FI102837B - T4-glykoproteiinin liukoista polypeptidiosaa koodaava nukleiinihappomo lekyyli ja menetelmä polypeptidin tuottamiseksi - Google Patents

Description

102837 T4-glykoprote±inin liukoista polypeptidiosaa koodaava nukle-iinihappomolekyyli ja menetelmä polypeptidin tuottamiseksi 5 Tämä hakemus on osajatko US-hakemukselle 114 244, jätetty 23. lokakuuta, 1987, joka on osajatko US-hakemukselle 898 587, jätetty 21. elokuuta, 1986, jonka sisältö on liitetty tähän hakemukseen viitteeksi.

10 Keksinnön taustaa Tässä hakemuksessa on viitattu useisiin julkaisuihin arabialaisilla numeroilla suluissa. Näiden viitteiden täydelliset lainaukset voidaan löytää teknillisten tietojen jälkeen, vä- 15 littömästi ennen patenttivaatimuksia. Näiden julkaisujen esitys on kokonaisuudessaan täten liitetty viitteeksi tähän hakemukseen, jotta kuvattaisiin täydellisemmin sitä alan tilannetta, johon tämä keksintö kuuluu. 1 T-lymfosyyttien erilaiset toiminnalliset luokat tunnistavat antigeenin kohdesolujen erillään olevien populaatioiden pinnalla. Auttaja-T-solut ovat suuresti vuorovaikutuksessa mak-rofagien ja B-solujen kanssa; sytotoksiset T-solut ovat vuorovaikutuksessa laajemman alueen kanssa antigeeniä kantavien , 25 kohdesolujen kanssa. Näitä soluihin liittyviä tunnistamista- f pahtumia välittää todennäköisesti spesifinen pintamolekyylien liittyminen sekä effektori- että kohdesoluihin. T-solujen pintaa kuvataan polymorfisten yhtä hyvin kuin ei-polymorfis-ten proteiinien lukumäärällä, jotka rajoittuvat suurelta 30 osalta T-lymfosyytteihin. Vaikka useimmat näistä molekyyleistä ovat yleisiä kaikille T-soluille, kaksi pintaproteiinien luokkaa eroaa yhdenmukaisesti erilaisiin T-solujen toiminnallisiin luokkiin ja nämä proteiinit sisältyvät T-solu-kohde-solu vuorovaikutuksiin.

35

Toiselle pintamolekyylien luokalle on tunnusomaista T-lymfosyyttien pääasialliset toiminnalliset alasarjat: pintaglyko-proteiinit T4 ja T8. Aikaisin kateenkorvaan liittyvässä kehityksessä ekspressoidaan glykoproteiinit T4 ja T8 samanaikai- 102837 sesti tymosyyttien pinnalla (1) . Ääreisimmuunisysteemeissä T4 ja T8 molekyylejä ekspressoidaan molemminpuolisesti lukuunottamatta T-solujen alasarjoja ja niitä ekspressoidaan vain harvoin samassa solussa (2, 3). T4-molekyyliä ekspressoidaan 5 T-soluissa, jotka ovat vuorovaikutuksessa kohteiden kanssa, joissa on luokan II päähistokompatibiliteettikompleksimole-kyylejä (MHC), kun taas T-solut, joissa on T8, ovat vuorovaikutuksessa kohteiden kanssa, jotka ekspressoivat luokan I MHC proteiineja (4, 5, 6, 7, 8, 9). T-lymfosyyttien T4-populaatio 10 sisältää auttajasoluja, kun taas T8-populaatio sisältää enemmistönä sytotoksisia ja supressorisoluja (6, 10). Kuitenkin harvinaiset T4+-solut voivat toimia sytotoksisina tai supres-sorisoluina (6, 10), antaen olettaa, että T4:n ja T8:n eks-pressoituminen liittyy tiukemmin MHC-luokan tunnistamiseen 15 kuin effektoritoimintaan. Näiden molekyylien merkitys T-solu-kohdesolu vuorovaikutuksessa voidaan osoittaa kokeilla mono-klonaalisten vasta-aineiden kanssa. Vasta-aineet, jotka on kohdistettu spesifisiä T4-molekyylin epitooppeja vastaan (tai hiiriin ja rottiin liittyvään vastaavaan L3T4), inhiboivat 20 antigeenin indusoiman T-solun lisääntymisen, imunesteen vapautumisen ja auttajasolutoiminnan (7, 8, 11, 12, 13). Samalla lailla T8:aa vastaan kohdistetut monoklonaaliset vasta-aineet (tai hiiriin ja rottiin liittyvä vastaava Lytz) inhiboi sytotoksista T-solun välittämää tappamista (14, 15). Nämä . 25 huomiot yhdessä sen tosiasian kanssa, että T4 ja T8 eivät osoita merkittävää polymorfisuutta, ovat johtaneet hypoteesiin, että T4 ja T8 tunnistavat luokan II ja luokan I molekyyleissä ei-polymeeriset alueet, vastaavasti.

30 Toinen luokka proteiineja, joiden on ajateltu eroavan erilai-; sissa effektori T-soluissa, ovat reseptorit, jotka tunnistavat MHC-molekyylin polymorfisten alueiden kanssa liittyneenä olevan antigeenin (16, 17, 18). Auttaja-T-lymfosyyttien vuorovaikutukset rajoittuvat suuresti antigeeniä sisältäviin kohdesoluihin, 35 jotka ekspressoivat luokan II MHC-proteiineja, kun taas syto-toksiset ja supressori-T-solut rajoittuvat kohteisiin, joissa on luokan I MHC-molekyylejä (4, 5, 6, 7, 8, 9). Näitä spesifisiä vuorovaikutuksia voi välittää T-solureseptori (tai resep- 3 102837 torit), jotka tunnistavat antigeenin spesifisten MHC-molekyyli-en yhteydestä (17, 18). Täten, T-lymfosyytillä voi olla kaksi itsenäistä reseptoria, jotka kykenevät tunnistamaan MHC-prote-iinien sekä vakio-että polymorfiset determinantit ja nämä re-5 septorit voivat olla vastuussa spesifiseen, T-solujen toiminnallisesti erillisten populaatioiden kohdistamiseen.

Immunikatoa (AIDS) kuvataan T4+-lymfosyyttien poistumisella e-limistöstä. Seurauksena T-solun välittämä immuunisuus heikenit) tyy AIDS-potilaissa, johtaen vakavien opportunististen infektioiden ja epätavallisten kasvainten esiintymiseen. AIDS johtuu siitä, että läheistä sukua olevat retrovirukset (LAV, HTLV-II tai ARV), nyt nimetty ihmisen immuunikatovirus (human immunodeficiency virus (HIV)), infektoivat T-lymfosyytit. Näiden ainei-15 den infektiivisyyden raja rajoittuu soluihin, jotka ekspressoi-vat T4-glykoproteiineja pinnallaan.

Sen vuoksi T4-glykoproteiinit eivät toimi ainostaan reseptoreina kohdesolujen pinnalla oleville molekyyleille, vaan myös re-20 septoreina AIDS-viruksille. T4:ää vastaan kohdistetut vasta-aineet estävät AIDS-viruksen infektion T4-soluissa in vitro. Lisäksi äskettäiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kun T4+ T-lymfosyyttejä kohdistetaan AIDS-virukselle, viruksen 110 kd:n kuoren glykoproteiini liittyy T4-molekyyliin isäntäsolussa. Vi-25 ruksen lymfotrooppinen luonne voidaan siksi selittää sen resep-' torin, T4, rajoittuneella ekspressoitumisella T-lymfosyyttien alapopulaatiossa.

T4+ T-lymfosyyttien katoaminen AIDSissa johtaa soluun liitty-30 vän immunivasteen heikkenemiseen. Lisäksi, AIDSia seuraa usein keskushermostosysteemin (CNS) toimintahäiriö, useimmiten seura-' uksena puoliäkillinen aivotulehdus. Taudin vaivaamista aivoista on tunnistettu AIDS-viruksen RNA ja DNA ja virus on eristetty sekä aivo- että aivo-selkäydinnesteestä potilaista, joilla on 35 neurologisia häiriöitä. Nämä huomiot antavat olettaa, että AI-DS-virus infektoi aivosolut ja on suoraan vastuussa CNS-leesi-oihin, joita on havaittu AIDS-potilailla. Täten, AIDS-virus voi 102837 olla neurotrofinen yhtä hyvin kuin lymfotrofinen. Sen vuoksi on tärkeätä määrittää, ekspressoidaanko T4:ää myös CNSissä vai voivatko lisäksi tulevat aivo-spesifiset pintamolekyylit toimia reseptorina AIDS-virukselle.

5

Selvitystä T4:n ja T8:n spesifisistä vuorovaikutuksista voitaisiin helpottaa eristämällä T4- ja T8-geenit, niiden rakenteen määrittäminen ja kyky viedä ne erilaisiin soluihin liittyviin ympäristöihin. T8-molekyyliä koodaavan cDNA:n eristys ja sek-10 venssointi on esitetty (19, 20, 21). Johdettu proteiinisekvens-si osoittaa, että T8 on membraaniin sidottu glykoproteiini, jossa on N-terminaalinen alue, jossa on homologia immunoglobii-nin kevyeisiin muuttuviin alueisiin.

15 Keksinnön lyhennelmä Tämä keksintö antaa terapeuttisen aineen, joka kykenee spesifisesti muodostamaan kompleksin ihmisen immuunikatoviruksen kuoren glykoproteiinin kanssa, joka koostuu polypeptidistä. Erääs-20 sä keksinnön suoritusmuodossa polypeptidin aminohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä noin +3 -+185 fuusioituneena aminohapposekvenssiin noin +351 - +369. E-räässä toisessa keksinnön suoritusmuodossa polypeptidin aminohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvens-25 sistä, noin +3 - +106 fuusioituneena aminohapposekvenssiin noin +351 - +369. Vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa polypeptidin aminiohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä noin +3 - +185.

30 Tämä keksintö antaa myös menetelmän käsitellä kohdetta, joka on infektoitu ihmisen immuunikatoviruksella. Menetelmään kuuluu, että annetaan kohteelle tehokas määrä farmaseuttista yhdistettä, jossa on tehokas määrä keksinnön terapeuttista ainetta ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

35 102837

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1. Sytofluorograafinen kuvio epäsuorasta immunofluoresoi-5 vasta värjäyksestä OKT*4:llä ja OKT*8:lla.

Soluja (5 x 10!) inkuboitiin hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden OKT*4B:n tai OKT*8:n kanssa, pestiin ja inkuboitiin sitten FITC-konjugoidun vuohi anti-hiiri immunoglobuliinin kanssa. 10 Solut analysoitiin FACS IV solulajittelijassa ja merkittiin VAX 11/780-tietokoneella soluluku vs. fluoresenssin log. Ei-trans-formoidut NIH 3T3-solut ja L-solut antoivat identtiset syto-fluorograafiset viivat. Fro 2,2 on leukeminen T-solulinja, jonka fenotyyppi on T3-; T4+; T8+; T11+. LTD-4 on T4+ primäärinen 15 L-solu transformantti, joka on saatu seuraamalla kokonais geno-misen DNA:n siirymistä. 3A+ on NIH 3T3 solujinja, joka transformoitiin T4-pMV6tk/neo retroviraalisella ekspressoitumisra-kenteella.

20 Kuvio 2. T4+- ja T4-L-soluista ja ihmisen soluista johdetun RNA:n Northern Blot analyysi.

Kolme pg poly(A)+ RNA:ta ja 12 pg kokonais RNA:ta (ääreis T-so-lut ja tymosyytit) elektroforesoitiin 0,8 %:ssa agaroosiformal-25 dehydigeelissä, blotattiin GeneScreen:lie (New England Nuclear) ja koetettiin ”P-leimatun 0,6 kb T4 cDNA-insertin kanssa. T4+-soluihin kuuluvat LTD-4 (T4+, TS- L-solutransformantit), SK-7 T-soluhybridoma (T4+, TS-), OT-CLL-leukemia (T4+, TS-),

Fro 2,2 leukemia (T4+, TS-), T4-rikastetut ääreis-T-lymfosyytit 30 ja ihmisen lymfosyytit. T4—soluihin kuuluvat ei-transformoitu-neet solut, tk7 (T8+ L-solutransformantti), HeLa-solut, ihmisen • neuroblastomasolut (IMR) ja TS-rikastetut ääreis-T-lymfosyytit.

Ihmisen tymosyyttilinjaa säteilytettiin neljä kertaa kauemmin ja valokuvattiin suuren erotuskyvyn filmille.

35 102837

Kuvio 3. pT4B- ja T4-geenin restriktionukleaasikartta, sekvens-sointistrategia ja rekombinanttivektorit 5 A. pT4B cDNA:n ja T4-geenin BamHI-restriktiofragmenttien ryhmittyminen. BamHI-fragmenttien järjestys T4-geenissä määritettiin Southern blot-analyysillä ja genomisella kloonauskartoi-tuksella. pT4B- ja T4-geenin 5'-pään ryhmittyminen on osoitettu katkoviivalla ja varjostetut alueet pT4B:ssä vastaavat koodaus-10 sekvenssiä. Merkityt koot ovat kiloemäksinä.

B. Sekvenssointistrategia. Nuolet merkitsevät sekvenssin pituutta, joka on määritetty subkloonaamalla fragmentit M13:een ja sekvessoimalla dideoksiterminaatiomenetelmällä (36).

15 C. Eukaryoottiset ekspressiovektorit. Näissä rakenteissa on kaksi Moloney hiiriin ja rottiin liittyvää leukemiaviruksen pitkää terminaalista toistumaa (LTR), joiden suunnat on merkitty nuolin. pT4B subkloonattiin jokaisen vektorin EcoRI-kohtaan 20 merkityn suuntaisena, (a) T4-pVcos7-rakenne. (b) T4-pMV6tk/neo-rakenne sisältää neomysiinifosfotransferaasigeenin fuusioituneena HSV-tymidiinikinaasipromoottoriin.

Kuvio 4. Ei-transformoitujen ja T4+ L-solujen ja T-, B- ja ih-25 misen ei-lymfoidisolujen DNA:n Southern Blot analyysi 10 ]ig soluun liittyvää DNA:ta pilkottiin BamHI:llä, elektrofo-resoitiin 0,8 % agaroosigeelissä, blotattiin GeneScreen:ssä ja koetettiin nick-transloidun pT4B-cDNA-insertin kanssa. Merkityt 30 kokomerkinnät ovat kiloemäksinä. 20 kb:n, 6,6 kb:n, 4 kb:n, 1,8 kb:n ja 1 kb:n hybridisointivyöhykkeet ovat kaikissa ihmisen : DNArssa. DNA:t T4-:sta, ei-lymfoidia alkuperää, sisältää ei- transf ormoidut L-solut, ihmisen fibroblastit (GM), ihmisen neu-roblastomasolut (NB) ja HeLa-solut. CB, CP58 ja CP94 ovat 35 DNA:ta, jotka on johdettu EBV-transformoidusta ihmisen B-solu-linjoista. LTD-4 on T4+ primäärinen L-solu transformantti. RPMI ja HSB2 ovat T4- ihmisen T-solun leukemisia linjoja; E+-solut 102837 ja tymosyytit (Thym.) sisältävät T4+ T-soluja. OT-CLL, Jurkat (Jurk.), Fro 2,2, CEM ja Molt 4 ovat T4+ T-soluja. gP\M4 on ge-nominen klooni, jossa on sekvenssejä, jotka ylettyvät T4-geenin 3'-päähän.

5

Kuvio 5. NIH 3T3-solujen, jotka on transformoitu retroviraali-silla ekspressiorakenteilla, T4-glykoproteiinin immunopresi-pitaatio 10 L-[,!S]-metioniinileimatuille proteiineille kahdesta riippumattomasta NIH 3T3-transformantista, ääreis-T-lymfosyyteista ja ei-transformoiduista 3T3-soluista tehtiin linssilektiinikroma-tografia glykoproteiinien rikastamiseksi. 2,5 x 10* cpm:ää jokaista näytettä esipuhdistettiin ja immunosaostettiin sitten 15 OKT*4-monoklonaalisten vasta-aineiden ja proteiini A-Sepharosen kanssa. Helmet pestiin, liuotettiin näytepuskuriin ja elektro-foresoitiin 10 % SDS-polyakryyliamidigeelissä pelkistävissä (linjat a-d) ja ei-pelkistävissä (linjat e ja f) olosuhteissa. Linja a, ei-transformoidut NIH 3T3-solut. Linja b, T4C2, NIH 20 3T3-solu transformoitu T4-pVcos7-rakenteella. Linjat c ja e, 3A+, NIH 3T3-solu transformoitu T4-pMV6tk/neo-rakenteella. Linjat d ja f, ihmisen ääreis-T-lymfosyytit. Suhteelliset moleku-laariset massat (Mr) on annettu kilodaltoneina.

25 Kuvio 6. T4 cDNA:n ja T4-proteiinin transloidun sekvenssin nuk-' leotidisekvenssi cDNA klooni pT4B:n nukleotidi- ja ennustetut aminohapposekvenssit saatiin kuviossa 3B esitetyn sekvessointistrategian mukaan. 30 Aminohapposekvenssien yläpuolella olevat numerot tarkoittavat aminohappojäännöksen kohtia. Numerot oikealla osoittavat nuk-- ' leotidikohdat. Kaikki solun ulkopuoliset kysteiinit on merkitty {•):lla tai (o):11a. Johtava sekvenssi (L), vaihteleva sekvenssi (V), liittymissekvenssi (J), transmembraani (TM) ja sy-35 toplasmiset alueet (CYT) on merkitty vaakasuorilla nuolin sekvenssin alapuolelle, vaikka tarkat rajat ovat epäselvät. Kaksi mahdollista N-sitoutunutta glykosylaatiokohtaa (Asn-Leu-Thr) on 1028-37 merkitty myös (CHO).

Kuvio 7. SP6-transkriptiosta johdetun RNA:n in vitro translaatio 5

Koko pitkä T4 cDNA-insertti subkloonattiin RNA-ekspressiovekto-rille pSP65 (Promega Biotec.). Linearisoitu plasmidi-DNA trans-kriptoitiin SP6-polymeraasilla (40) ja RNA transloitiin vehnän-alkiosysteemissä (Bethesda Research Laboratories), jossa oli L-10 [”s]-metioniinia. In vitro-tuotteille tehtiin elektroforeesi 10 %:ssa SDS-polyakryyliamidigeelissä (linja T4). Vasikan aivoli-säke-RNA:ta käytettiin kontrollina. Suhteelliset molekulaariset massat (Mr) annetaan kilodaltoneina.

15 Kuvio 8. Kaavamainen kuva T4:n glykoproteiinista, joka ylettyy solumembraanin yli T4 koostuu neljästä peräkkäisestä VJ-kaltaisesta alueesta (V,J[-V(J<), hydrofobisesta membraanin ylittävästä segmentistä (var-20 jostettu alue) ja varautuneesta sytoplasmisesta alueesta (CYT). Kaksi mahdollista N-sitoutunutta glykosylaatiokohtaa solun ulkopuolisessa osassa on merkitty (---). Intronien 2-8 sijainnit ovat myös merkitty ( ).

25 Kuvio 9. T4:n muuttuvan, liittyvän ja transmembraanialueiden ryhmittyminen immunoglobuliinigeeniperheen kanssa A. T4:n muuttuvan alueen aminohapposekvenssin ryhmittyminen hiiren kappa-kevyt-ketjuimmunoglobuliini J606:n (66), ihmisen 30 T-soluantigeenireseptori β-ketjun YT35 (97) ja ihmisen T-solu-antigeenireseptori α-ketjun HPB-MLT kanssa (98). Muuttumattomat jäännökset kevyen ketjun vaihtelevassa osassa kuuluvat (Inv.) ryhmittymään. Ryhmittymä esitettiin, jotta maksimoitaisiin i-denttisyys ja rakenteellinen homologia T4:n kanssa, jotka ovat 35 laatikoituna jäännöksinä. Viivat, joilla on kirjaimet A, B, C, C, D, E, F ja G, sekvenssien alapuolella osoittavat jäännöksi-ä, jotka muodostavat β-juosteet (67), β-juoste G jatkuu J-sek- 102837 venssiin.

B. T4:n liittyvän alueen aminohapposekvenssin ryhmittyminen, jossa on T-solun antigeenireseptorin β-ketjun konsensus J-sek- 5 venssit, immunoglobuliini lambda- ja kappa-kevytketjut ja ihmisen T-solureseptorin α-ketjun J-sekvenssi (99).

C. T4:n transmembraanialueiden ryhmittyminen ja MHC luokka II β-ketju (100). Oletettu transmembraanialue (TM) on merkitty 10 sekvenssin alapuolelle.

Kuvio 10. T4-geenin restriktionukleaasikartta ihmisen kromoso-maalisella DNA:lla 15 9 eksonin asemat määritettiin genomisella kloonauskartoituksel- la, Southern blot analyysillä ja nukleotidisekvenssoinnilla. Leader sekvenssi (L), muuttuva sekvenssi (V), liittyvä sekvenssi (J), transmembraani- (TM) ja sytoplasmiset (CYT) alueet on laatikoitu. Metioniinikodonin asema, jota ympäröi aloitus-20 konsensussekvenssi, on merkitty (ATG) leader eksonin alussa (L); terminaatiokodoni TGA näkyy toisen sytoplasmisen eksonin lopussa (CYT). Merkityt koot ovat kiloemäksinä.

Kuvio 11. Rekombinanttiretroviraaliset ekspressiovektorit ja 25 transformoitujen solujen rakenne.

A. Rekombinantti retroviraaliset ekspressiovektorit pMV7, sisältävät kaksi suoraan toistuvaa hiiriin ja rottiin liittyvää sarkomaviruksen pitkää terminaalista toistoa (LTR) nuolien o-30 soittamassa suunnassa. pMV7:ssä on myös bakteerin neomysiini- fosfotransferaasigeeni (neo) fuusioituneena HSV tymidiinikinaa-: sipromoottoriin (tk). Täysipitkät cDNA-insertit, jotka koodaa- vat T4:ää (T4B) (70) tai T8:aa (T8F1) (20) subkloonattiin Eco- RI-kohtaan nuolten osoittamassa suunnassa, jolloin saatiin T4-35 pMV7 ja T8-pMV7, vastaavasti. Koodaussekvenssit on osoitettu varjostettuina alueina. Merkityt koot ovat kiloemäksinä.

102837 B. Retroviruksen välittämä geeninsiirtostrategia

Kuvio 12. Luonnollisesti eristettyjen ja transformoitujen T4+-solujen infektion tehokkuus.

5

Solut ympättiin 10-kertaisella AIDS-virusten laimennussarjalla, inkuboitiin 18 h 37'C:ssa, pestiin ja maljattiin mikroviljel-miin. Infektoitujen viljelmien frekvenssi määritettiin enzyme-linked immunoabsorbent assaylla (ELISA) 12 päivää infektion 10 jälkeen (46). Tulokset esitettiin graafisesti %:na positiivisia viljelmiä vs. viruslaimennuksen log. Infektiivistä virustiit-teriä (ID-50) kuvataan sen laimennuksen käänteisarvona, jossa 50 % viljelmistä on viruspositiivisia (47). Luonnollisesti e-ristettyihin T4+-soluihin kuuluu fytohemmagglutiniini (PHA)- 15 stimuloidut normaalit ääreislymfosyytit (·-·) ja T-solulin- ja CEM (o-o). T4+ transfektoituihin solulinjoihin kuuluvat HSB2-T4+ T-solut (A-A) ja Raji-T4+ B-solut (·- ) . TS+ transfektoidut solulinjat HSB2-TS+ ja Raji-TS+ (□-O) toimi vat kontrolleina näissä kokeissa.

20

Kuvio 13. Synsytian muodostuminen T4+ HeLa-transformanteissa A. 2 x 10’ yksinkertainen kerros HeLa-T4+-transformantteja sekoitettiin 2 x 10* AIDS-viruksia tuottavien H9-solujen kanssa 25 ja inkuboitiin 37'C:ssa. Viljelmien tarkastelu 18 h kuluttua paljasti, että yli 90 % tumista yksinkertaisessa kalvossa oli synsytian sisällä.

B. Anti-T4 monoklonaalista vasta-ainetta (1:20) lisättiin se-30 koitettuun viljelmään ymppäämisen kanssa samanaikaisesti. Viljelmien tarkastelu 18 h kuluttua paljasti solufuusion täydellisen puuttumisen.

Viljelmät valokuvattiin 160 x suurennuksella.

35 102837

Kuvio 14. Sytometrinen virtausanalyysi AIDS-viruksista, jotka sitoutuvat T4+ transformoituihin soluihin 5 Pylväs A. Solut (5 x 105) inkuboitiin fluoreskeiini-konjugoitu- neiden anti-T4A- (-) tai anti-T8 (----) monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, pestiin ja analysoitiin sytofluoromet-rillä.

10 Pylväs B. Solut '(5 x 105) inkuboitiin puskurin (---) tai AIDS- virusten (-) kanssa, pestiin, inkuboitiin fluoreskeiini-kon- jugoituneiden anti-AIDS-virusvasta-aineen kanssa ja analysoitiin sytofluorometrillä.

15 Pylväs C. Solut (5 x 101) inkuboitiin puskurin (---) tai anti- T4A-monoklonaalisen vasta-aineen, jota seurasi AIDS-virus ( “) tai anti-T8-monoklonaalisen vasta-aineen, jota seurasi AIDS-virus (-·-·—) kanssa. Pesun jälkeen lisättiin fluoreskeii-ni-konjugoitua anti-AIDS-virus vasta-ainetta ja solut analysoi- 20 tiin sytofluorometrillä.

Jokaisen solun fluresenssihistogrammit (soluluku vs. fluore-sointi-intensitiivisyys) ovat järjestetty vaakasuoraan.

25 Kuvio 15. Northern Blot analyysi RNArsta, joka on saatu ihmisen ja hiiren aivo-, lymfa- ja ydinsoluista A. Ihmisen RNA-näytteiden Northern blot analyysi. Yksi ug po-ly(A)+ RNA:ta Raji (T4- B-solulinja), U937 (T4+ monosyyttinen 30 solulinja) ja Jurkat (T4+ T-solulinja) ja 5 pg poly(A)+ RNA:ta aivokuoresta, elektroforesoitiin 1 % agaroosiformaldehydigee-lissä, blotattiin Hybondille (Amersham) ja koetettiin ”p-lei-matulla T4 cDNA-insertillä, pT4B (70).

35 B. Hiiren RNA-näytteiden Northern blot analyysi. 5 ug poly(A)+ RNA:ta 3T3-soluista (fibroblastisolulinja), etuaivoista ja ta-. ka-aivoista ja 20 pg kokonais RNA:ta tymosyyteista elektrofore- 102837 12 soitiin 1 % agaroosiformaldehydigeelissä, siirrettiin Hybondil-le ja koetettiin “P-leimatulla L3T4 cDNA-insertillä, pL3T4B.

Kuvio 16. psT4DHFR:n plasmidikartta 5 psT4DHFR-plasmidi on pUC18-johdannainen, jossa on T4 cDNA:n bp 1-1257 klooni pT4B, joka koodaa T4:n leader ja solunulkopuolis-ta segmenttiä. Tämä sT4 cDNA on insertoitu SV40 aikaisen promoottorin ja synteettisen linkkerin, jossa on TAA lopetuskodoni 10 (liite), jota seuraa vasikan kasvuhormonigeenin polyadenylaa-tioalue, väliin. sT4-ekspressiokasetti on liittynyt hiiren hd-fr-ekspressiokasettiin, joka koostuu β-globiinipromoottorista, hiiren dhfr-koodaussekvenssistä ja SV40 polyadenylaatioaluees-ta.

15

Kuvio 17. Fluoresoiva histogrammi (soluluku vs. fluoresointi-intensiivisyys) sT4 inhiboi HIV:n sitoutumista T4+ CEM-soluihin. Soluja inku-20 boitiin puskurin (.-.-.-), HIV:n, jota oli esi-inkuboitu sT4:n kanssa (-) tai HIV:n kanssa, jota oli esi-inkuboitu konsen troidun kontrollisupernatantin kanssa ei-transformoituneista DXB-ll-soluista (---), pestiin, altistettiin fluoresoivasti konjugoituneelle anti-HIV-vasta-aineelle ja analysoitiin syto-25 fluorometrillä. Fluoresoiva histogrammi (soluluku vs. fluore-sointi-intensiivisyys) näkyy.

Kuvio 18. HIV-infektion inhhibiitio sT4:n toimesta 30 Suoritettiin infektiivisyystitraus HIV-ympille (ID-50-määri-, tys). 10-kertaisia virusymppilaimennussarjoja inkuboidaan indi- kaattorisolujen kanssa (PHA-stimuloituja ihmisen lymfosyyttejä) 18 h. Sitten solut pestään ja maljataan mikroviljelmiin (1 x 101 solua viljelmää kohti, 10 viljelmää laimennusta kohti).

35 Päivinä 4, 8 ja 12 supernatanteista testataan HIV antigeenin sieppausmäärityksellä. ID-50-titraukset suoritettiin alustassa, jossa oli 8,6 pg/ml sT4:ää, joka lisättiin HIV-laimennukseen 30 « 102837 13 min ennen solujen ymppäämistä ja pidettiin kasvatusalustassa koko kokeen ajan () tai alustassa, johon sT4 oli viety ensimmäisen 18 h ympin jälkeen (O) (myöhästynyt lisäyskontrolli) tai alustassa, jossa ei ollut sT4:ää (Q) (kontrolli).

5 A. Piirros prosenttia HIV-positiivisia viljelmiä päivänä 8 versus virusympin laimennus.

B. Piirros ID-50 (käänteisarvo viruslaimennuksesta, jossa 50 % 10 viljelmistä on positiivisia) päivinä 4, 8 ja 12.

C. Piirros prosenttia HIV-positiivisia viljelmiä päivänä 8 versus sT4-konsentraatioiden vaihtelu käyttämällä 10'1 HIV-laimen-nusta.

15

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö antaa terapeuttisen aineen, joka kykenee spesifisesti muodostamaan kompleksin ihmisen immuunikatoviruksen kuo-20 ren glykoproteiinin kanssa, joka koostuu polypeptidistä. Eräässä keksinnön suoritusmuodossa polypeptidin aminohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä noin +3 -+185 fuusioituneena aminohapposekvenssiin noin +351 - +369. E-räässä toisessa keksinnön suoritusmuodossa polypeptidin amino-25 happosekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä, noin +3 - +106 fuusioituneena aminohapposekvenssiin noin +351 - +369. Vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa polypeptidin aminiohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä noin +3 - +185.

30

Farmaseuttinen koostumus, joka on hyödyllinen terapeuttiseksi aineeksi hoidettaessa kohdetta, joka on infektoitunut ihmisen immuunikatoviruksella, annetaan myös. Tämä farmaseuttinen koostumus koostuu tämän keksinnön aminohapposekvenssistä, joka ky-35 kenee spesifisesti muodostamaan kompleksin ihmisen immuunikato-viruksen kuoren glykoproteiinin kanssa ja on liukoinen vesipitoisiin liuoksiin ja farmaseuttisesti hyväksyttyyn kantajaan.

102837

Sellaisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia tunnetaan a-lalla, johon tämä keksintö kuuluu ja niihin kuuluvat, mutta ei rajoitu, 0,01-0,1 M, edullisesti 0,05 M fosfaattipuskuri tai 0,8 % suolaliuos.

5

Annetaan myös menetelmän käsitellä kohdetta, joka on infektoitu ihmisen immuunikatoviruksella. Tähän menetelmään kuuluu, että annetaan kohteelle tehokas määrä farmaseuttista yhdistettä, jossa on farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja ja tämän keksin-10 nön aminohapposekvenssi, joka kykenee spesifisesti muodostamaan kompleksin ihmisen immuunikatoviruksen kuoren glykoproteiinin kanssa ja on liukoinen vesipitoisessa liuoksessa, niin että tekee ihmisen immuunikatoviruksen (tässä viitattu myös AIDS-vi-ruksena), joka on infektoinut kohteen, kykenemättömäksi infek-15 toimaan T4+-soluja.

sT4-proteiinin in vitro biologisten ja immunologisten ominaisuuksien kuvaaminen osoittaa, että proteiinilla on arvoa AIDSin estämisessä ja hoidossa. Tutkimukset osoittavat, että sT4-pro-; 20 teiini toimii viruksen solunulkopuolisten ja solusta soluun le viämisen estäjänä. Koska sT4:n on osoitettu estävän viruksen sitoutumista T4+-kohdesoluihin viljelmässä, uskotaan, että sT4:n antaminen infektoituneille henkilöille toimisi estämään solunulkopuolista viruksen leviämistä. Siksi, sT4:llä on arvoa 25 sekä ennaltaestävänä että terapeuttisena tekijänä AIDSin hoidossa .

Ennaltaehkäisevänä sT4:ää annetaan henkilöille, joilla on suuri riski sairauteen tai henkilöille, jotka osoittavat altistumista 30 HIV:lie viruksia vastaan olevien vasta-aineiden takia. Annettaessa tehokas määrä sT4:ää sairauden aikaisessa vaiheessa tai '· ennen sen puhkeamista se toimii inhiboimalla T4+-lymfosyyttien HIV-infektion. Terapeuttisena aineena sT4:n antaminen henki-löillle, jotka ovat HIV-infektoituneet, toimii estämään viruk-35 sen solunulkopuolisen leviämisen.

HIV-infektoituneiden solujen ja muiden T4+-lymfosyyttien väli- 102837 15 nen fuusio näyttää olevan myös viruksen leviämistapa. Lisäksi, fuusio saattaa olla vastuussa, osittain, T4+-lymfosyyttitoimin-nan heikkenemisestä ja lopulta T4+-lymfosyyttien loppumisesta infektoituneissa yksilöissä. Solufuusio riippuu sekä viruksen 5 kuorigeenin tuotteista että T4-reseptorista ja sen voi estää OKT4A tai samanlaiset monoklonaaliset vasta-aineet (Mabs) (120). sT4 sekaantuu solufuusioon ja sen takia sen odotetaan vähentävän viruksen solusta soluun leviämistä ja T4+-lymfosyyt-titoiminnan katoamista.

10 T4-reseptori on monomorfinen ja täten sT4:n uskotaan olevan y-leinen viruksen, joka tunnistaa T4-reseptorin pinta-alueen, mukaanlukien kaikki HIV:t, inhibiittori.

15 sT4 voidaan käyttää yhdessä muiden aineiden kanssa, esimerkiksi aineiden yhteydessä, jotka on kohdistettu muita HIV-proteiineja vastaan, kuten käänteistranskriptaasi, proteaasi tai tat. Tehokkaan terapeuttisen HIV:ä vastaan olevan aineen pitäisi estää viruksen välittämä infektio yhtä hyvin kuin solusta soluun le-. 20 viäminen. sT4:ää voidaan käyttää myös yhdessä muiden anti-vi- raalisten aineiden, esimerkiksi, atsidotymidiinin (AZT), kanssa .

Tämän keksinnön sT4-proteiinilla on käyttöä myös T4+-solutoi-25 minnan inhibiittorina. Lukuisat tutkimukset ehdottavat kriittistä roolia CD4-reseptorille (CD4 on yleistä terminologiaa ihmisen T4-reseptorille ja sen vastineille muissa nisäkässoluis-sa) immunisietokyvyssä, eityisesti patogeenisyydessä ja itseim-muunisairauksien etenemisessä ja isäntäspesifisessä siirrännäi-30 sen hylkimisessä. sT4:n erityinen merkityksellisyys on huomiot anti-CD4 Mabsin kanssa. Niiden liittymisen kautta CD4-resepto-' riin tietyt näistä Mabseista parantavat itseimmuunivasteita ja siirrännäishylkimistä. Esimerkkeihin sellaisesta toiminnasta kuuluu T-solutoiminnan inhibiitio in vitro, esimerkiksi anti-35 geenin indusoima lisääntyminen, imunesteen erittyminen ja aut-tajasolutoiminta joillakin anti-CD4 Mabseilla; systeemisen pu-nahukan käsittely antamalla anti-CD4 Mabsia hiiriin ja rottiin 102837 liittyvän lupuksen jarruttamiseksi; ja kudoksen siirtämistutki-mukset hiirissä, jolloin yksi ainoa annos hiiriin ja rottiin liittyvää Mabia, joka on kohdistettu hiiriin ja rottiin liittyvää CD4-reseptoria vastaan, johtaa siirrännäisen hyväksymi-5 seen, joka on siirretty saman lajin yksilöstä toiseen.

Mabin CD4:ään sitoutumisen molekulaarinen yhteys on epäselvä. Mabit saattavat estää CD4:n liittymisen sen ligandeihin, ligan-di, joka on säilynyt epitooppi MHC luokka II antigeeneissä, to-10 disteet antavat olettaa (121, 122). Kuitenkin jotkut näistä samoista Mabeista inhiboivat CD4-soluaktivaation selvällä luokka II riippumattomalla reitillä.

sT4:n uskotaan myös inhiboivan T-solu vuorovaikutuksia sellu-15 laarisen T4:n kilpailijana, ehkä sitoutumalla solunulkopuoli-siin kohdemolekyyleihin, jotka normaalisti ovat vuorovaikutuksessa T4-reseptorin pinta-alueen kanssa. Tällä erolla Mabsin ja sT4:n välillä voisi olla tärkeät toiminnalliset seuraukset. E-simerkiksi, kun jotkut Mabsit, jotka on kohdistettu T4:ää vas-20 taan, tuovat esiin vasteen T4-solua vastaan, sT4 saattaa tuoda esiin vasteen soluja vastaan, jotka ekspressoivat MHC luokka II antigeenejä. Myös T4:n affiniteetti sen oletettua luokka II li-gandiin näyttää olevan melko alhainen verrattuna Mabsin korkeisiin affiniteetteihin, jotka on kohdistettu T4:ää vastaan. Tä-25 ten, vaikka Mabs ja sT4 voivat vuorovaikuttaa samoilla prosesseilla, ne vaikuttaisivat erilaisiin kohdemolekyyleihin ja erilaisiin kohdesoluihin.

Ennaltaehkäisevänä tai terapeuttisen aineena sT4:ää annetaan 30 ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta, edullisesti laskimonsisäisesti. Ainetta voidaan antaa infuusiolla tai ruiskulla, e-sim. päivittäin, viikottain tai kuukausittain. sT4:n antamisen määrä ja nopeus valitaan niin, että ylläpidetään sT4:n tehokas määrä verenkierrossa. Vaihtoehtoinen tapa antamiselle olisi 35 ruumiin ulkopuolinen käyttämällä sT4:ää dialyysiaineena.

Tämän keksinnön sT4-proteiinia voidaan käyttää myös reagenssina 102837 tunnistamaan luonnollia, synteettisä tai rekombinanttimolekyy-lejä, jotka toimivat terapeuttisina aineina tai T4+-solujen vuorovaikutuksen inhibiittoreina.

5 Esimerkiksi, sT4-proteiinia voidaan käyttää seulontamäärityk-sissä, kuten proteiinin vuorovaikutuksen määritykset mitattuna ELISAan perustuvilla metodologeilla, jotta saataisiin biologisesti puhdas, vesiliukoinen reagenssi, jota voidaan käyttää yhdessä muiden reagenssien kanssa määrittämään T4-reseptorin pin-10 ta-alueen vuorovaikutusten kilpailijoita. Esimerkiksi, koska sT4 sitoutuu HIV env-proteiiniin tai seoksiin, joissa on HIV env-proteiineja, sitä voidaan käyttää seulomaan virussitoutumi-sen inhibiittoreita. Perustuen in vitro tietoihin, jotka osoittavat, että sT4 sitoutuu soluihin, jotka ekspressoivat HIV env-15 proteiineja, sT4 voi olla myös selektiivinen kohdemolekyyli HIV-infektoiduille soluille in vivo. Kohdespesifisenä kantajaproteiinina sT4 voi olla esimerkiksi kantajaproteiinina jakamaan sytotoksisia aineita infektoituneille soluille.

20 Lisäksi, perustuen tietoihin, jotka osoittavat, että T4-resep-tori assosioituu spesifisesti MHC luokka II antigeenien kanssa antigeenejä esittävissä soluissa, kuten on ehdotettu T4+-solu-jen luokkarestriktiossa, sT4:ää voidaan käyttää yhdessä luokka II antigeenien kanssa testaamaan T4-lymfosyytti - kohdesolu-25 vuorovaikutuksia. Näiden esimerkkien lisäksi, jotka perustuvat suoriin sitoutumismäärityksiin sT4:n ja sen kohdemolekyylien välillä, monimutkaisempia määrityksiä voidaan suunnitella, jotka ovat riippuvaisia biokemiallisista vasteista sT4-tunnistami-sessa.

30

Lisäksi annetaan ekspressiovektori, joka koodaa polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä noin +3 - +185 fuusioituneena aminohapposekvenssiin noin +351 - +369. Eräässä toisessa keksinnön suoritusmuo-35 dossa ekspressiovektori koodaa polypeptidiä, jonka aminohappo-sekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä, noin +3 - +106 fuusioituneena aminohapposekvenssiin noin +351 - 102837 18 +369. Vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa ekspressio-vektori koodaa polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi koostuu kuviossa 6 olevasta aminohapposekvenssistä noin +3 -+185.

5 Tämä keksintö antaa myös isäntäsolun, jossa on tämän keksinnön ekspressiovektori. Eräässä keksinnön suoritusmuodossa sopiva isäntä on bakteerisolu. Eräässä toisessa keksinnön suoritusmuodossa bakteerisolu on Esohariohia coli -solu.

10 Vielä eräässä tämän keksinnön suoritusmuodossa sopiva isäntä on eukaryoottinen solu. Vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa eukaryoottinen solu on nisäkässolu. Vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa eukaryoottinen solu on hiivasolu. Ja vielä eräässä keksinnön suoritusmuodossa sopiva isäntä on 15 hyönteissolu.

Tämä keksintö antaa myös keinon tuottaa sT4:ää, jossa on T4-reseptorin ennustettu solunulkopuolinen alue. Käyttämällä tätä osaa T4 cDNArsta, joka koodaa T4-reseptorin leader- ja 20 solunulkopuolisia alueita, so. pre-sT4, vektorit rakennetaan niin, että ne kykenevät yliekspressoimaan sT4:ää nisäkässo-luissa.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-.· 25 tenttivaatimuksissa.

Erään sT4:n sekvenssi on seuraava: 1 .

19 102837 10 20 30 40 10 10 * · · · · « caa as oö aä ocr ccc αγγ Tcr ora βχ τ» »r aa τκ wc tä οα <rr τχ ?χ

S 70 ·0 »o 100 110 UO

* 1 1 __ 1 _ · ·

cwo5eAwaceAaASGAACcaeoSAetsesrtXTAoeacTiecrrc»craciecAA

MCAmAxqGiyV4lProihaAt^KUUuUuuuv&iUuO^ 130 140 ISO . 110 170 110

* 1 1 +1 · · · CIO SCS CIC CTC CEA GGA OOC ACT OC GSA AAÖ MA CIO OT3 C5G Q3C AM AM 033 CAT

^ Uu^LjuUuProAUAUatrGlnOlyltfiLyiVAlVtlUuGlytyiLyiGlyAep ISO 200 310 220 230 240 • · · 1 · «

ACA OIO GM 6T0 MC TTT AGA QCT TS 06 AAG MG M3C A2A ΟΛ TfC OC ICC AM AAC

%rvueiuZ1u3tfCy»7fcrAUS«reinLy»lyiMrXUaiAit»iu1ttptysAm 210 240 270 210 2«0 300 • 1 1 · · ·

.. TOC AAC CMS AA AM ATT CTO CSX AAT (M OCC TOC ICC TA AC? AM 05Γ CCA VSS AAG

10 s«r Act sin XU tyi ZU lm. Gly Am Gin Gly fter r» lm B» ly· oiy Pro s«r Ly1 310 320 330 340 390 3«0 • 1 1 1 1 ·

CTO AAT GM 006 GO (SAC TOC AA MA AOC CIT 70S SAC CM GGA AM! TIC CCC 633 ASC

UuAmAapAr^AlAAopSorAxqAcGStflaiTfcpAitGlnOlYAmlfciftoUull· 370 380 390 400 410 420 . M 1 1 · · · 1 20 ATC ACS AM CXT AM ADI CM CSC TCA CAJ AC? 'WC A3C TOT GAX CIO OMI GAG CMS AAG ilo Ly» Am Iju ly1 Xl· 61u Aop Sir Ajp TJir.Tyr II· cyo Glu Vai Glu A1p gIa Ly1 430 440 450 490 470 410 • · » · 104 · 1 GAG GAO CIS CM TIG CA CIO TIC GGA T39 ACT GCC AAC 7C7 GAC ACC CAC CIC CTT CVS GluGiuVaiGlnuuLauvtiibiGlyUul&rAUAmserAq^lSurKlaLiulJuGln « 490 900 910 920 93Q 940 28 ****** 090 CM AGC GXQ ACC CIO ACC TTO GAG AGC CX CCT GST AGT ACC CCC TCA GIG CM WT GlyOlnSerlmBurleittrlmeiuSerProPteGlySerStrProSirValGlncy1 590 S«0 970 910 990 <Q0 • 1 · 1 1 » AGS AGT OCX AGS GOT AM AAC ASA CM GQS GQ3 AM ACC CTC TCC GTB 7CT OC CIO GAG Ax? Sar Pro Ar? Gly Xy· Am XI· Gin Gly Gly lya Thr Lau MV V«1 Stf Gin Inu Glu 30 <10 <20 <30 <40 <90 «0 • 1 · · 1 1 CSC CMS GM AGT GGC AGC tGG ACA TSC ACT CIC TIG QG AAC OC AM AM GIG GAG TIC UuGlnAepsorGlyChrl^ihrcyoTturvtiiMGinAmGlAlytLytVftlGlutt· 35 20 102837 <70 «IQ <90 710 720 730 • · * 183· * * MA KX ΟΑβ ASC OIO 083 CtX OSt TK OO AM QCB WC MC AA OtC TKt AM AM OM Ly* ll« λβρ SI· v*l VX1 uu AU ft* sln Ly» AI* s«r ter 21* vei Tyt Ly* Ly* Clu 5 730 740 790 710 770 7<0

• · * · « I

oasGMkaecnacTreTQCTXCQacrGaocmjyaoRGttAJeeBjusaacMfr oiy Clu ein v*l Up 9em ser 9he 9n Uu AU fh* φ* v«a oiu uy* Lai nr oiy ur 790 <00 no 120 <39 ' 940 • ' * * · « *

,A oseGMcwweToeeMoaBawMoacrwcwciaeAMWrwBAiiCAceTJTCAC

"O aly Glu Un ttp Trp <Un AU Qlu Arq AU S*r Ur S*r ty* s*r Trp lie Är R» Aap ISO «0 <70 MO <90 too

• * · t « I

CW AM AM AM GM 083 WT OÄ AAA C3S STT AÄ CM OC ÄT AM OTC OM3 A30 OX

UuLy*Ajnitf*C!luV*l9*rv*lLy»Ar9Vei72ur<anAjpP»lY*Uu<UAMetaly 910 930 930 940 990 9<0 ·*··«*

o AMAMcrcaaicweficwAoecsecseoeaeTiBecroeOtfocraaeTCrasA

ly» ly» i*i fro ι*ι κι· lm τι» uu Pro oia Xl» uu Pro fiU xyt Ai* ei/ s«r oiy 970 910 990 1000 1010 1020 _ · t « t t 4 AMCieMcaoQcoTGueoBMiuiAesuuienoosooGMonMecnon

AanUuTfcrLaiAUuuoiuAUiytTfcroiyZytUuKiceinGluveiAjnLuvei __ 1030 1040 10SO ' 1040 1070 1090 2U · * · § · * cieAseMAoccMraecTceMAAAAAiTiCAaeToraMCPSTOSQOAcccAaTa: Vil Ar? au “ftr ain Iäi Gm ly* λβη Leu Tfcr cy» aiu v*l Τϊρ ςίγ Pre Ί1* S«r 1090 UOO 1110 1120 1130 1140 * · · · · *

CCT AM C93 A93 CSC MC T!0 AM CXC CM3 MC AM CMS QA ΑΑβ OTC 70S AMI C3S GM

Pre Ly· Uu mt Uu Mae Imi ly* Lm eiu Ami ly· Qlu AI· ly* v*l s*r ly· Ar* Glu

28 UfO 11M 1170, 1K0 1190 UOO

* « * · * *

MeaeaoxBtasaiecxQMCGcrGMQeBOQOJaGTosoiOToroncrsMrroMTas Ly* AU ’Λ1 Trp Vei Uu j» Pro aiu AU äly rt*t Gin Cy* Uu Laa Mr A*> s*r

Uio 1220 ' U30 1240 1230 U<0 • · * * * *

OSA CM OTC CT3 C8J SU ICC MC X2C AM ffTt CIO CSC AA TO TCC AOC CCS (RO TAA

30 0SY eu vei Lu Qlu Stf Am U« Lys V»114U ρκο ΊΑτ tt? sorltir Pro^ — 1270 *

tee ase CSC OC A

35 102837 21 sT4:n koodaussekvenssi saadaan, esimerkiksi syntetisoimalla geeni käyttämällä tunnettua DNA-sekvenssiä, standardikloonaus-tekniikoilla, jotka perustuvat sekvenssiin ja uudelleen eristä-5 mällä tunnistamalla proteiini, s.o. transfektoimalla cDNA-kloo-nit T4:ää ekspressoivista solulinjoista ja tunnistamalla vasta-aineiden avulla, jotka on kohdistettu proteiinia vastaan. cDNA-kloonit, joissa on sT4-koodaussekvenssi, tunnistetaan käyttämällä oligonukleotidihybridisaatiokoettimia. Koettimet suunni-10 teilaan perustuen T4-proteiinin tunnettuun sekvenssiin. Kun klooni, jossa on sT4-koodaussekvenssi, on tunnistettu, koodaus-sekvenssi leikataan pois käyttämällä restriktioendonukleaaseja ja insertoidaan kloonaus- ja/tai ekspressiovektoreille. Eks-pressiovektorilla, sT4-koodaussekvenssi liitetään operatiivi-15 sesti säätelytoimintoihin, joita tarvitaan tai jotka ovat toivottuja transkriptiossa, translaatiossa ja koodaussekvenssin prosessoinnissa.

Säätelytoimintoihin kuuluvat, esimerkiksi toiminnat, joita tar-20 vitaan RNA-polymeraasin sitoutumiseen ja transkriptioon, yhtä hyvin kuin muihin toimintoihin, kuten transkriptoitavien sekvenssien polyadenylointiin ja lisäykseen. Promoottori voi olla säädeltävä siten, että esimerkiksi ekspressio ei indusoidu ennen kuin transfektion ja transformoitujen kloonien selektion 25 jälkeen. Keksinnön käytännön käytännöllisiin promoottoreihin kuuluvat esimerkiksi SV40 aikainen promoottori ja rous sarcoma-viruksen, moloney sarcoma-viruksen tai sytomegaloviruksen (CMV) pitkät terminaaliset toistot (LTR).

30 Ennen transfektiota sT4-minigeeni, s.o. geeni, joka koodaa sT4-.. reseptorin johtavia ja solunulkopuolisia alueita, liitetään e- dullisesti suurempaan DNA-molekyyliin, jossa on geneettinen va-lintamarkkeri. Valintamarkkerisysteemi koostuu mistä tahansa geenistä tai geeneistä, jotka aiheuttavat helposti tunnistetta-35 van fenotyypin muutoksen transfektoidussa isäntäsolussa. Sellainen fenotyypin muutos voi olla esimerkiksi pesäkkeiden muodostus, lääkeresistenssi, kuten geenit G418:aan tai hygromysii- 102837 22 ni B-resistenssi; tai muita valittavia markkereita kuten ksan-tiiniguaniinifosforibosyylitransferääsi (xgprt), tymidiiniki-naasi (TK) ja galaktokinaasi (galK). Valintamarkkeria, joka sallii geenin amplifikaation, voidaan käyttää kohottamaan ko-5 piolukua, joko kohenneella transfektiotehokkuudella tai lisääntyneellä solunsisäiselläf kiinnostuksen kohteena olevan geenin replikaatiolla ja valintamarkkerilla. Sellaiset markkerit voivat toimia myös amplifioimaan geenin kopiolukua, mukaanlukien geenit dihydrofolaattireduktaasille (metotreksaattiresistens-10 si), CAD (N-fosfoasetyyli-L-aspartaattiresistenssi) ja adeno-siinideaminaasi (2-deoksikoformysiiniresistenssi).

Transkription ja translaation jälkeen nisäkässoluissa leader-sekvenssi näytetään pilkottavan ja valmis sT4 eritetään ilmas-15 toituun alustaan.

Keksinnön edullisessa käytännön muodossa sT4-minigeeni liittyy ihmisen H-ras- tai hiiren dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) mi-nigeeniin, jolloin syntyvät ekspressiovektorit.

20 sT4-minigeeni liittyy, esimerkiksi ihmisen H-ras:iin tai hiiren DHFR:ään, jotta saataisiin valintamarkkeri ja keinot selektiivisesti amplifioida geeniekspressiota näiden geenien yhteisen transfektion kautta. Yleisiin valintamarkkereihin kuuluvat, e-25 simerkiksi DHFR, G418 tai hygromysiini, joka selektoi niin vähän kuin yksittäisen kiinnostuksen kohteena olevan geenin kopion integraatiota. Amplifikaatio, esimerkiksi metotraksaatin (mtx) kanssa DHFR-systeemissä johtaa geenin yliekspressoitumi-seen.

30

Vaihtoehtoinen keino geenin kasvaneelle ekspressoitumiselle on ras-proto-onkogeenin käyttäminen, ras-geeniperheeseen kuuluu H-ras-, K-ras- ja N-ras-geenit. Keksinnön edullisessa sovellutuksessa käytetään H-ras-geeniä.

Muita DNA-toimintoja voidaan kytkeä suoraan tai epäsuorasti sT4-minigeeniin tai sellaiset toiminnat voivat olla ei-kytket- 35 „ 102837

A J

tyjä. Katso esimerkiksi Axel, U.S. patentti nr, 4399216.

Nisäkässoluissa voidaan geenituotteen yliekspressoituminen saada aikaan ohimenevin tai stabiilein keinoin. Ohimenevä ylieks-5 pressoituminen voidaan saada virusmenetelmin, kuten käyttämällä lehmänrokkovirusvektoreita tai geeniamplifikaatiomenetelmin, kuten SV40:een perustuvat vektorit soluissa, jotka ylläpitävät SV-40-replikaatiota. Nämä menetelmät johtavat lopullisesti so-lukuolemaan. Stabiili yliekspressoituminen voidaan saavuttaa 10 luomalla monia geenikopioita, kuten selektiolla geeniamplifi-kaatiolle tai käyttämällä ras-proto-onkogeenejä.

sT4-proteiinin yliekspressoituminen yhteistransfektiolla käyttämällä H-ras-geenisysteemiä voidaan saavuttaa käyttämällä lu-15 kuisia erilaisia solulinjoja, jolloin edullinen solulinja on NIH-3T3-solulinja, joka on kontakti-inhiboitunut hiiren fibro-blastisolulinja. Muihin solulinjoihin kuuluvat normaali rotan munuaisen (NRK) (ATCC 1571) solulinja ja rotan munasolun fibro-blasti 52 (REF-52) solulinja (115).

20

Kun käytetään valintamarkkerisysteemiä, esimerkiksi DHFR meto-treksaatin kanssa (DHFR/MTX-tekniikka), jolloin geenin kopiolu-vun amplifikaatio saavutetaan valikoivalla amplifikaatiolla, Kiinan hamsterin munasarjasolulinja (CHO) on edullinen. Erityi-25 sesti käytetään CHO-soluja, jotka ovat DHFR-viallisia (116).

Muita solutyyppejä, joita voidaan käyttää, ovat esimerkiksi mikä tahansa nisäkässolu, joka on muokattu niin, että se on DHFR-.

30 Joitakin DHFR+-solutyyppejä voidaan käyttää yhdessä mutantti , DHFR-geenien kanssa, jotka ovat vähemmän sensitiivisiä meto- treksaatille kuin normaali DHFR (Axel, U.S. patentti nr. 4399-216). Periaatteessa DHFR+-soluja voidaan käyttää yhdessä normaalien DHFR-geenien ja lisäksi tulevan dominoivan valikoitavan 35 geenin kanssa, kuten G418-resistenssigeeni (117) . Transfektio suoritetaan standarditekniikoilla (118, 119). Näihin tekniikkoihin kuuluvat, esimerkiksi kalsiumfosfaattisaostus, DEAE-dek- 102837 24 straani indusoitu pinosytoosi, elektroporaatio ja virustrans-fektio.

Transfektion jälkeen solu, jossa on sT4-minigeeni, viljellään 5 ravintoalustassa olosuhteissa, jotka sallivat selektoitavan geenin amplifikaation. Voidaan käyttää standardi nisäkässolu-viljelmää, esimerkiksi F12-alusta (CIBCO, Grand Island, New York) ilman hypoksantiinia ja tymidiiniä ja jossa on 100 % naudan sikiön seerumia. Soluviljelmiä pidetään ympäröivässä pai-10 neessa 30-45'C:ssa. Solut, jotka selviävät valinnasta ja eks- pressoivat korkeita sT4-proteiinitasoja, valitaan lisäkasvatuk-seen. Sellaisia soluja kasvatetaan valikoivissa olosuhteissa ja tuote, sT4-proteiini, kerätään ja puhdistetaan.

15 Soluviljelmämenetelmiä, joita voidaan käyttää tämän keksinnön käytännössä, ovat esimerkiksi kiinnittyvien solujen käyttö tai solujen kasvu suspensiossa. Ilmastettua alustaa (CM) voidaan kerätä soluista, jotka ovat kasvaneet suspensiossa tai kiinnittyneenä kiinteään kantajaan, s.o. CM valmistetaan kiinnittyvis-• 20 tä soluista, jotka ovat kasvaneet rullapulloissa tai kasvaneena kiinteällä kantajalla ja viljeltynä suspensiossa tai nesteyte-tyissä tai pakatuissa alustoissa. CM valmistetaan suspensioso-luista sekoitetuista tankkiastioista.

25 Keksinnön sT4:ään kuuluu T4:n solunulkopuolisen alueen johdannaisia. Sellaisissa johdannaisissa on lisäys, deleetioita tai substituutioita, mitkä muuttelut eivät merkittävästi vaikuta haitallisesti proteiinin eritykseen ilmastettuun alustaan ja proteiinin affiniteettiin HIV env-proteiiniin, s.o., gpl20. E-30 simerkiksi, yksi tai muutama aminohappo voidaan lisätä tai de-.. letoida N- tai C-terminuksesta. Tai yksi tai muutama aminohap- - po, edullisesti ei enempää kuin neljä aminohappoa, voidaan in- sertoida, deletoida tai substituoida sisäisiin aminohappoihin. Vaihtoehtoisesti, hybridiproteiini, s.o. translationaalinen 35 fuusio, voidaan tehdä sT4:n ja proteiinikantajän, toisen antigeeni- tai toisen sT4-molekyylin välille poly-sT4-molekyylin valmistamiseksi. Vielä eräässä vaihtoehdossa sT4 voidaan konju- 102837 25 goida synteettisesti kajitajamolekyyliin.

Eräs sT4-johdannaisen suoritusmuoto kuvataan allaolevissa esimerkeissä (katso esimerkki 3). sT4:n affiniteetti HIV envrhen 5 voidaan osoittaa kilpailevalla sitoutumismäärityksellä käyttämällä sT4-molekyyliä, jolla on tunnettu affiniteetti tai käyttämällä vasta-aineita, jotka tunnistavat T4-reseptorin, kuten OKT4 ja OKT4A. Keksinnön hyödylliset johdannais-sT4-molekyylit saostetaan valikoivasti ilmastetusta alustasta OKT4A:lla kuten 10 esimerkissä 3 on’näytetty. Johdannaisia voidaan valmistaa kemiallisesti ekspressoitumisen jälkeen, tai geneettisesti ennen ekspressoitumista muokkaamalla leader ja/tai solunulkopuolisen alueen koodaussekvenssiä.

15 Keksinnön sT4 voidaan puhdistaa käytetystä alustasta käyttämällä erilaisia proteiinin puhdistustekniikkoja, esimerkiksi, af-finiteettikromatografia; ioninvaihtokromatografia; koon erotta-miskromatografia tai käänteisfaasikromatografia.

; 20 sT4 voidaan puhdistaa affiniteettikromatografiällä käyttämällä yleisiä ryhmäspesifisiä adsorbantteja, esimerkiksi hiilihydraattia sitovaa tai väriaffiniteettiligandeja; tai käyttämällä ligandeja, jotka spesifisesti sitoutuvat sT4:ään, esimerkiksi monoklonaalinen vasta-aine tai HIV gpl20-proteiini tai sen o-25 sat.

Tyypilliseen puhdistuskaavioon kuuluu: (1) kasvatetaan solut seerumivapaassa selektiokasvualustassa; (2) ilmastetun alustan selkeyttäminen; ja (3) keksinnön sT4:n erotus muista proteii-30 neista, jotka ovat läsnä ilmastetussa alustassa.

• · ·! Edullisessa menetelmässä sT4 puhdistetaan seerumivapaasta vil- jelyalustasta käyttämällä kromatografiavaiheiden sarjoja, jotka perustuvat sT4-molekyylin fysikaalisiin ominaisuuksiin. sT4 35 voidaan puhdistaa myös viljelyalustasta, jossa on seerumia käyttämällä samanlaisia kromatografisia menetelmiä.

102837 26 sT4:n edullisessa puhdistusmenetelmässä viljelyalustaa annetaan ensin mennä ioninvaihtopylvään läpi, edullisesti S-Sepharose* (sulfopropyyli Sepharose) pylväs, joka sitoo sT4:n, kun taas pääosa kontaminoivasta proteiinista virtaa pylvään läpi. Prote-5 iininäyte eluoidaan sitten käyttämällä lineaarista suolägradi-enttia. Käytetään toista ioninvaihtopylvästä. Tämä pylväs, e-dullisesti Q-Sepharose* (kvaternäärinen aminoetyyli Sepharose) pylväällä on ominaisuuksia, kuten että näytteessä läsnäolevat kontaminoivat proteiinit sitoutuvat pylvääseen, kun taas sT4 ei 10 sitoudu ja saadaan pylvään läpi virranneesta puskurista. Lopuksi käytetään geelisuodatuspylvästä, joka toimii poistamaan jäljelle jääneet kontaminoivat materiaalit.

Vaihtoehtoiseen sT4:n puhdistusmenetelmään kuuluu monoklonaa-15 listen vasta-aineiden käyttö, jotka on kohdistettu sT4:ää vastaan. sT4-proteiini voidaan puhdistaa yhdessä vaiheessa antamalla selkeytetyn viljelyalustan mennä affiniteettigeelikanta-jan läpi, johon monoklonaalinen vasta-aine, joka on kohdistettu sT4:ää vastaan, sitoutuu. sT4 sitoutuu pylvääseen vasta-aineen * 20 sitoutumiskohtaan, kun kaikki kontaminoivat proteiinit vir- taavat pylvään läpi. sT4 eluoidaan sitten pylväästä olosuhteissa, jotka estävät sT4-proteiinia inaktivoitumasta.

Lisäksi on annettu menetelmä, jossa tuotetaan mitä tahansa e-25 dellä kuvattua terapeuttista ainetta, joka kykenee spesifisesti muodostamaan kompleksin ihmisen immuunikatoviruksen kuoren gly-koproteiinin kanssa, mihin kuuluu että kasvatetaan keksinnön isäntävektorisysteemiä sopivissa olosuhteissa, jotka sallivat terapeuttisen aineen tuottamisen ja siten tuotetun terapeutti-30 sen aineen keräämisen.

< — - sT4:ää voidaan käyttää diagnostisissa määrityksissä T4-proteii- nien havaitsemiseen tai sellaisten molekyylien, joiden kanssa ne ovat vuorovaikutuksessa. Esimerkiksi, kvantitoimisella T4-35 ja T4+-solut ja vasta-aineet T4:ään olisi diagnostista arvoa AIDSiin.

10283.7

Lisäksi, sT4:ää voidaan käyttää tuottamaan uusia diagnostisia reagenssejä, esimerkiksi Mabs tai muun tyyppisiä molekyylejä käytettäväksi standardi immunologisissa määrityksissä, s.o. ELISA, vangitsemisimmunomääritykset, radioimmunomääritykset.

5 Koska sT4 osoittaa OKT4:ää, OKT4A:ta ja useimpia ellei kaikkia muita T4-reseptorin pintaepitooppeja, sT4 on erityisen hyödyllinen immunodiagnostisissa määrityksissä, sillä sitä voidaan käyttää T4-tasojen absoluuttiseen kvatitoimiseen systeemissä. Tällä hetkellä ei ole standardeja T4-reseptorin kvantitoimisek-10 si.

T4-reseptori on kolmessa erilaisessa kemiallisessa ympäristössä; hapettava, hydrofiilinen solupinta; hydrofobinen membraani; ja pelkistävä, hydrofiilinen sytoplasma. Nämä erilaiset ympä-15 ristöt estäisivät todennäköisemmin reseptorin eristämisen sen täydellisessä luonnontilassa. sT4, joka koostuu vain solunul-kopuolisesta alueesta, eritetään liukoisena proteiinina solusu-pernatanttiin ja sen konformaatio näyttää matkivan reseptori-. pinta-alueen pintaa. Täten sT4 on sopiva yksityiskohtaiseen ra- 20 kenneanalyysiin, erityisesti röntgensädekristallografiaan.

sT4:n kolmiulotteisen rakenteen määritys yksinään tai komplek-soidussa muodossa muiden interaktiivisten molekyylien kanssa voisi antaa perustan selektiivisten sT4:n vastavaikuttajien ja vaikuttajien loogiselle suunnittelulle.

25 Tämän keksinnön antamat erilaiset ennaltaehkäisevät ja immuni-saatiomenetelmät AIDSiin perustuvat uusien peptidien, vasta-aineiden ja DNA-molekyylien, jotka on esitetty tässä, kykyihin muodostaa komplekseja tai hybridisoitua spesifisten molekyylien 30 kanssa ja herättää immunologinen vaste, joka on tehokas neutralisoimaan AIDS-viruksen. Nämä molekyylit, menetelmät niiden valmistamiseksi ja menetelmät AIDSin hoitoon ymmärretään paremmin viittaamalla seuraaviin kokeisiin ja esimerkkeihin, joita annetaan valaisevissa tarkoituksissa eikä niiden ole tarkoitus 35 selittää tämän keksinnön, joka kuvataan tähän liitetyissä patenttivaatimuksissa, alaa rajoittavaksi.

102837

Materiaalit ja menetelmät Solut ja vasta-aineet 5 Ääreisveren leukosyytit, jotka eristettiin Ficoll-Hypaque ti-heysgradienttisentrifugaatiolla, fraktioitiin lampaan punasolu ruusuke-positiivisiin (E+)-soluihin. T4+- ja T8+-alasarjät E+-populaatiossa eristettiin selektoimalla positiivisesti T8-kan-tavia soluja, joissa oli anti-T8-vasta-ainetta ja ihmisen puna-10 soluja konjugoituneena affiniteettipuhdistetun kani anti-hiiren IgG:n kanssa (10). Näiden alasarjojen sytofluorimetrinen analyysi osoitti, että T4+-solut olivat 95 % T4+:aa ja 2 % T8:aa, kun taas T8+-solut olivat 95 % T8+:aa ja 2 % T4+:aa.

15 Fro 2,2 T-solulinja (T3-, T4+, T8+, T11+) saatiin aikuiselta potilaalta, jolla oli erilaistumaton akuutti leukemia. Jurkatt on T3-, T4+, T8+, Tll-, RPMI 8402 on T3-, T4-, T8-, T11+. OT-CLL on krooninen lymfosyyttinen leukemia, joka on T3+, T4+, T8-ja T11+ (22). T4+-solulinjat CEM ja Molt 4 saatiin American Ty-20 pe Culture Collectionista. Kaikkia leukemia T-solulinjoja kasvatettiin jatkuvasti RPMI 1640-alustassa, jossa oli 5 % vasikan sikiön seerumia. Transformoidut B-solulinjat CB, CP58 ja CP94 saatiin kuten edellä kuvattiin (23). 1

Affiniteettipuhdistettu kani anti-hiiri IgG konjugoitiin ihmisen punasoluihin kromikloridimenetelmällä (24).

L-solujen ja NIH 3T3-solujen yhteistransformaatio 30 Hiiriin ja rottiin liittyvät L tk-aprt—soluja pidettiin Dul-. becco's modifioidussa Eagle alustassa (DME), johon oli lisätty 10 % vasikan seerumia (Gibco) ja 50 pg/ml diaminopuriinia (DAP). L-solut maljattiin tiheytenä 5 x 104 solua 10 cm:n maljaa kohti, 1 päivä ennen transformaatiota. Kalsiumfosfaattisa-35 ostumat valmistettiin Graham ja van der Eb menetelmän mukaan (25), jota Wigler et ai. olivat muokanneet, käyttämällä 100 ng pTK:ta ja 20 pg suurimolekyylipainoista T-solu- tai L-solu- 102837 29 DNArta maljaa kohti. L-solut laitettiin selektion alaisiksi DME:hen, jossa oli 10 % vasikan seerumia, 15 pg/ml hypoksantii-nia, 1 ug/ml aminopteriiniä ja 5 ug/ml tymidiiniä (HAT-alusta (27)) seuraavana päivänä. 12-14 päivän jälkeen HAT-selektiolla, 5 seulottiin tk+-transformantit käyttämällä rusettimääritystä.

Hiiren NIH 3T3-solut pidettiin DME:ssä, johon oli lisätty 10 % vastasyntyneen vasikan seerumia (Gibco). NIh 3T3-solut maljat-tiin tiheytenä 5 x 10* solua 10 cm:n maljaa kohti, 2 päivää en-10 nen transformaatiota. Soluille käytettiin kalsiumfosfaattisaos-tusta käyttämällä 10 ug kantaja-DNA:ta ja joko 10 ug T4-pMV6tk/ neo tai 10 ug T4-pVcos7 ja 500 ng pSV2neo. 2 päivän kuluttua solut laitettiin selektion alaisiksi DME:hen, jossa oli 10 % vasikan seerumia ja 500 pg/ml G418 (Geneticin*; Gibco). Ruset-15 timääritykset suoritettiin säilyneille pesäkkeille viikko selektiivisellä alustalla kasvamisen jälkeen.

Rusettimääritys 20 Sen jälkeen kun oli pesty kerran fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), maljoja inkuboitiin 2,5 ml kanssa puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta OKTMA (1 mg/ml) laimennettu 1/500 PBS:ään, jossa oli 5 % vasikan sikiön seerumia 45 min huoneenlämpötilassa. Vapaa vasta-aine poistettiin maljoilta 25 kolmella varovaisella huuhtelulla PBS:ssä. Lisättiin 6 ml ihmisen punasoluja, jotka oli konjugoitu puhdistetun kani anti-hiiri IgG-vasta-aineen kanssa (2 % v/v kantaliuos, laimennettu 1/10 PBS/5 % vasikan sikiön seerumi) ja maljat jätettiin huoneenlämpötilaan. 45 min kuluttua, vapaat punasolut imettiin va-30 rovasti pois ja PBS lisättiin ennen rusettipositiivisten pesäk-, keiden tarkastelua.

Sytofluorimetrinen analyysi 35 Kiinnittyneet solut poistettiin 0,005 M EDTA:11a PBS:ssä ja pestiin kerran PBS:llä, jossa oli 1 % naudan seerumialbumiinia (BSA) ja 0,01 % natriumatsidia (cytowash). Solut (5 x 101) 0,1 10283? 30 ml:ssa lisättiin putkiin sopivin OKT*4-, OKT*8- ja kontrolli-vasta-aine-laimennuksin. Solu-vasta-aineseosta inkuboitiin 45 min 4*C:ssa ja sitten pestiin kaksi kertaa cytowashilla. Soluihin lisättiin fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC)-konjugoidut 5 vuohi anti-hiiri IgG + A + M (Cappel) ja inkuboitiin 1 h 4'C: ssa. Sitten solut pestiin kolme kertaa cytowashissa ja suspen-doitiin uudelleen 0,5 ml PBS:ää, jossa oli 0,01 % natriumatsi-dia. Solut analysoitiin Becton Dickinson FACS IV solulajitteli-jalla ja tiedot säilytettiin ja piirrettiin käyttämällä VAX/ 10 780-tietokonetta (Digital Equipment Co.) RNA- ja DNA-eristys

Soluista eristettiin kokonais-RNA homogenisoimalla 4 M guanidi-15 niumtiosyaanaatissa, jota seurasi ultrasentrifugaatio 5,7 M

CsCl-tyynyssä (28). Poly(A)+-selektio saavutettiin oligo(dT)-selluloosakromatografiällä (tyyppi 3, Collaborative Research) (29). Suurimolekyylipainoinen genominen DNA valmistettiin kuten Wigler et ai. ovat kuvanneet (26).

20 cDNA ja genominen kirjasto

Kaksoisjuosteinen cDNA syntetisoitiin poly(A)+-RNA:sta, joka oli johdettu ihmisen ääreis-T-soluista. EcoRI- ja T4 DNA-poly-. 25 meraasikäsittelyn jälkeen kaksoisjuosteinen cDNA kloonattiin lambdagtlO:n EcoRI-kohtaan (30) käyttämällä EcoRI-linkkereitä. Charon 4 ihmisen genominen kirjasto saatiin ystävällisesti Dr. Tom Maniatiselta (Harvard University) (31).

30 Subtraktoidun cDNA-koettimen synteesi * “P-leimattu cDNA syntetisoitiin poly(A)+ RNA:sta, joka oli joh dettu primäärisestä transformantista, LTD-4, kuten Davis et ai. kuvaavat (32). Sen jälkeen, kun cDNA oli hybridisoitu ylimäärän 35 ei-transformoitua L-solu poly(A)+ RNA:n kanssa (Rot=3000), yksittäis juosteiset sekvenssit, jotka rikastettiin ihmisen cDNA: ta varten, eristettiin hydroksiapatiittikromatografiällä (32).

102837 31

Ennen suodatinhybridisaatiota, subraktoitu cDNA-koetin konsentroitiin sek. butanolin kanssa ja suola poistettiin G-50 Sepha-dex-pylväässä, joka oli tasapainotettu TE:llä.

5 cDNA- ja genomisien kirjastojen seulonta

Ihmisen ääreis-T-solukirjasto maljattiin E^_ coli C600/HFL:lle ja ihmisen genominen kirjasto maljattiin E^_ coli LE392:lle. Kaksoissuodattimien seulonta suoritettiin standardimenetelmien 10 mukaan (33), hybridisaatio suoritettiin 50 %:ssa formamidissa ja 5 x SSC:ssä 42*C:ssa. cDNA-kirjaston seulomisessa käytettiin 6 x 101 cpm:n subraktoitua koetinta 137 mm:ä kohden nitrosellu-loosasuodatinta. Genomisen kirjaston suodattimet hybridisoitiin nick-transloituun (34) cDNA-inserttiin. Pesut suoritettiin 15 68'C:ssa, lopullinen pesu 0,2 x SSCrssä. Autoradiografia suori tettiin -70'C:ssa vahvistusvarjostimen läsnäollessa 1-2 päivää.

DNA-sekvenssointi • 20 pT4B:n restriktiofragmentit subkloonattiin M13-vektoreille mpl8 ja mpl9 (35). Sekvenssointireaktiot suoritettiin käyttämällä dideoksiketjuterminaatiotekniikkaa (36) . Sekvenssointistrategia on kuvattu kuviossa 3B.

25 Southern ja Northern Blot analyysit

Suurimolekyylipainoiset DNA:t pilkottiin 5 yksiköllä restrik-tionukleaasia pg:aa DNA:ta kohden valmistajan suosituksen mukaisesti (Boehringer Mannheim). Näytteille tehtiin elektrofo-30 reesi 0,8 %:ssa agaroosigeelissä. DNA-fragmentit siirrettiin GeneScreenille (New England Nuclear; (37)) ja hybridisoitiin, • kuten Church ja Gilbert ovat kuvanneet (38).

RNA ajettiin 0,8 %:ssa agaroosi-formaldehydigeelissä (39) ja 35 siirrettiin GeneScreenille. Northern hybridisaatio suoritettiin valmistajan antamien ohjeiden mukaan. Sekä Southern että Northern blotit hybridisoitiin nick-transloituihin koettimiin.

102837 32 SP6 RNA:n synteesi ja in vitro translaatio

Kb T4 cDNA subkloonattiin pSP65:n EcoRI-kohtaan (Promega Bio-5 tee) ja linearisoitiin Hindlll:11a. Linearisoidun plasmidi- DNA:n (1 ug) transkriptio SP6-polymeraasin kanssa radioleimat-tujen nukleotidien puuttuessa suoritettiin kuten kuvattiin (40), paitsi että GpppG ja leimaamaton CT9 lisättiin transkrip-tiopuskuriin. Yksi kymmenes reaktioseoksesta transloitiin veh-10 nän alkiosysteemissä (Bethesda Research Laboratories), jossa oli L-[,!S]-metioniinia (Amersham) ja 1 mikromol S-adenosyylime-tioniinia. In vitro translaatiotuotteille tehtiin SDS-polyak-ryyliamidielektroforeesi pelkistävissä olosuhteissa, kuten alla on kuvattu.

15

Soluleimaaminen, lektiinikromatografia ja immunosaostus

Soluja kasvatettiin 12 h metioniinivapaassa DME-alustassa, jossa oli 10 % dialysoitua vasikan seerumia ja 1 mCi L-[”S]-metio-: 20 niiniä (Amersham), kuten edellä kuvattiin (41). Solut liuotet tiin 10 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl (TBS), jossa oli 0,5 % Nonidet P-40 (Shell) ja 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluori-dia (Sigma). Lysaatteja sentrifugoitiin 1 h 100000 x g ja su-pernatanteille tehtiin linssilektiinikromatografia (Pharmacia) , 25 Hedo et ai. menetelmien mukaan (42). Eluaatit esiabsorboitiin kerran kontrollihiiren vesivatsojen seoksen ja proteiini A-Sep-harosen (Pharmacia) kanssa 1 h 4‘C:ssa ja kahdesti proteiini A-Sepharosen kanssa yksinään 1 h 4'C:ssa. Jokaista supernatant-tia, 2,5 x 104 cpm, sekoitettiin sitten 10 μΐ monoklonaalisen 30 vasta-aineen (noin 1 mg/ml) ja proteiini A-Sepharosen kanssa ja , inkuboitiin kääntöpöydällä yön yli 4'C:ssa. Alustat pestiin • sitten 4 kertaa kylmällä TBS:llä, jossa oli 0,5 % NP-40 ja 0,2 % SDSrää ja suspendoitiin uudelleen elektroforeesinäytepusku-riin.

35 102837

Geelielektroforeesi SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin Laemmlin 5 menetelmän mukaan (43). Immunosabstumat ja in vitro translaa-tiotuotteet liuotettiin näytepuskuriin, jossa oli tai ei ollut 2-merkaptoetanolia ja sitten laitettiin 10 % polyakryyliamidi-geeleihin. Suoritettiin autoradiografia Kodak XAR-5 filmille vahvistusvarjostimien läsnäollessa (DuPont Chemical Company).

10

Samanaikainen transformaatio ja rusetrimääritys

Hiiren ^-S-soluja pidettiin Dulbecco's modifioidussa Eagle's alustassa (DME), johon oli lisätty 10 % vasikan seerumia (CS) 15 (Gibco). ^-2-solut maljattiin tiheydellä 5 x 105 solua 10 cm:n maljaa kohti, 2 päivää ennen transformaatiota. Kalsiumfosfaat-tisaostumat valmistettiin Graham ja van der Eb menetelmän mukaan (25), jota Wigler et ai. olivat muokanneet (27). Saostuma-mat laitettiin soluihin käyttämällä 10 pg kantaja-DNA:ta ja jo-: 20 ko 10 pg T4-pMV7:ää tai 10 pg T8-pMV7:ää. 2 päivän kuluttua so lut laitettiin selektion alaisiksi DME/10 % CS:ään ja 500 pg/ml G418:ta (Geneticin*; Gibco).

Rusettimääritykset T4+- tai T8+-pesäkkeiden tunnistamiseksi 25 tehtiin selvinneille pesäkkeille 1 viikko kasvun jälkeen selek-tioalustalla. Sen jälkeen, kun oli huuhdeltu kerran fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), maljoja inkuboitiin 2,5 ml:n kanssa puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta OKT*4A tai OKT*8 (1 mg/ml; Ortho), joka oli laimennettu 1/500 PBS:ään, 30 jossa oli 5 % vasikan sikiön seerumia (FCS) 45 min huoneenlämpötilassa. Vapaa vasta-aine poistettiin maljoilta kolmella va- * rovaisella huuhtelulla PBS:ssä. 6 ml ihmisen punasoluja, jotka oli konjugoitu puhdistetun kani anti-hiiri IgG vasta-aineen kanssa (2 % kantaliuos, laimennettu 1/10 PBS/5 % FCS), lisät-35 tiin ja maljat jätettiin huoneenlämpötilaan. 45 min kuluttua vapaat punasolut imettiin varovasti ja PBS lisättiin ennen tarkastelua. T4+- ja T8+- ^-2-kloonit puhdistettiin pesäke-eris- 102837 34 tyksellä ja luonnehdittiin virtaussytometrillä ja Northern blot analyysillä.

Rekombinantti-retroviruksen tuotto ja infektio 5 T4+- ja T8+ (^-2-kloonit eristettiin, mikä tuottaa rekombinant-ti-retrovirusvarastoja, joiden tiitterit ovat 101 cfu/ml. Vi-rusvarastot valmistettiin lisäämällä 10 ml tuoretta DME/10 % CS:ää lähes konfluenttia yksikerroksista T4+- tai T8+- ψ-2-10 klooneja. 24 h kuluttua alusta poistettiin ja suodatettiin 0,45 pm suodattimen läpi (Millipore). Infektiota varten 5 x 10’ solua inkuboitiin 2 ml kanssa virussupernatanttia (tai laimennusta) 8 pg/ml kanssa polybreeniä (Aldrich). 3 h kuluttua, lisättiin 8 ml tuoretta alustaa. 3 päivää infektion jälkeen solut 15 ympättiin uudelleen DME/10 % CS:ään, jossa oli 500 ug/ml G4-18:ää, kasvatettiin 2 viikkoa, etsittiin G418r-pesäkkeet ja seulottiin pinta T4- tai T8-ekspressoitumiselle käyttämällä in situ rusettimenetelmää tai virtaussytometriaa.

20 V,-2-viljelmä supernatantit käytettiin infektoimaan hiiren /-AM- solut, kuten edellä kuvattiin. T4+ tai T8+ kiinnittyvät trans-formantit puhdistettiin in situ rusettimääritykseilä, jota seurasi pesäke-eristys; T4+ tai T8+ ei-kiinnittyneet transforman-tit puhdistettiin fluoresointiaktivoidulla solulajittelulla 25 (FACS). Ei-kiinnittyvät ihmisen lymfasolulinjat (HSB2, RPMI-T-’ solut; Raji-B-solut) ja kiinnittyvät epiteelisolut (HeLa) in- fektoitiin T4+- tai T8+ jP-AM-kloonien yhteiskasvatuksella (esi-käsitelty 10 ug/ml mitomysiini-C;tä 2 h; Sigma) ja puhdistettiin.

30 . Solulinjoista selektoitiin G418-resistenssit 1,5 mg/ml-konsen- traatiossa, paitsi HeLa-solut, jotka vaativat 1 mg/ml ja fibro-blastit, jotka vaativat 0,5 mg/ml. Kaikki soluviljelmät, jotka tuottavat rekombinantti amfotrooppisia viruksia (4-AM) ylläpi-35 dettiin P3 suojaolosuhteissa.

102837 AIDS-virus HTLV-III/LAV prototyyppi LAV-kanta saatiin J.-C. Chermanilta 5 (Institut Pasteur, Paris; (45)). Näissä tutkimuksissa käytetyt virusympit olivat toisesta viidenteen viruksen kierrättämisestä laboratoriossamme. Ympit ovat viljelmäsupernatantteja HTLV-IH/ LAV-infektoiduista, fytohemagglutiniini (PHA)-stimuloiduista ääreislymfosyyteistä, jotka kerättiin peräkkäisillä sentrifu-10 gaatioilla (300 x g 7 min, jota seurasi 1500 x g 20 min) ja säilöttiin nestetyppeen. Sitoutumiskokeita varten virus konsentroitiin viljelysupernatanteista, kerättiin kuten edellä ultra-sentrifugaatiolla 90000 x g 90 min 15 % renograffin-tyynyn päällä (E.R. Squibb) 0,01 M Tris, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 15 8,0.

Anti-HTLV-III/LAV-reagenssit

Seerumia, jossa oli korkeat vasta-ainetasot HTLV-III/LAV:lie, 20 saatiin homoseksuaaliselta mieheltä, jolla oli krooninen imusolmukkeiden sairaus ja sen spesifisyys on kuvattu immunofluo-resenssillä (46), Western blot analyysillä (47) ja radioimmuno-saostumalla (48). Osia IgG-fraktioista kytkettiin fluoreskeii-ni-isotiosyaanatin kanssa (FITC; FITC'.proteiini suhde 10,7 ug/-25 ml), piparjuuriperoksidaasin kanssa (HPO; tyyppi VI; Sigma) ja : agaroosin, kuten kuvattiin (47, 49, 50, 51). IgG-konjugaatteja ei-immuunista seerumista valmistettiin rinnakkain.

Käänteistranskriptaasimääritys 30

Magnesiumriippuvainen, osasista koottu käänteistranskriptaasi-(RT) aktiivisuus mitattiin (A), (dT) 12-18 (tai (dA), (dT)negatiivisena kontrollina) templaattialukkeen kanssa 7,5 mM Mg!,:n läsnäollessa (52).

35 102837

Sytoplasmisen AIDS-viruksen immunofluoresointimääritys

Kasvatetut solut (1 x 10! 0,1 ml:ssa) sentrifugoitiin lasisen 5 objektilasin päällä (Shandon Cytocentrifuge), kiinnitettiin 95 % etanolissa ja 5 % etikkahapossa -20'C:ssa 30 min ja hydrat-tiin uudelleen kolmella 10 min PBS-vaihdolla (0,01 M PO,, 0,15 M NaCl, pH 8,0). Objektilaseja pidettiin 1/5000 FITC-anti-HTLV-III/LAV-laimenneuksessa (19 pg/ml) 30 min huoneenlämpötilassa. 10 Sitten objektilasit pestiin (kolme vaihtoa, 10 min jokainen) ja kiinnitettynä peiteliuskaan 50 %:lla glyserolilla PBS:ssä. Objektilasit tutkittiin läpivalaisu Leitz Orthoplan mikroskoopilla 630 x voimalla. Näissä olosuhteissa FITC-anti-HTLV-Ill/LAV-reagenssi on spesifinen HTLV-III/LAV:lie. Ei-infektoituneet 15 PHA-stimuloidut solut, Epstein Barr (EB)-virusinfektoidut B-so-lulinjat, adenovirus-infektoitu solulinja, useat T-solulinjat ja HTLV-I- ja HTLV-II-infektoituneet solulinjat eivät värjään-tyneet.

20 AIDS-virus immunomääritys (antigeenin vangitsemismääritys) Tämä on sandwich-määritys, joka on kuvattu yksityiskohtaisesti (47). Lyhyesti, viljelmäsupernatanttia lisätään mikrotiitteri-maljakaivoihin, jotka on peitetty anti-HTLV-III/LAV IgG:llä.

25 Sen jälkeen, kun maljat on pesty, sitoutunut virusantigeeni ha-* valtaan HPO-anti-HTLV-III/LAV:llä. Tämä määritys, joka on aina kin yhtä sensitiivinen kuin RT-määritys, on negatiivinen vilje-lysupernatanteille PHA-stimuloiduista lymfosyyteistä lukuisista luovuttajista, EB virus-infektoiduista B-solulinjoista, lukui-30 sista T-solulinjoista, polyklonaalisista ja kloonatuista IL-2 riippuvaisista T-solulinjoista, myeloidista linjasta K562, samoin kuin linjoista, joissa on HTLV-I tai HTLV-II. Katkaistu 0D,„ positiivisen supernatantin erottamiseksi negatiivisesta määritettiin jokaisella kerralla keskiarvosta plus 2 SD ainakin 35 10 toistuvaa määritystä kontrollisupernatanteista (ei-infektoi tu soluviljelmä), jotka oli kerätty samaan aikaan.

37 102837 AIDS-virus infektiivisyys-(ID-50)-määritys

Mikroviljelmämääritys infektiivisen HTLV-III/LAV:n titrauksek-si on kuvattu yksityiskohtaisesti (47) . Lyhyesti, PHA-stimuloi-5 dut lymfosyytit tai solulinjat (2 x 10* solua/ml) ympättiin 10-kertaisella virusymppilaimennussarjalla ja inkuboitiin 18 h 37' *C:ssa. Solut pestiin ja maljattiin mikroviljelmään (10-20 viljelmää laimennusta kohti; 1 x 105 solua viljelmää kohti 0,25 ml:n alustassa). Joka neljäs päivä poistettiin 100 μΐ superna-10 tanttia ja laitettiin tilalle tuoretta alustaa. Sitten super-natanteista määritettiin virusantigeenit antigeenin vangitse-mismäärityksellä, kuten edellä kuvattiin. Infektiivinen virus-tiitteri (ID-50) kuvataan sen laimennuksen käänteisarvoksi, jossa 50 % viljelmistä on viruspositiivisia (47).

15 VSV pseudotyyppimääritys

Rakkulainen suutulehdusvirus (VSV, Indiana-kanta, villityyppi) kasvatettiin soluissa, jotka tuottivat retrovirusta, jota tar-20 vitaan kuoren pseudotyyppiin, kuten on kuvattu (53). Hyperim- muunia neutralisoivaa lammas anti-VSV-seerumia lisättiin kerättyihin VSV:hen ei-pseudotyyppivirionien inaktivoimiseksi. Pseu-dotyyppitiitterit ulottuivat 104-10! PFU/ml. Määritystä varten maljattiin 2 x 10! solua, jotka oli tarkoitus infektoida VSV-25 pseudotyypeillä, halkaisijaltaan 30 mm kudosviljelmäkaivoihin. HeLa-, NIH 3T3- ja L-solut olivat luonnostaan kiinnittyviä; kaikki muut solutyypit kiinnittyivät, kun pohjan esikäsitel-tiin 50 pg:lla poly-L-lysiiniä. Sen jälkeen, kun virus oli adsorboitunut 1 h, solut pestiin ja jokaiseen kaivoon lisättiin 30 101 minkin CCL64 tai naudan MDBK solua. Nämä solut tuottavat , erinomaiset plakit toiseen VSV-infektioon, mutta ovat resis- tensse jä pseudotyyppien virionien infektiolle. Sen jälkeen, kun plakki-indikaattorisolujen oli annettu laskeutua ja levitä (noin 90 35 min), yksikerroksiset kalvot peitettiin agarialustalla. VSV- plakit laskettiin 2 päivää infektion jälkeen. Käytettiin anti-T4A monoklonaalista vasta-ainetta (1:20), anti-HTLV-III seeru- 102837 38 mia (1:10) tai anti-HTLV-I seerumia (1:10) inhiboimaan pseudo-tyyppiplakkien muodostumista esikäsittelemällä solut 30 min ennen pseudotyyppien lisäämistä (54).

5 Synsytium induktion määritys 2 x 10’ solua kasvatettiin yhdessä 2 x 101 H9-solun kanssa, jotka oli infektoitu ja jotka tuottivat HTLV-III (55) 10 mm halkaisijaltaan olevissa kaivoissa. Viljelmää inkuboitiin 37' 10 'C:ssa ja synsytian muodostus tutkittiin 18 h kuluttua, kuten aikaisemmin on kuvattu (54, 56). Solut, joissa oli 5 tai useampia synsytioita, laskettiin positiivisiksi. Synsytium inhibii-tio määritettiin lisäämällä anti-T4A monoklonaalista vasta-ainetta (1:20) sekoitettuihin viljelmiin ymopäämisen kanssa sa-15 manaikaisesti.

Sytofluorimetrinen analyysi ja AIDS-virus sitoutuminen

Menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti (46). Lyhyesti, solu-20 pinta T4 tai T8-ekspressio määritettiin suoralla immunofluo-resenssilla fluoreskeiini-konjugoidun anti-T4A:n tai anti-T8 monoklonaalisten vasta-aineiden (OKTMA, 0KT*8) kanssa. Laimen-nus/pesupuskuri oli 0,01 M PO,, 0,15 M NaCl, pH 7,4, jossa oli 0,1 % naudan seerumin albumiinia, 2 % v/v AB' ihmisen seerumia 25 ja 0,01 % NaN,. Kaikki reagenssit titrattiin etukäteen optimaaliselle (kyllästetty) sitoutumiselle. Soluja (5 x 10!) inkuboitiin 25 μΐ laimennuksessa monoklonaalista vasta-ainetta 30 min 4'C:ssa. Solut pestiin sentrifugoimalla (300 x g 7 min), sus-pendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan 1 % paraformaldehydiä suolaliu-30 oksessa) ja analysoitiin fluoresenssiaktivoidulla solulajitte-lijalla (FACS IV, Becton Dickinson). HTLV-III/LAV-sitoutumista : varten inkuboitiin 5 x 10’ solua HTLV-III/LAV:n kanssa, (500 ng 10 ul:ssa) 30 min 37'C:ssa. Pestyt solut suspendoitiin uudelleen 25 μΐ fluoreskeiinikonjugoitua anti-HTLV-III/LAV 30 min 35 4*C:ssa. Solut pestiin, suspendoitiin uudelleen 1 % paraformal-dehydiä ja analysoitiin FACS:lla kuten edellä. HTLV-III/LAV-in-hibiitiota varten soluja esi-inkuboitiin anti-T4A:n tai anti- 102837 39 T8:n kanssa (20 ng 20 ul:ssa) 30 min 4°C:ssa, jota seurasi HTLV-III/LAV-lisäys (500 ng 10 pl:ssa) 30 min 37*C:ssa. Solut pestiin, inkuboitiin fluoreskeiini-konjugoidun anti-HTLV-III/-LAV:n kanssa, pestiin, suspendoitiin uudelleen paraformaldehy-5 diin ja analysoitiin FACS:lla kuten edellä.

Solupinnan radiojodinointi, immunosaostuminen ja geelielektro-foreesi 10 T4+ NIH 3T3 transformantit radiojodinoitiin laktoperoksidaasi-

tekniikalla (18) seuraavasti: 4 x 107 solua suspendoitiin 1 ml: aan PBS:ää, jossa oli 0,5 mM EDTA, 2 mCi Nall!I ja 20 ug laktoperoksidaasia. Aikoina 0, 1, 5, 10 ja 15 min lisättiin 10 μΐ 0,03 % H,0,:ta. Reaktio suoritettiin 23oC:ssa ja pysäytet-15 tiin 20 min kuluttua 2 sentrifugaatiolla 50 tilavuudessa kylmää PBS:ää, jossa oli 10 mM Nai. Leimatut solut jaettiin 4 putkeen ja inkuboitiin, kuten osoitettiin, HTLV-III/LAV:n kanssa (2 ug 20 pl:ssa) 30 min 37*C:ssa. Seuraavat pesut ja muokkaamiset suoritettiin 0-4'C:ssa. Pestyt solut lyysattiin lisäämällä 1 ml 20 detergenttilyysauspuskuria (LB; 0,02 M Tris, 0,12 M NaCl, pH

8,0, jossa oli 0,2 mM fenyylietyylisulfonyylifluoridia, 5 ug/ml aprotiinia, 0,2 mM EGTA, 0,2 mM NaF, 0,2 % natriumdeoksikolaat-ti ja 0,5 % (v/v) Nonidet P-40). Putkia pidettiin jäissä 15 min ja tumat poistettiin sentrifugoimalla 3000 x g 20 min.

25

' Absorptioita varten valmistettiin ihmisen anti-HTLV-III/LAV

IgG-, ihmisen ei-immuuni IgG-, anti-T4A- ja anti-T8-vasta-ai-neiden Sepharose-konjugaatteja, kuten on kuvattu (48). Lysaatit esiabsorboitiin 200 pl kanssa Sepharose-ei-immuuni ihmisen 30 IgG:tä 1,5 h pyörittämällä ja sitten immunosaostettiin 20 μ1:η . kanssa Sepharose-konjugaatteja (kuten osoitettu) 3 h pyörittä- · mällä. Sepharose-absorbantit pestiin 3 kertaa: kerran LB:llä; kerran LB:llä, jossa oli 0,5 M NaCl; ja kerran LB:llä, jossa oli 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia (SDS). Absorboitunut mate-35 riaali uutettiin 65’C:ssa 30 min 20 μ1:η kanssa näytepuskuria (0,01 M Tris, pH 8,0, jossa oli 2 % SDS, 5 % 2-merkaptoetanoli (v/v), 25 ug bromifenolisineä ja 10 % glyserolia (v/v). Elekt- 102837 40 roforeesi suoritettiin 3,3-20 % gradientti polyakryyliamidigee-lissä, jossa oli 3 % kerrosgeeli (57) ja autoradiogrammit kehitettiin Kodakin XAR-5 filmillä.

5 Virus inhibiitio määritys 2 x 105 T4+ JM T-solua altistettiin AIDS-virukselle hetkenä 0 min. Inhibiittorit ammoniumkloridi (20 mM) tai amantadiini (20 mM) lisättiin erilaisina aikoina virusinfektiotapahtuman aikana 10 (0 min, 30 min ja' 60 min) . 6 h kuluttua solut pestiin ja mal- jattiin uudelleen tuoreeseen alustaan (RPMI/10 % FCS). Näiden aineiden vaikutus AIDS-virusinfektioon määritettiin 5 päivää infektion jälkeen. Niiden infektoituneiden solujen fraktio, jotka ekspressoivat virusantigeenejä, viljelmissä, määritettiin 15 immunofluoresenssimikroskoopilla kuten edellä kuvattiin (58).

RNA-eristys ja Northern Blot hybridisaatio

Kokonais-RNA eristettiin soluista homogenisoimalla 4 M:ssa gua-, 20 nidiniumtiosyaanaatissa, jota seurasi ultrasentrifugaatio 5,7 M

CsCl-tyynyssä (28). Poly(A)+-selektio saavutettiin oligo(dT)-selluloosakromatografiällä (Type 3, Collaborative Research) (29) .

25 RNA elektroforesoitiin 1 %:ssa agaroosiformaldehydigeelissä • (39) ja siirrettiin Hybondille (Amersham). Northern blot hybri disaatio suoritettiin valmistajan antamien ohjeiden mukaisesti. Koettimet nick-transloitiin spesifisellä aktiivisuudella 0,5-1 x 10* cpm/ug a"P-leimatun deoksinukleotiditrifosfaattien kanssa 30 (59).

Tulokset T4 cDNA:n eristys 35

Strategiaan, jota käytettiin eristämään T4 cDNA alunperin, kuului että rakennettiin L-solutransformantteja, jotka ekspressoi- 102837 41 vat T4:ää pinnoillaan. cDNA, joka oli syntetisoitu T4+-trans-formoidun fibroblastin mRNA:sta, rikastettiin subtraktoidulla hybridisaatiolla ja käytettiin koettimena eristettäessä cDNA: ta, joka koodaa T4:ää cDNA-kirjastosta, joka oli tehty ääreis 5 T-lymfosyyttien mRNA:sta. T4+ cDNA-kloonien identtisyys määritettiin Northern ja Southern blot analyyseillä ja lopuksi näiden kloonien kyky siirtää T4+-fenotyyppiä resipienttisoluihin. Samanlaisia tekniikoita on käytetty aikaisemmin eristämään geeniä, joka koodaa T8-proteiinia (20).

10

Hiiren L-solut, joilta puuttu tymidiinikinaasi (tk), transformoitiin yhdessä genomisen DNA:n kanssa, joka oli T-solu leuke-misesta solulinjasta HUT-102, yhdessä tk-sisältävän plsamidin pTK kanssa (25,26). tk+ L-solutransformantit, jotka ekspressoi-15 vat T-solun pintaproteiineja, tunnistettiin iji situ rusettimää-rityksessä. tk+-pesäkkeet altistettiin hiiren moniklonaalisille vasta-aineille, jotka oli kohdistettu T4:ää vastaan ja inkuboi-tiin sitten punaisten verisolujen kanssa, jotka oli kytketty kani anti-hiiri immunoglobuliiniin. T4+-transformantit ovat nä- t 20 kyvästi punaisia sen nojalla, että ne ovat spesifisesti liittyneet punaisten verisolujen kanssa. Tällä tavoin saatiin yksi primäärinen T4+-transformantti, LTD-4. Tämän kloonin T4-mole-kyylin ekspressoituminen vahvistettiin itsenäisesti sytofluori-metrianalyysilla (kuvio 1).

25 : T4+-transformantin, LTD-4, mRNA-populaation pitäisi erota ei- transformoidun L-solun mRNA-populaatiosta vain uudesti transformoitujen geenien ekspressiossa. Nämä sekvenssit rikastettiin liittämällä erittäin radioaktiivinen cDNA, joka oli valmistettu 30 T4+-transformantin poly(A)+ RNAista, hyvin suuren ylimäärän kanssa ei-transformoidun L-solun RNA:ta (32, 60). cDNA, joka ei kyennyt hybridisoitumaan, ei edes korkeilla Rot-arvoilla, eristettiin hydroksiapatiittikromatografiällä ja käytettiin seulomaan ihmisen ääreis T-solu-cDNA-kirjastoa, joka oli rakennettu 35 lambda kloonausvektoriin gtlO. Tunnistettiin 4 viikottain hyb-ridisoituvaa plakkia, puhdistettiin ja T4-sekvenssien läsnäolo analysoitiin.

102837 42

Jotta määritettäisiin, koodaako mikään näistä klooneista T4:ää, suoritettiin ensimmäiseksi Northern blot analyysit RNA:n kanssa, joka oli T4+- ja T4—ääreis T-soluista, leukemioista, tymo-5 syyteista, L-solu-transformanteista ja ei-lymfasoluista (kuvio 2). Yksi neljästä kloonista hybridisoitui RNA:n kanssa, jota oli vain T4+-soluissa. Tämä klooni osoittaa 3 kb RNA:n, jota on T4+-transformanteissa, LTD-4, jota on myös T4+-ääreislymfosyyt-tien populaatiossa, erilaisia leukeemisia T4+-solulinjoja ja 10 tymosyyttejä. Hybridisaatiota ei havaittu RNA:n kanssa, joka oli ei-transformoiduista fibroblasteista, T4- ääreislymfosyy-teistä, HeLa-soluista tai ihmisen neuroblastomasoluista.

Tässä kloonissa havaitun RNA:n ekspressoitumisen kuvio on yh-15 denmukainen sen mahdollisuuden kanssa, että se koodaa T4:ää. Kuitenkin, tämä cDNA on vain 0,6 kb pitkä, mutta hybridisoituu 3 kb mRNA:han. Siksi ihmisen ääreis T-solu cDNA-kirjasto seulottiin uudelleen ja saatiin yksi klooni, jossa oli 3 kb in-sertti, joka on lähellä valmiin lähetti-RNA:n kokoa. Tämän 20 kloonin restriktiokartat näkyvät kuvioissa 3A ja 3B.

Genominen blot-analyysi

Seuraavaksi suoritettiin Southern blot-kokeita (37), jotta o-25 soitettaisiin että eristetty cDNA-klooni hybridisoituu DNA:n kanssa, joka on T4+-transformantista samoin kuin ihmisen DNA:n kanssa, mutta ei ei-transformoidun hiiren L-solun DNA:n kanssa (kuvio 4). Genominen DNA lukuisista ihmisen soluista paljastaa viiden hybridisaatiofragmentin sarjan sen jälkeen, kun se on 30 pilkottu BamHI-entsyymillä. Kuten odotettiin, T4-sekvenssit . voidaan havaita transformantissa LTD-4 mutta ei ei-transformoi- ..· dussa L-solun DNA:ssa. BamHI-f ragmentti, joka on lähinnä geenin 3'-päätä (6,6 kb) ei ole läsnä LTD-4:ssä, oletettavasti integ-raatiotapahtuman seurauksena. Lisäksi, karkeat uudelleenjärjes-35 tymiset eivät ole ilmeisiä tällä karkean analyysin tasolla, kun verrataan DNA:ta lymfa- ja ei-lymfasoluista. Hybridisoituvien fragmenttien molekyylipainojen summa on 33 kb, antaen olettaa, 10283? 43 että T4-geeni on melko suuri. Saatiin täydellinen genomisten kloonien sarja, joka ylettyy tämän alueen yli (katso alapuolella) ja BamHI-fragmentit järjestettiin näiden kloonien restrik-tioanalyysillä (kuvio 3A), vahvistaen että geeni suuri ja sen 5 täytyy sisältää merkittävän pituisia introneja.

T4 cDNA:n ekspressoituminen transformoiduissa hiiren fibroblas-teissa 10 Lisätodistetta sille, että eristetty cDNA koodaisi T4:ää, saataisiin, jos tämä klooni voisi muuttaa fibroblastit T4+-feno-tyypiksi transformaation jälkeen. T4-geeni on suuri kromosomaa-lisessa DNA:ssa ja ylettyy useiden genomisten kloonien yli. Siksi cDNA-klooni vietiin kahteen retrovirus ekspressiovekto-15 riin, pVcos7 ja pMV6kt/neo, joissa on Moloney hiiriin ja rottiin liittyvä leukemiaviruksen pitkä terminaalinen toisto (LTR), joka on yksittäisen EcoRI-kloonauskohdan vieressä (kuvio 3C). 5'-LTR edistää transkriptiota kloonauskohdan kautta ja 3'-LTR sisältää pilkkomiseen ja polyadenylaatioon tarpeellisia : 20 sekvenssejä. Vektori pMV6tk/neo sisältää myös tk-promoottorin fuusioituneena neomysiinifosfotransferaasigeenin koodausaluee-seen. Rakenne, joka käyttää pVcos7:ää, tarvitsee transformaatiota ei-kytkeytyneen selektiivisen markkerin kanssa, kun taas pMV6tk/neo:ssa on neomysiiniresistenssimarkkeri, joka sallii 25 kytkeytyneen yhteistransformaation. NIH 3T3-solujen neo+-pesäk-keet, jotka saatiin transformaation jälkeen, selektoitiin niiden kyvyn mukaan kasvaa alustalla, jossa on neomysiinianalogi G418 ja seulottiin käyttämällä rusettimenetelmää T4:n ekspres-soitumisen havaitsemiseksi solupinnalla. Noin 50 % G418-pesäk-30 keistä, jotka saatiin pVcos7:llä ja 75 % pesäkkeistä, jotka saatiin pMV6tk/neo:11a, olivat T4-positiivisia tässä määrityk-- ·’ sessä. Rusettipositiivisia pesäkkeitä analysoitiin lisää syto- fluorimetrillä, jotta varmistettaisiin että T4 ekspressoituu transformoidun solun pinnalla (kuvio 1).

35

Suoritettiin metabolisten proteiinin leimauskokeita, jotka o-soittavat, että T4+ transformoitu fibroblasti ja T-lymfosyytti 102837 44 ekspressoi T4-proteiinia, jolla on samanlainen molekyylipaino. Ei-transformoidut NIH 3T3-solut, T4+-transformantit ja T-lymfo-syytit leimattiin 12 h L-[”s]-metioniinin läsnäollessa (41). Solut detergenttiliuotettiin ja lysaatti ajettiin linssilektii-5 nipylväiden yliglykoproteiinien rikastamiseksi (42), Sidottu glykoproteiinifraktio eluoitiin ja immunosaostettiin monoklo-naalisten vasta-aineiden kanssa, jotka oli kohdistettu T4:ää vastaan (kuvio 5). Pelkistävissä olosuhteissa havaitaan glyko-proteiini, joka kulkee 55 kd:n suhteellisella molekyylimassal-10 la, T-lymfosyyttien ja kahden itsenäisen T4+-transformantin uutteista.

Tätä proteiinia ei havaita kontrolli 3T3 fibroblasteissa. Ei-pelkistävissä olosuhteissa 51 kd:n glykoproteiini immunosaoste-15 taan anti-T4:n kanssa T-soluissa ja transformoiduissa fibroblasteissa.

Nämä kokeet osoittavat, että transformantit ekspressoivat 55 kd:n glykoproteiinia, joka on immunosaostettu anti-T4:n kanssa, 20 joka on identtinen kooltaan T-lymfosyyttien pinnalla ekspres-soituneen kanssa. Täten Northern ja Southern analyysit, joissa käytetään eristettyä cDNA:ta, yhdessä sen kanssa, että tämä cDNA antaa T4+-fenotyypin hiiren fibroblasteille, osoittaa että T-solun pintaproteiinin T4:n koko koodaussekvenssi on kloonat-25 tu.

T4 cDNA:n nukleotidisekvenssi ja johdettu proteiinisekvenssi T4 koodausalueen täydellinen nukleotidisekvenssi määritettiin 30 sekvenssoimalla 3 kb:n cDNA-insertin molemmat juosteet käyttämällä dideoksiterminaatiomenetelmää (35, 36). Täydellinen nuk-• leotidisekvenssi ja ennustettu proteiinisekvenssi näkyvät ku

vassa 6. Pisin avoin lukuraami alkaa kohdasta 76, jossa on me-tioniinikodoni, jota ympäröi aloitus konsensussekvenssi Pur-35 NNATGPur (61). Tässä lukuraamissa on 1374 nukleotidiä, jotka koodaavat polypeptidiä, jossa on 458 aminohappoa. Tämän luku-raamin välitön läheisyys vahvistettiin insertoimalla tämä cDNA

102837 45 RNA-ekspressiovektoriin pSP6 (40) . RNA, joka oli syntetisoitu tästä vektorista, ohjaa ei-muokatun 51 kd:n proteiinin synteesiä, kun transloitu in vitro, jonka tarkka molekyylipaino ennustettiin nukleotidisekvenssistä (kuvio 7).

5 T4 koostuu leader sekvenssistä, 4 peräkkäistä vaihtelevaa liittymisen (VJ) kaltaista aluetta ja membraanin yli ulottuva alue, joista jokaisella on homologiaa immunoglobuliinigeeniperheen erilaisten jäsenten vastaavien alueiden kanssa (62, 63) (kuviot 10 6 ja 8). Hydrofobisten jäännösten pätkä, joka vastaa johtavaa peptidiä, jonka Kyte-Dolittle ennusti (64), hydropatisiittinen luonnos, seuraa välittömästi aloituskodonia. Vaikka tarkkaa kohtaa, missä luonnon T4-proteiini prosessoidaan, ei voida määrittää, niin pidetään mahdollisena, että pilkkominen tapahtuu 15 juuri treoniinin jälkeen kohdassa -1, mikä perustuu tunnettuhin pilkkomiskuvioihin (65). Siksi siknaalipeptideissä on 23 aminohappoa ja prosessoitu T4-proteiini koostuu 435 jäännöksestä.

Valmiin proteiinin jäännöksillä 1-94 on samat aminohapot ja ra- ^ 20 kenteellinen homologia immunoglobuliinin kevyen ketjun vaihte- levan alueen kanssa (kuvio 9A). Tämän alueen kokonaishomologia immunoglobuliinin vaihtelevien alueiden kanssa on 32 %. Sek-venssivertailu immunoglobuliinien kevyen ketjun V-alueiden ja T4:n N-terminaalisen V-kaltaisen alueen (VI) välillä osoittaa, 25 että kahdeksan 14:sta jäännöksestä on säilyneitä (66). Tässä alueessa on 2 systeiinijäännöstä, joita erottaa 67 aminohappoa, joiden asemat ja etäisyys ovat analogisia vastaavien kanssa, jotka on löydetty immunoglobuliinien kevyissä ketjuissa ja vastaavissa molekyyleissä (67). Nämä systeiinit voivat kyetä muo-30 dostamaan säilyneen juosteen sisäisen disulfidisidoksen, joka on luonteenomaista V-alueille. Tätä olettamusta kannattaa meidän huomiomme, että T4 kulkee nopeammin ei-pelkistävissä olosuhteissa kuin pelkistävissä olosuhteissa, joka on yhdenmukainen ainakin yhden juosteen sisäisen sidoksen muodostumisen 35 kanssa (kuvio 5, linjat e ja f).

Lukuun ottamatta yksittäisten aminohappojen tasolla olevia ho- 102837 mologioita, T4:n VI-alueella on samoja rakenteellisia piirteitä immunoglobuliinin vaihtelevien alueiden kanssa. Immunoglobu-liinin vaihtelevat ja vakioalueet laskostuvat luonteenomaisella tavalla, jossa antiparallellien β-juosteiden sarjat laskostuvat 5 muodostaakseen 2 β-levyä (67, 68). Näitä β-levyjä pitävät yhdessä disulfidisillat ja luonteenomaiset hydrofobiset vuorovaikutukset. Jotta määritettäisiin, kuinka T4:n V:n kaltaisen alueen ennustettu sekundäärinen rakenne vertaa immunoglobuliinien kevyen ketjun V-alueiden rakenteiden kanssa, suoritettiin kak-10 siulotteiset rakenteelliset ryhmittymiset. Saatiin myös luonnos mahdollisista β-juosteista ja β-käänteistä näissä sekvensseissä käyttämällä Choun ja Fasmanin (69) empiirisesti johtamaa algoritmia. Nämä tulokset antavat olettaa, että on 7 β-juostet-ta T4:n V-kaltaisessa alueessa, jotka sopivat läheisesti yhteen 15 immuniglobuliinin V-alueessa olevien kanssa (kuvio 9A). T4:n 2 säilynuttä systeiiniä löydetään β-juosteissa B ja F, jotka sopivat juuri yhteen systeiinien asemien kanssa V-alueella, jonka tiedetään muodostavan säilyvän disulfidisidoksen immunoglcbu-liinissa. Tryptofaanijäännös on 12 aminohappoa alavirtaan en-20 simmäisestä systeiinistä ja tyrosiinijäännös sijaitsee 2 aminohappoa ennen toista systeiiniä. Nämä jäännökset ovat erittäin luonteenomaisia β-juosteille C ja F, vastaavasti kevyen ketjun V-alueilla. Lisäksi, aspartaattijäännös on 6 aminohappoa ennen systeiiniä ja arginiinijäännös on β-juosteen D juuressa. Nämä 25 varautuneet jäännökset ovat erittäin luonteenomaisia V-alueille (67). Lopuksi, vaihtelevia hydrofobisia jäännösten pätkiä on läsnä pitkin β-juosteita, mikä lujittaa kahden β-levyn vuorovaikutusta .

30 T4:n Vl-aluetta seuraa pätkä aminohappojäännöksiä, joilla on . merkittävä homologia immunoglobuliinien ja T-soluantigeenire- ..· septorien liittyvien (J) alueiden kanssa. Kuviossa 9B T4:n J:n kaltainen alue on suorassa rivissä immunoglobuliinin kevyiden ketjujen ja T-soluantigeenireseptorin konsensus liittyvien sek-35 venssien kanssa. Tätä J:n kaltaista aluetta seuraa 265 aminohapon pätkä, joka voi olla rakenteellisesti jakautunut kolmeen lisä VJ:n kaltaiseen alueeseen, joilla on tilastollisesti mer- 102837 47 kittävä sekvenssi- ja rakenteellinen homologia prototyyppi im-munoglobuliinin VJ-alueen kanssa (kuviot 6 ja 8). Lisäksi, tässä sekvenssissä on 2 mahdollista N-sitoutunutta glykosylaatio-kohtaa (Asn-Leu-Thr; kuvio 6).

5

Solunulkopuolista aluetta seuraa oletettu transmembraanisek-venssi, joka on ennustettu hydropatisiittisella luonnoksella (64), jossa on vain hydrofobiset ja neutraalit aminohappojäännökset. Tällä segmentillä on silmiinpistävä homologia luokan II 10 pää-histokompatibiliteettiproteiinien 3-ketjujen transmembraa-nin eksonin kanssa (kuvio 90 . T4:n ja MHC luokka II 3-ketjujen transmembraanialueiden ryhmittyminen paljastaa 48 %:n homologi-an ilman aukkoja. Membraanin liittävän segmentin jälkeen seuraa erittäin varautunut 40 aminohapon sekvenssi, jossa on sytoplas-15 minen alue (kuviot 6 ja 8).

T4-geeni: kromosomaalinen sijainti ja intron-ekson asemat T4 cDNA:ta käytettiin määrittämään T4-geenin kromosomaalinen 20 sijainti analysoimalla sen eritysnäyte hiiri-ihminen somaattisten soluhybridien panelissa ja in situ-hybridisäätiössä ihmisen metafaasikromosomeihin (101). Genomiset blottauskokeet ja in situ hybridisaatiot osoittavat, että T4-geeni on ihmisen kromosomin 12 lyhyessä osassa, alueiden 12pl2 ja 12pter välissä.

25

Saatiin sarja limittäisiä genomisia klooneja, jotka ylettyivät T4-geenin yli, seulomalla ihmisen genomisia kirjastoja, jotka oli rakennettu lambda kloonausvektoreihin Charon 4 ja EMLB-3 (31) radioleimatun pT4 cDNA-insertin kanssa (70). Näiden kloo-30 nien kuvaaminen sekä restriktio- että Southern blot-analyyseil-• la osoitti, että niissä oli koko T4 koodaussekvenssi. T4-geenin täydellinen introni-eksoni rakennelma määritettiin sitten sek-venssoimalla spesifisiä genomisten kloonien fragmentteja käyttämällä dideoksiterminaatioproseduuria (35, 36).

35 T4-geeni koostuu 9 eksonista, joita pilkkoo 8 intronia, kuten kuvioissa 8 ja 10 näkyy. Ensimmäisessä eksonissa on 5'-ei- 48 102837 transloitu alue ja leader segmentti. Ensimmäisen vaihtelevan kaltaisen alueen, Vt, pilkkoo suuri introni, joka sijaitsee nukleotidiasemassa 289 (kuvio 6). Siksi V^-aluetta koodaa toinen ja kolmas eksoni ja V,J,:ta, V,J,:a, V<J, :ää ja trans-5 membraani (TM) alueita jokaista koodaa erilliset eksonit (eksonit 4-7). Sytoplasmisen alueen (CYT) pilkkoo introni ja sytoplasmisen alueen viimeistä osuutta ja 3'-ei-transloitua a-luetta koodaa yhdeksäs eksoni.

10 , T4+- ja T8+-transformoitujen solujen rakentaminen

Kokeelliseen lähestymiseeen tutkia T4:n osuutta AIDS-virusin-fektiossa alunperin sisältyi T4-geenin vieminen T4—solulin-jaan, joka ei kyennet pitämään yllä virusinfektiota. Transfor-15 moiduista soluista testattiin sitten herkkyys AIDS-virukselle, jota seurasi tutkimukset siitä mekanismista, jolla T4 välittää virusinfektion.

Täysi pitkä cDNA-klooni, joka koodaa T4:n pintaproteiinia, sub-20 kloonattiin retroviraaliseen ekspressiovektoriin, pMV7. Eks- pressiovektori, pMV7 (kuvio 11A), sisältää kaksi suoraan toistettua Moloney hiiriin ja rottiin liittyvää viruksen pitkää terminaalista toistoa (LTR), joka on yksittäisen EcoRI-kloo-nauskohdan vieressä. 5'-LTR edistää jatkuvasti transkriptiota 25 kloonauskohdan kautta, kun taas 3’-LTR antaa sekvenssit, jotka ovat tarpeelliset RNA:n pilkkomiseen ja polyadenylointiin. Lisäksi pMV7:ssä on herpesvirus tymidiinikinaasipromoottori (tk) fuusioituneena bakteerin neomysiinifosfotransferaasigeenin (neo) koodausalueeseen, dominoiva selektoitava markkeri, joka 30 sallii kytkeytyneen yhteistransformaation ja infektion.

T4-pMV7 vietiin ψ-2- ja ^>-AM-soluihin, 3T3 solulinjassa oli virheellisiä ekotrooppisia ja amfotrooppisia proviruksia, vastaavasti (kuvio 11B) (44, 59). Molemmat solulinjat ovat kykene- 35 mättömiä koteloimaan endogeenistä virus-RNA:ta, mutta voivat antaa kaikki ehdottomat trans-virustoiminnot. Näiden solulinjo-jen stabiili transfektio T4-pMV7:llä johtaa rekombinantti ret- 102837 49 rovirusvarastojen tuottamiseen, jotka koodaavat T4:ää, joissa ei ole auttajavirusta. Näitä puhtaasti virusvarastoja voidaan sitten käyttää tehokkaasti siirtämään T4-sekvenssejä sekä hiiren että ihmisen soluihin ilman, että kohdesolu tuottaa retro-5 viruksia.

Lyhyesti, T4-pMV7 vietiin 'p_2~s°luihin käyttämällä DNA:n välittämän geenisiirron menetelmää (kuvio 11B) (25, 27). Neo+-posi- tiiviset pesäkkeet selektoitiin niiden kyvyn mukaan kasvaa a-10 lustassa, jossa oli neomysiinianalogi G418 (Geneticin*) ja seulottiin T4:n ekspressiota solupinnalla käyttämällä in situ ru-settimääritystä (20, 70). Transfektoitujen ^-2-solujen, jotka ekspressoivat T4:ää, pesäkkeet tunnistettiin sitten, jotka tuottavat rekombinantti retrovirusta 105 cfu/ml tiitterillä.

15 T4+ V*-2-klooneja käytettiin sitten tuottamaan retroviruksia, jotka kykenevät infektoimaan hiiren Y>-AM-solu ja. Eristettiin T4, joka ekspressoi ψ-AM-klooneja, mikä tuotti rekombinantti retrovirusta 104 cfu/ml tiitterillä. T4+ ihmisen transformantit tehtiin kasvattamalla yhdessä soluja mitomysiini-C-käsitellyil-, 20 lä tai «^-AM-kloonien kanssa (kuvio 11B) . Sen jälkeen T4+ trans- formantit analysoitiin Northern blot analyysillä ja virtaussy-tometrillä, jotta varmistettaisiin että T4:ää ekspressoidaan ja se on läsnä solun pinnalla. Kontrollisolulinjät, jotka ekspressoivat T8 pintaproteiinia rakennettiin vastaavalla tavalla.

25 T4 on olennainen AIDS-virusinfektiolle

Jotta ensin määritettäisiin, onko T4-proteiinin länäolo ihmisen lymfosyytin pinnalla riittävä tekemään solun herkäksi AIDS-vi-30 rusinfektiolle, tehtiin primitiivisten T-solun leukeemisen lin-. jän transformantit, HSB2, jotka ekspressoivat vain aikaisia T- lymfosyyttiproteiineja Tl ja Tll pinnallaan. HSB2 ei ekspressoi T4:ää eikä T8:aa, se ei myöskään ekspressoi T-soluantigeenire-septoria tai T3-proteiinien yhteenliittyneitä komplekseja. HS-35 B2-transformantit, jotka ekspressoivat joko T4- tai T8-protei-ineja solupinnalla, valittiin ja käytettiin määrittämään näiden solulinjojen herkkyyttä AIDS-virusinfektiolle. Käytettiin usei- 102837 50 ta erilaisia kokeellisia lähestymisiä määrittämään AIDS-virus-infektiota, mukaanlukien käänteistranskriptaasin ekspressoitu-minen (52), solun sytoplasmassa olevan viruksen ekspressoitumi-nen immunofluoresenssimikroskopialla (46), virusantigeenien ha-5 vaitseminen viljelmäsupernatantissa käyttämällä immunomääritys-tä (47), yhtä hyvin kuin infektiivisten virionien tuottaminen supernatantti alaviljelmällä fytohemmagglutiniini (PHA)-stimuloitujen ääreislymfosyyttien kanssa (46). Käyttämällä näitä määrityksiä ei havaittu AIDS-virusinfektion selvyyttä HSB2-so-10 lulinjaan (taulukko I).

f

Taulukko I

102837 51 T4 + ja T8+ ihmisen transformanttien herkkyys AIDS-virus-infek-tiolle 5

Ihmisen Maksi- Syto- Super- Super- Synsy- VSV Virus solu maali- plas- natant- natant- tium (AIDS) sitou- nen minen ti vi- ti ala- induk- pseudo- tumi- käänteis- virus rus Ag viljel- tio tyyppi- nen 10 trans- mä infek- kriptaa- tio si CEM(T4+) 675023 + + + ' + + + 15 HSB2 4245 _____ HSB2-T8+ 4460 _____ HSB2-T4+190915 + + + + + +

Raji ND ND ND ND - - ND

20 Ra ji-T8+ 5595 _____

Raji-T4+ 103500 + + + + + +

HeLa 6430 _____

HeLa-T8+ 4075 - - ND

25 HeLa-T4+ 48125 + + + + + +

Ympättiin 5x10* solua AIDS-viruksen kanssa, inkuboitiin 37*C:ssa 24 h, pestiin ja maljattiin tuoreeseen alustaan. Solut ja su-pernatantit poistettiin päivinä 3, 6, 9, 12, 16, 20, 24 ja 28 30 ja käytettiin neljässä viruksen paljastamismäärityksessä: kään-teistranskriptaasi, sytoplasminen virus, supernatantti virusan-tigeeni ja supernatantti alaviljelmä.

Pseudotyyppi infektiokokeen tulokset on ilmaistu seuraavasti: + 35 (>10* PFU/ml; - (10 PFU/ml); ND, ei määritetty.

40 « ψ » 45 „ 102857

Lisäksi aikaisemmin on osoitettu, että laaja solufuusio tapahtuu, kun ihmisen ei-infektoidut solut, joissa on AIDS-virusre-septorit, kasvatetaan yhdessä solujen kanssa, jotka tuottavat 5 AIDS-virusta (54) . Tässä määrityksessä ei ole synsytian induktiota, kun HSB2-solut sekoitetaan AIDS-virusta tuottavien H9-solujen kanssa (taulukko I), vaikka muodostuu runsas synsytia HTLV-I:tä ja HTLV-II:ta tuottavien solujen kanssa (tiedot eivät näy) .

10

Lopuksi viruksen siirtyminen testattiin käyttämällä rakkuloihin liittyvän suutulehdusviruksen (VSV) pseudotyyppejä, joilla oli AIDS-viruksen kuoren glykoproteiineja (taulukko I) (53, 54).

Kun solut, jotka on infektoitu AIDS-viruksella, superinfektoi-15 daan VSV:llä, osa VSV:n jälkeläisistä kokoavat riittävästi AIDS-viruksen kuoren glykoproteiinia vastustamaan neutralisointia hyperimmuunin anti-VSV-seerumin toimesta.Näiden VSV (AIDS) pseudotyyppi virionien isäntäsarja rajoittuu soluihin, jotka ekspressoivat reseptoreita, jotka ovat spesifisiä AIDS-viruk-20 selle. Soluun tunkeutumisen ja virionin kuoren poistamisen jälkeen transkapsidoitu VSV-genomi replikoi ei-pseudotyyppipartik-keleiden tuottamiseksi. Sekundäärisen infektion aikana, VSV-jälkeläiset, jotka ovat vapautuneet infektoituneista soluista, tunkeutuvat ja tuhoavat naapuri-indikaattorisolut, jotka ovat 25 resistenssejä VSV (AIDS) pseudotyyppi-infektiolle (minkin CCL64 tai naudan MDBK solut), joka johtaa VSV-plakkien muodostumiseen, jotka sitten lasketaan. Täten infektio VSV (AIDS) pseudo-tyyppien kanssa antaa kvantitatiivisen sytopaattisen plakkimää-rityksen viruksen sisääntulolle (54). Tässä määrityksessä ei 30 havaittu plakkeja taustan yli, kun HSB2-solut altistettiin VSV (AIDS) pseudotyypeille (taulukko I). Kontrollikokeissa VSV-pseudotyyppien kanssa RNA koteloitui HTLV-I-kuoreen (VSV (HTLV-I)), havaittiin lukuisia plakkeja, osoittaen, että HSB2-solu, jossa on HTLV-I-reseptorit, kykenee replikoimaan VSV:n tehok-35 kaasti. Nämä huomiot osoittavat, että VSV-genomi, joka on koteloitunut AIDS-viruksen kuoreen, ei kykene menemään HSB2-solui-hin.

102837

Seuraavaksi tutkittiin, tekeekö toiminnallisen T4 cDNA:n vieminen HSB2-soluihin tämän solun herkäksi AIDS-virusinfektiolle (taulukko I). HSB2-T4+-transformanttien altistaminen AIDS-vi-5 rukselle johtaa tuottavaan virusinfektioon, kuten määritettiin käänteistranskriptaasiaktiivisuudella (52), viruksen ekspres-soitumisella solun sytoplasmassa fluoresenssimikroskoopilla (46), virusantigeenin havaitseminen viljelmäsupernatantissa käyttämällä immunomääritystä (47), samoin kuin supernatantti 10 alaviljelmän tuottama infektiivinen virus PHA-stimuloitujen lymfosyyttien kanssa (taulukko I) (46) . Kontrolli HSB2-T8+-so-lut olivat yhdenmukaisesti negatiivisia jokaisessa määrityksessä .

15 Lisäksi tutkittiin myös tehokkuus, jolla AIDS-virus infektoi erilaisia T4 + T-soluja. HSB2-T4+- ja HSB2-T8+-transformantit, luonnollisesti eristetty T4+ T-solulinja CEM, samoin kuin PHA-stimuloidut ääreislymfosyytit altistettiin AIDS-viruksen 10-kertaiselle laimennussarjalle, pestiin ja maljättiin mikrovil-: 20 jelmiin. Infektoitujen viljelmien frekvenssi määritettiin käyt tämällä immunomääritystä 12 päivää sen jälkeen, kun oli tehty virusaltistaminen (kuvio 12) (47). Tällä tavalla määritettiin AIDS-viruksen, jota tarvitaan infektoimaan 50 % altistetuista viljelmistä (ID-50), tiitteri. PHA-stimuloitujen periferisten 25 lymfosyyttien ID-50 on 2-3 suuruusluokkaa suurempi kuin mitä on havaittu joko luonnollisesti eristetyille tai transformoiduille T4+-solulinjoille. HSB2-T4+-solujen infektion tehokkuus on noin 10 kertaa suurempi kuin mitä on havaittu luonnollisesti eristetylle T4+ T-solulinjalle CEM (kuvio 12). Kontrolli HSB2-T8+-so-30 lut eivät ole herkkiä infektiolle edes korkeimmilla tutkituilla virustiittereillä, HSB2-T4+-solujen kykyä kannattaa sekä synsytian muodostusta että VSV (AIDS) pseudotyyppien replikaatiota tutkittiin myös. Kun 35 HSB2-T4+-solut kasvatetaan yhdessä AIDS-virusta tuottavien H9-solujen kanssa, synsytian muodostus havaitaan helposti 18 h sisällä (taulukot I ja II). Lisäksi, synsytian induktion lakkaa, „ 102837 54 kun esikäsitellään viljelmiä anti-T4 monoklonaalisella vasta-aineella (taulukko II). Lopuksi, kun HSB2-T4+-solut altistetaan VSV (AIDS) pseudotyypeille, tuotetaan infektiivisiä VSV-partik-keleita, jotka tuhoavat naapuri-indikaattorisolut (taulukot I 5 ja III). Lisäksi plakkien muodostus estyy esikäsittelemällä joko anti-AIDS-virusvasta-aineella tai anti-T4A monoklonaalisella vasta-aineella (taulukko III). Kontrolli HSB2-T8+-solut ovat yhdenmukaisesti negatiivisia jokaisessa 7 määrityksessä,jota käytettiin määrittämään AIDS-virusinfektiota (taulukot I, II ja 10 III) . Nämä havairtnot antavat geneettistä näyttöä, että ei-val-miissa ihmisen T-lymfosyytissä T4-proteiinin pelkkä läsnäolo antaa olennaisen toiminnan, jota vaaditaan AIDS-virusinfaktioon .

15 Taulukko II

Synsytian induktio T4+ ihmisen transformanteissa

Synsytian induktio 20

Ihmisen H9/AIDS H9/AIDS

solut + aT4A

JM(T4+) +++++ 25 8166(T4+) +++++

HSB2 - ND

HSB2-T8+ - ND

HSB2-T4+ ++ 30

: Raji + ND

Raji-T8+ - ND

Raji-T4+ +++

35 HeLa - ND

HeLa-t(+ - ND

HeLa-T4+ +++++ 2 x 10! solua kasvatettiin yhdessä 2 x 10* AIDS-virusta tuotta-j 40 van B9-solujen kanssa (H9/AIDS) ja inkuboitiin 37*C:ssa. Viljelmistä tutkittiin synsytian muodostus 18 h kuluttua. Tulokset on ilmaistu likimääräisenä %:na tumia, joita on synsytiassa: - (ei synsytiaa); ++ (25 %) ; +++ (50%); +++++ (90%); ND (ei määritetty). Synsytian inhibiitio määritettiin lisäämällä anti-45 T4A monoklonaalista vasta-ainetta (aT4A; 1:20) sekoitettuun viljelmään ymppäämisen aikana. Luonnollisesti eristetty T4+ T-solulinjat JM ja 8166 toimivat positiivisina kontrolleina näissä tutkimuksissa.

Taulukko III

102837 VSV pseudotyyppi sytopaattinen plakkimääritys T4+- ja T8+ ihmisen transformanteille 5 VSV pseudotyyppitiitteri (PFU/ml)

Ihmisen VSV (HTLV-I) VSV(AIDS)

solut + aHTLV-I + aAIDS +aT4A

10 CEM(T4+) 20000 50 42000 50 200

HSB2-T8+ 10000 50 0 ND ND

HSB2-T4+ 12000 50 1000 100 300 15

Raji-T8+ 5000 ND 0 ND ND

Raji-T4+ 5000 50 1500 25 150

HeLa 10000 ND 0 ND ND

20 HeLa-T4+ 10000 50 17000 50 200 2 x 105 solua inkuboitiin VSV (AIDS) pseudotyyppien kanssa (53, 54) 1 h 37’C:ssa. Sitten solut pestiin ja 1 x 10* minkin CCL64 tai naudan MDBK plakki-indikaattorisolua, jotka ovat permissii-25 visiä VSV-infektiolle, mutta resistenttejä VSV(AIDS):lle, lisättiin jokaiseen kaivoon. Sitten viljelmät peitettiin agaria-lustalla ja VSV-plakit laskettiin 2 päivää infektion jälkeen. Anti-T4A monoklonaalista vasta-ainetta (aT4A; 1:20) tai anti-AIDS-virusseerumia (aAIDS; 1:10) käytettiin inhiboimaan VSV : 30 (AIDS) pseudotyyppi plakin muodostusta esikäsittelemällä soluja 30 min ennen altistamista pseudotyypeille (54). VSV (HTLV-I) pseudotyyppejä, jotka tarttuvat monenlaisiin ihmisen solutyyp-peihin (54), käytettiin kontrolleina näissä kokeissa. Anti-HTLV-I seerumia (1:10) käytettiin estämään VSV (HTLV-I) pseudo-35 tyyppi plakin muodostus. Tulokset ilmaistaan PFU/ml; ND (ei määritetty).

102837 56 AIDS-virusinfektio ei rajoitu T-lymfosyytteihin

Toiminnallien T4 cDNA vietiin kahteen ihmisen ei-T-solulinjaan: HeLa, epiteelinen solulinja, joka on johdettu kohdunkaulasyö-5 vasta (72) ja Raji, B-lymfoblastoidi solulinja, joka on johdettu potilaasta, jolla oli Burkittin lymfoma (73) (kuvio 11B). Ennen retroviruksen välittämää geeninsiirtoa nämä solulinjat eivät ekspressoi pinta-T4-proteiinia tai T4 mRNArta, eivätkä ne ole herkkiä AIDS-virus-infektiolle (taulukko I). Lisäksi paren-10 taali solulinjat eivät kannata synsytian induktiota eivätkä VSV (AIDS) pseudotyyppien tarttumista (taulukot I, II ja III).

Päinvastoin, T4+ Raji ja HeLa transformantit kannattavat AIDS-virusinf ektiota kaikissa edellä kuvatuissa kriteereissä (tau-15 lukko I). Tehokkuus, jolla AIDS-virus infektoi Raji-T4+-solut, on lähellä HSB2-T4+-solujen tehokkuutta ja on noin 10 kertaa korkeampi kuin luonnollisesti eristetyn T4+ T-solulinja CEM:n infektion tehokkuus (kuvio 12). Lisäksi, yhteiskasvatuksen jälkeen AIDS-virusta tuottavien H9-solujen kanssa, Raji T4+- ja 20 HeLa-T4+-solut kannattavat synsytian induktiota, mikä lakkaa esikäsittelemällä viljelmät anti-T4A monoklonaalisella vasta-aineella (taulukot I ja II; kuvio 13). Lisäksi näiden solujen altistaminen VSV (AIDS) pseudotyypeille johtaa infektiivisen VSV:n tuottoon ja plakkien muodostumiseen, jotka ovat inhiboi-25 tuneet esikäsittelemällä anti-AIDS-virus-vasta-aineella tai anti-T4A monoklonaalisella vasta-aineella (taulukot I ja III). Kontrolli Raji-T8+ ja HeLa-T8+ transformantit ovat yhdenmukaisesti negatiivisia jokaisessa näissä määrityksissä (taulukot I, II ja III). Siksi toiminnallisen T4-geenin vieminen joko ihmi-30 sen T-lymfosyytteihin, B-lymfosyytteihin tai epiteelisoluihin on riittävää tekemään sellaiset solut herkiksi AIDS-virusinfektiolle. Yhteenvetona, nämä tulokset osoittavat, että T4+ T-so-lutropismi, jota havaittiin in vivo. on seurausta T4-molekyylin estyneestä ekspressoitumisesta eikä sen solutyypin luonteesta, 35 jossa se ekspressoituu.

102837 AIDS-virus sitoutuu pinta-T4-proteiiniin

Edelliset kokeet antavat geneettistä näyttöä, että T4-ekspres-5 soitumista tarvitaan AIDS-virusinfektioon, mutta eivät anna informaatiota tämän molekyylin osuudesta viruksen elämänkierrossa. Havainto, että T4:n pinta-ekspressio on välttämätöntä AIDS-virusinf ektiolle, antaa olettaa, että T4 on AIDS-virusresepto-ri. Sen tähden käytettiin sytofluorimetriä tutkimaan AIDS-vi-10 ruksen sitoutumista T4+ ja T8+ transformoituneiden ihmisen solujen pinnalle (taulukkko I; kuvio 14). HSB2-, Raji- ja HeLa-soluja ja T4+ tai T8+ transformantteja inkuboitiin AIDS-viruk-sen kanssa. Sen jälkeen kun virukset olivat absorpoituneet, solut pestiin, altistettiin fluoreskeiini-konjugoituneelle anti-15 AIDS-virus-vasta-aineelle ja analysoitiin virtaussytometrillä. Tämä määritys osoitti, että AIDS-virus sitoutuu tehokkaasti ja spesifisesti ihmisen transformantteihin, jotka ekspressoivat pinta-T4:ää, mutta eivät T4 parentaalisiin soluihin eivätkä T8+-transformantteihin (kuvio 14, palsta C). Lisäksi, kun T4+-: 20 transformantit altistetaan AIDS-virukselle, T4 glykoproteiini saostuu samanaikaisesti viruksen kuoren glykoproteiinin kanssa, antaen olettaa, että on suora fysikaalinen yhteys näiden molekyylien välillä (tiedot eivät näy). Nämä tulokset osoittavat, että AIDS-virus sitoutuu T4-molekyyliin solun pinnalla ja että 25 tämä sitoutuminen ei riipu muista T-soluspesifisistä proteiineista, koska sitoutuminen tapahtuu kaikille T4+-solutyypeille, jotka on tutkittu.

Edelliset tutkimukset ovat kuvanneet 2 erillistä reittiä kuo-30 rellisten virusten sisäänmenolle (74, 75, 76, 77). Jotkut virukset fuusioituvat suoraan plasmamembraanin kanssa vapauttaen niiden nukleokapsidit sytoplasmaan, kun taas toiset internali-soituvat reseptorin välittämässä endosytoosissa.Endosomin hapan ympäristö helpottaa sitten viruskuoren fuusiota solurakkulan 35 rajoittavan membraanin kanssa. Infektio virusten toimesta, jotka menevät soluun endosyyttistä reittiä, voidaan estää käsittelemällä soluja aineilla, kuten heikot emäkset, jotka poistavat 102837 58 endosomista happamuuden (58, 78, 79, 80). Ammoniumkloridin läsnäollessa fuusio estyy endosomissa, mutta lysosomaalinen hajotus etenee silti vähentyneellä nopeudella (80).

5 Siksi tutkittiin ammoniumkloridin tehoa T4+ T-solulinjan JM

AIDS-virusinfektioon. Ammoniumkloridin puuttuessa, yli 50 % JM-soluista, jotka oli altistettu AIDS-virukselle, ekspressoivat virusantigeenejä 5 päivää infektion jälkeen, kuten määritettiin immunofluoresenssimikroskoopilla. Jos JM-solut altistetaan am-10 moniumkloridille (6 h) joko virusten lisäyksen aikana tai 30 min sisällä viruslisäyksestä, havaittiin suurempi kuin 95 % virusinfektion inhibiitio. Kuitenkin jos soluja käsitellään ammo-niumkloridilla 1 h viruslisäyksen jälkeen, ei havaittu infektion inhibiitiota, havainto, joka on yhdenmukainen viruksen si-15 säänmenemisen kinetiikalle, jota on kuvattu muille viruksille, jotka menevät soluihin reseptorin välittämän endosytoosin kautta. Lopuksi, ammoniumkloriditeho oli täysin reversiibeli. Solut, jotka altistettiin ammoniumkloridille 1 h:ksi ja sitten . pestiin vapaaksi yhdisteestä ja altistettiin AIDS-virukselle, : 20 kannattivat virusinfektion kontrollitasoja. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia aikaisempien havaintojen kanssa, että ammoniumkloridin poiston jälkeen endosomien pH palaa alkuperäisille alhaisille arvoille 1-2 minuutissa (78, 80). Saatiin samanlaisia tuloksia amantadiinilla, yhdiste, joka poistaa happamuuden en-25 dosomista.

Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia viruksen sisäänmenon mekanismin kanssa, johon kuuluu T4-AIDS-viruskompleksin endosytoosi ja alhainen pH-indusoitu viruksen kuoren fuusio endosomin rajoit-30 tavan membraanin kanssa, jolloin viruksen nukleokapsidi vapautuu solun sytoplasmaan.

t4 mRNA ekspressoidaan aivoissa 35 Sen lisäksi, että AIDS hajottaa solun immunisysteemin, sitä seuraa usein myös keskushermostosysteemin (CNS) häiriöt, joiden ajatellaan olevan seurausta AIDS-viruksen suorasta aivosolujen 102837 59 infektiosta (81). Sen tähden oli kiinnostavaa määrittää, eks-pressoidaanko T4:ää CNS-soluissa, tällöin antaen selityksen viruksen neurotrooppisille ominaisuuksille. Tehtiin Northern blot analyysit sekä ihmisen että hiiren aivoista valmistetuista 5 RNA:sta, jotta määritettäisiin, ekspressoidaanko T4 mRNA-sek-venssejä CNSrssä (kuvio 15). Poly(A)+ RNA, joka on johdettu ihmisen aivokuoresta, sisältää 2 erillistä T4 mRNA:ta, joiden mo-lekyylipainot ovat noin 3 ja 1,8 kb (kuvio 15A). Heikompi 3 kb:n RNA on identtinen kooltaan mRNA:n kanssa, jota 2 T4+ leu-10 kernistä solulinjaa, U937 (monosyyttinen solulinja) ja Jurkat (T-solulinja), samoin kuin ääreis-T-lymfosyytit ekspressoivat. Pienempi, voimakkaampi 1,8 kb:n mRNA, joka puuttuu T-lymfosyy-teistä, voisi johtua vaihtoehtoisesta pilkkomisesta tai vaihtoehtoisista 5’- tai 3'-termineistä.

15

Suoritettiin huolellisempi analyysi T4 mRNA:n sijainnista eristämällä poly(A)+ RNA hiiren aivojen spesifisistä alueista (kuvio 15B). Hybridisointi radioleimatulla cDNA:lla, joka koodaa T4:n hiiriin ja rottiin liittyvää homologiaa, L3T4:ää, paljas-20 taa voimakkaan 2,2 kb:n mRNA:n hiiren etuaivoissa, mikä puuttuu taka-aivonäytteistä. 2,2 kb L3T4 mRNA havaitaan kuoressa, ala-näkökukkulassa ja on voimakkain aivojuoviossa, mutta puuttuu pikkuaivoista, aivorungosta tai selkäytimestä (tiedot eivät näy). Tämä 2,2 kb:n mRNA, joka havaittiinn CNSrssä, on noin 1 25 kb pienempi kuin 3,2 kb mRNA, joka koodaa L3T4:ää tymosyyteissä (kuvio 15B). Nämä tulokset osoittavat, että neurotropismi, jota AIDS-virus tuo esiin, on todennäköisesti seurausta T4-molekyy-lin pintaekspressoitumisesta aivosoluissa. Etuaivoissa havaitun mRNArn taso on noin 1/30 tasosta tymosyyteissä. Tämä voi hei-30 jastaa alhaista ekspressoitumisen tasoa suurella joukolla soluja tai korkeampaa ekspressoitumisen tasoa solujen pienellä alapopulaatiolla. Tällä hetkellä ei tiedetä, ekspressoivatko neuronit tai tukisolut T4:ää. Vaihtelevien transkriptien läsnäolo CNSrssä tekee epätodennäköiseksi sen, että T4 mRNArta 35 ekspressoi aivoissa harvinainen tunkeutuva T-lymfosyytti.

102837

Selostus T4:n ja T8:n, joilla on toiminnallisesti erilliset T-solujen alasarjat, eritys antaa olettaa, että nämä molekyylit voivat olla tärkeitä T-lymfosyyttien vuorovaikutuksessa sopivien 5 kohdesolujen kanssa. Ensimmäisenä vaiheena ymmärrettäessä näiden proteiinien spesifistä osaa, saatiin cDNA-kloonit sekä T4- että T8-molekyyleistä ja niiden nukleotidisekvenssit määritettiin (20, 70). T4:n ja T8:n vähennettyjen prote-iinisekvenssien vertailu osoittaa, että näillä molekyyleillä 10 on merkittävää sekvenssi- ja rakennehomologiaa immunoglobu-liinin vaihtelevien (V) alueiden kanssa ja immunoglobuliinin supergeeninperheenjäseninä. Kuitenkin, T4:n ja T8:n N-ter-minaaliset V:n kaltaiset alueet ovat melko erilaisia: niillä on vain 28 %:n homologia ja niillä on sen tähden vähemmän 15 homologiaa toistensa kanssa kuin kummallakaan on immunoglobuliinin kevyiden ketjujen kanssa (kuvio 9A). Lisäksi alueet, joissa on maksimaalinen säilyminen T4:n ja T8:n välillä, ovat myös alueet, joissa on vahvin homologia immunoglo-buliiniin ja T-solureseptorin V-alueisiin. Täten, näiden 20 kahden molekyylin immunoglobuliinin kaltaiset alueet, vaikka rakenteellisesti samankaltaisia, osoittavat merkittävää sekvenssipoikkeamista, joka on yhdenmukaista sen hypoteesin kanssa, että ne tunnistavat erilaisia molekyylejä kohdesolujen erilaisissa alasarjoissa.

25 T4:n ja T8:n N-terminaaliSten alueiden V:n kaltaisen alueen rakennehomologialla voi olla erityistä merkittävyyttä näiden proteiinien toimintaan. Tosiasiassa kaikki immunoglobuliinin supergeeniperheenjäsenet ottavat osaa immunivasteeseen (62). 30 Lisäksi, tämän perheen yksittäiset jäsenet osoittavat voima-. kasta taipumusta liittyä yhteen toistensa kanssa dimeerien " muodostamiseksi. Tämä yhteenliittymien on ilmeistä immunog lobuliinin raskaiden ja kevyiden ketjujen, T-soluantigeeni-reseptorin alfa-ja beta-ketjujen, 02-mikroglobuliinin ja 35 luokka I MHC-proteiinien ja luokka II MHC-molekyylien alfa-ja beta-ketjujen vuorovaikutuksessa. T8-glykoproteiini muodostaa disulfidisillan 102837 61 T6:n, oletettu MHC:n kaltainen molekyyli, kanssa tymosyyttien pinnalle (82) ja esiintyy 32 kd:n multimeeri alayksikköinä ää-reis-T-lymfosyyteissä (83). Neljän V:n kaltaisen alueen läsnäolo T4:ssä osoittaa, että nämä alueet liittyvät yhteen toistensa 5 kanssa yhtä hyvin kuin spesifisten ligandien kanssa muiden solujen tai virusten pinnalla. Nämä immunoglobuliinin kaltaisten molekyylien spesifiset affiniteetit saattavat olla olennaisia T4:n ja T8:n toimintojen tunnistamiselle.

10 T4:n evoluutio

Immunoglobuliinissa ja T-soluantigeenireseptorigeenissä, V- ja J-eksonit ovat suureksi osaksi erotetut ja asettuvat rinnakkain vain somaattisen rekombinaatiotapahtuman jälkeen (62, 63). T4 15 mRNA koodaa neljää vierekkäistä V:n ja J:n kaltaista elementtiä ilman, että siihen tarvittaisiin DNA-rekombinaatiotapahtumia. Sen tähden on mahdollista, että T4 kuvastaa primitiivisempää geeniä, joka kehittyi ennen uudelleenjärjestelymekanismin ilmestymistä. Lisäkannatusta tälle saadaan äskettäisistä havain-' 20 noista, että ensimmäisen V:n kaltaisen T4-alueen (VI) pilkkoo introni, joka ei ole läsnä V-geeneissä, jotka koodaavat joko immunoglobuliineja tai T-soluantigeenireseptoreja. Lisääntyvä näyttö antaa olettaa, että on paljon todennäköisempää intro-neille poistua tarkkaan evoluution aikana kuin että introneja 25 insertoidaan aiemmassa intronittomassa ympäristössä. Täten, T4 voi edustaa perittyä immunoglobuliinigeeniä, jossa tapahtui duplikaatioita, hajaantumista ja uudelleenjärjestäytymistä nykyisen immunoglobuliinigeeniperheen luomiseksi. Vaikka T4 on toiminnallinen paljon kompleksimmassa immuunisysteemissä nyky-30 ään, T4 voi tuottaa reseptoreja, jotka ovat tehokkaita primi-. tiivisemmissä solun immunivasteissa. Primitiiviset immuunivas- ' teet, kuten selkärangattomien, eivät näytä sisältyvän resepto- rimolekyylien vaihtelevaan ohjelmistoon, vaan rajoittuvat yksinkertaisemmissa tapauksissa itse ja ei-itse erottamiseen (85, 35 86) ja ovat todennäköisesti "staattisen" geenisarjan, joilla ei ole uudelleenjärjestäytymistä, mukauttamia.

102837 62

Olkoon T4:n ilmestymisen järjestys mikä tahansa kehitysajassa, tämän geenin järjestely paljastaa kiinnostavan esimerkin ekso-nin paikasta toiseen työntämisestä. T4 koostuu neljästä V-J:n kaltaisesta alueesta, J:n kaltainen ja transmembraanisegmentti, 5 jokaisella on homologiaa immunoglobuliinin supergeeniperheen erilaisten jäsenten kanssa. V:n ja J:n kaltaiset alueet ovat homologisia sekä immunoglobuliinien että T-soluantigeeniresep-toriketjujen vastaavien alueiden kanssa; transmembraanialueilla on merkittävä homologia luokka II MHC-molekyylien β-ketjujen 10 tämän alueen kanssa (kuvio 9C). Sen vuoksi T4 koostuu kokoelmasta eksoneja, jotka ovat säilyneet useissa immunoglobuliinin supergeeniperheenjäsenissä, jotka ovat järjestäytyneet eri tavoin, jolloin luodaan suuri joukko erilaisia molekyylejä, jotka ottavat osaa immuunivasteeseen.

15 T4 on AIDS-virusreseptori Tässä annetut asiatiedot esittävät mekanismin AIDS-virusinfek-tiolle, johon ensin kuuluu spesifinen AIDS-viruksen yhteenliit-: 20 tyminen T4-molekyylien kanssa solun pinnalla. Tämä yhteenliit tyminen voidaan osoittaa T-lymfosyyteilla, B-lymfosyyteilla ja epiteelisoluilla ja ei sen vuoksi vaadi lisäksi tulevien T-so-luspesifisten proteiinien osanottoa. Lisäksi, tässä annetut asiatiedot osoittavat, että T4-AIDS-viruskompleksi.internali-25 soituu reseptorin välittämässä endosytoosissa ja sitten virus-kuori fuusioituu endosomin rajoittavan membraanin kanssa, jolloin nukleokapsidi vapautuu sytoplasmaan. Virusreplikaatio ja transkriptio voi sitten tapahtua sekä lymfa- että ei-lymfasolu-linjoissa. Lisäksi, T4 ekspressoituu aivoissa samoin kuin lym-30 fosyyteissa, antaen selityksen AIDS-viruksen kaksois-neurotro-fiselle ja lymfotrofiselle luonteelle. Tällä tavoin ihmisen • retrovirus on käyttänyt hyväksi T-lymfosyyttipintaproteiinia, joka on tärkeä välittämässä effektorisolu-kohdesolu vuorovaikutuksia, spesifisesti pommittamaan AIDS-virusta T4+-solujen 35 populaatioon.

Lukuisille kuorellisille viruksille on tunnistettu solupintare- 102837 63 septoreja ja näiden reseptorien ekspressoitumisen malli on u-sein vastuussa spesifisten virusten isäntäsarjasta ja trooppisista ominaisuuksista (74, 76). Jotkut virukset infektoivat vain kapealla alueella viruksia, kuvastaen virusreseptorin 5 ekspressoitumista kohdesolujen spesifisiin populaatioihin. Ve-sikauhuvirus, esimerkiksi on vuorovaikutuksessa nikotiiniase-tyylikoliinireseptorin (87) kanssa ja infektoi suuressa määrin luustoon kiinnittyneitä lihaksia ja neuroneja, kun taas Eps-tein-Barr-virus on vuorovaikutuksessa C3d komplementti resep-10 torityypin 2 (88) kanssa ja infektoi B-lymfosyyttejä. Muut virukset, kuten myksovirukset, ovat vuorovaikutuksessa kaikkialla levinneen siaalihappojäännösten kanssa solupinnalla ja infektoi paljon laajempaa solutyyppialuetta. Estynyt solupintaresepto-rien ekspressoituminen antaa vain yhden selityksen virustropis-15 mille. Jotkut virukset replikoivat vain erilaistuneiden solu- tyyppien estyneissä sarjoissa, kun taas toisia transkriptoidaan tehokkaasti vain spesifisissä solutyypeissä. Täten, Moloney hiiriin ja rottiin liittyvä leukemiavirus (Mo-MuLV) indusoi T-solulymfomaa vastasyntyneissä hiirissä, mutta läheistä sukua : 20 oleva Friend auttaja hiiriin ja rottiin liittyvä leukemiavirus (Fr-MuLV) indusoi etupäässä varhais-puna- ja valkosoluveritautia (89, 90, 91). Tämän tropismin on ajateltu johtuvan eroista LTR:ssä, jotka helpottavat Mo-MULV-genomin tehokasta transkriptiota T-lymfosyyteissa ja Fr-MuLV-genomin punertavissa prekur-25 soreissa (92, 93, 94).

Kuten tässä on osoitettu, AIDS-viruksen primäärinen trooppinen determinantti on T4-proteiinin ekspressoituminen kohdesolun pinnalla. In vivo infektio estyy lymfasoluihin ja meyloidiso-30 luihin, samoin kuin aivosoluihin: kolme populaatiota, jotka ekspressoivat T4:ää. In vitro todistukset osoittavat, että T4:n ’ vieminen T4- ihmisen B-lymfosyytteihin ja epiteelisoluihin, so luihin, jotka eivät ole luonnollisia kohteita AIDS-virukselle, tekevät nämä solut herkiksi AIDS-viruksen tuottavalle infektio-35 lie.

102837

Esimerkki Ί

Liukoiset Τ4-fragmentit

Liukoiset glykoproteiinifragmentit valmistetaan soluvalmis-5 teista käyttämällä rajoitettua proteaasipilkkomista. Vaihtoehtoisesti voidaan tehdä DNA-ekspressiovektorit, jotka koo-daavat T4-fragmentteja, joilta puuttuu transmembraanialue, alue, jossa on neutraalit ja hydrofobiset jäännökset, ja käyttää tuottamaan T4-fragmentteja. Nämä fragmentit luikene-10 vat vesipitoisiin liuoksiin ja niissä on leader (signaali) sekvenssit. Kun fragmentit ekspressoituvat nisäkässoluissa, ne kuljetetaan karkeaan endoplasmiseen retikulumiin/Golgin kompleksiin ja mahdollisesti eritetään soluista.

15 Esimerkki_2 AIDS-potilaiden käsittely

Liukoisia T4-glykoproteiinifragmentteja, kuten esimerkissä 1 on kuvattu, annetaan tyypillisesti farmaseuttisesti hyväk-20 syttävässä kantajassa potilaalle, joka on ihmisen immuunikatoviruksen infektoima, niin että ne sitoutuvat virukseen, jota on kohteen veressä ja muissa kehon nesteissä ja estävät T4+-solujen infektion in vivo. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi, potilaan veren annetaan kiertää pylväässä, jossa on joko 25 immobilisoituja T4-glykoproteiineja tai liukoisia T4-fragmentteja, niin että virus voidaan erottaa verestä. Sellaiset toimenpiteet sallivat immuunisysteemin nostamaan tehokkaamman immunologisen vasteen virusta vastaan, s.o. sallivat ei-infektoituneiden T4+ T-solujen lisääntyä.

30

Liukoisia T4-fragmentteja käytetään terapeuttisina aineina, s.o. solunulkopuolisen ja solusta soluun levuinneen HIV-infektion inhibiittorina. Hakijat ovat osoittaneet, että liukoiset T4-fragmentit inhiboivat in vitro HIV-sitoutumista T4+-kohdeso-35 luihin ja niiden infektiota (katso esimerkki 4). Liukoisten T4-fragmenttien antaminen henkilöille, jotka ovat HIV-infektoitu- 102837 65 neita, inhiboi virusinfektion solunulkopuolista leviämistä. Lisäksi, HIV-infektoituneiden T4-solujen ja ei-infektoituneiden T4+-solujen fuusio, joka on myös se reitti, jolla virus leviää, inhiboidaan antamalla liukoisia T4-fragmentteja.

5

Siksi liukoisten T4-fragmenttien antaminen hidastaa sairauden kulkua, vähentää useita AIDSiin liittyviä oireita ja estää uusien patologisten muutosten tapahtumisen.

10 Liukoisia T4-fragmentteja, biokemiallisesti puhtaita, vesiliukoisia reagensseja, käytetään yhdessä muiden reagenssien kanssa määrittämään T4-HIV-vuorovaikutuksen kilpailijoita. Täten, liukoiset T4-fragmentit, yhdessä HIV:n kuoren proteiinin kanssa tai biokemiallisten seosten kanssa, joissa on HIV:n kuoren pro-15 teiineja, käytetään seulomaan virussitoutumisen inhibiittorei-ta.

Esimerkki 3

Liukoisten T4-fragmenttien tuottaminen ·· ; 20

On eristetty cDNA, joka koodaa membraaniin sitoutunutta T4-pro-teiinia (pT4B), luonnehdittu ja ekspressoituu erilaisissa nisä-kässolutyypeissä (70) . Liukoisia T4-fragmentteja tuotetaan bakteeri-, hiiva, hyönteis- ja nisäkässysteemeissä. Koska T4-pro-25 teiini todennäköisesti laskostuu monimutkaisella tavalla ja on glykolysoitu, ekspressoituminen nisäkässysteemissä on edullinen. Liukoisia T4-fragmentteja tuotetaan tylpistämällä pT4B V,J4-alueen jälkeen. Sellaiset fragmentit loppuvat ennen trans-membraanisegmenttiä, joka alkaa noin nukleotidikohdasta 1264 30 (kuvio 6). Tältä rekombinatti-DNA-molekyyliltä puuttuu sekä transmembraani- että sytoplasmiset alueet. EcoRI-HpaII-frag-mentti, joka ympäröi nukleotidejä 1-1252, eristetään kokoamalla se pienemmistä pT4B:n fragmenteista. Vaihtoehtoisesti, membraa-nin sisältävä segmentti deletoidaan yksinään, jolloin V4J4-alue 35 jää fuusioituneeksi sytoplasmiseen alueeseen. Eräs lähestymistapa on deletoida fragmentti, joka sisältää Hpall-kohdat pT4B: Itä, nukleotidit 1252-1342. Sellaiset rakenteet ylläpitävät T4- 102837 66 signaalisekvenssin, jota tarvitaan karkeaan endoplasmiseen re-tikulumiin/Golgin kompleksiin sisäänmenemiseen ja mahdolliseen erittämiseen solusta. Lisäksi, näissä rakenteissa on solunulko-puolinen osuus T4-proteiinia, jossa on sitoutumisalue ihmisen 5 immuunikatoviruksen kuoren glykoproteiinille.

Jotta liukoisia T4-fragmentteja ekspressoidaan nisäkässystee-meissä, muokattu T4 cDNA-fragmentti subkloonataan vektoreihin, joissa on vahvat eukaryoottiset promoottorit/enhancerit, samoin 10 kuin RNA:n polyadenylointikohdat. Esimerkiksi, simian viruksen (SV40) aikainen promoottori ja voimistaja (enhancer) sijaitsevat ylävirtaan liukoisesta T4 cDNA-fragmentista. Transkription päättyminen ja RNA-polyadenylointi saavutetaan sijoittamalla joko SV40:n tai ihmisen kasvuhormonigeenin polyadenylaatiokohta 15 alavirtaan liukoisesta cDNA-fragmentista. Kun viedään yhdessä rakenne, jossa on näitä elementtejä valikoitavan markkerin kanssa, eukaryoottisiin soluihin millä tahansa alalla tunnetulla menetelmällä, johtaa se eksogeenisen DNA:n stabiiliin integraatioon. Transformantit, jotka valittiin niiden hyvän puolen : 20 takia, ne kykenevät kasvamaan valikoivalla alustalla ja erittä mään T4-fragmentteja viljelmäsupernatanttiin. Liukoisia T4-fragmentteja havaitaan supernatantissa jollakin useasta määrityksestä, esim. radioimmunosaostus, ja sitten puhdistetaan. Liukoisten T4-fragmenttien puhdistamista ja luonnehtimista li-25 sää suuresti tekemällä solulinja, joka yliekspressoi eritettyä proteiinifragmenttia. Strategioita, jotka sallivat proteiinien yliekspressoitumisen, on käytetty bakteereissa, hiivassa, hyönteisissä ja nisäkässysteemeissä. Indusoituvia ekspressoitumis-systeemejä on myös käytetty bakteereissa ja hiivassa, jotta y-30 lituotettaisiin proteiineja, jotka saattavat olla toksisia, jos niitä ekspressoidaan konstitutiivisesta. Liukoisten T4-frag-menttien yliekspressoituminen toteutetaan amplifioimalla liukoinen T4-ekspressiovektori, joka johtaa konstitutiiviseen yli-ekspressoitumiseen. Dihydrofolaattireduktaasi (dhfr) geenien 35 amplifikaatiota, kasvattamalla astettain kohoavassa metotrek-saattikonsentraatioissa, dhfr:n antagonisti, on käytetty laajalti. Koska amplifioitu yksikkö ei rajoitu dhfr-koodaussek- 102837 vensseihin, tämä lähestymistapa johtaa niiden vieressä olevien sekvenssien yhteisamplifikaatioon. Siksi dhfr:ää käytetään valikoivana markkerina ja keinona vasta siirrettyjen sekvenssien yhteisamplifikatioon. Tätä strategiaa on käytetty menestyksellä 5 kohottamaan useiden erilaisten geenien, jotka transformoituvat dhfr-plasmidien kanssa, ekspressoitumista. Vaihtoehtoiseen amp-lifikaatiokaavioon kuuluu liukoisen T4 cDNA-ekspressiovektorin yhteistransfektio pdLAT-3-plasmidin kanssa, jota seuraa vali-kointikaavio, kuten edellä kuvattiin (102) .

10

Siksi liukoinen T4 cDNA-ekspressiorakenne transfektoidaan yhdessä dhfr-ekspressioplasmidin kanssa. Vaihtoehtoisesti, dhfr-geeni on samalla plasmidilla kuin liukoinen T4 cDNA-fragmentti, sallien kytkeytyneen yhteistransformaation. Näiden rakenteiden 15 transfektio dhfr-vajavaiseen (dhfr-) Kiinan hamsterin munasar-jasoluihin (CHO) ja sen jälkeen tapahtuva valinta metotreksaa-tilla, sallii stabiilien transformanttien, jotka ekspressoivat vasta sisäänvietyjä sekvenssejä, eristyksen. Puhdistetaan useita klooneja ja viljelmäsupernatantit kerätään ja niistä määri-• 20 tetään liukoisten T4-fragmenttien läsnäolo. Klooneja, jotka tuottavat suurimmat liukoisten T4-fragmenttien tasot, luonnehditaan lisää Northern ja Southern blot-analyyseillä. Näitä so-lulinjoja kasvatetaan sitten valikoivassa alustassa, jossa on vähitellen kohoavat metotreksaattikonsentraatiot. Tämä valikoi-25 va paine johtaa vasta sisäänviedyn dhfr-geenin ja viereisten T4-sekvenssien amplifikaatioon. Kun on saavutettu korkein meto-treksaattikonsentraatio, henkiin jääneille soluille tehdään Northern ja Southern blot-analyysit, jotta määritettäisiin amp-lifikaation laajuus ja viljelmäsupernatanteista tutkitaan liu-30 koisten T4-fragmenttien läsnäolo.

Jotta luonnehdittaisiin liukoiset T4-fragmentit viljelmäsuper-natantissa, useita transformantteja leimataan aineenvaihdunnallisesta (”S)-metioniinilla. Solulysaatit ja supernatantit ana-35 lysoidaan sitten radioimmunosaostuksella ja Western blot-ana-lyysillä käyttämällä kaupallisesti saatavia anti-T4-vasta-ai-neita. Saostumille suoritetaan SDS-polyakryyliamidigeelielekt- 102837 68 roforeesi ja havaitaan .vyöhyke, jolla on ennustettu, suhteellinen molekyylimassa (Mr) , eritetystä, tylpennetystä T4-muodos-ta. Koska se syntetisoidaan nisäkässysteemissä, tämä proteiini on glykosyloitu ja laskostettu kunnolla, s.o. disulfidisillat 5 muodostuvat. Jotta puhdistettaisiin liukoiset T4-fragmentit viljelysupernatantista, suoritetaan immunoaffiniteettipylväs-kromatografia käyttämällä anti-T4-vasta-aineita. Proteiini, joka on sitoutunut pylvääseen, eluoidaan korkeassa suolakonsen-traatiossa ja alhaisessa pH:ssa. Suoritetaan eluoidusta materi-10 aalista SDS-polyäkryyliamidigeelielektroforeesi, jotta määritettäisiin eluoidun proteiinifraktion M, ja puhtaus. Lisäksi, suoritetaan myös radioimmunosaostus ja Western blot-analyysi, jotta luonnehdittaisiin lisää affiniteetti-puhdistettua materiaalia.

15

Samanlaisia lähestymistapoja voidaan tehdä bakteereissa, hiivassa ja hyönteisissä liukoisten T4-fragmenttien tuottamiseksi. Lisäksi voidaan tuottaa fragmentteja, jotka ovat pienempiä kooltaan kuin tässä kuvattu, esim. sisältää vain V^-alueen.

: 20

Vektoreiden rakentaminen Käyttämällä rekombinantti-DNA-manipulointia, laitettiin ihmisen T4 cDNA-sekvenssin emäsparit (bp) 1-1257 SV40 aikaisen promoot-25 torin ja TAA-lopetuskodonin väliin, jota seurasi naudan kasvu-hormonigeenin polyadenylaatioalue. Tämä T4 cDNA:n sekvenssi koodaa T4-reseptorin johtavaa ja ennustettua solunulkopuolista aluetta. Tämä sT4 minigeeni liitettiin ihmisen H~ras:iin tai hiiren dihydrofolaattireduktaasiminigeeniin vektoreiden pST4CH-30 ras:n ja pST4DHFR:n luomiseksi, vastaavasti. Näiden vektoreiden ·, rakentaminen oli seuraavanlainen: pST4sal:n rakentaminen: Plasmidi pST4sal tehtiin kahdesta muusta plasmidista, JRT4 ja pUCsT4. Näiden plasmidien rakentaminen 35 on kuvattu yksityiskohtaisesti alla.

Plasmidin JRT4 rakentaminen: Plasmidin JRT4 luomiseksi plasmidi V ' 102837 DSP1 (103) pilkottiin XhoI:llä, SV40 polyA aikainen alue dele-toitiin ja Xhol-kohdat täytettiin käyttämällä DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia. Naudan kasvuhormonipolyadenylaatioalue (113) pilkottiin PvuIIilla ja Kpnl:llä ja Kpnl-kohta tehtiin 5 tylppäpäiseksi T4-DNA-polymeraasilla. Tämä 230 bp fragmentti ligoitiin DSPl:een DSPIBGHin luomiseksi. DSP1BGH pilkottiin Smal:llä ja Sällillä ja galK-kasetti (koostuen SV40 aikainen promoottori, galK koodausalue ja BGH polyA-alue) ligoitiin pUC19:ään (107) Sali-kohtaan käyttämällä synteettistä linkkeri-10 ä, jossa on Sali pää, Bglll kohta ja Smal pää. Tämä kolmiosainen ligaatio johti plasmidiin DSP1BZBGH.JT.

DSP1BZBGH.JT, joka pilkottiin Stulillä ja Bcllillä galK koodau-salueen deletoimiseksi, ligoitiin 1,7 kb:n EcoRI- (täytetty) 15 BamHI-fragmenttiin, jossa oli T4 cDNA pT4B-plasmidilta (70) JRT4-plasmidin luomiseksi.

pUCsT4-plasmidin rakentaminen: pUCsT4-plasmidin luomiseksi ligoitiin T4 cDNA:n Haell- ja HpaII-fragmentti (1125 bp) plasmi-• 20 dilta pT4B käyttämällä synteettisiä linkkereitä vektorille pUC- 18, joka oli pilkottu Kpnlrllä ja Xbalillä. T4 cDNA:n Haell loppu ligoitiin pUC18:n Kpnl-kohtaan käyttämällä synteettistä linkkeriä Kpnl pään ja Haell pään kanssa. T4 cDNA:n Hpall pää ligoitiin pUC18:n Xbal-kohtaan käyttämällä synteettistä linkke-25 riä Hpall pään ja Xbal pään kanssa. Tämä linkkeri insertoi myös TAA-lopetuskodonin T4 koodausalueen nukleotidin 1257 jälkeen. Saatu plasmidi oli pUCsT4.

Plasmidin pST4sal luomiseksi pilkottiin plasmidi JRT4 BglII:lla 30 ja Saclillä ja eristettiin 959 bp fragmentti (koostuen SV40 aikaisesta promoottorista ja T4 cDNA:n ensimmäisistä 602 nukleotidistä. Plasmidi pUCsT4 pilkottiin Sacl:llä ja Xbalillä ja e-ristettiin 660 bp fragmentti (koostuen T4 cDNAin nukleotideistä 603-1257, jota seurasi TAA-kodoni synteettiseltä linkkeril-35 tä). Nämä kaksi fragmenttia ligoitiin DSP1BZBGH.JT:hen, joka oli pilkottu Bglllilla ja Xbalillä SV40 aikaisen promoottorin ja täysipitkän T4-koodausalueen deletoimiseksi. Saatu plasmidi oli pST4sal.

102837 pST4DHFR:n rakentaminen: Plasmidin pST4DHFR:n luomiseksi ligoi-tiin BglII-BamHI-fragmentti, jossa oli β-globiini DHFR-ekspres-5 soitumiskasettir pST4sal:n BamHI-kohtaan. β-globiini DHFR-eks-pressoitumiskasetti koostuu: hiiren β-globiinipromoottorista (550 bp HincII-fragmentti plasmidilta pPK288 (108), jota oli muokattu sen 5'-päästä synteettisellä linkkerillä niin, että siinä oli Bglll-kohta; hiiren DHFR-koodausalue (735 bp Hindlll-10 (täytetty) fragmentti plasmidilta pSV2-DHFR (109); Nhel- (täytetty) BamHI (täytetty) SV40 polyA aikainen alue DSPl:ltä (103); ja hiiren DHFR lopetusalue (907 bp Hindlll- (täytetty) fragmentti plasmidilta mDH9 (110), muokattu sen 3'-päästä synteettisellä linkkerillä BamHI-kohdan luomiseksi. pST4DHFR:n 15 plasmidikartta on näytetty.

pST4cHras:n rakentaminen: Plasmidi pMERcHras luotiin pilkkomalla plasmidi pSVK (111) EcoRV:lla ja HindIII:lla (täytetty) galK-alueen poistamiseksi ja ligoitiin 870 bp:n Ndel- (täytet-• 20 ty) Sali- (tehty tylppäpäiseksi mung bean nukleaasilla) frag menttiin, jossa oli cHras:n koodausalue plasmidilta pSKcHras (112).

Liukoinen T4 transkriptiokasetti poistettiin pST4sal:lta Bglll-25 BamHI-fragmentin kautta ja ligoitiin pMERcHras:n BamHI-kohtaan (3' SV40:n polyA-aikaisesta) pST4cHras:n luomiseksi.

Liukoisten T4 (sT4) minigeenien ekspressoituminen nisäkässolui-ssa 30 psT4cHras:n ekspressoituminen NIH-3T3-soluissa: Plasmidi pST4c-Hras (10 yg) saostettiin yhdessä kalsiumfosfaattisaostusmene-telmällä 10 yg:n kanssa pTKneo-plasmidia, vektori, joka antaa G418-resistenssin, 10 yg läsnäollessa kantaja-DNA:ta (NIH-3T3 35 genominen DNA) NIH-3T3-soluihin (ympätty, kun 5 x 10! solua 60 mm:n viljelmämaljaa kohti edellisenä päivänä). Soluja inkuboi-tiin saostuneen DNA:n kanssa 6 h 37‘C:ssa. DNA-saostuma pois- 102837 71 tettiin ja astioihin lisättiin tuoretta alustaa (DMEM, 5 % Nu-Serum* (Collaborative Research, Inc., lexington, Massachuset-tes)). Solut trypsinoitiin 16 h myöhemmin ja ympättiin kolmeen 100 mm:n astiaan ja ylläpidettiin edellä mainitussa alustassa.

5 Pesäkkeet ilmestyivät (noin 50 astiaa kohti) 12-14 päivässä. Transformoiduista pesäkkeistä valittiin 11, levitettiin ja ympättiin sitten 5 x 105 solua 100 mm:n astiaa kohti selektoita-vaksi edellä olevassa alustassa plus 500 ug/ml GENETICIN* G418 (Gibco Laboratories, Grand Island, New York). Kaikki 11 kloonia 10 selvisi hengissä G418-valinnassa (500 pg/ml) ja niistä seulottiin H-ras-(p21) tasot standardiproteiini immuniblotanalyysil-lä.

Klooneista, jotka ekspressoivat korkeimmat p21-tasot (noin 2 ng 15 p21/pg Triton-liukoista proteiinia), määritettiin sT4-ekspres-soituminen. Konfluentteja viljelmiä inkuboitiin 18 h ,!S-leima-tun metioniinin ja systeiinin kanssa. Viljelmäsupernatantit ja solulysaatit immunisaostettiin monoklonaalisten vasta-aineiden . kanssa, jotka olivat spesifisiä T4- (OKT4, OKT4A) ja T8- (OKT8) • 20 reseptoreille, polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka olivat spesifisiä ras-proteiineille tai ei-spesifisen hiiren IgG:n kanssa. Saostettiin proteiini, joka oli noin 45 kd, sT4:n ennustettu koko, saostettiin spesifisesti viljelmäalustasta molempien monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka oli kohdistettu 25 T4-reseptoria vastaan, avulla. Solulysaateissa ei havaittu sT4-vyöhykettä. Kuten odotettiin, p21 saostui solusta, mutta ei viljelmäsupernatanteista. Sen jälkeinen kvantitointi osoittaa, verrattuna puhdistettuun sT4:ään, että nämä solut tuottavat suhteellisen alhaisia sT4-tasoja, s.o. noin 100 kertaisesti al-30 haisempia kuin CHO-solujen kanssa, kuten esimerkissä 2B kuvattiin.

pST4DHFR:n ekspressoituminen Kiinan hamsterin munasarjasoluissa (CHO): DXB-ll-solut, DHFR-vajavainen CHO-solulinja (104), 35 transfektoitiin kalsiumfosfaattisaostuksella 10-30 pg:lla pST4-DHFR:ää 10 pg:n läsnäollessa kantaja-DNA:ta (NIH-3T3 genominen DNA) yksi päivä sen jälkeen, kun oli ympätty 5 x 10! solua 60 102837 mm:n astiaa kohti. Soluja inkuboitiin saostuneen DNA:n kanssa 6 h 37'C:ssa, alusta poistettiin ja astioihin lisättiin tuoretta alustaa (F12, 10 % FBS, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja streptomysiiniä) . Alusta vaihdettiin jälleen 16 h kuluttua ja soluja 5 inkuboitiin toiset 24 h. Sitten solut trypsinoitiin, ympättiin kolmeen 100 mm:n astiaan ja valikoitiin nukleosidivapaassa a-lustassa (F-12 ilman hypoksantiinia ja tymidiiniä, 10 % dialy-soitua FBS:ää ja 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja streptomysiiniä) . Pesäkkeet (noin 100 astiaa kohti) ilmestyivät 7-10 päi-10 vässä. Jokaisesta astiasta kerättiin pesäkkeet, levitettiin ja ympättiin sitten 5 x 101 ja 5 x 10* solua kaivoa kohti 24 kaivon viljelmämaljoilla tai 5 x 10’ solua 100 mm:n astiaa kohti. Solujen annettiin selvitä 3 päivää ennen kuin alettiin valikointi nukleosidivapaalla alustalla, jossa oli 20 nM metotreksaattia 15 (mtx). Yksittäisistä kaivoista tai klooneista määritettiin sT4-ekspressoituminen ja ne, jotka valittiin lisäamplifikaatioon, ympättiin 24 kaivon viljelmämaljoille edellä kuvatuin tiheyksin. Valinta 800 nM mtxrllä nukleosidivapaalla alustalla aloi-, tettiin 3 päivää ymppäämisen jälkeen. Tämä valintamenetelmä • 20 toistettiin valinnoille 8 pM:ssa mtx ja 80 pMrssa mtx.

Saatiin useita solulinjoja käyttämällä tätä menetelmää, joka ekspressoi liukoista T4:ää vähimmäismäärällä 3 pg/solu/24 h.

25 sT4:n puhdistus: Ilmastettu alusta (CM) valmistettiin seerumi-vapaaksi kiinnittyvistä soluviljelmistä, jotka oli levitetty 850 cm1 pyöriviin pulloihin mtx-valikoivissa olosuhteissa. Kun solut olivat konfluentteja, ne pestiin 2 kertaa fosfaattipusku-roidulla suolaliuoksella (PBS) ilman Mg:t :aa ja Ca" :aa ja kas-30 vatusalusta (Ham's F12 ilman hypoksantiinia ja tymidiiniä, 10 % vasikan sikiön seerumia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja streptomysiiniä ja mtx:ää valikoivassa konsentraatiossa) korvattiin samalla alustalla miinus seerumi ja mtx ja plus 1 x ITS (insuliini, transferriini ja seleeni (Collaborative Research 35 Inc). 24-48 h kuluttua alusta poistettiin ja korvattiin valikoivalla kasvualustalla. Seerumivapaata alustaa käytettiin sitten uudestaan 3-5 päivän sisällä ja tätä kierrosta toistettiin 102837 73 määräämättömästä s.o. enemmän kuin 2 kuukautta. CM kirkastettiin sentrifugoimalla 8000 x g. Lisättiin proteaasi-inhibiitto-ria PMSF:ää (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) 0,5 mM:iin ja CM konsentroitiin noin 10-kertaisesti painesuodatinsuodatuksella.

5 Tämä konsentroitu CM kirkastettiin sentrifugoimalla 2000 x g ja lisättiin Aprotinin:a, proteaasi-inhibiittori (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) niin, että lopullinen konsentraatio oli 5 pg/ml. Näyte käsiteltiin suoraan tai -70'C:ssa säilytyksen jälkeen.

10

Konsentroitu CM-näyte laimennettiin 2-kertaisesti 50 mM MES:llä [2-(N-morfoliino)-etaanisulfonihappo], pH 6,0 ja suodatettiin 0,45 mikronin suodattimen läpi. Sitten näytettä käsiteltiin 100 pm pAPMSF:llä (p-amidinofenyylimetyylisulfonyylifluoridi) (Cal-15 Biochem-Behring, San Diego, California) ja laitettiin S-Sepha-rose* (sulfopropyyli) (Pharmacia P-L Biochemicals , Piscataway, New Jersey) pylvääseen, joka oli tasapainotettu 50 mM MES:ssä, pH 6,0, proteiinikonsentraation ollessa 1,5-2,0 rog/ml geeli. Näytettä eluoitiin käyttämällä lineaarista 0-0,5 M NaCl-gradi-20 enttia 50 mM MES:ssä, pH 6,0. Piikkifraktiot, jotka eluoituivat noin 0,2 M NaCl:ssä, kerättiin ja käsiteltiin pAPMSF:llä 100 μΜ:ϊίη. Fraktiot, joissa oli sT4:ää, varmistettiin SDS-PAGE:lla ja immunoblotmäärityksillä. Sen jälkeen, kun näyte oli ollut 4'C:ssa 1 h, se dialysoitiin 50 mM Bis-Tris-propaania vastaa 25 [1,3-bis[tris-(hydroksimetyyli)-metyyliamino]propaani], pH 6,0.

Näytettä käsiteltiin 100 uM pAPMSFrllä ja laitettiin sitten 0,1 % tiodiglykolia, pH 9,0 Q-Sepharose* (kvaternäärinen amino-etyyli) pylvääseen (Pharmacia) (5 ml näytettä/ml geeli), joka 30 oli tasapainotettu 50 mM:ssa Bis-Tris-propaanissa (BTP), pH

9,0. sT4-näyte ei sitoudu Q-Sepharoseen* ja saatiin sitoutumattomassa fraktiossa pylvään pesussa. Sitoutumattoman näytteen pH säädettiin välittömästi 6,0:ksi.

35 Lopullinen vaihe oli kromatografia 30 mikronin Superose* 12- pylväässä (2,5 x 46 cm) (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 50 mM:ssa fosfaatissa, 0,15 M NaCl pH 7,0. Pylväs ajettiin vir- 7Λ 102837 74 taussnopeudella 3,0 ml/min. Tehtiin 10 ml:n injektioita ja 42 minuutin piikki kerättiin annoksittain. Menetelmä tuotti noin 1,0 mg tuotetta 20 mg kokonaisproteiinia kohti solulinjalle, joka tuotti noin 3 pg/solu/päivä.

5 sT4:n luonnehtiminen

Fysikaaliset ominaisuudet: Kokonaisproteiinikonsentraatio määritettiin käyttämällä kolorimetristä BCA-proteiinimääritystä 10 (Bicinchoninic Acid, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). Absoluuttiset konsentraatiot määritettiin kvantitatiivisella aminohappoanalyysillä. Puhdistetun sT4:n mitattu aminohappo-koostumus tehtiin käyttämällä standardiaminohappoanalyysitek-niikkoja ja havaittiin sopivan yhteen molekyylille ennustetun 15 sekvenssin kanssa koevirheen puitteissa (+/- 15 %). 20 ensimmäistä jäännöstä sekvenssi oli kuten oli ennustettu, paitsi että se alkaa lys-lys-val-val----. Täten, valmis aminoloppu alkaa asemasta +3 suhteessa ennustettuun johtavaan leikkauskohtaan ja eroaa ennustetusta sekvenssistä tässä kohdassa asn:n vaihduttua 20 lys:iin. Valmiin aminohapon lopun kohta vastaa hyvin hiiren ja lampaan CD4-proteiinien määritettyä loppua. Asn:n vaihtuminen lys:ksi saattaa edustaa sekvenssointivirhetta (yksittäisen e-mäksen vaihtuminen) tai mutaatiota, joka tapahtui rekombinant-tiprosessien aikana.

25

Immunoepitoopit: Monoklonaaliset vasta-aineet OKT4 ja OKT4A tunnistavat T4-reseptorin ei-vuorovaikutuksessa olevat pintae-pitoopit (114). Nämä vasta-aineet ovat spesifisiä luonnollisille konformaatioille siten, että ne eivät sitoudu pelkistettyyn, 30 SDS-denaturoituun proteiiniin immunoblot-analyysissä. Osoitettiin, että molemmat vasta-aineet saostavat spesifisesti sT4:ää nS-leimatusta viljelmäsupernatanteista käyttämällä seuraavaa immunosaostusmenetelmää: 35 sT4:ää tuottavien solujen viljelmät, joissa oli 1 x 105 solua 60 mm:n viljelmäastiaa kohti, leimattiin 16 h 37'C:ssa 1,5 ml:ssa metioniini- ja systeiinivapaata F12-alustaa, jossa oli 102837 75 ITS ja 170 pCi/ml [,JS]metioniinia ja 30 uCi/ml [nS]systeiiniä (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, California). Kirkastettu alusta (100 μΐ) laimennettiin samalla tilavuudella saostuspus-kuria (10 mM natriumfosfaattia pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % NP-5 40*, 0,5 % rasvatonta maitojauhetta) ja inkuboitiin 3 ug:n kanssa kanin IgG:tä 15 min 4'Cissa, jota seurasi 30 μΐ (pakattu tilavuus) proteiini A sepharose helmiä (Pharmacia P-L Biochemi-cals) 30 min 4'C:ssa. Esikirkastettua supernatanttia inkuboitiin 5 ug kanssa OKT4:ää, OKT4A:ta ja OKT8:aa (P. Raon lahja, 10 Ortho Pharmaceuticals Corp., Raritan, New Jersey), hiiren

IgG:tä (Cooper Biomedical, Malvern, Pennsylvania), tai kani a-hiiri IgG:n kanssa (Cooper Biomedical) 30 min 4'Cissa. OKT4, OKT4A, OKT8, hiiren IgG ja kani α-hiiri IgG seostettiin inku-boimalla 20 μ1:η kanssa (pakattu tilavuus) proteiini A sepha-15 rose helmiä 30 min 4'C:ssa. Saostuksen jälkeen nämä helmet pestiin kahdesti 200 ul:lla saostuspuskuria ja kerran 200 ulilla saostuspuskuria miinus Np-40* ja rasvaton maitojauhe. Pestyjä helmiä keitettiin 5 min 20 ulissa näytepuskuria (125 mM Tris-, HC1 pH 6,8, 20 % glyserolia, 1,4 M β-merkaptoetanolia) ja su- 20 pernatantit analysoitiin 12,5 %issa SDS-polyakryyliamidigeelis-sä. Samanlaisia tuloksia saatiin OKT4Billä, OKT4Cillä, OKT4Di llä, OKT4Eillä, OKT4Fillä ja muilla Mabseilla, jotka olivat spesifisiä T4ille. Nämä tulokset antavat olettaa, että sT4in konformaatio jäljittelee tarkasti T4-reseptorin pintaaluetta.

25

Jotta voitaisiin päättää, voiko sT4 liittyä HIV gpl20in kanssa ja voiko tämä liittyminen inhiboida HIVin siotumista T4-solui-hin, noin 5 ug puhdistettua sT4iää absorboitiin Sepharose-hel-miin, jotka oli peitetty OKT4illä ja kontrollivasta-aineella.

30 Sitten helmet sekoitettiin ,!S-metioniini-leimatun HIV-lysaatin kanssa. sT4-kompleksi OKT4in kanssa saostaa samanaikaisesti vain 120 kdin kuoren glykoproteiinin. OKT4-helmet eivät saosta virusproteiineja sT4in puuttuessa tai kontrollisupernatanttien, ei-transfektoiduista CHO-soluista, läsnäollessa. Lisäksi, vi-35 rusproteiini ei saostu, jos Sepharose-helmiä, jotka on peitetty kontrolli hiiren immunoglobuliinilla (isotyyppi sopii yhteen OKT4in kanssa), inkuboidaan sT4:n kanssa. Nämä tutkimukset o- 102837 soittavat, että saatu sT4, jossa ei ole muita solupintakompo-nentteja, joita on T-lymfosyyttien pinnalla, kykenee spesifisesti liittymään AIDS-viruksen kuoren glykoproteiinin kanssa.

5 Suoritettiin sytofluorimetria, jotta osoitettaisiin että T4:n vuorovaikutus koskemattoman HIV:n gpl20:n kanssa lakkauttaa AIDS-viruksen sitoutumisen T4+-solujen pinnalle. T4+ CEM-solut altistettiin HIV:lie sT4:n läsnäollessa tai puuttuessa. Virus-absorption jälkeen solut pestiin, altistettiin fluoreskeiini- 10. konjugoidulle anti-HIV vasta-aineelle ja analysoitiin virtaus-sytometrillä (kuvio 17) (48). sT4:n puuttuessa HIV sitoutuu te hokkaasti T4+ CEM-soluihin. Jos HIV:ä esi-inkuboidaan sT4:n kanssa, viruksen sitoutuminen T4+-soluihin lakkaa (kuvio 17).

10 ng puhdistettua sT4:ää on riittävä inhiboimaan 100 ng:n vi-15 rusproteiinin sitoutumisen. Jos kuoren glykoproceiini sisältää 5 % kokonais virusproteiinia, niin arvioitu 5:1 molaarinen suhde T4:ää gpl20:een, kykenee inhiboimaan HIV:n sitoutumisen T4+-soluihin.

20 sT4:n kyky inhiboida HIV:n infektio T4+-soluihin tutkittiin myös. Fytohemagglutiniinistimuloidut ihmisen lymfosyytit altistettiin 10-kertaiselle HIV-ymppilaimennussarjalle sT4:n läsnäollessa tai puuttuessa, pestiin ja maljattiin mikroviljelmiin. Infektoituneiden viljelmien frekvenssi määritettiin käyttämällä 25 immunomääritystä 4, 8 ja 12 päivää virukselle altistamisen jälkeen (47). Tällä tavoin infektiivinen virustiitteri, ID-50 kuvataan sen laimennuksen käänteisarvoksi, jota tarvitaan infektoimaan 50 % altistetuista soluviljelmistä päivänä 12. sT4:n puuttuessa ID-50, joka havaitaan virusympin kanssa, on noin 30 10*. Kuitenkin, kun läsnä on 8 pg/ml puhdistettua liukoista . T4:ää, infektiivisyys pienenee melkein 4 log:lla ID-50:een 101,5 (kuvio 18) . Tämä dramaattinen vähentyminen HIV-infektiivi-syydessä havaitaan koko infektiotapahtuman ajan. Kontrolliksi ei-spesifiselle inhibiitiolle tai sT4:n toksisille vaikutuksil-35 le lisättiin sT4:ää viljelmiin 18 h ensimmäisen virukselle altistamisen jälkeen. Viljelmät, jotka altistettiin sT4:lle 18 h infektion jälkeen, osoittavat vain 1 log:n inhibiitiota ID- 77 102837 50:ssä, mikä oletettavasti johtuu viruksen, joita levisi ensimmäisen ymppäyksen jälkeen, inhibiitiosta. Täten, 4 log:n vähentyminen virusinfektiivisyydessä, joka havaittiin kun virusta oli esi-inkuboitu sT4:n kanssa, johtuu todennäköisesti sT4:n 5 spesifisestä liittymisestä gpl20:n kanssa viruksen pinnalla.

Nämä partikkelit eivät kykene sen vuoksi enää olemaan vuorovaikutuksessa T4-reseptorin kanssa solun pinnalla. Havaittiin 4 log:n inhibiitio, kun esi-inkuboidaan 10’ infektiivistä partik-kelia/ml 8 ug/ml sT4:n kanssa. Virusvalmisteet, joissa oli 105 10 infektiivistä partikkelia/ml, arvioitiin sisältävän 10* partik-kelia/ml. Jos jokaisessa partikkelissa on 1000 kuoriglykoprote-iinia, niin silloin saadaan inhibiitio suhteella 100 T4-mole-kyyliä/molekyyli kuoriproteiinia.

15 Saatavilla olevat suhteellisen suuret määrät rakenteellisesti koskematonta sT4:ää helpottaa tutkia mekanismia, jolla T4 on vuorovaikutuksessa sekä antigeeniä edustavien solujen samoin kuin HIV-virusten pinnan kanssa. T4+-auttajasolujen spesifinen vuorovaikutus antigeeniä edustavien solujen kanssa (B-solut ja 20 makrofaagit) saattaa johtua, ainakin osittain T4:n liittymisestä luokka II MHC-molekyylien kanssa (105, 106). Se että saadaan merkittäviä määriä puhdistettua sT4:ää, sallii suoran fysikaalisen liittymisen osoittamisen T4:n ja luokka II MHC-molekyy-lien välillä.

25 ·' sT4:n kyky sitoutua gpl20:aan ja inhiboida virus-infektiota in vitro, osoittaa, että sT4 on tehokas anti-virusaine käsiteltäessä AIDS-potilaita.

30 Esimerkki 4

Liukoisten V1V2J4 liukoisten T-4-fragmenttien tuottaminen Vektoreiden rakentaminen 35 psT4BBVIDHFR:n rakentaminen: Plasmidin psT4BBVIDHFR saamiseksi plasmidi psT4DHFR (kuvattu esimerkissä 3) pilkottiin EcoRI:lla ja Xbal:llä ja pienempi fragmentti, jossa oli sT-4 koodausalue.

102837 78 deletoitiin. Plasmidi sT4sal pilkottiin Xbalillä ja Bbvl:llä ja 1120 emäsparin koodaussekvenssi, jossa oli sekvenssi liukoiselle T-4:lle miinus leader alue, eristettiin. Tämä fragmentti li-goitiin EcoRI/Xbal-pilkottuun psT4DHFR:ään, käyttämällä syn 5 teettistä linkkeriä, jossa oli EcoRI pää, Kpnl kohta ja Bbvl pää. Tämä fragmentti on kompatibeli edellä eristetyn sT-4-frag-mentilla olevan Bbvl-ylijäävän osan kanssa. Saatua plasmidia merkittiin psT4BBVIDHFR.

10 0MPAST4:n rakentaminen: Plasmidin OMPAST4 saamiseksi plasmidi OMPA.GS pilkottiin NcoI:llä ja Sällillä ja pienempi fragmentti, jossa oli linkkerialue, deletoitiin. OMPA.GS on johdettu pASI :sta (Rosenberg et ai., Meth. Enxymol. 101:123 (1983); U.S. patentti 4578355), jossa on synteettinen sekvenssi insertoitu 15 Ndel-kohtaan dl ribosomin sitoutumisekvenssin 3'päässä. Synteettisessä sekvenssissä on OMPA leader, jota seuraa multili-neaarinen sekvenssi. Synteettinen sekvenssi oli olennaisilta osiltaan seuraava:

20 5' -T ATG AAA AAG ACA GOT ATC GCG ATT GXA GTG GCA CTG GCT GGT

TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GGC TCT AGA GTC GAC CTA GTT AAC TAG-3'

Plasmidi pUCsT4 pilkottiin NcoIiLlä ja Sall:llä ja.1149 emäspa-25 rin fragmentin sisältävä SCD-4-sekvenssi [T-4 nukleotidit 124-1257] eristettiin. Tämä fragmentti ligoitiin Ncol/Sall pilkottuun OMPA.GS:ään OMPAST4:n saamiseksi.

OMOPAST4BbvI:n rakentaminen: OMPAST4BbvI-plasmidin saamiseksi 30 pilkottiin plasmidi OMPAST4 Nael:llä ja Xbalillä. Pienempi . fragmentti, joka saatiin tästä pilkkomisesta, sisälsi sT-4 koo- dausalueen, deletoitiin. Plasmidi ST4BBVIDHFR pilkottiin Kpnl: llä ja saatu 3' ylijäävä osa tehtiin tylppäpäiseksi T4 DNA-po-lymeraasilla. Tylppäpäinen DNA pilkottiin sitten Xbalillä ja 35 1124 emäsparin fragmentti, jossa oli nukleotidit 145-1257 Ct4 cDNA:lta, eristettiin. Eristetty fragmentti ligoitiin Nael/-Xbal-pilkottuun 0MPAST4-plasmidiin plasmidin OMPASTI4BbVI:n 102837 saamiseksi .

pucGT4184:n rakentaminen: Plasmidin pucSt4184 saamiseksi ligoi-tiin EcoRI-Nhel-fragmentti T-4 cDNA:lta [682 bp fragmentti, jo-5 ka koodaa aminohappoja (-23) - (+178)] synteettiseen linkkeriin sk727/725 (Nhel ja Aval päät) Nhel-kohtaan. sk727/725 koodaa T-4 aminohappoja 179-185). sk727/725:n Aval-pää ligoitiin pUcST-4:n (jossa on ihmisen cDNA:n bp 1198-1257 ja T-4-reseptorin koodaavat aminohapot 351-369, jota seurasi TAA lopetuskodoni) 10 Aval-Xba 1-fragmenttiin. Tämä sekvenssi, jota reunustaa EcoRI-ja Xbal-päät, insertoitiin pUC19:ään EcoRI- ja Xba 1-päinin puC19-polylinkkerissä (sk727/725). sk727/725 on pääpiirteiltään seuraava: 15 5' gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac 3' gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5' pucST4106:n rakentaminen: Plasmidin pucST4106 saamiseksi liitettiin T-4 cDNA:n EcoRI-Avä ΙΙ-fargmentti ( jossa on bp 1-413 20 ja koodaavat aminohapot (-) 25-87) synteettiseen linkkeriin sk-791/792 (Ava II-Aval-päät) Avall-kohtaan. sk791-792 koodaa T-4:n aminohappoja 88-104. sk791/792:n Aval-pää ligoitiin puc-ST4:n Aval-Xbal-fragmenttiin (jossa on bp 1198-1257 ihmisen cDNA:sta ja T-4-reseptorin koodaavat aminohapot 351-369, joita 25 seuraa TAA-lopetuskodoni). Tämä sekvenssi, jota reunustaa EcoRI ja Xbal-päät, insertoitiin pUC19:ään EcoRI- ja Xbal-päihin puC19-polylinkkeriin. sk791/792 on pääpiirteiltään seuraava: 5’ gaccagaaggaggaggtgcaattgctagtgttcggattgactgccaac 30 gtcttcctcctccacgttaacgatcacaagcctaactgacggttgagc 5' sT418DHFR:n rakentaminen: Plasmidin sT4184.DHFR:n saamiseksi pucST4184:n (koodaavat aminohapot -25 - 183 fuusioituneet 355:een - 373) EcoRI-Xbal-fragmentti ligoitiin psT4DHFR:n Eco-35 Rl-ja Xbal-päihin sT-4:ää koodaavan EcoRI-Xbal-fragmentin sijasta.

102837 80 sT4106DHFR:n rakentaminen: Plasmidin ST4106.DHFR:n saamiseksi pucST4106:n (koodaavat aminohapot -23 - 106 fuusioituneet 351:een - 369:ään) EcoRI-Xbal-fragmentti ligoitiin psT4DHFR:n EcoRI-ja Xbal-päihin sT-4:ää koodaavan EcoRI-Xbal-fragmentin 5 sijasta.

pST4184DHFR:n ekspressoituminen Kiinan hamsterin munasarja (CHO) soluissa 10 DXB-ll-solut, DHFR-vajavainen CHO-solulinja (Urlaub et al., supra) transfektoitiin kalsiumfosfaattisaostuksella 10-30 pg: 11a pST-418DHFR:ää 10 ug:n läsnäollessa kantaja-DNA:ta (NIH-3T3 genominen DNA) 1 päivän kuluttua ymppäämisestä 60 mm:n as-toihin 5 x 105 solulla. Saostumat poistettiin 6 h kuluttua ja 15 korvattiin F12-alustalla, jossa ei ollut hypoksantiinia tai ty-midiiniä, ja jossa oli 10 % dialysoitua vasikan sikiön seerumi-a. Pesäkkeet ilmestyivät (noin 100 astiaa kohti) 16 päivässä. Jokaisesta astiasta kerättiin pesäkkeet, levitettiin ja ympättiin sitten 3 x 104 solua kaivoa kohti 24 kaivon viljelmämal-20 joilla. Solut kasvoivat nukleosidivapaalla alustalla, jossa oli 80 nM metotreksaattia (mtx) valikoimaan transfektoidun dhfr:n ja VlV2J4-minigeenin mahdollista amplifikaatiota. Kahden viikon kuluttua 8 nM mtx:ssä aktiivisesti kasvavat solut olivat selvästi näkyviä. Yksittäisistä kaivoista tai klooneista määritet-25 tiin samanaikaisesti deleetiomutanttien ekspressoituminen ja ne, jotka valittiin lisäamplifikaatioon, ympättiin 24 kaivon viljelmämaljoille edellä kuvatuin tiheyksin. Joukko alaparvia, jotka ekspressoivat korkeita VlV2J4-tasoja, kasvatettiin kohoavissa mtx-tasoissa, jotta valikoitaisiin lisää dhfr transkrip-30 tioyksikön ja T4184S(V1V2-J4) minigeenin amplifikaatiota.

Saatiin useita solulinjoja käyttämällä tätä menetelmää, joka ekspressoi liukoista deleetiomutantteja määrällä, jotka ovat ainakin 2 pg/solu/24 h.

Ilmastettu alusta (CM) valmistettiin seerumivapaaksi kiinnittyvistä soluviljelmistä, jotka oli levitetty 850 cm! pyöriviin 35 102837 81 pulloihin mtx-valikoivi,ssa olosuhteissa. Kun solut olivat kon-fluentteja, ne pestiin 2 kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ilman Mg:':aa ja Ca1' :aa ja kasvatusalusta (Ham's F12 ilman hypoksantiinia ja tymidiiniä, 10 % vasikan si-5 kiön seerumia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja streptomysiiniä ja mtx:ää valikoivassa konsentraatiossa) korvattiin samalla a-lustalla miinus seerumi ja mtx ja plus 1 x ITS (insuliini, transferriini ja seleeni (Collaborative Research Inc). 24-48 h kuluttua alusta poistettiin ja korvattiin valikoivalla kasvua-10 lustalla. Seerumivapaata alustaa käytettiin sitten uudestaan 3-5 päivän sisällä ja tätä kierrosta toistettiin määräämättömäs-ti, s.o. enemmän kuin 2 kuukautta. CM kirkastettiin sentrifu-goimalla 8000 x g. Lisättiin proteaasi-inhibiittoria PMSF:ää (fenyylimetyylisulfonyylifluoridi) 0,5 mM:iin ja CM konsentroi-15 tiin noin 10-kertaisesti painesuodatinsuodatuksella. Tämä konsentroitu CM kirkastettiin sentrifugoimalla 2000 x g ja lisättiin Aprotinin:a, proteaasi-inhibiittori (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) niin, että lopullinen konsentraatio oli 5 pg/ ml. Näyte käsiteltiin suoraan tai -70'C:ssa säilytyksen jäl-20 keen.

Western Blot analyysi: Ilmastettu alusta VlV2J4:ää tuottavista CHO-soluista konsentroitiin ja ajettiin 15 % pelkistävä polyak-ryyliamidigeeli. Proteiini siirrettiin nitroselluloosapaperille 25 ja koetettiin polyklonaalisen antiseerumin kanssa, joka oli * muodostunut denaturoitua E, colia, joka oli johdettu T-4-NSI- fuusiomolekyylistä, vastaan. Tämä antiseerumi tunnistaa spesifisesti VlV2J4-dupletin, joka kulkee noin 25 Kd:ssa. Tämä vastaa VlV2J4-koodaussekvenssin ennustettua kokoa leader-proses-30 soinnin jälkeen. Fysikaalista perustaa dupletille ei tunneta.

. Se ei todennäköisesti johdu eroista N-kytkeytyneessä glykosy- laatiossa, sillä 2 konsensussekvenssiä tätä glykosylaatiota varten T-4:ssä eivät ole VlV2J4:ssä.

35 Immunoepitoopit: Monoklonaaliset vasta-aineet OKT-4 ja OKT-4A, OKT4B, OKT4C, OKT4D, OKT4E ja OKT4F tunnistavat spesifisesti pintaepitoopit luonnollisessa, membraaniin sitoutuneessa T-4- 102837 82 reseptorissa (Rao, et ajL . , Cell Immunol. 80.:310 (1983)). Nämä vasta-aineet ovat spesifisiä luonnollisille konformaatioille siten, että ne eivät sitoudu pelkistettyyn, SDS-denaturoituun proteiiniin immunoblot-analyyseissä. Osoitettiin, että molemmat 5 vasta-aineet saostavat spesifisesti VlV2J4:ää ,5S-leimatusta viljelmäsupernatanteista käyttämällä seuraavaa immunosaostusme-netelmää:

VlV2J4:ää tuottavien solujen viljelmät, joissa oli 1 x 10s so-10 lua 60 mm:n viljelmäastiaa kohti, leimattiin 16 h 37'C:ssa 1,5 ml:ssa metioniini- ja systeiinivapaata F12-alustaa, jossa oli ITS ja 170 pCi/ml [”s]metioniinia ja 30 pCi/ml [”s]systeiiniä (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, California). Kirkastettu alusta (100 μΐ) laimennettiin samalla tilavuudella saostuspus-15 kuria 10 mM natriumfosfaattia pH 7,5 (100 mM NaCl, 0,1 % NP-40*, 0,5 % rasvatonta maitojauhetta) ja inkuboitiin 3 ug:n kanssa kanin IgG:tä 15 min 4'C:ssa, jota seurasi 30 μΐ (pakattu tilavuus) proteiini A sepharose helmiä (Pharmacia P-L Biochemi-cals) 30 min 4'C:ssa. Esikirkastettua supernatanttia inkuboi-20 tiin 5 pg kanssa jokaisen edellä viitatun OKT4-vasta-aineiden kanssa, hiiren IgG:n (Cooper Biomedical, Malvern, PA), tai kani α-hiiri IgG:n kanssa (Cooper Biomedical) 30 min 4’C:ssa. 0K-T4-vasta-aineet, hiiren IgG ja kani α-hiiri IgG saostettiin in-kuboimalla 20 μ1:η kanssa (pakattu tilavuus) proteiin A sepha-25 rose helmiä 30 min 4'C:ssa. Saostuksen jälkeen nämä helmet pestiin kahdesti 200 pl:lla saostuspuskuria ja kerran 200 pl:lla saostuspuskuria miinus Np-40* ja rasvaton maitojauhe. Pestyjä helmiä keitettiin 5 min 20 pl:ssa näytepuskuria (125 mM Tris-HC1 pH 6,8, 20 % glyserolia, 1,4 M β-merkaptoetanolia) ja su-30 pernatantit analysoitiin 12,5 %:ssa SDS-polyakryyliamidigeelis-sä. Poikkeuksena OKT4, jokainen monoklonaalinen vasta-aine sa-ostaa spesifisesti VlV2J4:n ’’S-leimatuista viljelmäsupernatanteista.

35 HIV-sitoutumisen kilpailu: Kun OKT4 tunnistaa VlV2J4:n, se o-soittaa, että V1V2J4 inhiboi AIDS-viruksen sitoutumisen herkkiin soluihin. CM:ää, jossa on tai puuttuu V1V2J4, käytettiin 102837 83 ensimmäisissä määrityksissä. HIV:ä inkuboitiin CM:n kanssa ja viruksen sitoutuminen T-4+ CEM-solulinjaan määritettiin inku-boimalla FITC-konjugoidun, anti-HIV-vasta-aineen kanssa ja FACS- (fluoreskeiiniaktivoitu solunlajittelija) analyysillä, ku-5 ten McDougal, et ai, supra. kuvaavat (1985). CM VlV2J4:ää tuottavasta solulinjasta inhiboi HIV:n sitoutumista laimennuksesta riippuvalla tavalla, kun taas minkäänlaista vastetta ei nähty CM:llä, jotka olivat samanveroisista, ei-tuottaja (DBX-11) soluista.

10

Proteiinia V1J4 ekspressoidaan samalla lailla CHO-soluissa. Kuitenkin näissä alustavissa kokeissa proteiinia ei nähtävästi kuljetettu alustaan. Perustuen muihin tutkimuksiin, jotka o-soittavat että V1J4, joka on tuotettu muissa rekombinanttiorga-15 nismeissa, sitoo OKT4A:ta, näyttää siltä että V1J4, jota ekspressoidaan nisäkässoluviljelmässä, inhiboisi HIV-sitoutumista.

Esimerkki 5 20 Anti-liukoisen T4-fragmentin vasta-aineiden valmistaminen

Kahdeksan viikkoa vanhat Balb/c-hiiret injektoidaan vatsaontelon sisäisesti 50 ug:lla puhdistettua liukoista tämän keksinnön T4-fragmenttia (valmistettu kuten edellä kuvattiin) 25 täydellisessä Freundin adjuvantissa, 1:1 tilavuudeltaan. Hiirille annetaan sitten lisäannos, kuukauden välein, jolloin liukoinen T4-fragmentti on sekoitettu epätäydellisen Freundin ad-juvantin kanssa ja veri otetaan häntäsuonesta. Seerumin immuno-globuliinileikkaukset saadaan ammoniumsulfaattisaostuksella ja 30 spesifinen anti-liukoinen T4-fragmentin vasta-aineet puhdistetaan affiniteettikromatografiällä käyttämällä immobilisoitua T4-fragmenttia.

84 102837

Esimerkki 6

Liukoisen T4-fragmentin anti-idiotyyppisten vasta-aineiden val-5 niistäminen

Syngeeniset ja kongeeniset hiiret injektoidaan vatsaontelon sisäisesti 50 ug:lla puhdistettua tämän keksinnön anti-liukoinen T4-fragmentin vasta-ainetta (valmistettu kuten edellä kuvat-10 tiin) täydellisessä Freundin adjuvantissa ja annettiin lisäan-nos anti-liukoinen T4-fragmentin vasta-ainetta epätäydellisessä Freundin adjuvantissa kuukausittain. Päivinä 4r 3 ja 2 ennen fuusiota hiirille annettiin lisäannos suonensisäisesti 50 ug immunoglobuliinia suolalioksessa. Pernasolut fuusioituvat sit-15 ten P3X63 AG8.653, ei-erittävien myeloomasolujen kanssa menetelmien mukaisesti, jotka on kuvattu ja ovat tunnettuja alalla, johon tämä keksintö kuuluu. Kaksi viikkoa myöhemmin hybridoma-supernatanteista seulotaan sitoutumisaktiivisuus anti-liukoinen T4-fragmentin vasta-aineita vastaan radioimmunomäärityksellä.

: 20 Positiivisista klooneista määritetään sitten kyky sitoa ihmisen immunikatoviruksen kuoren glykoproteiinia ja AIDS-virusta. Vaihtoehtoisesti, käyttämällä "yksi-vaihe" menetelmää hiiret injektoidaan vatsaontelon sisäisesti liukoisella T4-fragmentil-la, joka on täydellisessä Freundin adjuvantissa, annetaan lisä-25 annos liukoisella T4-fragmentilla suolaliuoksessa ja hiirien * pernasolut fuusioituvat myeloomien kanssa kuten edellä. Hybri- domasupernatanteista määritetään sitten suoraan liukoinen-T4-fragmentin anti-idiotyyppiset vasta-aineet.

85 1 0 2 8 3 7

Kirjallisuusviitteet 1. E.L. Reinherz et ai., "Discrete Stages of Human Intrathymic Differentiation: Analysis of Normal Thymocyte and Leucemic Lym- 5 phoblasts of T Cell Lineage", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:-1588-1592 (1980).

2. E.L. Reinherz ja S.F. Schlossman, "The Differentiation and Function of Human T Lymphocytes", Cell 19:821-827 (1980).

10 3. M.L. Blue et al., "Coexpression of T4 and T8 on Peripheral Blood T cells Demonstrated by Two-color Fluorescence Flow Cytometry", J. Immunol. 134=2281-2286 (1985).

15 4. E.G. Engleman et al., "Activation of Human T Lymphocyte sub sets: Helper and Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize and Respond to Distinct Histocompatibility Antigens", J. Immunol. 127:2124-2129 (1981).

20 5. A.M. Krensky et al., "Long-term Human Cytolytic T-cell Lines

Allospesific for HLA-DR6 Antigen Are OKT4+", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2365-2369 (1982).

6. S.C. Meuer, S.F. Schlossman ja E. Reinherz, "Clonal Analysis 25 of Human Cytotoxic T Lymphocytes T4+ and T8+ Effector T Cells

Recognize Products of Different Major Histocompatibility Complex Regions", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4395-4399 (1982).

7. W.E. Biddison et al., "Possible Involvement of the OKT4 Mo-30 lecule in T Cell Recognition of Class II HLA Antigens", J. Exp.

• Med. 156:1065-1076 (1982).

8. D.R.Wilde et al., "Evidence Implicating L3T4 in Class II MHC Reactivity Monoclonal Antibody GK 15 (Anti-L3T4) Blocks Class 35 II MHC Antigen-Spesific Proliferation, Release of Lymphokines and Binding by Cloned Murine Helper T Lymphocyte Lines", J. Immunol. 131:2178-2183 (1983).

S6 102837 9. S.L. Swain, "T Cell Subsets and the Recognition of MHC Class", Immunol. Rev. 74.:129-142 (1983).

5 10. Y. Thomas et al., "Functional Analysis of Human T Cell Sub sets Defined by Monoclonal Antobodies. IV. Induction of Suppressor Cells Within the OKT4+ Population", J. Exp. Med. 154: 459-467 (1981).

10 11. E.G. Engleman et al., "Antibodies to Membrane Structures that Distinguish Suppressor/Cytotoxic and Helper T Lymphocyte Subpopulations Block the Mixed Leukocyte reaction in Man", J. Exp. Med. 154: 193-198 (1981).

15 12. P.Marrack et al., "The Major Histocompatibility Complex- restricted Antigen Receptor on T Cells. II. Role of the L3T4 Product", J. Exp. Med. 158.: 1077-1091 (1983).

13. L. Rogozinski et al., "The T4 Surface Antigen is Involved 20 in the Induction of Helper Function", J. Immunol. 132:735-739 (1984) .

14. S.L.Swain, "Significance of Lyt Phenotypes: Lyt2 Antobodies Block Activities of T Cells that Recognize Class I Major Histo- 25 compatibility Complex Antigens Regardless of their Function", ' Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78^:7101-7105 (1981).

15. U. Landegren et al., "Selective Inhibition of Human T Cell Cytotoxicity at Levels of Target Recognition of Lysis by Mono- 30 clonal 0KT3 Leu-2a Antibodies", J. Exp. Med. 155: 1579-1584 (1982).

* 16. R.M. Zinkernagel ja P.C. Doherty, "MHC-restricted Cytotoxic T Cells: Studies on the Biological Role of Polymorphic Major 35 Transplantation Antigens Determining T Cell Restriction, Spesi-ficity, Function and Responsiveness", Adv. Immunol. 27:52-177 (1979) .

102837 17. J. Kappler et al., "The Major Histocompatibility Complex-Restricted Antigen Receptor on T Cells in Mouse and Man: Identification of Constant and Variable Peptides", Cell 35:295-302 5 (1983).

18. 0. Acuto et al., "The Human T Cell Receptor: Appearance in Ontogeny and Biochemical relationship of Alpha and Beta Subunits on IL-2 Dependent Clones and T Cell Tumors", Cell 34: 10 717-726 (1983).

19. P. Kavathas et al., "Isolation of the Gene Coding for, Human T Lymphocyte Antigen Leu-2 (T8) by Gene Transfer and cDNA Subtraction ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7688-7692 (1984).

15 20. D.R. Littman et al., "The isolation and Sequence of the Gene Encoding T8: Molecule Defining Functional Classes of T Lymphocytes ", Cell 4^:237-246 (1985).

20 21. V.P. Sukhatma et al., "The T Cell Differentiation Antigen

Leu-2/T8 is Homologous to Immunoglobulin and T Cell Receptor Variable Regions", Cell 40.:591-597 (1985).

22. S.M. Friedman et al., "OT-CLL: A Human T Cell Chronic Lym-25 phocytic Leukemia That Produces IL-2 in High Titer" J. Immunol.

- -'r 128.:935-940 (1982) .

23. D.A. Thurley-Lawson, L. Chess ja J.L. Strominger, "Suppression of In Vitro Epstein-Barr Infection: A New Role for 30 Adult Human T Cells", J. Exp. Med. 146.:495-508 (1977).

9 24. J.W. Goding, "The Chronic Chloride Method of Coupling Antigens to erythrocytes: Definition of Some Important Parametrs", J. Immunol. Methods 3^0:61-66 (1976).

35 25. F.L. Graham ja A.J. van der Eb, "A New Technique for Assay of Infectivity of Human Adenovirus DNA", Virology 52:456-467 88 (1973). 102837 26. M. Wigler et ai., "Biochemical Transfer Of Single-Copy Eu-caryotic Genes Using Total Cellular DNA as Donor", Cell 14:725- 5 731 (1978).

27. M. Wigler et al., "Transfer of purified Herpes Virus Thymidine Kinase gene to Cultured Mouse Cells", Cellll:223-232 (1977).

10 28. J.M. Chirgwin et al., "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochemistry 18:5294-5299 (1979).

15 29. H. Aviv ja P. Leder, "Purification of Biologically Active

Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic Acid-Cellulose", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412 (1972).

30. T. Huynh, R.A. Young ja R.W. Davis, "Construction and 20 Screening cDNA Libraries in gtlO and gtll", DNA Cloning Techniques - A Practical Approach, D.M. Glover, toim. (Oxford: IRL Press), painossa.

31. T. Maniatis et al., "The Isolation of structural Genes from 25 Libraries of Eucaryotic DNA", Cell 15:687-701 (1978).

32. M.M. Davis et al. "Cell-Type-Specific cDNA Probes and the Murine I Region: the Localization and Orientation of A1 Alpha", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2194-2198 (1984).

30 33. T. Maniatis, E.F. Fritch ja J. Sambrook, Molecular Cloning * (Cold Spring Harbor, NY; Cold Spring Harbor Laboratory) (1982).

34. P.W.J. Rigby et al., "Labeling deoxyribonucleic Acid to 35 High Specific Activity In Vitro by Nick Translation with DNA

Polymerase I", J. Mol. Biol. 111:237-251 (1977).

102837 89 35. J. Vieira ja J. Messing, "The pUC Plasmids, an M13mp7-De-rived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Promers", Gene 1,9:259-268 (1982).

5 36. F. Sanger, S. Nicklen ja A. Coulson, "DNA Sequencing with

Chain-terminating Inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74.: 5463-5467 (1977).

37. E. Southern, "Detection of Specific Sequences Among DNA

10 Fragments Separated by Gel Electrophoresis", J. Mol. Biol. 98: 503-517 (19575).

38. G.M. Church ja W. Gilbert, "Genomic Sequencing", Proc.

Natl. Acad. Sci. USA .81:1991-1995 (1984).

15 39. R.H. Scheller et al., "A Family of Genes that Codes for ELH, a Neuropeptide Eliciting a Stereotyped Pattern of Behavior in Aplysia", Cell 28:707-719 (1982).

20 40. K. Zinn, D. DiMaio ja T. Maniatis, "Identification of Two

Distinct regulatory regions Adjacent to the Human Beta-Interferon Gene" Cell 43:865-879 (1983).

41. C. Terhorst et al., "Further Structural Studies of the Hea-25 vy Chain of HLA Antigens and Its Similarity to Immunoglobulins", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:4002-4006 (1977).

42. J.A. Hedo, L.C. Harrison ja J. Roth, "Binding of Insulin Receptors to Lectins: Evidence for Common Carbohydrate Determi- 30 nations on Several Membrane Receptors", Biochemistry 20:3385-3393 (1981).

w i 43. U.K. Laemmli, "Cleavage of structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4", Nature 227:680-685 35 (1970).

44. R. Mann, R.C. Mulligan ja D. Baltimore, Construction of a 102837 90 retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus, Cell 33:153-159 (1983).

45. F. Barre-Sinoussi et al., Isolation of a T lymphotropic 5 retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS), Science 220:868-871 (1983).

46. J.S. McDougal, et al., Cellular tropism of the human retrovirus HYLV-III/LAV.I. Role of T cell activation and expression 10 . of the T4 antigen, J. Immol. 135:3151-3162 (1985).

47. J.S.McDougal, et al., Immunoassay for the detection and quantitation of infectious human retrovirus, lymphadenopathy-assoicated virus (LAV), J. Immunol. Meth. 76^: 171-183 (1985).

15 48. J.S.McDougal, et al., Binding of HTLV-III/LAV to T4+ T cells by a complex of the 110K viral protein and the T4 molecule, Science 231:382-385 (1986).

20 49. C.B. Reimer, et al., Standardization of ligand binding as says for alpha-fetoprotein. Teoksessa Immunofluorescence and Related Staining Techniques. W Knapp, K. Holubar ja G. Wick, toim. (Amsterdam:Elsevier/North Holland Press) s. 189 (1978).

25 50. M.B. Wilson ja P.K. Nakane, Recent Developments in the per- r iodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies. Teoksessa Immunofluorescence and Related Staining Techniques. W Knapp, K. Holubar ja G. Wick, toim. (Amsterdam: Elsevier/North Holland Press) s. 215 (1978).

30 ·. 51. J. Porath, R. Axen ja S. Ermback, Chemical coupling of pro teins to agar, Nature 215:1491-1493 (1967).

52. B.J. Poiesz, et al., Detection and isolation of type C ret-35 rovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of patient with cutaneous T cell lymphoma, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7415-7419 (1980).

102837 53. P. Clapham, K. Nagy ja R.A. Weiss, Pseudotypes of human T-cell virus types 1 and 2: Neutralization by patients' sera, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2886-28899 (1984).

5 54. A.G. Dalgleish, et al., The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus, Nature 312, 763-766 (1984).

10 55. M. Popvic, et al., Detection, isolation and continuous pro duction of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and Pre.AIDS, Science 224, 497-500 (1984).

56. K. Nagy, et al., Human T-cell leukemia virus type 1: induc-15 tion of sycytia and inhibition by patients' sera, Int. J. Cancer 32, 321-328 (1983).

57. D.M. Deville ja H. Glossman, Molecular weight determination of membrane protein and glycoprotein subunits by discon- 20 tinuous gel electrophoresis in dodecyl sulfate, Methods En-zymol. 32, 92-102 (1974).

58. A. Helenius, et al. On the entry of Semliki Forest virus into BHK-21 cells, J. Cell. Biol. 84/ 404-420 (1980).

25 * 59. R.D. Cone ja R.C. Mulligan, High-efficiency gene transfer into mammalian cells: Generation of helper-free recombinant retroviruses with broad mammalian host range, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6349-6353 (1984).

30 -. 60. F.W. Alt, et al., "Probes for Spesific mRNAs by Subtractive

Hybridization: Anomalous Expression of Immunoglobulin Genes", teoksessa Eucaryotic gene Regulation, R. Axel, T. Maniatis ja C.F. Fox, toim. (New York: Academic Press), ss. 407-419 (1979). 35 61. M. Kozak, "Comparison of Initiation of Protein Synthesis in Procaryotes, Eucaryotes and Organelles", Microbiol. Rev. 47:1- 45 (1983).

102837 62. L. Hood, M. Kronenberg ja T. Hunkapiller, "T Cell Antigen receptors and the Immunoglobulin Supergene Family", Cell 40: 5 225-229 (19585).

63. S. Tonegawa, "Somatic Generation of Antibody Diversity", Nature 302:575-581 (1983).

10 64. J. Kyte ja R.F. Doolittle, "A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein", J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982).

65. G. von Heijne, "Patterns of Amino Acids Near Signal-Se-15 quence Cleavage Sites", Eur. J. Biochem. 133:17-21 (1983).

66. E.A. Rabat, et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (Washington, D.C.; U.S. Department of health and Human Services), s. 281 (1983).

20 67. A.F. William et al., "Cell Surface Glycoproteins and the Origins of immunity", teoksessa Proceedings of Sigrid Juselius Symposium, L.C. Andersson, C.G. Gahmberg ha P. Ekblom, toim. (New York: Academic Press), painossa (1984).

25 : 68. L.M. Amzell ja R.J. Poljak, "Three-Dimensional Structure of

Immunoglobulins", Ann. Rev. Biochem. 48.:961-997 (1979).

69. P.Y. Chou ja G.D. Fasman, "Empirical Predictions of Protein 30 Conformation", Ann. Rev. Biochem. 47.<.251-276 (1978).

4 70. P.J. Maddon, et al., The isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the T cell surface protein T4: A new member of the immunoglobulin gene family, Cell 42, 93-104 (1985).

35 71. R.A. Adams, A. Flowers ja B.J. Davis, Direct implantation and serial transplatation of human acute lymphoblastic leukemia in hamsters, SB-2, Can. Res. 28., 1121-1125 (1968).

102837 93 72. G.O. Gey, W.D. Coffman ja M.T. Kubicek, Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and 5 normal epithelium. Cancer Res. 12, 264-265 (1952).

73. R.J.V. Pulvertaft, cytology of Burkitt's tumor (African lymphoma), Lancet I, 238-240 (1964).

10 74. N.J. Dimmock, Initial stages of infection with animal viru ses, J. Gen. Virol. 59, 1-22 (1982).

75. J. White, M. Kielian ja A. Helenius, Membrane fusion proteins of enveloped animal viruses, Quart. Rev. Biophys. 16, 15 151-195 (1983).

76. M. Marsh, The entry of enveloped viruses into cells by en-dosytosis, Biochem. J. 218,1-10 (1984).

'· 20 77. M. Kielian ja A. Helenius, Entry of alpha-viruses. Teokses sa Togaviridae and Flaviviridae, S. Schlesinger ja M.J. Schle-singer, toim., (Plenum Publishing Corp.), ss. 91-119 (1986).

78. S. Ohkuma ja B. Poole, Fluorescence probe measurements of 25 the intralysosomal pH in living cells and the pertubation of pH

: by various agents, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7jj, 3327-3331 (1978).

79. F.R. Maxfield, Weak bases and ionophore rapidly and rever-30 sibly raise the pH of endocytic vesicles in cultured mouse fib- , roblasts, J. Cell. Biol. 95, 676-681 (1982).

80. A. Helenius, M. Marsh ja J.White, Inhibition of Semliki Forest virus penetration by lysosomotropic weak bases, J. Gen.

35 Virol. 58,47-61 (1982).

81. R.T. Johnson ja J.C. McArthur, AIDS and the brain, TINS 3, 91-94 (1986).

102837 82. P.M. Snow, M. Van de Rijn ja C. Terhorst, "Association Between the Human Thymic Differentiation Antigens T6 and T8", 5 Eur. J. Immunol., painossa (1985).

83. P.M. Snow ja C. Terhorst, "The T8 Antigen is a Multimeric Complex of Two Distinct Subunits on Human Thymocytes but Consists of Homomultimeric Forms on Peripheral Blood T Lym- 10 phocytes", J. Biol. Chem. 258:14675-14681 (1983).

84. C. Terhorst et al., "Biochemical Analysis of Human T Lymphocyte Differentiation Antigens T4 and T5", Science 209:520-521 (1980).

15 85. W.H. Hildemann, "Immunocompetence and Allogeneic Polymorphism Among Invertebrates", Transplantation 27:1-3 (1979).

86. V.L. Scofield et al., "protochordate Allorecognition is ·. 20 Controlled by MHC-like Gene System", Nature 295:499-502 (1982).

87. T.L. Lentz, et al., Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor?, Science 215:182-184 (1982).

25 88. J.D. Fingeroth, et al., Epstein-Barr virus receptor of hu- : man B lymphocytes is the C3d receptor CR2, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 81, 4510-4514 (1984).

89. P.E. Tambourin, et al., The physiopathology of Friend leu-30 kemia, leukemia res. 3,117-129 (1979) ' % 90. A. Oliff, et al., Isolation of transplantable eryth-roleukemia cells from mice infected with helper-independent Friend murine leukemia virus, Blood .58,244-254 (1981).

35 91. J.E. Silver ja J.M. Fredrickson, Susceptibility to Friend helper virus leukemias in CXB recombinant inbred mice, J. Exp.

102837

Med. 158., 1693-17 02 (198,3).

92. P.A. Chatis, et al., Role for the 3' end of the genome in determining disease specificity of Friend and Moloney murine 5 leukemia viruses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4408-4411 (1983).

93. P.A. Chatis, et al., A 3' end fragment encompassing the transcriptional enhancers of nondefective Friend virus confers 10 erthyroleukemogehicity on moloney leukemia virus, J. Virol. 52, 248-254 (1984).

94. A. Bosze, H.J. Thiesen ja P. Charnay, A transcriptional enhancer with specificity for erythroid cells is located in the 15 long terminal repeat of the Friend murine leukemia virus, EMBO J. 5, 1615-1623 (1986).

95. A.N. Barclay, et al., Immunoglobulin-related structures associated with vertebrate cell surfaces, painossa.

20 96. M.O. Dayhoff, W.C. Barker ja L.T. Hunt, Establishing homologies in protein sequences. Teoksessa Methods in Enzymology. Enzyme Structure Part I, C.H.W. Hirs ja S.N. Timasheff, toim. (New York: Academic Press), ss. 524-545 (1983).

25 ! 97. Y. Yanagi, et al., A human T-cell-spedific cDNA clone en codes a protein having extensive homology to immunoglobulin chains, Nature 308,145-149 (1984).

30 98. G.K. Sim, et al., Primary structure of human T-cell recep tor -chain, Nature 312, 771-775 (1984).

« -- s 99. H. Saito, et al., A third rearranged and expressed gene in a clone of cytotoxic T lymphocytes, Nature 312, 36-40 (1984).

35 100. H. Saito, et al., Complete primary structure of the E chain and gene of the mouse major histocompatibility complex,

Proc. Natl. Acad. Sci. .USA 80, 5520-5524 (1983).

102837 101. M. Isobe, et al., The gene encoding the T-cell surface protein T4 is located on human chromosome 12, Proc. Natl. Acad.

5 Sci. USA 83, 4399-4402 (1986).

102. J.M. Roberts ja R. Axel, Gene Amplification and Gene Correction in Somatic Cells, Cell 22,109-119 (1982).

10 103. D.S. Pfarr, G. Sathe ja M.E. Reff, A Highly Modular Cloning Vector for the Analysis of Eucaryotic Genes and Gene Regulatory Elements, DNA, 4,461-467 (1985).

15 104. G. Urlaub ja L.A. Cnasin, Isolation of Cninese Hamster

Cell Mutants Deficient In Dihydrofolate Reductase Activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980).

105. Gay, D. et al., Nature 328:626-629 (1987).

20 106. Sleckman, B.D. et al. , Nature 328.^351-351 (1987).

107. Yanisch-Perron, et al., Gene 33:103 (1985).

25 108. berg, P., et al. Mol. Cell. Biol. 3:246 (1983).

109. Subramani, et al.. Mol. Cell Biol. 1:854 (1981) 110. Frayne, et al., Mol. Cell Biol. 4.:2921 (1984).

30 111. Schumperli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 257 (1980).

112. Gross, et al.. Mol. Cell Biol. 5:1015 (1985).

35 113. Pfarr, et al., DIMA 5:115 (1986).

102837 97 114. Rao, et al., Cell Immunol. 80:310 (1983).

115. McClure, et al., Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation 9:345 (1982).

5 116. Urlaub, et al., Cell 33:405 (1983).

117. Kim, et al.. Cell 42:129 (1987).

10 118. Wigler, et al., PNAS USA 76:1373 (1979).

119. Copeland, et al., Cell .17.:993 (1979).

120. Sattenau, et al., Science 234:1120 (1986).

15 121. Greenstein, et al., Ann. Inst. Pasteur 138:134 (1987).

122. Gay, et al., Ann. Inst. Pasteur 138:127 (1987).

Claims (12)

102837 98

1. Isolerad nukleinsyramolekyl, kännetecknad av att den ko-15 dar en löslig polypeptid, vars aminosyrasekvens innefattar den i figur 6 illustrerade aminosyrasekvensen frdn aminosyra cirka 3 tili aminosyra cirka 185 fusionerad tili aminosyrasekvensen frän aminosyra cirka 351 tili aminosyra cirka 369.

1. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa liukoista polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi käsittää kuviossa 6 esitetyn aminohapposekvenssin aminoha- 5 posta noin 3 aminohappoon noin 185 fuusioituna aminohappo-sekvenssiin aminohaposta noin 351 aminohappoon noin 369.

2. Isolerad nukleinsyramolekyl, kännetecknad av att den ko- dar en löslig polypeptid vars aminosyrasekvens innefattar den i figur 6 illustrerade aminosyrasekvensen frän aminosyra cirka 3 tili aminosyra cirka 106 fusionerad tili aminosyra-: sekvensen frän aminosyra cirka 351 tili aminosyra cirka 369. 25

2. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa liukoista polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi 10 käsittää kuviossa 6 esitetyn aminohapposekvenssin aminohaposta noin 3 aminohappoon noin 106 fuusioituna aminohappo-sekvenssiin aminohaposta noin 351 aminohappoon noin 369.

3. Isolerad nukleinsyramolekyl, kännetecknad av att den ko-dar en löslig polypeptid, vars aminosyrasekvens innefattar den i figur 6 illustrerade aminosyrasekvensen frän aminosyra . cirka 3 tili aminosyra cirka 185. 30

3. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että 15 se koodaa liukoista polypeptidiä, jonka aminohapposekvenssi käsittää kuviossa 6 esitetyn aminohapposekvenssin aminohaposta noin 3 aminohappoon noin 185.

4. Expressionsvektor, kännetecknad av att den uttrycker en del av den i figur 6 illustrerade CD4-genen och kodar en po-lypeptid enligt nägot av patentkraven 1, 2 eller 3. 35 5. Värdcell, kännetecknad av att den innefattar en expres sionsvektor enligt patentkrav 4. 102837 100

4. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se ilmentää ku-20 viossa 6 esitetyn CD4-geenin osaa ja koodaa jossakin patenttivaatimuksessa 1, 2 tai 3 mainittua polypeptidiä.

5. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää patentti- : vaatimuksen 4 mukaisen ekspressiovektorin. 25

6. Värdcell enligt patentkrav 5, kännetecknad av att den är en bakteriecell.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on bakteerisolu.

7. Värdcell enligt patentkrav 6, kännetecknad av att den är 5 Escherichia coll.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, tunnettu sii-30 tä, että se on Escherichia coli.

8. Värdcell enligt patentkrav 5, kännetecknad av att den är en eukaryotcell. 10 9. Värdcell enligt patentkrav 8, kännetecknad av att den är en däggdjurscell.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on eukaryoottisolu.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu sii tä, että se on nisäkässolu. 102837 99

10. Värdcell enligt patentkrav 8, kännetecknad av att den är en jästcell. 15

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on hiivasolu.

11. Värdcell enligt patentkrav 5, kännetecknad av att den är en insektcell.

11. Patenttivaatimuksen 5 mukainen isäntäsolu, tunnettu sii-5 tä, että se on hyönteissolu.

12. Menetelmä missä tahansa patenttivaatimuksessa 1, 2 tai 3 mainitun polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 4 mukaista isäntävektorisysteemiä kasva- 10 tetaan sopivissa olosuhteissa polypeptidin tuottamiseksi ja otetaan talteen näin saatu polypeptidi.

12. Förfarande för framställning av en polypeptid enligt 20 nägot av patentkraven 1, 2 eller 3, kännetecknat av att att ett värdvektorsystem enligt patentkrav 4 odlas under lampii-ga betingelser som möjliggör produktion av polypepeptiden, och den sälunda erhällna polypeptiden utvinns.