FI105687B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rhinoviruksen reseptoriproteiinin multimeerin valmistamiseksi - Google Patents

Description

105687

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen rhinoviruksen reseptoriproteiinin multimeerin valmistamiseksi # Tässä kuvataan solujen välistä adheesiota välittä-’ 5 vän molekyylin (ICAM) multimeerisia konfiguraatioita ja muotoja, mukaan lukien näiden proteiinien sekä täyspitkät että lyhentyneet muodot, jotka sitoutuvat tehokkaasti ihmisen rhinovirukseen ja voivat vähentää tehokkaasti HRV-viruksen tartunnanaiheuttamiskykyä. Tarkemmin keksintö 10 koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen multimeerin valmistamiseksi, joka sisältää kaksi tai useampia monomeereja, jotka valitaan toisistaan riippumatta ryhmästä, joka koostuu solujen välistä adheesiota välittävästä molekyyli-1:stä, ICAM-l:stä ja sen fragmenteista.

15 Täyspitkää ICAM:ia, joka tunnetaan myös nimellä ihmisen rhinovirusreseptori (HRR), nimitetään transmemb-raaniseksi ICAM:iksi (tmICAM-1); ei-transmembraaniset ICAM-muodot, myös tunnetut nimellä lyhennetty ICAM (tICAM), ovat täyspitkää lyhyempiä. Kun nämä proteiinit 20 ovat multimeerisessa konfiguraatiossa, edullisesti dimee-reinä, ne osoittavat tehostunutta sitoutumista ihmisen rhinovirukseen (HRV) ja kykenevät vähentämään HRV:n tartunnanaiheuttamiskykyä. Lisäksi näitä multimerisoituja proteiineja voidaan käyttää myös vähentämään muiden sel-•t 25 laisten virusten tartunnanaiheuttamiskykyä, joiden tiede tään sitoutuvan ihmisen rhinovirusreseptorin (HRR) "pääryhmään", kuten coxsackie A -viruksen, ja niitä voidaan myös käyttää tukkimaan transmembraanisen, solujen välistä adheesiota välittävän molekyylin (tmICAM) vuorovaikutus 30 imusolun toimintaan liittyvän antigeeni-1:n (LFA-1:n) kanssa, joka on ratkaisevan tärkeä monille immunologiseen vasteeseen liittyville soluadheesioprosesseille. Lopuksi näitä multimeerisia proteiineja voidaan käyttää tutkittaessa ICAM-l/HRV -vuorovaikutusta, erityisesti suunnitel- .2 105687 taessa muita lääkkeitä, jotka on suunnattu vaikuttamaan tähän vuorovaikutukseen.

Ihmisen rhinovirukset ovat tärkein nuhakuumetta aiheuttava tekijä. Ne kuuluvat pikornavirusten ryhmään ja ne 5 voidaan luokitella sen isäntäsolun reseptorin mukaan, johon ne sitoutuvat. Tomassini, et ai., iL_ Virol.. 58:290 (1986) raportoivat eristäneensä reseptoriproteiinin, joka on mukana ihmisen rhinoviruksen tarttuessa soluun. Arviolta 90 % rhinovirusten useammasta kuin ll5:sta serotyypis-10 tä, samoin kuin useat coxsackie A -viruksen tyypit, sitoutuvat yhteen yhteiseen reseptoriin, joka on nimetty ihmisen "päärhinovirusreseptoriksi" (HRR); loput 10 % sitoutuvat yhteen tai useampaan muuhun solun reseptoriin.

Hiljattain, Greve, J. ai. , Cell, 56:839 (1989), 15 yhteisjulkaisussa tämän keksinnön muiden keksijöiden kanssa, tunnisti pää-HRR:n glykoproteiiniksi, jonka molekyyli-paino näyttää olevan 95 000 daltonia ja jonka aminohappo-sekvenssi on olennaisesti identtinen aikaisemmin kuvatun solun pinnan proteiinin, nimeltään solujen välistä adhee-20 siota välittävä molekyyli (ICAM-1), nukleotidisekvenssistä päätellyn aminohapposekvenssin kanssa. Simmons, D. et ai. . Nature. 331:624 (1988) . Staunton, et. ai, Cell. 52:925 - 933 (1988). Myöhemmin Staunton, D.E., et ai., Cell. 58:849 (1989) vahvisti, että ICAM-1 on HRV:n pääreseptori solun # 25 pinnalla. Katso myös Staunton, et ai., Cell. 61: 243 - 254 (1990) .

ICAM-1 on 505 aminohapon pituinen integraalinen solukalvon proteiini ja sillä on: i) viisi immunoglobulii-nin kaltaista solunulkoista osaa aminoterminaalisessa 30 päässä (aminohappotähteet 1 - 453), ii) hydrofobinen solukalvon läpäisevä osa (454 - 477) ja iii) lyhyt soluli-massa sijaitseva osa karboksiterminaalisessa päässä (478 -505) . ICAM-1 on immunoglobuliinien supergeeniperheen jäsen ja se toimii ligandina imusolujen molekyylille, imusolun 35 toimintaan liittyvälle molekyylille 1 (LFA-l:lle), joka on * 3 105687 integriiniperheen jäsen. LFA-l:n heterotyyppinen sitoutuminen ICAM-l:een välittää eri solutyyppien soluadheesiota ja se on tärkeä laajalla immunologisten vuorovaikutusten alueella; sytokiinien aiheuttama ICAM-1:n ilmenemisen in-5 dusoituminen tulehdusvasteen aikana voi säädellä imusolujen paikantumista tulehduskohtiin. ICAM-l:n primaarisen rakenteen on havaittu olevan homologinen kahden soluadhee-siomolekyylin kanssa, se on: hermosolun adheesiomolekyylin (NCAM) ja myeliiniin liittyvän glykoproteiinin (MAG).

10 On noudatettu useita eri lähestymistapoja virusten tartunnanaiheuttamiskyvyn vähentämiseksi yleensä ja rhino-virusten erityisesti, mukaanlukien i) sellaisen vasta-aineen kehittäminen solun pinnan reseptorille, jota käyttämällä tukitaan viruksen sitoutuminen soluun, ii) inter-15 feronin käyttäminen antiviraalisen tilan edistämiseksi isäntäsoluissa; iii) erilaisten aineiden kehittäminen, joilla estetään viruksen replikaatio; iv) vasta-aineiden kehittäminen viruksen kuoriproteiineille/peptideille; ja v) virusinfektion estäminen eristetyllä solun pinnan re-20 septoriproteiinilla, joka tukkii spesifisesti viruksen solun pinnan reseptoriin sitoutuvan osan.

Tätä jälkimmäistä lähestymistapaa käyttäen Greve et ai., Cell. 56:879 (1989), yllä, raportoivat, että puhdistettu tmICAM-1 kykeni sitoutumaan rhinovirus . 25 HRV3:een in vitro. Julkaisemattomat tulokset HRV2:lla, HRV3:lla ja HRV14:llä osoittavat positiivista korrelaatiota rhinovirukseen sitoutumiskyvyn ja rhinoviruksen neutra-loimiskyvyn välillä, erityisesti jos sitoutumistutkimukset suoritetaan olosuhteissa, joissa ICAM-1 tarjotaan erityi-30 sessä muodossa ja konfiguraatiossa, kuten alempana edelleen käsitellään. Tulokset (julkaisemattomia), joissa käy- · tettiin HRV14:ää ja HRV2:ta, osoittavat positiivista kor- relaatiota viruksen reseptoriluokan ja tmICAM-l:een sitou tumiskyvyn välillä in vitro. Toisin sanoen ICAM-1, joka on 35 pääreseptori, voi sitoutua HRV3:een, HRV4:ään ja muihin • 105687 4 "pääreseptoriserotyyppeihin" ja neutraloida ne, samalla kun se ei sido tai neutraloi HRV2:ta, "vähäisempää" resep-toriserotyyppiä. Lisätutkimukset (julkaisemattomia), joissa käytettiin puhdistettua tmICAM-1:tä, osoittavat, että 5 se estää tehokkaasti rhinoviruksen tartunnanaiheuttamisky-kyä plakkien määrän vähenemistestissä, kun rhinovirus esi-käsitellään tmICAM-l:llä (50 %:n vähennys tiitterissä re-septoripitoisuuden ollessa 10 nM ja yhden logaritmiyksikön vähennys tiitterissä reseptoripitoisuuden ollessa 100 nM) . 10 Nämä tulokset olivat yhtäpitäviä rhinoviruksen affiniteetin kanssa Hela-solujen ICAM-1:lie, jonka dissosiaatio-vakio näytti olevan 10 nM, ja osoittivat suoraa suhdetta reseptorin virukseen sitoutumiskyvyn ja sen viruksen neut-raloimiskyvyn välillä.

15 Koska tmICAM-l:n tuotanto suuressa mittakaavassa ei ole tällä hetkellä taloudellisesti mahdollista, ja koska tmICAM-l:n pitäminen aktiivisessa muodossa vaatii deter-genttien käyttöä, sellaiset vaihtoehtoiset keinot ovat toivottavia, joilla voidaan tuottaa reseptoriproteiinia 20 rhinoviruksen estäjäksi. On kehitetty tmICAM-l:n cDNA-gee-nimuotoja (samoin kuin ekspressiotuotteita tuottavia solu-linjoja; patenttihakemusjulkaisu EP 0 362 531), joita on muutettu geneettisesti lyhennettyjen ICAM-1-molekyylien tuottamiseksi. Näistä ICAM-1:n lyhennetyistä muodoista ·. 25 (tICAM(453) ja tICAM(185)) puuttuu solukalvon läpäisevä osa, ja ne eritetään soluviljelyelatusaineeseen. Ne sitoutuvat rhinovirukseen määrityksessä, joka on kuvattu Greven et ai., Cell. 56:879 (1989) yllä mainitussa artikkelissa, vaikkakin tmICAM-l:n suhteen merkittävästi vähentynein 30 tasoin. Täten niiden tehokkuus rhinoviruksen tartunnanai-heuttamiskyvyn estäjinä näytti olevan vähäisempi kuin tmICAM-1:n. Katso patenttihakemusjulkaisut EP 0 319 815, EP 0 362 531, US 5 589 453 ja EP 0 362 531.

Patenttihakemusjulkaisut 5 589 453 ja EP 0 362 531 35 kohdistuvat transmembraanisen rhinovirusreseptorin käyt- • 9 m ~ 5 105687 töön rhinoviruksen tartunnanaiheuttamiskyvyn estäjänä käytettäessä ionitonta detergenttiä transmembraanisen proteiinin pitämiseksi liuoksessa ja kohdistuvat lyhennettyihin, solujen välistä adheesiota välittäviin molekyyleihin ' 5 (tl-CAM), joissa on transmembraanisten, solujen välistä adheesiota välittävien molekyylien solunulkoiset osat 1, 2 ja 3 ja jotka lyhennetyt muodot eivät vaadi ionittoman detergentin läsnäoloa, jotta ne saataisiin liukoisiksi;

Patenttihakemusjulkaisu EP 0 319 815 kohdistuu 10 transfektoituihin solulinjoihin, jotka ilmentävät pää-rhinovirusreseptoria (HRR) ja HRR:n tunnistukseen solujen välistä adheesiota välittäväksi molekyyliksi; ja

Patenttihakemusjulkaisut US 5 859 212, US 5 849 699, US 5 821 341 ja US 5 235 049 kohdistuvat luonnossa 15 ilmenevään liukoiseen ICAM:iin (sICAM), joka on sukua tml-CAM:lie mutta eroaa siitä siten, että tästä sICAM:ista puuttuvat solukalvon sisäosaan ja solulima-alueelle ulottuvat aminohapot; lisäksi tällä sICAM:11a on uusi 11:n aminohapon sekvenssi C-päässä.

20 Myöhemmin Marlin, S.D., et ai., Nature, 344:70 (1990), raportoivat muodostaneensa ja puhdistaneensa normaalisti solukalvoon sitoutuneen ICAM-1-molekyylin lyhennetyn liukoisen muodon, jolle he antoivat nimeksi sICAM-1. Sillä on sekä deletoidun proteiinin solukalvon läpäisevä ·. 25 osa että solulimassä" “sijaitseva osa, ja se eroaa villi- tyyppisestä aminohapposekvenssistä yhdellä konservatiivisella substituutiolla karboksyylipäässään. Se koostuu ICAM-1:n tähteistä 1 - 452 ja uudesta fenyylialaniinitäh-teesä C-päässä. Nämä tutkijat osoittivat, että sICAM-1-30 tasojen piti olla "i-5~Ö”“/Ig/ml, jotta HRV14-viruksen sitoutuminen soluihin estyi. Kuitenkin he havaitsivat myös, että sICAM-1 pitoisuutena 1 μg/ml (18 nM), ollessaan jatkuvasti läsnä viljelmäelatusaineessa, kykeni estämään 50 prosenttisesti HRV54- infektion etenemisen. Estovaikutus 35 korreloitiin viruksen reseptoriluokkaan, sikäli että m .6 105687 coxsackie A13 estettiin mutta poliovirus tai HRV2 ei; tuloksia tartunnanaiheuttamiskyvystä ei HRV14:n kohdalla kuitenkaan raportoitu. Täten he eivät osoittaneet suoraa korrelaatiota sitoutumisen ja tartunnanaiheuttamiskyvyn 5 estymisen välillä. Lisäksi, kuten alempana tarkemmin selitetään, yritykset toistaa Marlinin et ai. saamat tulokset eivät ole olleet menestyksekkäitä ja ovat viitanneet siihen, että tarvitaan korkeampi konsentraatio ICAMrin lyhennettyä muotoa (10 kertaa korkeampi kuin transmembraanista 10 ICAM:ia), jotta saataisiin aikaan 50 %:n vähentyminen vi-rustiitterissä.

Tähän päivään saakka kukaan ei ole kyennyt osoittamaan ainetta, joka sitoutuu ihmisen rhinovirukseen ja vähentää tehokkaasti sen tartunnanaiheuttamiskykyä (tukki-15 maila virusinfektion eristetyllä solun pinnan reseptori-proteiinilla) yhtä tehokkaasti kuin tmICAM-1; vastaavasti alalla on edelleen olemassa tarve ICAM-1-muodolle, joka voi sitoutua tehokkaasti ihmisen rhinovirukseen ja voi tehokkaasti vähentää HRV:n tartunnanaiheuttamiskykyä.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle terapeuttisesti käyttökelpoisen multimeerin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Tässä valmistetaan transmembraanisen ICAMrin (tml-CAM-1:n) multimeerisia konfiguraatioita samoin kuin ei-·. 25 transmembraanisen ICAM:in (tICAMrin) multimeerisia konfi guraatioita. Ei-transmembraaninen ICAM tunnetaan myös nimellä lyhennetty ICAM, se on: ICAM, josta merkittävässä määrin puuttuu solunsisäinen karboksyylipään osa ja hydrofobinen solukalvossa sijaitseva osa ja johon kuuluvat, 30 näihin rajoittumatta, tICAM(453)- ja tICAM(185) -muodot.

ICAMrin ei-transmembraanisiin muotoihin voivat kuulua ICAMrin funktionaaliset johdannaiset ja tICAMrin muteiini-muodot liittämisen edistämiseksi. Kun lyhennetyt ICAM-muo-dot ovat multimeerisessa konfiguraatiossa, edullisesti 35 dimeereinä, ne osoittavat tehostunutta sitoutumista ihmi- • 7 105687 sen rhinovirukseen ja kykenevät vähentämään viruksen tar-tunnanaiheuttamiskykyä. ICAM:n eri muodot, transmembraani-set tai ei-transmembraaniset, voidaan tehdä multimeerisik-si kantajaan adsorboimalla. Tämä kantaja voidaan valmistaa 5 sellaisista materiaaleista, kuten nitroselluloosa, PVDF, DEAE, lipidipolymeerit, samoin kuin aminodekstraani, tai erilaisista inerteistä polymeereistä, jotka voivat adsorboitua tICAM:iin tai jotka voidaan kytkeä siihen joko vä-liryhmän tai kytkentäryhmän kanssa tai ilman.

10 Multimeerinen ICAM voidaan myös tehdä multimeeri- seksi kytkemällä ICAM esimerkiksi vasta-aineeseen, pro-teiinikantajaan tai ristisidoksia muodostavaan reagens-siin. Esimerkki vasta-aineesta on anti-ICAM -vasta-aine, CL 203; sopiviin proteiinikantajiin kuuluvat albumiini ja 15 proteoglykaanit; ja soveliaisiin ristisidoksia muodostaviin reagensseihin kuuluvat heterobifunktionaaliset ja homobifunktionaaliset" ristisidoksia muodostavat reagens-sit, kuten bifunktionaäliset N-hydroksisukkinimidiesterit, imidoesterit tai bis-maleimidoheksaanit. Kytkemisen edis-20 tämiseksi ICAM:ia voidaan muokata joko karboksyylipäästä tai aminopäästä reaktiivisella aminohappotähteellä, kuten lysiinillä, kysteiinillä tai muulla (muilla) aminohappotähteellä (aminohappotähteillä), jotka tarjoavat kohdan (kohtia) kytkemisen edistämiseksi. Näihin muokattuihin ·. 25 ICAM-tyyppeihin viitataan nimellä muteiinit. Lisäksi ICAM:ia voidaan muokata kummasta päästä tahansa sellaisen lipidin sisällyttämiseksi, joka pystyy edistämään oligo-meeristen misellien muodostumista. Multimeerisen ICAM:in sisältävä ICAM voi olla joko täysin glykosyloitu, osittain 30 glykosyloitu tai glykosyloimaton.

Keksintö tarjoaa myös käyttöön menetelmiä, joilla • i _ _ voidaan tehostaa ICAM:in ja sen funktionaalisten johdannaisten kiinnittymistä ligandiin, kuten ihmisen rhinovirukseen, ja "pääryhmäreseptoriviruksiin", imusolun toimin-35 taan liittyvään antigeeni-1:een (LFA-l:een), Plasmodium 8 105687 falciparumiin (malaria) ja vastaaviin, jolloin ICAM esitetään ligandille muodossa ja konfiguraatiossa, joissa ICAM:in sitoutuminen ligandiin tehostuu. ICAM-muoto voi olla joko transmembraaninen tai ei-transmembraaninen (ly-5 hennetty). Lyhennetty ICAM on ICAM, josta puuttuu merkittävässä määrin solunsisäinen karboksyyliosa ja hydrofobinen solukalvossa sijaitseva osa. Edullisiin lyhennettyihin ICAM-muotoihin kuuluvat tICAM(453) ja tICAM(185). ICAM voidaan muokata joko karboksyylipäästä tai aminopäästä 10 multimeerisen ICAM:in muodostumisen tehostamiseksi. Nämä muokkaukset voivat sisältää reaktiivisten aminohappotähteiden lisäyksen, kuten lysiinin, kysteiinin tai muun aminohappotähteen (muiden aminohappotähteiden), jotka tarjoavat kytkeytymistä helpottavan kohdan (helpottavia koh-15 tia) . Menetelmän ICAM:in nukleotidisekvenssi voidaan sisällyttää vektoriin, kuten plasmidiin, ja vektori voidaan tuoda isäntäsoluun, esimerkiksi eukaryootti- tai proka-ryoottisoluihin. Edullinen eukaryoottisolu on nisäkässolu, kuten kiinanhamsterin munasarjasolut; edullinen proka-20 ryoottisolu on E. coli.

Valmistettavan ICAM:in konfiguraatio on multimee-rinen, jolloin dimeerinen on edullisin. Multimeerinen konfiguraatio voi sisältää ensimmäisen ICAM:in, joka on kytketty ristisidoksin toiseen ICAM:iin, tai se voi sisältää >, 25 ICAM:in, joka on adsorboitu kantajaan, jolloin näin syntyy « multimeerinen konfiguraatio. Kantajina voivat olla mole-kyylipainoltaan suuret ja merkittävässä määrin inertit polymeerit, kuten nitroselluloosa, PVDF, DEAE, lipidi-polymeerit ja aminodekstraani, tai erilaiset polymeerit, 30 jotka voivat adsorboida ICAM:ia ja jotka voidaan kytkeä ICAM:iin, joko väliryhmän tai kytkentäryhmän kanssa tai ilman. Multimeerinen ICAM voidaan tehdä multimeeriseksi esimerkiksi kytkemällä se vasta-aineeseen, proteiinikan-tajaan tai ristisidoksia muodostavaan aineeseen. Edulli-35 siin ristisidoksia muodostaviin reagensseihin kuuluvat heterobifunktionaaliset ja homobifunktionaaliset risti- - - 9 .9 105687 sidoksia muodostavat reagenssit, kuten bifunktionaaliset N-hydroksisukkinimidiesterit, imidoesterit, bis-maleimido-heksaanit; edullisiin proteiinikantajiin kuuluvat albumiini ja proteoglykaanit; esimerkki edullisesta vasta-ainees-5 ta on CL 203 ja mitkä tahansa muut vasta-aineet, jotka eivät häiritse HRV:n sitoutumista.

Kuvataan myös uusia farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät farmaseuttisesti soveliaan liuottimen, laimennusaineen, adjuvantin tai kantajan ja aktiivisena 10 ainesosana tehokkaan annoksen polypeptidiä, jolle on ominaista, että sillä on ihmisen rhinovirusta sitovaa aktiivisuutta ja se vähentää viruksen tartunnanaiheuttamisky-kyä.

Muut tämän keksinnön piirteet ja edut käyvät ilmi 15 tarkasteltaessa seuraavaa yksityiskohtaista kuvausta, joka sisältää useita havainnollisia esimerkkejä keksinnön käytöstä .

Kuten yllä mainitaan, nisäkässoluista eristetyllä tmICAM-l:llä on kyky neutraloida pääreseptoriryhmään kuu-20 luvia ihmisen rhinoviruksia, mutta vain jos se pidetään liuoksessa detergentin kanssa. On havaittu, että tietyillä ICAM-l:n liukoisilla fragmenteilla on vähentynyt kyky sitoa virusta, eivätkä ne vähennä tartunnanaiheuttamiskykyä yhtä tehokkaasti kuin tmICAM-1. Tähän päivään mennessä • 25 kukaan ei ole kyennyt ottamaan selville tämän vähentyneen kyvyn syytä.

On ehdotettu, että rhinovirusreseptori esiintyy solujen pinnalla pentameerisessa muodossa [Tomassini, J. ja Colonno, R., J. Virol. 58 (1986) 290 - 295]. Kuitenkin 30 Hela-soluihin sitoutuvan rhinoviruksen ja anti-ICAM-l-mo-noklonaalisen vasta-aineen kvantitaatio (tämän keksinnön muiden keksijöiden julkaisemattomia tuloksia) on paljastanut maksimissaan 30 000 sitoutunutta virionia solua kohti (määritetty 35S-metioniinileimatun HRV:n sitoutumisen pe-35 rusteella) ja 50 000 - 60 000 ICAM-1-molekyyliä solua kohti (määritetty radioleimatun Mab:n ICAM-1:een sitoutumisen . 10 105687 perusteella). Nämä tulokset antoivat aihetta lisätutkimuksille, joissa tutkittiin mahdollisuutta, että solujen pinnalla on sitoutunut viiden sijasta pikemminkin vain 1 tai 2 ICAM-1-molekyyliä yhtä soluun sitoutunutta HRV-partikke-5 lia kohti.

Geneettisesti muokattuja lyhennetyn ICAM-l:n muotoja, joista puuttuu C-terminaalinen, transmembraaninen osa ja jotka eritetään rekombinanttigeenillä transfektoitujen nisäkässolujen viljelyelatusaineeseen. Alla kuvataan kah-10 den tällaisen eritetyn ICAM-molekyylin, tICAM(453):n ja tICAM(185):n puhdistus näillä geeneillä pysyvästi transfektoitujen solujen käyttämästä viljelyelatusaineesta. Liuoksessa olevan HRV:n sitoutumiskokeessa ja HRV:n neut-ralointikokeessa havaittiin, että tICAM(453):11a on mer-15 kittävästi (noin 200-kertaisesti) vähentynyt aviditeetti HRV:lie tmICAM-l:n suhteen. Kun kuitenkin joko tmICAM-1 tai tICAM(453) tai tICAM(l85) adsorboidaan ensin mihin tahansa lukuisista liukenemattomista kantajista, kuten nitroselluloosa-, PVDF-(polyvinyylideenidifluoridi-) tai 20 DEAE-(dietyyliaminoetyyli-)membraaneihin, ja sitten inku- boidaan radioaktiivisen HRV:n kanssa, tICAM(453):n viruk-sensitorniskyky muuttuu vertailukelpoiseksi tmICAM-l:n kanssa. Täten multimeerisen tICAM(453)m tai multimeerisen tICAM(185):n sitoutumisella HRV:een on samat ominaisuudet • 25 kuin HRV:n sitoutumisella ICAM-l:een Hela-soluissa: anti- ICAM-l-monoklonaaliset vasta-aineet estävät sen, kuten spesifinen pääreseptoriryhmän rhinoviruksille ja sillä on sama lämpötilariippuvuus kuin rhinovirusten sitoutumisella soluihin (se on, sitoutuu hyvin 37 °C:ssa ja ei-havaitta-30 vasti 4 °C:ssa).

Tässä käytettäessä seuraaviin lyhennyksiin ja ter- • < meihin kuuluvat, näihin välttämättä rajoittumatta, seuraa-vat määritelmät.

11 105687

Lyhennys Määritelmä ICAM Solujen välistä adheesiota välittävä molekyyli - voidaan käyttää merkitsemään sekä täyspitkiä (transmembraa-5 nisiä) että lyhennettyjä (ei-trans- membraanisia) proteiinimuotoja.

ICÄM-1 Solujen välistä adheesiota välittävä molekyyli-1, myös tunnettu nimillä 10 ICAM, tmICAM-1; merkitsee täyspitkää, transmembraanista proteiinia.

tmICAM-1 Transmembraaninen, solujen välistä adheesiota välittävä molekyyli-1, 15 myös tunnettu nimellä ihmisen rhino- virusreseptori (HRR), vaatii esim. detergentti-olosuhteita muuttuakseen liukoiseksi.

20 sICAM-1 Luonnossa ilmenevä liukoinen ICAM-1, josta on poistettu sekä ICAM-1:n transmembraaninen osa että soluli-massa sijaitseva osa; aminohapot 1 -442 sekä 11 uutta aminohappoa; ei ·. 25 voida erottaa Stauntonin, et ai.

tICAM453:sta, joka koostuu aminohapoista 1 - 453 ja jossa terminaalinen tyrosiini on korvattu fenyylialanii-nilla.

30 tICAM I Lyhennetty, solujen välistä ad- • « heesiota välittävä molekyyli-1, myös tunnettu nimellä ei-transmembraaninen ICAM.

» .12 105687 tICAM(453) Lyhennetty muoto ICAM:ista - ICAMrin solun ulkoinen aminoterminaalinen osa, josta on poistettu ICAM-l:n solukalvon läpäisevä osa ja solulimassa 5 oleva osa; myös viitattu nimellä sIC- AM-1 Marlinin, ££, ai. artikkelissa.

tICAM(185) Lyhennetty ICAM:in muoto - ICAM:in solun ulkoinen aminoterminaalinen 10 osa, josta ICAM-l:n solukalvon lä päisevä osa ja solulimassa oleva osa on poistettu.

"Multimeeriseksi saattamiseen" ja "multimeeriseen" 15 kuuluvat, näihin rajoittumatta, dimerisaatio ja dimeeri-nen, ja niihin kuuluu mikä tahansa ICAM-1-molekyylin konfiguraatio tai sen fragmentti, joka tehokkaasti vähentää viruksen sitoutumista ja tartunnanaiheuttamiskykyä; "transmembraaninen" tarkoittaa yleisesti ICAM-1-20 proteiinimolekyylin muotoja, joissa on hydrofobinen, solukalvon läpäisevä sekvenssi ja jotka ovat solukalvoon sitoutuneita; "ei-transmembraaninen" tarkoittaa yleensä ICAM-1-proteiinin liukoisia muotoja, mukaan lukien niin kutsutut 25 "lyhennetyt" proteiinimuodot, jotka eivät ole solukalvoon sitoutuneita, vaan eritetään pikemminkin soluviljelmän elatusaineeseen liukoisina proteiineina, samoin kuin "transmembraaniset" muodot, jotka on irrotettu liukoiseksi tekemällä solujen solukalvoista hajottamalla solut ionit-30 tomassa detergentissä; "lyhennetty" sisältää yleensä minkä tahansa pro- • « teiinimuodon, joka on täyspitkää, transmembraanista ICAM-muotoa lyhyempi; "muotoa" käytetään tässä yleensä erottamaan täys-35 pitkiä ja osapitkiä ICAM-muotoja toisistaan; kun taas "konfiguraatiota" käytetään yleensä erottamaan toisistaan \ • - 13 105687 mahdollisten ICAM-muotojen monomeerisia, dimeerisiä, ja multimeerisia konfiguraatioita; kaikki ICAM-l-molekyylin muodot ja konfiguraatiot, joko täyspitkät tai sen fragmentit, mukaanlukien muteii-5 nit, joko monomeeriset tai multimeeriset, voivat olla täysin tai osittain glykosyloituja, tai täysin glykosyloimat-tomia, niin kauan kuin molekyyli edelleen tehokkaasti vähentää viruksen sitoutumista ja tartunnanaiheuttamiskykyä; "ligandia" käytetään yleensä tässä niin, että siilo hen sisältyy mikä tahansa, joka kykenee sitoutumaan ainakin yhteen ICAMrin mihin tahansa muotoon ja konfiguraatioon, ja se sisältää, näihin rajoittumatta, ihmisen rhi-noviruksen, muut virukset, jotka sitoutuvat ihmisen rhino-virusreseptorin "pääryhmään", imusolun toimintaan liit-15 tyvän antigeeni-1:n, ja Plasmodium falciparumin (malaria) ; ja "ihmisen rhinovirus" sisältää yleisesti kaikki ihmisen rhinoviruksen ihmisellä esiintyvät serotyypit, kuten on luetteloitu artikkelissa Hamparian, V., et ai., Virol. 20 159:191 - 192 (1987).

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

Esimerkki 1 koskee rhinovirusten viljelyä, puhdistusta ja määritystä;

Esimerkki 2 koskee ICAM-l:n monoklonaalisten vasta-·, 25 aineiden puhdistusta ja eristystä;

Esimerkki 3 koskee ICAM-cDNA:n ei-transmembraanis-ten, lyhennettyjen muotojen muodostamista täyspitkästä ICAM-1-cDNA:sta;

Esimerkki 4 koskee nisäkässolujen transfektiota ja 30 ICAM-cDNA:n ei-transmembraanisten, lyhennettyjen muotojen ekspressiota;

Esimerkki 5 koskee ICAM-l:n ei-transmembraanisten, lyhennettyjen muotojen eristystä ja puhdistusta;

Esimerkki 6 koskee tmICAM-1:n, tICAM(185):n ja 35 tICAM(453):n radioaktiivista leimausta ja sen osoitusta, • 14 105687 että kyky sitoutua monoklonaalisiin vasta-aineisiin säilyy;

Esimerkki 7 koskee ihmisen rhinoviruksen sitoutu-mismääritystä transmembraanisiin ja ei-transmembraanisiin, 5 lyhennettyihin ICAM-1-muotoihin;

Esimerkki 8 koskee CL203-IgG -vasta-ainevälitteistä tICAM(453):n ristisitoutumista;

Esimerkki 9 koskee transmembraanisten ja ei-trans-membraanisten, lyhennettyjen ICAM-1-muotojen multimeeri-10 siksi saattamista;

Esimerkki 10 koskee tartunnanaiheuttamiskyvyn neut-ralisaatiomääritystä multimeerisille, transmembraanisille ja multimeerisille, ei-transmembraanisille, lyhennetyille ICAM-1-muodoille; 15 Esimerkki 11 koskee transmembraanisten ja lyhennettyjen ICAM-1-muotojen käyttöä ICAM/LFA-1 -vuorovaikutuksen tehokkaina estäjinä.

Esimerkki 1

Rhinovirusten viljely, puhdistus ja määritys 20 Rhinovirukset viljeltiin, puhdistettiin ja mää ritettiin olennaisesti kuten on kuvattu (Abraham, G. , et ai., J. Virol.. 51:340 (1984) ja Greve, et ai., Cell. 56:839 (1989)). Näitä tutkimuksia varten valittuihin se- rotyyppeihin kuuluvat alan standardi HRV14 ja HRV3, jolla 25 on noin 10 kertaa korkeampi affiniteetti ICAM:iin kuin HRV14:llä. HRV2:ta, joka sitoutuu "vähäisempään" reseptoriin pikemminkin kuin "pääreseptoriin", käytettiin nega-tiivikontrollina.

Rhinovirukset HRV2, HRV3 ja HRV14 hankittiin Ameri-30 can Type Culture Collection -yhtiöltä, plakkipuhdistettiin ja eristettiin infektoitujen Hela-S3 -solujen lysaateista. Puhdistettu rhinovirus valmistettiin polyetyleeniglykoli-saostuksella ja sakkaroosigradienttisedimentaatiolla. Viruksen puhtausaste määriteltiin kuoriproteiinien SDS-35 PAGE -analyysillä ja elektronimikroskopialla. Tartunnan-aiheuttamiskyky määritettiin etsimällä viimeinen vielä • • 15 105687 solutuhoa aiheuttava viruslaimennos, olennaisesti kuten kuvataan artikkelissa Minor, P.D., Growth, assay and purification of picornaviruses, teoksessa Virology: A Practical Approach, toim. B.W.J. Mahy, (Oxford:IRL Press), 5 s.25 - 41. -

Esimerkki 2 ICAM-l:n monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto ja eristys

Naaraspuoliset BALB/cByJ -hiiret immunisoitiin in-10 jektoimalla vatsaonteloon 107 koskematonta Hela-solua 0,5 ml:ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) kolmasti 3 viikon välein. Kaksi viikkoa myöhemmin hiiristä otettiin verta ja testattiin kykenivätkö seerumierät suojelemaan Hela-soluja HRV14-infektiolta. Positiivisille hii-15 rille annettiin tehosteena lopullinen 107 Hela-solun injektio, ja 3 päivää myöhemmin pernasolut fuusioitiin P3X63-Ag8.653-myeloomasolujen kanssa (Galfre, et ai., Nature. 266:550 - 552 (1977)), jolloin saatiin kaiken kaikkiaan noin 700 Tiybridooman sisältävää kaivoa. Kukin 20 kaivo testattiin inkuboimalla 3 x 104 Hela-solua sekä 100 μΐ supernatanttia 96-kaivoisilla levyillä 1 tunnin ajan 37 °C:een lämpötilassa; sitten solut pestiin PBS:llä ja lisättiin riittävä määrä HRV14:ää, jotta saatiin aikaan täydellinen solutuhovaikutus 24 - 36 tunnissa. Positiivi-25 set kaivot (infektiolta suojatut) merkittiin muistiin 36 tunnin kuluttua.

Solut poistettiin kaivoista, jotka osoittautuivat positiivisiksi ensimmäisessä seulonnassa, ja kloonattiin laimennossarjan avulla 96-kaivoisille mikrotiitterile-30 vyille. Näistä kaivoista saadut supernatantit testattiin solusuojelumäärityksessä ja positiiviset kaivot tunnistet- • < tiin taas. Suoritettiin lisäkloonauksia, kunnes kaikki hybridooman sisältävät kaivot olivat positiivisia, mikä osoitti että oli saatu aikaan klonaalinen populaatio. Saa-35 tiin neljä kloonattua solulinjaa ja niiden vastaavat vas- • « 16 105687 ta-aineet ja niille annettiin vastaavasti nimet C78.1A, C78.2A, C78.4A, C78.5A, c92.IA ja C92.5A.

C92.1A talletettiin 19. marraskuuta 1987 American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, 12301 5 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 ja sille annettiin nimeksi HB 9594.

Esimerkki 3

Ei-transmembraanisten, lyhennettyjen ICAM-cDNA

-muotojen muodostus täyspitkästä ICAM-l-cDNA:sta 10 A. ICAM-l-cDNA:n valmistus cDNA syntetisoitiin satunnaisalukkeilla HEI-solujen poly A+ RNArsta käyttäen Amersham™ cDNA synthesis kit -tarvikesarjaa valmistajan suosittelemissa olosuhteissa, olosuhteissa. Suoritettiin 25 syklin PCR-monistus käyt-15 täen 100 ng:aa cDNA:ta alukkeilla PCR 5.1: (ggaattcATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC) ja PCR 3.1: (ggaattcTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTGTT) .

20

Monistussyklit koostuivat lämpötiloista 94 °C 1 minuutin ajan, 55 °C 2 minuutin ajan ja 72 °C 4 minuutin ajan. PCR-reaktiotuote digestoitiin EcoRI-entsyymillä ja kloonattiin EcoRI-digestoituun faagivektoriin 1GT10 (Strata-25 gene™) . Rekombinanttifaagikloonit seulottiin plakkihybri- disaatiolla ICAM-l-spesifisiä oligonukleotideja käyttäen: GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTGGGGCCGCAGGTCCAGTTC (ICAM1) ja 30 CGCTGGCAGGACAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGTGTTCT (ICAM3).

• «

Positiivinen klooni, jolle annettiin nimeksi 1HRR4, valittiin ja puhdistettiin. Insertti irrotettiin EcoRI-digestiolla ja subkloonattiin Bluescript KS+:n 35 EcoRI-kohtaan. Tälle kloonille annettiin nimeksi pHHR2.

Koko insertti sekvensoitiin ja sen havaittiin sisältävän 17 105687 koko ICAM-1:tä koodittavan sekvenssin, joka alkaa aloi-tuskodonista ATG ja loppuu TGA-lopetuskodoniin PCRrllä tuotetun ICAM-1-sekvenssin mukaisesti (Simmons, et ai., Nature. 331:624 (1988); Staunton, et ai-, Cell. 52:925 -

' 5 933 (1988)) yhdellä korvautumisella: kohdassa 1462 A

G:ksi. Tämä sama muutos tunnistettiin useissa toisistaan riippumattomissa klooneissa ja täten se edustaa ICAM-l-geenin polymorfismia.

B. tICAM-1(453):n ja tICAM(185):n muodostus 10 I CAM-l-cDNA_: il muokattu ja muotoja luotiin PCR-monis- tusreaktioilla (Saiki, et ai., Science, 230: 1350 - 1354 (1985)) käyttäen templaattina täyspitkää ICAM-l-cDNA-kloo-nia pHHR-2. Plasmidi-DNA digestoitiin EcoRI:llä ICAM-l-in-sertin irrottamiseksi ja se käsiteltiin alkalisella fosfa-15 taasilla, jotta saataisiin estettyä vektorin muuttuminen uudestaan rengasmaiseksi seuraavissa ligaatiovaiheissa. Kymmenen nanogrammäa templaatti-DNA:ta alistettiin 10:lie PCR-monistussyklille käyttäen oligonukleotidialukkeita PCR5.5 ja PCR3.3 tICAM-453:lie ja PCR5.5 ja 3.10 20 tICAM-185:Ile seuraavissa olosuhteissa: Lämpötila ( °C) Aika (minuutteja) 94 1 55 ....... 2 25 72 1,5 ·. 71 4 (lopullinen jatkaminen) PCR5.5:llä on sekvenssi: 3 0

GGAATTCAAGCTTCTCAGCCTCGCTATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC

• joka koostuu EcoRI-^.j_a Hindlll-kohdista, 12 emäsparin ICAM-1:n 5'-pään transloitumattomasta sekvenssistä ja 35 24 ensimmäisestä signaalipeptidiä koodittavasta emäspä- rista. .......................

• « 18 105687 PCR3.3:11a on sekvenssi:

GGAATTCCTGCAGTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT

5 joka koostuu EcoRI- ja PstI-kohdista, lopetuskodonista, ja 24 emäsparista, jotka ovat komplementaarisia emäksille, jotka koodittavat ICAM-l:n viimeistä kahdeksaa solunul-koista aminohappoa (tähteet 446 - 453) .

PCR3.10:llä on sekvenssi: 10

TTCTAGAGGATCCTCAAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGG

joka koostuu Xbal- ja BamHI-kohdista, lopetuskodonista, ja 24 emäsparista, jotka ovat komplementaarisia emäksille, 15 jotka koodittavat ICAM-l:n tähteitä 178 - 185.

PCR-reaktiotuotteet digestoitiin EcoRI:llä (11CAM(453) ) tai EcoRI:llä ja BamHI:llä (tICAM(185)) ja kloonattiin Bluescript™ SK+ -plasmidin (Stratagene) poly-linkkerikohtaan. Halutut insertit sisältävät kloonit vah-20 vistettiin restriktioanalyysillä ja DNA-sekvensoinnilla. Insertit irrotettiin Bluescript™-plasmidista digestoimalla HindIII:lla ja Xbal:llä ja sijoitettiin ekspressiovekto-riin CDM8 (Seed, Nature. 239:840 (1987) Hindlll- ja

Xbal-kohtiin. Valittiin tICAM(453)-insertin sisältävä 25 klooni, jolle annettiin nimeksi pHRR-8.2 ja tICAM(185)- insertin sisältävä klooni, jolle annettiin nimeksi pHRR23-13, ja nämä pantiin perusteelliseen sekvenssianalyysiin. Tämä vahvisti haluttujen lopetuskodonien olemassaolon ja ICAM-1:tä koodittavasta sekvenssistä valittujen 30 alueiden eheyden.

Nämä plasmidit transfektoitiin COS-soluihin käyt- • < täen DEAE-dekstraani -menetelmiä ja soluja viljeltiin 72 tuntia ennen määritystä. Ekspressiota pinnalla tarkkailtiin FACS-laitteella epäsuoraa immunofluoresenssia ja 35 ICAM-1:lie spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta käyt täen. Ohimenevä ilmeneminen COS-soluissa ja metabolisesti m 19 105687 leimattujen (35S-kysteiini) solujen supernatantin immuno-presipitaatio C78.4A Mab:lla (monoklonaalisella vasta-aineella) osoitti liukoisten, 45 kD:n ja 80 kD:n ICAM-1-fragmenttien tuotannon pHRR23-13:sta ja vastaavasti 5 pHRR8.2:sta. Stabiilien kiinanhamsterin munasarjasolu- transfektanttien valmistus kuvataan alla esimerkissä 4.

C. Modifioidut, glykosyloimattomat, transmembraani-set IGAM-1-molekyylit

Tehtiin muokattu, täyspitkä ICAM-1 samanaikaisella 10 mutageneesillä kohtiin N-103, N-118, N-156 ja N-178, kukin muutettiin Q-aminohapoksi. Tämä poistaa kaikki neljä N-sidoksellista glykosylaatiokohtaa ICAM-1-molekyylin so-lunulkoisesta D2-osasta. Tuloksena oleva molekyyli, johon viitataan nimellä glykosyloimaton, transmembraaninen ICAM, 15 tuotettiin COS-solujen pinnalla ja se kykeni sitomaan ra-dioleimattua HRV3:aa tasoin, jotka olivat vertailukelpoisia muokkaamattoman ICAM-1:n kanssa. Tämä tulos osoitti, että osan 2 (ensimmäisen 184 aminohapon) glykosylaatiota ei tarvita, jotta virus sitoutuisi ICAM-1:een.

20 On odotettavissa, että ei-transmembraaninen ICAM

voidaan muokata vastaavasti, jolloin saadaan muokattuja, glykosyloimattornia, ei-transmembraanisia ICAM-1-molekyylejä.

D. Sellaisten ei-transmembraanisten (lyhennettyjen) 25 ICAM-1:n geeniteknologisin menetelmin käsiteltyjen muoto jen muodostus, jotka sisältävät reaktiivisia tähteitä, jotka soveltuvat ristisidoksien tekemiseen multimeerien muodostusta varten

Muodostettiin yllä kuvatulla tavalla pHRR-2-cDNA:ta 30 PCR:n avulla muokkaamalla molekyyli, joka sisälsi ICAM-1:n 453 aminohapon pituisen solunulkoisen osan ja lisäksi e t uuden lysiinitähteen C-päässä. Käytetyt alukkeet olivat PCR5.5 (kuvattu yllä) ja PCR3.19, jolla on sekvenssi:

3 5 TTCTAGAGGATCCTCACTTCTCATACCGGGGGAGAGCACATT

20 105687 ja joka koostuu Xbal- ja BamHI-kohdista, lopetuskodonista, Lys-kodonista ja 24 emäksestä, jotka ovat komplementaarisia sekvenssille, joka koodittaa aminohappotähteitä 446 -453. CDM8-vektoriin kloonauksen jälkeen vahvistettiin 5 tICAM-453K:n tuotanto lyhytaikaisella ekspressiolla COS-soluissa. Pysyvät CHO-solulinjat tehtiin samanaikaisella transfektiolla pSV2-DHFR:n kanssa aikaisemmin kuvatulla tavalla.

Käytettiin samaa strategiaa lisäämään Lys-tähde 10 tlCAM(185):n C-päähän käyttäen PCR5.5:tä ja PCR3.20:ta, jolla on sekvenssi:

TTCTAGAGGATCCTCACTTAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGC

15 ja joka koostuu Xbal- ja BamHI-kohdista, lopetuskodonista, Lys-kodonista ja 24 emäksestä, jotka ovat komplementaarisia sekvenssille, joka koodittaa tähteitä 178-185. Lyhytaikainen ekspressio COS-soluissa vahvisti tICAM-185:n tuotannon ja stabiilit CHO-solulinjat saatiin aikaisemmin 20 kuvatulla tavalla.

Kolme tICAM(l-452):n muokattua muotoa, jotka kukin sisältävät Cys-lisätähteen, muodostettiin kokopitkän ICAM-1-cDNA:n suunnatulla mutageneesillä. Lopetuskodoni tuotiin kuhunkin konstruktioon vaihtamalla E-453 GAG . 25 TAG:iksi. C-pää on täten Y-452. Tähteet N-338, T-360 ja Q-387 mutatoitiin kukin erikseen kysteiiniksi käyttäen toista suunnattua mutageneesiä. Haluttujen mutaatioiden läsnäolo vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Tähteet, jotka valittiin mutatoitaviksi kyste-30 iineiksi, valittiin tietokoneella aikaansaadun pinnalla esiintymisen todennäköisyyttä kuvaavan käyrän perusteella, joka ennustaa näiden alueiden sijainnin pinnalla. T-360 on myös lähellä N-358:aa, joka on mahdollinen N-sidoksellinen glykosylaatiokohta. Kaikki kolme Cys-muokkausta tuotettiin 35 ja eritettiin transfektoitujen COS-solujen elatusainee- seen. Proteiinien tutkiminen pelkistävissä ja ei-pelkistä- • .21 105687 vissä oloissa ei osoittanut dimeerien läsnäoloa. On odotettavissa, että sulfhydryyliryhmien kanssa reagoivia, ristisidoksia muodostavia reagensseja voidaan käyttää muodostamaan ristisidoksia Cys-muokattujen tICAM-muotojen ' 5 välille, jolloin saadaan multimeerisia muotoja.

Esimerkki 4

Solujen transfektio ja ICAM-cDNA:n ei-transmembraa-nisten, lyhennettyjen muotojen ekspressio A. Eukaryoottisolujen transfektio 10 Kiinanhamsterin munasarjasoluja (CHO-soluja) , jois ta puuttuu dihydrofolaattireduktaasi (DHFR), hankittiin Cutter Labs -yhtiöstä (Berkeley, CA) . Solut transfektoi-tiin samanaikaisesti plasmidilla pSV2 DHFR, joka sisältää hiiren dihydrofolaattireduktaasigeenin (DHFR) SV40-pro-15 moottorin alaisuudessa, ja CDM8-vektorissa sijaitsevilla tICAM-453- tai tICAM-184-konstruktioilla (Seed ja Aruffo, PNAS. 84:3365 - 3369 (1987)).

Transfektiot tehtiin sekä elektroporaatio- että kalsiumfosfaattimenetelmiä käyttäen. Bebbington, yllä. 20 Transfektoituneet, DHFR-positiiviset solut valittiin sen perusteella, että ne kasvoivat nukleosidittomassa elatus-aineessa, ja transfektanttipoolit kloonattiin laimennos-sarjan avulla.

tICAM:ia erittävät solulinjat valittiin testaamalla 25 viljelmän supernatantista ICAM:in läsnäolo kaksipuolisella radioimmunomäärityksellä (RIA:11a) käyttäen Mab:eja C78.4A ja c78.5A seuraavasti, Yhtä ICAM:in pinnalla olevaa epi-tooppia vastaan suunnattua monoklonaalista vasta-ainetta (esimerkiksi Mab c78.4A:ta) adsorboitiin muovisiin 96-kai-30 voisiin levyihin (Immunlon-levyt, Dynatech Inc.), levyillä olevat ylimääräiset sitoutumiskohdat tukittiin naudan see-rumialbumiinilla (BSÄT_j~ä_ sitten viljelmän supernatantteja inkuboitiin levyjen kanssa. Sitten levyt pestiin ja inku-boitiin 125I-monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (suunnattu 35 ICAM:in pinnalla olevaa toista epitooppia vastaan, esimer- 22 105687 kiksi c78.5A:ta) , ja sitoutuneen 125IgG:n määrä määritettiin pesun jälkeen. tICAM:in konsentraatio määritettiin vertaamalla tuntemattomista saatua RIA-dataa standardikäyrää vastaan, joka sisälsi tm-ICAM:in tunnettuja pitoisuuksia.

5 Positiivisia klooneja kasvatettiin ja tICAM-muotojen tuo tanto vahvistettiin immunopresipitoimalla metabolisesti leimattujen solujen supernatantit Mab c78.4A:lla.

Solulinj at CT.2A (tICAM(453) ja CD12.IA, (tICAM(185)) valittiin jatkotutkimuksiin ja ne alistettiin 10 geenimonistukseen metotreksaattia sisältävässä elatusai- neessa, kuten on kuvattu Bebbingtonin et ai. artikkelissa yllä. 100 nM:lle metotreksaatille resistenttiä kloonia, joka oli peräisin CT.2A:sta ja 1 ^M:lle metotreksaatille resistenttiä CD12.lA-kloonia käytettiin liukoisten, lyhen-15 nettyjen ICAM-l-proteiinien puhdistukseen.

B. Prokaryoottisolujen transfaktio

Koska ICAM:in virusta sitovan osan glykosylaatiota ei vaadita, jotta viruksen sitoutumiskyky säilyisi (kuten esimerkissä 3C osoitetaan), on odotettavissa että proka-20 ryoottisoluja, kuten E. coli. voidaan transfektoida menestyksekkäästi toimivien proteiinien tuottamiseksi.

Esimerkki 5 ICAM-l:n ei-transmembraanisten, lyhennettyjen muotojen eristys ja puhdistus 25 Monoklonaalista vasta-ainetta käyttävä affiniteet- tikromatografia c78.4A-Sepharose™: llä on kuvattu aikaisemmin samaan aikaan vireillä olevassa US-patenttihakemukses-sa sarjanumero 130 378 ja Greven e£. ai. artikkelissa (Cell. 56:839 - 847 (1989)). Seerumia sisältävään elatus-30 aineeseen eritetty tICAM vaatii lisäpuhdistusvaiheita seerumissa korkeina tasoina läsnäolevan proteiiniepäpuhtauden vuoksi. Ennen eluutiota Mab-affiniteettipylväästä pylväs pestiin 1 M NaCl:lla heikosti sitoutuneiden proteiinien poistamiseksi. tICAM(453):n tapauksessa c78.4-Sepha-35 rose™-pylväästä eluoitu, osittain puhdistettu tICAM(453) » .23 105687

dialysoitiin 10 mM Tris -puskuriin (pH 6,0), absorboitiin mono-Q™-pylvääseen (Pharmacia) ja eluoitiin 0 - 0,3 M

NaCl-gradientilla. tICAM184 puhdistettiin edelleen geeli-suodatuksella Superöse-12™-pylväässä.

5 Ymmärretään my5s, että ICAM-l:n ei-transmembraani- set, lyhennetyt muodot voidaan puhdistaa tavanomaisin 10-ninvaihtomenetelmin käyttämättä monoklonaalista vasta-ainetta käyttävää affiniteettikromatografiaa.

Esimerkki 6 10 tmiCAM-1:n, tICAM185:n ja tICAM453:n radioaktiivi nen leimaus ja sen osoitus, että kyky sitoutua monoklonaa-lisiin vasta-aineisiin säilyy

Epitoopit, jotka ovat reaktiivisia monoklonaalisten vasta-aineiden c78.4A ja C78.5A kanssa, ovat konformaa-15 tiosta riippuvaisia epitooppeja, ja täten niitä voidaan käyttää analyyttisinä koettimina, joilla osoitetaan ICAM:in alkuperäisen rakenteen säilyminen. Tunnettuja määriä puhdistettua^ ICÄM:ia inkuboitiin c78.4A- tai c78.5A- IgG-Sepharoosin™ kanssa ja määritettiin, mikä osa 20 radioaktiivisuudesta sitoutui. Nämä kokeet osoittivat, että puhdistetut tmICAM-1, tICAM(185) ja tICAM(453) -molekyylit säilyttivät täysin kykynsä sitoutua näihin monoklo-naalisiin vasta-aineisiin.

; Transfektantit leimattiin metabolisesti 35S-kys- 25 teiinillä ja solulysaatit (transmembraanisen ICAM:in tapauksessa) tai viljelmän supernatantit (lyhennetyn ICAM:in tapauksessa) valmistettiin ja inkuboitiin C78.4A- IgG-Sep-harose™ -pallojen kanssa. Pallot pestiin ja adsorboidut proteiinit ^lutoitiin SDS:llä ja analysoitiin 30 SDS-PAGE:11a; katso Greve, et ai.. Cell. 56:839 - 847 (1989)). Havaittiin, että eristetyt proteiinit sitoutuivat kvantitatiivisesti c78.4A- ja C78.5A -monoklonaalisiin vasta-aineisiin.

Vastaavasti sekä tICAM(185) että tICAM(453) ovat 35 molemmat säilyttäneet alkuperäisen ICAM:in rakenteen.

105687 24

Esimerkki 7

Ihmisen rhinoviruksen sitoutumismääritykset trans-membraanisille ja ei-transmembraanisille, lyhennetyille ICAM-l:n muodoille 5 Alla on kuvattu kolme sitoutumismääritystä, joita käytettiin eri ICAM-muotojen sitoutumisaktiivisuutta määritettäessä .

A. Sakkautumismääritys [35S] -kysteiinillä leimattu tmICAM-1 tai tICAM se-10 koitettiin HRV3:n kanssa 100 μΐ-.ssa. liuosta (10 mM HEPtSS (pH 7,5) , 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1 % Triton X-100). Seosta inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:een lämpötilassa, jäähdytettiin jäillä, sijoitettiin kerrokseksi 200 /il:n tyynylle (10 % glyserolia ja 0,2 M trietanoli-15 amiinia (pH 7,5)) ja sentrifugoitiin Beckmanin paineilmalla toimivassa sentrifuugissa 134 000 g:ssä 30 minuuttia 4 °C:een lämpötilassa. Pinnalta poistettiin 275 μΐ ja sakka analysoitiin SDS-PAGE:lla ja tuikelaskennalla. Kontrol-likokeiden SDS-geelien hopeavärjäys osoitti, että olennai-20 sesti kaikki HRV3 sakkautuu näissä oloissa ja olennaisesti kaikki ICAM jää supernatanttiin. Tulokset näytetään taulukossa 1.

Taulukko 1 25 ICAM ICAM:in sakkautumis-%* tmiCAM-1 11,6 % tICAM(453) 1,0 % tICAM(185) 4,3 % 30 * neljän kokeen keskiarvo; näitä lukuja ei voi muuttaa suoraan suhteellisiksi affiniteeteiksi Nämä tulokset osoittavat, että molemmat ICAM:in 35 lyhennetyt muodot sitoutuvat rhinovirukseen, mutta tasoin, jotka ovat merkittävästi pienentyneet tmICAM:in tasoihin verrattuna.

• 25 105687 B. Sitoutumismääritys liuoksessa

Jotta saataisiin kvantitatiivista tietoa tmICAM- ja tICAM-fragmenttien suhteellisesta affiniteetista liuoksessa, kehitettiin liukoinen kompetitiomääritys, jossa käyte-5 tään liukoisia tmICAM- tai liukoisia tICAM-fragmentteja estämään 35S-HRV3:n sitoutuminen aikaisemmin immobilisoi-tuun ICAM:iin; ionitonta detergenttiä (Triton X-100) sisällytettiin puskureihin, jotta eri proteiineja voitaisiin verrata identtisissä oloissa. Ensimmäiseksi tmICAM-1 10 (eristetty 0,1 prosenttisen oktyyliglukosidin ollessa läsnä Triton X-100:n sijasta) laimennettiin 10:teen osaansa Tris/NaCl-puskuriin ja annettiin adsorboitua mikrotiit-terilevyn (Immunlon-4, Dynatech) kaivoihin yli yön. Levyllä olevat epäspesifiset sitoutumiskohdat tukittiin sitten 15 BSA:lla (10 mg/ml) ja sitoutumiskokeet suoritettiin 0,1 % Triton X-100/l mg/ml BSA/Tris/NaCl -liuoksessa. Noin 20 000 cpm 35S-HRV3-virusta sekoitettiin vaihtelevien ICAM-määrien kanssa, joko tmICAM:in, tICAM(453):n tai tICAM(185):n, inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:een lämpö-20 tilassa ja lisättiin sitten mikrotiitterilevyjen kaivoihin ja inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 °C:een lämpötilassa. Levyt pestiin ja sitoutunut radioaktiivisuus määritettiin.

Kuten taulukossa 2 esitetään, tmICAM-1 estää viruksen sitoutumista puolella maksimitehosta matalina pitoi-, 25 suuksina (0,008 μΜ) , samalla kun tICAM(453) ja tICAM(185) estävät paljon korkeampina pitoisuuksina (2,8 μΜ ja vastaavasti 7,9 μΜ; tai 350:stä lähes 1 000:een kertaa korkeampina kuin tmICAM).

26 105687

Taulukko 2 I CAM IC50* tmICAM 8,0 ± 3,3 nM (N=3) 5 tICAM(453) 2,8 ± 0,6 μΜ (N=3) tICAM(185) 7,9 + 2,8 μΜ (N=3) * IC50 on se liukoisen ICAM:in pitoisuus, joka tar vitaan estämään HRV3:n sitoutumista 50 %:lla.

10 Nämä tulokset vahvistavat ja laajentavat aikaisempia havaintoja, joiden mukaan tICAM(453) ja tICAM(185) sitoutuvat todellakin rhinovirukseen, mutta alhaisemmilla 15 affiniteeteilla kuin tmICAM-Ι, ja tarjoavat todistusaineistoa siitä, että virusta sitova osa sijaitsee ICAM-l:n kahden N-terminaalisen osan (185 tähdettä) sisällä .

C. Dot-blot -määritys 20 Hyödynnettiin vaihtoehtoista sitoutumisaktiivisuu- den mittausmenetelmää, jossa nitroselluloosafilttereille adsorboitiin tmICAM-Ι, tICAM(453) tai tICAM(185), filttereillä olevat epäspesifiset sitoutumiskohdat tukittiin naudan seerumialbumiinilla (BSA) (10 mg/ml) ja filtterin 25 kanssa inkuboitiin radioaktiivista virusta tai 125I Mab-vas-ta-ainetta ICAM-l:lle 60 minuutin ajan 37 °C:een lämpötilassa. Filtterit pestiin puskurilla ja filttereillä valotettiin röntgenfilmi.

Filttereille sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä 30 määritettiin autoradiogrammien densitometrialla ja tulokset ilmaistaan HRV3:n sitoutumisena (keinotekoisina yksiköinä), jotka on normalisoitu täplään sitoutuneen ICAM:in määrään määrittämällä rinnakkain se 125I-monoklonaalisen vasta-aineen C78.4A tai c78.5A määrä, joka on sitoutunut 35 ICAM:iin (sitoutunut täplään). Tulokset esitetään taulukossa 3 .

« .27 105687

Taulukko 3 35S-HRV3:n sitoutuminen immobilisoituun ICAM:iin* 5 ICAM tICAM(453) ICAM/tICAM453 :n suhde 1,2 ± 1,1 0,52 ± 0,45 2,3

5:n kokeen keskiarvo. Tulokset ilmaistaan keinotekoisina densitometrisina yksikköinä: 35S-HRV3:n sitoutuminen/125I

10 anti-ICAM- monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen.

Lisätutkimukset tICAM 185:lie on aloitettu. Sitou-tumiskokeet ovat osoittaneet vastaavia tuloksia. Steerisen 15 eston odotetaan olevan osallisena. Viruksen koko on noin 30 nanometriä. tICAM(185):n pituus on alle 10 nanometriä. Väliryhmän tai kytkentäryhmän käyttö tarjoaisi helpomman saatavuuden sitoutumista varten.

Tämän kokeen tulokset osoittavat, että näissä mää-20 ritysolosuhteissa tICAM(453) kykenee sitoutumaan rhino-virukseen tasoin, jotka ovat vertailukelpoisia tmICAM-l:n kanssa, kun sitoutuneen viruksen määrä normalisoitiin sitoutuneen 125I-Mab -määrään. Lisäksi nämä tulokset osoittavat, että tlCAM-muodot kykenevät sitoutumaan rhinoviruk-25 seen, mutta sitoutumisaviditeetti riippuu tICAM:in konfi-„ guraatiosta. tmICAM-l__voi olla pieni multimeeri (todennä- köisesti dimeeri), ja tICAM:in esittely multimeerisessä muodossa jäljittelee tätä multimeerista konfiguraatiota.

Tätä hypoteesia tukevat todisteet tulevat kvantita-30 tiivisista sitoutumiskokeista (julkaisemattomia), joissa soluun sitoutumaan kykenevien rhinovirusten ja vasta-aine-molekyylien maksimimäärän suhde on noin 1,5, kuten yllä esitetään. Tämä on ristiriidassa Tomassini, J. , et al:n aikaisempaan työhön, J. Virol.. 58:290 (1986), joka ehdot-35 ti viiden molekyylin kompleksin olevan tarpeen sitoutumiselle. Heidän johtopäätöksensä perustui geelisuodatustu- 28 105687 losten virheelliseen tulkintaan, jossa ei osattu ottaa huomioon sitoutuneita detergenttimolekyylejä.

Esimerkki 8 CL203 IgG-vasta-aine-välitteinen tIGAM(453):n ris-5 tisitoutuminen

Jotta saataisiin lisätodisteita siitä, että tmICAM-1:n korkeampi suhteellinen sitoutumisaktiivisuus johtuu proteiinin multimeerisesta muodosta, tICAM(453)-proteiinia esi-inkuboitiin CL203:n, ICAM-l:n monoklonaali-10 sen vasta-aineen kanssa, joka ei estä viruksen sitoutumista ICAM-l:een ja sitoutuu kohtaan, joka on C-päässä tähteen 184 suhteen (Staunton, e£, ai., Cell. 56:849 (1989) ja Cell. 61:243 (1990). Täten vasta-aine voi tehokkaasti "muodostaa ristisidoksen" kahden tICAM(453)-molekyylin 15 välille, jolloin syntyy tICAM(453):n "dimeereitä", silti tukkimatta kunkin kahden tICAM(453)-molekyylin virusta sitovaa osaa. Kun testattiin kompetitiomäärityksessä CL203-IgG:n ja tICAM(453):n seosta painosuhteessa 4:1, havaittiin että vasta-aineella ristisidottu tICAM(453) 20 esti HRV3:n sitoutumisen 7,4 kertaa pienemmässä pitoisuu dessa kuin tICAM(453) yksin, mikä on yhtäpitävä sen ajatuksen kanssa, että tmICAM-1 sitoutuu korkeammalla affiniteetilla rhinovirukseen, koska se on dimeeri tai pieni multimeeri.

·' 25 Jotta saataisiin aikaan vaihtoehtoisia tICAM: in multimeerisia muotoja, muodostettiin useita muita muokattuja, lyhennettyjä ICAM-muotoja, kuten kuvataan yllä esimerkissä 3. Nämä muodot voidaan sitten tehdä multimeeri-siksi esimerkissä 9 alla kuvatulla tavalla.

30 Esimerkki 9

Transmenbraanisen ja ei-transxnembraanisen ICAM-l:n lyhennettyjen muotojen multimeerisiksi saattaminen

On olemassa useita tapoja, joilla tICAM voidaan muuttaa multimeerimuodoiksi, joilla on tehostunut virusta 35 sitova ja sitä neutraloiva kyky monomeerimuotoon verrat- • . 29 105687 tuna. Esimerkiksi tICAM(453) voidaan kytkeä inerttiin polymeeriin, kuten aminodekstraaniin (MP 40 000) käyttäen homobifunktionaalisia (kuten N-hydroksisukkinimidi (NHS) -estereitä) tai heterobifunktionaalisia (kuten niitä, jot-5 ka sisältävät NHS-esterin ja valolla aktivoitavia tai sulfhydryylin kanssa reagoivia ryhmiä) ristisidoksia muodostavia aineita, jotka käyttävät hyväkseen aminodekstraanin aminoryhmää ja tICAM:in pinnalla olevaa amino- tai muuta ryhmää. Monia esimerkkejä soveliaista, ristisidoksia 10 muodostavista aineista voidaan löytää Pierce Chemical Company -yhtiön tuoteluettelosta (Rockford, Illinois).

Koska tICAM reagoi huonosti NHS-esteriin pohjautuvien yhdisteiden kanssa, tICAM:illa, jolla olisi geeniteknologisin menetelmin käsitelty C-pään lysiinitähde 15 (katso esimerkki 3) , olisi parempi kytkeytymistehokkuus kantajiin homobifunktionaalisten reagenssien kanssa, kun taas geeniteknologisin menetelmin muokatuista C-pään kys-teiinitähteistä olisi apua heterobifunktionaalisia rea-gensseja, kuten sulfo-maleimidobentsoyyli-N-hydroksisukki-20 nimidiesteriä (MBS), käyttävässä kytkemisessä.

Vaihtoehtoisesti voidaan saada aikaan liukoisia tICAM-multimeereja tuomalla geeniteknologisin menetelmin reaktiivisia tähteitä tICAM:in C-pään loppuun. Voidaan ; esimerkiksi saada aikaan vapaita kysteiinitähteitä ·· 25 tICAM: in C-pään alueen suhteellisen hydrof iilisiin sek- vensseihin (joilla olisi suurempi taipumus kohdata liuotin) . On odotettavissa, että tämä sallisi dimeerien saamisen aikaan in situ.· vaihtoehtoisesti monomeereja voitaisiin puhdistaa ja dimeereja saada aikaan in vitro disulfi-30 dien vaihdon avulla.

Toinen lähestymistapa vaatii lysiinitähteiden sijoittamisen samanlaisiin kohtiin ja puhdistetun proteiinin ristisitomisen in vitro homobifunktionaalisilla NHS-este-reillä. Esimerkkejä sellaisista lysiinitähteistä ovat täh-35 teet 338, 360, 387.

30 105687

Kysteiinitähteiden ristisitominen toisiinsa voidaan saada aikaan saattamalla vapaita kysteiiniryhmiä sisältävä tICAM reagoimaan bis-maleimidoheksaanin (Pierce Chemical Co.) tai muiden bis-maleimido-analogien avulla. tICAM:in 5 pinnalla olevien vapaiden kysteiinitähteiden ristisitomi nen kantajamolekyylien pinnalla oleviin aminoryhmiin voidaan saada aikaan saattamalla se reagoimaan m-maleimido-bentsoyyli-N-hydroksisukkinimidiesterin kanssa. tICAM-mo-lekyylien pinnalla olevien aminoryhmien ristisitominen 10 voidaan saada aikaan homobifunktionaalisilla N-hydroksi- sukkinimidiestereillä (katso esimerkiksi Pierce Chemical Co. -yhtiön tuoteluottelo). Vaihtoehtoisesti tICAM:in pinnalla olevat hiilihydraattiryhmät voidaan hapettaa aldehy-deiksi ja kytkeä kantajamolekyylin pinnalla oleviin hyd-15 ratsiini-aktivoituihin aminoryhmiin.

Esimerkki 10

Transmembraanisen ja ei-transmembraanisen ICAM-l:n lyhennettyjen muotojen tartunnanaiheuttamiskyvyn neutra-lisaatiomääritys 20 On käytetty kolmea eri viruksen tartunnanaiheutta miskyvyn määritystä. Nämä eri määritykset ottavat huomioon erot transmembraanisen ja ei-transmembraanisen ICAM:in liukoisuuksissa.

A. Plakkien määrän vähenemistesti detergentin läs-··· 25 näollessa Tämän määrityksen tulokset osoittavat, mikä viruksen suurin laimennos vielä tehokkaasti tappaa soluja. Virusta esi-inkuboidaan transmembraanisen ICAM-proteiinin kanssa 0,1 % TX100:n läsnäollessa, laimennetaan sarjana 30 viljelyelatusaineeseen, inkuboidaan 30 minuutin ajan Hela-solujen kanssa (106 solua/ml), laimennetaan 10-kertaisesti ja maljataan 96-kaivoisen mikrotiitterilevyn useisiin kaivoihin, joissa on vaihtelevia viruskonsentraatioita. 0,1-prosenttista TX100:aa käytettiin positiivikontrollina. 5 35 päivän jälkeen kaivot merkitään muistiin joko infektoi- • . 31 105687 tuneina tai ei-infektoituneina solutuhovaikutuksen (CPE) läsnäolon perusteella ja tiitteri ilmaistaan alkuperäisen viruksen plakkeja muodostavina yksiköinä/ml (PFU/ml). Tämä määritys kuvattiin US-hakemuksessa sarjanumero 239 571 ja 5 sitä käytettiin osoittamaan tmICAM-l:n antiviraalinen vaikutus (joka vaatii detergentin läsnäolon pysyäkseen liuoksessa) . Käytettävä ICAM-proteiinin pitoisuus on esi-inku-baatioseoksessa oleva alkupitoisuus; ICAM-proteiini ei ole kuitenkaan jatkuvasti läsnä infektion aikana sikäli, että 10 proteiini laimennetaan sarjana. Vaikka detergentin läsnäolo vaaditaankin tmICAM:in liukoiseksi saattamiseen, detergentin läsnäolo tappaa soluja; täten laimennossarjat ovat tarpeen.

B. Plakkien määrän vähenemistästi ilman detergent- 15 tiä Tässä plakkien määrän vähenemistestissä, perin-teisemmässä määrityksessä, Hela-solut infektoidaan rhino-viruksen laimennossarjalla kuten yllä, mutta detergenttiä ei ole läsnä; täten tätä määritystä ei voida käyttää 20 tmICAM:in määrityksessä. Tässä määrityksessä tICAM on läs nä jatkuvasti viljelyelatusaineessa osoitettuna pitoisuutena. tmICAM-l:ia (joka vaatii detergentin läsnäolon) ei voida määrittää talla menetelmällä, koska tarvittavan detergentin lisäys tappaisi Hela-solut.

'/ 25 C. Plakkien määrän vähenemistesti viruksen ja ICAM:in ollessa jatkuvasti läsnä Tämä määritys on samanlainen kuin Marlinin, et ai. (Nature 1990) käyttämä, jossa Hela-soluviljelmä infektoidaan 100 PPU:lla^virusta ICAM-proteiinin ollessa läsnä 30 tai poissa ja sitä viljellään noin 4 päivää, kunnes solu-tuhovaikutus (CPE) on ilmeinen. Viljelmät merkitään sitten visuaalisesti muistiin CPE:n perusteella. Määritysolot olivat samat kuin Marlinilla yllä. Muistiinmerkitseminen tehtiin visuaalisesti pikemminkin kuin kristalliviolettia 35 käyttävällä värjäysmenetelmällä.

• 32 105687 Tässä määrityksessä detergenttiä ei ole läsnä, ICAM on jatkuvasti läsnä ja tämä määritys mittaa viruksen rep-likaation/lisääntymisen vähenemistä mielivaltaisessa aikapisteessä .

5 Tulokset näistä kolmesta erilaisesta viruksen tar- tunnanaiheuttamiskyvyn määrityksestä on esitetty yhteenvetona taulukossa 4.

Taulukko 4 10 IC 50 % (μΜ)*

ICAM Määritys: A B C

tmICAM-1 0,03 ND ND

tICAM(453) > 20 0,2 0,2

15 11CAM (185) > 20 ND ND

* IC 50 % on määritetty siksi ICAM-proteiinin kon- sentraatioksi, joka tarvitaan estämään HRV3:n tartun-nanaiheuttamiskykyä 50 %:lla.

20 Nämä tulokset osoittavat, että tmICAM-1 vähentää merkittävästi aktiivisemmin viruksen tartunnanaiheutta-miskykyä kuin lyhennetyt ICAM-proteiinit jopa silloin, 25 kun niitä verrataan eri määritysjärjestelmissä. Erot tICAM(453):n neutralisaatiokyvyssä määrityksessä (A) ja •määrityksessä (B) osoittavat, että tICAM(453)-välitteinen neutralisaatio vaatii tICAM(453):n jatkuvan läsnäolon vil-jelyelatusaineessa ja on palautuva. Neutralisaation palau-30 tuvuus käy ilmi neutralisaation puuttumisesta, joka havaittiin määrityksessä (A). tmICAM-l:n neutralisaatioak-tiivisuus on päinvastoin > 667 kertaa korkeampi kuin tICAM(453):n ja kuin tICAM(185):n määrityksessä (A) ja voisi jopa olla korkeampi määrityksessä (B) , jos olisi 35 mahdollista saada tmICAM-1 olemaan jatkuvasti läsnä vil-jelyelatusaineessa ilman detergenttiä.

Näiden tulosten vertailemiseksi Marlinin, et ai. tulosten kanssa yritettiin toistaa heidän määritysolosuh- « 33 105687 teensä. Kuten taulukossa 4 esitetään, määrityksen (B) ja määrityksen (C) tulosten välillä on hyvä korrelaatio, vaikkakin IC 50 % tTCAM(453) :lle on 10 kertaa suurempi kuin Marlinin, et ai. havaitsema. Jotta saataisiin määri-5 tettyä, johtuuko tämä käytetyn rhinoviruksen serotyypin erilaisuudesta, määritys toistettiin HRV14:llä ja HRV54:llä (Marlinin, et ai. käyttämä serotyyppi). IC 50 % näille molemmille serotyypeille oli 0,2 μΜ tICAM(453):ia, mikä osoitti ettei serotyyppiherkkyydessä ole eroa 10 HRV14:n, HRV54:n ja HRV3:n välillä.

Koetettaessa ratkaista tämä ristiriita käytettiin samoja puskureita, joita Mariin et ai. käyttivät, jotta nähtäisiin vaikuttivatko ne rhinoviruksen tartunnanaiheut-tamiskykyyn määrityksessä (C). Mariin et ai. valmistivat 15 sICAM-l-proteiininsa puskuriin, joka sisälsi 50 mM trieta-noliamiinia (TEA)/20 mM Tris. Kun tätä puskuria yksin lisättiin kontrolli-infektioihin (l/10-osa, lopullinen kon-sentraatio 5 mM TEA/2 mM Tris) HRV3:11a ja HRV14:llä, havaittiin lähes täydellinen CPE:n esto. Täten on mahdollis-20 ta, että viruksen replikaatioon voisi liittyä puskurin aikaansaamia vaikutuksia, jotka eivät liity minkään ICAM-muodon läsnäoloon.

Esimerkki 11 ICAM-l:n transmembraanisten ja lyhennettyjen multi-25 meerimuotojen käyttö ICAM/LFA-1 -vuorovaikutuksen tehokkaina estäjinä ICAM-1:n normaali tehtävä on toimia leukosyytti-integriini LFA-l:n ligandina; näiden kahden molekyylin välinen vuorovaikutus johtaa imusolujen ja monien muiden 30 solujen väliseen adheesioon. tICAM(453):n kykyä estää - ICAM-l:n ja LFA-1:n välinen adheesio solujen pinnalla tut kittiin seuraavasti,. .ICAM-1 adsorboitiin mikrotiitterile-vyihin esimerkissä 7C, kuvatulla tavalla. JY-solut, jotka ilmentävät LFA-1:ta, tarttuvat ICAM:ia ilmentäviin solui-35 hin tai ICAM-1:ll_ä_ päällystettyihin viljelymaljoihin 105687 34 (Staunton, gt ai, JCB) . JY-soluja esi-inkuboitiin tICAM(453):n ollessa läsnä tai poissa 30:n minuutin ajan 37 °C:een lämpötilassa ja lisättiin sitten ICAM-l:llä päällystettyille maljoille ja inkuboitiin 60 minuutin ajan 5 37°C:een lämpötilassa. Sitten mikrotiitterilevyt pestiin ja maljoille kiinnittyneiden solujen lukumäärä laskettiin.

Taulukko 5

Liukoisen ICAM:in aikaansaama LFA-l/IGAM-l-vuorovaikutuk-10 sen esto tICAM(453) (pg/ml) % kontrollisolujen sitoutumisesta* 100 100 96 15 300 93 600 75 * Sitoutuminen ICAM-l:llä päällystetyille mikrotiitteri-levyille; 10 μg/ml anti-LFA-1- tai anti-ICAM-l-monoklonaa-20 lista vasta-ainetta vähensi sitoutumisen < 1 prosenttiin.

Kuten taulukosta 5 voidaan nähdä, JY-solujen sitoutumisen estymisen havaittiin olevan vähäistä jopa korkeissakin tICAM(453):n pitoisuuksissa (0,6 mg/ml). Tämä johtuu todennäköisesti siitä seikasta, että solujen väli-25 nen adheesio on hyvin yhteistoiminnallinen prosessi, johon osallistuu tuhansia molekyylejä ja tICAM(453):n affiniteetti on alhainen. tICAM(453) :n tai tICAM(185) :n esittely multimeerisessä konfiguraatiossa lisäisi tICAMrin affiniteettia soluja kohtaan ja kykenisi palvelemaan tehokkaana 30 adheesiota estävänä aineena tulehdus- tai autoimmuunitau deissa.

t

Edellä mainitut esimerkit kuvaavat tICAM:in liukoisten, multimeeristen muotojen luomista, jotka lisäävät merkittävästi tICAM-l:n sitoutumista ja neutralisaatioky-3 5 kyä.

• 35 105687

Vaikka tämä keksintö on kuvattu spesifisten menetelmien ja koostumusten muodossa, ymmärretään että ämmät-timiehille ilmaantuu muunnelmia ja muunnoksia tätä keksintöä ajateltaessa.

5 Esimerkiksi on odotettavissa, että ICAM-l:stä joh detut pienemmät proteiinifragmentit ja peptidit, jotka edelleen sisältävät virusta sitovan kohdan, olisivat myös tehokkaita multimeerisessä konfiguraatiossa. On myös odotettavissa, että multimeerinen ICAM voi olla ICAM-l/LFA-1-10 vuorovaikutuksen tehokas inhibiittori, koska näiden kahden molekyylin välinen affiniteetti on varsin alhainen ja näiden kahden molekyylin välittämä solu-solu -sitoutuminen on hyvin yhteistoiminnallinen.

Vaikkakin edullinen muoto ja konfiguraatio on ei-15 transmembraaninen (lyhennetty) ICAM dimeerisessä konfiguraatiossa, sen ei ole tarkoitus estää muiden sellaisten muotojen ja konfiguraatioiden, jotka sitovat virusta tehokkaasti ja neutraloivat tehokkaasti viruksen aktiivisuutta, mukanaoloa tämän keksinnön suoja-alassa.

20 Lisäksi on odotettavissa, että keksinnön yleistä menetelmää, jolla valmistetaan liukoisia proteiinimuotoja ei-liukoisista, normaalisti solukalvoihin sitoutuneista reseptoriproteiineista, voidaan käyttää valmistamaan liukoisia, multimeerisia muotoja muista reseptoriproteiineis-25 ta, jotka hyödyllisellä tavalla sitoutuvat ja vähentävät sellaisten virusten tartunnanaiheuttamiskykyä, jotka eivät kuulu niihin, jotka sitoutuvat "pääryhmäreseptoriin". Sellaisiin muihin viruksiin kuuluvat polio-, Herpes Simplex-ja Epstein-Barr -virus.

30 On odotettavissa, että ammattimiehille ilmaantuu useita muunnoksia ja muunnelmia yllä havainnollisissa esimerkeissä kuvatusta keksinnöstä, ja vastaavasti sille pitäisi asettaa vain sellaisia rajoituksia, jotka ilmenevät mukana olevissa patenttivaatimuksissa.

105687 36

Niinpä mukana olevissa patenttivaatimuksissa on tarkoitus kattaa kaikki sellaiset ekvivalentit muunnelmat, jotka kuuluvat patenttivaatimusten mukaiseen keksinnön suoja-alaan.

Claims (17)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen multi-meerin valmistamiseksi, joka sisältää kaksi tai useampia 5 monomeerejä, jotka valitaan toisistaan riippumatta ryhmästä, joka koostuu solujen välistä adheesiota välittävästä molekyyli-1:stä, ICAM-l:stä ja sen fragmenteistä, tunnettu siitä, että monomeerit kytketään suoraan ainakin yhden kovalenttisen sidoksen kautta tai epäsuorasti ainakin 10 yhden kemiallisen tai mekaanisen kytkentäaineen kautta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että fragmentti on ICAM, josta olennaisesti puuttuu solunsisäinen karboksyyliosa ja hydrofobinen solukalvossa sijaitseva osa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fragmentti on tICAM(453) tai tICAM(185).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ICAM:ia muokataan joko karbok- 20 syylipäästä tai aminopäästä, jolloin multimeerisen ICAM:in muodostus tehostuu.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muokkaus käsittää lysiinin lisäyksen karboksyylipäähän. . 25

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muokkaus käsittää vapaan kys-teiinin lisäyksen karboksyylipäähän.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että multimeeriseen konfiguraatioon 30 kuuluu dimeerinen muoto.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että multimeerinen konfiguraatio sisältää ensimmäisen ICAM:in, joka on liitetty ristisidok-sin toiseen ICAM:iin. * m 105687

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että multimeerinen konfiguraatio sisältää ICAM:in, joka on adsorboitu kantajaan multimeeri-sen konfiguraation aikaansaamiseksi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja on suurimolekyylipai-noinen ja olennaisesti inertti polymeeri.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polymeeri on inertti polymeeri 10 ja on nitroselluloosa, PVDF, DEAE, lipidipolymeeri tai ami-nodekstraani.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että multimeerinen ICAM saatetaan multimeeriseksi liittämällä se jäseneen.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jäsen on vasta-aine, proteii-nikantaja tai ristisidoksia muodostava reagenssi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ristisidoksia muodostava rea- 20 genssi on heterobifunktionaalinen tai homobifunktionaalinen ristisidoksia muodostava reagenssi.

15. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinikantaja on albumiini tai proteoglykaani.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on anti-ICAM-vasta-aine CL 203.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on ihmisen rhinovirus, 30 pääryhmäreseptorivirus, imusoluun liittyvä antigeeni-1 (LFA-1) tai Plasmodium falciparum. 105687 ' 39 Patentkrav