730 * * * 183* · * AAA AXX GAC ATC CTO CTC CIA OCT TTC CAG MCI OCC TCC AGC A2A CTC TXT AAC AAA GAG Lya II· Asp II· Vel Val Lau Ala (h· Gin Lyt Ali Sar S*r U· Vel Tyr Lys Lys Glu 730 740 750 760 770 , 780 * · · * · · CGG GAA OG CTC GAC TTC TOC TTC CO CTC GCCTTTACACITCAAAKiCICACG GOC ACT Gly Glu Gin Vel Aep (hi Seir Eha Pro Lau Ala tha Thr Val Glu Lys L«u Us Gly Sar 790 800 810 820 830 840 * · · · » ·

GGC CMC CTG TOG TGG OG COG CM3 AGG GCT TOC TCC TCC AAG TCT TOC ATC ACC TTT GAC

Gly Glu Lou Trp Τερ Gin Ala Glu Arg Ala Sar Sar Sar Lys Sar Trp 11· Thr Iha Asp 850 860 870 880 890 900 * * * · * *

CTO AAG AAC AAG GAA CTC TCT GIA AAA CGG GIT AOC GVJ GAG CCT AAG CTC OC ATO GOC

Lou Lys Asn Lys Glu val Sar Val Lya Arg Val Oir Gin Asp Pro Lys Lau Gin Har Gly 910 920 930 940 950 960 • · · · * ♦ AAGAAcarasercourcicAaccrcccceeGCCTrcccrcAGixTGCTGQc tot gca

Lys Lys Lau Pro Lau His Lau Thr Lau Pro Gin Ale Lau Pro Gin Tyr Als Gly Sar Gly 970 900 990 1000 1010 1020 • * · · · ·

AAC CTO ACC CTC GCC CIT GAA GCG AAA AA GGA AAC TIG CAT OG GAA CTO AAC CTO CTG

Asn Lau Thr Lau Ale Lau du Ali lys Thr Gly Lys Lau His Gin Glu Vil Asn Lau Val 1030 1040 1050 1060 1070 1080 * * · * » ·

CTO ATO AGA GCC ACT OO CXC CM# AAA AAT TTO ACC TCT GAG GIG TOC GGA COC AOC TCC

Val .ler Arg Ale Thr Gin Lau Gin lys Asn Lau Thr cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Sar 1090 1100 1110 1120 1130 1140 • * · · * *

CCT AAG CTO ATO CTG ACC TTO AAA CTO GAG AAC AAG GAG GCA AAG CTO TOG AAG OGG GAG

pro Lys Lau Mae Lau Sar Lau Lys Lau Glu Asn lys Glu Ale Lys Val Sar Lys Arg Glu 1130 1160 1170 1130 1190 1200 * · · · · ·

AAG CCS CTO TOG CTG CTG AAC CCT GAG <303 G0G AK TOG C3G TOT CTO CTO AGT GAC TOG

Lys Ala v*l Ttp Val Uu Am Prt> Glu Ala Gly flat %p Gin cys Lau Isu Sar Asp Sar 1210 1220 1230 1240 1250 1260 » * .* · * ·

GGA OG CTO CTG CTO GAA TOC AAC ATO AAG CTT CTO COC XX TOG TOC ACC COG GTO TAA

Gly Gin Val Lau Lau Glu Sar Asn 11a Lys Val Uu Pro Thr Trp Sar Thr Pro Val - 351 369 1270 TOG GCC CTC TNG λ

I DK 175816 B1 I

I 18 I

I Den kodende sekvens for sT4 fås fx ved syntese af genet under anvendelse af den I

I kendte DNA-sekvens ved standardmæssige kloningsteknikker på basis af sekven- I

I sen og ved reisolering ved detektion af protein, dvs. transfektion af cDNA-kloner I

I fra T4-udtrykkende cellelinjer og identificering ved hjælp af antistoffer rettet mod I

5 proteinet. cDNA-kloner, som bærer den sT4-kodende sekvens, identificeres ved I

I hjælp af oligonukleotid-hybridiseringsprober. Proberne udformes på basis af T4- I

proteinets kendte sekvens. Efter identificering af en klon, som bærer den sT4- I

kodende sekvens, skæres den kodende sekvens ud ved hjælp af restriktionsendo- I

I nukleaser og indsættes i klonings- og/eller ekspressionsvektorer. I en ekspres- I

10 sionsvektor er den sT4-kodende sekvens operativt forbundet med regulerende I

funktioner, som kræves eller er ønskede for transkription, translation og proces- I

I sering af den kodende sekvens. I

Regulerende funktioner omfatter fx funktioner, der kræves til RNA-polymerase- I

15 binding og -transkription, samt andre funktioner såsom polyadenylering og for- I

H stærkning af transkriptionelle sekvenser. Promotoren kan være regulerbar, således I

at ekspression fx først induceres efter transfektion og selektion af transformerede I

H kloner. Promotorer, der kan anvendes ved udøvelse af opfindelsen, omfatter fx den I

tidlige SV40-promotor og de lange terminale repeats (LTR'er) fra Rous sarkom- I

20 virus, Moloney sarkom-virus eller cytomegalovirus (CMV). I

I Før transfektion inkorporeres sT4-minigenet, dvs. det gen, der koder for leder-om- I

I rådet og det ekstracellulære område af T4-receptoren, fortrinsvis i et større DNA- I

H molekyle, som omfatter et genetisk selektionsmarkørsystem. Selektionsmarkør- I

25 systemet består af et hvilket som helst gen eller gener, som medfører en let detek- I

terbar fænotypisk ændring i en transficeret værtscelle. En sådan fænotypisk æn- I

dring kan fx være dannelse af foci, lægemiddelresistens såsom gener for G418- I

H eller hygromycin B-resistens; eller andre selekterbare markører såsom xanthin- I

guanin-phosphoribosyltransferase (xgprt), thymidinkinase (TK) og galactokinase I

30 (galK). En selektionsmarkør, som muliggør genamplifikation, kan anvendes for at I

forøge kopiantallet, hvad enten det sker ved forøget transfektionseffektivitet eller I

ved forøget intracellulær replikation af det pågældende gen og selektionsmarkøren. I

Sådanne markører, som også tjener til at amplificere genkopiantallet, omfatter ge- I

ner for dihydrofolatreduktase (methotrexat-resistens), CAD (N-phosphonacetyl-L- I

35 aspartat-resistens) og adenosin-deaminase (2-deoxycoformycin-resistens). I

DK 175816 B1 i 19

Cff-or trancl'rinHnn nn i nnhfA/Hwr^AllAr r-Λ** Ιλ^λ»*λλΙ#ιιλγ»λαπ > ·^ ►!· -*►· . ,v... >Γ ... · . wg ·ν·%·ν· ν· · I |^b>>.vwwf I <.ν··ν> >^VI >V.WW> » W> l*/W· > WMrf VII UV * bCI ^ spaltet, og moden sT4 udskilles i det konditionerede medium.

5 I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen er sT4-minigenet forbundet med et humant H-ras- eller et muse-dihydrofolatreduktase-(DHFR)-minigen til dannelse af ekspressionsvektorerne.

sT4-minigenet er fx forbundet med det humane H-ras eller muse-DHFR for at til-10 vejebringe en selektionsmarkør og midler til selektiv amplifikation af genekspression via cotransfektion med disse gener. Fælles selektionsmarkører omfatter fx DHFR, G418 eller hygromycin, som selekterer for integration af så få som en enkelt kopi af det pågældende gen. Amplifikation med fx methotrexat (mtx) i DHFR-syste-met resulterer i overekspression af genet.

IS

En alternativ metode til at få forøget ekspression af genet omfatter anvendelse af ras-protoonkogenet. ras-genfamilien omfatter H-ras-, K-ras- og N-ras-generne. I en foretrukken anvendelse af opfindelsen anvendes H-ras-genet.

20 Andre DNA-funktioner kan være direkte eller indirekte forbundet med sT4-mini-genet, eller sådanne funktioner kan være uforbundet, se fx Axel, US 4.399.216.

Overekspression af genprodukter i pattedyrceller kan opnås ved transiente eller stabile metoder. Transiente overekspression kan opnås ved virale metoder såsom 25 anvendelse af vacciniavirusvektorer eller ved genamplifikationsmetoder såsom med SV40-baserede vektorer i celler, som understøtter SV40-replikation. Disse metoder fører i sidste ende til celledød. Stabil overekspression kan opnås ved dannelse af . flere genkopier såsom ved selektion for genamplifikation eller ved anvendelse af ras-protoonkogenerne.

30

Overekspression af sT4-protein ved cotransfektion under anvendelse af H-ras-gensystemet kan opnås under anvendelse af en række forskellige cellelinjer, hvor den foretrukne cellelinje er NIH-3T3-celle!injen, som er en kontaktinhiberet muse-fibroblastcellelinje. Andre cellelinjer omfatter den normale rottenyre (NRK) (ATCC 35 1571) cellelinje og rotteembryofibroblast 52 (REF-52) cellelinjen (115).

Η

I DK 175816 B1 I

I 20 I

I Nar der anvendes et selektionsmarkørsystem, fx DHFR med methotrexat I

I (DHFR/MTX-teknik), hvor der opnås amplifikation af genkopiantal ved selektiv H

H amplifikation, foretrækkes kinesisk hamster-ovariecellelinjen (CHO). Især an- I

5 vendes CHO-cellér, som mangler DHFR (116). Andre celletyper, som kan an- I

I vendes, omfatter fx en hvilken som helst pattedyrcelle, der er modificeret til at I

I være DHFR'. I

I Nogle DHFR4-celletyper kan anvendes i kombination med muterede DHFR-gener, fl

fl 10 som er mindre følsomme over for methotrexat end normal DHFR (Axel, US I

I 4.399.216). 1 princippet kan DHFR+-celler anvendes i kombination med normale I

fl DHFR-gener og et yderligere dominerende selekterbart gen såsom genet for G418- , I

fl resistens (117). Transfektion udføres ved standardteknikker (118, 119). Disse tek- I

fl nikker omfatter fx calciumphosphatpræcipitation, DEAE-dextraninduceret pinocy- I

fl 15 tose, elektroporation og viral transfektion. I

fl Efter transfektion dyrkes en celle, som bærer sT4-minigenet, i et næringsmedium I

fl under betingelser, der muliggør amplifikation af det selekterbare gen. Der kan be- fl

B nyttes standardmæssige pattedyrcelle-dyrkningsmedier, fx Fl2-medium (GIBCO, I

B 20 Grand Island, New York) uden hypoxanthin og thymidin og indeholdende 10% fø- fl

B talt bovint serum. Cellekulturer holdes ved omgivelsestryk ved 30-45°C. Celler, B

fl som overlever selektion og udtrykker store mængder sT4-protein, selekteres til fl B yderligere dyrkning. Sådanne celler dyrkes under selektive betingelser, og produk- fl B tet, sT4-proteinet, isoleres og oprenses. fl

I 25 I

B Celledyrkningsmetoder, som kan anvendes ved udøvelse af opfindelsen, omfatter fl B fx anvendelse af adhærerende celler eller dyrkning af celler i en suspension. Kondi- fl

B tioneret medium (CM) kan isoleres fra celler, der er dyrket i suspension eller er ad- I

B hæreret til faste underlag, dvs. CM fremstilles ud fra adhærerende celler dyrket i I

B 30 dyrkningskolber ("roller bottles") eller dyrket på faste underlag og dyrket i suspen- fl

B sion eller fluidiserede eller pakkede lejer. CM fremstilles ud fra suspensionsceller i I

B beholdere med omrørte tanke. I

B sT4 ifølge opfindelsen omfatter derivater af T4’s ekstracellulære område. Sådanne fl B 35 derivater omfatter additioner, deletioner eller substitutioner, hvilke ændringer ikke fl * 21 DK 175816 B1 væsentligt påvirker udskillelse af proteinet til det konditionerede medium i ugunstig rofninrt camf nrnhoinofc affintfof fr\r- UT\/_am/_rtmfain rittr nn1 1Π Cv Uan άη ollor - —.....3 —----r' ............... * — · r·—----f “ w’ jr*--' ·· * —— —·* —·»· nogle få aminosyrer føjes til eller deleteres fra N- eller C-terminalen; eller én eller nogle få aminosyrer, fortrinsvis ikke mere end fire aminosyrer, kan indsættes i, de-5 leteres fra eller substitueres for interne aminosyrer. Alternativt kan der konstrueres et hybridprotein, dvs. en translationel fusion, mellem sT4 og en proteinbærer, et andet antigen eller andre sT4-molekyler til fremstilling af et poly-sT4-molekyle. I et yderligere alternativ kan sT4 konjugeres syntetisk til et bærermolekyle.

10 Én udførelsesform af et sT4-derivat er beskrevet i eksemplerne nedenfor (se eksempel 3). sT4’s affinitet for HIV env kan påvises ved et kompetitivt bindings-assay under anvendelse af et sT4-molekyle, der har en kendt affinitet, eller under anvendelse af antistoffer, som genkender T4-receptoren, såsom OKT4 og OKT4A. Anvendelige sT4-molekylederivater ifølge opfindelsen præcipiteres selektivt fra 15 konditioneret medium ved hjælp af OKT4A som beskrevet i eksempel 3. Derivater kan fremstilles kemisk (efter ekspression) eller genetisk (før ekspression) ved manipulation af den kodende sekvens for lederområdet og/eller det ekstracellulære område.

20 sT4 ifølge opfindelsen kan oprenses fra det opbrugte dyrkningsmedium under anvendelse af forskellige proteinoprensningsteknikker, fx affinitetskromatografi; ion-bytterkromatografi; størrelseseksklusionskromatografi; hydrofob kromatografi eller omvendt fase-kromatografi.

25 sT4 kan oprenses ved affinitetskromatografi under anvendelse af generelle gruppespecifikke adsorbenter, fx carbonhydratbindings- eller farveaffinitetsligander; eller under anvendelse af ligander, der specifikt binder til sT4, fx monoklonalt antistof eller HIV gpl20-protein eller dele deraf.

30 Et eksempel på en oprensningsprocedure omfatter: (1) dyrkning af celler i et serumfrit selektionsvækstmedium; (2) klaring af det konditionerede medium; og (3) adskillelse af sT4 ifølge opfindelsen fra andre proteiner, som findes i det konditionerede medium.

I DK 175816 B1 I

I 22 I

I Ved en foretrukken metode oprenses sT4 fra det serumfri dyrkningsmedium under I

I anvendelse af en række kromatografitrin, som er baseret på sT4-molekylets fysiske I

I egenskaber. sT4 kan også oprenses fra det serumholdige dyrkningsmedium under I anvendelse af lignende kromatografimetoder.

I Ved den foretrukne metode til oprensning af sT4 ledes dyrkningsmediet først gen- I

I nem en ionbyttersøjle, fortrinsvis en S-Sepharose®-søjle (sulfopropyl-Sepharose), I

I som binder sT4, mens hovedparten af kontaminerende proteiner strømmer gennem I

I søjlen. Proteinprøven elueres derefter under anvendelse af en lineær saltgradient.

I 10 Der benyttes en anden ionbyttersøjle. Denne søjle, fortrinsvis en Q-Sepharose®- I

I søjle (kvaternær aminoethyl-Sepharose), har sådanne egenskaber, at de kontami- I

I nerende proteiner, der findes i prøven, bindes til søjlen, mens sT4 ikke binder og I

I opsamles i søjlens gennemstrømningsbuffer. Til slut anvendes en gelfiltreringssøjle, I

som fungerer ved at fjerne tilbageværende kontaminerende materialer. I

I 15 I

En alternativ metode til oprensning af sT4 omfatter anvendelse af monoklonale I

antistoffer rettet mod sT4. sT4-proteinet kan oprenses i ét trin ved at lede klaret I

I dyrkningsmedium gennem et gelaffinitetsunderlag, hvortil monoklonalt antistof I

rettet mod sT4 er bundet. sT4 binder til søjlen ved antistofbindingsstedet, mens I

20 alle kontaminerende proteiner vaskes gennem søjlen. sT4 elueres.derefter fra

søjlen under betingelser, som forhindrer sT4-proteinet i at blive inaktiveret. I

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et hvilket som I

helst af de ovenfor nævnte terapeutiske midler, som specifikt er i stand til at danne

25 et kompleks med kappeglycoproteinet fra humant immundefektvirus, hvilken frem- I

gangsmåde omfatter dyrkning af værtsvektorsystemet ifølge opfindelsen under I

hensigtsmæssige betingelser, der muliggør produktion af det terapeutiske middel, I

hvorefter det således producerede terapeutiske middel isoleres. I

30 sT4 kan anvendes i diagnostiske assays til detektion af T4-proteiner eller de mole- H

kyler, hvormed de samvirker. Fx vil kvantificering af T4- og T4+-celler og antistof- H

fer mod T4 være af diagnostisk værdi for AIDS. H

I Desuden kan sT4 anvendes til at generere nye diagnostiske reagenser, fx Mabs I

35 eller andre typer molekyler til anvendelse i de standardmæssige immunologiske 23 DK 175816 B1 assays, dvs. ELISA, bindingsimmunassays, radioimmunassays. Da sT4 udviser OKT4. OKT4A ΟΠ rip flp^tP. om iHr<=> allp af T^-rorenini-pnc m/rino OVerf!?d6epiL0* per, er sT4 særlig nyttig i immundiagnostiske assays, da det kan anvendes til absolut kvantificering af T4-niveauer i et system. For tiden findes der ingen Stan-5 darder til kvantificering af T4-receptoren.

T4-receptoren findes i tre forskellige kemiske miljøer: den oxiderende, hydrofile celleoverflade; den hydrofobe membran; og det reducerende, hydrofile cytoplasma.

Disse forskelligartede miljøer vil sandsynligvis udelukke isolering af receptoren i I 10 dens fulde native tilstand. sT4, som kun består af det ekstracellulære område, ud skilles som et opløseligt protein i celtesupernatanten, og dets konformation ser ud til at efterligne overfladen af receptoroverfladeområdet. sT4 er således egnet til detaljeret strukturanalyse, især til røntgenkrystallografi. Bestemmelse af den tre-| dimensionale struktur af sT4 alene eller i en kompleks form med andre interaktive 15 molekyler kan tilvejebringe et grundlag for en rationel udformning af selektive ! antagonister og agonister for sT4.

De forskellige profylakse- og immuniseringsmetoder for AIDS, som tilvejebringes af den foreliggende opfindelse, er baseret på de beskrevne hidtil ukendte peptiders, 20 antistoffers og DNA-molekylers evne til at danne komplekser med eller hybridisere til specifikke molekyler og fremkalde et immunologisk respons, som er effektivt til neutralisering af AIDS-viruset. Disse molekyler, fremgangsmåder til fremstilling deraf samt metoder til behandling af AIDS vil fremgå tydeligere under henvisning til følgende forsøg og eksempler, som kun er anført som en illustration og på ingen 25 måde skal opfattes som en begrænsning af den foreliggende opfindelse, som er defineret i nedenstående patentkrav.

MATERIALER OG METODER 30

Celler og antistoffer

Leukocytter fra perifert blod isoleret ved Ficoll-Hypaque-densitetsgradientcentri-fugering blev fraktioneret i fåreerythrocyt rosettepositive (E+) celler. T4+-og T8+-35 undergrupper inden for E+ populationen blev isoleret ved positiv selektion af T8-

I DK 175816 B1 I

I 24 I

I bærende celler med anti-T8-antistof og humane erythrocytter konjugeret med I

I affinitetsoprenset kanin-antimuse-IgG (10). Cytofluorometrisk analyse af disse I

undergrupper viste, at T4+-cellerne var >95% T4+ og <2% T8+, mens T8+-cellerne I

I var >95% T8+ og <2% T4+. I

I

I Fro 2.2 T-cellelinjen (T3 , T4+, T8*, Tll+) stammede fra en voksen patient med I

I udifferentieret akut leukæmi. Jurkat er T3', T4+, T8+, Til*, RPM1 8402 er T3*, T4', I

I T8*, Til*. OT-CLL er en kronisk lymfocytær leukæmi, som er T3+, T4+, T8* og Til* I

I (22). T4+-cellelinjerne CEM og Molt 4 blev skaffet fra American Type Culture Collec- I

10 tion. Alle leukæmiske T-cellelinjer blev kontinuerligt dyrket i RPMI 1640-medium I

I indeholdende 5% føtalt kalveserum. Transformerede B-cellelinjer CB, CP58 og I

I CP94 blev fremstillet som beskrevet tidligere (23). I

I Affinitetsoprenset kanin-antimuse-IgG blev konjugeret med humane erythrocytter I

B 15 ved chromchloridmetoden (24). I

B Cotransformation af L-celler og NIH 3T3-celler I

L tk'aprt’-museceller blev holdt i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DME) I

B 20 beriget med 10% kalveserum (Gibco) og 50 pg/ml diamrnopurin (DAP). L-celler I

B blev udpladet med en tæthed pi 5xl04 celler pr. 10 cm skil 1 dag før transfor- I

B mation. Calciumphosphatpræcipitater blev fremstillet ved fremgangsmåden ifølge I

B Graham og van der Eb (25), modificeret af Wigler et al. (26) under anvendelse af I

B 100 ng pTK og 20 ug højmolekylært T-celle- eller L-celle-DNA pr. skål. L-cellerne I

B 25 blev den følgende dag anbragt under selektion i DME med 10% kalveserum, I

B 15 pg/ml hypoxanthin, 1 pg/ml aminopterin og 5 pg/mf thymidin (HAT-medium I

B (27)). Efter 12-14 dages HAT-selektion blev tk+-transformanter screenet under I

B anvendel-se af rosettedannelsesassayet. I

B 30 NIH 3T3-museceller blev holdt i DME beriget med 10% nyfødt kalveserum (Gibco). I

B NIH 3T3-celler blev udpladet med en tæthed på 5xl04 celler pr. 10 cm skål 2 dage I

B for transformation. Et calciumphosphatpræcipitat blev anbragt på cellerne under I

B anvendelse af 10 pg bærer-DNA og enten 10 pg T4-pMV6tk/neo eller 10 pg T4- I

B pVcos7 og 500 ng pSV2neo. Efter 2 dage blev cellerne anbragt under selektion i I

B 35 DME med 10% kalveserum og 500 pg/ml G418 (Geneticin®; Gibco). Rosettedan- I

25 DK 175816 B1 nelsesassays blev udført på overlevende kolonier 1 uge efter vækst i selektivt

Rosettedannetsesassay 5

Efter én skylning med phosphatbufret saltopløsning (PBS) blev pladerne inkuberet med 2,5 ml af det oprensede monoklonale antistof ΟΚΤ·4Α (1 mg/ml) fortyndet 1:500 i PBS indeholdende 5% fatalt kalveserum i 45 minutter ved stuetemperatur.

Frit antistof blev fjernet fra pladerne ved 3 nænsomme skylninger i PBS. 6 ml hu-10 mane erythrocytter konjugeret med oprenset kanin-antimuse-lgG-antistof (2% vol/vol stamsuspension, fortyndet 1:10 i PBS/5% fatalt kalveserum) blev tilsat, og pladerne henstod ved stuetemperatur. Efter 45 minutter blev frie erythrocytter nænsomt suget op, og PBS blev tilsat før undersøgelse for rosettepositive kloner.

15 Cytofluorometrisk analyse

Adhærerende celler blev fjernet med 0,005 M EDTA i PBS og vasket én gang med PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,01% natriumazid (cyto-vask). Celler (5xl06) i 0,1 ml blev sat til rør med hensigtsmæssige fortyndinger af 20 ΟΚΤ·4, ΟΚΤ·8 eller kontrolantistoffer. Celle/antistofblandingen blev inkuberet i 45 minutter ved 4°C og derefter vasket to gange i cytovask. Ffuorosceinisothiocyanat-(FlTC)-konjugeret gede-antimuse-IgG + A + M (Cappel) blev sat til cellerne og inkuberet i 1 time ved 4°C. Cellerne blev derpå vasket 3 gange i cytovask og resus-penderet i 0,5 ml PBS med 0,01% natriumazid. Cellerne blev analyseret på en 25 Becton Dickinson FACS IV Cell Sorter, og data blev lagret og plottet under anvendelse af en VAX 11/780-computer (Digital. Equipment Co.).

RNA- og DNA-isolering 30 Totalt RNA blev isoleret fra cellerne ved homogenisering i 4 M guadinium-thiocya-nat efterfulgt af ultracentrifugering gennem en 5,7 M CsCI-pude (28). Poly(A)+-selektion blev foretaget ved oligo(dT)-cellulosekromatografi (Type 3, Collaborative Research) (29). Højmolekylært genomisk DNA blev fremstillet som beskrevet af Wigler et al. (26).

35

I DK 175816 B1 I

I 26 I

cDNA- og genombiblioteker I

Dobbeltstrenget cDNA blev syntetiseret ud fra poly(A)·* RNA fra perifere humane T- I

celler (20). Efter behandling med EcoRI-methylase og T4 DNA-polymerase blev det H

I 5 dobbeltstrengede cDNA klonet i EcoRI-stedet på XgtlO (30) under anvendelse af I

I EcoRI-linkere. Charon 4 humant genombibliotek blev venligt stillet til rådighed af I

I Dr. Tom Maniatis (Harvard University) (31). I

I Syntese af en subtraheret cDNA-probe I

10 I

32P-mærket cDNA blev syntetiseret ud fra poly(A)+ RNA fra den primære transfor- I

I mant, LTD-4, som beskrevet af Davis et al. (32). Efter sammenføjning af cDNA’et I

I med et overskud af utransformeret L-celle poly(A)+ RNA (Rot = 3000) blev enkelt- I

I strengede sekvenser, som var rige på humane cDNA'er, isoleret ved hydroxyapatit- I

I 15 kromatografi (32). Før filterhybridisering blev den subtraherede cDNA-probe kon- I

I centreret med sek.butanol og afsaltet på en G-50 Sephadex-søjle ækvilibreret i TE. I

I Screening af cDNA- og genombiblioteker H

I 20 Biblioteket af perifere humane T-celler blev udpladet på E. coli C600/HFL, og det I

humane genombibliotek blev udpladet på E. coli LE392. Screening af duplikat-filtre I

blev udført ved en standardprocedure (33), hvor hybridiseringen blev udført i 50% I

I formamid og 5xSSC ved 42°C. Ved screeningen af cDNA-biblioteket blev 6xl04 cpm I

I subtraheret probe påført pr. 137 mm nitrocellulosefilter. Filtre fra genombibliote- I

25 ket blev hybridiseret til en nick-translateret (34) cDNA-indsætning. Vaskningerne I

blev udført ved 68°C med en afsluttende vask i 0,2x SSC. Autoradiografi blev ud- I

I ført ved -70°C i nærværelse af forstærkningsskærme i 1-2 dage. I

I DNA-sekventering I

i I

I Restriktionsfragmenter fra pT4B blev subklonet i M13-vektorerne mpl8 og mpl9 I

I (35). Sekventeringsreaktioner blev udført under anvendelse af dideoxykædetermi- I

I nationsteknikken (36). Sekventeringsstrategien er vist i fig. 3B. I

H 35 I

27 DK 175816 B1

Southern og northern blot-hybridiseringer Højmolekylære cellulære DNA’er blev skåret med 5 enheder restriktionsnuklease pr. jig DNA ifølge leverandørens forskrifter (Boehringer Mannheim). Prøver (10 pg) 5 blev underkastet elektroforese på en 0,8% agarosegel. DNA-fragmenter blev overført til GeneScreen (New England Nuclear; (37)) og hybridiseret som beskrevet af Church og Gilbert (38).

RNA blev kørt på en 0,8% agarose-formaldehydgel (39) og overført til GeneScreen.

10 Northern-hybridisering blev udført ifølge de af leverandøren givne forskrifter. Både Southern og northern blots blev hybridiseret til nick-translaterede prober.

Syntese og in viVo-translation af SP6 RNA

15 Det.... kb lange T4-CDNA blev subklonet i EcoRI-stedet på pSP65 (Promega Biotec) og lineariseret med Hindlll. Transkription af lineariseret plasmid-DNA (1 ug) med SP6-polymerase i fraværelse af radiomærkede nukleotider blev udført som beskrevet (40) bortset fra, at GpppG og umærket CTP blev sat til transkriptionsbuf-feren. 1/10 af reaktionsblandingen blev translateret i et hvedekimsystem 20 (Bethesda Research Laboratories) indeholdende L-[32S]-methionin (Amersham) og 1 jimol S-adenosylmethionin. In v/tro-translationsprodukterne blev underkastet SDS-polyacrylamidelektroforese under reducerende betingelser som beskrevet nedenfor.

25 Cellemærkning, lectinkromatografi og immunudfældning

Celler blev dyrket i 12 dage i methioninfrit DME-medium indeholdende 10% dialyseret kalveserum og 1 mCi L-[32S]-methionin (Amersham) som beskrevet tidligere (41). Cellerne blev solubiliseret i 10 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCI (TBS) 30 indeholdende 0,5% Nonidet P-40 (Shell) og 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma). Lysateme blev centrifugeret i 1 time ved 100.000 x g, og supernatanter-ne blev underkastet linselectinkromatografi (Pharmacia) ved fremgangsmåderne ifølge Hedo et al. (42). Eluater blev præabsorberet én gang med en blanding af kontrolmuseascites og protein A-Sepharose (Pharmacia) i 1 time ved 4°C og to 35 gange med protein A-Sepharose alene i 1 time ved 4°C. Af hver supernatant blev

I DK 175816 B1 I

I 26 I

B 2,5xl04 cpm derefter blandet med 10 μΙ monoklonalt antistof (ca. 1 mg/ml) og I

protein A-Sepharose og inkuberet på en drejeskive natten over ved 4°C. Kuglerne H

blev derefter vasket 4 gange med koldt TBS Indeholdende 0,5% NP-40 og 0,2% I

I SDS og blev resuspenderet i elektroforeseprøvebuffer. H

I 5

I Gelelektroforese I

B SDS-polyacrylamidgelelektroforese blev udført ved proceduren ifølge Laemmli (43). H

I Immunpræcipitaterne og in v/tro-translationsprodukterne blev opløst i prøvebuffer H

B 10 med eller uden 2-mercaptoethanol og blev derefter sat på 10% polyacrylamidgeler. B

B Autoradiografi blev udført på Kodak XAR-5-film i nærværelse af forstærknings- I

I skærme (DuPont Chemical Company). I

I Cotransformation og rosettedannelsesassay I

I 15 I

I Muse ψ-2-celler (44) blev holdt i Dulbecco’s modificerede Eagle's medium (DME) I

I beriget med 10% kalveserum (CS) (Gibco). ψ-2-celler blev udpladet med en tæt- H

I hed på 5x105 celler pr. 10 cm skål 2 dage før transformation. Calciumphosphat- B

I præcipitater blev fremstillet ved metoden ifølge Graham og van der Eb (25), mo- B

I 20 dificeret af Wigler et al. (27), Præcipitater blev tilført cellerne under anvendelse af B

B 10 ug bærer-DNA og enten 10 μg T4-pMV7 eller 10 pg T8-pMV7. Efter 2 dage blev B

I cellerne anbragt under selektionsbetingelser i DME/10% CS og 500 pg/ml G418 B

I (Geneticin®; Gibco). B

B 25 Rosettedannelsesassays for at identificere T4*-eller T8+-kolonier blev udført på B

B overlevende kolonier l uge efter vækst i selektivt medium. Efter én skylning med B

B phosphatbufret saltopløsning (PBS) blev pladerne inkuberet med 2,5 ml af det op- B

B rensede monoklonale antistof OKT*4A eller ΟΚΤ·8 (1 mg/ml; Ortho) fortyndet B

I 1:500 i PBS indeholdende 5% føtalt kalveserum (FCS) i 45 minutter ved stuetem- I

I 30 peratur. Frit antistof blev fjernet fra pladerne ved tre nænsomme skylninger i PBS. H

I 6 ml humane erythrocytter konjugeret med oprenset kanin-antimuse-IgG-antistof I

I (2% vol/vol stamsuspension fortyndet 1:10 i PBS/5% FCS) blev tilsat, og pladerne I

B henstod ved stuetemperatur. Efter 45 minutter blev frie erythrocytter nænsomt H

B suget op, og PBS blev tilsat før undersøgelse. T4+-og Τ8+-ψ-2-kloner blev oprenset H

B 35 ved koloniisolering og karakteriseret ved flow-cytometri og northern blot-analyse. H

29 DK 175816 B1

Fremstilling af og infektion med rekombinant retrovirus

Der blev isoleret T4+-og T8+-vy-2-kloner, som producerer rekombinant stam-5 retrovirus i titere på 10s cfu/ml. Stamvira blev fremstillet ved tilsætning af 10 ml frisk DME/10% CS til et næsten konfluent monolag af T4+- eller T8+-\y-2-klonerne.

Efter 24 timer blev mediet fjernet og filtreret gennem et 0,45 pm filter (Millipore).

Til infektion blev 5xl05 celler inkuberet med 2 ml viral supernatant (eller en fortynding) i nærværelse af 8 pg/ml polybren (Aldrich). Efter 3 timer blev der tilsat 8 10 ml frisk medium. 3 dage efter infektionen blev cellerne på ny podet i DME/10% CS indeholdende 500 pg/ml G418, dyrket i 2 uger, analyseret for G4l8r kolonier og screenet for overflade T4- eller T8-ekspression under anvendelse af in situ-roset-tedannelsesproceduren eller flow-cytometri.

15 ψ-2-kultursupernatanter blev anvendt til at inficere muse-i|/-AM-celler som beskrevet ovenfor. T4+- eller T8+-adhærerende transformanter blev oprenset ved in s/fu-rosettedannelsesassayet efterfulgt af koloniisolering; T4+- eller T8+-ikke-adhærente transformanter blev oprenset ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). lkke-adhærerende humane lymfoide cellelinjer (HSB2, RPM1 - T-celler; 20 Raji - B-celler) og adhærerende epitelceller (HeLa) blev inficeret ved samdyrkning med T4+- eller T84-\y-AM-kloner (forbehandlet med 10 pg/ml mitomydn-C i 2 timer; Sigma) og blev oprenset.

Cellelinjer blev selekteret for G418-resistens ved en koncentration på 1,5 mg/ml 25 undtagen HeLa-celler, som kræver l mg/ml, og fibroblaster, som kræver 0,5 mg/ml. Alle cellekulturer, der producerede rekombinante amfotrofe vira (ψ-AM), blev holdt under P3-indeslutningsbetingelser.

AIDS-virus 30

Prototype-LAV-stammen HTLV-IU/LAV blev skaffet fra J.-C. Cherman (Institut Pasteur, Paris; (45)). Virusinokula, der blev anvendt ved disse undersøgelser, var fra den 2. til 5. passage af virus i nærværende ansøgers laboratorium. Inokula er kultursupernatanter fra HTLV-IlI/LAV-inficerede, phytohæmagglutinin-(PHA)-35 stimulerede perifere lymfocytter, som blev høstet ved sekventiel centrifugering

I DK 175816 B1 I

I 30 I

I (300 x g i 7 minutter efterfulgt af 1500 x g i 20 minutter) og blev opbevaret i I

flydende nitrogen. Til bindingsundersøgelser blev virus koncentreret fra kultur- I

supernatanter og høstet som beskrevet ovenfor ved ultracentrifugering ved 90.000 I

I x g i 90 minutter over en 15% pude af Renograffin (E.R. Squibb) i 0,01 M Tris, I

I 5 0,15 M NaCI, 1 mM EDTA, pH 8,0. I

I Anti-HTLV-III/LAV-reagenser I

I Serum med høje niveauer af antistof mod HTLV-III/LAV blev fremskaffet fra en I

10 homoseksuel mand med kronisk lymfadenopati, og dets specificitet er blevet be- I

skrevet ved immunfluorescens (46), western blot-analyse (47) og radioimmun- I

udfældning (48). Portioner af IgG-fraktionen blev koblet med fluorescein-isothio- I

cyanat (FITC; FITC:protein-forhold på 10,7 pg/ml), peberrodsperoxidase (HPO; I

type VI; Sigma) og agarose som beskrevet (47, 49, 50, 51). Konjugater af JgG fra I

15 et ikke-immunt serum blev fremstillet parallelt. I

Omvendt transkriptaseassay I

H Magnesiumafhængig, partikelformig omvendt transkriptase (RT)-aktivitet blev målt I

20 med en skabelonprimer af (A)n(dT)l2-18 (eller (dA)n(dT)i2-i8 som negativ kontrol) i I

nærværelse af 7,5 mM Mg2+ (52). I

H Immunfluorescensdetektion af cytoplasmisk AIDS-virus I

25 Dyrkede celler (lxlO5 i 0,1 ml) blev centrifugeret over på objektglas (Shandon I

H Cytocentri.fuge), fikseret i 95% ethanol og 5% eddikesyre ved -20°C i 30 minutter I

og rehydratiseret med tre 10 minutters udskiftninger af PBS (0,01 Μ PO4, 0,15 Μ I

NaCI, pH 8,0). Objektglassene blev eksponeret på en 1:500 fortynding af FITC- I

anti-HTLV-III/LAV (19 pg/ml) i 30 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene I

H 30 blev derefter vasket (tre udskiftninger, 10 minutter hver) og under et dækglas til- I

sat 50% glycerol i PBS. Objektglassene blev undersøgt under et epiiilumineret Leitz I

H Orthoplan-mikroskop ved 630x forstørrelse. Under disse betingelser er FITC-anti- I

HTLV-III/l_AV-reagenset specifikt over for HTLV-III/LAV. Uinficerede PHA-stimu- I

H lerede celler, Epstein Barr (EB)-virusinficerede B-cellelinjer, en adenovirus-inficeret I

31 DK 175816 B1 cellelinje, flere T-cellelinjer og HTLV-I- og HTLV-II-inficerede cellelinjer blev ikke fan/af AIDS-virus-immunassay (antigenbindingsassay) 5

Dette er et sandwich-immunassay, som er beskrevet i detaljer (47). Kort fortalt sættes kultursupernatant til mikrotiterpladebrønde belagt med anti-HTLV-IlI/LAV-IgG. Efter at pladerne er vasket, detekteres bundet virusantigen med HPO-anti-HTLV-III/LAV. Dette assay, som er mindst lige så følsomt som RT-assayet, er ne-10 gativt med kuitursupernatanter fra PHA-stimulerede lymfocytter fra flere donorer, EB-virusinficerede B-cellelinjer, flere T-cellelinjer, polyklonale og klonede IL-2-afhængige T-cellelinjer, den myeloide linje K562 samt cellelinjer, der indeholder HTLV-l eller HTLV-II. OD49o*grænsen for at kunne skelne en positiv fra en negativ supernatant blev bestemt for hvert forsøg ud fra gennemsnittet plus 2 SD af 15 mindst 10 gentagne bestemmelser på kontrolsupernatanter (uinficeret cellekultur) høstet på samme tid.

AIDS-virusinfektivitetsassay (ID-50) 20 Mikrokulturassayet for titrering af infektiøst HTLV-III/LAV er beskrevet i detaljer (47). Kort fortalt inokuleres PHA-stimulerede lymfocytter eller cellelinjer (2xl06 celler/ml) med 10 ganges seriefortyndinger af virusinokulum og inkuberes i 18 timer ved 37°C. Cellerne blev derpå vasket og udpladet i mikrokultur (10-20 kulturer pr. fortynding: 1x10s celler pr. kultur i 0,25 ml medium). Hver 4. dag blev 25 100 μΙ supernatant fjernet og erstattet med frisk medium. Supernatanter blev derefter analyseret for virusantigen ved antigen-bindingsassayet som beskrevet ovenfor. Infektiøst virustiter (ID-50) defineres som det reciprokke af den fortynding, ved hvilken 50% af kulturerne er positive for virus (47).

30 VSV-pseudotypeassay

Vesikulser stomatitisvirus (VSV, Indianastamme, vildtype) blev propageret i celler, der producerede det retrovirus, der er nødvendigt for kappepseudotypen som beskrevet (53). Hyperimmunt neutraliserende fåre-anti-VSV-serum blev sat til det 35 høstede VSV for at inaktivere ikke-pseudotypevirioner. Pseudotypetiterne lå mel- Η

I DK 175816 B1 I

I 32 I

I lem 104 og 105 PFU/ml. Til assayet blev 2xlOs celler, der skulle inficeres med VSV- I

pseudotyper, udpladet i vævskulturbrønde med en diameter pi 30 mm. HeLa-, N1H I

3T3- og L-celler var naturligt adhærerende; alle andre celletyper blev bundet ved , I

I forbehandling af det underliggende lag med 50 μ9/ιτιΙ poly-L-lysin. Efter virusad- I

I 5 sorption i 1 time blev cellerne vasket, og 106 CCL64-minkceller eller bovine MDBK- I

I celler blev sat til hver brønd. Disse celler tilvejebringer udmærkede plaques til se- I

kundær VSV-infektion, men er resistente over for infektion med pseudotypeviri- I

I oner. Efter at plaque-indikatorcellerne havde fået lov at etablere sig og sprede sig I

(ca. 90 minutter), blev enkeltlagene overlejret med agarmedium. VSV-plaques blev : I

I 10 talt 2 dage efter infektion. Anti-T4A-monoklonalt antistof (1:20), anti-HTLV-IIl- I

I serum (1:10) eller anti-HTLV-I-serum (1:10) blev anvendt for at inhibere pseudo- I

I typeplaquedannelse ved forbehandling af celler 30 minutter før tilsætning af pseu- I

I dotyper som beskrevet i (54). ; I

15 Syncytiuminduktionsassay I

2xl05 celler blev dyrket sammen med 2xl04 H9-celler, der var inficeret med og I

producerede HTLV-III (55), i brønde med en diameter på 10 mm. Kulturerne blev I

inkuberet ved 37°C og undersøgt for syncytiumdannelse efter 18 timer som be- I

H 20 skrevet tidligere (54, 56). Celler med 5 syncytier eller derover blev anset for posi- I

tive. Syncytiuminhibering blev analyseret ved tilsætning af anti-T4A-monoklonalt I

antistof (1:20) til de blandede kulturer ved tidspunktet for podning. I

Cytofluorometrisk analyse og AIDS-virusbinding I

H 25 I

Metoden er beskrevet i detaljer (46). Kort fortalt blev celleoverflade T4- eller T8- I

H ekspression detekteret ved direkte immunfluorescens med fluoresceinkonjugerede I

anti-T4A- eller anti-T8-monoklonale antistoffer (ΟΚΤ·4Α, ΟΚΤ·8). Diluent/vaske- I

bufferen var 0,01 M P04, 0,15 M NaCI, pH 7,4, indeholdende 0,1% bovint serum- I

H 30 albumin, 2% vol/vol AB+ humant serum og 0,01% NaN3. Alle reagenser blev præ- I

H titreret for optimal (mættende) binding. Celler (5xl05) blev inkuberet i en 25 μΙ I

H fortynding af monoklonalt antistof i 30 minutter ved 4°C. Cellerne blev vasket ved I

H centrifugering (300 x g i 7 minutter), resuspenderet i 0,5 ml 1% paraformaldehyd i I

H saltop-løsning og analyseret med et fluorescensaktiveret cellesorteringsapparat I

35 (FACS IV, Becton Dickinson). Til HTLV-III/LAV-binding blev 5xl05 celler inkuberet I

a 33 DK 175816 B1 med HTLV-1II/LAV (500 ng i 10 μΙ) i 30 minutter ved 37°C. Vaskede celler blev rp^iicnpnriprpt i 75 ni flunresceinkoniugeret anti-HTLV-III/LAV i 30 minutter ved 4°C. Cellerne blev vasket, resuspenderet i 1% paraformaldehyd og analyseret ved FACS som ovenfor. Til inhibering af HTLV-III/LAV-binding blev cellerne præinkube-5 ret med anti-T4A eller anti-T8 (20 ng i 20 μΙ) i 30 minutter ved 4°C efterfulgt af tilsætning af HTLV-III/-LAV (500 ng i 10 μΙ) i 30 minutter ved 37°C. Cellerne blev vasket, inkuberet med fiuoresceinkonjugeret anti-HTLV-Ill/LAV, vasket, resuspenderet i paraformal-dehyd og analyseret ved FACS som ovenfor.

10 Celleoverfladeradioiodering, immunudfældning og gelelektroforese T4+-N1H 3T3-transformanter blev overfladeradioioderet ved lactoperoxidaseteknik-ken (18) som følger: 4xl07 celler blev suspenderet i 1 ml PBS indeholdende 0,5 mM EDTA, 2 mCi Na125I og 20 μg lactoperoxidase. Ved 0, 1, 5, 10 og 15 15 minutter blev der tilsat 10 μΙ 0,03% H202. Reaktionen blev udført ved 23°C og blev standset efter 20 minutter ved 2 centrifugeringer i 50 volumen koldt PBS indeholdende 10 mM Nal. Mærkede celler blev opdelt i 4 rør og inkuberet som beskrevet med HTLV-IJI/LAV (2 μς i 20 μ!) i 30 minutter ved 37°C. Efterfølgende vaskninger og manipulationer blev udført ved 0-4°C. Vaskede celler blev lyseret ved tilsætning 20 af 1 ml detergentlyseringsbuffer (LB; 0,02 M Tris, 0,12 M NaCI, pH 8,0, indeholdende 0,2 mM phenylethylsulfonylfluorid, 5 pg/ml aprotinin, 0,2 mM EGTA, 0,2 mM NaF, 0,2% natriumdeoxycholat og 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40). Rørene blev holdt på is i 15 minutter, og kernerne blev fjernet ved centrifugering ved 3000 x g i 20 minutter.

25

Til absorptioner blev Sepharose-konjugater af human anti-HTLV-III/-LAV-IgG-, human ikke-immun IgG-, anti-T4A- og anti-T8-antistoffer fremstillet som beskrevet (48). lysater blev præabsorberet med 200 μΙ Sepharose/ikke-human IgG i 1,5 time under rotation og derpå immunudfældet med 20 μΙ Sepharose-konjugater (som be-30 skrevet) i 3 timer under rotation. Sepharose-absorbanter blev vasket 3 gange: 1 gang med LB; 1 gang med L8 indeholdende 0,5 M NaCI; og 1 gang med LB indeholdende 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS). Absorberet materiale blev elueret ved 65°C i 30 minutter med 20 μΙ prøvebuffer (0,01 M Tris, pH 8,0, indeholdende 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol (vol/vol), 25 pg bromphenolblåt og 10% glycerol

I DK 175816 B1 I

I I

. (vol/vol). Elektroforese blev udført i en 3,3-20% gradient polyacrylamidgel med en I

I 3% stackinggel (57), og autoradiografier blev fremkaldt med Kodak XAR-5-film.

I Virusinhiberingsassay I

I 5 -I

2xl05 T4+-JM T-celier blev udsat for AIDS-virus ved 0 minutter. Inhibitorerne I

ammoniumchlorid (20 mM) eller amantadin (20 mM) blev tilsat på forskellige I

tidspunkter i løbet af virusinfektionen (0 minutter, 30 minutter og 60 minutter). H

I Efter 6 timer blev cellerne vasket og udpiadet i frisk medium (RPMI/10% PCS). I

I 10 Disse agens' virkning på AIDS-virusinfektion blev bestemt 5 dage efter infektion. I

I Den fraktion af inficerede celler i kulturerne, der udtrykte virusantigener, blev I

I bestemt ved immunfluorescensmikroskopi som beskrevet ovenfor (58). H

I RNA-isolering og northern blot-hybridiseringer I

I I

I Totalt RNA blev isoleret fra celler ved homogenisering i 4M guanidiniumthiocyanat I

I efterfulgt af ultracentrifugering gennem en 5,7 M CsCI-pude (28). Poly(A)+-selek- H

I tion blev udført ved oligo(dT)-cellulosekromatografi (type 3, Collaborative I

I Research) (29). I

I 20 I

RNA blev underkastet elektroforese gennem en 1% agaroseformaldehydgel (39) og H

I overført til Hybond (Amersham). Northern blot-hybridisering blev udført ifølge leve- H

I randørens forskrifter. Prober blev nick-translateret til en specifik aktivitet på 0,5- H

lxlO9 cpm/ng med a32P-mærket deoxynukleotidtriphosphater (59). H

25 I

I RESULTATER

I Isolering af T4-cDNA I

30 Den strategi, der blev fulgt for at isolere et T4-cDNA, omfattede til at begynde H

I med, at der blev konstrueret L-celletransformanter, som udtrykker T4 på deres H

I overflade. cDNA syntetiseret ud fra en T4+-transformeret fibroblasts mRNA blev H

I isoleret ved subtraktiv hybridisering og anvendt som probe for at isolere et cDNA- H

I kodende T4 fra et cDNA-bibliotek, der var fremstillet ud fra mRNA'et fra perifere T-

I 35 lymfocytter. Identiteten af T4+-cDNA-kloner blev bestemt ved northern og H

35 DK 175816 B1

Southern blot-analyser og'til sidst ved disse kloners evne til at overføre T4+-f=onnh«pon hi l innonHo loiniifirpr pr HHlinprp blevet anvendt for at isolere det gen, der koder for T8-proteinet (20).

5 Muse-L-celler, der manglede thymidinkinase (tk), blev cotransformeret med genomisk DNA fra den leukæmiske T-cellelinje HUT-102 sammen med det tk-holdige plasmid pTK (25, 26). tk+-l-cel)etransformanter, der udtrykte T-ce))e-overfladeproteiner, blev identificeret ved et in s/fu-rosettedannelsesassay. tk+-kolonier blev udsat for musemonoklonale antistoffer rettet mod T4 og blev dernæst 10 inkuberet med røde blodlegemer koblet med kanin-antimuseimmunglobulin. T4+-transformanter er synligt røde på grund af deres specifikke association med røde blodlegemer. På denne måde fik man én primær T4+-transformant, LTD-4. Denne klons ekspression af T4-molekylet blev uafhængigt bekræftet ved cytofluorometrisk analyse (fig. 1). mRNA-populationen fra T4+-transformanten LTD-4 bør kun være 15 forskellig fra populationen af en utransformeret L-celle med hensyn til ekspressionen af nyligt transformerede gener. Disse sekvenser blev isoleret ved at sammenføje højradioaktivt cDNA fremstillet ud fra poly-(A)+ RNA fraT4+-transforman-ten med et stort overskud af RNA fra en utransformeret L-celle (32, 60). cDNA, som ikke kunne hybridisere, selv ved høje Rot-værdier, blev isoleret ved hydroxy-20 apatitkromatografi og anvendt til at screene et human perifer T-celle cDNA-bibli-otek, som var konstrueret i lambdakloningsvektoren gtlO. 4 svagt hybridiserende plaques blev identificeret, plaqueoprenset og analyseret for tilstedeværelsen af T4-sekvenser.

25 For at bestemme, om nogle af disse kloner kodede for T4, blev der indledningsvis udført northern blot-analyser med RNA fra T4+- og T4'-perifere T-celler, leukæmiske celler, thymocytter, L-celletransformanter og ikke-lymfoide celler (fig. 2). 1 af de 4 kloner hybridiserede til et RNA, som kun var til stede i T4*-celler. Denne klon detekterer et 3 kb langt RNA, som er til stede i T4+-transformanten, LTD-4, 30 som også er til stede i en population af T4+-perifere lymfocytter, forskellige T4+-leukæmiske cellelinjer og thymocytter. Ingen hybridisering blev observeret med RNA fra utransformerede fibroblaster, T4'-perifere lymfocytter, HeLa-celler eller humane neuroblastomceller.

I DK 175816 B1 I

I 36 I

Det RNA-ekspressionsmønster, der blev detekteret af denne klon, stemmer over-

ens med den mulighed, at det koder for T4. Dette cDNA er imidlertid kun 0,6 kb I

H langt, men hybridiserer til et 3 kb langt mRNA. Derfor blev det humane perifere T- I

celle cDNA-bibliotek screenet på ny, og dette gav én klon (pT4B), som indeholdt en I

5 3 kb lang indsætning, hvis størrelse lå tæt på størrelsen af det modne messenger- I

RNA. Restriktionskort over denne klon er vist i fig. 3A og 3B. I

Genomisk blotanalyse I

10 Southern blot-forsøg (37) blev dernæst udført for at påvise, at den isolerede cDNA- I

klon hybridiserede med DNA fra T4+-transformanten samt humant DNA, men ikke I

H med utransformeret muse-L-celle-DNA (fig. 4). Genomisk DNA fra en række hu- I

H mane celler udviser et sæt på 5 hybridiserende fragmenter efter skæring med en- I

zymet BamHl. Som forventet kan der detekteres T4-sekvenser i transformanten I

15 LTD-4, men ikke i transformeret L-celie-DNA. BamHI-fragmentet nærmest ved 3’- I

I enden af genet (6,6 kb) er ikke til stede i LTD-4, formodentlig som følge af inte- I

grationsbegivenheden. Desuden kan der med det blotte øje ikke ses nogen omlej- I

ringer ved dette grove analyseniveau, når man sammenligner DNA fra lymfoide og I

ikke-lymfoide celler. Summen af molekylvægte af de hybridiserende fragmenter er I

20 33 kb, hvilket antyder, at T4-genet er temmelig stort. Et fuldstændigt sæt af geno- I

I miske kloner, der spænder over dette område, blev opnået (se nedenfor), og I

BamHI-fragmenterne blev ordnet ved restriktionsanalyse af disse kloner (fig. 3A), I

I hvilket bekræftede, at genet er stort og må indeholde introner af betydelige læng- I

I der. I

I

Ekspression af T4-cDNA i transformerede musefibrobiaster I

H Der kan tilvejebringes en yderligere påvisning af, at det isolerede cDNA koder for I

T4, hvis denne klon kan omdanne fibroblaster til T4+-fænotypen efter transforma- I

30 tion. T4-genet i chromosomajt DNA er stort og strækker sig over flere genomiske I

I kloner. Derfor blev cDNA-klonen indsat i to retrovirale ekspressionsvektorer, I

I pVcos7 og pMV6tk/neo, som indeholder Moloney museleukæmivirus "long terminal I

I repeats" (LTR), der flankerer et enkelt EcoRl-kloningssted (fig. 3C). 5'-LTR frem- I

I mer transkription gennem kloningsstedet, og 3’-LTR indeholder sekvenser, der er I

I 35 nødvendige for skæring og polyadenylering. Vektoren pMV6tk/neo indeholder også I

DK 175816 B1 ! 37 tk-promotoren fusioneret til det kodende område af neomycin-phosphotransferase- i aenet. Den konstruktion, der henvtter r»Vrn<;7i Irrspver trancfnrmsrinn moH on n-bundet selekterbar markør, mens pMV6tk/neo bærer markøren for neomycin-resistens, som tillader bundet cotransformation. Neo+ kolonier af N1H 3T3-celler, 5 der var vundet efter transformation, blev selekteret ved deres evne til at vokse på medier, der indeholdt neomycin-analogen G418, og blev screenet under anvendelse af rosettedannelsesproceduren for at detektere ekspressionen af T4 på celleoverfladen. Ca. 50% af de G418-kolo-nier, der blev vundet med pVcos7, og 75% af de kolonier, der blev vundet med pMV6tk/neo, var positive for T4 ved dette assay. j 10 Rosettepositive kolonier blev desuden analyseret ved cytofluorometri for at bekræfte, at T4 udtrykkes på den transformerede celleoverflade (fig. 1).

Forsøg med metabolisk proteinmærkning blev udført, og disse viser, at den T4+-transformerede fibroblast og T-lymfocytten udtrykker et T4-protein med identisk 15 molekylvægt. Utransformerede NIH 3T3-celler, T4+-transformanter og T-lymfo-cytter blev mærket i 12 timer i nærværelse af L-[35S]-methionin (41). Cellerne blev detergentsolubiliseret, og lysatet blev ledt gennem linselectinsøjler for at isolere glycoproteiner (42). Den bundne glycoproteinfraktion blev elueret og immunudfael-det med monoklonale antistoffer rettet mod T4 (fig. 5). Under reducerende be-20 tingelser detekteres der et glycoprotein, som vandrer ved en relativ molekylvægt på 55 kD, i ekstrakter fra T-lymfocytter og to uafhængige T4+-transformanter.

Dette protein detekteres ikke i 3T3-kontrolfibroblaster. Under ikke-reducerende betingelser immunudfældes et 51 kD langt glycoprotein med anti-T4 i T-celler og i de transformerede fibroblaster.

25

Disse forsøg viser, at transformanterne udtrykker et 55 kD glycoprotein, der immunudfældes med anti-T4, og som har samme størrelse som det, der udtrykkes på overfladen af T-lymfocytter. Northern- og Southern-analyser under anvendelse af det isolerede cDNA sammen med dette cDNA's evne til at meddele musefibroblas-30 ter T4+-fænotypen indikerer således, at hele den kodende sekvens for T-celle-overfladeproteinet T4 var blevet klonet.

35

I DK 175816 B1 I

I 38 I

Nukleotidsekvens af T4-CDNA og den udledte proteinsekvens I

Den fuldstændige nukleotidsekvens af det T4-kodende område blev bestemt ved at I

I sekventere begge strenge af den 3 kb lange cDNA-indsætning under anvendelse af I

5 dideoxyterminationsmetoden (35, 36). Den fuldstændige nukleotidsekvens og den I

I forventede proteinsekvens er vist i fig. 6. Den længste åbne læseramme begynder i I

position 76 med en methioninkodon omgivet af initieringsconsensussekvensen I

I PurNNATG-Pur (61). Denne læseramme strækker sig over 1374 nukleotider og I

koder for et polypeptid indeholdende 458 aminosyrer. Sammenhængen i denne I

10 læseramme blev bekræftet ved at indsætte dette cDNA i RNA-ekspressionsvek- I

I toren pSP6 (40). Hvis RNA syntetiseret fra denne vektor translateres in vitro, sty- I

I rer det syntesen af et umodificeret 51 kD protein, hvis præcise molekylvægt er I

I bestemt ud fra nukleotidsekvensen (fig. 7). I

I 15 T4 består af en ledersekvens, 4 tandem variableforbindelses (VJ)-lignende områder I

og et område, der strækker sig over membranen, hvilke områder hver har homolo- I

gi med tilsvarende områder i forskellige medlemmer af immunglobulingenfamilien I

I (62, 63) (fig. 6 og 8). En strækning af hydrofobe rester svarende til et lederpeptid, I

der blev forudsagt ved et Kyte-Dolittle (64) hydropaticitetsplot, følger umiddelbart I

20 efter initieringskodonen. Selv om den nøjagtige position, i hvilken det native T4- I

protein forarbejdes, ikke kan bestemmes, antages det, at skæringen sker lige efter I

threonin i position -l, på basis af kendte skæringsmønstre (65). Derfor indeholder I

signalpeptidet 23 aminosyrer, og det forarbejdede T4-protein består af 435 rester. I

25 Resterne 1-94 i det modne protein deler både aminosyrer og strukturel homologi I

med immunglobulins lette kædes variable område (fig. 9A). Den samlede homologi I

af dette område med immunglobulins variable områder er 32%. Sekvenssammen- I

H ligning mellem V-områderne af immunglobuliner med lette kæder og det N-ter- I

minale V-lignende område (VI) i T4 viser, at 8 af 14 invariante rester er bevaret I

30 (66). Dette område indeholder to cysteinrester, adskilt af 67 aminosyrer, hvis posi- I

tioner og afstand er analogt med det, der findes i immunglobuliner med lette kæ- I

der og beslægtede molekyler (67). Disse cysteinrester er måske i stand til at danne I

den bevarede disulfidbinding mellem strengene, der er karakteristisk for V-områ- I

der. Denne teori underbygges af den iagttagelse, at T4 vandrer hurtigere under I

39 DK 175816 B1 ikke-reducerende betingelser end under reducerende betingelser, hvilket stemmer overens med dannpkpn af minHcr pn hinHinn mellom chrennono (fin 5, bene e og f).

5 Bortset fra homologier på enkeltaminosyreniveau deler Vl-området af T4-struk-turelle træk med de variable områder af immuglobulin. Variable og konstante områder af immunglobulin foldes i et karakteristisk mønster, i hvilket en række anti-parallelle p-strenge foldes til dannelse af to p-lag (67, 68). Disse p-lag holdes både sammen af en disulfidbro og af karakteristiske hydrofobe interaktioner. For at 10 bestemme, hvorledes den forventede sekundære struktur af det V-lignende T4-område er i forhold til strukturen af V-områderne i lette immunglobulinkæder, blev der foretaget todimensionale strukturelle opstillinger. Der blev også opnået et plot over sandsynlige p-strenge og p-drejninger i disse sekvenser under anvendelse af den empirisk afledte algoritme ifølge Chou og Fasman (69). Disse analyser tyder på 15 tilstedeværelse af 7 β-strenge i det V-lignende T4-område, hvilke strenge svarer godt til dem, der findes i V-området i immunglobulin (fig. 9A). De to bevarede cysteiner i T4 findes i p-strengene B og F og svarer nøjagtig til positionerne af de cysteiner i V-området, der vides at danne den bevarede disulfidbinding i immunglobulin. En tryptophanrest ligger 12 aminosyrer nedstrøms for den første cystein, 20 og en tyrosinrest befinder sig to aminosyrer før den anden cystein. Disse rester er i høj grad karakteristiske for p-strengene henholdsvis C og F i lette kæders V-områ-de. Desuden findes der en aspartatrest 6 aminosyrer før den anden cystein, og en argininrest ligger ved basen af p-strengen D. Disse ladede rester er meget karakteristiske for V-områder (67). Endelig er stykker af skiftende hydrofobe rester til 25 stede i alle p-strengene, hvilke rester styrker interaktionen mellem de to p-lag.

Vl-området i T4 følges af en strækning af aminosyrerester, som bærer betydelig homologi med forbindelses (J)-områderne i immunglobuliner og T-celleantigen-receptorer. I fig. 9B er dette J-lignende T4-område stillet op sammen med consen-30 susforbindelsessekvenserne af lette immunglobulinkæder og de to kæder af T-celleantigenreceptoren. Dette J-lignende område følges af en strækning på 265 aminosyrer, som i strukturel henseende kan opdeles i tre yderligere VJ-lignende områder med statistisk signifikant sekvens- og strukturhomologi med prototypiske immunglobulin VJ-områder (fig. 6 og 8). Desuden indeholder denne sekvens to 35 potentielle N-bundne glycosyleringssteder (Asn-Leu-Thr; fig. 6).

I DK 175816 B1 I

I 40 I

I Det ekstracellulære område efterfølges af en formodet transmembran sekvens, I

hvilket er forventet ved et hydropaticitetsplot (64), hvilken sekvens kun indeholder I

I hydrofobe og neutrale aminosyrerester. Dette segment har en slående homologi I

I 5 med den transmembrane exon for β-kæderne af klasse II store histokompatibili- I

I tetsproteiner (fig. 9C). Opstilling af de transmembrane områder af T4 og MHC I

I klasse II p-kæder viser 48% homologi uden mellemrum. Efter det segment, der I

I strækker sig over membranen, følger en højladet sekvens på 40 aminosyrer I

omfattende det cytoplasmiske område (fig. 6 og 8). I

I 10 I

I T4-genet: kromosomplacering og positioner af intron-exon I

T4-cDNA'et blev anvendt til bestemmelse af kromosomplaceringen af T4-genet ved I

I analyse af dets segregationsmønster i en række musehumane somatiske cellehy- I

I 15 brider og ved in s/tu-hybridisering til humane metafase-kromosomer (101). Gen- I

I omblotforsøg og in s/tu-hybridisering viser, at T4-genet findes på den korte arm af I

det humane kromosom 12 mellem omraderne 12pl2 og 12pter. I

En række overlappende genomkloner, der spændte over T4-genet, blev fundet ved I

20 at screene humane genombiblioteker, der var konstrueret i lambda-kloningsvekto- I

I rerne Charon 4 og EMLB-3 (31) med en radiomærket pT4B cDNA-indsaetning (70). I

Karakterisering af disse kloner ved både restriktions- og Southern blot-analyse I

viste, at de indeholdt hele den T4-kodende sekvens. Den fuldstændige intron/exon- I

organisation af T4-genet blev derefter bestemt ved at sekventere specifikke frag- I

25 menter af genomklonerne under anvendelse af dideoxyterminationsproceduren I

I (35, 36). I

T4-genet omfatter 9 exoner adskilt af 8 introner som vist i fig. 8 og 10. Den første I

exon indeholder det 5'-utranslaterede område og ledersegmentet. Det første vari- I

H 30 abel-lignende område, Vj, er adskilt af en stor intron i nukleotidposition 289 (fig. I

H 6). Derfor indkodes V^j-området af den anden og tredje exon, og V2J2-, V3J3-, I

H V4J4- og transmembrane (TM)-områder indkodes hver især af separate exoner I

(exon 4-7). Det cytoplasmiske område (CYT) er afbrudt af en intron, og den I

sidste del af det cytoplasmiske område og det 3’-utranslaterede område indkodes I

35 af den 9. exon. I

41 DK 175816 B1

Konstruktion af T4+-00 T8+-tranQfnrmPrprfp roUpr

Den eksperimentelle procedure, der blev anvendt til undersøgelse af T4's rolle ved 5 AI DS-virusinfektion, omfattede først indføring af T4-genet i T4'-cellelinjer, som ikke kunne fremme virusinfektion. De transformerede celler blev derefter testet for modtagelighed over for AIDS-virus, efterfulgt af undersøgelser af den mekanisme, ved hjælp af hvilken T4 medierer virusinfektion.

10 En cDNA-klon med fuld længde, som indkoder T4-overfladeproteinet, blev subklo-net i den retrovirale ekspressionsvektor pMV7. Ekspressionsvektoren pMV7 (fig.

11A) indeholder to direkte gentagne Moloney musesarkomvirus "long terminal repeats" (LTR), som flankerer et enkelt EcoRI-kloningssted. 5’-LTR fremmer kon-stitutivt transkription gennem kloningsstedet, mens 3'-LTR tilvejebringer sekven-15 ser, der er nødvendige for skæring og polyadenylering af RNA'et. Desuden indeholder pMV7 herpesvirus-thymidinkinase-promotoren (tk) fusioneret til det kodende område af det bakterielle neomycin-phosphotransferasegen (neo), en dominerende selekterbar markør, der tillader bundet cotransformation og infektion.

20 T4-pMV7 blev indsat i ψ-2- og ψ-AM-celler, NIH 3T3-cellelinjer, som indeholdt defekte henholdsvis økotrope og amfotrope provira (fig. 11B) (44, 59). Begge cellelinjer er ude af stand til at indkapsle ("encapsidate") endogent viralt RNA, men kan tilvejebringe alle obligate transvirale funktioner. Stabil transfektion af disse cellelinjer med T4-pMV7 medfører produktion af rekombinante T4-kodende stam-25 retrovira, som er fri for hjælpervirus. Disse rene stamvira kan derefter anvendes til effektivt at indføre T4-sekvenser i både museceller og menneskeceller, uden at målcellen producerer retrovirus.

Kort fortalt blev T4-pMV7 DNA indsat i ψ-2-celler under anvendelse af proceduren 30 med DNA-medieret genoverførsel (Fig. 11B) (25, 27). Neo+-positive kolonier blev selekteret ved deres evne til at vokse i medier indeholdende neomycin-analogen G418 (Geneticin®) og screenet for ekspressionen af T4 på celleoverfladen under anvendelse af et in s/'tu-rosettedannelsesassay (20, 70). Der blev derefter identificeret kolonier af transficerede ψ-2-celler, der udtrykte T4, og som producerer 35 rekombinant retrovirus i titere på 10s cfu/ml. T4+-»|>-2-kloner blev derefter anvendt

I DK 175816 B1 I

42 I

I til at frembringe retrovira, som kunne inficere muse ψ-AM-celler. T4, der udtrykte

I ψ-AM-kloner, blev isoleret, og disse gav rekombinante retrovirale titere på ΙΟ4 I

I cfu/ml. T4+-humane transformanter blev genereret ved samdyrkning af celler med

I mitomycin-C-behandlede kloner eller ψ-AM-kloner (fig. 11B). T4+-transformanter I

I 5 blev derefter analyseret ved northern blot-analyse og flow-cytometri for at bekræf- I

I te, at T4 udtrykkes og er til stede på celleoverfladen. Kontrolcellelinjer, der ud- I

trykte T8-overfladeproteinet, blev konstrueret på analog måde. , I

I

T4 er essentiel for AIDS-virusinfektion I

I

For indledningsvis at bestemme, hvorvidt tilstedeværelsen af T4-proteinet på over-

I fladen af en human lymfocyt er tilstrækkelig til at gøre cellen følsom over for AIDS- I

I virusinfektion, blev der konstrueret transformanter af den primitive leukæmiske T- I

cellelinje HSB2 (71), der kun udtrykker de tidlige T-lymfocytproteiner TI og Til på

I 15 overfladen. HSB2 udtrykker hverken T4 eller T8 og udtrykker heller ikke T-cellean- I

tigenreceptoren eller det associerede kompleks af T3-proteiner. HSB2-transforman- I

ter, som enten udtrykker T4- eller T8-proteinerne på celleoverfladen, blev selekte- I

ret og anvendt for at bestemme disse ceilelinjers følsomhed over for AIDS-virusin- I

fektion. Flere forskellige forsøgsprocedurer blev benyttet for at bedømme AIDS- I

H 20 virusinfektion, herunder ekspression af omvendt transkriptase (52), ekspression af I

virus i cellens cytoplasma ved immunfluorescensmikroskopi (46), detektion af vi- I

rusantigener i kultursupernatanten under anvendelse af et immunassay (47) samt I

produktion af infektiøse virioner af supernatantsubkultur med phytohæmagglutinin I

(PHA)-stimulerede perifere lymfocytter (46). Under anvendelse af disse assays blev I

I 25 der ikke iagttaget tegn på AIDS-virusinfektion af HSB2-cellelinjen (tabel I). I

43 DK 175816 B1 TARR1. 7

T4+ og T8+ humane transformanters følsomhed over for AIDS-virusin- I

fektion

Maksimal om- Cytoplasmisk Supernatant-Human celle vendt tran- virus viral Ag skriptase CEM(T4+) 675023 + + HSB2 4245 HSB2-T8+ 4460 HSB2-T4+ 190915 + +

Ra j i ND ND ND

Raji-T8+ 5595 - -

Raji-T4+ 103500 + +

HeLa 6438 - -

HeLa-T8+ 4875

HeLa-T4+ 48125 + +

Supernatant- Syncytium- VSV(AIDS) Virus-

Human celle subkultur induktion pseudotype- binding infektion CEM(T4+) + + + + HSB2 - - - * HSB2-T8+ - - - * HSB2-T4+ + + + +

Raj i ND - ND

Raji-T8+ - - -

Raj i-T4+ + + + +

HeLa -

HeLa-T8+ - - ND

HeLa-T4+ + + + + 5xl06 celler blev inokuleret med AIDS-virus, inkuberet ved 37°C i 24 timer, vasket og udpladet i frisk medium. Celler og supernatanter blev fjernet på dag 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24 og 28 og anvendt i 4 virusdetektionsassays: omvendt transkriptase, cytoplasmisk virus, supernatantvirusantigen og supernatantsubkuttur.

i

I DK 175816 B1 I

I I

I Resultaterne af pseudotypeinfektionseksperimenterne er udtrykt som følger: I

I + (>103 PFU/ml); - (10 PFU/ml); ND = ikke bestemt. I

I Desuden er det tidligere blevet påvist, at der forekommer omfattende cellefusion, I

I 5 når uinficerede humane celler, der bærer receptorer for AIDS-virus, dyrkes sam- I

I men med celler, som producerer AIDS-virus (54). I dette assay er der ingen induk- I

I tion af syncytier, når HSB2-celler blandes med AIDS-virusproducerende H9-celler I

I (tabel I), selv om der dannes mange syncytier med HTLV-I- og HTLV-lI-produce- I

I rende celler (data ikke vist). I

I i° I

Til slut blev der testet for virusindtrængen under anvendelse af pseudotyper af I

I vesikulær stomatitisvirus (VSV), som bærer kappeg ly coproteinerne af AIDS-virus I

(tabel I) (53, 54). Nar celler inficeret med AIDS-virus superinficeres med VSV, I

H opsamler en del af VSV-afkommet tilstrækkelig AlDS-viruskøppeglycoprotein til at

15 modstå neutralisering med hyperimmunt anti-VSV-serum. De værter, der kan I

I anvendes med disse VSV (AIDS)-pseudotypevirioner, er begrænset til celler, der I

udtrykker AlDS-virusspecifikke receptorer. Efter indtrængen i cellen og afdækning I

I af virionen replikerer det transkapsiderede VSV-genom og danner ikke-pseudoty- I

I pepartikler. Under den sekundære infektion trænger VSV-afkom, som er afgivet fra I

I 20 inficerede celler, ind og ødelægger tilstødende indikatorceller, som er resistente I

over for VSV (AIDS)-pseudotypeinfektion (CCL64-minkceller eller bovine MDBK- I

I celler), hvilket resulterer i dannelse af VSV-plaques, som derefter tælles. Infektion I

I med VSV (AIDS)-pseudotyper giver således et kvantitativt cytopatisk plaqueassay I

for virusindtrængen (54). I dette assay blev der ikke observeret nogen plaques I

25 over baggrundsniveau, når HSB2-celler blev udsat for VSV (AlDS)-pseudotyper I

(tabel I). I kontrolforsøg med pseudotyper af VSV RNA indkapslet i en HTLV-I-kap- I

pe (VSV (HTLV-I)) blev der iagttaget adskillige plaques, hvilket viser, at HSB2-cel- I

len, som bærer HTLV-I-receptorer, er i stand til at replikere VSV på effektiv måde. I

Disse iagttagelser viser, at VSV-genomet indkapslet i en AIDS-viruskappe er ude af I

30 stand til at trænge ind i HSB2-celler. I

Det blev derefter undersøgt (tabel I), om indsætning af et funktionelt T4-cDNA i I

HSB2 ville gøre denne celle følsom over for AI DS-virusinfektion. Udsættelse af I

HSB2-T44-transformanter for AIDS-virus resulterer i en produktiv virusinfektion, I

i DK 175816 B1 45 hvilket blev bestemt ved ekspression af omvendt transkriptaseaktivitet (52), pkcnrp<:<;inn sf x/irnc i rpllonc rvrpplgcrng \/o/j »mmunflL'OreSCenSmikroSkopi (46), detektion af virusantigen i kultursupernatanten under anvendelse af et immun-assay (47) samt produktion af infektiøst virus af supernatantsubkultur med PHA-5 stimulerede lymfocytter (tabel I) (46). HSB2-T8+ kontrolceller var hele tiden negative i hvert af disse assays.

Desuden undersøgte man også den effektivitet, hvormed forskellige T4+-T-celler ! inficeres med AIDS-virus. HSB2-T44- og HSB2-T8+-transformanter, den naturligt 10 isolerede T4+ T-cellelinje CEM samt PHA-stimulerede perifere lymfocytter blev udsat for 10 ganges seriefortyndinger af AIDS-virus, vasket og udpladet i mikrokul-tur. Frekvensen af inficerede kulturer blev derefter bestemt under anvendelse af et immunassay 12 dage efter udsættelse for virus (fig. 12) (47). På denne måde blev den titer af AIDS-virus, der krævedes for at inficere 50% af de udsatte kulturer 15 (ID-50), defineret. ID-50 af PHA-stimulerede perifere lymfocytter er 2-3 størrelsesordener større end det, der blev observeret for enten naturligt isolerede eller transformerede T44-cellelinjer. Infektionseffektiviteten af HSB2-T4+-cel!er er ca. 10 gange større end det, der blev iagttaget for den naturligt isolerede T4+ T-cellelinje CEM (fig. 12). HSB2-T8+-kontrolceller er ikke følsomme over for infektion selv ved de 20 højeste virustitere, der blev undersøgt.

HSB2-T4+-cellers evne til at fremme både syncytiumdannelse og replikation af VSV (AIDS)-pseudotyper blev også undersøgt. Nar HSB2-T4+-celler dyrkes sammen med AlDS-virusproducerende H9-celler, ses der let syncytiumdannelse i løbet af 18 25 timer (tabel I og II). Desuden undertrykkes syncytiuminduktion ved at forbehandle kulturer med anti-T4A-monoklonalt antistof (tabel II). Nar HSB2-T4+-celler udsættes for VSV (AIDS)-pseudotyper, dannes der endelig infektiøse VSV-partikler, som nedbryder tilstødende indikatorceller (tabel 1 og III). Desuden inhiberes plaquedan-nelse ved forbehandling med enten anti-AIDS-virusantistof eller anti-T4A-monoklo-30 nalt antistof (tabel III). HSB2-T84 kontrolceller er hele tiden negative i hvert af de 7 assays, der blev anvendt for at detektere AlDS-virusinfektion (tabel 1, II og III).

Disse iagttagelser tilvejebringer genetisk bevis for, at den blotte tilstedeværelse af T4-proteinet i en umoden human T-lymfocyt tilvejebringer en essentiel funktion, der er nødvendig for AIDS-virusinfektion.

35

I DK 175816 B1 I

I I

I TABEL 11 I

Induktion af syncytier i T4+ humane transformanter H

Syncytium-induktion H

I Humane H9/A1DS H9/AIDS I

I celler + qTAA I

I JM(T4+) +++++ I

I 8166 (T4+) wn I

I HSB2 ND I

I HSB2-T8+ ND I

I HSB2-T4+ ++ I

I Raj i ND I

I Raj i *T8+ ND I

Raji-T4+ +++ I

I HeLa ND I

I HeLa-T8+ ND I

H HeLa-T4+ +++++

I 25 2xl05 celler blev dyrket sammen med 2xl04 AIDS-virusproducerende H9-celler I

(H9/AIDS) og inkuberet ved 37°C. Kulturerne blev undersøgt for syncytiumdannel- I

se efter 18 timer. Resultaterne er udtrykt som den omtrentlige procentdel af kerner I

I indeholdt i syncytier: - (ingen syncytier); ++ (25%); + + + (50%); ++++ + (90%); I

ND (ikke bestemt). Syncytiuminhibering blev analyseret ved at sætte anti-T4A-mo- I

I 30 noklonalt antistof (aT4A; 1:20) til de blandede kulturer ved tidspunktet for I

podning. De naturligt isolerede T4+-T-cellelinjer JM og 8166 tjente som positive I

kontroller i disse undersøgelser.

I 35 I

47 DK 175816 B1

TABEL III

VSV-pseudotype cytopatisk plaqueassay på T4+-og T8+-humane transformanter VSV-pseudotype-titer (PFU/rol)

Humane VSV(HTLV-I) VSV(AIDS)

celler + oHTLV-I + aAlDS + aT4A

CEM(T4+) 20.000 50 42.000 50 200 !

HSB2-T8+ 10.000 50 0 ND ND

HSB2-T4+ 12.000 50 1.000 100 300

Raj i -T8+ 5.000 ND 0 ND ND

Raji-T4+ 5.000 50 1.500 25 150

HeLa 10.000 ND 0 ND ND

HeLa-T4+ 10.000 50 17.000 50 200 25 2x105 celler blev inkuberet med VSV (AIDS)-pseudotyper (53, 54) i l time ved 37°C. Cellerne blev derefter vasket, og til hver brønd blev der sat lxlO6 CCL64-mink- eller bovine MDBK-plaqueindikatorceller, som tillod VSV-infektion, men var resistente over for VSV (AIDS). Kulturerne blev derefter overlejret med agarmedium, og VSV-plaques blev talt to dage efter infektion. Anti-T4A-monoklonalt antistof 30 (aT4A; 1:20) eller anti-Al DS-virusserum (aAlDS; 1:10) blev anvendt til at inhibere VSV (AIDS)-pseudotype-plaquedannelse ved forbehandling af celler 30 minutter før udsættelse for pseudotyper (54). VSV (HLTV-l) pseudotyper, som blev udpladet på en lang række humane celletyper (54), blev anvendt som kontroller i disse forsøg. Anti-HTLV-I-serum (1:10) blev anvendt for at blokere VSV (HTLV-I) pseudotype-35 plaquedannelse. Resultaterne er udtrykt som PFU/ml; ND (ikke bestemt).

I DK 175816 B1 I

I 48 I

AIDS-virusinfektion er ikke begrænset til T-lymfocytter I

I Et funktionelt T4-cDNA blev indsat i to humane ikke-T-cellelinjer: HeLa, en epitel- I

5 cellelinje stammende fra et cervikalt carcinom (72), og Raji, en B-lymfoblastoid I

cellelinje fra en patient med Burkitt's lymfom (73) (fig. 11B). Før retrovirusme- I

I dieret genoverførsel udtrykker disse cellelinjer ikke T4-overfladeprotein eller T4 I

I mRNA, og de er heller ikke følsomme over for AIDS-virusinfektion (tabel I). Des- I

I uden fremmer forældrecellelinjerne ikke induktion af syncytium og heller ikke I

I 10 udpladning af VSV (AIDS)-pseudotyper (tabel I, II og III). I

I Derimod fremmer T4+-Raji- og HeLa-transformanter AIDS-virusinfektion ifølge alle I

I de kriterier, der tidligere er beskrevet (tabel I). Den effektivitet, hvormed Raji-T4+- I

celler kan inficeres med AIDS-virus, ligger tæt på HSB2-T4+-cellers og er ca. 10 I

H 15 gange større end infektionseffektiviteten hos den naturligt isolerede T4+-T-cellelinje I

H CEM (fig. 12). Efter dyrkning sammen med AIDS-virusproducerende H9-celler I

I fremmer Raji-T4+-og HeLa^^-celler desuden induktion af syncytier, hvilket I

I undertrykkes ved at forbehandle kulturer med anti-T4A-monoklonalt antistof (tabel I

I I og II; fig. 13). Desuden medfører udsættelse af disse celler for VSV (AIDS)-pseu- I

20 dotyper produktion af infektiøst VSV og dannelse af plaques, som inhiberes ved I

forbehandling med anti-AIDS-virusantistof eller anti-T4A-monoklonalt antistof I

(tabel I og III). Raji-T8+ og HeLa-T8+ kontroltransformanter er hele tiden negative I

i hvert af disse assays (tabel I, Il og III). I

25 Derfor er indføring af et funktionelt T4-gen i enten humane T-lymfocytter, B-lymfo- I

cytter eller epitelceller tilstrækkeligt til at gøre sådanne celler følsomme over for I

AIDS-virusinfektion. Tilsammen indikerer disse iagttagelser, at den T4+-T-celle- I

tropisme, der iagttages in vivo, er en følge af den begrænsede ekspression af T4- I

molekylet og ikke arten af den celletype, i hvilken det udtrykkes. I

I 30 I

AIDS-virus binder til T4-overfladeprotein I

De tidligere eksperimenter giver genetisk bevis for, at T4-ekspression er nødvendig I

for AIDS-virusinfektion, men giver ingen information om dette molekyles rolle for I

35 virusets livscyklus. Den iagttagelse, at overfladeekspression af T4 er nødvendig for I

I 1 I

49 DK 175816 B1 AIDS-virusinfektion, antyder, at T4 er AlDS-virusreceptoren. Der blev derfor anvendt rvtnflunrnmptri fnr at nnder^tane hindinnpn af ΑΙΠ9-νϊπις til overfladerne af T4+-og T8+-transformerede humane celler (tabel I; fig. 14). HSB2-, Raji- og HeLa- | celler og T4+-eller T8+-transformanterne blev inkuberet med AIDS-virus. Efter vi-5 rusabsorption blev cellerne vasket, udsat for fluoresceinkonjugeret anti-AIDS-vi-rusantistof og analyseret ved flow-cytometri. Dette assay viste, at AIDS-virus binder effektivt og specifikt til de humane transformanter, der udtrykker overflade-T4, men ikke til T4'-forældrecellerne og ej heller til T8+-transformanterne (fig. 14, diagram B; tabel 1). Bindingen af AIDS-virus til T4+-celler undertrykkes ved præinku-10 bation med anti-T4A-monoklona!t antistof, men ikke ved præinkubation med anti-T8-monoklonalt antistof (fig. 14, diagram C). Når T4+-transformerede celler udsæt-; tes for AIDS-virus, copræcipiteres T4-glycoproteinet desuden sammen med virus- kappeglycoproteinet, hvilket antyder en direkte fysisk forbindelse mellem disse molekyler (data ikke vist). Disse resultater viser, at AIDS-viruset binder tilT4-mo-15 lekylet pi celleoverfladen, og at denne binding er uafhængig af andre T-cel)especi-fikke proteiner, da binding forekommer til alle de undersøgte T4+-celletyper.

Tidligere undersøgelser har beskrevet to forskellige indtrængningsveje for kappe-vira (74, 75, 76, 77). Nogle vira fusionerer direkte med plasmamembranen og af-20 giver deres nukleokapsider i cytoplasmaet, hvorimod andre internaliseres ved receptormedieret endocytose. Endosomets sure miljø letter derpå fusion af viruskap-pen med vakuolens begrænsende membran. Infektion med vira, som trænger ind i celler via den endocytiske vej, kan inhiberes ved behandling af cellerne med agens såsom svage baser, som afsyrner endosomet (58, 78, 79, 80). I nærværelse af 25 ammoniumchlorid blokeres fusion i endosomet, men lysosomnedbrydning finder stadig sted i reduceret grad (80).

Virkningen af ammoniumchlorid på AIDS-virusinfektion af Τ44-Τ-οθΙΙεϋη)βη JM blev derfor undersøgt. I fraværelse af ammoniumchlorid udtrykker over 50% af JM-cel-30 ler, der har været udsat for AIDS-virus, virusantigener 5 dage efter infektion, hvilket blev bestemt ved immunfluorescensmikroskopi. Hvis JM-celler udsættes for ammoniumchlorid (i 6 timer) enten på tidspunktet for tilsætning af virus eller inden for 30 minutter efter tilsætning af virus, blev der iagttaget over 95% inhibering af virusinfektion. Hvis cellerne blev behandlet med ammoniumchlorid 1 time efter til-35 sætning af virus, blev der imidlertid ikke iagttaget inhibering af infektionen, en

50 I

DK 175816 B1 I

iagttagelse, der stemte overens med den kinetik for virusindtrængen, der er be-

skrevet for andre vira, som trænger ind i cellerne via receptormedieret endocytose. I

Endelig var ammoniumchforids virkning fuldstændig reversibel. Celler, der var ud- I

sat for ammoniumchlorid i 1 time og derefter blev vasket fri for forbindelsen og ud- I

5 sat for AIDS-virus, øgede kontrolniveauer af virusinfektion. Disse resultater stem-

mer overens med tidligere iagttagelser af, at endosomets pH efter fjernelse af am- I

moniumchlorid vender tilbage til de oprindelige lave værdier i løbet af 1-2 minutter I

(78, 80). Der blev opnået lignende resultater med amantadin, en forbindelse, som I

afsyrner endosomet. I

Disse resultater stemmer overens med en mekanisme for virusindtrængen, der I

involverer endocytose af T4-AlDS-viruskomplekset og lav pH-inducéret fusion af H

viruskappen med endosomets begrænsende membran, hvilket afgiver det virale I

nukleokapsid i cellens cytoplasma. I

T4 mRNA udtrykkes i hjernen I

Ud over nedbrydning af det cellulære immunsystem er AIDS ofte ledsaget af lidel- I

ser i centralnervesystemet (CNS), som antages at være en følge af den direkte in- I

20 fektion af hjerneceller med AIDS-virus (81). Det var derfor interessant at bestem- I

me, om T4 udtrykkes i celler i CNS, hvilket kunne give en forklaring af virusets I

neurotrope egenskaber. Northern blot-analyser af RNA fremstillet ud fra både men- I

neske- og musehjerner blev udført for at bestemme, om T4 mRNA-sekvenser ud- I

trykkes i CNS (fig. 15). Poly(A)+ RNA fra human cerebral cortex indeholder to for- I

25 skellige T4 mRNA’er med en molekylvægt på ca. 3 og 1,8 kb. (fig. 15A). Det I

svageste 3 kb lange RNA har samme størrelse som det mRNA, der udtrykkes af to

T4+-leukæmiske cellelinjer, U937 (monocytisk cellelinje) og Jurkat (T-cellelinje) I

samt af perifere T-lymfocytter. Det mindre, mere talrige 1,8 kb lange mRNA, som I

er fra værende i T-lymfocytter, kunne skyldes alternativ splejsning eller alternative I

30 5'- eller 3’-terminaler. I

En mere omhyggelig analyse af lokaliseringen af T4 mRNA blev udført ved at isole- I

re pofy(A)+ RNA fra specifikke områder af musehjernen (fig. 15B). Hybridisering I

med radiomærket cDNA, der koder for musehomologen til T4, L3T4, viser et in-

35 tenst 2,2 kb langt mRNA i museforhjernen, som ikke findes i prøver fra baghjer- I

51 DK 175816 B1 nen. Det 2,2 kb lange L3T4 mRNA kan detekteres i cortex, hypothalamus og er mest talrigt i striatum, men er fraværende i cerebellum, hiernestammen eller rvo-arven (data ikke vist). Dette 2,2 kb lange mRNA, der detekteres i CNS, er ca. 1 kb mindre end det 3,2 kb lange mRNA, som koder for L3T4 i thymocytter (fig. 15B).

5 Disse resultater viser, at den neurotropisme, der udvises af AIDS-virus, sandsynligis er et resultat af overfladeekspression af T4-molekylet pi hjerneceller. Det niveau af mRNA, der detekteres i forhjernen, er ca. 1/30 af niveauet i thymocytter. Dette kan afspejle lavniveauekspression af et stort antal celler eller højere ekspressions-iveauer af en lille subpopulation af celler. Det er for tiden ikke kendt, om T4 ud-10 rykkes af neuroner eller støtteceller. Tilstedeværelsen af et varianttranskript i CNS gør det imidlertid usandsynligt, at T4-mRNA'et i hjernen udtrykkes af den sjældne invaderende T-lymfocyt.

Diskussion 15

Adskillelsen af T4 og T8 med funktionelt forskellige undergrupper af T-celler anyder, at disse molekyler kan være vigtige for interaktionen mellem T-lymfocytter og relevante målceller. Som et første trin til forståelse af disse proteiners specifikke rolle blev der fremstillet cDNA-kloner fra både T4- og T8-molekylerne, og deres nu-20 kleotidsekvens blev bestemt (20, 70). Sammenligning af de deducerede protein-sekvenser af T4 og T8 viser, at disse molekyler har betydelig fælles sekvens- og strukturhomologi med immunglobulins variable (V) områder og som medlemmer af immunglobulin-supergenfamilien. Imidlertid er de N-terminale V-lignende områder i T4 og T8 temmelig forskellige: de har kun 28% homologi til fælles og er derfor 25 mindre homologe med hinanden, end de hver især er med lette irnmunglobulin-kæder (fig. 9A). Desuden er områderne med maksimal bevarelse mellem T4 og T8 også de områder, der har stærkest homologi med immunglobulins og T-cellerecep-torers V-områder. Disse to molekylers immunglobulin-lignende områder udviser således, selv om de strukturmæssigt ligner hinanden, betydelige sekvensforskelle, 30 som underbygger den hypotese, at de genkender forskellige molekyler på forskellige undergrupper af målceller.

Den strukturelle homologi i det V-lignende område, som de N-terminale områder i T4 og T8 har til fælles, kan have særlig relevans for disse proteiners funktioner.

35 Praktisk talt alle medlemmer af immunglobulinsupergenfamilien tager del i immun-

DK 175816 B1 I

responset (62). Desuden har de individuelle medlemmer af denne familie en stærk

tendens til at gå i forbindelse med hinanden og danne dimerer. Denne forbindelse H

er tydelig ved interaktionen mellem de tunge og lette immunglobulinkæder, a- og H

β-kæderne af T-celleantigenreceptoren, p2-mikrogtobulin og klasse I MHC-proteiner : H

5 og a- og p-kæderne af klasse II MHC-molekyler. T8-glycoproteinet danner en disul* I

fidbinding med T6, et formodet MHC-lignende molekyle, på overfladen af thymo- I

cytter (82) og eksisterer som multimerer af den 32 kD lange underenhed på perife* I

re T-lymfocytter (83). Tilstedeværelsen af 4 V-lignende områder i T4 indikerer, at I

disse områder går i forbindelse med hinanden samt med specifikke ligander på ; I

1 10 overfladen af andre celler eller vira. Disse specifikke affiniteter hos immunglobulin- I I

lignende molekyler kan være essentielle for T4 og T8's genkendelsesfunktioner. H

Evolution af T4 H

15 I immunglobulin- og T-celleantigenreceptorgenerne ligger V- og >exonerne langt H

fra hinanden og bliver først sammenstillet efter en somatisk rekombinationsbegi- H

venhed (62, 63). T4 mRNA'et koder for 4 sammenhængende V- og J-lignende ele- I

menter uden at kræve DNA-rekombinationsbegivenheder. Det er derfor muligt, at H

T4 afspejler et mere primitivt gen, der udviklede sig før fremkomsten af omlej- H

20 ringsmekanismer. Yderligere belæg for dette kommer fra nylige iagttagelser af, H

at det første V-lignende område i T4 (VI) er afbrudt af en intron, som ikke er til I

stede i de V-gener, der enten koder for immunglobulinerne eller T-celleantigenre- H

ceptorerne. En beviskæde tyder på, at det er langt mere sandsynligt, at intraner M

fjernes præcist under udviklingen, end at intraner indsættes i et tidligere intronfrit H

25 miljø. T4 kan således repræsentere et tidligt immunglobulingen, som gennemgik

duplikationer, divergens og omlejring for at danne den aktuelle immunglobulin- H

genfamilie. Selv om T4 for tiden er funktionel i et langt mere komplekst immun- H

system, kan T4 afspejle receptorer, som er virksomme i mere primitive cellulære H

immunresponser. Primitive immunresponser såsom dem hos hvirvelløse dyr ser H

30 ikke ud til at involvere et forskelligartet repertoire af receptormolekyler, men er H

i de simpleste tilfælde begrænset til en skelnen mellem sig selv og ikke sig selv

(85, 86) og akkomoderes sandsynligvis af et "statisk" sæt af gener, som ikke I

gennemgår omlejring. H

DK 175816 B1 I

Uanset rækkefølgen af fremkomsten af T4 i udviklingen er organisationen af dette I

nen pr int-pressant eksemDel på exonblandinq. T4 består af 4 V-J-lignende områder, | et J-lignende område og et transmembrant segment, der hver har fælles homologi med forskellige medlemmer af immunglobulin-supergenfamilien. De V- og J-lig-5 nende områder er homologe med de tilsvarende områder i både immunglobuliner og T-celleantigenreceptorkæderne; det transmembrane område udviser betydelig homologi med dette område i β-kæderne af klasse II MHC-molekyler (fig. 9C). T4 består derfor af en række exoner, der er bevaret i flere medlemmer af immunglobulin-supergenfamilien, som er blandet på forskellige måder til dannelse af et stort 10 antal forskellige molekyler, som tager del i immunresponset.

T4 er AIDS-virusreceptoren

De i nærværende sammenhæng tilvejebragte data tyder på en mekanisme for 15 AIDS-virusinfektion, som i begyndelsen involverer den specifikke association af AIDS-viruset med T4-molekyler på celleoverfladen. Denne association kan påvises på T-lymfocytter, B-lymfocytter og epitelceller og kræver derfor ikke deltagelse af yderligere T-cellespecifikke proteiner. Desuden viser disse data, at T4-AIDS-virus-komplekset internaliseres via receptormedieret endocytose, og viruskappen fusio-20 nerer derefter med endosomets begrænsende membran og afgiver nukleokapsidet i cytoplasmaet. Virusreplikation og -transkription kan derpå forekomme i både lym-foide og ikke-lymfoide cellelinjer. Desuden udtrykkes T4-genet i hjernen samt i lymfocytter, hvilket forklarer AIDS-virusets dobbelte neurotrope og lymfotrope karakter, på denne måde er et T-lymfocyt-overfladeprotein, som er vigtigt ved 25 mediering af effektorcelle/målcelle-interaktioner, blevet udnyttet af et humant retrovirus til specifikt at målrette AIDS-viruset til populationer af T4+-celler.

Celleoverfladereceptorer er blevet identificeret for en række kappevira, og disse receptorers ekspressionsmønster er ofte ansvarligt for specifikke viras mulige vær-30 ter og tropiske egenskaber (74, 76). Nogle vira inficerer kun et snævert udvalg af celletyper, hvilket afspejler ekspressionen af virusreceptoren på specifikke populationer af målceller. Rabiesvirus samvirker fx med nikotinacetylcholinreceptoren (87) og inficerer hovedsagelig skeletmuskler og neuroner, hvorimod Epstein-Barr-virus samvirker med C3d-komplementreceptortype 2 (88) og inficerer B-lymfocyt-

I DK 175816 B1 I

Η I

ter. Andre vira såsom myxovira samvirker med allestedsnærværende sialsyrerester I

på celleoverfladen og inficerer et meget bredere udvalg af celletyper. I

H Den begrænsede ekspression af celleoverfladereceptorer giver kun én forklaring på I

Η J 5 viral tropisme. Nogle vira replikerer kun i et begrænset sæt af differentierede celle- I

typer, mens andre kun transkriberes effektivt i specifikke celletyper. Således indu- I

cerer Moloney museieukæmivirus (Mo-MuLV) T-cellelymfomer hos nyfødte mus, I

H mens det nært beslægtede Friend hjælper-museleukæmivirus (Fr-MuLV) primært I

H inducerer erythroleukæmier (89, 90, 91). Denne tropisme antages at skyldes for- I

10 skelle i de LTR'er, som letter den effektive transkription af Mo-MuLV-genomet i T- I

lymfocytter og Fr-MuLV-genomet i erythroide precursorer (92, 93, 94). I

Som beskrevet er den primære tropiske AIDS-virusdeterminant ekspressionen af I

H T4-proteinet på overfladen af målcellen. In w'vø-infektion er begrænset til lymfoide I

15 celler og myeloide celler samt hjerneceller: tre populationer, der udtrykker T4. In I

v/tro-forsøg viser, at indsætning af T4 i T4-humane B-lymfocytter og epitelceller, I

celler, som ikke er naturlige mål for AIDS-virus, gør disse celler følsomme over for I

produktiv infektion med AIDS-virus. I

I

I EKSEMPEL 1 I

H Opløselige T4-fragmenter I

25 Der fremstilles opløselige T4-glycoproteinfragmenter under anvendelse af be- I

grænset proteasenedbrydning ud fra cellepræparationer. Alternativt kan der I

konstrueres DNA-ekspressionsvektorer, der koder for T4-fragmenter, og som I

mangler transmembranområdet, et område indeholdende neutrale og hydrofobe I

rester, og disse vektorer kan anvendes til fremstilling af sådanne T4-fragmenter. I

30 Disse fragmenter er opløselige i vandige opløsninger og indeholder leder-(signal)- I

sekvenser. Når disse fragmenter udtrykkes i pattedyrceller, transporteres de til det I

ru endoplasmatiske retikulum/golgrkompleks og udskilles til slut fra cellerne. I

. 35 I

DK 175816 B1 I

EKSEMPEL 2

Behandling af AlDS-patienter 5 Opløselige T4-glycoproteinfragmenter som beskrevet i eksempel 1, typisk i en farmaceutisk acceptabel bærer, administreres til patienter, der er inficeret med et humant immundefektvirus, for at fragmenterne skal binde til virus, som findes i patientens blod og andre legemsvæsker, og blokere infektion af T44-celler in vivo.

Alternativt eller yderligere ledes en patients blod gennem en søjle, der enten inde-10 holder immobiliserede T4-glycoproteiner eller opløselige T4-fragmen-ter, således at viruset kan adskilles fra blodet. Sådanne foranstaltninger gør det muligt for immunsystemet at etablere et mere effektivt immunologisk respons mod viruset, dvs. tillade uinficerede T4+ T-celler at proliferere.

15 Opløselige T4-fragmenter anvendes som terapeutisk middel, dvs. en inhibitor for ekstracellulær spredning og celle-celle-spredning af HIV-infektion. Nærværende ansøgere har pavist, at opløselige T4-fragmenter inhiberer in vitro HIV-binding til og infektion af T4+-målceller (jfr. eksempel 4). Administration af opløselige T4-fragmenter til personer inficeret med HIV inhiberer ekstracellulær spredning af 20 virusinfektionen. Desuden inhiberes fusion af HIV-inficerede T4+-celler og uinficerede T4+-celler, hvilket også er en vej, ad hvilken viruset spredes, ved administration af opløselige T4-fragmenter.

I Derfor forsinker administration af opløselige T4-fragmenter sygdommens forløb, 25 lindrer adskillige symptomer, der er forbundet med AIDS, og forhindrer forekomst af nye patologiske forandringer.

Opløselige T4-fragmenter, der er biokemisk rene, vandige opløselige reagenser, anvendes i kombination med andre reagenser for at analysere for konkurrenter til 30 T4-HIV-interaktionen. Opløselige T4-fragmenter anvendes således i kombination med HIV-kappeproteiner eller biokemiske blandinger indeholdende HIV-kappe-proteiner til at screene for inhibitorer af virusbinding.

I DK 175816 B1

I I

EKSEMPEL 3

Produktion af opløselige T4-fragmenter I

5 cDNA, som koder for det membranbundne T4-protein (pT4B), er blevet isoleret, I

karakteriseret og udtrykt i en række pattedyrcelletyper (70). Opløselige T4-frag- I

menter produceres i bakterie-, gær-, insekt- og pattedyrsystemer. Da T4-proteinet I

sandsynligvis foldes på en kompliceret måde og er glycosyleret, foretrækkes eks- I

H pression i pattedyrsystemer. Opløselige T4-fragmenter produceres ved at skære I

H 10 pT4B efter V4J4-området. Sådanne DNA-f rag menter ender før transmembranseg- I

mentet, der begynder ved ca. nukleotidposition 1264 (fig. 6). Dette rekombinante j I

DNA-molekyler mangler både transmembranområdet og det cytoplasmiske områ- I

H de. EcoRI-Hpall-fragmentet, der omfatter nukleotiderne 1-1252, isoleres ved at 1 I

samle det ud fra mindre fragmenter af pT4B. Alternativt deleteres det membran- I

H 15 omspændende segment alene, hvilket medfører, at V4J4-området fusioneres til det I

cytoplasmiske område. En fremgangsmåde er at deletere det fragment, der om- I

spænder Hpall-stederne fra nukleotiderne 1252-1342, fra pT4B. I sådanne kon- I

H struktioner bevares den T4-signalsekvens, der er nødvendig for indtrængen i det ru I

H endoplasmatiske retikulum/golgikompleks og til slut udskillelse fra cellen. Desuden I

H 20 bevares i disse konstruktioner den ekstracellulære del af T4-proteinet, i hvilken I

der findes bindingsområdet for kappeglycoproteinet fra humant immundefektvirus. I

For at udtrykke opløselige T4-fragmenter i pattedyrsystemer subklones det modi- I

Ficerede T4-cDNA-fragment i vektorer, som indeholder stærke eukaryote promo- I

25 torer/enhancere samt polyadenyleringssteder, som er nødvendige for spaltning og I

H polyadenylering af RNA’et. Fx er den tidlige simianvirus (SV40)-promotor og -en- I

hancer beliggende opstrøms for det opløselige T4-cDNA-fragment. Transkriptions- I

I termination og RNA-polyadenylering opnås ved at anbringe polyadenyleringsstedet I

I fra enten SV40 eller det humane væksthormongen nedstrøms for det opløselige I

I 30 T4-cDNA-fragment. Indsætning af en konstruktion, der indeholder disse elementer I

sammen med en selekterbar markør, i eukaryote celler ved en hvilken som helst af I

I flere metoder, der er kendte på området, fører til stabil integration af exogent I

I DNA. Transformanter, der selekteres for deres evne til at vokse i selektivt medium, I

I udskiller opløselige T4-fragmenter i kultursupernatanten. Opløselige T4-fragmenter I

57 DK 175816 B1 detekteres i supernatanten ved ét af flere assays, fx radioimmunudfældning, og sn /4 A»* * V wvi W VS·· ·

Oprensning og karakterisering af opløselige T4-fragmenter lettes i høj grad ved 5 konstruktion af en cellelinje, der overudtrykker det udskilte proteinfragment.

Strategier, der tillader overekspression af proteiner, er blevet anvendt med bakterie-, gær-, insekt- og pattedyrsystemer. Inducerbare ekspressionssystemer er også blevet anvendt med bakterier og gær for at overproducere proteiner, som kan være toxiske, hvis de udtrykkes konstitutivt. Overekspression af opløselige T4-10 fragmenter udføres ved at amplificere en opløselig T4-ekspressionsvektor, hvilket medfører konstitutiv overekspression. Amplifikation af dihydrofolatreduktase (dhfr)-generne ved dyrkning i progressivt stigende koncentrationer af lægemidlet methotrexat, en dhfr-antagonist, er i vid udstrækning blevet benyttet. Da den amplificerede enhed ikke er begrænset til dhfr-kodende sekvenser, resulterer 15 denne fremgangsmåde i coamplifikation af sekvenser, der grænser op til disse.

Derfor anvendes dhfr som selekterbar markør og som middel til coamplifikation af nyligt indførte sekvenser. Denne strategi er med held blevet anvendt til at forøge ekspressionen af flere forskellige gener, som cotransformeres med dhfr-plasmider.

En alternativ amplifikationsprocedure omfatter cotransfektion af den opløselige T4-20 cDNA-ekspressionsvektor med plasmidet pdLAT-3 efterfulgt af en elektionsproce-dure som beskrevet tidligere (102).

Derfor cotransficeres den opløselige T4-cDNA-ekspressionskonstruktion med et dhfr-ekspressionsplasmid. Alternativt findes dhfr-genet på det samme plasmid som 25 det opløselige T4-cDNA-fragment, hvilket muliggør forbundet cotransformation.

Transfektion af disse konstruktioner i dhfr-deficiente (dhfr") kinesisk hamsterova-rieceller (CHO) og efterfølgende selektion i methotrexat muliggør isolering af stabile transformanter, der udtrykker nyligt indsatte sekvenser. Flere kloner oprenses, og kultursupernatanter opsamles og analyseres for tilstedeværelsen af 30 opløselige T4-fragmenter. Kloner, der producerer de største mængder opløselige T4-fragmenter, karakteriseres yderligere ved northern og Southern blot-analyser.

Disse cellelinjer dyrkes derpå i selektivt medium, der indeholder trinvis forøgede methotrexatkoncentrationer. Dette selektive tryk medfører amplifikation af det nyligt indsatte dhfr-gen og tilgrænsende T4-sekvenser. Efter at den højeste metho-35 trexatkoncentration er nået, underkastes de overlevende celler northern og _ _i

DK 175816 B1 I

Southern blot-analyser for at bestemme amplifikationsgraden, og kultursuperna- I

tanter undersøges for tilstedeværelsen af opløselige T4-fragmenter. I

For at karakterisere de opløselige T4-fragmenter i kultursupernatanten mærkes H

5 flere transformanter metabolisk med (35S)-methionin. Cellelysater og supernatan- I

ter analyseres dernæst ved radioimmunudfældning og western blot-analyse under I

anvendelse af kommercielt tilgængelige anti-T4-antistoffer. SDS-polyacrylamid- I

gelelektroforese udføres på præcipitateme, og der observeres et bånd med den H

forventede relative molekylvægt (Mr) af den udskilte, afkortede form af T4. Oa I

10 dette protein syntetiseres i et pattedyrsystem, er det korrekt glycosyleret og foldet, I

dvs. der dannes disulfidbroer. For at oprense de opløselige T4-fragmenter fra kul- I

tursupernatanten udføres der immunaffinitets-søjlekromatografi under anvendelse I

af anti-T4-antistoffer. Protein, der bindes til søjlen, elueres ved høje saltkoncentra- I

tioner og lav pH. Der udføres SDS-polyacrylamid-gelelektroforese på det eluerede I

15 materiale for at bestemme Mr og renhed af den eluerede proteinfraktion. Desuden H

udføres der også radioimmunudfældning og western blot-analyse for yderligere at H

karakterisere det affinitetsoprensede materiale. I

Lignende fremgangsmåder kan udføres i bakterier, gær og insekter til fremstilling H

20 af opløselige T4-fragmenter. Desuden kan der produceres fragmenter med en

mindre størrelse end den her beskrevne, fx kun indeholdende V^-området. I

Konstruktion af vektorer I

25 Under anvendelse af rekombinant-DIMA-manipulationer blev baseparrene (bp) 1- I

1257 af den humane T4-cDNA-sekvens anbragt mellem en tidlig SV40-promotor og I

en TAA-terminationskodon efterfulgt af polyadenyleringsområdet af det bovine I

væksthormongen. Denne sekvens af T4-cDNA koder for T4-receptorens lederom- I

råde og forventede ekstracellulære område. Dette sT4-minigen blev forbundet med I

30 et humant H-ras-gen eller et muse-dihydrofolatreduktaseminigen til dannelse af I

vektorerne henholdsvis pST4CHras og pST4DHFR. Konstruktionen af disse vektorer H

foregik som følger: I

Konstruktion af pST4sal: Plasmidet pST4sal blev konstrueret ud fra to andre plas- H

35 mider, JRT4 og pUCsT4. Konstruktionen af disse plasmider er beskrevet nedenfor. I

59 DK 175816 B1

Konstruktion af plasmidet JRT4: Til dannelse af plasmidet JRT4 blev plasmidet DSP1 (103) skåret med Xhol, det tidlige SV40 polyA-område blev deleteret, og Xhol-stederne blev udfyldt med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase. Polyade-5 nyleringsområdet fra bovint væksthormon (113) blev skåret med PvuII og Kpnl, og KpnI-stedets ender blev gjort stumpe ved behandling med T4-DNA-polymerase.

Dette 230 bp lange fragment blev ligeret til DSP1 til dannelse af DSP1BGH.

DSP1BGH blev skåret med Smal og Sall, og galK-kassetten (der består af den 10 tidlige SV40-promotor, det galK-kodende område og BGH-polyA-området) blev ligeret ind i pUC19 (107) ved Sall-stedet under anvendelse af en syntetisk linker bestående af en Sall-ende, et Bglll-sted og en Smal-ende. Denne tredelte ligering gav plasmidet DSP1BZBGH JT.

15 DSP1BZBGH.JT, som blev skåret med Stul og Bell for at deletere det galK-kodende område, blev ligeret til et 1,7 kb langt EcoRI-(udfyldt)-BamHI-fragment indeholdende T4-CDNA fra plasmidet pT4B (70), hvilket gav plasmidet 3RT4.

Konstruktion af plasmidet pUCsT4: Til dannelse af plasmidet pUCsT4 blev et Haell-20 og Hpall-fragment (1125 bp) fra T4-CDNA fra plasmidet pT4B ligeret ved hjælp af syntetiske linkere til vektoren pUC18, som var skåret med Kpnl og Xbal. Haell-enden af T4-cDNA'et blev ligeret til KpnI-stedet fra pUC18 ved hjælp af en syntetisk linker med en KpnI-ende og en Haell-ende. Hpall-enden af T4-cDNA’et blev ligeret til Xbal-stedet i pUC18 ved hjælp af en syntetisk linker med en Hpall-ende 25 og en Xbal-ende. Med denne linker blev der også indsat en TAA-stopkodon efter nukleotid 1257 i det T4-kodende område. Det resulterende plasmid var pUCsT4.

Til dannelse af plasmidet pST4sal blev plasmidet JRT4 skåret med BgJII og SacI, og der blev isoleret et 959 bp langt fragment (bestående af den tidlige SV40-promotor 30 og de første 602 nukleotider af T4-cDNA'et). Plasmidet pUCsT4 blev skåret med Sad og Xbal, og der blev isoleret et 660 bp langt fragment (bestående af T4-CDNA fra nukleotideme 603-1257 efterfulgt af TAA-kodonen fra den syntetiske linker).

Disse to fragmenter blev ligeret ind i DSP1BZBGH.JT, som var skåret med Bglll og Xbal for at deletere den tidlige SV40-promotor og det T4-kodende område med 35 fuld længde. Det resulterende plasmid var pST4sal.

I DK 175816 B1 I

I 60 I

I Konstruktion af pST4DHFR: Til dannelse af pJasmidet pST4DHFR blev et Bglll- I

I BamHI-fragment, som indeholdt en β-globin-DHFR-ekspressionskassette, ligeret I

I ind i BamHI-stedet på pST4sal. β-globin-DHFR-ekspressionskassetten består af: I

I i 5 muse-p-globinpromotoren (550 bp HincII-fragment fra plasmidet pPK288 (108) I

modificeret ved 5'-enden med en syntetisk linker til at indeholde et Bglll-sted); det I

I muse-DHFR-kodende område (735 bp HindIU-(udfyldt)-fragment fra plasmidet I

I pSV2-DHFR (109)); NheI-(udfyldt)-BamHI-(udfyldt)-SV40-polyA tidligt område I

I fra DSPl (103); og muse-DHFR-terminatorområdet (907 bp Hindlll-(udfyldt)- I

I 10 fragment fra plasmidet mDH9 (110), modificeret ved 3’-enden med en syntetisk

I linker til dannelse af et BamHI-sted). Plasmidkortet over pST4DHFR er vist. H

I Konstruktion af pST4cHras: Plasmidet pMERcHras blev dannet ved at skære plas-

midet pSVK (111) med EcoRV og Hindlll (udfyldt) for at fjerne galK-området og I

I 15 ligere et 870 bp langt NdeI-(udfyldt)-Sall (gjort stumpendet med mungbønnenu- I

klease)-fragment, som indeholder det kodende område for cHras, fra plasmidet H

pSKcHras (112). I

I Den opløselige T4-transkriptionskassette blev fjernet fra pST4sal via et Bglll- H

I 20 BamHI-fragment og ligeret ind i BamHI-stedet (3’ i forhold til SV40 polyA tidlig) på I

I pMERcHras til dannelse af pST4cHras. I

I Ekspression af opløselige T4-($T4)-minigener i pattedyrceller I

I 25 Ekspression af psT4cHras i NlH-3T3-celler: Plasmidet pST4cHras (10 Mg) blev I

coprsecipiteret ved calciumphosphat-præcipitationsmetoden med 10 pg af plas- H

I midet pTKneo, en vektor, der giver G418-resistens, i nærværelse af 10 μς bærer- H

I DNA (NIH-3T3-genomisk DNA) på NIH-3T3-cel-ler (podet med 5 x 10s celler pr. 60 I

I mm dyrkningsskål den foregående dag). Cellerne blev inkuberet med det præcipi- I

I 30 terede DNA i 6 timer ved 37C. DNA-præcipitatet blev fjernet, og frisk medium H

(DMEM, 5% Nu-Serum® (Collaborative Research, Inc., Lexington, Massachusetts)) Η

blev sat til skålene. Cellerne blev trypsiniseret 16 timer senere og podet i tre I

I 100 mm skåle og holdt i ovenstående medium. Foci (ca. 50 pr. skål) fremkom i H

I løbet af 12-14 dage. 11 af de transformerede foci blev selekteret, ekspanderet og I

I 35 derpå podet med 5 x 10s celler pr. 100 mm skål til selektion i ovenstående medium I

61 DK 175816 B1 plus 500 pg/ml GE-iNE-TICIN® G418 (Gibco Laboratories, Grand Island, New York).

Alle 11 kloner overlevede G418-selektion (500 jtg/ml) og blev screenet for H-ras (p21)-niveauer ved standardmæssig protein-immunblotanalyse.

5 De kloner, som udtrykte de højeste niveauer af p21 (ca. 2 ng p21/pg Triton-opløseligt protein), blev analyseret for ekspression af sT4. Konfluente kulturer blev inkuberet i 18 timer med 35S-mærket methionin og cystein. Kultursupernatanter og cellelysater blev immunudfældet med monoklonale antistoffer, der var specifikke for T4-receptoren (0KT4, OKT4A) og T8-receptoren (OKT8), polyklonalt antistof, 10 der var specifikt for ras-proteiner, eller uspecifikt muse-IgG. Et protein på ca.

45 kD, den forventede størrelse af sT4, blev specifikt præcipiteret fra dyrkningsmediet af begge de monoklonale antistoffer, der var rettet mod T4-receptoren. sT4-båndet blev ikke observeret i cellelysater. Som forventet blev p21 præcipiteret fra cellen, men ikke fra kultursupernatanterne. Efterfølgende kvantificering viser, 15 at i sammenligning med oprenset sT4 producerer disse celler relativt lave niveauer af sT4, dvs. ca. 100 gange lavere end med CHO-celler som beskrevet i eksempel 2B.

Ekspression af pST4DHFR i kinesisk hamsterovarie-celler (CHO): 20 DXB-ll-celler, en DHFR-deficient CHO-cellelinje (104), blev transficeret ved calciumphosphat-præcipitation med 10-30 ug pST4DHFR i nærværelse af 10 pg bærer-DNA (NIH-3T3-genomisk DNA) 1 dag efter podning af 60 mm skåle med 5 x 105 celler. Cellerne blev inkuberet med DNA-præcipitatet i 6 timer ved 37°C, mediet blev fjernet, og frisk medium (F12, 10% FBS, 100 enheder/ml penicillin og 25 streptomycin) blev sat til skålene. Mediet blev på ny udskiftet efter 16 timer, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24 timer. Cellerne blev derefter trypsiniseret, podet i tre 100 mm skåle og selekteret i nukleosidfrit medium (F12 uden hypoxan-thin og thymidin, 10% dialyseret FBS og 100 enheder/ml penicillin og streptomycin). Der fremkom kolonier (ca. 100 pr. skål) i løbet af 7-10 dage. Kolonier fra hver 30 skål blev samlet i pulje, ekspanderet og derefter podet med 5 x I03og med 5 x 104 celler pr. brønd i kulturplader med 24 brønde, eller med 5 x 105 celler pr. 100 mm skål. Cellerne fik lov til at komme sig i 3 dage før påbegyndelse af selektion i nukleosidfrit medium indeholdende 20 nM methotrexat (mtx). Enkelte brønde eller kloner blev analyseret ved konfluens for sT4-ekspression, og de, der blev selek-35 teret til yderligere amplifikation, blev podet i kulturplader med 24 brønde i de

I DK 175816 B1 I

I 62 I

I ovenfor beskrevne tætheder. Selektion ved 800 nM mtx i nukleosidfrit medium blev H

I påbegyndt 3 dage efter podning. Denne selektionsprocedure blev gentaget for se- H

I lektioner ved 8 jiM mtx og 80 μΜ mtx. H

I 5 Ved denne metode blev der afledt flere cellelinjer, som udtrykker opløselig T4 med

mindst 3 pg/celle/24 timer. I

I Oprensning af sT4: Konditioneret medium (CM) blev gjort serumfrit fra adhæreren- I

I de cellekulturer og ekspanderet i 850 cm2 dyrkningskolber under mtx-selektive be- I

I 10 tingelser. Ved konfluens blev cellerne vasket to gange med phosphatbufret saltop- I

løsning (PBS) uden Mg2+ og Ca2+, og dyrkningsmediet (Hams F12 uden hypoxan- I

thin og thymidin, 10% føtalt bovint serum, 100 enheder/ml penicillin og streptomy- I

I cin og mtx i den selektive koncentration) blev erstattet med det samme medium H

H minus serum og mtx og plus 1 x ITS (insulin, transferrin og selen [Collaborative

I 15 Research Inc.]). Efter 24-48 timer blev mediet fjernet og erstattet med selektivt, I

I vækstmedium. Serumfrit medium blev derefter igen tilsat i løbet af 3-5 dage, og I

I denne cyklus blev gentaget i længere tid, dvs. i mere end to måneder. CM blev H

klaret ved centrifugering ved 8000 x g. En proteaseinhibitor, PMSF (phenylmethyl- H

sulfonylfluorid), blev tilsat op til 0,5 mM, og CM blev koncentreret ca. 10 gange ved H

20 trykmembranfiltrering. Dette koncentrerede CM blev klaret ved centrifugering ved H

2000 x g, og aprotinin, en proteaseinhibitor (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), I

blev tilsat til en slutkoncentration på 5 pg/ml. Prøven blev processeret direkte eller I

efter opbevaring ved -70°C. I

25 Den koncentrerede CM-prøve blev fortyndet 2 gange med 50 mM MES [2-(N- I

morpholino)ethansulfonsyre], pH 6,0, og filtreret gennem et 0,45 fim filter. Prøven H

blev derefter behandlet med 100 fim pAPMSF (p-amidinophenylmethylsulfonyl- I

fluorid) (CalBiochem-Behring, San Diego, Californien) og sat på en S-Sepharose®- I

I søjle (sulfopropyl) (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, New Jersey) ækvili- I

I 30 breret i 50 mM MES, pH 6,0, i en proteinkoncentration på 1,5-2,0 mg/ml gel.

I Prøven blev elueret under anvendelse af en lineær gradient af 0-0,5 M NaCI i I

I 50 mM MES, pH 6,0. Topfraktioner, som eluerede ved ca. 0,2 M NaCI, blev samlet i I

I pulje og behandlet med pAPMSF til 100 μΜ. Fraktioner indeholdende sT4 blev be- I

I kræftet ved SDS-PAGE og immunblot-assays. Efter henstand ved 4°C i 1 time blev I

63 DK 175816 B1 prøven dialyseret mod 50 mM Bis-Tris-propan [l,3-bis[tris-(hydroxymethyl)-methylaminnlpronanl. pH 6 0

Prøven blev behandlet med 100 μΜ pAPSMF, og 0,1% thiodiglycol, pH 9,0 blev 5 derefter sat på en Q-Sepharose®-søjle {kvaternær aminoethyl) (Pharmacia) (5 ml prøve/ml gel) ækvilibreret i 50 mM Bis-Tris-propan (BTP), pH 9,0. sT4-prøven binder ikke til Q-Sepharose® og blev opsamlet i den ubundne fraktion og søjle-vaskevæsken. Den ubundne prøve blev umiddelbart indstillet til pH 6,0.

10 Det sidste trin var kromatografi på en 30 μ Superose® 12-søjle (2,5 x 46 cm) (Pharmacia) ækvilibreret i 50 mM phosphat, 0,15 M NaCI, pH 7,0. Søjlen blev kørt ved en gennemstrømningshastighed på 3,0 ml/minut. 10 ml injektioner blev foretaget, og 42 minutters toppen blev opsamlet batchvis. Processen gav ca. 1,0 mg produkt pr. 20,0 mg totalt protein for en cellelinje, som producerede ca. 3 pg/cel-15 le/dag.

Karakterisering af sT4

Fysiske egenskaber. Total proteinkoncentration blev bestemt under anvendelse af 20 det kolorimetriske BCA-proteinassay (bicinchoninsyre, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). Absolutte koncentrationer blev bestemt ved kvantitativ aminosyre-analyse. Måling af det oprensede sT4’s aminosyresammensætning blev foretaget under anvendelse af standardmæssige aminosyreanalyseteknikker og viste sig at stemme overens med den forventede sekvens for molekylet, når der tages hensyn 25 til eksperimentelle fejl (± 15%). Over de første 20 rester var sekvensen som forventet bortset fra, at den begynder: lys-lys-val-val—. Den modne aminoterminal begynder således ved position +3 med hensyn til det forventede lederskæringssted og er forskellig fra den forventede sekvens ved denne position, idet der er en ændring fra asn til lys. Positionen af den modne aminoterminal stemmer godt 30 overens med de bestemte terminaler af muse- og fåre-CD4-proteinerne. Ændringen fra asn til lys kan repræsentere en sekventeringsfej! (enkelt baseændring) eller en mutation, som opstod under de rekombinante procedurer.

Immunepitoper: De monoklonale antistoffer OKT4 og OKT4A genkender ikke-35 interfererende overfladeepitoper på T4-receptoren (114). Disse antistoffer er

I DK 175816 B1 I

I

I specifikke for den native konformation i den henseende, at de ikke binder til I

I reduceret, SDS-denatureret protein ved immunblotassays. Det blev påvist, at I

begge antistoffer specifikt præcipiterer sT4 fra 3SS-mærkede kultursupematanter I

H under anvendelse af følgende immunudfældningsprocedure:

I - I

I Kulturer af sT4-producerende celler indeholdende 1 x 106 celler pr. 60 mm dyrk- I

ningsskil blev mærket i 16 timer ved 37°C i 1,5 ml methionin-og cysteinfrit F12- I

medium indeholdende ITS og 170 μCi/ml [35S]-methionin og 30 pCi/ml [35S]cystein I

(1CN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Californien). Klaret medium {100 μΐ) blev for- I

10 tyndet med et lige så stort volumen præcipitationsbuffer (10 mM natriumphosphat, I

I pH 7,5, 100 mM NaCI, 0,1% NP-40®, 0,5% ikke-fedtholdig tørmælk) og inkuberet I

I med 3 μg kanin-IgG i 15 minutter ved 4°C, efterfulgt af 30 μί (pakket volumen) I

I protein A-sepharosekugler (Pharmacia P-L Biochemicals) i 30 minutter ved 4°C. I

I Den i forvejen klarede supernatant blev inkuberet med 5 μg OKT4, OKT4A og OKT8 I

I 15 (gave fra P. Rao, Ortho Pharmaceuticals Corp., Raritan, New Jersey), muse-IgG I

I (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania) eller kanin-a-muse-lgG (Cooper I

I Biomedical) i 30 minutter ved 4°C. OKT4, OKT4A, OKT8, muse-IgG og kanin-α- I

muse-IgG blev præcipiteret ved inkubation med 20 μΙ (pakket volumen) protein A- I

H sepharosekugler i 30 minutter ved 4°C. Efter præcipitation blev kuglerne vasket to I

20 gange med 200 μ I præcipitationsbuffer og én gang med 200 μΙ præcipitationsbuffer I

minus NP-40® og ikke-fedtholdig tørmælk. De vaskede kugler blev kogt i 5 minut- I

I ter i 20 μΙ prøvebuffer (125 mM Tris-HCI, pH 6,8, 20% glycerol, 1,4 M β-mercapto- I

ethanol), og supernatanterne blev analyseret ved elektroforese på en 12,5% SDS- I

I polyacrylamidgel. Lignende resultater blev opnået med OKT4B, OKT4C, OKT4D, I

25 OKT4E, OKT4F og andre Mabs, der er specifikke for T4. Disse resultater antyder, at I

konformationen af sT4 nøjagtigt efterligner T4-recep-torens overfladeomride. I

For at bestemme, om sT4 kan associere med HIV gpl20, og om denne association

kan inhibere bindingen af HIV til T4-ce!ler, blev ca. 5 pg oprenset sT4 absorberet til I

I 30 Sepharose-kugler overtrukket med OKT4 eller kontrolantistof. Kuglerne blev der- I

efter blandet med et lysat af 35S-methionin-mærket HIV. Komplekset af sT4 med I

OKT4 copræcipiterer kun det 120 kD store kappeglycoprotein. Der præcipiteres I

ingen virale proteiner af OKT4-kugler i fravær af sT4 eller i nærværelse af kontrol- I

H supernatanter fra de utransficerede CHO-celler. Endvidere præcipiteres viralt pro-

35 tein ikke, hvis Sepharose-kugler overtrukket med kontrol-museimmunglobulin I

65 DK 175816 B1 (isotype matchet med 0KT4) inkuberes med sT4. Disse undersøgelser indikerer, at det opnåede sT4, der er fri for andre celleoverfladebestanddele, som findes på overfladen af T-lymfocytter, er i stand til specifikt at associere med AIDS-virusets kappeglycoprotein.

5

Cytofluorometri blev udført for at påvise, atT4’s interaktion med gpl20 fra intakt HIV ophæver AIDS-virusets binding til overfladen af T4+-celler. T4+ CEM-celler blev udsat for HIV i nærværelse eller fravær af sT4. Efter viral absorption blev cellerne vasket, udsat for fluoresceinkonjugeret anti-HIV-antistof og analyseret ved flow-10 cytometri (fig. 17) (48). I fravær af sT4 binder HIV effektivt til T4+-CEM-celler.

Hvis HIV præinkuberes med sT4, ophæves virusbindingen til T4+-celler (fig. 17). 10 ng oprenset sT4 er tilstrækkelig til at inhibere bindingen af 100 ng viralt protein.

Hvis kappeglycoproteinet omfatter 5% af det totale virusprotein, er et anslået 5:1 molforhold mellem T4 og gpl20 i stand til fuldstændigt at inhibere HIV-binding til 15 T4+-celler.

sT4's evne til at inhibere infektionen af T4+-celler med HIV blev også undersøgt. Phytohæmagglutinin-stimulerede humane lymfocytter blev udsat for 10 ganges seriefortyndinger af et HIV-inokulum i nærværelse eller fravær af sT4, vasket og 20 udpladet i mikrokultur. Frekvensen af inficerede kulturer blev bestemt med et immunassay 4, 8 og 12 dage efter udsættelse for virus (47). På denne måde defineres den infektiøse virustiter, ID-50, som det reciprokke af den fortynding, der kræves for at inficere 50% af de eksponerede cellekulturer på dag 12. 1 fravær af sT4 er den ID-50, der observeres med det virale inokulum, ca. ΙΟ5. I nærværelse 25 af 8 pg/ml oprenset opløselig T4 er infektiviteten imidlertid formindsket med næsten 4 logaritmer til en ID-50 på 1015 (fig. 18). Denne dramatiske reduktion i ineffektivitet med HIV observeres under hele infektionens forløb. Som en kontrol for uspecifik inhibering eller toksiske virkninger af sT4 blev sT4 sat til kulturer 18 timer efter den indledende udsættelse for virus. Kulturer, der blev udsat for sT4 18 30 timer efter infektion, udviser kun en 1 logaritmes inhibering i ID-50, hvilket formo-entlig skyldes inhibering af virusspredning efter den indledende inokulering. Den 4 logaritmers reduktion i virusinfektivitet, der observeres, når virus præinkuberes med sT4, skyldes sandsynligvis sT4’s specifikke association med gpl20 på virus-verfladen. Disse partikler er derfor ikke længere i stand til at samvirke med T4-35 receptoren på celleoverfladen. 4 logaritmers inhibering blev observeret, når 105-

I DK 175816 B1 I

I 66 I

I infektiøse partikler/ml præinkuberes med 8 »ig/ml sT4. De virale præparationer H

I med 105-infektiøse partikler/ml blev bedømt til at indeholde 109-partikler/ml. Hvis ' I

hver partikel indeholder 1000 kappeglycoproteiner, opnås inhiberingen ved et for-

hold på 100 T4-molekyler/molekyle kappeprotein. H

I 5 I

Tilgængeligheden af relativt store mængder strukturmæssigt intakt sT4 letter H

I undersøgelse af mekanismen for T4-interaktioner med overfladen af både anti- I

I genpræsenterende celler og HIV-virus. Specificiteten af T4+-hjælpercellers inter-

I aktion med antigenpræsenterende celler (B-celler og makrofager) kan i det H

I 10 mindste delvis skyldes associationen af T4 med klasse II MHC-molekyler (105, H

I 106). Tilgængeligheden af betydelige mængder oprenset sT4 muliggør en direkte H

I påvisning af en fysisk association mellem T4 og klasse II MHC-molekyler. H

I sT4’s evne til at binde gpl20 og inhibere virusinfektion in vitro indikerer, at sT4 er I

I 15 et effektivt antiviralt middel til behandling af AIDS-patienter. I

I EKSEMPEL 4 I

I Produktion af opløselige V1V2J4 opløselige T4-fragmenter I

I

Konstruktion af vektorer I

I Konstruktion af psT4BBVIDHFR\ Til dannelse af plasmidet psT4BBVIDHFR blev I

I plasmidet pST4DHFR (beskrevet i eksempel 3) skåret med EcoRI og Xbal, og det

25 mindste fragment, som indeholdt det sT4-kodende område, blev deleteret. Pias- I

I midet sT4sal blev skåret med Xbal og Bbvl, og der blev isoleret et 1120 basepar H

I langt kodende fragment indeholdende sekvensen for opløselig T4 minus lederom- H

I rådet. Dette fragment blev ligeret til det EcoRI/Xbal-skårne pST4DHFR under an- I

I vendelse af en syntetisk linker med en EcoRI-ende, et KpnI-sted og en BbvI-ende.

H 30 Dette fragment er kompatibelt med BbvI-fremspringet på det ovenfor isolerede H

I sT4-fragment. Det resulterende plasmid blev betegnet pST4BBVIDHFR. H

Konstruktion af OMPAST4 : Til dannelse af plasmidet OMPAST4 blev plasmidet I

0MPA.6S skåret med Ncol og Sall, og det mindste fragment indeholdende linker- H

I 35 området blev deleteret. OMPA.GS er et derivat af pASI (Rosenberg et al., Meth. I

DK 175816 B1 67

Enzymol. 101:123 (1983); US 4.578.355), som har en syntetisk sekvens indsat i

NripT-«;fPHpr vp4 Τ-ρπΗρπ pf rΠ-rihn¢nmhinHinncco^^/oncon Den ewnt-ot-ieUo sekvens omfatter OMPA-lederen efterfulgt af en multilinersekvens. Den syntetiske sekvens var i det væsentlige som følger: 5 5' -T ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGC TCT AGA GTC GAC CTA GTT AAC TAG-3' 10

Plasmidet pUCsT4 blev skåret med Ncol og Sall, og det 1149 basepar lange fragment indeholdende SCD-4-sekvens [T4-nukleotiderne 124-1257) blev isoleret.

Dette fragment blev ligeret til det Ncol/Sall-skårne OMPA.GS til dannelse af OMPAST4.

15

Konstruktion af OMPAST4Bbvl\ Til dannelse af plasmidet OMPAST4BbvI blev plasmidet OMPAST4 skåret med Nael og Xbal. Det mindste fragment, der fremkom ved denne skæring og indeholdt det sT4-kodende område, blev deleteret. Plasmidet ST4BBVIDHFR blev skåret med Kpnl, og enderne på det resulterende 3‘-fremspring 20 blev gjort stumpe med T4-DNA-polymerase. Det stumpendede DNA blev derefter skåret med Xbal, og det 1124 basepar lange fragment indeholdende nukleotiderne 145-1257 fra sT4-cDNA‘et blev isoleret. Det isolerede fragment blev ligeret til det Nael/Xbal-skårne OMPAST4-plasmid, hvilket dannede plasmidet OMPAST4BbvI.

25 Konstruktion af pucST4184: Til dannelse af plasmidet pucST4184 blev et EcoRI-Nhel-fragment fra T4-cDNA’et [et 682 bp langt fragment, der koder for amino-syrerne (-23) til (+178)] ligeret til den syntetiske linker sk727/725 (Nhel- og Aval-ender) ved Nhel-stedet. sk727/725 koder for T4-aminosyrerne 179-185. Aval-enden af sk727/725 blev ligeret til et Aval-Xbal-fragment af pUcST4 (der omfatter 30 bp 1198-1257 af det humane cDNA og koder for aminosyrerne 351-369 af T4-receptoren efterfulgt af en TAA-terminationskodon). Denne sekvens, som er flankeret af EcoRI- og Xbal-ender, blev indsat i pUC19 ved EcoRl- og Xbal-enderne i puC19-polylinkeren (sk727/725). sk727/725 er i det væsentlige som følger: 35

I DK 175816 B1 I

I 68 I

I 5'gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac 3' I

I gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5 I

I Konstruktion af pucST4l06: Til dannelse af plasmidet pucST4106 blev et EcoRI- I

I 5 AvaII-fragment (der omfatter bp 1-413 og koder for aminosyrerne (-)25-87) af T4- I

I cDNA’et forbundet med den syntetiske linker sk79l/792 (Avall-Aval-ender) ved I

I Avall-stedet. sk79l/792 koder for T4-aminosyrerne 88-104. Aval-enden af

I sk791/792 blev ligeret til et Aval-Xbal-fragment af pucST4 (der omfatter bp 1198- I

I 1257 af det humane cDNA og koder for aminosyrerne 351-369 af T4-receptoren I

I 10 efterfulgt af en TAA-terminationskodon). Denne sekvens, som er flankeret af I

I EcoRI- og Xbal-ender, blev indsat i pUC19 ved EcoRI- og Xbal-enderne i puC19- I

I polylinkeren. sk791/792 er i det væsentlige som følger: I

I 15 5' gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5'

I Konstruktion af ST4184DHFR: Til dannelse af plasmidet ST4184DHFR blev et EcoRI- I

20 Xbal-fragment fra pucST4184 (der koder for aminosyrerne -25 til 183 fusioneret til I

355-373) ligeret til EcoRI- og Xbal-enderne af psT4DHFR i stedet for det EcoRI- I

I Xbal-fragment, der koder for sT4. I

I Konstruktion af sT4106DHFR: Ti) dannelse af plasmidet ST4106DHFR blev et EcoRI- I

I 25 Xbal-fragment fra pucST4106 (der koder for aminosyrerne -23 til 106 fusioneret til I

I 351-369) ligeret til EcoRI- og Xbal-enderne af psT4DHFR i stedet for det EcoRI- I

I Xbal-fragment, der koder for sT4. I

I Ekspression af pST4184DHFR i kinesisk hamsterovarie-celier (CHO) I

I I

I DXB-ll-celler, en DHFR-deficient CHO-cellelinje (Urlaub et al., supra), blev I

H transficeret ved calciumphosphat-præcipitation med 10-30 fig pST4184DHFR i nær- I

værelse af 10 μς baerer-DNA (NIH-3T3-genomisk DNA) 1 dag efter podning af I

I 60 mm-skåle med 5 x 105 celler. Præcipitater blev fjernet efter 6 timer og erstattet I

35 med F12-medium uden hypoxanthin eller thymidin og indeholdende 10% dialyseret I

69 DK 175816 B1 føtalt bovint serum. Der fremkom kolonier (ca. 100 pr. skål) i løbet af 16 dage. Kolonier fra hver skål blev samlet i pulje, ekspanderet og derefter podet med 3 x 104 celler pr. brønd i kulturplader med 24 brønde. Disse celler blev dyrket i nukleosid-frit medium indeholdende 80 nM methotrexat (mtx) for at selektere for potentiel 5 amplifikation af det transficerede dhfr- og VlV2J4-minigen. Efter 2 uger i 8 nM mtx var aktivt voksende celler klart synlige. Enkelte brønde eller kloner blev analyseret ved konfluens for ekspression af deletionsmutanterne, og de, der blev selekteret til yderligere amplifikation, blev podet i kulturplader med 24 brønde i den ovenfor beskrevne tæthed. Et antal subpopulationer, der udtrykte høje niveauer af V1V2J4, 10 blev dyrket i stigende niveauer mtx for at selektere for yderligere amplifikation af dhfr-transkriptionsenheden og T4184s(VlV2J4)-minigenet.

Under anvendelse af denne metode blev der afledt flere cellelinjer, som udtrykker deletionsmutanterne i mængder på mindst ca. 2 pg/cel-le/24 timer.

15

Konditioneret medium (CM) blev fremstillet serumfrit ud fra adhærerede cellekulturer ekspanderet i 850 cm2 dyrkningskolber under mtx-selektive betingelser. Ved konfluens blev cellerne vasket to gange med phosphatbufret saltopløsning (PBS) uden Mg2+ og Ca2+, og dyrkningsmediet (Hams F12 uden hypoxanthin og thymidin, 20 10% føtalt bovint serum, 100 enheder/ml penicillin og streptomycin og mtx i den selektive koncentration) blev erstattet med det samme medium minus serum og mtx og plus 1 x ITS (insulin, transferrin og selen (Collaborative Research Inc.)).

Efter 24-48 timer blev mediet fjernet og erstattet med selektivt dyrkningsmedium. Serumfrit medium blev derefter igen tilsat i løbet af 3-5 dage, og denne cyklus blev 25 gentaget i længere tid, dvs. i mere end to måneder. CM blev klaret ved centrifugering ved 8000 x g. En proteaseinhibitor, PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid), blev tilsat til 0,5 mM, og CM blev koncentreret ca. 10 gange ved trykmembranfiltrering.

Dette koncentrerede CM blev klaret ved centrifugering ved 2000 x g, og aprotinin, en proteaseinhibitor (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), blev tilsat til en slutkon-30 centration på 5 ng/ml. Prøven blev processeret direkte eller efter opbevaring ved -70°C.

Western blot-analyse: Konditioneret medium fra VlV2J4-producerende CHO-celler blev koncentreret og kørt på en 15% reducerende polyacrylamidgel. Protein blev 35 overført til nitrocellulosepapir og proppet med et polyklonalt antiserum fremstillet

I DK 175816 B1 I

I 70 I

I mod et denatureret E. coll·afledt T4-NSI-fusionsmolekyle. Dette antiserum gen- H

I kender specifikt en VlV2J4-dublet, som vandrer ved ca. 25 kD. Dette svarer til den H

I forventede størrelse af den VlV2J4-kodende sekvens efter lederprocessering. Den H

I fysiske basis for dubletten er ikke kendt. Det er ikke sandsynligt, at den skyldes I

I 5 forskellene i N-forbundet glycosylering, da de to consensussekvenser i T4 for I

I denne glycosylering ikke findes i V1V2J4. I

I Immunepitoper: De monoklonale antistoffer OKT4 og OKT4A, OKT4B, OKT4C, I

I OKT4D, OKT4E og OKT4F genkender specifikt overfladeepitoper på den native, H

I 10 membranbundne T4-receptor (Rao et al., Cell Immunol. 80:310 (1983)). Disse I

I antistoffer er specifikke for den native konformation, idet de ikke binder til redu- I

ceret, SDS-denatureret protein i immunblotassays. Det blev påvist, at begge anti- I

I stoffer specifikt præcipiterer V1V2J4 fra 35S-mærkede kultursupernatanter under H

I anvendelse af følgende immunudfældningsmetode: H

I 15 I

I Kulturer af VlV2J4-producerende celler indeholdende 1 x 106 celler pr. 60 mm H

I dyrkningsskål blev mærket i 16 timer ved 37°C i 1,5 ml methionin- og cysteinfrit I

F12-medium indeholdende ITS og 170 pCi/ml [35S]methionin og 30 pCi/ml I

[35S]cystein (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Californien). Klaret medium H

I 20 (100 μΙ) blev fortyndet med et lige så stort volumen præcipitationsbuffer (10 mM H

I natriumphosphat, pH 7,5, 100 mM NaCI, 0,1% NP-40®, 0,5% ikke-fedtholdig I

I tørmælk) og inkuberet med 3 pg kantn-IgG i 15 minutter ved 4°C efterfulgt af H

I 30 μΙ (pakket volumen) protein A-sepharosekugler (Pharmacia P-L Biochemicals) i I

I 30 minutter ved 4°C. Den i forvejen klarede supernatant blev inkuberet med 5 pg H

I 25 af hvert af de ovenfor nævnte OKT4-antistof-fer, muse-IgG (Cooper Biomedical, Η

I Malvern, Pennsylvania) eller kanin-a-muse-IgG (Cooper Biomedical) i 30 minutter H

I ved 4°C. OKT4-antistof-ferne, muse-IgG og kanin-a-muse-IgG blev præcipiteret Η

I ved inkubation med 20 μΙ (pakket volumen) protein A-sepharosekugler i 30 minut- H

I ter ved 4°C. Efter præcipitation blev kuglerne vasket to gange med 200 μΙ præ- I

I 30 cipitationsbuffer og én gang med 200 μΙ præcipitationsbuffer minus NP-40® og I

I ikke-fedtholdig tørmælk. De vaskede kugler blev kogt i 5 minutter i 20 μΙ H

I prøvebuffer (125 mM Tris-HCI, pH 6,8, 20% glycerol, 1,4 M β-mercaptoethanol), og I

I supernatanterne blev analyseret ved elektroforese på en 12,5% SDS-polyacryl- I

amidgel. Med undtagelse af OKT4 præcipiterede hvert af de monoklonale anti- I

I 35 stoffer specifikt V1V2J4 fra 35S-mærkede kultursupernatanter. I

i 71 DK 175816 B1

Konkurrence om kilV binding: ΟΚΤΊΛ’ε genkende!?? ?f V1V214 inriikprprie. at V1V2J4 vil inhibere bindingen af AIDS-virus til modtagelige celler. CM, der indeholdt eller manglede V1V234, blev anvendt til de indledende assays. HIV blev 5 inkuberet med CM, og virusbinding til T4+-CEM-celleiinjen blev kvantificeret ved inkubation med et FlTC-konjugeret anti-HIV-antistof og FACS-analyse (fluorescein-aktiveret cellesortering) som beskrevet af McDougal et al., supra (1985). CM fra den VlV234-producerende cellelinje inhiberede HIV-binding på en fortyndingsafhængig måde, mens der ikke sås noget respons med CM fra matchede ikke-produ-10 cerende (DXB-11) celler.

Proteinet V134 blev på lignende vis udtrykt i CHO-celler. I disse foreløbige undersøgelser blev proteinet imidlertid tilsyneladende ikke eksporteret til mediet. På basis af andre undersøgelser, der viser, at V1J4, der er produceret i andre rekom-15 binante organismer, binder OKT4A, ser det ud til, at V134, der er udtrykt i pattedyrcellekultur, vil inhibere HIV-binding.

EKSEMPEL 5 20 Fremstilling af antiopløseligt T4-fragment-antistoffer 8 uger gamle Balb/c-mus injiceres intraperitonealt med 50 pg af et oprenset opløseligt T4-fragment ifølge den foreliggende opfindelse (fremstillet som beskrevet ovenfor) i Freund's komplette adjuvans, 1:1 efter volumen. Musene reimmuniseres 25 derefter med månedlige intervaller med det opløselige T4-fragment blandet med Freund's ukomplette adjuvans, og der tages blod fra halevenen. Immunglobulin-fraktioner af sera genereres ved ammoniumsulfatudfældning, og specifikke antiopløseligt T4-fragment-antistoffer oprenses ved affinitetskromatografi under anvendelse af et immobiliseret T4-fragment.

30 35

I DK 175816 B1 I

I 72 I

EKSEMPEL 6 I

Fremstilling af opløseligt T4-fragment~anti-idiotypiske antistoffer I

5 Syngeniske og kongeniske mus injiceres intraperitonealt med 50 ug af et oprenset I

antiopløseligt T4-fragment-antistof ifølge den foreliggende opfindelse (fremstillet I

som beskrevet ovenfor) i Freunds komplette adjuvans og reimmuniseres hver må- I

ned med antiopløseligt T4-fragment-antistof i Freund's ukomplette adjuvans. På I

dag 4, 3 og 2 før fusion injiceres musene intravenøst med 50 pg immuglobulin i I

10 saltopløsning. Splenocytter fusioneres derefter med P3X63 AG8.653 ikke-secerner- I

ende myelomceller ifølge procedurer, der er beskrevet og er kendte inden for det I

område, som opfindelsen tilhører. 2 uger senere screenes hybridomsupematanter I

for bindingsaktivitet mod antiopløseligt T4-fragment-antistoffer ved radioimmuno- I

I assay. Positive kloner analyseres derefter for deres evne til at binde et kappeglyco- I

15 protein fra humant immundefektvirus og AIDS-virus. Ved at anvende "ettrins"- I

- proceduren injiceres musene alternativt intraperitonealt med et opløseligt T4- I

fragment i Freund's komplette adjuvans og immuniseres intravenøst med det I

opløselige T4-fragment i saltopløsning, og musemiltceller fusioneres med myelomer I

som ovenfor. Hybridomsupematanter analyseres derefter direkte for opløseligt T4- I

20 fragment-antiidiotypiske antistoffer. I

I REFERENCER I

1. E.L. Reinherz et al., "Discrete Stages of Hunan Intrathymic I

Differentiation: Analysis of Normal Thymocyte and Leukemic I

Lymphoblasts of T Cell Lineage", Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77: I

1588-1592 (1980). I

2. E.L. Reinherz og S.F. Schlossman, "The Differentiation and I

Function of Human T Lymphocytes", Cell 19: 821-827 (1980). I

3. M.L. Blue et al., "Coexpression of T4 and T8 on Peripheral Blood I

7 73 DK 175816 B1 T Cells Demonstrated by Two-color Fluoroescence Flow Cytometry", J. Immunol. 134: 2281-2286 (1983).

4. E.G. Engleman et al., "Activation of Human T Lymphocyte subsets:

Helper and Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize and Respond to j Distinct Histocompatibility Antigens", J. Immunol. 127: 2124- j 2129 (1981).

5. A.M. Krensky et al., "Long-term Human Cytolytic T-cell Lines Allospecific for HLA-DR6 Antigen Are 0K.T4+” , Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 79: 2365-2369 (1982).

6. S.C. Meuer, S.F. Schlossman og E. Reinherz, "Clonal Analysis of Human Cytotoxic T Lymphocytes T4+ and T8+ Effector T Cells Recognize Products of Different Major Histocompatibility Complex Regions", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4395-4399 (1982).

7. W.E. Biddison et al., "Possible Involvement of the 0KT4 Molecule in T Cell Recognition of Class II HLA Antigens", J. Exp. Med.

156: 1065-1076 (1982).

8. D.R. Wilde et al., "Evidence Implicating L3T4 in Class II MHC Antigen Reactivity Monoclonal Antibody GK 15 (Anti-L3T4) Blocks Class II MHC Antigen-Specific Proliferation, Release of Lympho-kines and Binding by Cloned Murine Helper T Lymphocyte Lines", J. Immunol. 131: 2178-2183 (1983).

9. S.L. Swain, "T Cell Subsets and the Recognition of MHC Class",

Immunol. Rev. 74; 129-142 (1983).

10. Y. Thomas et al., "Functional Analysis of Human T Cell Subsets Defined by Monoclonal Antibodies. IV. Induction of Suppressor Cells Within the 0KT4+ Population", J. Exp. Med. 154: 459-467 (1981).

11. E.G. Engleman et al., "Antibodies to Membrane Structures that Distinguish Suppressor/Cytotoxic and Helper T Lymphocyte Sub-populations Block the Mixed Leukocyte Reaction in Man", J. Exp.

Med. 154: 193-198 (1981).

12. P. Marrack et al., "The Major Histocompatibility Complex-restricted Antigen Receptor on T Cells. II. Role of the L3T4 Product", J. Exp. Med. 158: 1077-1091 (1983).

13. L. Rogozinski et al., "The T4 Surface Antigen is Involved in the Induction of Helper Function", J. Immunol. 132: 735-739 (1984).

14. S.L. Swain, "Significance of Lyt Phenotypes: Lyt2 Antibodies Block Activities of T Cells that Recognize Class I Major Histo-

I DK 175816 B1 I

I I

B compatibility Complex Antigens Regardless of Their Function", B

I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7101-7105 (1981). I

B 15. U. Landegren et al., "Selective Inhibition of Human T Cell I

Cytotoxicity at Levels of Target Recognition of Initiation of fl

Lysis by Monoclonal 0KT3 and Leu-2a Antibodies", J. Exp. Med. fl

I 155: 1579-1584 (1982). I

fl 16. R.M. Zinkemagel og P.C. Doherty, "MHC-restricted Cytotoxic T I

Cells: Studies on the Biological Role of Polymorphic Major fl

Transplantation Antigens Determining T Cell Restriction, Speci- fl fl ficity, Function, and Responsiveness", Adv. Immunol. 27: 52-177 fl

(1979). I

17. J. Kappler et al., "The Major Histocompatibility Complex-Re- H

stricted Antigen Receptor on T Cells in Mouse and Man: Identifi- I

cation of Constant and Variable Peptides", Cell 35: 295-302 H

I (1983). I

18. 0. Acuto et al., "The Human T Cell Receptor: Appearance in I

Ontogeny and Biochemical Relationship of Alpha and Beta Subunits H

on IL-2 Dependent Clones and T Cell Tumors", Cell 34; 717-726 I

I (1983). I

19. P. Kavathas et al., "Isolation of the Gene Coding for the Human fl

T Lymphocyte Antigen Leu-2 (T8) by Gene Transfer and cDNA Sub- I

I traction", Proc. Nad. Acad. Sci. USA 81: 7688-7692 (1984). I

20. D.R. Littman et al., "The Isolation and Sequence of the Gene H

Encoding T8: A Molecule Defining Functional Classes of T Lympho- I

I cytes". Cell 40: 237-246 (1985). I

I 21. V.P. Sukhatma et al., "The T Cell Differentiation Antigen Leu- I

2/T8 is Homologous to Immunoglobulin and T Cell Receptor Vari- fl

able Regions", Cell 40: 591-597 (1985). I

22. S.M. Friedman et al., "OT-CLL: A Human T Cell Chronic Lymphocy- H

tic Leukemia That Produces IL-2 in High Titer", J. Immunol. 128; I

I 935-940 (1982). I

23. D.A. Thurley-Lawon, L. Chess og J.L. Strominger, "Suppression of B

In Vitro Epstein-Barr Infection: A New Role for Adult Human T I

Cells", J. Exp. Med. 146: 495-508 (1977). I

H 24. J.W. Goding, "The Chromic Chloride Method of Coupling Antigens B

to Erythrocytes: Definition of Some Important Parameters", J. B

I Immunol. Methods 10: 61-66 (1976). I

DK 175816 B1 I · 75 i 25. F.L. Gtancuu ug A.J. van uei Eu, “A new Technique Tul che Assay of Infectivity of Hunan Adenovirus DNA", Virology 52: 456-467 (1973).

26. M. Wigler et al., "Biochemical Transfer of Single-Copy Eucaryo-tic Genes Using Total Cellular DNA as Donor", Cell 16: 725-731 (1978).

27. M. Uigler et al., "Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene to Cultured Mouse Cells", Cell 11: 223-232 (1977).

i 28. J.M. Chirgwin et al., "Isolation of Biologically Active Ribo- nucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochemistry 18: 5294-5299 (1979).

29. H. Aviv og P. Leder, "Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic Acid-Cellulose", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412 (1972).

30. T. Huynh, R.A. Young og R.W. Davis, "Construction and Screening cDNA Libraries in gtlO and gtll", DNA Cloning Techniques - A Practical Approach, D.M. Glover, red. (Oxford: 1RL Press), under udgivelse.

31. T. Maniatis et al., "The Isolation of Structural Genes from Libraries of Eucaryotic DNA", Cell 15: 687-701 (1978).

32. M.M. Davis et al., "Cell-Type-Specific cDNA Probes and the Murine I Region: the Localization and Orientation of Ad Alpha",

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2194-2198 (1984).

33. T. Maniatis, E.F. Fritch og J. Sambrook, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) (1982).

34. P.W.J. Rigby et al., "Labelling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity In Vitro by Nick Translation with DNA Polymerase I", J. Mol. Biol. 113: 237-251 (1977).

35. J. Vieira og J. Messing, "The pUC Plasmids, an Ml3mp7-Derived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers", Gene 19: 259-268 (1982).

36. F. Sanger, S. Nicklen og A. Coulson, "DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977).

37. E. Southern, "Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoresis", J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975).

I DK 175816 B1 I

I 76 I

38. G.M. Church og W. Gilbert, "Genomic Sequencing", Proc. Natl. I

I Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984). I

I 39. R.H. Scheller et al., "A Family of Genes that Codes for ELH, a I

Neuropeptide Eliciting a Stereotyped Pattern of Behavior in I

I Aplysia-, Cell 28: 707-719 (1982). I

I 40. K. Zinn, D. DiMaio og T. Maniatis, "Identification of Two Dis- I

tinet Regulatory Regions Adjacent to the Human Beta-Interferon I

I Gene”, Cell 34: 865-879 (1983). I

I 41. C. Terhorst et al., "Further Structural Studies of the Heavy I

Chain of HLA Antigens and Its Similarity to Immunoglobulins", I

I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4002-4006 (1977). I

42. J.A. Hedo, L.C. Harrison og J. Roth, "Binding of Insulin Recep- I

tors to Lectins: Evidence for Common Carbohydrate Determinants I

on Several Membrane Receptors", Biochemistry 20: 3385-3393 I

I (1981). I

H 43. U.K. Laemmli, "Cleavage of Structural Proteins During the Assem- I

I bly of the Head of Bacteriophage T4", Nature 227: 680-685 I

I (1970). I

H 44. R. Mann, R.C. Mulligan og D. Baltimore, "Construction of a I

retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free I

I defective retrovirus", Cell 33: 153-159 (1983). I

45. F. Barre-Sinoussi et al., "Isolation of a T lymphotropic retro- I

virus from a patient at risk for acquired immune deficiency I

I syndrome (AIDS)", Science 220: 868-871 (1983). I

46. J.S. McDougal et al., "Cellular tropism of the human retrovirus I

HTLV-1II/LAV. I. Role of T cell activation and expression of the I

I T4 antigen", J. Immol. 135: 3151-3162 (1985). I

47. J.S. McDougal et al., "Immunoassay for the detection and quanti- I

H tation of infectious human retrovirus, lymphadenopathy-associa- I

I ted virus (LAV)", J. Immunol. fteth. 76: 171-183 (1985). ' I

I 48. J.S. McDougal et al., "Binding of HTLV-I11/LAV to T4+ cells by a I

H complex of the 110K viral protein and the T4 molecule", Science I

I 231: 382-385 (1986). I

49. C.B. Reimer et al., "Standardization of ligand binding assays I

for alpha-fetoprotein", i Immunofluorescence and Related Stai- I

ning Techniques. V. Knapp, K. Holubar og G. Wick, red. (Amster- H

I dam: Elsevier/North Holland Press), s. 189 (1978). I

DK 175816 B1 77 50. M.B. Wilson og P.K. Nakane, "Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies", i Immunofluorescence and Related Staining Techniques, W. Knapp, K. Holubar og G. Wick, red. (Amsterdam: Elsevier/North Holland Press), s. 215 (1978).

51. J. Porath, R. Axen og S. Ermback, "Chemical coupling of proteins to agar”. Nature 215: 1491-1493 (1967).

52. B.J. Poiesz et al., "Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T cell lymphoma", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7415-7419 (1980).

53. P. Clapham, K. Nagy og R.A. Weiss, "Pseudotypes of human T-cell virus types 1 and 2: Neutralization by patients' sera", Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 81: 2886-2889 (1984).

54. A.G. Dalgleish et al., "The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus". Nature 312: 763-766 (1984).

55. M. Popovic et al., "Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and Pre-AIDS", Science 22h: 497-500 (1984).

56. K. Nagy et al., "Human T-cell leukemia virus type 1: induction of syncytia and inhibition by patients* sera", Int. J. Cancer 32: 321-328 (1983).

57. D.M. Neville og H. Glossman, "Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein subunits by discontinuous gel electrophoresis in dodecyl sulfate", Methods Enzymol. 32: 92-102 (1974).

58. A. Helenius et al., "On the entry of Semliki Forest virus into BHK-21 cells", J. Cell. Biol. 84: 404-420 (1980).

59. R.D. Cone og R.C. Mulligan, "High-efficiency gene transfer into mammalian cells: Generation of helper-free recombinant retroviruses with broad mammalian host range", Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81: 6349-6353 (1984).

60. F.W. Alt et al., "Probes for Specific mRNAs by Subtractive Hybridization: Anomalous Expression of Immunoglobulin Genes", i Eucaryotic Gene Regulation, R. Axel, T. Maniatis og C.F. Fox, red. (New York: Academic Press), s. 407-419 (1979).

i

I DK 175816 B1 I

1 78 I

61. M. Kozak, “Comparison of Inielation of Protein Synthesis in

Procaryotes, Eucaryotes and Organelles", Microbiol. Rev. 47: 1-

45 (1983). I

I 62. L. Hood, M. Kronenberg og T. Hunkapiller, "T Cell Antigen Recep- I

I tors and the Immunoglobulin Supergene Family", Cell 40: 225-229 I

I (1985). I

63. S. Tonegawa, "Somatic Generation of Antibody Diversity", Nature I

302: 575-581 (1983). I

I 64. j . Kyte og R.F. Doolittle, "A Simple Method for Displaying the I

H Hydropathic Character of a Protein", J. Mol. Biol. 157: 105-132 I

(1982). I

65 G. von Heijne, "Patterns of Amino Acids Near Signal-Sequence I

I Cleavage Sites", £ur. J. Biochem. 133: 17-21 (1983). I

66. E.A. Rabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological I

Interest" (Washington, D.C.; US Department of Health and Human I

I Services), s. 281 (1983). I

H 67. A.F. Williams et al., "Cell Surface Glycoproteins and the Ori- I

gins of Immunity", i the Proceedings of Che Sigrid Juselius M

Symposium, L.C. Andersson, C.G. Gahmberg og P. Ekblom, red. (New I

H York: Academic Press), under udgivelse (1984). I

68. L.M. Amzel og R.J. Poljak, "Three-Dimensional Structure of I

Immunoglobulins", Ann. Rev. Biochem. 48: 961-997 (1979). I

69. P.Y. Chou og G.D. Fasman, "Empirical Predictions of Protein I

H Conformation", Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276 (1978). I

H 70. P.J. Maddon et al., "The isolation and nucleocide sequence of a I

H cDNA encoding the T cell surface protein T4 : A new member of the I

immunoglobulin gene family", Cell 42: 93-104 (1985). I

H 71. R.A. Adams, A. Flowers og B.J, Davis, "Direct implantation and I

H serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in I

hamsters, SB-2", Can. Res. 28: 1121-1125 (1968). I

72. G.O. Gey, W.D. Coffman og M.T. Kubicek, "Tissue culture studies I

H of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal H

epithelium", Cancer Res. 12: 266-265 (1952). I

73. R.J.V. Pulvertaft, "Cytology of Burkitt's tumor (African Lympho- I

na)", Lancet I: 238-240 (1964). I

H 74. N.J. Dimmock, "Initial stages of infection with animal viruses", I

I J. Cen. Virol. 59: 1-22 (1982). I

79 DK 175816 B1 75. J. White, M. Kielian og A. Helenius, "Membrane fusion proteins ot enveloped animal viruses", ifuarc. κβν. aiophys. ίο: i3i-195 (1983).

76. M. Marsh, "The entry of enveloped viruses into cells by endocy-tosis", Biochem. J. 218: 1-10 (1984).

77. M. Kielian og A. Helenius, "Entry of alphaviruses*, i Che Toga-viridae and Flaviviridae, S. Schlesinger og M.J. Schlesinger, red. (Plenum Publishing Corp.), s. 91-119 (1986).

78. S. Ohkuma og B. Poole, "Fluorescence probe measurements of the intralysosomal pH in living cells and the pertubation of pH by various agents", Proc. Nad. Acad. Sci. USA 75: 3327-3331 (1978).

79. F.R. Maxfield, "Weak bases and ionophore rapidly and reversibly raise the pH of endocytic vesicles in cultured mouse fibroblasts", J. Cell. Biol. 95: 676-681 (1982).

80. A. Helenius, M. Marsh og J. White, "Inhibition of Semliki Forest virus penetration by lysosomotropic weak bases”, J. Gen. Virol.

58: 47-61 (1982).

81. R.T. Johnson og J.C. McArthur, "AIDS and the brain”, TINS 9: 91-94 (1986).

82. P.M. Snow, M. Van de Rijn og C. Terhorst, "Association Between the Human Thymic Differentiation Antigens T6 and T8", Eur. J.

Immunol., under udgivelse (1985).

83. P.M. Snow og C. Terhorst, "The T8 Antigen is a Multimeric Com- 1 plex of Two Distinct Subunits on Human Thymocytes but Consists of Homomultimeric Forms on Peripheral Blood T Lymphocytes", J.

Biol. Chem. 258: 14675-14681 (1983).

84. C. Terhorst et al., "Biochemical Analysis of Human T Lymphocyte Differentiation Antigens T4 and T5", Science 209: 520-521 (1980).

85. W.H. Hildemann, "Immunocompentance and Allogeneic Polymorphism Among Invertebrates", Transplantation 27: 1-3 (1979).

86. V.L. Scofield et al., "Protochordate Allorecognition is Controlled by a MHC-like Gene System", Nature 295: 499-502 (1982).

87. T.L. Lentz et al., "Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor?", Science 215: 182-184 (1982).

88. J.D. Fingeroth et al., "Epstein-Barr virus receptor of human B

I DK 175816 B1 I

I 80 I

lymphocytes is the C3d receptor CR2", Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 81: 4510-4514 (1984). I

89. P.E. Tambourin et al., "The physiopathology of Friend leukemia", I

I Leukemia Res. 3: 117-129 (1979). I

90. A. Oliff et al., "Isolation of transplantable erythroleukemia I

cells from mice infected with helper-independent Friend murine I

I leukemia virus", Blood 58: 244-254 (1981). I

H

91. J.E. Silver og J.M. Fredrickson, "Susceptibility to Friend I

helper virus leukemias in CXB recombinant inbred mice", J. Exp. I

I Med. 158: 1693-1702 (1983). I

92. P.A. Chatis et al., "Role for the 3' end of the genome in deter- I

H mining disease specificity of Friend and Moloney murine leukemia I

I viruses", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4408-4411 (1983). I

93. P.A. Chatis et al., "A 3' end fragment encompassing the tran- I

H scriptional enhancers of nondefective Friend virus confers I

H erythroleukemogénicity on Moloney leukemia virus", J. Virol. 52: I

I 248-254 (1984). I

94. A. Bosze, H.J. Thiesen og P. Charnay, "A transcriptional enhan- I

cer with specificity for erythroid cells is located in the long I

H terminal repeat of the Friend murine leukemia virus", EMBO J. 5: I

I 1615-1623 (1986). I

95. A.N. Barclay et al. , "Immunoglobulin-related structures associa-

ted with vertebrate cell surface”, under udgivelse. I

96. M.O. Dayhoff, W.C. Barker og L.T. Hunt, "Establishing homologies I

H in protein sequences", i Methods in Enzymology. Enzyme Structure I

Part J, C.H.W. Hirs og S.N. Timasheff, red. (New York: Academic I

I Press), s. 524-545 (1983). I

H 97. Y. Yanagi et al., "A human T cell-specific cDNA clone encodes a I

protein having extensive homology to immunoglobulin chains", I

H Nature 308: 145-149 (1984). I

H 98. G.K. Sim et al., "Primary structure of human T-cell receptor I

chain", Nature 312: 771-775 (1984). I

H 99. H. Saito et al., "A third rearranged and expressed gene in a I

clone of cytotoxic T lymphocytes", Nature 312: 36-40 (1984). I

H 100. H. Saito et al., "Complete primary structure of the E chain and I

gene of the mouse major histocompatibility complex", Proc. Natl. I

Acad. Sci. USA 80: 5520-5524 (1983). I

81 DK 175816 B1 101. M. Isobe et al.. "The gene encoding the T-cell surface protein T4 is located on human chromosome 12", Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 83: 4399-4402 (1986).

102. J.M. Roberts og R. Axel, "Gene Amplification and Gene Correction in Somatic Cells", Cell 29: 109-119 (1982).

103. D.S. Pfarr, G. Sathe og M.E. Reff, "A Highly Modular Cloning Vector for the Analysis of Eucaryotic Genes and Gene Regulatory Elements", DNA 4: 461-467 (1985).

104. G. Urlaub og L.A. Chasin, "Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient In Dihydrofolate Reductase Activity", Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220 (1980).

105. D. Gay et al., Nature 328: 626-629 (1987).

106. B.D. Sleckman et al., Nature 328: 351-353 (1987).

107. Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103 (1985).

108. P. Berg et al., Mol. Cell Biol. 3: 246 (1983).

109. Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1: 854 (1981).

110. Frayne et al., Mol. Cell Biol. 4: 2921 (1984).

111. Schumperli et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 257 (1982).

112. Gross et al., Mol. Cell Biol. 5: 1015 (1985).

113. Pfarr et al., DNA 5: 115 (1986).

114. Rao et al., Cell Immunol. 80: 310 (1983).

115. McClure et al., Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation 9: 345 (1982).

116. Urlaub et al.. Cell 33: 405 (1983).

117. Kim et al.. Cell 42: 129 (1987).

118. Wigler et al., PNAS USA 76: 1373 (1979).

119. Copeland et al., Cell 17: 993 (1979).

120. Sattentau et al., Science 234: 1120 (1986).

121. Greenstein et al., Ann. Inst. Pasteur 138: 134 (1987).

122. Gay et al., Ann. Inst. Pasteur 138: 127 (1987).

Claims (14)

1. Terapeutisk middel, I kendetegnet ved, at det er i stand til specifikt at danne et kompleks med et I 5 kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, omfattende et polypeptid, hvis I I aminosyresekvens omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 til ca. I I +185 fusioneret til aminosyresekvensen fra ca. +351 til ca. +369.

2. Terapeutisk middel, I I 10 kendetegnet ved, at det er i stand til specifikt at danne et kompleks med et I I kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, omfattende et polypeptid, hvis I I aminosyresekvens omfatter den i hg. 6 viste aminosyresekvens fra ca.

+3 til ca. I I +106 fusioneret til aminosyresekvensen fra ca. +351 til ca. +369. I I 15 3. Terapeutisk middel, I kendetegnet ved, at det er i stand til specifikt at danne et kompleks med et I I kappeglycoprotein fra humant immundefektvirus, omfattende et polypeptid, hvis I I aminosyresekvens omfatter den i fig. 6 viste aminosyresekvens fra ca. +3 ti! ca. I I +185. I I 20 I

4. Farmaceutisk præparat, H I kendetegnet ved, at det omfatter en virksom mængde af et terapeutisk I I middel ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 samt en farmaceutisk acceptabel I I bærer. I I 25 I

5. Farmaceutisk præparat til anvendelse ved behandling af infektion med et I I humant immundefektvirus, I I kendetegnet ved, at det er er præparat ifølge krav 4. I I 30

6. Ekspressionsvektor, H I kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid som anført i et hvilket som I I helst af kravene 1-3. H I

7. Værtscelle, I I 35 kendetegnet ved, at den omfatter en ekspressionsvektor ifølge krav 6. 83 DK 175816 B1

8. Bakteriel værtscelle ifølge krav 7.

9. Escherichia co//-værtscelle ifølge krav 8. 5

10. Eukaryot værtscelle ifølge krav 7.

11. Pattedyrværtscelle ifølge krav 10. 10

12. Gærværtscelle ifølge krav 10.

13. Insektværtscelle ifølge krav 7.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af et terapeutisk middel ifølge et hvilket som 15 helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at et værtsvektorsystem ifølge krav 6 dyrkes under hensigtsmæssige betingelser, der tillader produktion af det terapeutiske middel, hvorefter det således fremstillede terapeutiske middel isoleres.