HU213019B - Process for producing soluble forms of t-4 protein - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás T4 fehérje oldható formáinak előállítására.

A leírásban számos közleményre hivatkozunk zárójelbe tett arab számokkal. Ezeknek az irodalmi helyeknek a pontos adatai a leírás végén találhatók, közvetlenül az igénypontok előtt. Ezt a megoldást azért kell alkalmaznunk, mert a több helyen szereplő irodalmi adatok részletes feltüntetése minden helyen túlságosan megnövelné az amúgyis terjedelmes leírást.

AT limfociták különböző funkcionális fajtái célsejtek különböző populációinak felületén levő antigént ismernek fel. A segítő (helper) T sejtek nagy mértékű kölcsönhatásban vannak a makrofágokkal és B sejtekkel; a citotoxikus T sejtek antigén-hordozó célsejtek szélesebb tartományával vannak kölcsönhatásban. Ezeket a celluláris felismerő eseményeket valószínűleg mind az effektor, mind a célsejteken levő felületi molekulák fajlagos társulásai közvetítik. A T sejtek felületét egy sor polimorf, valamint nem polimorf fehérje jellemzi, amelyek a T limfociták legnagyobb részénél gátolva vannak. Bár ezeknek a molekuláknak legtöbbje közös az összes T sejteknél, a felületi fehérjék két csoportja következetesen különbözik a T sejtek különböző funkcionális fajtáin, és ezek a fehérjék érdekeltek a T sejt-célsejt kölcsönhatásban.

A felületi molekulák egyik csoportja megkülönbözteti a T limfociták főbb funkcionális alpopulációját: a T4 és T8 felületi glikoproteineket. A timusz kifejlődésének korai szakaszában a T4 és T8 glikoproteinek együtt fejeződnek ki a timociták felületén (1). A perifériás immunrendszerben a T4 és T8 molekulák T sejtek kölcsönösen kizáró alpopulációján fejeződnek ki és csak ritkán fejeződnek ki azonos sejten (2, 3). A T4 molekula akkor fejeződik ki T sejteken, amikor azok a

II. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekulákat hordozó anyagokkal lépnek kölcsönhatásba, míg a T8-at hordozó T sejtek az I. osztályú MHC fehérjéket kifejező anyagokkal lépnek kölcsönhatásba (4, 5, 6, 7, 8, 9). A T limfociták T4 populációja segítő (helper) sejteket tartalmaz, míg a T8 populáció a citotoxikus és elfojtó (szupresszor) sejtek többségét tartalmazza (6, 10). Kevés T4⁺ T sejt működhet azonban citotoxikus vagy szupresszor sejtekként (6, 10), ami arra utal, hogy a T4 vagy T8 kifejeződése szorosabban társul az MHC osztály felismeréséhez, mint az effektor funkcióhoz. Ezeknek a molekuláknak a jelentőségét a T sejt-célsejt kölcsönhatásokban monoklonális antitestekkel végzett vizsgálatokkal lehet demonstrálni. AT4 molekula (vagy az ezzel ekvivalens rágcsáló L3T4 molekula) speciális epitópjai ellen irányuló antitestek gátolják a T sejtek antigén által indukált burjánzását, a limfokin-kibocsátást és segítősejt funkciót (7, 8,11,12, 13). Hasonlóképpen a T8 ellen (vagy az ezzel ekvivalens rágcsáló Lyt 2 ellen) irányuló monoklonális antitestek gátolják a citotoxikus T sejt közvetítette pusztítást (14, 15). Ezek a megfigyelések, azzal a ténnyel együtt, hogy a T4 és T8 nem mutat jelentős polimorfizmust, ahhoz a hipotézishez vezetnek, hogy a T4 és T8 a II. osztályú, illetve I. osztályú molekulák nem-polimorf területeit ismerik fel.

A fehérjék egy másik csoportját, amelyek az eltérő effektor T sejteken - feltételezhetőleg - különbözőek, azok a receptorok képezik, amelyek az MHC molekulák polimorf területeivel kapcsolatban lévő antigént ismerik fel (16, 17, 18). A segítő T limfociták kölcsönhatásai nagy mértékben korlátozódnak a II. osztályú MHC fehérjéket kifejező, antigén-hordozó célsejtekre, míg a citotoxikus és szupresszor T sejtek az I. osztályú MHC molekulákat hordozó célokra korlátozódnak (4, 5, 6, 7, 8, 9). Ezeket a fajlagos kölcsönhatásokat azok a T sejt vagy receptorok közvetíthetik, amelyek az antigént a fajlagos MHC molekulák környezetében ismerik fel (17, 18). Egy T limfocita tehát két független receptorral bírhat, amelyek képesek felismerni az MHC fehérjék mind konstans, mind polimorf determinánsait, és ezek a receptorok lehetnek felelősek a T sejtek funkcionálisan elkülönült populációinak fajlagos célbaj uttatásában.

A szerzett humán immunhiány szindrómát (AIDS) a T4⁺ limfociták kimerülése jellemzi. Ennek következtében a T sejt közvetítette immunitás az AIDS-betegekben legyengül, ami súlyos opportunista fertőzések fellépését és szokatlan szövetfejlődések megjelenését idézi elő. Az AIDS annak a következménye, hogy a T limfociták egy sor egymással szoros rokonságban levő retrovírussal (LAV, HTLV-II1 vagy ARV) fertőződnek, amelyeket jelenleg együttesen immunhiány-vírusnak (HÍV) nevezünk. Ezeknek a fertőzőképessége olyan sejtekre korlátozódik, amelyek felületükön T4 glikoproteint fejeznek ki.

Ennek megfelelően a T4 glikoprotein nem csupán célsejtek felületén levő molekulák, hanem az AIDS-vírus számára is receptorként szolgál. A T4 elleni monoklonális antitestek in vitro blokkolják a T4⁺ sejtek AIDS-vírus fertőzését. Ezen kívül az utóbbi időben végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy amikor T4⁺ T limfociták AIDS-vírusnak vannak kitéve, a vírus 110 kD-os burok-glikoproteinje a gazdasejten levő T4 molekulával asszociálódik. A vírus limfotrópikus jellege tehát azzal magyarázható, hogy T4 receptora korlátozottan fejeződik ki a T limfociták alpopulációiban.

A T4⁺ T limfociták AIDS-ben való kimerülése a celluláris immunválasz károsodását okozza. Ezenkívül az AIDS gyakran a központi idegrendszer rendellenességeivel, leggyakrabban a szubakut enkefalitisz következményeivel társul. Érintett agyakban AIDS-vírus RNS-t és DNS-t azonosítottak, és a vírust ideggyógyászati rendellenességekkel küzdő betegeknek mind az agyi, mind a gerincvelői folyadékából izolálták. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az AIDSvírus az agysejteket fertőzi meg, és közvetlenül felelős az AIDS-betegekben megfigyelt CNS károsodásokért, így az AIDS-vírus lehet neurotróp, valamint limfotróf. Ennek következtében fontos meghatározni, hogy a T4 kifejeződik-e a CNS-ben is, illetve további agy-fajlagos felületi molekulák szolgálhatnak-e receptorként az AIDS-vírus számára.

A T4 és T8 fajlagos kölcsönhatásainak felderítését megkönnyítheti a T4 és T8 gének izolálása, szerkezetük meghatározása, és az a képesség, hogy különböző

HU 213 019 Β celluláris környezetbe vezethetjük be ezeket. Nemrégiben számoltak be egy a T8 molekulát kódoló cDNS izolálásáról és ismertették szekvenciáját (19, 20, 21). A kikövetkeztetett fehérje-szekvencia azt mutatja, hogy a T8 egy membrán-kötött glikoprotein, amely olyan Nterminális tartománnyal rendelkezik, amely az immunglobulin könnyű láncok változó területeivel homológ területet tartalmaz.

A találmány olyan polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítményre vonatkozik, amely fajlagosan komplexet képez a humán immunhiány-vírus burok glikoproteinjével. A találmány egyik kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott körülbelül +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a +185-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát és az ahhoz fuzionált, körülbelül a +351-helyzetű aminosavtól körülbelül a +369-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazza. A találmány egy másik kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott körülbelül +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a +106-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát és az ahhoz fuzionált, körülbelül a +351-helyzetű, aminosavtól körülbelül a +369-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazza. A találmány egy további kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza körülbelül a +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a +185-helyzetűig.

A találmány szerinti készítmény humán immunhiány-vírussal fertőzött betegek kezelésére alkalmazható. A kezelés során a találmány szerinti gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét adagoljuk, amely a találmány szerinti hatóanyagot farmakológiailag elfogadható segédanyagok mellett tartalmazza.

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat.

1. ábra Az OKT4-gyel és OKT8-cal végzett közvetett immunfluoreszcens festés citofluorográfiás görbéi

Sejteket (5xlO⁵) inkubáltunk az OKT4B vagy OKT8 egér monoklonális antitestekkel, mostuk, majd FITC-konjugált kecske anti-egér immunglobulinnal inkubáltuk. A sejteket FACS IV Cell Sorter sejtosztályozóval elemeztük, és VAX 11/780 számítógép segítségével ábrázoltuk a sejtszámot a fluoreszcencia logaritmusának függvényében. A nem transzformált NIH 3T3 sejtek és az L sejtek azonos citofluorográfiás nyomokat adtak. A Fro 2.2 egy leukémiás T sejtvonal T3; T4⁺; T8⁺; TI 1⁺ fenotípussal. Az LTD-4 egy T4⁺ primer L sejt transzformáns, amelyet teljes genomi DNS átvitelét követően kaptunk. A 3A+ egy NIH 3/3 sejtvonal, amely T4-pMV6tk/neo retrovitális kifejező konstrukcióval van transzformálva.

2. ábra T4⁺ és T4~ sejtekből és humán sejtekből származó RNS Northem-folt elemzése pg poli(A⁺) RNS-t vagy 12 pg teljes RNS-t (perifériás T sejtek és timociták) elektroforézisnek vetettünk alá 0,8% agaróz-formaldehid gélen, GeneScreenre itattuk át (New England Nuclear), és egy ³²P-jelzett

0,6 kb-s T4 cDNS inszerttel vizsgáltuk át. AT4⁺ sejtekként LTD-4-et (T4⁺, T8 L sejt transzformánsok), SK7 T sejt hibridómát (T4⁺, T8), Fro 2.2 leukémiát (T4⁺, T8“), T4“ dúsított perifériás T limfocitákat és humán timocitákat alkalmaztunk. A T4 sejtekként nemtranszformált sejteket, a tK7-et (T8⁺ L sejt transzformánsok), HeLa sejteket, humán neuroblasztóma sejteket (IMR), és T8-dúsított perifériás T limfocitákat alkalmaztunk. A humán timocita vonalat négyszer hoszszabb ideig exponáltuk és nagy kontrasztú filmen fényképeztük.

3. ábra pT4B és a T4 gén restrikciós nukleázos térképei, szekvenciaelemzési stratégia és rekombináns vektorok

A. A pT4B cDNS és a T4 gén BamHI restrikciós fragmentumainak felsorakoztatása. A BamHI fragmentumok sorrendjét a T4 génben Southern-folt elemzéssel és genomi klón térképezéssel határoztuk meg. A T4B és a T4 gén 5' végének elrendezését szaggatott vonallal mutatjuk be, míg az árnyékolt terület a pTB4-ben megfelel a kódoló szekvenciának. A jelzett méretek kilobázisban vannak megadva.

B. Szekvenciaelemzési stratégia. A nyilak jelzik az Ml 3-ba történt szubklónozással és a didezoxiterminációs munkamenettel (36) végzett szekvenciaelemzéssel meghatározott szekvencia hosszát.

C. Eukarióta kifejező vektorok. Ezek a konstrukciók két Moloney rágcsáló leukémia-vírus hosszú terminális ismétlődést (LTR) tartalmaznak, amelyek orientációját nyilak jelzik. A pT4B cDNS-t az egyes vektorok EcoRI helyébe szubklónoztuk a jelzett orientációban, (a) A T4~pVcos7 konstrukció, (b) A T4-pMV6tk/neo konstrukció tartalmazza a neomicin foszfotranszferáz gént a HSV timidin kináz promotorhoz fuzionálva.

4. ábra A nem transzformált és T4⁺ L sejtekből, valamint a Τ, B nem-limfoid humán sejtekből való DNS Southern-folt elemzése pg celluláris DNS-t emésztettünk BamHI-gyel, elektroforézisnek vetettük alá 0,8%-os agaróz gélen, átitattuk GeneScreen-re, és nick-transzlatált pT4B cDNS inszerttel vizsgáltuk át. A jelzett méret-markerek kilobázisban vannak megadva. A 20 kb; 6,6 kb; 4 kb; 1,8 kb; és 1 kb méretű hibridizáló csík minden humán DNS-ben feltűnik. T4~, nem-limfoid eredetű DNS-ekként nem-transzformált L-sejtekből, humán fibroblasztokból (GM), humán neuroblasztóma sejtekből (NB) és HeLa sejtekből származó DNS-t alkalmaztunk. A CB, CP58 és CP94 olyan DNS-ek, amelyek EBV-vel transzformált humán B sejt vonalakból származnak. Az LTD—4 egy T4⁺ primer L sejt transzformáns. Az RPMI és HSB2 T4^_ humán T sejt leukémiás vonalak; az E⁺ sejtek és timociták (Tim.) T4⁺ T sejteket tartalmaznak. Az OT-CLL, Jurkat (Jurk.), Fro 2.2, CeM, és Molt4 pedig T4⁺ T sejtek. A gyM4 olyan genomi klón, amely a T4 gén 3' végét átérő szekvenciákat tartalmaz.

HU 213 019 Β

5. ábra A retrovirális kifejező konstrukciókkal transzformált NIH 3T3 sejtekből való T4 glikoprotein immunkicsapása

L-3[³⁵S]-metioninnal jelzett fehérjéket két független NIH 3T3 transzformánsból, perifériás T limfocitákból és nemtranszformált 3T3 sejtekből lencse lektin kromatográfiának vetettünk alá, hogy glikoproteinekre feldúsítsuk. Az egyes mintákból 2,5x10⁶ cpm-et előderítettünk, majd OKT4 monoklonális antitestekkel és A-fehérje Sepharose-zal immunkicsaptuk. A gyöngyöket mostuk, feloldottuk minta pufferral és elektroforézisnek vetettük alá 10%-os SDS-poliakrilamid gélen redukáló (a-d vonalak) és nem redukáló (e és f vonalak) körülmények között, „a” vonal: nem transzformált NIH 3T3 sejtek; „b” vonal: T4C2, egy T4-pVcos7 konstrukcióval transzformált NIH 3T3 sejt; „c” vonal és „e” vonal: 3A⁺, T4~ pMV6tk/neo konstrukcióval transzformált NIH 3T3 sejt; „d” és ,,f’ vonal: perifériás humán T limfociták. A relatív molekulatömegek (M_r) kilodaltonban vannak megadva.

6. ábra A T4 cDNS nukleotid szekvenciája és a T4 fehérje transzlatált szekvenciája

A pT4B cDNS klón 3B. ábrán bemutatott szekvenciaelemzési stratégia szerint kapott nukleotid- és kikövetkeztetett aminosavszekvenciája. Az aminosavszekvencia fölötti számok az aminosavgyökök helyeit jelölik. A jobb oldalon levő számok a nukleotid-helyeket mutatják be. Az összes extracelluláris ciszteint (·) vagy (o) jellel jelöltük. A vezető szekvenciát (L), változó jellegű (V), kapcsoló jellegű (J), transzmembrán (TM) és citoplazmás (CYT) területeket vízszintes nyíllal jelöltük a szekvencia alatt, bár a pontos határok bizonytalanok. Két lehetséges Nkapcsolt glikozilező helyet (Asn-Leu-Thr) szintén megjelöltünk.

7. ábra SP6 átírásból származó RNS in vitro átírása

A teljes hosszúságú T4 cDNS inszertet a pSP65 RNS kifejező vektorba szubklónoztuk (Promega Biotec). A linearizált plazmid DNS-t SP6 polimerázzal (40) átírtuk, és az RNS-t olyan búzacsíra rendszerbe (Bethesda Research Laboratories) transzlatáltuk, amely L-[³⁵S]-metionint tartalmazott. Az in vitro transzlációs terméket elektroforézisnek vetettük alá 10%-os SDS-poliakrilamid gélen (T4 vonal). Kontrollként szarvasmarha hipofízis RNS-t (BP) alkalmaztunk. A relatív molekulatömegeket (M_r) kilodaltonokban adjuk meg.

8. ábra A transzmembrán T4 glikoprőtéin vázlatos diagramja

A T4 egymás utáni (tandem) VJ jellegű tartományt (V,J,-V₄J₄) tartalmaz, továbbá egy hidrofób transzmembrán szegmenst (árnyékolt terület) és egy feltöltött citoplazmás területet (CYT). Két lehetséges N-kapcsolt glikozilező helyet jeleztünk az extracelluláris részben (---). A 2-8. intronok helyeit szintén jeleztük a T4 génben (►).

9. ábra A T4 változó, kapcsoló és transzmembrán területeinek összevetése az immunglobulin gén család tagjaival

A. A T4 változó terület aminosavszekvenciájának összevetése egy J606 egér kappa könnyűlánc immunglobulinnal (66), T8-cal (20), YT35 humán T sejt antigén receptor β-lánccal (97) és HPB-MLTa humán T sejt antigén receptor a-lánccal (98). A könnyűlánc változó terület azonos gyökei meg vannak jelölve (Inv.) az összevetésben. Az összevetést azért végezzük el, hogy maximálisan meghatározzuk az azonosságokat és szerkezeti homológiákat a T4-gyel, ezeket a gyököket bekereteztük. A szekvencia alatti A, B, C, C', D, E, F és G betűjelek azokat a gyököket jelzik, amelyek β-szálakat képeznek (67). A G β-szál folytatódik a J szekvenciában.

Β. AT4 kapcsoló terület aminosavszekvenciájának öszszevetése a T sejt antigén receptor β-lánc konszenzus J szekvenciáival, az immunglobulin lambda és kappa könnyű láncokkal és a humán T sejt receptor α-lánc J szekvenciájával (99).

C. A T4 transzmembrán területek és egy MHC Π osztálybeli β-lánc (100) összevetése. A vélt transzmembrán tartományt (TM) a szekvencia alatt jelöltük.

10. ábra A humán kromoszomális DNS-ben levő T4 gén restrikciós nukleázos térképe A 9 exon helyzetét genomi klón térképezéssel,

Southern-folt elemzéssel és nukleotid szekvenciaelemzéssel határoztuk meg. A vezető szekvenciát (L), változó jellegű (V), kapcsoló jellegű (J), transzmembrán (TM) és citoplazmás (CYT) területeket keretben ábrázoltuk. Megjelöltük az iniciációs konszenzus szekvencia által körülvett metionin kodon (ATG) helyét a vezető exon (L) kezdeténél; a TGA terminációs kodont a második citoplazmás exon (CYT) végénél mutatjuk be. A jelzett méretek kilobázisban vannak megadva.

11. ábra Rekombináns retrovirális kifejező vektorok és transzformált sejtek

A. Rekombináns retrovirális kifejező vektorok. A pMV7 két közvetlenül ismételt Moloney rágcsáló szarkóma vírus hosszú terminális ismétlődést (LTR) tartalmaz a nyilakkal jelölt orientációban. A pMV7 tartalmazza a bakteriális neomicin foszfotranszferáz gént (neo) is a HSV timidin kináz promotorhoz (tk) fuzionálva. A T4-et (T4B) (70) vagy T8-at (T8F1) (20) kódoló teljes hosszúságú cDNS inszertet az EcoRI helybe szubklónozzuk a nyilak által jelölt orientációban, így alakítva ki a T4pMV7-et, illetve T8-mPV7-et. A kódoló szekvenciát árnyékolt területként mutatjuk be. A jelzett méretek kilobázisban vannak megadva.

B. Retrovírus-közvetítette gén-átviteli stratégia.

12. ábra A természetből izolált és transzformált T4' sejtek fertőzésének hatékonysága Sejteket inokuláltunk AIDS-vírus tízszeres sorozat4

HU 213 019 Β hígításaival 18 órán át 37 °C hőmérsékleten, majd mostuk és mikrotenyésztéshez szélesztettük. A fertőzött tenyészetek gyakoriságát enzimmel kapcsolt immunszorbens assay-val (ELISA) határoztuk meg 12 nappal a fertőzés után (46). Az eredményeket a pozitív tenyészetek %-aként a vírushígítás logaritmusa függvényében ábrázoltuk. A fertőző vírus titer (ID-50) azon hígítás reciproka, amelynél a tenyészetek 50%-a a vírusra pozitív (47). A természetből izolált T4⁺ sejtek: a fitohemagglutinin (PHA) által stimulált normál perifériás limfociták (·-·) és a CEM T sejt vonal (o-o). A T4⁺ transzfektált sejtvonalak: a HSB2-T4⁺ T sejtek (A-A) és a Raji-T4⁺ B sejtek (M). A HSB2-T8+ és RajiT8⁺ transzfektált sejtvonalak (O—O) szolgáltak kontrollként ezekben a vizsgálatokban.

13. ábra Szincitiumok képződése T4⁺ HeLa transzformánsokban

A. 2x10? egyrétegű HeLa-T4⁺ transzformánst összekevertünk 2xl0⁴ AIDS-vírus-termelő H9 sejttel, és 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A tenyészetekben 18 óra után a magok 90%-a az egy sejtrétegben (monolayer) szincitiumot képezett.

B. Anti-T4A monoklonális antitestet (1:20 hígításban) adtunk az összekevert tenyészetekhez az oltás időpontjában. A tenyészetekben 18 óra után sejtfúzió teljes hiánya állapítható meg.

A tenyészeteket 160-szoros nagyításban fényképeztük.

14. ábra A T4⁺ transzformált sejtekhez kötődő A1DSvírus citometriás elemzése

A. oszlop. Sejteket (5xl0⁵) inkubáltunk fluoreszceinnel konjugált anti-T4A (-) vagy anti-T8 (---) monoklonális antitestekkel, mostuk és citofluorometriával elemeztük.

B. oszlop. Sejteket (5xlO⁵) inkubáltunk pufferral (---), illetve AIDS-vírussal (-), mostuk, inkubáltuk fluoreszceinnel konjugált anti-AIDS-vírus antitesttel és citofiuorometriával elemezzük.

C. oszlop. Sejteket (5xlO⁵) inkubáltunk pufferral (--), illetve anti-T4A monoklonális antitesttel, majd

AIDS-vírussal (-), illetve anti-T8 monoklonális antitesttel, majd AIDS-vírussal (-·-·-). Mosás után fluoreszceinnel konjugált anti-AIDS-vírus antitestet adtunk hozzá, és a sejteket citofiuorometriával elemeztük.

Az egyes sejtvonalak fluoreszcenciás hisztogramjait (sejtszám a fluoreszcenciás intenzitás függvényében) vízszintesen rendeztük el.

15. ábra Humán és egér agyból, valamint limfoid és mieloid sejtekből származó RNS Northemfolt elemzése

A. Humán RNS minták Northem-folt elemzése: 1 gg poli-(A)⁺) RNS-t Raji (T4“ B sejtvonal), U937 (T4^-3 monocitás sejtvonal) és Jurkat (T4⁺ T sejtvonal) sejtvonalakból és 5 gg poli (A)⁺ RNS-t agykéregből elektroforézisnek vetettünk alá 1%-os agaróz-formaldehid gélen, Hybond-ra (Amersham) itattuk át és átvizsgáltuk ³²P-vel jelzett pT4B T4 cDNS inszerttel (70).

B. Egér RNS minták Northern-folt elemzése: 5 gg poli-(A)⁺ RNS-t 3G3 sejtekből (fibroblaszt sejtvonal), előágyból és hátsóagyból és 20 gg teljes RNS-t timocitákból elektroforézisnek vetettünk alá 1 %-os formaldehid gélen, Hybond-ra vittük át és átvizsgáltuk pL3T4B ³²P-vei jelzett L3T4 cDNS inszerttel.

16. ábra psT4DHFR plazmid-térképe

A psT4DHFR plazmid egy pUC18 származék, amely a pT4B T4 cDNS klón 1-1257. bázispárját tartalmazza; ez kódolja a T4 vezető és extracelluláris szegmensét. Ez az sT4 cDNS vagy SV40 korai promotor és egy TAA terminációs kodont (betoldás) tartalmazó kapcsoló közé van beiktatva, ahol a kapcsolót a szarvasmarha növekedési hormon gén poliadenilező területe követi. Az sT4 kifejező kazetta egy egér hdfr kifejező kazettához van kapcsolva, ez utóbbi tartalmazza a β-globin promotort, egér dhfr kódoló szekvenciát és az SV40 poliadenilező területet.

17. ábra Fluoreszcenciás hisztogram (a sejtszám fluoreszcenciás intenzitás függvényében)

Az sT4 gátolja a HÍV kötését a T4⁺ CEM sejtekhez. A sejteket pufferral (-·-·-·-), sT4-gyel előinkubált HÍV-vei ( ), illetve nem-transzformált DXB-11 sejtekből származó koncentrált kontroll felülúszóval előinkubált HIV-vel (---) inkubáltuk, majd mostuk, fluoreszcens-konjugált anti-HIV antitestnek tettük ki és citofiuorometriával elemeztük. Egy fluoreszcens hisztogramot (fluoreszcenciás intenzitás a sejtszám függvényében) mutatunk be.

18. ábra A HIV-fertőzőképesség gátlása sT4-gyel

Egy HÍV inokulum tízszeres sorozathígítását inkubáltuk indikátor sejtekkel (PHA-val stimulált humán limfociták) 18 órán át. A sejteket azután mostuk és mikrotenyészethez szélesztettük (1Á10⁵ sejt/tenyészet, 10 tenyészet hígításonként). A 4., 8. és 12. napon a felülúszókat HIV-re átvizsgáltuk antigén-befogási vizsgálattal. ID-50 titrálásokat végeztünk olyan tápközegben, amely 8,6 g/ml sT4-et tartalmazott, amelyet a HÍV hígításhoz adtunk 30 perccel a sejtek inokulálása előtt és a tenyésztő tápközegben tartottuk a kísérlet során (), illetve olyan tápközegben, amelyhez a kezdeti 18 órán inokulum után adagoltuk az sT4-et, (o) (késleltetett kontroll), illetve sT4 nélküli tápközegben (□) (kontroll).

A. A 8. napon HIV-re pozitív tenyészetek százaléka a vírus inokulum hígítása függvényében.

B. Az ID-50 függvény (annak a vírushígításnak a reciproka, amelynél a tenyészetek 50%-a pozitív) a 4., 8. és 12. napon.

C. A 8. napon HIV-re pozitív tenyészetek százalékának függvénye az sT4 változó koncentrációinak függvényében, a HÍV 10“³ hígítását alkalmazva.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, amely olyan polipeptidet tartalmaz, amely fajlagosan komplexet képez a humán immunhiány vírus burok glikoproteinjével. A találmány egyik kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott körülbelül +3-hely5

HU 213 019 Β zetű aminosavtól körülbelül a +185-helyzetűig teijedő aminosavszekvenciát és az ahhoz fuzionált, körülbelül a +351-helyzetű aminosavtól körülbelül a +369-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazza. A találmány egy másik kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott körülbelül +3helyzetű aminosavtól körülbelül a +106-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát és az ahhoz fuzionált, körülbelül a +351-helyzetű, aminosavtól körülbelül a +369helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazza. A találmány egy további kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza körülbelül a +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a +185-helyzetűig. A találmány szerinti készítmény farmakológiailag elfogadható segédanyagok mellett olyan találmány szerinti aminosavszekvenciát tartalmaz, amely fajlagosan képes humán immunhiány vírus burok glikoproteinnel komplexet képezni, és vizes oldatban oldható. Farmakológiailag elfogadható segédanyagokként alkalmazhatók például a szakterületen ismert hordozók, így pl. a 0,010,1 mól/literes, előnyösen 0,05 mól/literes foszfát-puffer vagy 0,8%-os konyhasóoldat.

A kezelés során a találmány szerinti gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét adagoljuk, amely elegendő ahhoz, hogy a kezelt személyt fertőző humán immunhiány vírusokat (amelyeket ebben a bejelentésben AIDS-vírusnak is nevezünk) képtelenné tegye T4⁺ sejtek fertőzésére.

Az sT4 fehérje (a T4 receptor extracelluláris tartománya) in vitro biológiai és immunológiai tulajdonságainak jellemzése azt jelzi, hogy ez a fehéije értékes az AIDS megelőzésében és kezelésében. Vizsgálatok során kimutatták, hogy az sT4 fehérje inhibitorként működik a vírus extracelluláris és sejtről-sejtre való elterjedésében. Mivel az sT4 blokkolja a vírus T4⁺ célsejtekhez való kötődését tenyészetben, feltételezhető, hogy az sT4 fertőzött személyeknek való adagolása gátolja a vírus extracelluláris elterjedését. Ennél fogva az sT4 értékes az AIDS kezelésében mind megelőző, mind terápiás szerként.

Megelőző szerként az sT4-et olyan egyéneknek adagoljuk, akik nagy kockázatnak vannak kitéve ezzel a betegséggel kapcsolatban, vagy olyan egyéneknek, akiknél az antitestek jelenléte arra utal, hogy HIV-nek voltak kitéve. Az sT4 hatásos mennyiségének beadagolása a betegség korai stádiumában vagy annak megjelenése előtt meggátolja, hogy a T4⁺ limfociták HIV-vel fertőződjenek. Az sT4 HIV-vel fertőzött személyeknek terápiás szerként való adagolása meggátolja a vírus extracelluláris továbbterjedését.

A vírus elterjedésének egy másik útja lehet a HIVvel fertőzött sejtek és más T4⁺ limfociták közötti fúzió. Ezenkívül a fúzió - legalábbis részben - felelős lehet a T4⁺ limfociták károsodásáért, majd a T4⁺ limfociták kimerüléséért a fertőzött egyénekben. A sejtfúzió függ a vírus burok gén termékeitől, valamint a T4 receptortól, és az 0KT4A vagy hasonló monoklonális antitestek (Mab-k) gátolhatják (120). Az sT4 akadályozza a sejtfúziót, és ennél fogva várható, hogy csökkenti a vírus sejtről-sejtre való terjedését és a T4⁺ limfocita funkció elvesztését.

A T4 receptor monomorf, és így feltételezhető, hogy az sT4 minden olyan vírus univerzális inhibitora, amely felismerj a T4 receptort, tehát minden HIV-é.

Az sT4-et más szerekkel kombinálva is alkalmazhatjuk, pl. olyan szerekkel társítva, amelyek más HÍV fehéijék ellen irányulnak, pl. reverz transzkriptáz, proteáz vagy tat ellen. Egy HÍV elleni hatásos terápiás szemek meg kell akadályoznia a vírus által közvetített fertőzést, valamint a fertőzés sejtről-sejtre való átvitelét is. Az sT4-et más vírusellenes szerekkel, pl. azidotimidinnel (AZT) kombinálva is alkalmazhatjuk.

A találmány szerinti sT4 fehérje használható T4⁺ sejtfunkció inhibitoraként is. Számos vizsgálat azt mutatja, hogy a CD4 receptor (a CD4 a humán T4 receptoroknak és ezek más emlős sejtekben meglevő megfelelőinek általános elnevezése) kritikus szerepet játszik az immun-toleranciában, főleg az autoimmun betegségek patogenezisében és az autoimmun betegségek kifejlődésében, valamint az átültetett szervek gazdaspecifikus kilökődésében. Az sT4-re vonatkozóan különös fontosságúak az anti-CD4 Mab-okkal kapcsolatos megfigyelések. A CD4 receptorral való kapcsolódásuk révén ezek közül a Mab-ok közül néhány enyhíti az autoimmun válaszokat és az átültetett szervek kilökődését. Ilyen hatás például a T sejt funkció in vitro gátlása, pl. az antigén-indukált burjánzás, limfokin-kiválasztás és segítő sejt funkció gátlása bizonyos anti-CD4 Mab-ok révén; a szisztémás lupusz eritematózusz kezelése antiCD4 Mab-ok adagolásával, hogy csökkentsük a rágcsáló lupusz kialakulását; és szervátültetési tanulmányok egerekben, ahol a rágcsáló CD4 receptor ellen irányuló rágcsáló Mab egyetlen dózisa a beültetett idegen szövet befogadását eredményezi.

A Mab CD4-hez való kötődésének molekuláris következménye nem világos. A Mab-ok blokkolhatják a CD4 társulását saját ligandumához, amely - amint ezt adatok igazolják - az MHC II. osztályú antigéneken levő konzervatív epitóp (121, 122). Ugyanezeknek a Mab-oknak legalább egy része gátolja a láthatóan II. osztályútól független úton történő CD4 sejtaktiválást.

Az sT4-ről feltételezhető továbbá, hogy a celluláris T4 versenytársaként gátolja a T sejt kölcsönhatásokat, talán az olyan extracelluláris célmolekulákhoz való kötődés révén, amelyek normálisan a T4 receptor felületi tartományával vannak kölcsönhatásban. Ez a Mabok és az sT4 közötti különbség fontos funkcionális következményekkel bírhat. így pl. míg néhány a T4 ellen irányú Mab a T4 sejtre való választ vált ki, az sT4 olyan sejtekre válthat ki választ, amelyek MHC II. osztályú antigéneket fejeznek ki. Ugyanúgy a T4 affinitása vélt II. osztályú ligandumához, úgy tűnik, egészen alacsony, összehasonlítva a T4 ellen irányuló Mab-ok nagy affinitásaival. így bár a Mab-ok és az sT4 ugyanazon folyamatokban vehetnek részt, eltérő célmolekulákra és különböző célsejtekre hatnak.

Az sT4-et mind megelőző, mind terápiás szerként parenterálisan, előnyösen intravénásán adagoljuk. A szert infúzió vagy injekció formájában, pl. naponta,

HU 213 019 Β hetente vagy havonta adagolhatjuk. Az sT4 mennyiségét úgy választjuk meg, hogy az sT4 hatékony mennyisége legyen jelen a vérkeringésben. Az sT4 adagolásának egy másik módja lehet testen kívüli, dializálószerként történő alkalmazás.

A találmány szerinti sT4 fehérjér alkalmazhatjuk reagensként is olyan természetes, szintetikus vagy rekombináns molekulák azonosítására, amelyek T4⁺ sejt kölcsönhatások terápiás szereként vagy megelőző szereként hatnak.

így pl. az sT4 fehérjéket alkalmazhatjuk pl. ELISAalapú eljárásokkal végzett átvizsgálást műveletekben fehérje-kölcsönhatások vizsgálatához, olyan biokémiailag tiszta, vízoldható reagensként, amelyet más reagensekkel együtt a T4 receptor felületi tartomány kölcsönhatásai kompetítorainak kutatására használunk, így pl. mivel az sT4 kötődik a HÍV env fehérjéhez vagy HÍV env fehérjéket tartalmazó keverékekhez, alkalmazhatjuk a vírus-kötés inhibitorainak kutatására végzett átvizsgáláshoz. In vitro adatok azt mutatják, hogy az sT4 a HÍV env fehérjéket kifejező sejtekhez kötődik, ebből következik, hogy az sT4 szelektív célzó molekulaként is szolgálhat in vivő a HIV-vel fertőzött sejtekhez. Célspecifikus hordozó fehérjeként az sT4 alkalmazható például arra, hogy citotoxikus szereket fertőzött sejtekhez juttassunk.

Ezenkívül vannak adatok arra nézve, hogy a T4 receptor fajlagosan társul az MHC II. osztályú antigénekkel antigént bemutató sejteken, amint ezt a T4⁺ sejtek csoportjának korlátozása igazolja, az sT4-et a II. osztályú antigénekkel kombinálva alkalmazhatjuk T4 limfocita-célsejt kölcsönhatások gátlásának vizsgálatára. Ezeken az sT4 és célmolekulái közötti közvetlen kapcsolási vizsgálaton alapuló példákon kívül komplexebb vizsgálatokat is tervezhetünk, amelyek az sT4 felismerésre adott biokémiai válaszokon alapulnak.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy olyan polipeptidet kódoló kifejező vektor előállítására, amelynek aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott körülbelül +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a +185-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát és az ahhoz fuzionált, körülbelül a +351-helyzetű aminosavtól körülbelül a +369-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazza. A találmány egy másik kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott körülbelül +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a + 106helyzetűig teijedő aminosavszekvenciát és az ahhoz fuzionált, körülbelül a +351-helyzetű aminosavtól körülbelül a +369-helyzetűig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazza. A találmány egy további kiviteli módjában a polipeptid aminosavszekvenciája a 6. ábrán bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza körülbelül a +3-helyzetű aminosavtól körülbelül a +185-helyzetűig.

A találmány tárgya ezenkívül eljárás olyan gazdasejtek előállítására, amelyek a találmány szerinti kifejező vektorokat tartalmazzák. A találmány egyik kiviteli módjában a megfelelő gazdaszervezet baktériumsejt. A találmány egy további kiviteli módjában a baktériumsejt Escherichia coli sejt. A találmány egy még további kiviteli módjában a megfelelő gazdaszervezet valamely eukarióta sejt valamely emlős sejt. A találmány egy még további kiviteli módjában az eukarióta sejt valamely élesztősejt. A találmány egy még további módjában a megfelelő gazdaszervezet valamely rovarsejt.

A találmány tárgya továbbá eljárás a T4 receptor kikövetkeztetett extracelluláris tartományát tartalmazó sT4 előállítására. A T4 cDNS-nek azt a részét használva, amely a T4 receptor vezető és extracelluláris tartományait kódolja, azaz a pre-sT4-et, olyan vektorokat alkotunk, amelyek emlős sejtekben kifejeződve az sT4 túltermelésére képesek. Az sT4 szekvenciája a következő:

Az sT4 kódoló szekvenciáját megkaphatjuk például úgy, hogy az ismert DNS szekvenciát alkalmazva a gént szintetizáljuk, vagy megkaphatjuk a szekvencián alapuló standard klónozó technikákkal, vagy újra izolálással a fehérje kimutatása segítségével, azaz a T4 kifejező sejtvonalakból való cDNS kiónok transzfekciójával és a fehérje ellen irányuló antitestek révén történő azonosításával. Az sT4 kódoló szekvenciát hordozó cDNS kiónokat oligonukleotid hibridizációs vizsgáló minta alkalmazásával azonosítjuk. A vizsgáló mintákat a T4 fehérje ismert szekvenciája alapján tervezzük. Amikor egy sT4 kódoló szekvenciát hordozó kiónt azonosítottunk, a kódoló szekvenciát restrikciós endonukleázok alkalmazásával kimetsszük és klónozó és/vagy kifejező vektorokba inszertáljuk. Egy kifejező vektorban az sT4 kódoló szekvencia működőképesen kapcsolódik a transzkripcióhoz, transzlációhoz és a kódoló szekvencia kidolgozásához feltétlenül szükséges vagy kívánatos szabályozó funkciókhoz.

A szabályozó funkciók például az RNS polimeráz kötéshez és transzkripcióhoz, valamint további funkciókhoz, pl. poliadenilezéshez és a transzkripciós szekvenciák fokozásához szükséges funkciók. A promotor lehet szabályozható pl. úgy, hogy a kifejeződés nem indukálódik mindaddig, amíg a transzformált kiónok transzfekciója és kiválasztása meg nem történik. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható promotorok lehetnek pl. az SV40 korai promotor és a Rous szarkóma vírus, Moloney szarkóma vírus vagy citomegalovírus (CMV) hosszú terminális ismétlődései (LTR-ek).

A transzfekció előtt az sT4 minigént, vagyis a T4 receptor vezető és extracelluláris tartományait kódoló gént, előnyösen egy nagyobb DNS molekulába építjük, amely valamely genetikai szelekciós marker rendszert tartalmaz. A szelekciós marker rendszer bármely olyan gén lehet, amely könnyen kimutatható fenotípusos változást idéz elő egy transzfektált gazdasejtben. Dyen fenotípusos gén lehet pl. gócképződés; gyógyszerrezisztencia, mint pl. a G418 vagy higromicin B elleni rezisztencia génjei; vagy más szelektálható markerek, mint pl. a xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (xgprt), timidin-kináz (TK) és galaktokináz (galK). A gén sokszorozását lehetővé tevő szelekciós markert alkalmazhatjuk kópiaszám növelésére úgy, hogy fokozódik a transzfekció hatékonysága, vagy fokozódik a szóban forgó gén és a szelekciós marker intracelluláris replikációja. Az ilyen markerek, amelyek a gén kópiaszámának növelésére is szolgálnak, például a dihidrofolát-reduktáz (metotrexát rezisztencia), a CAD (N7

HU 213 019 Β foszfono-acetil-L-aszpartát rezisztencia) és az adenozin-dezamináz (2-dezoxikoformicin rezisztencia).

A transzkripciót és transzlációt követően az emlős sejtekben, a vezető szekvencia lehasad, és az érett sT4 kiválasztódik a kondicionált tápközegbe.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módja szerint az sT4 minigént humán H-ras vagy egér dihidrofolát-reduktáz (DHFR) minigénnel összekapcsolva alkalmazzuk a kifejező vektorok megalkotásában.

Az sT4 minigén pl. a humán H-ras-sal vagy egér DHFR-rel kapcsoljuk abból a célból, hogy szelekciós markert és eszközt kapjunk a génkifejezés szelektív sokszorozására az ezen génekkel való kotranszfekció révén. Általánosan használt szelekciós markerek például a DHFR, G418 vagy higromicin markerek, amelyek a szóban forgó gén akár egyetlen kópiájának integrációjára nézve is szelektálnak. DHFR rendszerben a például metotrexáttal (mtx) történő sokszorozás a gén kifejeződésével túltermelést eredményez.

A gén fokozott kifejezésének egy másik eszköze a ras proto-onkogén alkalmazása. A ras géncsaládhoz tartozik a H-ras, K-ras és az N-ras gén. A találmány szerinti megoldásban előnyöen a H-ras gént alkalmazzuk.

További DNS funkciók lehetnek közvetlenül vagy közvetve kapcsolva az sT4 minigénbez, vagy az ilyen funkciók lehetnek nem kötöttek is (lásd pl. US4 399 216).

Gén-termékek kifejeződésének túltermelését emlős sejtekben átmeneti vagy állandó eljárásokkal érhetjük el. Átmeneti túltermelés érhető el víruson alapuló eljárásokkal, így például Vaccinia vírus vektorok alkalmazásával vagy génsokszorozási eljárásokkal, mint pl. SV—40 alapú vektorokkal olyan sejtekben, amelyek elősegítik az SV—40 replikációt. Ezek az eljárások végülis a sejt pusztulásához vezetnek. Az állandó túltermelés többszörös génkópiák kialakításával érhető el, pl. génsokszorozásra nézve történő szelekció vagy ras proto-onkogének alkalmazásával.

Az sT4 fehérje kifejeződésének túltermelése a Hras gén rendszer alkalmazásával történő kotranszfekcióval különböző sejtvonalak felhasználásával érhető el, ezek közül előnyös a NIH-3T3 sejtvonal, amely egy kontakt módon gátolt egér fibroblaszt sejtvonal. További alkalmas sejtvonalak például a normális patkányvese (NRK) (ATCC 1571) sejtvonal és a patkány embrió fibroblaszt 52 (REF-52) sejtvonal (115).

Amikor szelekciós marker rendszerként, pl. a DHFR-t metotrexáttal (DHFR/MTX technika) alkalmazzuk, ahol a gén kópiaszám sokszorozását szelektív sokszorozással érjük el, a kínai hörcsög petefészek sejtvonal (CHO) az előnyös. Különösen DHFR-ben hiányos CHO sejteket alkalmazunk (116). A további alkalmazható sejttípus lehet például bármely emlős sejt, amelyet előzetesen úgy módosítottak, hogy DHFR legyen.

Bizonyos DHFR⁺ sejttípusokat is alkalmazhatunk olyan mutáns DHFR génekkel kombinálva, amelyek kevésbé érzékenyek a metotrexátra, mint a normál DHFR (US-4 399 216). Elvileg DHFR⁺ sejteket alkalmazhatunk normál DHFR génekkel és egy további domináns szelektálható génnel, pl. a G418 rezisztencia génjével (117) kombinálva. A transzfekciót standard módszerekkel végezzük (118, 119). Ilyen módszer például a kalcium-foszfátos kicsapás, a DEAE-dextránnal indukált pinocitózis, elektroporáció és vírustranszfekció.

A transzfekciót követően azt a sejtet, amely az sT4 minigént hordozza, megfelelő tápközegben tenyésztjük olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a szelektálható gén sokszorozását. E célra standard emlős sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, így például az FI2 tápközeg (GIBCO, Grand Island, New York) hipoxantin és timidin nélkül, amely 10% borjúembrió-szérumot tartalmaz. A sejttenyészeteket normál nyomáson 30-45 °C közötti hőmérsékleten tartjuk. Azokat a sejteket, amelyek túlélik a szelekciót és magas szinten fejeznek ki sT4 fehérjét, kiválasztjuk további tenyésztésre. Az ilyen sejteket szelektív körülmények között tenyésztjük, és a terméket, az sT4 fehérjét összegyűjtjük és tisztítjuk.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható sejttenyésztési módszerek pl. a letapadó sejtek alkalmazása vagy a sejtek növesztése szuszpenzióban. Kondicionált tápközeget (CM) szuszpenzíóban nőtt sejtekről vagy szilárd hordozóra letapadt sejtekről gyűjthetünk, vagyis a CM-et gördülő palackokban vagy szilárd hordozón növesztett és szuszpenzióban vagy fluidizált, illetve töltetágyban tenyésztett letapadó sejtekről készítjük. Szuszpendált sejtekről a CM-et kevert tank típusú edényekben készítjük.

A találmány szerinti eljárással előállított sT4 magában foglalja a T4 extracelluláris tartományának származékait. Az ilyen származékok lehetnek addícióból, delécióból vagy szubsztitúcióból eredő származékok, amennyiben a változások nem hatnak károsan a fehérje kondicionált tápközegben történő kiválasztására, valamint a fehérjének a HÍV env fehérjéhez, azaz a gpl20hoz való affinitására. így pl. az N- vagy C-terminálison egy vagy néhány aminosavat lehet hozzáadni vagy elvenni. Vagy egy vagy néhány aminosavat, előnyösen nem több, mint 4 aminosavat inszertálunk, deletálunk vagy helyettesítünk a közbülső aminosavak esetén. Egy másik eljárás szerint egy hibrid fehérjét, azaz egy transzlációs fúziós terméket alkothatunk az sT4 és egy fehérje-hordozó, másik antigén vagy további sT4 molekulák között, hogy egy poli-sT4 molekulát állítsunk elő. Egy még további változat szerint az sT4-et szintetikusan konjugálhatjuk egy hordozó molekulához.

Az sT4 származék egyik kiviteli formáját az alábbi példákban mutatjuk be (3. példa). Az sT4 affinitása a HÍV env-hez kompetitív kötési méréssel mutatható be, ismert affinitással bíró sT4 molekulákat alkalmazva, vagy olyan antitesteket alkalmazva, amelyek felismerik a T4 receptort, ilyen antitestek pl. az OKT4 és OKT4A. A találmány szerinti hasznos sT4 származékot szelektíven kicsapjuk OKT4A-val, kondicionált tápközegből, amint ezt a 3. példában bemutatjuk. Származékokat készíthetünk kifejeződés után kémiai úton vagy kifejeződés előtt genetikailag, a vezető és/vagy extracelluláris tartomány kódoló szekvenciájának manipulálásával.

HU 213 019 Β

A találmány szerinti eljárással előállított sT4-et különböző fehérjetisztítási technikákkal tisztíthatjuk a tenyésztő tápközegből, pl. affinitáskromatográfiával; ioncserélő kromatográfiával; méretkizárásos kromatográfiával; hidrofób kromatográfiával vagy fordított fázisú kromatográfiával.

Az sT4-et tisztíthatjuk affinitáskromatográfiával általános csoport-specifikus adszorbenseket, pl. szénhidrát-kötő vagy festék-affinitási ligandumokat; vagy olyan ligandumokat alkalmazva, amelyek fajlagosan kötődnek sT4-hez, ilyen pl. a HÍV gpl20 fehérje monoklonális antitestje vagy ennek részei.

A tisztítást végezhetjük a következő munkamenet szerint: (1) sejteket növesztünk szérummentes szelektív növesztő tápközegen; (2) a kondicionált tápközeget tisztítjuk; (3) a találmány szerinti sT4-et elkülönítjük más, a kondicionált tápközegben jelen levő fehérjéktől.

Az egyik előnyös eljárásban az sT4-et a szérummentes tenyésztő tápközegből egy sor kromatográfiás lépéssel tisztítjuk, amelyek az sT4 molekula fizikai tulajdonságain alapulnak. Az sT4-et tisztíthatjuk szérumot tartalmazó tenyésztő tápközegből is, hasonló kromatográfiás eljárásokkal.

Az sT4 tisztításának egyik előnyös módja szerint a tenyésztő tápközeget először ioncserélő oszlopon, előnyösen S-Sepharose (szulfo-propil-szefaróz) oszlopon vezetjük keresztül, amely megköti az sT4-et, míg a szennyező fehérjék többsége átáramlik az oszlopon. A fehérje mintát azután lineáris sógradienst alkalmazva eluáljuk. Ezután egy második oszlopot alkalmazunk. Ez az oszlop, előnyösen Q-Sepharose oszlop (kvatemer amino-etil-szefaróz), amely olyan tulajdonságokkal bír, hogy a mintában jelen levő szennyező fehérjék az oszlophoz kötődnek, míg az sT4 nem kötődik és az oszlopon átfolyó pufferból nyerhető ki. Végül gélszűrő oszlopot alkalmazunk, amely eltávolítja a maradék szennyező anyagokat.

Az sT4 tisztításának egy másik módszere szerint sT4 ellen irányuló monoklonális antitesteket alkalmazunk. Az sT4 fehérjét egy lépésben tisztíthatjuk úgy, hogy a derített tenyésztő tápközeget egy olyan affinitás gél hordozón bocsátjuk át, amelyhez az sT4 elleni monoklonális antitestet kötöttünk. Az sT4 az oszlophoz kötődik az antitestkötő helynél, míg minden szennyező fehérje áthalad az oszlopon. Az sT4-et azután olyan körülmények között eluáljuk az oszlopról, amelyek megakadályozzák, hogy az sT4 fehérje in aktiválódj ék.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fentebb leírt terápiás szerek előállítására, amelyek speciális komplex képzésére képesek humán immunhiány vírus burok glikoproteinjével. Az eljárás abban áll, hogy a találmány szerinti gazdaszervezet-vektor rendszert olyan megfelelő körülmények között növesztjük, amelyek lehetővé teszik a terápiás szer termelődését, majd az így termelt terápiás szert kinyerjük.

Ezenkívül az sT4-et alkalmazhatjuk diagnosztikai vizsgálatokhoz T4 fehérjék kimutatására vagy olyan molekulák kimutatására, amelyek ezekkel kölcsönhatásban vannak. így pl. T4 és T4⁺ sejtek és T4 elleni antitestek mennyiségi kimutatása diagnosztikus értékű lehet AIDS-nél.

Ezenkívül az sT4-et alkalmazhatjuk új diagnosztikus reagensek, p. Mab-ok vagy más típusú molekulák kialakítására standard immunológiai vizsgálatokban való alkalmazáshoz, pl. ELISA-hoz, befogó immunvizsgálatokhoz, radioimmun-vizsgálatokhoz. Mivel az sT4 kimutatja az OKT4-et, az OKT4A-t és a T4 receptor legtöbb vagy csaknem mindegyik felületi epitópját, az sT4 különösen hasznos az immundiagnosztikai vizsgálatokban, mivel alkalmazható egy rendszerben levő T4 szint abszolút mennyiségi meghatározására. Jelenleg nincsenek még standardok a T4 receptor mennyiségi meghatározására.

A T4 receptor három különböző kémiai környezetben van jelen: az oxidáló, hidrofil sejtfelületen; a hidrofób membránon; és a redukáló, hidrofil citoplazmában. Ezek a különböző környezetek eleve kizárják, hogy a receptor teljesen natív állapotban izolálható legyen. Az sT4, amely csak az extracelluláris tartományt tartalmazza, oldható fehérjeként szekretálódik a sejt felülúszóba, és úgy tűnik, hogy konformációja utánozza a receptor felületi tartomány felületét. így az sT4 alkalmazható részletes szerkezeti elemzésben, főleg röntgen sugár-krisztallográfiában. Az sT4 három dimenziós szerkezetének egymagában vagy más interaktív molekulákkal való komplex formájában történő meghatározása alapján megtervezhetők az sT4 szelektív antagonistái és agonistái.

A találmány szerinti eljárással végzett, az AIDS-et megelőző, illetve ellene történő immunizálást célzó eljárások, az itt leírt új peptideknek, antitesteknek és DNS molekuláknak azon képességén alapulnak, hogy komplexeket képeznek vagy hibridizálódnak fajlagos molekulákhoz és az AIDS-vírus semlegesítéséhez hatékony immunológiai válaszokat váltanak ki. Ezen molekulák előállítására szolgáló eljárások és az AIDS kezelésére szolgáló eljárások illusztrálására a következő kísérleteket és példákat ismertetjük a korlátozás szándéka nélkül.

Anyagok és módszerek

Sejtek és antitestek

Ficoll-Hypaque sűrűség-gradiens centrifugálással izolált perifériás vér leukocitákat frakcionáltunk birka eritrocita rozetta-pozitív (E⁺) sejtekre. Az E⁺ populáción belül T4⁺ és T8⁺ alpopulációkat izoláltunk T8-hordozó sejtek pozitív szelekciójával anti-T8 antitesttel és affinitással tisztított nyúl anti-egér IgG-vel konjugált humán eritrocitákkal (10). Ezen alpopulációk citofluorometriás elemzése azt demonstrálja, hogy a T4⁺ sejtek 95%-ban T4⁺ és 2%-ban T8⁺ sejtek, míg a T8⁺ sejtek 95%-ban T8⁺ és 2%-ban T4⁺ sejtek.

A Fro 2.2 T sejtvonal (T3“, T4⁺, T8⁺, TI 1⁺) egy nem differenciált akut leukémiában szenvedő felnőtt betegből származik. A Jurkat jellemző: T3“, T4⁺, T8⁺, TI Γ; az RPMI 8402 jellemzői: T3, T4⁺, T8’ és TI 1⁺ (22). ACEM és Molt4 sejtvonalakat az American Type Culture Collection-tól szereztük be. Az összes leukémiás T sejtvonal folytonosan növekszik olyan RPMI 1640 tápközegen, amely 5% borjúembrió-szérumot is tartalmaz. A CB, CP58 és CP94 transzformált B sejtvonalakat már korábban leírták (23).

HU 213 019 Β

Az affinitással tisztított nyúl anti-egér IgG-t króm-kloridos eljárással (24) konjugáltuk humán eritrocitákhoz.

Az L sejtek és NÍH 3T* sejtek kotranszformálása

Rágcsáló L tk’aprt sejteket Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközegen (DME) tartottunk fenn, amely 10% borjúszérummal (Gibco) és 50 gg/ml diamino-purinnal (DAP) volt kiegészítve. L sejteket szélesztettünk 5X10⁴ sejt%10 cm-es lemezsűrűséggel 1 nappal a transzformálás előtt. Kalcium-foszfátos csapadékot készítettünk Graham és van dér Eb eljárásával (25) Wigler és munkatársai módosítása szerint (26), 100 ng pTK-t és 20 gg nagy molekulatömegű T sejt vagy L sejt DNS-t alkalmazva lemezenként. A következő napon az L sejteket szelekciós nyomásnak tettük ki DME-ben, amely 10% borjúszérumot, 15 gg/ml hipoxantint, 1 gg/ml aminopterint és 5 gg/ml timidint tartalmazott [HAT tápközeg (27)]. A HAT-szelekció 12-14. napja után tk⁺ transzformánsokra nézve átvizsgálást végeztünk, rozettaképzési vizsgálatot alkalmazva.

Rágcsáló NIH 3T3 sejteket tartottunk fenn olyan DME tápközegben, amely 10% újszülött borjúszérummal volt kiegészítve (Gibco). NIH 3T3 sejteket szélesztettünk 5Χ10⁴ sejt/10 cm-es lemezsűrűséggel 2 nappal a transzformálás előtt. A sejteken kalcium-foszfátos kicsapást végeztünk 10 gg hordozó DNS-t és/vagy 10 gg T4-pMV6tk/neo-t vagy 10 gg T4-pcos7t és 500 ng pSV2neo-t alkalmazva. 2 nap múlva a sejteket szelekciós nyomásnak tettük ki 10% borjúszérummal és 500 gg/ml G418-cal (Geneticin; Gibco) kiegészített DME-ben. Rozettaképzési vizsgálatot végeztünk a túlélő telepeken egy héttel a szelektív tápközegen végzett növesztés után.

Rozettaképzési vizsgálatok

Foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS) végzett egyszeri öblítés után a lemezeket 2,5 ml 1 mg/ml-es OKT ·4Α monoklonális antitesttel, amely 5% borjúembrió-szérumot tartalmazó PBS-sel 1:500 arányban volt hígítva, inkubáltuk 45 percen át szobahőmérsékleten. A szabad antitesteket a lemezekről három, PBS-sel végzett óvatos öblítéssel eltávolítottuk. 6 milliliter, tisztított nyúl anti-egér IgG antitesttel [2 térfogat%-os törzs-szuszpenzió 1:10 arányban 5% borjúembrió-szérumot tartalmazó PBS-sel hígítva] konjugált humán eritrocitát adtunk hozzá, és a lemezeket szobahőmérsékleten állni hagytuk. 45 perc múlva a szabad eritrocitákat óvatosan leszívattuk és PBS-t adtunk hozzá a rozetta-pozitív telepek megfigyelése előtt.

Citofluorometriás elemzés

Letapadó sejteket gyűjtöttünk össze 0,005 mól/1 EDTA-val (PBS-ben) és egyszer mostuk 1% szarvasmarha-szérum albumint (BSA) és 0,01% nátrium-azidot tartalmazó PBS-sel (sejt-modó, „cytowash”). 0,1 ml-ben 5xl0⁶ sejtet adtunk a csövekhez az OKT4, OKT8, illetve kontroll antitestek megfelelő hígításaival. A sejt-antitest keveréket 45 percig inkubáltuk 4 °C hőmérsékleten, majd kétszer mostuk sejt-mosóban. Fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) konjugált kecske antiegér IgG+A+M-et (Cappel) adtunk a sejtekhez, és az elegyet 1 órán át inkubáltuk 4 °C hőmérsékleten. A sejteket azután háromszor mostuk sejt-mosóban, és újra szuszpendáltuk 0,5 ml 0,01% nátrium-azidot tartalmazó PBS-ben. A sejteket Becton Dickinson FACS IV Cell Sorter sejtosztályozóban elemeztük, az adatokat tároltuk, és VAX 11/780 számítógép (Digital Equipment Co.) segítségével ábrázoltuk a függvényt.

RNS és DNS izolálása

Teljes RNS-t izoláltunk a sejtekből úgy, hogy 4 mól/1 guanidínium-tiocianáttal homogenizálást, majd ultracentrifugálást végeztünk egy 5,7 mól/l-es CsCl párnán (28). Poli(A)⁺ szelekciót végeztünk oligo(dT)cellulóz kromatográfiával (3. típus, Collaborative Research) (29). Nagy molekulatömegű genomi DNS-t készítettünk olyan módon, ahogyan ezt Wigler és munkatársai leírták (26).

cDNS és genomi könyvtárak

Perifériás humán T sejtekből származó poli(A)⁺ RNS-ből kettősszálú cDNS-t szintetizáltunk (20). EcoRI metilázzal és T4 DNS polimerázzal végzett kezelés után a kettősszálú cDNS-t a LgtlO (30) EcoRI helyébe klónoztuk EcoRI kapcsolókat alkalmazva. A Charon 4 humán genom könyvtár beszerezhető dr. Maniatis Tom-tól (Harvard University) (31).

A kivont cDNS vizsgáló próba szintézise ³²P-jelzett cDNS-t szintetizáltunk az LTD-4 primer transzformánsból származó poli(A)⁺ RNS-ből, amint ezt Davis és munkatársai leírták (32). A cDNS nem-transzformált L sejt poli(A)⁺ RNS (Rőt = 3000) fölöslegéhez történő hibridizálása után humán cDNS-ben dúsított egyszálú szekvenciákat izoláltunk hidroxi-apatit kromatográfiával (32). A szűrő-hibridizálás előtt a kivont cDNS vizsgáló mintát sec-butanollal koncentráltuk és TE-vel kiegyensúlyozott Sephadex G-50 oszlopon sómentesítettük.

A cDNS és genomi könyvtárak átvizsgálása

A perifériás humán T sejt könyvtárat E. coli C600/HFL-re, míg a humán genomi könyvtárat E. coli LE392-re szélesztettük. A párhuzamos szűrőkre nézve történő átvizsgálást standard munkamenet (33) szerint végeztük, a hibridizálást 50%-os formamidban és 5xSSC-ben 42 °C hőmérsékleten végeztük. A cDNS könyvtár átvizsgálásakor óxlO⁴ cpm kivont vizsgáló mintát alkalmaztunk 137 mm-es nitrocellulóz szűrőnként. A genomi könyvtárból való szűrőket egy nicktranszlatált (34) cDNS inszerthez hibridizáltuk. A mosásokat 68 °C hőmérsékleten végeztük, utolsó mosás 0,2xSSC-vel történt. Autoradiográfiát végeztünk -70 °C hőmérsékleten erősítő szűrő jelenlétében 1-2 napon át.

DNS szekvenciaelemzés pT4B restrikciós fragmentumokat szubklónoztunk mpl8 és mpl9 Μ13-vektorokba (35). A szekvenciaelemzést a didezoxi-láncterminációs technikával (36) végeztük. A szekvenciaelemzési stratégiát a 3B. ábrán ábrázoltuk.

HU 213 019 Β

Southern- és Northem-folt hibridizációk

Nagy molekulatömegű celluláris DNS-t emésztettünk 5 egységéig DNS restrikciós nukleázzal, a gyártó (Boehringer Mannheim) ajánlásai szerint. A mintákat (10 pg) elektroforézisnek vetettük alá 0,8%-os agaróz gélen. A DNS fragmentumokat GeneScreen-re (New England Nuclear) vittünk át (37), és Church és Gilbert által leírt (38) módon hibridizáltuk.

Az RNS-t 0,8%-os agaróz-formaldehid gélen (39) futtattuk és GeneScreen-re vittük át. Northern hibridizálást hajtottunk végre a gyártó által adott munkamenet szerint. Mind a Southern, mind a Northem-foltokat nick-transzlatált vizsgáló mintákhoz hibridizáltuk.

SP6 RNS szintézise és in vitro transzlációja

T4 cDNS-t a pSP65 (Promega Biotec) EcoRI helyébe szubklónoztunk és HindlII-mal linearizáltuk. A linearizált plazmid DNS (1 pg) átírását SP6 polimerázzal radioaktívan jelzett nukleotidok távollétében ismert módon (40) hajtottuk végre, azzal az eltéréssel, hogy GpppG-t és nem-jelzett CTP-t adtunk a transzkripciós pufferhoz. A reakciókeverék egy tizedét búzacsíra rendszerben transzlatáltuk (Bethesda Research Laboratories), amely L-[³²S]-metionint (Amersham) és 1 pmol/1 S-adenozil-metionint is tartalmaz. Az in vitro transzlációs terméket SDS-poliakrilamid elektroforézisnek vetettük alá redukáló körülmények között, amint később leírjuk.

A sejt jelzése, lektin-kromatográfia és immunkicsapás

Sejteket növesztettünk 12 órán át metionin-mentes DME tápközegben, amely 10% dializált borjúszérumot és 1 mCi L-[³²S]-metionint (Amersham) is tartalmazott, amint ezt korábban leírták (41). A sejteket 10 mmól/1 Triszt (pH 7,4) és 150 mmól/1 NaCl-t tartalmazó oldatban (TBS) szolubilizáltuk, amely 0,5% Nonidet Ρ-40-et (Shell) és 0,2 mmól/1 fenil-metil-szulfonil-fluoridot (Sigma) is tartalmazott. A lizátumokat 1 órán át centrifugáltuk 100 000 g-nél, és a felülúszókat lencse lektin kromatográfiának (Pharmacia) vetettük alá Hedo és munkatársai munkamenete szerint (42). Az eluátumokat egyszer előabszorbeáltattuk kontroll egér aszcitesz és A-fehérjeSepharose (Pharmacia) keverékével 1 órán át 4 ’C hőmérsékleten, majd kétszer önmagában A-fehérje-Sepharose-zal 1 órán át 4 ’C hőmérsékleten. Azután az egyes felülúszókból 2,5x1ο⁴ cpm-et összekevertünk 10 pl monoklonális antitesttel (mintegy 1 mg/ml) és A-fehérjeSepharose-zal, és rázóasztalon inkubáltuk egy éjszakán át 4 ’C hőmérsékleten. A gyöngyöket azután négyszer mostuk hideg TBS-sel, amely 0,5% ΝΡ-40-et és 0,2% SDS-t is tartalmazott, majd elektroforézis minta-pufferban újra szuszpendáltuk.

Gélelektroforézis

Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist Laemmli munkamenete szerint végeztük (43). Az immuncsapadékot és az in vitro transzlációs termékeket 2-merkapto-etanolt tartalmazó vagy nem tartalmazó minta-pufferban feloldottuk, majd 10%-os poliakrilamid-gélre vittük fel. Az autoradiográfiát Kodak XAR-5 filmen végeztük erősítő szűrők (DuPont Chemical Company) jelenlétében.

Kontranszformálás és rozettaképzési vizsgálat

Egér Ψ-2 sejteket (44) tartottunk fenn Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközegen (DME), amely 10% borjúszérummal (CS) (Gibco) van kiegészítve. A Ψ-2-sejteket 5X1O⁵ sejt/10 cm-es lemez koncentrációban szélesztettük 2 nappal a transzformálás előtt. Kalcium-foszfát csapadékokat készítettünk Graham és von dér Eb (35) eljárása szerint, amint ezt Wigler és munkatársai módosították (27). A csapadékokat a sejtekhez adtuk 10 pg hordozó DNS-sel és 10 pg T4-pMV7-tel vagy 10 pg T8-pMV7-tel együtt. 2 nap múlva e sejteket szelekció céljából olyan DME-re vittük át, amely 10% CS-t és 500 pg/ml G418-at (Geneticin; Gibco) is tartalmazott.

A rozettaképzési vizsgálatokat a T4⁺ vagy T8⁺ telepek azonosítására túlélő telepeken végeztük 1 héttel a szelektív tápközegben való növesztés után. Foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldatta, (PBS) végzett egyszeri öblítés után a lemezeket 2,5 ml OKT4A vagy OKT8 tisztított monoklonális antitesttel (1 mg/ml; Ortho) inkubáltuk 45 percen át szobahőmérsékleten, amely 1:500 arányban 5% borjúembrió-szérumot (FCS) tartalmazó PBS-sel volt hígítva. A szabad antitesteket a lemezekről háromszor PBS-sel végzett óvatos öblítéssel távolítottuk el. 6 ml, tisztított nyúl antiegér IgG antitesttel konjugált humán eritrocitát [2 térfogat% törzsoldat; 1:10 arányban PBS/5% FCS-sel hígítva] adtunk hozzá,' és a lemezeket szobahőmérsékleten hagytuk állni. 45 perc múlva a szabad eritrocitákat óvatosan leszívattuk, és a megfigyelés előtt PBS-t adtunk hozzá. A T4⁺ és T8⁺ Ψ-2 telepeket telepizolálással tisztítottuk és áramlásos citometriával, valamint Northern-folt elemzéssel jellemeztük.

Rekombináns retrovírus termelése és fertőzés

Olyan T4⁺ és T8⁺ Ψ-2 kiónokat izoláltunk, amelyek 10⁵ telepképző egység/ml titerrel rendelkező rekombináns retrovírus törzstenyészeteket képeztek. A T4⁺ vagy T8⁺ Ψ-2 kiónok csaknem összefolyó egy-rétegeihez 10 ml, 10% CS-t tartalmazó friss DME-t adtunk, így vírus törzsoldatokat kaptunk. 24 óra múlva a tápközeget eltávolítottuk, és egy 0,45 mikrométeres szűrőn (Millipore) leszűrtük. A fertőzéshez 5X1O⁵ sejtet inkubáltunk 2 ml vírus felülúszóval (vagy hígításával) 8 pg/ml polibren (Aldrich) jelenlétében. 3 óra múlva 8 ml friss tápközeget adtunk hozzá. A fertőzés után 3 nappal a sejteket 500 pg/ml G418-at is tartalmazó DME/10% CS tápközegbe vittük át, 2 hétig növesztettük, szelektáltuk G418^r telepekre, és átvizsgáltuk T4 vagy T8 kifejeződésre, in situ rozettaképzési eljárást vagy áramlási citometriát alkalmazva.

Ψ-2 tenyészet felülúszóval a fenti módon egér ΨAM sejteket fertőztünk. A T4⁺ és T8⁺ letapadó transzformánsokat in situ rozettaképzési eljárással tisztítottuk, majd telepizolálást végeztünk; A T4⁺ és T8⁺ letapadó transzformánsokat in situ rozettaképzési eljárás11

HU 213 019 Β sál tisztítottuk, majd telepizolálást végeztünk; a T4⁺ és T8⁺ nem-letapadó transzformánsokat fluoreszcenciaaktivált sejtosztályozóval (FACS) tisztítottuk. Nem-letapadó humán limfoid sejtvonalakat (HSB2, RPMI-T sejtek; Raji-B sejtek) és letapadó hámsejteket (HeLa) fertőztünk T4⁺ és T8⁺ Ψ-ΑΜ klónokkal végzett együtt-tenyésztéssel [előkezelés 10 gg/ml mitomicin C-vel (Sigma) 2 órán át], majd tisztítást végeztünk.

A sejtvonalakat G418 rezisztenciára szelektáltunk (1,5 mg/ml koncentrációnál), kivéve a HeLa sejteket, amelyek 1 mg/ml-t igényelnek, és a fibroblasztokat, amelyek 0,5 mg/ml-t igényelnek. Az összes, rekombináns amfotróf vírust (4-AM) termelő sejttenyészetet P3 biztonsági körülmények között tartottuk fenn.

AIDS-vírus

A HTLV-III/LAV prototípus LAV törzse beszerezhető J.-C. Chermantól [Institut Pastuer, Párizs (45)]. A vizsgálatokban a saját laboratóriumunkban végzett második-ötödik passzálásból eredő vírus inokulumokat alkalmazhatunk. Az inokulumok a HTLV-III/LAV-val fertőzött, fitohemagglutininnel (PHA) stimulált perifériás limfocitákból való tenyészet felülúszók, amelyeket sorozatcentrifugálással (300 g 7 percig, majd 1500 g 20 percig) nyertünk ki, és amelyeket folyékony nitrogénben tároltunk. A kötési vizsgálatokhoz a vírust tenyészet felülúszókból koncentráltuk, a fentiek szerint kinyertük 90 000 g-nál 90 percen át végzett centrifugálással Renograffin (E. R. Squibb) 15%-os oldatának párnáján [oldószer: 0,01 mól/1 Trisz, 0,15 mól/1 NaCl, 1 mmól/1 EDTA (pH 8,0)].

Anti-HTLV-III/LAV reagensek

A HTLV-III/LAV elleni antitestek magas szintjével rendelkező szérumot egy krónikus limfoadenopátiában szenvedő homoszexuális férfiből nyertük, ennek fajlagosságát immunfluoreszcenciával (46), Western-folt elemzéssel (47) és radio-immunkicsapással (48) már korábban ismertették. Az IgG frakció részleteit jelöltük fluoreszcein izotiocianáttal (FITC; FITC: fehérje arány 10,7 gg/ml), torma peroxidázzal =HPO; VI. típus; Sigma) és agarózzal kapcsoltuk, amint ezt leírták (47, 49, 50, 51). Párhuzamosan IgG konjugátumokat preparáltunk egy nem-immun szérumból.

Reverz transzkriptáz vizsgálat

Magnézium-függő, reverz transzkriptáz (RT) aktivitást mértünk (A)_n (dT) 12-18 [vagy negatív kontrollként (dA)_n (dT)_]2_i8] templát primerjével 7,5 mmól/1 Mg²⁺jelenlétében (52).

Citoplazmás AIDS-vírus immunfloureszcenciás kimutatása

Tenyésztett sejteket (lxlO⁵ 0,1 ml-ben) üveglemezekre (Shandon Cytocentrifuge) centrifugáltunk, 95% etanolt és 5% ecetsavat tartalmazó oldatban -20 °C hőmérsékleten 30 percen át fixáltuk és újra hidráltuk háromszor váltott PBS-sel [PBS: 0,01 mól/1 PO₄, 0,15 mól/1 NaCl (pH 8,0)]. A lemezeken 1:500 hígítású FITC-anti-HTLV-III/LAV-oldatot (19 gg/ml) tartottunk 30 percig szobahőmérsékleten, majd mostuk (három oldószerváltás, 10-10 perces mosások), és 50% glicerint tartalmazó PBS-sel fedtük. A lemezeket felső megvilágítású Leitz Orthoplan mikroszkóppal átvizsgáltuk 630-szoros nagyításnál. Ilyen körülmények között a FITC-anti-HTLV-III/LAV reagens fajlagos a MTLV-III/LAV-ra, míg a nem-fertőzött, PHA-stimulált sejtek, az Epstein-Barr (EB) vírussal fertőzött B sejt vonalak, egy adenovírussal fertőzött sejtvonal, számos T sejtvonal, valamint a HTLV-I-vel és HTLV-Πvel fertőzött sejtvonalak nem festődnek.

AIDS-vírus immunvizsgálat (antigén-befogási vizsgálat)

Ezt a szendvics-immunvizsgálatot már részletesen leírták (47). Röviden ismertetve: tenyészet felülúszókat juttattunk egy mikrotitráló lemez anti-HTLV-III/LAV IgG bevonattal ellátott üregeibe. Miután a lemezeket mostuk, a kötött vírus antigént HPO-anti-HTLVIII/LAV-val mutattuk ki. Ez a vizsgálat, amely legalább annyira érzékeny, mint az RT vizsgálat, negatív eredményt adott számos donorból származó tenyészet felülúszójára, PHA-val stimulált limfocitákból, EB-vírussal fertőzött B sejtvonalakból, számos T sejtvonalból, a K562 mieloid sejtvonalból, valamint azokból a sejtvonalakból, amelyek HTLV-I-et vagy HTLV-II-t tartalmaztak. Az OD⁴⁹⁰ határértéket, amely a pozitív és negatív felülúszók megkülönböztetésére szolgált, az egyes menetekben kontroll felülúszók (nem fertőzött sejttenyészetek) legalább 10 ugyanakkor végzett ismételt meghatározásának átlagából [+2 SD (standard eltérés)] határoztuk meg.

AIDS-vírus fertőzőképességi (ID-50) vizsgálat

A fertőző HTLV-III/LAV titrálására végzett mikrotenyésztéses vizsgálatot már részletesen leírták (47). Röviden ismertetve: PHA-val stimulált limfocitákat vagy sejtvonalakat (2xl0⁶ sejt/ml) inokuláltunk vírus-inokulum tízszeres sorozathígításaival, és 18 órán át inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. A sejteket ezután mostuk és mikrotenyészetekbe vittük át (10-20 tenyészet hígításonként: lxlO⁵ sejt/tenyészet 0,25 ml-es tápközegben). Minden 4. napon 100 mikroliter felülúszót kivettünk és friss tápközeggel helyettesítettük. A felülúszókat azután vírus antigénre vizsgáltuk antigén befogásos technikával, amint ezt fentebb leírtuk. A fertőző vírus titemek (ID-50) azon hígítás reciprokát vesszük, amelynél a tenyészetek 50%-a pozitív a vírusra (47).

VSVpszeudotípus vizsgálat

Vezikuláris sztomatitisz vírust (VSV, Indiana törzs, vad típus) szaporítottunk olyan sejtekben, amelyek a burok pszeudotípushoz szükséges retrovírust termelik, amint ezt korábban leírták (53). Hiperimmun semlegesítő birka anti-VSV szérumot adtunk a kinyert VSVhez, hogy inaktiváljuk a nem-pszeudotípusos Villonokat. A pszeudotípus titerek 10⁴ és 10⁵ PFU/ml között voltak. A vizsgálathoz 2xl0⁵ VSV pszeudotípusokkal fertőzendő sejtet 30 mm átmérőjű szövettenyésztő üregekben tenyésztettünk. A HeLa, NIH 3T3 és L sejtek

HU 213 019 Β természettől fogva letapadok; az összes további sejttípust a szubsztrátum 50 gg/ml poli-L-lizinnel végzett előkezelésével rögzítettük. A vírus 1 órán át végzett adszorpciója után a sejteket mostuk és 10⁶ nyérc CCL64 vagy szarvasmarha MDBK sejteket adtunk az egyes üregekhez. Ezek a sejtek kiváló tarfoltokat képeznek a szekunder VSV-fertőzéshez, de rezisztensek a pszeudotípusos virionok általi fertőzésre. Miután hagytuk a tarfolt indikátor sejteket, hogy ülepedjenek és elszaporodjanak (mintegy 90 perc), felülrétegeztük agar tápközeggel. A VSV tarfoltokat 2 nappal a fertőzés után megszámoltuk. A pszeudotípusos tarfolt képződésének meggátlására a sejteket 30 perccel a pszeudotípusok hozzáadása előtt anti-T4A monoklonális antitestek (1:20), anti-HTLV-III szérum (1:10) vagy antiHTLV-I szérum (1:10) adagolásával előkezeltük, amint ezt már korábban leírták (54).

Szincítium indukciós vizsgálat

2X1O⁵ sejtet együtt tenyésztettünk HTLV-III-mal fertőzött és azt termelő (55) 2xl0⁴ H9 sejttel 10 mm átmérőjű üregekben. A tenyészeteket 37 ’C hőmérsékleten inkubáltuk, és 18 óra múlva megvizsgáltuk szincítium-képződésre, amint ezt már korábban leírták (54, 56). Azokat a sejteket, amelyek öt vagy több szincítiumot tartalmaztak, pozitívnak tekintettük. A szincítium gátlást olyan módon mértük, hogy anti-T4A monoklonális antitestet (1:20) adtunk a kevert tenyészetekhez az oltás időpontjában.

Citofluorometriás elemzés és AIDS-vírus kötés Az eljárást már részletesen leírták (46), Röviden ismertetve: a sejtfelületi T4 vagy T8 kifejezést közvetlen immunfluoreszcenciával határoztuk meg fluoreszceinnel konjugált anti-T4A vagy anti-T8 monoklonális antitestekkel (OKT4A, OKT8). A hígító/mosó puffer összetétele: 0,01 mól/1 PO₄, 0,15 mól/1 NaCl (pH 7,4), amely 0,1% szarvasmarha-szérum albumint, 2 térfogat% AB⁺ humán szérumot és 0,01% nátrium-azidot tartalmaz. Az összes reagenst előtitráltuk az optimális (telítő) kötéshez. Sejteket (5xlO⁵) inkubáltunk monoklonális antitest 25 μΐ-es hígításaiban 30 percig 4 ’C hőmérsékleten. A sejteket centrifugálással mostuk (300 g 7 percig), újraszuszpendáltuk 0,5 ml 1% paraformaldehidet tartalmazó fiziológiás konyhasóoldatban, és elemeztük fluoreszcenciával aktivált sejtosztályozóval (FACS IV, Becton-Dickinson). A HTLVΙΠ/LAV kötődéshez 5xl0⁵ sejtet inkubáltunk HTLVΙΠ/LAV-val (500 ng 10 μΐ-ben) 30 percen át 37 ’C hőmérsékleten. A mosott sejteket újraszuszpendáltuk 25 μΐ, fluoreszceinnel konjugált anti-HTLV-III/LAVval 30 percen át 4 °C hőmérsékleten. A sejteket mostuk, újraszuszpendáltuk 1%-os paraformaldehidben, és FACS-sel elemeztük a fentebb leírtak szerint. A HTLV-III/LAV kötés gátlásához a sejteket előinkubáltuk anti-T4A-val vagy anti-T8-cal (20 ng 20 μΐ-ben) 30 percen át 4 ’C hőmérsékleten, ezt követi HTLVIII/LAV hozzáadása (500 ng 10 μΐ-ben) 30 percig 37 ’C hőmérsékleten. A sejteket mostuk, fluoreszceinnel konjugált anti-HTLV-in/LAV-val inkubáltuk, újból mostuk, újraszuszpendáltuk paraformaldehidben, és

FACS-sel elemeztük, amint fentebb leírtuk.

Sejtfelületi radiojelzés jóddal, immunkicsapás és gélelektroforézis

T4⁺ NIH 3T3 transzformánsokat felületen radioaktív jóddal jeleztünk laktoperoxidázos technikával (18) az alábbiak szerint: 4xl0⁷ sejtet szuszpendáltunk 1 ml PBSben, amely 0,5 mmól/1 EDTA-t, 2 mCi Na¹²⁵I-t és 20 g laktoperoxidázt tartalmazott. A 0; 1.; 5.; 10. és 15. percben 10 μgl 0,03%-os H₂O₂-t adtunk hozzá. A reakciót 23 ’C hőmérsékleten végeztük és a 20. percben állítottuk le 2 cenrifugálással 50-szeres térfogat hideg PBS-ben, amely 10 mmól/1 NaI-t is tartalmazott. Ajelzett sejteket 4 csőbe osztottuk el és inkubáltuk, amint jeleztük, HTLVIII/LAV-val (2 μg 20 μΐ-ben) 30 percen át 37 ’C hőmérsékleten. Az ezt követő mosásokat és műveleteket 0-4 ’C közötti hőmérsékleten végeztük. A mosott sejteket lizáltuk 1 ml detergens lizáló puffer hozzáadásával [LB, 0,02 mól/1 Trisz, 0,12 mól/1 NaCal (pH 8,0), amely 0,2 mmól/1 fenil-etil-szulfonil-fluoridot, 5 μg/Inl aprotinint, 0,2 mmól/1 EGTA-t, 0,2 mmól/1 NaF-et, 0,2% nátrium-dezoxikolátot és 0,5 térfogat% Nonidet Ρ-40-et is tartalmazott]. A csöveket 15 percen át jégen tartottuk, és a magokat 3000 g-nál 20 percen keresztül végzett centrifugálással eltávolítottuk.

Az abszorpcióhoz humán anti-HTLV-III/LAV IgG, humán nemimmun IgG, anti-T4A, és anti-T8 antitestek Sepharose konjugátumait készítettük el, amint ezt már leírták (48). A lizátumokat előabszorbeáltattuk 200 μΐ Sepharose-nem-immun humán IgG konjugátumon 1,5 órán át forgatás mellett, majd immun-kicsapást végeztünk 20 μΐ Sepharose-konjugátummal (amint jeleztük) 3 órán át forgatás mellett. A Sepharose adszorbenseket háromszor mostuk: egyszer LB-vel; egyszer 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó LB-vel; és egyszer 0,1% nátriumdodecil-szulfátot tartalmazó LB-vel (SDS). Az adszorbeált anyagot 65 ’C hőmérsékleten eluáltuk 30 percen át 20 μΐ minta pufferral [0,01 mól/1 Trisz (pH 8,0), amely 2% SDS-t, 5 térfogat% 2-merkapto-etanolt, 25 μg brómfenolkéket és 10 térfogat% glicerint tartalmazott], Elektroforézist végeztünk 3,3-20% gradiens poliakril-amid gélen 3% felvivő gélből (57), és autoradiogramot fejlesztünk ki Kodak XAR-5 filmmel.

Vírus-gátlási vizsgálat

2X10⁵ T4⁺ JM T sejteket fertőztünk AIDS-vírussal a 0. percben. Ammónium-klorid (20 mmól/1) vagy amantadin (20 mmól/1) inhibitorokat adtunk hozzá különböző időpontokban a vírusfertőzés folyamán (0. perc; 30. perc és 60. perc). 6 óra múlva a sejteket mostuk és friss tápközegbe (RPMI/10% FCS) helyeztük. Az inhibitorok hatását az AIDS-vírusra 5 nappal a fertőzés után határoztuk meg. A fertőzött sejtek arányát a vírus antigént kifejező tenyészetekben immunfluoreszcenciás mikroszkópiával határoztuk meg, amint ezt korábban már leírták (58).

RNS izolálás és Northem-folt hibridizálás

Teljes RNS-t izoláltunk a sejtekből 4 mól/1 guanidínium-tiocianátban végzett homogenizálással, ezt ultracent13

HU 213 019 Β rifugálás követte 5,7 mól/l-es CsCl párnán keresztül (28). Poli(A)⁺ szelekciót végeztünk oligo(dT)-cellulóz kromatográfiával (3. típus, Collaborative Research) (29).

Az RNS-t elektroforézisnek vetettük alá 1%-os agarózformaldehid gélen (39) és Hybond-ra (Amersham) vittük át. Northem-folt hibridizálást végeztünk a gyártó által megadott munkamenet szerint. Vizsgáló mintákat nick-transzlációnak vetettünk alá 0,5l,10⁹cpm/pg fajlagos aktivitásra ³²P-vel jelzett dezoxinukleotid-trifoszfátokkal (59).

EREDMÉNYEK

T4 cDNS izolálása

A T4 cDNS izolálásához először olyan L sejt transzformánsokat alkotunk, amelyek felületükön T4et fejeznek ki. Egy T4⁺-transzformált fibroblaszt mRNS-éből szintetizált cDNS-t szubsztraktív hibridizálással feldúsítottuk és ezt alkalmaztuk vizsgáló mintaként valamely T4-et kódoló cDNS izolálására perifériás T limfociták mRNS-éből készült cDNS könyvtárból. A T4⁺ cDNS kiónok azonosságát Northern- és Southern-folt elemzésekkel határoztuk meg, és végül ezeknek a kiónoknak azzal a képességével, hogy a T4⁺ fenotípust átadják a befogadó sejteknek. Hasonló technikákat már alkalmaztak korábban a T8 fehérjét kódoló gén izolálására (20).

Timidin-kinázban (tk) hiányos egér L sejteket kotranszformáltunk a HUT-102 T sejt leukémiás sejtvonalból származó genomi DNS-sel és a tk-tartalmú pTK plazmiddal (25, 26). AT sejt felületi fehérjéket kifejező tk⁺ L sejt transzformánsokat in situ rozettaképzési vizsgálattal azonosítottuk. A tk⁺ telepeket T4 ellen irányuló egér monoklonális antitesteknek tettük ki, majd nyúl anti-egér immunglobulinnal társult vörösvérsejtekkel inkubáltuk. A T4⁺ transzformánsok szembetűnően vörösek a vörösvérsejtekkel való fajlagos társulásuk következtében. Ezen a módon egy primer transzformánst nyertünk, az LTD-4-et. A T4 molekula kifejeződését ennek a kiónnak a révén függetlenül is igazoltuk citofluorometriás elemzéssel (1. ábra).

Az LTD^t T4⁺ transzformáns mRNS populációja a nem transzformált L sejt mRNS populációjától csak az újonnan transzformált gének kifejezésében különbözik. Ezeket a szekvenciákat úgy dúsítottuk fel, hogy a T4⁺ transzformáns poli(A)⁺ RNS-éből készített, nagy mértékben radioaktív cDNS-t összeforrasztottuk nem transzformált L sejtből való RNS nagy fölöslegével (32, 60). Hidroxi-apatit kromatográfiával cDNS-t izoláltunk, amely nem képes hibridizálni még nagy Rőt értékeknél sem, és a ygtlO klónozó vektorban megalkotott humán perifériás T sejt cDNS könyvtár átvizsgálására alkalmaztuk. Négy gyengén hibridizáló tarfoltot azonosítottunk, tarfolt-tisztításnak vetettünk alá és elemeztük T4 szekvenciák jelenlétére.

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon ezeknek a kiónoknak bármelyike kódol-e T4-et, először Northem-folt elemzést hajtottunk végre T4⁺ és T4 perifériás T sejtekből, leukémiákból, timocitákból, L sejt transzformánsokból és nem-limfoid sejtekből való RNS-sel (2. ábra). A négy klón egyike hibridizált egy olyan RNS-hez, amely csak T4⁺ sejtekben van jelen. Ez a klón egy 3 kb-s RNS-t mutatott ki az LTD-4 T4⁺ transzformánsban, amely jelen van T4⁺ perifériás limfociták populációjában, egy sor T4⁺ leukémiás sejtvonalban és timocitákban is. Hibridizálás nem volt megfigyelhető nem-transzformált fibroblasztokból, T4 perifériás limfocitákból, HeLa sejtekből vagy humán neuroblasztóma sejtekből származó RNS-sel.

Az ezzel a klónnal kimutatott RNS kifejeződéseknek mintája egybevág azzal a lehetőséggel, hogy ez T4-et kódol. Ez a cDNS azonban csak 0,6 kb hosszúságú, mégis hibridizált egy 3 kb-s mRNS-hez. Ennek megfelelően a humán perifériás T sejt cDNS könyvtárat átvizsgáltuk, és egy olyan kiónt (pT4B) kaptunk, amely egy 3 kb-s inszertet tartalmazott, ez méretben közel áll az érett hírvivő RNS méretéhez. Ennek a kiónnak a restrikciós térképét a 3A. és 3B. ábrán mutatjuk be.

Genomi folt elemzés

Ezután Southern-folt kísérleteket (37) hajtottunk végre annak demonstrálására, hogy az izolált cDNS klón hibridizál a T4⁺ transzformánsból származó DNSsel, valamint humán DNS-sel, de nem hibridizál nemtranszformált egér L sejt DNS-sel (4. ábra). Különböző humán sejtekből származó genomi DNS-ekben öt hibridizáló fragmentum készletet találtunk a BamHI enzimmel végzett hasítás után. Amint várható volt, a T4 szekvenciákat ki tudtuk mutatni az LTD^4 transzformánsban, de nem tudtuk kimutatni a nem-transzformált L sejt DNS-ben. A gén 3' végéhez legközelebbi BamHI fragmentum (6,6 kb) nincs jelen az LTD-4-ben, valószínűleg az integráció következtében. Ezenkívül a limfoid és nem-limfoid sejtekből való DNS-eket közelítőleg összehasonlítva nem tűnik kijelentős átrendeződés. A hibridizáló fragmentumok molekulatömegének öszszege 33 kb, ami azt mutatja, hogy a T4 gén meglehetősen nagy. Az ezen a területen átérő genomi kiónok komplett sorozatát állítottuk elő (lásd a későbbiekben), és a BamHI fragmentumokat ezeknek a kiónoknak a restrikciós elemzésével sorba állítottuk (3A. ábra), így igazoltuk, hogy a gén nagy, és jelentős hosszúságú intronokat kell tartalmaznia.

T4 cDNS kifejezése transzformált egérfibroblasztokban

További bizonyítékokat adhat arra, hogy az izolált cDNS T4-et kódol, ha ez a klón fibroblasztokat alakít át T4⁺ fenotípusúvá transzformálás után. AT4 gén a kromoszomális DNS-ben nagy és számos genomi klónt ér át. Ennek megfelelően a cDNS klónt két retrovírus-eredetű kifejező vektorba, a pVcos7-be és pMVS kt/neo-ba vezettük be, amelyek tartalmazzák a Moloney rágcsáló leukémia vírus hosszú terminális ismétlődéseit (LTR) egy egyedi EcoRI klónozó hellyel szegélyezve (3C. ábra). Az 5'-LTR elősegíti az átírást a klónozó helyen keresztül és a 3'-LTR olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek a hasításhoz és poliadenilezéshez szükségesek. A pMV6tk/neo vektor tartalmazza a tk promotort is a neomicin foszfotranszferáz gén kódoló területéhez fuzionálva. ApVcos714

HU 213 019 Β et alkalmazó konstrukciót transzformálni kell egy nem kapcsolt szelektálható markerrel, míg a pMV6tk/neo hordozza a neomicin rezisztencia markert, amely lehetővé teszi a kapcsolt kotranszformálást. A transzformáció után kapott NIH 3T3 neo⁺ telepeket kiválogattuk azon képességük alapján, hogy növekednek a G418 neomicin-analógot tartalmazó tápközegben, és átvizsgáltuk a rozettaképzési munkamenetet alkalmazva, hogy kimutassuk a T4 kifejeződését a sejt felszínén. A pVcos7-tel kapott G418 telepek mintegy 75%-a volt pozitív T4-re ebben a vizsgálatban. A rozetta-pozitív telepeket citofluorometriával tovább elemeztük annak bizonyítására, hogy a T4 kifejeződik a transzformált sejt felszínén (1. ábra).

Metabolikus fehérje jelzési kísérleteket hajtottunk végre, amelyek azt demonstrálták, hogy a T4⁺ transzformáit fibroblaszt és a T lifocita azonos molekulatömegű T4 fehérjét fejez ki. Nem-transzformált NIH 3T3 sejteket, T4⁺ transzformánsokat és T limfocitákat jeleztünk 12 órán át L-[³⁵S]-metionin jelenlétében (41). A sejteket detergenssel szolubilizáltuk, és a lizátumot lencse lektin oszlopokon engedtük át, hogy a glikoproteineket feldúsítsuk (42). A kötött glikoprotein frakciót eluáltuk és immun-kicsaptuk T4 ellen irányuló monoklonális antitestekkel (5. ábra). Redukáló körülmények között egy 55 kD relatív molekulatömegnél vándorló glikoproteint mutattunk ki a T limfocitákból és két független T4⁺ transzformánsból való extraktumokból. Ez a fehérje nem észlelhető a kontroll 3T3 fibroblasztokban. Nemredukáló körülmények között egy 51 kD-s glikoproteint immun-kicsaptunk anti-T4-gyel T sejtekben és a transzformált fibroblasztokban.

Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a transzformánsok egy olyan 55 kD-s glikoproteint fejeznek ki, amely méretben azonos egy a T limfociták felületén kifejeződő és anti-T4-gyel immun-kicsapható glikoproteinnel. így az izolált cDNS-t alkalmazó Northern és Southern elemzés, ennek a cDNS-nek azzal a képességével együtt, hogy T4⁺ fenotípust visz át egér fibroblasztokra, azt jelzi, hogy a T4 T sejt felületi fehérje teljes kódoló szekvenciáját klónoztuk.

A T4 cDNS nukleotid szekvenciája és a kikövetkeztetett fehérje-szekvencia

A T4 kódoló terület komplett nukleotid szekvenciáját a 3 kb-s cDNS inszert két szálának szekvenciaelemzésével határoztuk meg, didezoxi-terminációs eljárással (35, 36). A teljes nukleotid szekvenciát és a kikövetkeztetett fehérje szekvenciát a 6. ábrán mutatjuk be. A leghosszabb nyitott leolvasó keret a 76. helynél kezdődik metionin kodonnal, amelyet a PurNNATGPur iniciációs konszenzus szekvencia vesz körül (61). Ez a leolvasó keret 1374 nukleotidot foglal magában, és 458 aminosavat tartalmazó polipeptidet kódol. Ennek a leolvasó keretnek az összefüggőségét olyan módon igazoltuk, hogy a cDNS-t a pSP6 RNS kifejező vektorba iktattuk be (40). Az ebből a vektorból szintetizált RNS, amikor in vitro transzlatáljuk, egy nem módosított 51 kD-s fehérje szintézisét irányítja, a pontos molekulatömeget a nukleotid szekvenciából következtettük ki (7. ábra).

A T4 egy vezető szekvenciából, négy tandem variábilis kapcsoló (VJ)-szerű területből és egy transzmembrán tartományból áll, amelyek mindegyike homológiát mutat az immunglobulin gén család különböző tagjainak megfelelő területeivel (62, 63) (6. és 8. ábrák). Az iniciációs kodont közvetlenül követi a hidrofób gyökök egy kiterjedt szakasza, amely egy KyteDolittle (64) hidropaticitási függvény által kikövetkeztetett vezető pepiidnek felel meg. Bár a natív T4 fehérje feldolgozódásának pontos helye nem határozható meg, az ismert hasítási mintákra alapozva arra lehet következtetni, hogy hasítás megy végbe közvetlenül a treonin utáni -1. helynél (65). Ennélfogva a szignálpeptid 23 aminosavat tartalmaz és a feldolgozott T4 fehérje 435 gyökből áll.

Az érett fehérje 1-94. gyökei mind aminosav, mind szerkezeti homológiát mutatnak az immunglobulin könnyűlánc variábilis tartománnyal (9A. ábra). Ennek a tartománynak az általános homológiája az immunglobulin variábilis területeivel 32%. Az immunglobulinok könnyűlánca és a T4 N-terminális V-szerű terület (VI) közötti szekvencia összehasonlítás azt demonstrálja, hogy a 14 invariáns gyök közül 8 megőrződött (66). Ez a tartomány két cisztein gyököt tartalmaz egymástól 67 aminosavval elválasztva, a cisztein gyökök helyzetei és térközei analógok azokkal a helyzetekkel és térközökkel, amelyeket immunglobulin könnyűláncokban és rokon molekulákban találunk (67). Ezek a ciszteinek képesek lehetnek kialakítani a V tartományokra jellemző megőrzött, szálon belüli diszulfid kötést. Ezt a feltételezést alátámasztja az a megfigyelésünk, hogy a T4 gyorsabban vándorol nem-redukáló körülmények között, mint redukáló körülmények között, ez pedig egybevág azzal, hogy egy szálon belül legalább egy kötés képződik (5. ábra, e. és f. vonal).

Az egyes aminosavak szintjén levő homológia mellett a T4 VI tartománya hasonló szerkezeti vonásokkal bír az immunglobulin variábilis területekkel. Az immunglobulin variábilis és állandó tartományok egy jellemző minta szerint hajtogatódnak össze, amelyben egy sorozat anti-paralell β-szál hajtogatódik össze, hogy két β-lemezt képezzen (67, 68). Ezeket a β-lemezeket diszulfid-hidak, és jellemző hidrofób kölcsönhatások tartják össze. Annak meghatározására, hogy a T4 V-szerű tartományának kikövetkeztetett szekunder szerkezete mennyire egyezik az immunglobulin könynyűláncok V-tartományának szerkezetével, kétdimenziós szerkezeti meghatározást végeztünk. Egy másik rajzot is kaphatunk ezen szekvenciákban levő valószínű β-szálakra és β-görbületekre vonatkozóan, Chou és Fasman empirikus eredetű algoritmusát (69) alkalmazva. Ezek az elemzések azt mutatják, hogy hét β-szál van jelen a T4 V-szerű tartományán belül, amelyek szorosan megegyeznek azokkal, amelyek az immunglobulin V tartományában találhatók (9A. ábra). A T4 két megőrzött ciszteinje a B és F β-szálakon belül található, ami pontosan megegyezik a ciszteinek elhelyezkedésével a V területben, amely ciszteinekről ismeretes, hogy az immunglobulinokban a megőrzött diszulfid-kötést alkotják. Egy triptofán gyök 12 aminosavval az első ciszteintől lefelé helyezkedik el, és egy

HU 213 019 Β tirozin gyök van két aminosavval a második cisztein előtt. Ezek a gyökök nagy mértékben jellemzőek a C, illetve F β-szálakra a könnyű lánc V területekben. Ezenkívül egy aszpartát gyök található hat aminosavval a második cisztein előtt, és egy arginin gyök fekszik a D β-szál alapjánál. Ezek a töltött gyökök nagy mértékben jellemzőek a V tartományokra (67). Végül változó hidrofób gyökök szakaszai vannak jelen a βszálak mentén, amelyek erősítik a két β-lemez kölcsönhatását.

AT4 VI tartományát egy olyan aminosav-szekvencia követi, amely jelentős homológiát mutat az immunglobulinok kapcsoló (J) területeivel és T sejt antigén receptorokkal. A 9B. ábrán a T4-nek ez a J-szerű területe csatlakozik az immunglobulin könnyűláncoknak és a T sejt antigén receptor két láncának konszenzus csatlakozó szekvenciáihoz. A J-szerű területet egy 265 aminosavas szakasz követi, amely szerkezetileg három további VJ-szerű tartományra osztható, és statisztikailag szignifikáns szekvencia- és szerkezeti homológja mutatható ki a prototípus immunglobulin VJ területekkel (6. és 8. ábrák). Ezenkívül ez a szekvencia két lehetséges N-kapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz (Asn-Leu-Thr; 6. ábra).

Az extracelluláris tartományt egy vélt transzmembrán szekvencia követi, amely egy hidropaticitási görbéből (64) jósolható meg; ez a szekvencia csak hidrofób és semleges aminosavgyököket tartalmaz. Ez a szegmens feltűnő homológiát mutat a II. osztályú főbb hisztokompatibilitási fehérjék β-láncainak transzmembrán exonjaival (9C. ábra). A T4 és MHC II. osztályú β-láncok összehasonlítása 48% homológiát mutat. A transzmembrán szegmenst követően egy 40 aminosavas, nagy mértékben poláros szekvencia tartalmazza a citoplazmás tartományt (6. és 8. ábra).

A T4 gén: kromoszomális elhelyezkedés és intronexon helyzetek

AT4 cDNS-t alkalmaztuk a T4 gén kromoszomális elhelyezkedésének meghatározására, szegregációs mintájának egérhumán szomatikus sejthibridek paneljében való elemzésével és humán metafázis kromoszómákhoz való in situ hibridizálással (101). A genomi foltképzési kísérletek és az in situ hibridizálás azt mutatja, hogy a T4 gén a 12. humán kromoszóma rövid karjában, a 12pl2 és 12pter területek között helyezkedik el.

A T4 gént átérő átfedő genomi kiónok készletét Charon 4 és EMLB-3 γ klónozó vektorokban (31) megalkotott humán genomi könyvtárak radioaktívan jelzett pT4B cDNS inszerttel (70) végzett átvizsgálásával kaptuk. A kiónok restrikciós és Southern-folt elemzéssel végzett jellemzése azt jelzi, hogy tartalmazzák a teljes T4 kódoló szekvenciát. Ezután a T4 gén teljes intron-exon szerveződését a genomi kiónok fajlagos fragmentumainak szekvenciaelemzésével határoztuk meg didezoxi-terminációs eljárással (35, 36).

A T4 gén 9 exonból áll, amelyet 8 intron szakít meg, amint ezt a 8. és 10. ábrán bemutatjuk. Az első exon az 5'-nem-transzlatált területet és a vezető szegmenst tartalmazza. Az első variábilis jellegű tartományt, a V_ret, egy nagy intron választja ketté, amely a 289. nukleotid helynél helyezkedik el (6. ábra). Ennél fogva a V]J| tartományt a második és a harmadik exon kódolja, míg a V₂J₂, V₃J₃, V₄J₄ és transzmembrán (TM) tartományokat mind különböző exonok kódolják (4-7. exonok). A citoplazmás tartományt (CYT) egy intron szakítja meg és a citoplazmás tartomány utolsó részét és a 3'-nem-transzlatált területet a kilencedik exon kódolja.

A T4⁺ és T8*~ transzformált sejtek megalkotása

A T4-nek az AIDS-vírus fertőzésben játszott szerepe vizsgálatára először a T4 gént bevezettük olyan T4-sejtvonalakba, amelyek nem képesek elősegíteni a vírusfertőzést. A transzformált sejteket azután megvizsgáltuk AIDS-vírusra való fogékonyságra. Ezután tanulmányoztuk a T4 vírusfertőzést közvetítő mechanizmusát.

A T4 felületi fehérjét kódoló teljes hosszúságú cDNS kiónt a pMV7 retrovirális kifejező vektorba szubklónoztuk. A pMV7 kifejező vektor (11 A. ábra) két közvetlenül ismétlődő Moloney rágcsáló szarkóma vírus hosszú terminális ismétlődést (LTR) tartalmaz, amelyek egy egyedi EcoRI klónozó helyet szegélyeznek. Az 5'-LTR konstitutívan elősegíti az átírást a klónozó helyen keresztül, míg a 3'-LtA azokat a szekvenciákat szolgáltatja, amelyek az RNS hasításához és poliadenilezéséhez szükségesek. Ezen kívül a pMV7 tartalmazza a herpesz vírus timidin kináz promotort (tk) a bakteriális neomicin foszfotranszferáz génhez (neo) és egy domináns szelektálható markerhez fuzionálva, lehetővé téve a kapcsolt kotranszformálást és fertőzést.

A T4-pMV7-et Ψ-2 és Ψ-ΑΜ sejtekbe, defektív ekotróp, illetve amfotróp provírusokat tartalmazó NIH 3T3 sejtvonalakba vezettük be (11B. ábra) (44, 59). Mindkét sejtvonal képtelen beburkolni endogén virális RNS-t, de szolgáltatják az összes kötelező transz vírus funkciót. Ezeknek a sejtvonalaknak a stabil transzfekciója T4-pMV7-tel T4-et kódoló rekombináns retrovirális készletek termelését eredményezi, amelyek mentesek segítő (helper) vírusoktól. Ezeket a tiszta vírustörzseket alkalmazhatjk azután T4 szekvenciák hatékony bevezetésére mind egér, mind humán sejtekbe anélkül, hogy a célsejtek retrovírust termelnének.

Röviden ismertetve: T4-pMV7 DNS-t vezettünk be Ψ-2 sejtekbe, DNS-közvetítette génátvitelt (11Β. ábra) alkalmazva (25, 27). Neo⁺ pozitív telepeket választottunk ki azon képességük alapján, hogy növekednek a G418-at (Geneticin) tartalmazó tápközegeken, és átvizsgáltuk sejtfelületen való, T4 kifejezésre nézve in situ rozettaképzési vizsgálattal (20, 70). Ezután azonosítottuk azokat a T4-et kifejező transzfektált Ψ-2 telepeket, amelyek rekombináns retrovírust termeltek 10⁵ cfu/ml titerrel. Azután T4⁺ Ψ-2 kiónokat alkalmaztunk egér Ψ-ΑΜ sejtek fertőzésére képes retrovírusok kialakítására. Azokat a T4-kifejező Ψ-ΑΜ kiónokat izoláltuk, amelyek 10⁴ cfu/ml rekombináns retrovírus litert alakítanak ki. T4⁺ humán transzformánsokat ala16

HU 213 019 Β látottunk ki sejtek és mitomicin-C-vel kezelt vagy ΨAM kiónok együtt-tenyésztésével (11B. ábra). Ezt követően a T4⁺ transzformánsokat Northem-folt elemzéssel és áramlási citometriával elemeztük annak igazolására, hogy a T4 kifejeződik és jelen van a sejt felületén. A T8 felületi fehérjét kifejező kontroll sejtvonalakat hasonló módon alkottuk meg.

A T4 esszenciális az AIDS-vírus fertőzéshez Annak meghatározására, hogy a T4 fehérje jelenléte egy humán limfocita felszínén elegendő ahhoz, hogy a sejtet fogékonnyá tegye az AIDS-vírus fertőzésre, a HSB2 primitív T sejt leukémiás sejt vonal (71) olyan transzformánsait alkottuk, amelyek csak a TI és Tll korai T limfocita fehérjéket fejezik ki. A HSB2 nem fejez ki sem T4-et, sem T8-at, és nem fejezi ki a T sejt antigén receptort vagy a T3 fehérjék asszociált komplexét. A HSB2 olyan transzformánsait szelektáltuk, amelyek vagy a T4, vagy a T8 fehérjét fejezik ki a sejtfelületen, és alkalmaztuk ezen sejtvonalak AIDS-vírus fer5 tőzésre való fogékonyságának meghatározására. Számos különböző kísérleti megközelítést alkalmaztunk, hogy megállapítsuk az AIDS-vírussal való fertőzöttséget, ideértve a reverz transzkriptáz kifejezését (52), a vírus kifejezés meghatározását a sejt citoplazmájában immunfluoreszcenciás mikroszkópiával (46), a vírus antigének kimutatását a tenyészet felülúszóban (47), valamint a fertőző virionok termelését felülúszóból indított altenyészetekkel fitohemagglutinin (PHA)-stimulált perifériás limfocitákkal (46). Ezeket a vizsgála15 tokát alkalmazva a HSB2 sejtvonal AIDS-vírus fertőzöttségére nem találtunk bizonyítékot (I. táblázat).

1. táblázat

T4⁺ és T8* humán sejttranszformánsok fogékonysága AIDS-vírus fertőzésre

HUMÁN SEJT	Maximális reverz transzkriptáz	Citoplazmás vírus	Vírus felülúszó Ag	Felülúszó altenyészet	Szincítium indukció	VSV (AIDS) pszeudotípus fertőzés	Víruskötés
CEM (T4+)	675 023	+	+	+	+	+	+
HSB2	4245	-	-	-	-	-	-
HSB2-T8+	4460	-	-	-	-	-	-
HSB2-T4+	190 915	+	+	+	+	+	+
Raji	ND	ND	ND	ND	-	-	ND
Raji-T8+	5595	-	-	-	-	-	-
Raji-T8+	103 500	+	+	+	+ ,	+	+
HeLa	6438	-	-	-	-	-	-
HeLa-T4+	4875	-	-	-	-	ND	-
HeLa-T4+	48 125	+	+	+	+	+	+

5x10⁶ sejtet inokuláltunk AIDS-vírussal, inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten 24 órán át, mostuk és újraszuszpendáltuk friss tápközegben. Sejteket és felülúszókat vettünk ki a 3., 6., 9., 12., 16., 20., 24. és 28. napon és négy vírus-kimutatási vizsgálatban alkalmaztuk, reverz transzkriptázos, citoplazmás vírusos, felületúszó vírus antigénes és felülúszó tenyésztési vizsgálatokban. A pszeudotípusos fertózéses kísérletek eredményeit az alábbiak szerint fejeztük ki:

+:510³ PFU/ml

-: 10 PFU/ml

ND: nem határoztuk meg

Ezenkívül már korábban igazolták, hogy erőteljes sejtfúzió megy végbe, amikor AIDS-vírus receptorokat hordozó, nem fertőzött humán sejteket együtt tenyésztenek AIDS-vírust termelő sejtekkel (54). Ezekben a vizsgálatokban nincs szincítium-indukció, amikor HSB2 sejteket keverünk össze AIDS-vírust termelő H9 sejtekkel (I. táblázat), míg bőségesen keletkeznek szincítiumok HTLV-I és HTLV-II termelő sejtekkel (adatokat nem mutatunk be).

Végül vírus behatolást vizsgáltunk az AIDS-vírus burok glikoproteinjeit hordozó vezikuláris sztomatitisz vírus pszeudotípusait alkalmazva (I. táblázat) (53, 54).

Amikor AIDS-vírussal fertőzött sejteket felülfertőzünk VSV-vei, a származék VSV egy hányada elegendő AIDS-vírus burok glikoproteint képez, hogy ellenálljon a hiperimmun anti-VSV szérum által történő semlegesítésnek. Ezeknek a VSV (AIDS) pszeudotípusos virionoknak gazdasejt-tartománya olyan sejtekre korlátozódik, amelyek az AIDS-vírusra fajlagos receptorokat fejeznek ki, A sejtbe való behatolás és a virion burokmentesítése után az átburkolt VSV genom replikálódik, így nem-pszeudotípusos részecskék alakulnak ki. A szekunder fertőzés során a fertőzött sejtekből kibocsátott utód VSV behatol és elroncsolja a VSV (AIDS) pszeudotípusos fertőzésre rezisztens szomszédos indikátor sejteket (nyérc CCL64 vagy szarvasmarha MDBK sejtek), olyan VSV tarfoltok keletkezését idézve elő, amelyeket azután meghatározunk. így a VSV (AIDS) pszeudotípussal való fertőzés kvantitatív citopatikus tarfolt vizsgálatot biztosít a vírus behatolásnak (54). Ebben a vizsgálatban a háttéren kívül tarfoltokat nem figyeltünk meg, amikor HSB2 sejteket VSV (AIDS) pszeudotípusoknak tettünk ki (I. táblázat). A kontroll kísérletekben egy HTLV-I burokba zárt VSV RNS pszeudotípussal [VSV (HTLV-I)] számos tarfoltot figyeltünk meg, ami azt mutatja, hogy azok a HSB2

HU 213 019 Β sejtek, amelyek HTLV-I-receptort hordoznak, képesek hatékonyan VSV-t replikáink Ezek a megfigyelések azt demonstrálják, hogy az AIDS-vírus burok befogott VSV genom nem képes behatolni HSB2 sejtekbe.

Ezután azt tanulmányoztuk, vajon egy funkcionális T4 cDNS bevezetése HSB2-be fogékonnyá teszi-e ezt a sejtet AIDS-vírus fertőzésre (I. táblázat). HSB2T4⁺ transzformánsok fertőzése AIDS-vírussal produktív vírusfertőzést eredményezett, amint ezt a reverz transzkriptáz aktivitás kifejezésével (52), a vírus kifejezésével a sejt citoplazmájában immunfluoreszcencia mikroszkópos vizsgálattal (46), a vírus antigén kimutatásával immunvizsgálattal a tenyészet feliilúszóban (47), valamint fertőző vírus termelésével felülúszó altenyészet segítségével PHA-stimulált limfocitákkal (1. táblázat) (46) meghatároztuk. A kontroll HSB2-T8⁺ sejtek következetesen negatívak ezen vizsgálatok mindegyikében.

Ezenkívül tanulmányoztuk azt a hatékonyságot is, amellyel a különböző T4⁺ T sejtek fertőződnek AIDSvírussal. A HSB2-T4* és HSB2-T8⁺ transzformánsokat, a természetből izolált CEM T4⁺ T sejtvonalat, valamint PHA-stimulált perifériás limfocitákat AIDSvírus 10-szeres sorozathígításaival fertőztük, mostuk, majd mikrotenyészetbe vittük. Ezután meghatároztuk a fertőzött tenyészetek gyakoriságát immunvizsgálattal 12 nappal a vírusfertőzés után (12. ábra) (47). Ezen a módon meghatároztuk a kezelt tenyészetek 50%-ának megfertőzéséhez szükséges AIDS-vírus titerét (ID—50). A PHA-stimulált perifériás limfociták ID-50 értéke 2-3 nagyságrenddel nagyobb, mint amelyet a természetből izolált vagy transzformált T4⁺ sejtvonalaknál megfigyeltünk. A HSB2-T4⁺ sejtek fertőzésének hatékonysága mintegy tízszer nagyobb, mint amelyet a természetből izolált CEM T4⁺ T sejtvonalnál megfigyeltünk. A kontroll HSB2-T8⁺ sejtek nem fogékonyak a fertőzésre még a legmagasabb vizsgált vírus-titernél sem.

Tanulmányoztuk a HSB2-T4* sejteknek azt a képességét, hogy támogatják mind a szincítium-képződést, mind a VSV (AIDS) pszeudotípusok replikálódását. Amikor a HSB-T4⁺ sejteket együtt tenyésztettük az AIDS-vírust termelő H9 sejtekkel, a szincítium képződés könnyen megfigyelhető 18 órán belül (I. és II. táblázatok). Ezenkívül a szincítium indukció megszűnik a tenyészetek anti-T4A monoklonális antitestekkel történő előkezelésével (II. táblázat). Végül, amikor a HSB2-T4⁺ sejteket VSV (AIDS) pszeudotípusoknak tettük ki, olyan fertőző VSV részecskék termelődtek, amelyek elroncsolták a szomszédos indikátor sejteket (I. és III. táblázatok). Ezenkívül a tarfoltképződés antiAIDS-vírus antitesttel vagy anti-T4A monoklonális antitesttel végzett előkezeléssel gátlódott (III. táblázat). A kontroll HSB2-T8⁺ sejtek következetesen negatívak voltak a hét vizsgálat mindegyikében, amelyet AIDSvírusfertőzés kimutatására alkalmaztunk (I., II. és III. táblázatok). Ezek a megfigyelések genetikai bizonyítékot adnak arra, hogy az éretlen humán T limfocitában a T4 fehéijének puszta jelenléte alapvetően szükséges az AIDS-vírus fertőzéshez.

II. táblázat

Szincítium indukálása T4⁺ humán sejt transzformánsokban

HUMÁN SEJTEK	SZINCÍTIUM INDUKCIÓ
H9/A1DS	H9/AIDS+aT4A
JM (T4+)	+++++	-
8166 (T4+)	+++++	-
HSB2	-	ND
HSB2-T8+	-	ND
HSB2-T4+	+++	-
Raji	-	ND
Raji-T8+	-	ND
Raji-T4+	+++	-
HeLa	-
HeLa-T8+		ND
HeLa-T4+	+++++	-

2xl0⁵ sejtet együtt tenyésztettünk 2xl0⁴, AIDS-vírust termelő H9 sejttel (H9/AIDS) és inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. A tenyészeteket 18 óra múlva vizsgáltuk meg szincítium-képződésre. Az eredményeket a szincítiumon belüli magok hozzávetőleges százaléka formájában fejeztük ki:

-: nincs szincítium ++: 25% +++: 50% +++++: 90%

ND: nem vizsgáltuk.

A szincítium-gátlást úgy vizsgáltuk, hogy a beoltás időpontjában a kevert tenyészetekhez anti-T4A monoklonális antitestet adtunk (aT4A; 1:20). A természetből izolált JM és 8166 T4⁺ T sejtvonalak szolgáltak pozitív kontrollként ezekben a tanulmányokban.

III. táblázat

VSVpszeudotípus citopátiás tarfolt vizsgálat T4⁺ és Tffi humán sejt transzformánsokban

HUMÁN SEJTEK	VDV PSZEUDOTÍPUS TITER (PFU/ml)
VSV (HTLV-I)	VSV (AIDS)
	+aHTLV-I		+aA- IDS	+T4A
CEM (T4+)	20 000	50	42 000	50	200
HSB2- T8+	10000		0	ND	ND
HSB2- T4+	12000	50	1000	100	300
Raji-T8+	500	ND	0	ND	ND
Raji-T4+	5000	50	1500	25	150
HeLa	10 000	ND	0	ND	ND
HeLa- T4+	10 000	50	17000	50	200

HU 213 019 Β

2X1O⁵ sejtet inkubáltunk VSV (AIDS) pszeudotípusokkal (53, 54) 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. A sejteket azután mostuk, és az egyes üregekhez lxlO⁶ nyérc CCL64 vagy szarvasmarha MDBK tarfolt indikátor sejteket adtunk, amelyek lehetővé teszik a VSV-fertőzést, de rezisztensek a VSV (AIDS)-re. A tenyészeteket ezután felülrétegeztük agar tápközeggel, és két nappal a fertőzés után leolvastuk a VSV tarfoltokat. Anti-T4A monoklonális antitesteket (a T4A; 1:20) vagy antiAIDS-vírus szérumot (aAIDS; 1:10) alkalmaztunk a VSV (AIDS) pszeudotípus tarfolt-képződés gátlására a sejtek előkezelésével 30 perccel a pszeudotípusokkal való fertőzés előtt (54). Kontrollként VSV (HTLV-I) pszeudotípusokat alkalmaztunk, amelyeket sokféle humán sejttípusra helyeztünk (54). Anti-HTLV-1 szérumot (1:10) alkalmaztunk a VSV (HTLV-I) pszeudotípusos tarfolt-képződés blokkolására. Az eredményeket PFU/ml-ben fejeztük ki.

ND: nem vizsgáltuk.

Az AIDS-vírusfertőzés nem korlátozódik a T limfocitákra

Funkcionális T4 cDNS-t vezettünk be két humán nem-T sejtvonalba: a HeLa-ba [hámsejt-vonal, amely méhnyaki karcinómából származik (72)], és a Raji-ba [B limfoblasztoid sejtvonal, amely Burkitt limfómában szenvedő betegből származik (73)] (11B. ábra). A retrovírus által közvetített génátvitel előtt ezek a sejtvonalak nem fejeznek ki felületi T4 fehérjét vagy T4 mRNS-t és nem fogékonyak AIDS-vírusfertőzésre (I. táblázat). Ezenkívül a szülő sejtvonalak nem támogatják szincítium indukálását, valamint a VSV (AIDS) pszeudotípusok elteijedését sem (I., II. és III. táblázatok).

Ezzel ellentétben a Raji és HeLa T4⁺ transzformánsok támogatják az AIDS-vírusfertőzést az összes kritérium szerint, amelyet korábban leírtunk (I. táblázat). A hatékonyság, amellyel a Raji-T4⁺ sejteket AIDS-vírussal fertőzhetjük, közel azonos HSB2-T4⁺ sejteknél levő hatékonysággal és mintegy tízszer nagyobb, mint a természetből izolált CEM T4⁺ T sejtvonal fertőzésének hatékonysága (12. ábra). Ezenkívül együtt-tenyésztéskor az AIDS-vírust termelő H9 sejtekkel a Raji-T4⁺ és HeLaT4⁺ sejtek támogatják a szincítiumok indukálását, amelyek eltűnnek, amikor a tenyészeteket anti-T4A monoklonális antitestekkel előkezeljük (I. és Π. táblázatok; 13. ábra). Ezenkívül ezeknek a sejteknek a kezelése VSV (AIDS) pszeudotípusokkal fertőző VSV termelését és olyan tarfoltok kialakulását idézi elő, amelyeket az antiAIDS-vírus antitestekkel vagy anti-T4A monoklonális antitestekkel végzett előkezelés gátol (I. és III. táblázatok). A kontroll Raji-T8⁺ és HeLa-T8⁺ transzformánsok következetesen negatívak mindezekben a vizsgálatokban (I., Π. és ΙΠ. táblázatok). Ennél fogva egy funkcionális T4 gén bevezetése humán T limfocitákba, B limfocitákba vagy hámsejtekbe elegendő ahhoz, hogy az ilyen sejtek fogékonnyá váljanak AIDS-vírusfertőzésre. Összefoglalva, ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy az in vivő megfigyelt T4⁺ T sejt tropizmus a T4 molekula korlátozott kifejeződésének következménye és nem azon sejttípus természetének következménye, amelyben kifejeződik.

Az AIDS-vírus kötődik a felületi T4 fehérjéhez

Az előző kísérletek genetikai bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a T4 kifejeződés szükséges az AIDSvírusfertőzéshez, de nem nyújtanak információkat ezen molekulának a vírus életciklusában betöltött szerepére vonatkozóan. Az a megfigyelés, hogy a T4 felületi kifejezése szükséges az AIDS-vírusfertőzéshez, azt sugallja, hogy a T4 az AIDS-vírus receptora. Ezért citofluorometriát alkalmaztunk, hogy megvizsgáljuk az AIDS-vírus kötését T4⁺ és T8⁺ transzformált humán sejtek felületéhez (I. táblázat; 14. ábra). A HSB2, Raji és HeLa sejteket és a T4⁺ vagy T8⁺ transzformánsokat inkubáltuk AIDS-vírussal. A vírus abszorpciója után a sejteket mostuk, fluoreszceinnel konjugált anti-AIDSvírus antitesttel kezeltük és áramlási citometriával elemeztük. Ez a vizsgálat azt jelzi, hogy az AIDS-vírus hatékonyan és fajlagosan kötődik a felületi T4-et kifejező humán transzformánsokhoz, de nem kötődik sem a T4” szülősejtekhez, sem a T8⁺ transzformánsokhoz (14. ábra, B. oszlop; I. táblázat). Az AIDS-vírus kötése a T4⁺ sejtekhez eltűnik anti-T4A monoklonális antitestekkel végzett előinkubálással, de nem tűnik el az antiT8 monoklonális antitestekkel végzett előinkubálással (14. ábra, C. oszlop). Ezen kívül amikor T4⁺ transzformáit sejteket AIDS-vírussal fertőztünk, a T4 glikoprotein együtt csapódott ki a vírus burok glikoproteinnel, ami arra utal, hogy közvetlen fizikai asszociálódás lép fel ezen molekulák között (adatokat nem mutatunk be). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az AIDS-vírus kötődik a sejt felületén a T4 molekulához, és hogy ez a kötés független más T sejt-specifikus fehéijéktől, mivel a kötés végbemegy minden vizsgált T4⁺ sejttípusnál.

Előzetes tanulmányok leírják a behatolás két eltérő útját a burokkal ellátott vírusoknál (74, 75, 76, 77). Néhány vírus közvetlenül fuzionál a plazma membránnal, kibocsátva nukleokapszidjait a citoplazmába, míg mások internalizálódnak receptor által közvetített endocitózissal. Az endoszóma savas környezete azután megkönnyíti a vírus burok fúzióját a vakuólum határoló membránjával. Az endocitikus út révén a sejtekbe jutó vírusokkal való fertőzést gátolni lehet a sejtek pl. gyenge bázisokkal végzett kezelésével, amelyek savmentesítik az endoszómát (58, 78, 79, 80). Ammónium-klorid jelenlétében a fúzió blokkolódik az endoszómában, de a lizoszomális elbomlás csökkentett sebességgel tovább folytatódik (80).

Ezért ammónium-klorid hatását vizsgáltuk a JM T4⁺ T sejtvonal AIDS-vírussal való fertőzésére. Ammónium-klorid távollétében az AIDS-vírusnak kitett JM sejtek vírus antigéneket fejeznek ki 5 nappal a fertőzés után, amint ezt immunfluoreszcencia mikroszkópiás vizsgálattal meghatároztuk. Ha JM sejteket ammónium-kloriddal kezeltünk (6 órán át) a vírus hozzáadásának időpontjában vagy 30 percen belül a vírus hozzáadása után, a vírusfertőzés több, mint 95%-os gátlását figyeltük meg. Ha azonban a sejteket egy órával a vírus hozzáadása után kezeltük ammónium-kloriddal, a fertőzés gátlása nem volt megfigyelhető, ez a megállapítás egybevág a vírus-belépés más olyan vírusoknál leírt kinetikájával, amelyek receptor-közvetített

HU 213 019 Β endocitózissal jutnak be. Végül az ammónium-klorid hatása teljesen reverzibilis. Ammónium-kloriddal egy órán át kezelt, majd az anyagtól mentessé mosott és AIDS-vírussal fertőzött sejtek elérik a kontroll vírusfertőzés szintjét. Ezek az eredmények egybevágnak azokkal a korábbi megfigyelésekkel, hogy az ammónium-klorid eltávolítására az endoszóma pH-ja 1-2 percen belül visszatér az eredeti alacsony értékekre (78, 80). Hasonló eredményeket kaptunk amantadinnel, egy, az endoszómát dezacilezó vegyülettel.

Ezek az eredmények egybevágnak a vírus-belépés korábban leírt mechanizmusával, amely szerint a T4AIDS-vírus komplex endocitózisa és a vírus burok és az endoszóma határoló membránja alacsony pH által indukált fúziója megy végbe, miközben vírus nukleokapszidot bocsát a sejt citoplazmájába.

A T4 mRNS kifejeződik az agyban

A celluláris immunrendszer lerombolásán kívül az AIDS gyakran társul a központi idegrendszer (CNS) rendellenességeivel, amelyekről úgy vélik, hogy az agysejtek AIDS-vírussal történő közvetlen fertőzésének következménye (81). Ennél fogva érdekes annak meghatározása, vajon a T4 kifejeződik-e a CNS-en belüli sejtekben, ezáltal magyarázatot adva a vírus neurotropikus tulajdonságaira. Mind humán, mind egér agyból készült RNS Northem-folt elemzését elvégeztük annak meghatározására, vajon a T4 mRNS szekvenciák kifejeződnek-e a CNS-ben (15. ábra). A humán agykéregből származó poli(A)⁺ RNS két külön T4 mRNS-t tartalmaz mintegy 3, illetve 1,8 kb molekulatömeggel (15A. ábra). A gyengébbik, 3 kb-s RNS méretben azonos azzal az mRNS-sel, amelyet két T4⁺ leukémiás sejtvonal, az U937 (monocitás sejtvonal) és Jurkat (T sejtvonal), valamint perifériás T limfociták fejeznek ki. A limfocitákból hiányzik, alternatív hasításból vagy alternatív 5' vagy 3' terminálisokból származhat.

AT4 mRNS elhelyezkedésének gondosabb elemzését végeztük el olyan módon, hogy poli(A)⁺ RNS-t izoláltunk az egéragy speciális területeiből (15B. ábra). A hibridizálás a T4 rágcsáló homológját, az L3T4-et kódoló, radioaktívan jelzett cDNS-sel egy intenzív 2,2 kb-s mRNS jelet mutatott az egér előagyból, amely nem volt jelen a hátsóagyi mintákban. A 2,2 kb-s L3T4 mRNS kimutatható a kéregben, hipotolamuszban és legbőségesebben a striatumban, de nincs jelen a nyúltagyban, agytörzsben vagy gerincagyban (adatokat nem mutatunk be). Ez a 2,2 kb-s a CNS-ben kimutatott mRNS mintegy 1 kb-val kisebb, mint az L3T4-et kódoló, 3,2 kb-es mRNS a timocitákban (15B. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az AIDS-vírus által kimutatott neurotropizmus valószínűleg a T4 molekula felületi kifejeződésének eredménye az agysejteken. Az előagyban kimutatott mRNS szintje mintegy 1/30-a a timocitákban levő szintnek. Ez tükrözheti nagyszámú sejt alacsony szintű kifejezését vagy tükrözheti sejtek kis alpopulációjának magas szintű kifejeződését. Jelenleg még nem ismeretes, vajon T4-et fejeznek-e ki neuronok vagy támasztó sejtek. Az átirati variánsok jelenléte a CNS-ben azonban valószínűtlenné teszi, hogy a

T4 mRNS az agyban a ritkán behatoló T limfociták révén fejeződik ki.

Diszkusszió

A T4 és T8 szegregációja T sejtek funkcionálisan eltérő alpopulációival azt sugallja, hogy ezek a molekulák fontosak lehetnek a T limfociták megfelelő célsejtekkel való kölcsönhatásában. Első lépésként ezen fehéijék speciális szerepének megértésében cDNS kiónokat kaptunk mind a T4, mind a T8 molekulákból és ezek nukleotid-szekvenciáit meghatároztuk (20, 70). A T4 és T8 kikövetkeztetett fehérjeszekvenciáinak összehasonlítása azt jelzi, hogy ezekben a molekulákban vannak fontos közös szekvenciák és van szerkezeti homológja az immunglobulin variábilis (V) tartományaival és az immunglobulin szupergén család tagjaival. A T4 és T8 N-terminális V-szerű tartományai azonban jelentősen eltérők: ezekben csupán 28% homológja van és ezért kevésbé homológok egymáshoz, mint bármelyikük az immunglobulin könnyűláncokhoz (9A. ábra). A T4 és T8 maximálisan megőrzött területei egyben a legerősebb homológia területei az immunglobulin és T sejt receptor V területek esetén is. így ezen két molekulának az immunglobulinszerű tartományai, bár szerkezetileg hasonlók, jelentős szekvenciaeltérést mutatnak; ez összevág azzal a hipotézissel, hogy ezek különböző molekulákat ismernek fel célsejtek különböző alpopulációin.

A T4 és T8 N-terminális tartományaiban levő Vszerű terület szerkezeti homológiája különösen fontos lehet ezeknek a fehérjéknek a működésében. Tulajdonképpen az immunglobulin szupergén család összes tagja részt vesz az immunválaszban (62). Ezen család egyes tagjai továbbá erős tendenciát mutatnak arra, hogy társuljanak egymáshoz dimereket képezve. Ez a társulás nyilvánvaló az immunglobulin nehéz- és könnyűláncainak, a T sejt antigén receptor P₂-mikrogolublin és I. osztályú MHC fehérjék alfa és béta láncainak, valamint a II. osztályú MHC molekulák alfa és béta láncainak kölcsönhatásában. A T8 glikoprotein diszulfid kötést képez T6-tal, egy vélt MHC-szerű molekulával a timociták felszínén (82), és a 32 kD-os alegység multimereként létezik a perifériás T limfocitákon (83). Négy V-szerű tartomány jelenléte a T4-ben azt jelzi, hogy ezek a területek egymással társultak, valamint társultak más sejtek vagy vírusok felületén levő fajlagos ligandumokkal. Az immunglobulinszerű molekulák ezen fajlagos affinitásai lényegesek lehetnek a T4 és T8 felismerő funkcióihoz.

A T4 evolúciója

Az immunglobulin és T sejt antigén receptor génekben a V és J exonok messzire el vannak különülve és egymáshoz közel csak azután kerülnek, miután a szomatikus rekombinációs esemény megtörtént (62, 63). A T4 mRNS négy összefüggő V és J-szerű elemet kódol anélkül, hogy DNS rekombinációs eseményre szükség lenne. Ennélfogva lehetséges, hogy a T4 egy primitívebb gént tükröz, amely az átrendezési mecha20

HU 213 019 Β nizmusok felbukkanása előtt alakult ki. Ezt az eredetet támogatják továbbá azok a nemrégi megfigyelések, hogy a T4(V1) első V-szerű területét egy olyan intron szakítja meg, amely sem az immunglobulinokat, sem a T sejt antigén receptorokat kódoló V génekben nincsen jelen. Az összegyűlt bizonyítékok azt sugallják: sokkal valószínűbb az, hogy az intronok pontosan eltávolítódnak az evolúció során, minthogy intronok iktatódjanak be egy korábban intron-mentes környezetbe. így a T4 egy ősi immunglobulin gént képviselhet, amely kettőződésen, elkülönülésen, és átrendeződésen ment keresztül, hogy kialakuljon a jelenlegi immunglobulin gén-család. Bár jelenleg egy sokkal komplexebb immunrendszerben működik, a T4 olyan receptorokat tükrözhet, amelyek primitívebb celluláris immunválaszban működnek. A primitív immunválaszok, pl. a gerinctelenek immunválaszai, úgy tűnik, nem rendelkeznek receptor molekulák széles választékával, hanem a legegyszerűbb esetekben „saját” és „nem-saját” közti megkülönböztetésre szorítkoznak (85, 86), és valószínűleg gének „statikus” készletével vannak ellátva, amelyek nem mennek keresztül átrendeződésen.

Bármi is a T4 megjelenésének sorrendje az evolúciós időben, ezen gének szervezettsége érdekes példa az exon összekeveredésre. A T4 négy V-J-szerű tartományt, egy J-szerű tartományt és egy transzmembrán szegmenst tartalmaz, amelyek mindegyike homológiát mutat az immunglobulin szupergén család különböző tagjaival. A V- és J-szerű tartományok homológok mind az immunglobulinok, mind a T sejt antigén receptor láncok ekvivalens területeivel; a transzmembrán tartomány jelentős homológiát mutat a Π. osztályú MHC molekulák β-láncaiban levő ilyen területtel (9C. ábra). A T4 ennél fogva az immunglobulin szupergén család számos tagjában megőrzött exonok gyűjteményéből áll, amelyek különböző utakon keverednek össze, hogy nagyszámú különböző molekulát alakítsanak ki, amelyek résztvesznek az immunválaszban.

A T4 az AIDS-vírus receptor

A kapott adatok az AIDS-vírusfertőzésnek olyan mechanizmusát sugallják, amelyben kezdetben az AIDS-vírus a sejt felületén levő T4 molekulákkal fajlagosan asszociálódik. Ez az asszociálódás kimutatható T limfocitákon, B limfocitákon és hámsejteken, ennek megfelelően ez nem igényli további T-sejt-fajlagos fehérjék részvételét. Ezenkívül az adatok azt mutatják, hogy a T4-AIDS-vírus komplex internalizálódik receptor-közvetített endocitózissal, majd a vírus burok fuzionál az endoszóma határoló membránjával, és nukleokapszidot juttat a citoplazmába. Ezután végbemehet a vírusreplikáció és átírás mind limfoid, mind nem-limfoid sejtvonalakban. Ezenkívül a T4 gén kifejeződik az agyban, valamint limfocitákban is, ami magyarázatot nyújt az AIDS-vírus kettős, neurotropikus és limfotropikus jellegére. Ezen a módon egy T limfocita felületi fehérjét, amely fontos az effektor sejt-célsejt kölcsönhatás közvetítésében, egy humán retrovírus használ arra a célra, hogy az AIDS-vírust fajlagosan a T4⁺ sejtek populációjához célba juttassa.

Számos, burokkal rendelkező vírusnál azonosítottak sejtfelületi receptorokat és ezen receptorok kifejezésének mintája gyakran felelős speciális vírusok gazdaszervezetválasztékáért és tropikus tulajdonságaiért (74, 76). Bizonyos vírusok csak sejttípusok szűk választékát képesek fertőzni, ami azt tükrözi, hogy a vírus-receptor a célsejteknek csak fajlagos populációin fejeződik ki. A veszettség vírusa pl. kölcsönhatásban van a nikotin-acetilkolin receptorral (87) és nagymértékben fertőzi a vázizmokat és neuronokat, míg az Epstein-Barr-vírus a 2. típusú C3d komplement receptorral (88) van kölcsönhatásban és B limfocitákat fertőz. Más vírusok, pl. a mixovírusok, a sejtfelületen mindenütt jelen levő sziálsav gyökökkel vannak kölcsönhatásban és sejttípusok szélesebb választékát fertőzik.

A sejtfelületi receptorok korlátozott kifejezése csak egy magyarázat a virális tropizmusra. Bizonyos vírusok differenciált sejttípusoknak csak korlátozott populációjában replikálódnak, míg mások csak speciális sejttípusokban íródnak át hatékonyan. A Moloney rágcsáló leukémia-vírus (Mo-MuLV) pl. T sejt limfómákat indukál újszülött egerekben, míg a szoros rokonságban levő Friend segítő (helper) leukémia-vírus (FrMuLV) elsősorban eritroleukémiát indukál (89, 90, 91). Erről a tropizmusról úgy véljük, hogy az LTR-ekben levő különbözőségek eredménye, ami megkönnyíti a Mo-MuLV genom hatékony átírását T limfocitákban és az Fr-MuLV genom hatékony átírását eritroid prekurzorokban (92, 93, 94).

Amint itt jelezzük, az AIDS-vírus elsődleges tropikus determinánsa a célsejt felületén a T4 fehérje kifejeződése. Az in vivő fertőzés limfoid és mieloid sejtekre, valamint agysejtekre korlátozódik, három olyan populációra, amely T4-et fejez ki. Az in vitro kísérletek eredményei azt jelzik, hogy a T4 bevezetése T4 humán limfocitákba és hámsejtekbe, vagyis olyan sejtekbe, amelyek az AIDS-vírus számára nem természetes célpontok, ezeket a sejteket fogékonnyá teszi AIDS-vírussal történő tényleges fertőzésre.

1. példa

Oldható T4 fragmentumok

Oldható T4 glikoprotein fragmentumokat készítünk korlátozott proteázos emésztéssel sejtpreparátumokból. Egy másik módszer szerint olyan T4 fragmentumokat kódoló DNS kifejező vektorokat alkothatunk és alkalmazhatunk ilyen T4 fragmentumok előállítására, amelyekből hiányzik a transzmembrán tartomány, vagyis egy olyan terület, amely semleges és hidrofób gyököket tartalmaz. Ezek a fragmentumok oldhatók vizes oldatokban és tartalmaznak vezető (szignál) szekvenciákat. Amikor ezeket emlős sejtekben fejezzük ki, ezek a fragmentumok átszállítódnak a durva endoplazmás retikulum/Golgi komplexen és végül kiválasztódnak a sejtekből.

2. példa

AlDS-betegek kezelése

Az 1. példában leírt oldható T4 glikoprotein fragmentumokat - gyógyászatilag elfogadható hordozóval elegyítve - humán immunhiány-vírussal fertőzött bete21

HU 213 019 Β geknek adagolunk úgy, hogy a fragmentumok kötődjenek a beteg vérében és más testfolyadékjaiban jelen levő vírussal és blokkolják a T4⁺ sejtek fertőzését in vivő. Más módszer szerint vagy emellett egy beteg vérét olyan oszlopon keresztül cirkuláltatjuk, amely immobilizált T4 glikoproteineket vagy oldható T4 fragmentumokat tartalmaz úgy, hogy a vírus elkülönüljön a vértől. Az ilyen intézkedések lehetővé teszik az immunrendszer számára, hogy hatékonyabb immunológiai választ alakítson ki a vírus ellen, vagyis a nem fertőzött T4⁺ T sejtek szaporodjanak.

Az oldható T4 fragmentumokat gyógyszerként, azaz a HIV-fertőzés extracelluláris és sejttől-sejtbe való terjedésének inhibitoraként alkalmazhatjuk. Kimutattuk, hogy az oldható T4 fragmentumok a HÍV kötését a T4⁺ célsejtekhez és ezeknek a sejteknek a fertőzését in vitro gátolják (lásd a 4. példát). Oldható T4 fragmentumok adagolása HIV-vel fertőzött személyeknek gátolja a vírusfertőzés extracelluláris elteijedését. Ezen kívül a HIV-vel fertőzött T4⁺ sejtek és nem fertőzött T4⁺ sejtek fúzióját, amely szintén egyik útja a vírus terjedésének, az oldható T4 fragmentumok beadása gátolja. Ennélfogva az oldható T4 fragmentumok beadása lassítja a betegség előremenetelét, enyhít számos, AIDS-szel együtt járó tünetet, és megakadályozza új patológiás változások létrejöttét.

Az oldható T4 fragmentumokat mint biokémiailag tiszta, vizes, oldható reagenseket együtt alkalmazzuk más reagensekkel, hogy megvizsgáljuk a T4-HIV kölcsönhatás kompetitorait. így az oldható T4 fragmentumokat más HÍV burok fehérjékkel vagy HÍV burok fehérjéket tartalmazó biokémiai keverékkel kombinálva vírus-kötések gátlószereinek átvizsgálására alkalmazzuk.

3. példa

Oldható T4 fragmentumok előállítása

Membrán-kötött T4 fehérjét (pT4B) kódoló cDNS-t izolálunk, jellemezzük, és kifejezzük különböző emlős sejttípusokban (70). Oldható T4 fragmentumokat állítunk elő bakteriális-, élesztő-, rovar- és emlős rendszerekben. Mivel a T4 fehérje valószínűleg komplex módon hajtogatódik és glikozileződik, az emlős rendszerekben való kifejeződés az előnyös. Oldható T4 fragmentumokat állítunk elő a pT4B megcsonkításával a V₄J₄ tartomány után. Az ilyen DNS fragmentumok a transzmembrán szegmens előtt befejeződnek, amely mintegy az 1264. nukleotid helyzetnél kezdődik (6. ábra). Ebből a rekombináns DNS molekulából hiányzik mind a transzmembrán, mind a citoplazmás tartomány. Az EcoRI-Hpall fragmentumot, amely az 1.1252. nukleotidok között helyezkedik el, izoláljuk pT4B kisebb fragmentumaiból összeállítva. Egy más módszer szerint egyedül a transzmembrán szegmenst iktatjuk ki, a V₄J₄ tartományt megtartva a citoplazmás tartománnyal fuzionálva. Az egyik megközelítés az, hogy a pT4B-ből kiiktatjuk az 1252. és 1342. Hpall helyek közti nukleotidokat. Az ilyen konstrukciók megtartják a durva endoplazmás retikulum/Golgi komplexbe való belépéshez és a sejtből való kiválasztódáshoz szükséges T4 szignál szekvenciát. Ezenkívül ezek a konstrukciók megtartják a T4 fehérje extracelluláris részeit, amelyekben a humán immunhiány-vírus burok glikoproteinhez való kötő tartomány található.

Abból a célból, hogy oldható T4 fragmentumokat fejezzünk ki emlős rendszerekben, a módosított T4 cDNS fragmentumokat olyan vektorokba szubklónozzuk, amelyek erős eukarióta promotorokkal/fokozókkal, valamint az RNS hasításához és poliadenilezéséhez szükséges poliadenilező helyekkel rendelkeznek. így pl. a majom-vírus (SV40) korai promotor és fokozó az oldható T4 cDNS fragmentumtól fölfelé helyezkedik el. Az átírás befejezését és az RNS poliadenilezését úgy érjük el, hogy az SV40 vagy a humán növekedési hormon gén poliadenilező helyét az oldható T4 cDNS fragmentumoktól lefelé helyezzük el. Egy olyan konstrukció bevezetése eukarióta sejtekbe, amely ezeket az elemeket egy szelektálható markerral együtt tartalmazza, a szakterületen ismert sokféle eljárás bármelyikével exokén DNS stabil integrációjához vezet. Azok a transzformánsok, amelyeket azon képességük alapján szelektálhatunk, hogy növekednek szelektív tápközegben, oldható T4 fragmentumokat a felülúszóban a rendelkezésre álló számos vizsgáló eljárás valamelyikével pl. radioimmun-kicsapással mutatjuk ki, majd tisztítjuk.

Az oldható T4 fragmentumok tisztítása és jellemzése nagy mértékben megkönnyíthető olyan sejtvonal megalkotásával, amely a kiválasztott fehérje fragmentum kifejezésével túltermelésre képes. Olyan stratégiákat alkalmazunk, amelyek lehetővé teszik fehérjék túltermelését baktériumokban, élesztőkben, rovar- és emlős rendszerekben. Alkalmazhatunk indukálható kifejező rendszereket is baktériumokban és élesztőkben fehéijék túltermelésére, amely fehérjék toxikusak lehetnek, ha konstitutív módon fejeződnek ki. Az oldható T4 fragmentumok túltermelését elvégezhetjük egy oldható T4 kifejező vektor sokszorozásával, amely konstitutív túltermelést eredményez. A dihidrofolát reduktáz (dhfr) gének sokszorozását a metotrexát, amely a dhfr antagonistája, progresszíven növekvő koncentrációban növesztve széles körben alkalmazzák. Mivel a sokszorozott egység nem korlátozódik dhfr kódoló szekvenciákra, ez a megközelítés az egymással szomszédos szekvenciák együttes sokszorozását eredményezi. Ezt a stratégiát sikerrel alkalmazzuk számos, a dhfr plazmidokkal együtt transzformáit sokféle különböző gén kifejezésének fokozására. Egy másik sokszorozási munkamenet magában foglalja az oldható T4 cDNS kifejező vektor kontranszfekcióját a pdLAT-3 plazmiddal, ezt egy korábban leírt (102) szelekciós munkamenet követi.

Ennek megfelelően az oldható T4 cDNS kifejező konstrukció együtt transzfektálódik egy dhfr kifejező plazmiddal. Egy másik eljárás szerint a dhfr gén azonos plazmidban van, mint az oldható T4 cDNS fragmentum, lehetővé téve a kapcsolt kotranszformálást. Ezeknek a konstrukcióknak a transzfekciója dhfr-hiányos (dhfr^-) kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekbe, és az ezt követő szelekció metotrexátban lehetővé teszi olyan stabil transzformánsok izolálását, amelyek újonnan bevezetett szekvenciákat fejeznek ki. Számos kiónt tisztítunk és tenyészet felülúszókat gyűjtünk és vizsgálunk át oldható

HU 213 019 Β

T4 fragmentumok jelenlétére. Azokat a kiónokat, amelyek a legmagasabb szinten termelik az oldható T4 fragmentumokat, tovább jellemezzük Northern- és Southernfolt elemzéssel. Ezeket a sejtvonalakat azután szelektív tápközegekben tenyésztjük, amelyek metotrexát lépcsőzetesen növekvő koncentrációit tartalmazzák. Ez a szelektív nyomás az újonnan bevezetett dhfr gén és a szomszédos T4 szekvenciák sokszorozását eredményezi. A legmagasabb metotrexát koncentráció elérése után a túlélő sejteket Northern- és Southern-folt elemzésnek vetjük alá abból a célból, hogy meghatározzuk a sokszorozás mértékét, és a tenyészet felülúszókat megvizsgáljuk oldható T4 fragmentumok jelenlétére.

Az oldható T4 fragmentumok jellemzésére a tenyészet felülúszóban, számos transzformánst jelzünk metabolikusan (³⁵S) metioninnal. Ezután a sejtlizátumokat és felülúszókat radioimmun-kicsapással és Westemfolt elemzéssel elemezzük, kereskedelmi forgalomban kapható anti-T4 antitesteket alkalmazva. SDS-poliakrilamid gélelektroforézist végzünk a csapadékokon, ahol a T4 kiválasztott, megcsonkított formája kikövetkeztetett relatív molekulatömegének (M_r) csíkját figyeljük meg. Mivel emlős rendszerben szintetizálódik, ez a fehérje megfelelően van glikozilezve és összehajtogatva, azaz diszulfid hidak alakulnak ki. Abból a célból, hogy az oldható T4 fragmentumokat megtisztítsuk a tenyészet felülúszóból, immun-affinitásos oszlopkromatográfiát hajtunk végre, anti-T4 antitesteket alkalmazva. Az oszlophoz kötött fehérjét nagy sókoncentrációnál és alacsony pH-nál eluáljuk. Elvégezzük az eluált anyag SDS-poliakrilamid gélelektroforézisét abból a célból, hogy meghatározzuk az M_r-t és az eluált fehéijefrakció tisztaságát. Ezenkívül radioimmun-kicsapás és Westem-folt elemzést is végzünk abból a célból, hogy tovább jellemezzük az affinitással tisztított anyagot.

Hasonló megközelítéseket alkalmazhatunk baktériumokban, élesztőkben és rovarokban is, hogy oldható T4 fragmentumokat állítsunk elő. Ezenkívül méretben kisebb fragmentumokat is állíthatunk elő, mint az itt leírt fragmentumok, pl. olyanokat, amelyek csak a VjJj-tartományt tartalmazzák.

Vektorok megalkotása

Rekombináns DNS manipulációkat alkalmazva a humán T4 cDNS szekvencia 1-1257 bázispárjait (bp) egy SV40 korai promotor és egy TAA terminációs kodon közé helyeztük, amely utóbbit a szarvasmarha növekedési hormon gén poliadenilező helye követte. A T4 cDNS-nek ez a szekvenciája a T4 receptor vezető és előre jósolt extracelluláris tartományát kódolja. Ezt az sT4 minigént egy humán H-ras-sal, vagy egy egér dihidrofolát reduktáz minigénnel kapcsoltuk, így kaptuk a pST4CH ras, illetve pST4DHFR vektorokat. Ezeket a vektorokat az alábbiak szerint készítettük:

pST4sal megalkotása pST4sal plazmidot két másik plazmidból, a JRT4ből és pUCsT4-ből állítottuk össze. Ezeknek a plazmidoknak a konstrukcióját az alábbiakban részletezzük.

JRT4 plazmid megalkotása

A DSP1 plazmidot (103) Xhol-gyel hasítottuk, az SV40 poliA korai területet kiiktattuk, és az Xhol helyeket DNS polimeráz Klenow-fragmentumot alkalmazva betöltöttük. A szarvasmarha növekedési hormon poliadenilező területet (113) hasítottuk PvuII-vel és Kpnlgyel, és a KpnI helyett tompa végűvé tettük T4 DNS polimerázzal végzett kezeléssel. Ezt a 230 bp-s fragmentumot DSPl-hez ligáltuk, hogy megalkossuk a DSPIBGH-t.

A DSPIBGH-t Smal-gyel és Sall-gyel hasítottuk és a galK kazettát (amely az SV40 korai promotort, a galK kódoló területet és a BGH poliA területet tartalmazta) ligáltuk pUC 19-be (107) a Sáli helynél olyan szintetikus kapcsolót (linkért) alkalmazva, amely tartalmaz egy Sáli helyet, egy Bglll helyet és egy Smal véget. Ez a háromrészes ligálás a DSP1BZBGH.JT plazmidot eredményezte.

A DSPIBZBGH.JT-t, amelyet Stul-gyel és BclIgyel hasítottunk, hogy kiiktassuk a galK kódoló területet, ligáltuk egy 1,7 kb-s EcoRI (betöltött)-BamHI fragmentumhoz, amely a pT4B plazmidból (70) való T4 cDNS-t tartalmazta, így kaptuk a JRT4 plazmidot.

A pUCsT4 plazmid megalkotása

A pT4B plazmidból származó T4 cDNS Haell és Hpall fragmentumát (1125 bp) egy szintetikus kapcsoló alkalmazásával pUC18 vektorhoz ligáltuk, amelyet előzőleg KpnI-gyel és Xbal-gyel hasítottunk. A T4 cDNS Haell végét a pUC18 KpnI helyébe ligáltuk egy olyan szintetikus kapcsolót alkalmazva, amely KpnI véggel és Haell véggel bírt. A T4 cDNS Hpall végét a pUC18 Xbal helyébe ligáltuk egy olyan szintetikus kapcsolót alkalmazva, amely Hpall véggel és Xbal véggel bírt. Ez a kapcsoló beiktatott egy TAA stop kodont is a T4 kódoló terület 1257. nukleotidja után. Az így létrejövő plazmid a pUCsT4.

Abból a célból, hogy a pST4sal plazmidot megalkossuk, a JRT4 plazmidot BglII-vel és Sacl-gyel hasítottuk, és a 959 bp-s fragmentumot (amely tartalmazza az SV40 korai promotort és a T4 cDNS első 602 nukleotidját) izoláltuk. A pUCsT4 plazmidot Sacl-gyel és Xbal-gyel hasítottuk és a 660 bp-s fragmentumot izoláltuk (amely a T4 cDNS-t tartalmazta a 603. és 1257. nukleotidok között, ezt pedig a szintetikus kapcsolóból származó TA kodon követte). Ezt a két fragmentumot DSP1BZBGH JT-be ligáltuk, amelyet előzőleg BglII-vel és Xbal-gyel hasítottunk, hogy az SV40 korai promotort és a teljes hosszúságú T4 kódoló területet kiiktassuk. Az így létrejövő plazmid a pST4sal.

A pST4DHFR megalkotása

Egy BglII-BamHI fragmentumot, amely egy β-globin DHFR kifejező kazettát tartalmazott, a pST4sal BamHI helyébe klónoztuk. A β-globin DHFR kifejező kazetta a következőkből áll: egér β-globin promotor [500 bp-s HincII fragmentum a pPK288 plazmidból (108) 5' végén egy szintetikus kapcsolóval módosítva, hogy tartalmazzon egy Bglll helyett], egér DHFR kódoló terület [735 bp-s HindlII fragmentum (betöltött) a

HU 213 019 Β pSV2-DHFR plazmidból (109)]; Nhel (betöltött)— BamHI (betöltött) SV40 poli A korai terület a DSP 1-ből (103); és egér DHFR terminátor terület [907 bp-s HindlII (betöltött) fragmentum az mDH9 plazmidból (110) 3' végén szintetikus kapcsolóval módosítva, hogy BamHI hely alakuljon ki]. A pST4DHFR plazmid-térképét bemutatjuk.

pST4cHras megalkotása

A pMERcHras plazmidot úgy alkottuk meg, hogy a pSVK plazmidot (111) EcoRV-tel és HindlII-mal (betöltve) hasítottuk, hogy eltávolítsuk a galK területet, és egy 870 bp-s Ndel (betöltött)—Sáli (Mung-bab nukleázzal tompa végűvé tett) fragmentumba ligáltuk, amely tartalmazta a cHras kódoló területet és pSKcHRas plazmidból (112) származott.

Az oldható T4 transzkripciós kazettát a pST4salból egy BglII-BamHI fragmentum útján eltávolítottuk, és a pMERcHras BamHI helyébe (3' felé az SV40 korai poliA-tól) ligáltuk, hogy megalkossuk a pST4cHras-t.

Az oldható T4 (sT4) minigének kifejezése emlős sejtekben pST4cHras kifejezése NIH-3T3 sejtekben pST4cHras plazmidot (10 pg) kalcium-foszfát kicsapási eljárással 10 pg pTKneo plazmiddal, vagyis egy olyan vektorral, amely G418 rezisztenciát ad át, együtt csaptunk ki, 10 pg hordozó DNS (NIH-3T3 genomi DNS) jelenlétében NIH-3T3 sejtekre (5X1O⁵ sejt/60 mm-es tenyésztő lemez koncentrációval beoltva az előző napon). A sejteket a kicsapott DNS-sel inkubáltuk 6 órán át 37 °C hőmérsékleten. A DNS csapadékot eltávolítottuk, és friss tápközeget [DMEM, 5% Nu-Serum (Collaborative Research, Inc., Lexington, Massachusetts)] adtunk a lemezekhez. A sejteket 16 óra múlva tripszinnel kezeltük, három 100 mm átmérőjű lemezre oltottuk, és a fenti tápközegen tartottuk fenn. Kerek telepek (mintegy 50 db lemezenként) tűntek fel 12-14 nap múlva. A transzformált telepek közül 11-et kiválasztottunk, szaporítottunk, majd 5X10⁵ sejt/100 mm-es lemez koncentrációban beoltottuk a fenti tápközeget és 500 pg/ml GENETICIN-t (G418) (Gibco Laboratories, Grand Island, New York) tartalmazó tápközegbe. Mind a 11 klón túlélte a G418 szelekciót (500 pg/ml), és ezeket átvizsgáltuk H-ras (p21) szintekre standard fehérje immunfolt-elemzéssel.

Azokat a kiónokat, amelyek a legnagyobb mértékben fejezik ki a p21-et (mintegy 2 ng p21/pg triton-oldható fehérje), átvizsgáltuk sT4 kifejezésre. Az összefolyó tenyészeteket 18 órán át inkubáltuk ³⁵S-jelzett metioninnal és ciszteinnel. A tenyészet felülúszókat és sejtlizátumokat immun-kicsaptuk T4 (OKT4, OKT4A) és T8 (OKT8) receptorokra fajlagos monoklonális antitestekkel, ras fehérjékre fajlagos poliklonális antitestekkel vagy nem fajlagos egér IgG-vel. Egy mintegy 45 kd-s fehérjét ez az sT4 (kikövetkeztetett mérete) fajlagosan kicsaptunk a tenyésztő tápközegből mindkét, a T4 receptor ellen irányuló monoklonális antitesttel. Az sT4 csík nem figyelhető meg a sejt-lizátumokban. Amint várható, a p21 kicsapódik a sejtből, de nem csapódik ki a tenyészet felülúszókból. Az ezt követő mennyiségi meghatározás azt mutatta a tisztított sT4gyel összehasonlítva, hogy ezek a sejtek viszonylag alacsony szinten termelnek sT4-et, vagyis mintegy százszor kevesebbet, mint a CHO sejtek, amint ezt a 2B. példában leírtuk.

pST4DHFR kifejezése kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben

DXB-11 sejtvonal sejteket, amely egy DHFR hiányos CHO sejtvonal (104), transzfektáltunk kalciumfoszfátos kicsapás segítségével 10-30 pg pSID4DHFR-rel 10 pg hordozó DNS (NIH3T3 genomi DNS) jelenlétében egy nappal a 60 mm-es lemezek 5xl0⁵ sejttel végzett beoltása után. A sejteket a DNS csapadékkal 6 órán át inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, a tápközeget eltávolítottuk, és friss tápközeget (F12, 10%, FBS, 100 egység/ml penicillin és streptomicin) adtunk a lemezekhez. A tápközeget 16 óra múlva ismét cseréltük, és a sejteket további 24 órán át inkubáltuk. A sejteket azután tripszinnel kezeltük, három 100 mm-es lemezre oltottuk és nukleozidmentes tápközegben szelektáltuk (F-12 hipoxantin és timidin nélkül, 10% dializált FBS, és 100 egység/ml penicillin és streptomicin). 7-10 nap múlva tűntek fel telepek (mintegy 100 db lemezként). Az egyes lemezekből telepeket gyűjtöttünk, szaporítottuk, majd átoltottuk 5xl0³ és 5xl0⁴ sejt/üreg koncentrációban 24 üreges tenyésztő lemezek üregeibe, vagy 5xl0⁵ sejt/100 mm-es lemez koncentrációban. A sejteket hagytuk kifejlődni 3 napig a 20 nmól/1 metotrexátot (mtx) tartalmazó nukleozidmentes tápközegben végzett szelekció előtt. Az egyes üregeket vagy kiónokat összefolyáskor vizsgáltuk sT4 kifejezésre, és azokat, amelyeket további szaporításra kiválasztottunk, átoltottuk 24 üreges tenyésztő lemezekre a fentebb leírt sűrűségeknél. A szelekciót nukleozid-mentes tápközegben levő 800 nmól/1 mtx-nél 3 nappal az átoltás után kezdtük. Ezt a szelekciós eljárást megismételtük 8 pmól/1 mtx-nél és 80 pmól/1 mtx-nél végzett szelekcióval.

Számos olyan sejtvonal alakul ki ezt az eljárást alkalmazva, amely oldható T4-et fejez ki minimum 3 pg/sejt/24 óra koncentrációban.

sT4 tisztítása

Kondicionált tápközeget (CM) készítettünk szérummentesen 850 cm²-es gördülő palackokban szaporított letapadó sejttenyészetekből mtx-szelektív körülmények között. Összefolyáskor a sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS) Mg²⁺ és Ca²⁺ nélkül, és a növesztő tápközeget (Ham-féle F12 hipoxantin és timidin nélkül, 10% borjúembrió-szérum, 100 egység/ml penicillin és streptomicin, és mtx a szelektív koncentrációban) helyettesítettük közel azonos tápközeggel, de szérum és mtx nélkül, viszont 2xITS-sel [inzulin, transzferrin és szelén (Collaborative Research, Inc.)] kiegészítve. 24-48 óra múlva a tápközeget eltávolítottuk és szelektív növesztő tápközeggel helyettesítettük. Ezután újból szé24

HU 213 019 Β rummentes tápközeget alkalmaztunk 3-5 napon belül, és ezt a ciklust korlátlanul ismételtük, azaz akár több, mint két hónapon át. A CM-et 8000 g-nál végzett centrifugálással derítettük. PMSF (fenil-metil-szulfonilfluorid) proteáz inhibitort adtunk hozzá 0,5 mmól/1 koncentráció eléréséig, és a CM-et mintegy tizedére koncentráltuk nyomás alatti membránszűréssel. Ezt a koncentrált CM-et 2000 g-vel végzett centrifugálással derítettük és aprotinint, egy proteáz inhibitort (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) adtunk hozzá 5 gg/ml végső koncentrációig. A mintát közvetlenül felhasználtuk vagy -70 °C hőmérsékleten tároltuk.

A koncentrált CM mintát kétszeresére hígítottuk 50 mmól/1 MES-sel [2-(N-morfolino)-etánszulfonsav, (pH 6,0)], és átszűrtük 0,45 mikronos szűrőn. A mintát azután 100 gmól/1 pAPMSF-fel (p-amidino-fenil-metil-szulfonil-fluorid) (CalBiochem-Behring, San Diego, Kalifornia) kezeltük, és 50 mmól/1 MES-sel kiegyensúlyozott S-Sepharose (szulfopropil)-szefaróz (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, New Jersey) oszlopra vittük 1,5-2,0 mg/ml gél fehérjekoncentrációban. A mintát 50 mmól/1 MES-ben (pH 6,0) levő 0-0,5 mól/1 lineáris NaCl-gradienst alkalmazva eluáltuk. Azokat a csúcs-frakciókat, amelyeket mintegy 0,2 mól/1 NaClnél eluáltunk, összegyűjtöttük és 100 gmól/1 koncentrációig pAPMSF-fel kezeltük. Az sT4-et tartalmazó frakciókat SDS-PAGE-vel és immunfolt vizsgálattal igazoltuk. 4 °C hőmérsékleten végzett 1 órás ülepítés után a mintákat 500 mmól/1 bisz-trisz-propánnal {1,3bisz[trisz(hidroxi-metil)-metilamino]-propán} (pH 6,0) szemben dializáltuk.

A mintát 100 mól/1 pAPMSF-fel és 0,1% tio-diglikollal kezeltük (pH 9,0), majd 50 mmól/1 bisz-triszpropánnal (BTP) (pH 9,0) kiegyensúlyozott Q-Sepharose (kvaterner amino-etil)-szefaróz oszlopra (Pharmacia) (5 ml minta/ml gél) vittük fel. Az sT4 minta nem kötődik a Q-Sepharose-hoz, így a nem kötött frakcióból és az oszlop mosófolyadékjából nyerhető ki. A nem kötött mintát azonnal pH 6,0-ra állítottuk be.

Az utolsó lépés 50 mmól/1 foszfátot és 0,15 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal (pH 7,0) kiegyensúlyozott 30 mikronos Superose 12 oszlopon (2,5x46 cm) (Pharmacia) végzett kromatográfia. Az oszlopot 3,0 ml/perc áramlási sebességgel működtettük. 10 ml-es adagokat injektáltunk be, és tételenként a 45 perces csúcsokat gyűjtöttük össze. Az eljárással mintegy 1,0 mg terméket gyűjtöttünk össze 20,0 mg teljes fehérjéből egy olyan sejtvonalról, amely mintegy 3 pg/sejt/nap terméket termel.

Az sT4 jellemzése

Fizikai tulajdonságok

A teljes fehérjekoncentrációt kolorimetriás BCA fehérjevizsgálatot alkalmazva határoztuk meg (bicinkoninsav, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). Az abszolút koncentrációkat kvantitatív aminosavelemzéssel határoztuk meg. A tisztított sT4 mért aminosavösszetételét standard aminosavelemzési technikákkal határoztuk meg, és úgy találtuk, hogy megegyezik a molekulához kikövetkeztetett szekvenciával a kísérleti hibán (+/-19%) belül. Az első 20 gyökön át a szekvencia a jósoltnak felelt meg, azzal az eltéréssel, hogy Lys-Lys-Val-Val szekvenciával kezdődik. így az érett fehérje amino-terminális a +3 helynél kezdődik a jósolt vezető kapcsoló helyhez viszonyítva, és ennél a helynél a megjósolt szekvenciától abban tér el, hogy az Asn helyett Lys-t tartalmaz. Az érett fehérje amino-terminális helye jó egyezésben van az egér- és birka cD4 fehérjék meghatározott terminálisával. Az Asn—>Lys vátozás szekvenciaelemzési hibát (egyedi báziscsere) vagy olyan mutációt képviselhet, amely a rekombináns munkamenetek során alakul ki.

lmmun-epitópok

Az OKT4 és OKT4A monoklonális antitestek felismerik a T4 receptor nem-interferáló felületi epitópjait (114). Ezek az antitestek fajlagosak a natív konformációra annyiban, hogy nem kötődnek redukált, SDS-sel denaturált fehérjéhez immunfoltvizsgálatban. Kimutattuk, hogy mindkét antitest fajlagosan kicsapja az sT4et a ³⁵S-jelzett tenyészet-felülúszókból, az alább leírt immunkicsapási munkamenetet alkalmazva.

ST4-termelő sejtek lxlO⁶ sejt/60 mm-es tenyésztő lemezt tartalmazó tenyészetét 16 órán át 37 ’C hőmérsékleten 1,5 ml, metionintól és ciszteintől mentes, de ITS-t és 170 pCi/ml (³⁵S) metionint és 30 pCi/ml (³⁵S) ciszteint (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Kalifornia) tartalmazó F12 tápközegben tartottuk. A derített tápközeget (100 pl) hígítottuk azonos térfogatú kicsapó pufferral [10 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 7,5), 100 mmól/1 NaCal, 0,1% NP-40, 0,5% sovány tejpor], és 3 pg nyúl IgG-vel inkubáltuk 15 percen át 4 °C hőmérsékleten, majd 30 μΐ-es (csomagolt térfogat) „A” fehérje Sepharose gyökökkel (Pharmacia P-L Biochemicals) inkubáltuk 30 percig 4 ’C hőmérsékleten. Az előderített felülúszót 5 pg OKT4-gyel, OKTA-val vagy OKT8-cal (beszerezhető: Rao P„ Ortho Pharmaceutical Corp., Raritan, New Jersey), egér IgG-vel (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania), illetve nyúl antiegér IgG-vel (Cooper Biomedical) inkubáltuk 30 percig 4 ’C hőmérsékleten. Az OKT4-t, OKT4A-t, OKT8t, egér IgG-t és nyúl anti-egér IgG-t 20 μΐ-es (csomagolt térfogat) „A” fehérje Sepharose gyöngyökkel 30 percig 4 ’C hőmérsékleten végzett inkubálással kicsaptuk. A kicsapást követően a gyöngyöket kétszer mostuk 200 pl kicsapó pufferral és egyszer mostuk 200 pl olyan kicsapó pufferral, amely ΝΡ-40-et és sovány tejport nem tartalmazott. A mosott gyöngyöket 5 percen át forraltuk 20 pl minta-pufferben [125 mmól/1 Trisz.HCl (pH 6,8), 20% glicerin 1,4 mól/1 β-merkapto-etanol], és a felülúszókat 12,5% SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elemeztük. Hasonló eredményeket kaptunk OKT4B-vel, OKT4C-ve), OKT4D-vel, OKT4E-vel, OKT4F-fel és más, T4-re fajlagos monoklonális antitestekkel (Mab). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az sT4 konformációja pontosan utánozza a T4 receptor felületi tartományát.

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon az sT4 társul-e a HÍV gpl20-szal, és vajon ez a társulás gátolja-e a HÍV kötéseit T4 sejtekhez, mintegy 5 pg tisztított sT425

HU 213 019 Β et abszorbeáltunk Sepharose OKT4-gyel vagy kontroll antitestekkel burkolt gyöngyökre. A gyöngyöket azután ³⁵S-metioninnal jelzett HÍV lizátumával kevertük össze. Az sT4-nek OKT4-gyel képzett komplexe csak a 120 kD-s burkolati glikoproteinnel együtt csapódik ki. Vírusfehérjék nem csapódnak ki az OKT4 gyöngyökkel sT4 távollétében vagy nem transzformált CHO sejtekből származó kontroll felülúszók jelenlétében. Ezenkívül vírusfehérje nem csapódik ki, ha kontroll egér immunglobulinnal (OKT4-hez illeszkedő izotípus) burkolt Sepharose gyöngyöket inkubálunk sT4-gyel.

Ezek a vizsgálatok azt jelzik, hogy a kapott sT4, amely mentes más, T limfociták felületén jelenlevő sejtfelületi komponensektől, képes fajlagosan társulni az AIDS-vírus burok glikoproteinjével.

Citofluorometriát végeztünk annak kimutatására, hogy a T4 kölcsönhatása ép HÍV gpl20-ával megszünteti az AIDS-vírus kötődését a T4⁺ sejtek felületéhez. T4⁺ CEM sejtekhez HIV-t adtunk sT4 jelenlétében vagy anélkül. A vírusabszorpciót követően a sejteket mostuk, fluoreszceinnel konjugált anti-HIV antitesttel kezeltük és áramlásos citrometriával (17. ábra) elemeztük (48). sT4 távollétéban a HÍV hatékonyan kötődött a T4⁺ CEM sejtekhez. Ha HIV-t inkubáltunk sT4-gyel, a vírus T4⁺ sejtekhez való kötődése megszűnik (17. ábra). 10 ng tisztított sT4 elegendő 100 ng vírusfehérje kötésének gátlásához. Ha a burok glikoprotein a teljes vírusfehérje 5%-át tartalmazza, a T4 becsült 5:1 mólaránya gP 120-hoz elegendő a HÍV T4⁺ sejtekhez való kötésének teljes gátlására.

Tanulmányoztuk az sT4-nek azt a képességét is, hogy gátolja a T4⁺ sejtek fertőzését HIV-vel. Fitohemagglutinin-stimulált humán limfocitákhoz HlV-inokulum tízszeres sorozat hígításait adtuk sT4 jelenlétében vagy anélkül, mostuk, és mikrotenyészetbe vittük. A fertőzött tenyészetek gyakoriságát immunassayt alkalmazva határoztuk meg 4, 8 és 12 nappal a vírus hozzáadása után (47). Ezen a módon meghatároztuk a fertőző vírus-titert (ID-50), amely annak a hígításnak a reciproka, amely ahhoz szükséges, hogy a kezelt sejttenyészetek 50%-a a 12. napon fertőzött legyen. sT4 távollétéban a vírus-inokulummal megfigyelt ID-50 értéke mintegy 10⁵Á8 pg/ml tisztított oldható T4 jelenlétében azonban a fertőzőképesség csaknem 4 logaritmikus értékkel csökken egészen 10^{l 5}-ig (18. ábra). Ezt a drámai csökkenést a HÍV fertőzöttségben a fertőzés teljes menetében megfigyeltük. A nem fajlagos gátláshoz vagy az sT4 toxikus hatásaihoz való kontrollként sT4-et adtunk a tenyészethez 18 órával a vírus hozzáadása után. Az sT4-gyel 18 órával a fertőzés után kezelt tenyészetek csak 1 lóg gátlást mutatnak az ID50-ben, ami valószínűleg a vírus elterjedésének gátlásából ered. így a 4 lóg csökkenés, amely a vírus fertőzőképességében megfigyelhető volt, amikor a vírust sT4-gyel előinkubáltuk, valószínűleg abból ered, hogy az sT4 fajlagosan asszociálódik gpl20-szal a vírus felületén. Ezek a részecskék ennél fogva már nem képesek kölcsönhatásba lépni a T4 receptorral a sejt felületén. 4 lóg gátlást figyelünk meg, amikor 10⁵ fertőző részecske/ml-t előinkubáltunk 8 pg/ml sT4-gyel. A 10⁵ fertőző részecske/ml-es víruskészítményről úgy becsültük meg, hogy 10⁹ részecske/ml-t tartalmaz. Ha minden egyes részecske 1000 burok glikoproteint tartalmaz, akkor a gátlásra 100 T4 molekula/burok fehérje molekula arányt kapunk.

A szerkezetileg ép sT4 viszonylag nagy mennyiségének hozzáférhetősége lehetővé teszi, hogy a T4 és az antigén-adó sejtek felülete, valamint a HIV-vírus közötti kölcsönhatások mechanizmusát tanulmányozzuk. A T4⁺ segítő (helper) sejtek és az antigén-adó sejtek (B sejtek és makrofágok) közötti kölcsönhatás fajlagossága legalábbis részben abból eredhet, hogy a T4 II. osztályú MHC molekulákkal asszociálódik (105, 106). A tisztított sT4 jelentős mennyiségének hozzáférhetősége lehetővé teszi a T4 és a Π. osztályú MHC molekulák fizikai asszociálódásának közvetlen demonstrálását.

Az sT4-nek az a képessége, hogy kötődik a gpl20hoz és in vitro gátolja a vírusfertőzést, jelzi, hogy az sT4 hatékony vírusellenes szer AIDS-betegek kezeléséhez.

4. példa

T4 oldható V1V2J4 fragmentumának előállítása

Vektorok megalkotása pST4BBVlDHFR megalkotása

A pST4DHFR plazmidot (amelyet a 3. példában írtunk le) hasítottuk EcoRI-gyel és Xbal-gyel, és a kisebbik fragmentumot, amely az sT4 kódoló területet tartalmazza, kiiktattuk. Az sT4sal plazmidot Xbal-gyel és BbvI-gyel hasítottuk, és egy 1120 bázispáros kódoló fragmentumot izoláltunk, amely az oldható T4 szekvenciát tartalmazza a vezető terület nélkül. Ezt a fragmentumot az EcoRI/Xbal-gyel hasított pST4DHFRhez ligáltuk, EcoRI véggel, KpnI hellyel és Bbvl véggel ellátott szintetikus kapcsolót alkalmazva. Ez a fragmentum illeszkedik a fentebb izolált sT4 fragmentumon levő Bbvl túlnyúláshoz. Az így létrejött plazmidot pST4BBVIDHFR-nek nevezzük.

OMPAST4 megalkotása

Az OMPA.GS plazmidot Ncol-gyel és Sall-gyel emésztettük és a kisebbik fragmentumot, amely a kapcsoló területet tartalmazza, kiiktattuk. Az OMPA.GS a pASI származéka [(123); US 4 578 355 számú szabadalmi leírás], amely egy szintetikus szekvenciát tartalmaz a cll riboszóma kötő szekvencia 3' végénél levő Ndel helybe inszertálva. A szintetikus szekvencia az OMPA vezetőt tartalmazza, amelyet egy többszerepű (multilinker) szekvencia követ. A szintetikus szekvencia lényegében az alábbi:

5' -T ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG

ATT	GCA	GTG	GCA	CTG	GCT	GGT	TTC	GCT
ACC	GTA	GCG	CAG	GCC	GGC	TCT	AGA	GTC
GAC	CTA	GTT	AAC	TAG-	-3'

A pUCsT4 plazmidot Ncol-gyel és Sall-gyel hasítottuk, és az 1149 bázispáros fragmentumot, amely az SCD-4 szekvenciát (T-4 nukleotidok 124.-1257. között) tartalmazza, izoláltuk. Ezt a fragmentumot ligáltuk az NcoI/Sall-gyel hasított DMPA.GS-hez, így az OMPAST4-et kaptuk.

HU 213 019 Β

Az OMPAST4BbvI megalkotása

Az OMPAST4 plazmidot Nael-gyel és Xbal-gyel hasítottuk. Az ebből a hasításból származó kisebbik fragmentumot, amely az sT4 kódoló területet tartalmazza, kiiktattuk. Az ST4BBVIDHFR plazmidot KpnI-gyel hasítottuk, és az így létrejövő 3' túlnyúló véget tompává tettük T4 DNS polimerázzal. A tompa végű DNS-t azután Xbal-gyel elhasítottuk, és az 1124 bázispáros fragmentumot izoláltuk, amely a CT4 cDNS 145.-1257. nukleotidját tartalmazza. Az izolált fragmentumot az Nael/Xbalgyel hasított OMPST4 plazmidhoz ligáltuk, ilyen módon az OMPASTI4BbvI plazmidot kaptuk.

A pucST4l84 megalkotása

EGy, a T4 cDNS-ből származó EcoRI-Nhel fragmentumot [682 bp-s fragmentum, amely a (-23) és (+178) közti aminosavakat kódolja] ligáltunk az sk727/725 szintetikus kapcsolóhoz (Nhel és Aval végek) az Nhel helynél. (Az sk727/725 a T-4 179.-185. aminosavait kódolja). Az sk727/725 Aval végeit a pucST4 Aval-Xbal fragmentumához ligáltuk (ez a humán cDNS 1198-1257. bp-jét tartalmazza és a T4 receptor 351 -369. aminosavait kódolja, a kódoló szekvenciát TAA terminációs kodon követi). Ezt a szekvenciát, amelyet EcoRI és Xbal végek határolnak, pUC 19-be inszertáltuk a pUC19 polilinkerben (sk727/725) levő EcoRI és Xbal végeknél. Az sk727/725 összetétele lényegében az alábbi:

5' GACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAAC-3'

GTC TTC CTCCTCCACGTTAACGATCACAAGCC TAACTGACGGTTGAGC-5' pucST4106 megalkotása

T4 cDNS EcoRI-AvalI fragmentumát [amely az

1.-413. bp-t tartalmazza és a (-)25.-87. aminosavakat kódolja] összekapcsoltuk az sk791-792 szintetikus kapcsolóval (Avaii-Aval végek) az Avall helynél. Az sk791-792 Aval végét a pucST4 Aval-Xbal fragmentumához ligáltuk (ez a fragmentum a humán cDNS 1198.-1257. bp-ját tartalmazza és a T4 receptor 351,369. aminosavait kódolja, és a kódoló szekvenciát egy TAA terminációs kodon követi). Ezt a szekvenciát, amelyet EcoRI és Xbal szegélyez, pUC19-be inszertáltuk a puC19 polilinkerben levő EcoRI és Xbal végeknél. Az sk791/792 lényegében az alábbi összetételű: 5'-GACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGACTGCCAAC

GTCTTCCTCCTCCACGTTAACGATCACAAGCCTAAC TGACGGTTGAGC-5' pT4184DHFR megalkotása

A pucST4184 EcoRI-Xbal fragmentumát (amely a 25.-183. aminosavakat kódolja a 355.-373. aminosavakhoz fuzionálva) ligáltuk a psT4DHFR EcoRI és Xbal végeihez az sT4-et kódoló EcoRI-Xbal fragmentum helyett.

sT4106DHFR megalkotása

A pucST4106 egy EcoRI-Xbal fragmentumát (amely a 23.-106. aminosavakat kódolja a 351.-369.

aminosavakkal fuzionálva) a psT4DHFR EcoRI és Xbal végeihez ligáltuk az sT4-et kódoló EcoRI-Xbal fragmentum helyett.

pST4184DHFR kifejezése kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben

DXB-11 sejteket, vagyis egy DHFR-hiányos CHO sejtvonalat (116) kalcium-foszfátos kicsapási eljárással 10-30 pg pST-4184DHFR-rel 10 pg hordozó DNS (NIH-3T3 genomikus DNS) jelenlétében transzfektáltunk, egy nappal a 60 mm-es lemezek 5X1O⁵ sejttel történt átoltása után. A csapadékot 6 óra múlva eltávolítottuk, és olyan FI 2 tápközeggel helyettesítettük, amelyben nem volt hipoxantin vagy timidin, viszont 10% dializált borjúembrió-szérumot tartalmazott. 16 napon belül telepek tűntek fel (mintegy 100 darab lemezként). Az egyes lemezekről telepeket gyűjtöttünk, szaporítottuk, majd 3xl0⁴ sejt/üreg mennyiségben 24 üreges tenyésztő lemez üregeibe oltottuk. Ezeket a sejteket nukleozid-mentes tápközegben növesztettük, amely 80 nmól/1 metotrexátot (mtx) tartalmazott, hogy szelektáljunk a transzfektált dhfr és V1V2J4 minigén lehetséges sokszorozására. 8 nmól/1 mtx-ben két hét múlva világosan láthatók voltak az aktívan növekvő sejtek. Egyedi üregeket vagy kiónokat vizsgáltunk összefolyáskor a deléciós mutáns kifejezésére, és azokat, amelyeket a további sokszorozáshoz kiválasztottunk, 24 üreges tenyésztő lemezek üregeibe oltottuk a fentebb leírt sűrűséggel. Sok olyan alpopulációt, amely magas szinten fejezte ki a VlV2J4-et, növesztettünk mtx fokozódó szintjeiben abból a célból, hogy szelektáljunk a dhfr átírási egység és a T4184s (V1V2J4) minigén további sokszorozódására.

Ezt az eljárást alkalmazva számos sejtvonal jött létre, amelyek legalább 2 pg/sejt/24 óra mennyiségben fejezik ki a deléciós mutánst. Kondicionált tápközeget (CM) készítettünk szérummentesen tapadó sejtekből, amelyek 850 cm² felületű gördülő palackokban szaporodnak mtx szelektív körülmények között. A felület beszövése után a sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldattal (PBS), amely Mg²⁺-t és Ca²⁺-t nem tartalmazott, és a növesztő tápközeget (Ham-féle FI 2 tápközeg hipoxantin és timidin nélkül, de 10% boíjúembriószérummal, 100 egység/ml penicillinnel és sztreptomicinnel és a szelektív koncentrációt biztosító mtx-szel) helyettesítettük lényegében azonos tápközeggel, amely azonban nem tartalmazott szérumot és mtx-et, viszont tartalmazott lxITS-t [inzulin, transzferrin és szelén (Collaborative Research Inc.)]. 24-48 óra múlva a tápközeget eltávolítottuk és szelektív növesztő tápközeggel helyettesítettük.

Ezután ismét szérummentes tápközeget alkalmaztunk 3-5 napig, és ezt a ciklust ismételtük korlátlanul, pl. több, mint 2 hónapon át. A CM-et 8000 g-vel végzett centrifügálással tisztítottuk. PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluorid) proteázgátlót adtunk hozzá 0,5 mmól/1 koncentrációig, és a CM-et mintegy tizedére koncentráltuk nyomás alatti membránszűréssel. Ezt a koncentrált CM-et azután 2000 g-nél végzett centrifügálással derítettük, és aprotinin proteáz inhi27

HU 213 019 Β bitort (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) adtunk hozzá 5 μg/ml végső koncentrációig. A mintát közvetlenül feldolgoztuk vagy -70 °C hőmérsékleten tároltuk.

Westem-folt elemzés

VlV2J4-termelő sejtekből származó kondicionált tápközeget koncentráltunk és 15%-os poliakrilamid redukáló gélen futtattuk. A fehérjét nitrocellulóz papírra vittük át, és denaturált E. coli eredetű T-4-NSI fúziós molekula ellen kialakított poliklonális antiszérummal átvizsgáltuk. Ez az antiszérum fajlagosan felismer egy V1V2J4 dublettet, amely mintegy 25 kDnél vándorol. Ez megfelel a vezető feldolgozása utáni V1V2J4 kódoló szekvencia megjósolt méretének. A dublettképződés fizikai alapja nem ismeretes. Nem valószínű, hogy ez az N-kapcsolt glikozilezésben levő különbségekből ered, mivel a T4-ben levő két konszenzus szekvencia ehhez a glikozilezéshez a VlV2J4-ben nincs jelen.

Immun-epitópok

Az OKT4 és OKT4A, OKT4B, OKT4C, OKT4D, OKT4E és OKT4F monoklonális antitestek fajlagosan felismerik a natív, membránkötött T4 receptoron levő felületi epitópokat (114). Ezek az antitestek fajlagosak a natív konformációra, amennyiben nem kötődnek a redukált, SDS-sel denaturált fehérjéhez immunfoltelemzésekben. Kimutattuk, hogy mindkét antitest fajlagosan kicsapja a VlV2J4-et a ³⁵S-jelzett tenyészet felülúszóból az alábbi immunkicsapási eljárást alkalmazva.

VIV2J4 termelő sejtek tenyészeteit, amelyek lxlO⁶ sejtet tartalmaztak 60 mm-es tenyésztő lemezenként, inkubáltuk 16 órán át 37 °C hőmérsékleten 1,5 ml, metionintól és ciszteintől mentes FI2 tápközegben, amely ITS-t és 170 pCi/ml [³⁵S] metionint és 30 pCi/ml [³⁵S] ciszteint (ICN Bioedicals, Inc., Costa Mesa, Kalifornia) tartalmazott. A derített tápközeget (100 μΐ) azonos térfogatú kicsapó pufferral [10 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 7,5); 100 mmól/1 NaCl, 0,1% NP—40; 0,5% sovány tejpor] hígítottuk, és 3 μg nyúl IgG-vel inkubáltuk 15 percen át 4 °C hőmérsékleten, ezt követően pedig 30 μΐ (csomagolt térfogat) „A” fehérje-Sepharose gyöngyökkel (Pharmacia P-L Biochemicals) inkubáltuk 30 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az előderített felülúszót 5-5 μg fentebb említett OKT4 antitesttel, egér IgG-vel (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania) vagy nyúl anti-egér IgG-vel (Cooper Biomedical) inkubáltuk 30 percen át 4 °C hőmérsékleten. Az OKT4 antitestek 20 μΐ (csomagolt térfogat) ,A” fehérje-Sepharose gyöngyökkel 30 percen át 4 °C hőmérsékleten történt inkubálással. A kicsapást követően a gyöngyöket kétszer mostuk 200 μΐ kicsapó-pufferral és egyszer olyan kicsapó-pufferral, amely nem tartalmazott ΝΡ-40-et és sovány tejport. A mosott gyöngyöket 5 percig forraltuk 20 μΐ minta-pufferban [ 125 mmól/1 Trisz-HCI (pH 6,8), 20% glicerin, 1,4 mól/1 β-merkapto-etanol], és a felülúszót 12,5% SDS-poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel elemeztük. Az OKT4 kivételével az összes monoklonális antitest fajlagosan kicsapja a VI V2J4-et a ³⁵S-sel jelzett tenyészet felülúszókból.

HIV-kötés versengés

A V1V2J4 felismerése az OKT4A révén azt jelzi, hogy a V1V2J4 gátolhatja az AIDS-vírus kötődését a fogékony sejtekhez. CM-et, amely vagy tartalmazott VlV2J4-et, vagy nem, alkalmaztunk a kezdeti vizsgálatokban. A HIV-t a CM-mel inkubáltuk, és a vírus-kötést a T4⁺ CEM sejtvonalhoz mennyiségileg értékeltük egy FITC-konjugált, anti-HIV antitesttel és FACS (fluoreszcenciával aktivált sejtosztályozó) elemzéssel, amint ezt McDougal és munkatársai leírták (47). A V1V2J4 termelő sejtvonalból származó CM a hígítástól függő mértékben gátolta a HIV-kötést, míg válasz nem volt látható a megfelelő nemtermelő (DXB-11) sejtekből való CM-mel.

A V1J4 fehérje hasonlóképpen kifejeződik CHO sejtekben. Ezekben az előzetes kísérletekben azonban a fehérje nyilvánvalóan nem jut ki a tápközegbe. Más tanulmányokra támaszkodva, amelyek azt mutatják, hogy a más rekombináns organizmusokban termelt V1J4 köti az OKT4A-t, úgy tűnik, hogy az emlős sejttenyészetben kifejezett VIJ4 gátolja a HIV-kötést.

5. példa

Anti-oldható T4 fragmentum antitestek előállítása hetes Balb/c egereket injektáltunk intraperitoneálisan 50 pg találmány szerinti, tisztított oldható T4 fragmentummal (a fentebb leírtak szerint előállítva), komplett Freund adjuvánsban 1:1 arányban. Az egereknek azután emlékeztető oltást adtunk hetenként inkomplett Freund adjuvánssal kevert oldható T4 fragmentummal, és vérmintát vettünk a farokvénán keresztül. A szérumok immunglobulin részét ammóniumszulfátos kicsapással kaptuk, és fajlagos anti-oldható T4 fragmentum antitesteket tisztítottunk affinitás-kromatográfiával immobilizált T4 fragmentumot alkalmazva.

6. példa

Oldható T4 fragmentum anti-idiotipikus antitestek

Szingenikus és kongenikus egereket injektáltunk intraperitoneálisan 50 pg, az 5. példa szerint előállított, tisztított, találmány szerinti anti-oldható T4 fragmentum antitesttel, komplett Freund-féle adjuvánsban és hetenként emlékeztető oltást adtunk inkomplett Freund-féle adjuvánsban levő anti-oldható T4 fragmentum antitesttel. 4, 3 és 2 nappal a fúzió előtt az egerek intravénás emlékeztető oltást kaptak, 50 pg immunglobulinnal fiziológiás konyhasóoldatban. Ezután splenocitákat fuzionáltunk P3X63 Ag8-653 nem-kiválasztó mielóma sejtekkel korábban leírt és a szakterületen ismert eljárások szerint. Két héttel később a hibridóma felülúszókat radioimmunvizsgálattal átvizsgáltuk anti-oldható T4 fragmentum antitest elleni kötő aktivitásra. A pozitív kiónokat azután megvizsgáltuk azon képességükre, hogy kötődnek humán immunhiány-vírus burok glikoproteinhez az AIDS-vírushoz. Egy másik eljárás szerint az „egylépéses” eljárást al28

HU 213 019 Β kalmazva egereket injektáltunk intraperitoneálisan komplett Freund-féle adjuvánsban levő oldható T4 fragmentummal, intravénás emlékeztető oltásokat adtunk fiziológiás konyhasóoldatban evő oldható T4 fragmentummal, és az egér lépsejteket a fentiek szerint mielómákkal fuzionáltuk. Ezután a hibridóma felülúszókat közvetlenül vizsgáltuk oldható T4 fragmentum antiidiotipikus antitestekre.

Az alábbiakban megadtuk azokat az irodalmi helyeket, amelyekre a leírás közben hivatkoztunk.

Irodalmi hivatkozások . E. L. Reinherz et al., „Discrete Stages of Humán Intrathymic Differentiation: Analysis of Normál Thymocyte and Leukemic Lymphoblasts of T Cell Lineage”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1588— 1592(1980).

2. E. L. Reinherz and S. F. Schlossman, „The Differentiation and Function of Humán T Lymphocytes”, Cell 19, 821-827(1980).

3. M. L. Blue et al., „Coexpression of T4 and T8 on Peripheral Blood T Cells Demonstrated by Two-color Fluoroescence Flow Cytometry”, J. Immunoi. 134, 2281-2286(1985).

4. E. G. Engleman et al., „Activation of Humán T Lymphocyte subsets: Helper and Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize and Respond to Distinct Histocompatibility Antigens”, J. Immunoi, 127, 2124-2129(1981).

5. A. M. Krensky et al., „Long-term Humán Cytolytic T-cell Lines Allospecific fór HLA-DR6 Antigén Are OKT4⁺”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2365-2369(1982).

6. S. C. Meuer, S. F. Schlossman and E. Reinherz, „Clonal Analysis of Humán Cytotoxic T Lymphocytes T4⁺ and T8⁺ Effector T Cells Recognize Products of Different Major Histocompatibility Complex Regions”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4395-4399 (1982).

7. W. E. Biddison et al., „Possible Involvement of the OKT4 Molecule in T Cell Recognition of Class II HLA Antigens”, J. Exp. Med. 156, 1065-1076 (1982).

8. D. R. Wilde et al., „Evidence Implicating L3T4 in Class II MHC Antigén Reactivity Monoclonal Antibody GK 15 (Anti-L3T4) Blocks Class II MHC Antigen-Specific Proliferation, Release of Lymphokines and Binding by Cloned Murine Helper T Lymphocyte Lines”, J. Immunoi. 131, 2178— 2183 (1983).

9. S. L. Swain, „T Cell Subsets and the Recognition of MHC Class”, Immunoi. Rév. 74, 129-142 (1983).

10. Y. Thomas et al., „Functional Analysis of Humán T Cell Subsets Defined by Monoclonal Antibodies. IV. Induction of Suppressor Cells Within the OKT4⁺ Population”, J. Exp. Med. 154, 459-467 (1981).

11. E. G. Engleman et al., „Antibodies to Membráné Structures that Distinguish Suppressor/Cytotoxic and Helper T Lymphocyte Subpopulations Block the Mixed Leukocyte Reaction in Mán”, J. Exp.

Med. 154, 193-198 (1981).

12. P. Marrack et al., „The Major Histocompatibility Complex-restricted Antigén Receptor on TCells. II. Role of the L3T4 Product”, J. Exp. Med. 158, 1077-1091 (1983).

13. L. Rogozinski et al., „The T4 Surface Antigén is Involved in the Induction of Helper Function”, J. Immunoi. 132, 735-739 (1984).

14. S. L. Swain, „Significance of Lyt Phenotypes: Lyt2 Antibodies Block Activities of T Cells that Recognize Class I Major Histocompatibility Complex Antigens Regardless of Their Function”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7101-7105 (1981).

15. U. Landegren et al., „Selective Inhibition of Humán T Cell Cytotoxicity at Levels of Target Recognition of Initiation of Lysis by Monoclonal OKT3 and Leu-2a Antibodies”, J. Exp. Med. 755, 15791584(1982).

16. R. M. Zinkernagel and P. C. Doherty, „MHCrestricted Cytotoxic T Cells: Studies on the Biological Role of Polymorphic Major Transplantation Antigens Determining T Cell Restriction, Specificity, Function, and Responsiveness”, Adv. Immunoi. 27, 52-177(1979).

17. J. Kappler et al., „The Major Histocompatibility Complex-Restricted Antigén Receptor on T Cells in Mouse and Mán: Identification of Constant and Variable Peptides”, Cell 35, 295-302 (1983).

18. O. Acuto et al., „The Humán T Cell Receptor: Appearance in Ontogeny and Biochemical Relationship of Alpha and Béta Subunits on IL-2 Dependent Clones and T Cell Tumors”, Cell 34, 717-726 (1983).

19. P. Kavathas et al„ „Isolation of the Gene Coding fór the Humán T Lymphocyte Antigén Leu-2 (T8) by Gene Transfer and cDNA Subtraction”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7688-7692 (1984).

20. D. R. Littman et al., „The Isolation and Sequence of the Gene Encoding T8: A Molecule Defining Functional Classes of T Lymphocytes”, Cell 40, 237-246(1985).

21. V. P. Sukhatma et al., „The T Cell Differentiation Antigén Leu-2/T8 is Homologous to Immunoglobulin and T Cell Receptor Variable Regions”, Cell 40, 5Ü\-5&1 (1985).

22. S. M. Friedman et al., „OT-CLL: A Humán T Cell Chronic Lymphocytic Leukémia Thet Produces IL-2 in High Titer”, J. Immunoi. 128, 935-940 (1982).

23. D. A. Thurley-Lawon, L. Chess and J. L. Strominger, „Suppression of In Vitro Epstein-Barr Infection: A New Role fór Aduit Humán T Cells”, J. Exp. Med. 146, 495-508 (1977).

24. J. W. Goding, „The Chromic Chloride Method of Coupling Antigens to Erythrocytes: Definition of Somé Important Parameters”, J. Immunoi. Methods 10, 61-66(1986).

25. F. L. Graham and A. J. van dér Eb, „A New

HU 213 019 Β

Technique fór the Assay of Infectivity of Humán Adenovirus DNA”, Virology 52, 456-467 (1973).

26. M. Wigler et al., „Biochemical Transfer of Single-Copy Eucaryotic Genes Using Totál Cellular DNAas Donor”, Cell 14, 725-731 (1978).

27. M. Wigler et al., „Transfer of Purified Herpes Vírus Thymidine Kinase Gene to Cul-tured Mouse Cells”, Cell 11, 223-232 (1977).

28. J. M. Chirgwin et al., ,Jsolation of Biologically

Active Ribonucleic Acid front Sources Enriched in Ribonuclease”, Biochemistry 18, 5294-5299 (1979).

29. H. Aviv and P. Leder, „Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic Acid-Cellulose”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972).

30. T. Huynh, R. A. Young and R. W. Davis, „Construction and Screening cDNA Libraries in gtlO and gtl 1”, DNA Cloning Techniques-A Practical Approach, D. M. Glover, ed. (Oxford: IRL Press), in press.

31. T. Maniatis et al„ „The Isolation of Structural Genes from Libraries of Eucaryotic DNA”, Cell 75, 687-701 (1978).

32. Μ. M. Davis et al., „Cell-Type-Specific cDNA Probes and the Murine I Region: the Localization and Orientation of A^d Alpha”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2194-2198(1984).

33. T. Maniatis, E. F. Fritch and J. Sambrook, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) (1982).

34. P. W. J. Rigby et al., ,Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity In Vitro by Nick Translation with DNA Polymerase I”, J. Mól. Bioi. 773, 237-251 (1977).

35. J. Vieira and J. Messing, „The pUC Plasmids, an M13mp7-Derived System fór Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers”, Gene 79, 259-268 (1982).

36. F. Sanger, S. Nicklen and A. Coulson, „DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

37. E. Southern, „Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gél Electrophoroesis”, J. Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975).

38. G. M. Church and W. Gilbert, „Genomic Sequencing”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991-1995 (1984).

39. R. H. Scheller et al., „A Family of Genes that Codes fór ELH, a Neuropeptide Eliciting a Stereotyped Pattern of Behaviour in Aplysia”, Cell 28, 707-719(1982).

40. K. Zinn, D. DiMaio and T. Maniatis, „Identification of Two Distinct Regulatory Regions Adjacent to the Humán Beta-Interferon Gene”, Cell 34, 865879(1983).

41. C. Terhorst et al., „Further Structural Studies of the Heavy Chain of HLA Antigens and Its Similarity to Immunoglobulins”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4002-4006 (1977).

42. J. A. Hedo, L. C. Hamson and J. Roth, „Binding of Insulin Receptora to Lectins: Evidence fór Common Carbohydrate Determinants on Several Membráné Receptora”, Biochemistry 20, 33853393(1981).

43. U. K. Laemmli, „Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4”, Natúré 227, 680-685 (1970).

44. R. Mann, R. C. Mulligan, and D. Baltimore, Construction of a retrovírus packagig mutant and its use to produce helper-free defective retrovírus, Cell 33, 153-159(1983).

45. F. Barre-Sinoussi, et al., Isolation of a T lymphotropic retrovírus from a patient at risk fór acquired immuné deficiecny syndrome (AIDS), Science 220, 868-871 (1983).

46. J. S. McDougal, et al., Cellular tropism of the humán retrovírus HTLV-III/LAV I. Role of T cell activation and expression of the T4 antigén, J. Immol. 735, 3151-3162(1985).

47. J. S. McDougal, et al„ Immunoassay fór the detection and quantitation of infectious humán retrovirus, lymphadenopathy-assoicated vírus (LAV), J. Immunoi. Meth. 76, 171-183 (1985).

48. J. S. McDougal, et al., Binding of HTLV-III/LAV to T4⁺ T cells by a complex of the 110K viral protein and the T4 molecule, Science 237, 382-385 (1986).

49. C. B. Reimer, et al., Standardization of ligand binding assays fór alpha-fetoprotein. In Immunofluorescence and Related Staining Techniques. W„ Knapp, K. Holubar, and G. Wick, eds. (Amserdam.Elsevier/North Holland Press) p. 189 (1978).

50. Μ. B. Wilson and P. K. Nakane, Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. In Immunofluorescence and Relating Staining Techniques, W. Knapp, K. Holubar, and G. Wick, eds. (Amsterdam :Elsevier/North Holland Press), p. 215 (1978).

51. J. Porath, R. Axen, and S. Ermback, Chemical coupling of proteins to agar, Natúré 275, 1491— 1493 (1967).

52. B. J. Poiesz, et al., Detection and isolation of type C retrovírus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T cell lymphoma. Proc; Natl. Acd. Aci. USA 77, 74157419 (1980).

53. P. Clapham, K. Nagy, and R. A. Weiss, Pseudotypes of humán T-cell vírus types 1 and 2: Neutralization by pateints’ sera, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2886-2889 (1984).

54. A. G. Dalgleish, et al., The CD4 (T4) antigén is an essential component of the receptor fór the AIDS retrovírus, Natúré 372, 763-766 (1984).

55. M. Popovic, et al., Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retorviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and PreAIDS, Science 224, 497-500 (1984).

56. K. Nagy, et al., Humán T-cell leukémia vírus type

HU 213 019 Β

1: induction of sycytia and inhibition by patients’ sera, Int. J. Cancer 32, 321-328 (1983).

57. D. M. Neville and H. Glossman, Molecular weight determination of membráné protein and glycoprotein subunits by discontinuous gél electrophoresis in dodecyl sulfate, Methods Enzymol. 32, 92102(1974).

58. A. Helenius, et al., On the entry of Semliki Forest vírus intő BHK-21 cells, J. Cell. Bioi. 84, 404-420 (1980).

59. R. D. Cone and R. C. Mulligan, High-efficiency gene transfer intő mammalian cells: Generation of helper-ffee recombinant retroviruses with broad mammalian hőst rangé, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6349-6353(1984).

60. F. W. Alt et al., „Probes fór Specific mRNAs by Subtractive Hybridization: Anomalous Expression of Immunoglobulin Genes”, in Eucaryotic Gene Reguládon, R. Axel, T. Maniatis and C. F. Fox, eds. (New York: Academic Press), pp. 407-419 (1979).

61. M. Kozák, „Comparison of Initiation of Protein Synthesis in Procaryotes, Eucaryotes and Organelles”, Mierobiol. Rév. 47, 1-45 (1983).

62. L. Hood, M. Kronenberg and T. Hunkapiller, „T Cell Antigén Receptors and the Immunoglobulin Supergene Family”, Cell 40, 225-229 (1985).

63. S. Tonegawa, „Somatic Generation of Antibody Diversity”, Natúré 302, 575-581 (1983).

64. J. Kyte and R. F. Doolittle, „A Simple Method fór Displaying the Hydropathic Character of a Protein”, J. Mól. Bioi. 747, 105-132 (1982).

65. G. von Heijne, „Patterns of Amino Acids Near Signal-Sequence Cleavage Sites”, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983).

66. E. A. Kábát et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest” (Washington, D. C.; U. S. Department of Health and Humán Ser-vices), p. 281 (1983).

67. A. F. Williams et al., „Cell Surface Glycoproteins and the Origins of Immunity”, In the Proceedings of the Sigrid Juselius Sym-posium, L. C. Andersson, C. G. Gahmberg and P. Ekblom, eds. (New York: Academic Press), in press (1984).

68. L. M. AMzel and R. J. Poljak, „Three-Dimensional Structure of Immunoglobulins”, Ann. Rév. Biochem. 48, 961-997 (1979).

69. P. Y. Chou and G. D. Fasman, „Empirical Predictions of Protein Conformation”, Ann. Rév. Biochem. 47, 251-276(1978).

70. P. J. Maddon, et al., The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4: A new member of the immunoglobulin gene family, Cell 42, 93-104 (1985).

71. R. A. Adams, A. Flowers and B. J. Davis, Direct implantation and serial transplatation of humán acute lymphoblastic leukémia in hamsters, SB-2, Can. Rés. 28, 1121-1125 (1968).

72. G. O. Gey, W. D. Coffman and Μ. T. Kubicek, Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normál epithelium, Cancer Rés. 72, 264-265(1952).

73. R. J. V. Pulvertaft, Cytology of Burkitt’s tumor . (African lymphoma), Láncét 7, 238-240 (1964).

74. N. J. Dimmock, Initial stages of infection with animal viruses, J. Gén. Virol. 59, 1-22 (1982).

75. J. White, M. Kielian and A. Helenius, Membráné fusion proteins of enveloped animal viruses, Quart. Rév. Biophys. 76, 151-195 (1983).

76. M. Marsh, The entry of enveloped viruses intő cells by endoeytosis, Biochem. J. 218, 1-10 (1984).

77. M. Kielian and A. Helenius, Entry of alphaviruses. In the Togaviridae and Flaviviridae, S. Schlesinger and M. J. Schlesinger, eds., (Plenum Publishing Corp.), pp. 91-119 (1986).

78. S. Ohkuma, and B. Poole, Fluorescence probe measurements of the intralysosomal pH in living cells and the pertubation of pH by various agents, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3327-3331 (1978).

79. F. R. Maxfield, Weak bases and ionophore rapidly and reversibly raise the pH of endocytic vesicles in cultured mouse fibroblasts, J. Cell. Bioi. 95, 676-681 (1982).

80. A. Helenius, M. Marsh, and J. White, Inhibition of Semliki Forest vírus penetration by lysosomotropic weak bases, J. Gén. Virol. 58, 47-61 (1982).

81. R. T. Johnson and J. C. McArthur, AIDS and the brain, TINS 9, 91-94(1986).

82. P. M. Snow, M. Van de Rijn and C. Terhorst, „Association Between the Humán Thymic Differentiation Antigens T6 and T8”, Eur. J. Immunoi., in press (1985).

83. P. M. Snow and C. Terhorst, „The T8 Antigén is a Multimeric Complex of Two Distinct Subunits on Humán Thymocytes bút Consists of Homomultimeric Forms on Peripheral Blood T Lymphocytes”,

J. Bioi. Chem. 258, 14 675-14 681 (1983).

84. C. Terhorst et al., „Biochemical Analysis of Humán T Lymphocyte Differentiation Antigens T4 andT5”, Science 209, 520-521 (1980).

85. W. H. Hildemann, „Immunocompetance and Allogeneic Polymorphism Among Invertebrates”, Transplantation 27, 1-3(1979).

86. V. L. Scofield et al., „Protochordate Allorecognition is Controlled by a MHC-like Gene System”, Natúré 295, 499-502 (1982).

87. T. L. Lentz, et al., Is the acetylcholine receptor a rabies vírus receptor ?, Science 275, 182-184 (1982).

88. J. D. Fingeroth, et al., Epstein-Barr vírus receptor of humán B lymphocytes is the C3d receptor CR2, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 81, 4510-4514 (1984).

89. P. E. Tambourin, et al., The physiopathology of Friend leukémia, Leukémia Rés. 3, 117-129 (1979).

90. A. Oliff, et al., Isolation of transplantable erythroleukemia cells from mice infected with helper-independent Friend murine leukémia vírus, Blood 58, 244-254(1981).

HU 213019 Β

91. J. E. Silver and J. M. Fredrickson, Susceptibility to Friend helper vírus leukémiás in CXB recombinant inbred mice, J. Exp. Med. 158, 1693-1702 (1983).

92. P. A. Chatis, et al., Role fór the 3' end of the genome in determining disease specificity of Friend and Moloney murine leukémia viruses, Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 80, 4408-4411 (1983).

93. P. A. Chatis, et al., A 3' end fragment encompassing the transcriptional enhancers of nondefective Friend vírus confers erthyroleukemogenicity on Moloney leukémia vírus, J. Virol. 52, 248-254 (1984).

94. A. Bősze, H. J. Thiesen and P. Chamay, A transcriptional enhancer with specificity fór erythroid cells is located in the long terminál repeat of the Friend murine leukémia vírus, EMBO J. 5, 1615— 1623(1986).

95. A. N. Barclay, et al., Immunoglobulin-related structures associated with vertebrate cell surfaces, in press.

96. Μ. O. Dayhoff, W. C. Barker and L. T. Hunt, Establishing homologies in protein sequences. In Methods in Enzymology. Enzyme Sturcture Part I, C. H. W. Hirs and S. N. Timasheff, eds. (New York: Academic Press), pp. 524-545 (1983).

97. Y. Yanagi, et al., A humán T cell-specific cDNA slone encodes a protein havint extensive homology to immunoglobulin chains, Natúré 308, 145-149 (1984).

98. G. K. Sím, et al., Primary structure of humán T-cell receptor -chain, Natúré 312, 771-775 (1984).

99. H. Saito, et al., A third rearranged and expressed gene in a clone of cytotoxic T lymphocytes, Natúré 312, 36-40(1984).

100. H. Saito, et al., Complete primary structure of the E chain and gene of the mouse major histocompatibility complex, Proc. Natl. Acad. USA 80, 55205524 (1983).

101. M. Isobe, et al., The gene encoding the T-cell surface protein T4 is located on humán chromsome 12, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4399-4402 (1986).

102. J. M. Roberts and R. Axel, Gene Amplification and Gene Correction in Somatic Cells, Cell 29, 109-119(1982).

103. D. S. Pfarr, G. Sathe and Μ. E. Reff, A Highly Modular Cloning Vector fór the Analysis of Eucaryotic Genes and Gene Regluatory Elements, DNA, 4, 461-467(1985).

104. G. Urlaub and L. A. Chasin, Isolation of Chinese Hamster Cell Mutants Deficient In Dihydrofolate Reductase Activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220(1980).

105. Gay, D. et al., Natúré 328, 626-629 (1987).

106. Sleckman, B. D. et al., Natúré 328, 351-353 (1987).

107. Yanisch-Perron, et al., Gene 33, 103 (1985).

108. Berg, P., et al., Mól. Cell. Bioi. 3, 246 (1983).

109. Subramani, et al.. Mól. Cell. Bioi. 1, 854 (1981).

110. Frayne, et al., Mól. Cell. Bioi. 4, 2921 (1984).

111. Schumperli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,

257 (1982).

112. Gross, et al., Mól. Cell. Bioi. 5, 1015 (1985).

113. Pfarr, etal., DNA 5, 115(1986).

114. Rao, et al., Cell Immunoi. 80, 310 (1983).

115. McCIure, et al., Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation 9, 345 (1982).

116. Urlaub, et al., Cell. 33, 405 (1983).

117. Kim, et al., Cell. 42, 129(1987).

118. Wigler, et al., PNAS USA 76, 1373 (1979).

119. Copeland, et al., Cell. 17, 993 (1979).

120. Sattentau, et al., Science 234, 1120(1986).

121. Greenstein, et al., Ann. Inst. Pastuer 138, 134 (1987).

122. Gay, et al., Ann. Ignst. Pasteur 138, 127 (1987).

123. Rosenberg és munkatársai: Meth. Enzymol., 101,

123 (1983).

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás T4 fehérje oldható, a humán immunhiány-vírus burok-glikoproteinjével komplexet képező fragmentumainak előállítására, azzal jellemezve, hogy egy a 6. ábrán bemutatott szekvencia +3. aminosavától a+ 185. aminosaváig terjedő szekvenciát és kívánt esetben ahhoz fuzionált, a 6. ábra szerinti szekvencia +351. aminosavától a +369. aminosaváig terjedő aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát alkalmas gazdaszervezetben kifejezünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy a 6. ábrán bemutatott szekvencia +3. aminosavától a +106. aminosaváig terjedő szekvenciát és adott esetben ahhoz fuzionált, a 6. ábra szerinti szekvencia +351. aminosavától a +369. aminosavig terjedő aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát fejezünk ki.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 6. ábrán bemutatott szekvencia +3. aminosavától a +185. aminosaváig terjedő aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát fejezünk ki.

4. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely az 1. igénypont szerinti oldható T4-fragmentumot a gyógyszerkészítésben szokásos vivő- és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítunk.

5. Eljárás kifejező vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas vektorba egy a 6. ábrán bemutatott szekvencia +3. aminosavától a +185. aminosaváig terjedő és adott esetben ahhoz fuzionált, a 6. ábra szerinti szekvencia +351. aminosavától a +369. aminosavig terjedő szekvenciával rendelkező polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát inszertálunk.

6. Eljárás gazdaszervezet előállítására, azzal jellemezve, hogy egy az 5. igénypont szerinti kifejező vektorral alkalmas gazdaszervezetet transzformálunk.

HU 213019 Β

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktérium sejteket transzformálunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli sejteket transzformálunk.

9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eukarióta sejteket transzformálunk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy emlős sejteket transzformálunk.

11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy élesztő sejteket transzformálunk.

5 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy rovar sejteket transzformálunk.