JPH04297499A - ヒトライノウイルスレセプタ蛋白質の多量体形態 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本発明は、ヒトのライノウイルスと有効
に結合しそしてＨＲＶ感染力を有効に減少させることが
できるところの、新規な多量体配置および形態の細胞内
粘着分子（ＩＣＡＭ）（これらの蛋白質の短縮されてい
ない形態および切形の形態を含む）に関する。

【０００２】ヒトのライノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）
としても知られている短縮されていないＩＣＡＭは、ト
ランスメンブランＩＣＡＭ（ｔｍＩＣＡＭ−１）と呼ば
れており、切形ＩＣＡＭ（ｔＩＣＡＭ）としても知られ
ている非トランスメンブランＩＣＡＭは、短縮されてい
る。多量体配置にあり、好適には二量体として存在して
いる場合、これらの蛋白質は、ヒトのライノウイルス（
ＨＲＶ）の結合を増強し、そしてＨＲＶ感染力を減少さ
せることができる。更に、これらの多量化された蛋白質
はまた、「主要」群のヒトのライノウイルスレセプタ（
ＨＲＲ）、例えばコクサッキーＡウイルスと結合するこ
とが知られている他のウイルスの感染力を減少させるた
めにも用いられ、そしてまた、免疫学的応答に関連して
いる数多くの細胞粘着工程にとって重要なところの、ト
ランスメンブラン細胞内粘着物質（ｔｍＩＣＡＭ）とリ
ンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）との相互作用を
防止するためにも使用され得る。最後に、これらの多量
化された蛋白質は、特にこの相互作用に影響を与えるこ
とを意図した他の薬剤の設計に関するＩＣＡＭ−１／Ｈ
ＲＶ相互作用の研究のために用いられてもよい。

【０００３】ヒトのライノウイルスは、通常の風邪の原
因となる主要な仲介物である。それらはピコルナウイル
ス科に属し、そしてそれらが結合する宿主細胞のレセプ
タを基準にして分類され得る。Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ他、
Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．、　５８：　２９０　（１９８６）
には、ヒトのライノウイルスの細胞付着に関連している
レセプタ蛋白質の単離が報告されている。１１５個以上
の血細型のライノウイルス並びに数種のコクサッキーＡ
ウイルスの約９０％は、「主要」ヒトライノウイルスレ
セプタ（ＨＲＲ）として呼ばれている単一の通常レセプ
タと結合し、残りの１０％は他の１種以上の細胞レセプ
タと結合する。

【０００４】最近、この共発明者Ｇｒｅｖｅ、　Ｊ．他
による共著のＣｅｌｌ、　５６：８３９　（１９８９）
において、９５，０００ダルトンの見掛け分子質量を有
し、そして前述した細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ−１）と
呼ばれている細胞表面蛋白質のヌクレオチド配列から推
論されるアミノ酸配列と本質的に同一なアミノ配列を有
する糖蛋白質として、該主要ＨＲＲを同定した。Ｓｉｍ
ｍｏｎｓ、　Ｄ他、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：６２４　（
１９８８）。Ｓｔａｕｎｔｏｎ、他、Ｃｅｌｌ、　５２
：９２５−９３３　（１９８８）。続いて、Ｓｔａｕｎ
ｔｏｎ、　Ｄ．Ｅ．他、Ｃｅｌｌ、　５６：８４９（１
９８９）において、ＩＣＡＭ−１がＨＲＶのための主要
な表面レセプタであることを確認した。Ｓｔａｕｎｔｏ
ｎ、他、Ｃｅｌｌ、　６１：２４３−２５４　（１９９
０）も参照。

【０００５】ＩＣＡＭ−１は、長さが全体を構成するメ
ンブラン蛋白質５０５アミノ酸であり、そしてｉ）この
アミノ酸末端に５個の免疫グロブリン様細胞外ドメイン
（アミノ酸残基１〜４５３）、ｉｉ）疎水性トランスメ
ンブランドメイン（４５４〜４７７）、およｉｉｉ）カ
ルボキシ末端に短い細胞質ドメイン（４７８〜５０５）
を有している。ＩＣＡＭ−１は、免疫グロブリン超遺伝
子系の１員であり、そして白血球分子のためのリガンド
、リンパ球機能関連分子−１（ＬＦＡ−１）、インテグ
リン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）系の１員として機能する。Ｉ
ＣＡＭ−１に対するＬＦＡ−１の異型結合は、多様な細
胞種の細胞粘着をもたらし、そしてこれは、幅広い範囲
の免疫相互作用において重要であり、そして炎症応答中
のシトキンによるＩＣＡＭ−１発現を誘発させることに
よって、炎症部位に対する白血球の局在化が調節され得
る。 ＩＣＡＭ−１の主要構造は、２つの細胞粘着分子、即ち
神経細胞粘着分子（ＮＣＡＭ）およびミエリン関連糖蛋
白質（ＭＡＧ）と同族であることが見いだされた。

【０００６】一般的なウイルス、特にライノウイルスの
感染力を減少させるための研究のいくつかの方法には、
次のものが含まれる：ｉ）細胞に対するウイルスの結合
を防止する用途のための、細胞表面レセプタに対する抗
体の開発、ｉｉ）宿主細胞中の抗ウイルス状態を促進す
るためのインターフェロンの使用、ｉｉｉ）ウイルスの
複製を抑制するための種々の薬剤の開発、ｉｖ）ウイル
スカプシド蛋白質／ペプチドに対する抗体の開発、そし
てｖ）単離した細胞表面レセプタ蛋白質を用いたウイル
ス感染の防止（これは特に、細胞表面レセプタのウイル
ス結合ドメインを妨害するものである）。

【０００７】この最後の方法を用いた上記Ｇｒｅｖｅ、
　他、　Ｃｅｌｌ、　５６：８７９　（１９８９）には
、精製したｔｍＩＣＡＭ−１をインビトロでライノウイ
ルスＨＲＶ３に結合させることができたと報告されてい
る。ＨＲＶ２、ＨＲＶ３、およびＨＲＶ１４を用いた未
公開の結果は、特に、ＩＣＡＭ−１を以下で更に考察す
るような特別な形態および立体配置で供給する条件下で
結合化研究を行う場合、ライノウイルスに対する結合能
力と、ライノウイルスを中和する能力との間に正の相関
関係があることを明らかに示している。ＨＲＶ１４およ
びＨＲＶ２を用いた結果（未公開）は、ウイルスのレセ
プタの種類と、インビトロでｔｍＩＣＡＭ−１に結合す
る能力との間に正の相関関係があることを明らかに示し
ている。即ち、主要レセプタであるＩＣＡＭ−１は、Ｈ
ＲＶ３、ＨＲＶ４、および他の「主要」レセプタ抗原型
と結合でき、そしてそれらを中和できるが、一方それは
、ＨＲＶ２、即ち「少数」レセプタ抗原型とは結合する
こともなく、それを中和することもない。精製したｔｍ
ＩＣＡＭ−１を用いた更に一層の試験（未公開）は、ラ
イノウイルスを予めｔｍＩＣＡＭ−１で処理したとき、
プラーク減少定量法においてライノウイルスの感染を有
効に抑制（１０ｎＭレセプタでタイターの５０％の減少
、および１００ｎＭレセプタ蛋白質でタイターの１ログ
の減少）することを明らかに示している。これらのデー
タは、１０ｎＭの見掛け解離定数を有するヒーラー細胞
のＩＣＡＭ−１に対するライノウイルスの親和力と一致
しており、そしてこれは、このウイルスに対する該レセ
プタの結合能力と、該ウイルスを中和する能力との間に
直接の関係があることを示していた。

【０００８】ｔｍＩＣＡＭ−１の大規模生産は現在のと
ころ商業的には不可能であるため、更に活性を示す形態
でｔｍＩＣＡＭ−１を維持するためには界面活性剤の使
用が必要であるため、ライノウイルス抑制因子としての
使用のためのレセプタ蛋白質製造の代替手段が望まれて
いる。切形ＩＣＡＭ−１分子を生産させるため遺伝学的
に変質させたｔｍＩＣＡＭ−１　ｃＤＮＡ遺伝子の形態
が開発された（並びに、発現生成物を生産する細胞系：
Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　３９０，６６２）。これらの切形形
態のＩＣＡＭ−１（ｔＩＣＡＭ（４５３））および（ｔ
ＩＣＡＭ（１８５））は、該トランスメンブラン領域が
欠失しており、そして細胞培地中に分泌される。それら
は、上記Ｇｒｅｖｅ、　他、　Ｃｅｌｌ、　５６：８７
９　（１９８９）中に記述されている定量法においてラ
イノウイルスと結合するが、しかしながら、ｔｍＩＣＡ
Ｍ−１に比較して本質的に減少したレベルである。従っ
て、ライノウイルス感染の抑制因子としてのそれらの有
効性は、ｔｍＩＣＡＭ−１のそれよりも低いと考えられ
る。一般的に、共出願中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　１３０，
３７８、　Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　２３９，５７０、　Ｕ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．　２６２，４２８、　Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　
２３９，５７１およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　３９０，６６
２参照。

【０００９】１９８８年９月１日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ
．　２３９，５７１およびそのＣＩＰ出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．
Ｎ．　２６２，４２８およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　３９０
，６６２は、溶液中にトランスメンブラン蛋白質を維持
するため非イオン系界面活性剤を用いたライノウイルス
感染の抑制因子としてのトランスメンブランライノウイ
ルスレセプタの使用を意図したものであり、更にトラン
スメンブラン細胞内粘着分子（ｔｍＩＣＡＭ）の細胞外
ドメイン１、２および３を有し、そして切形形態が可溶
化のための非イオン系界面活性剤の存在を必要としない
ところの、切形細胞内粘着分子（ｔＩＣＡＭ）を意図し
たものであり、そして１９８７年１２月８日出願のＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．　１３０，３７８およびそのＣＩＰ出願Ｕ
．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　２６２，５７０は、主要ライノウイル
スレセプタ（ＨＲＲ）を発現する移入された細胞系、お
よび細胞内粘着分子としてのＨＲＲの同定を意図したも
のであり、そして１９８９年１月２４日出願のＵ．Ｓ．
Ｓ．Ｎ．　３０１，１９２およびそのＣＩＰ出願Ｕ．Ｓ
．Ｓ．Ｎ．　４４９，３５６は、ｔｍＩＣＡＭに関連し
ているがｔｍＩＣＡＭとは異なる天然に存在する可溶Ｉ
ＣＡＭ（ｓＩＣＡＭ）（このｓＩＣＡＭは、該トランス
メンブラン領域および細胞質領域に伸びているアミノ酸
が欠失しており、更に、このｓＩＣＡＭはそのＣ末端に
１１個のアミノ酸から成る新規な配列を有している）を
意図したものである。次に、Ｍａｒｌｉｎ、　Ｓ．Ｄ．
、他、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：７０　（１９９０）には
、可溶切形形態の、通常にメンブランと結合しているＩ
ＣＡＭ−１分子（彼らは、これをｓＩＣＡＭ−１と呼ん
でいる）の建造および精製が報告されている。これは、
トランスメンブランドメインと、欠失した蛋白質を有す
る細胞質ドメインの両方を有しており、そしてこれは、
そのカルボキシル末端が控え目に単一置換されているこ
とで、野生型のアミノ酸配列とは異なっている。これは
、ＩＣＡＭ−１の残基１−４５２と、Ｃ末端の新規なフ
ェニルアラニン残基とを有している。これらの研究者達
は、細胞とＨＲＶ１４ウイルスとが結合するのを防止す
るためはｓＩＣＡＭ−１が＞５０μｇ／ｍＬのレベルで
必要であることを示した。しかしながら、彼らはまた、
培地中に一定して存在している場合、１μｇ／ｍＬ（１
８ｎＭ）のｓＩＣＡＭ−１がＨＲＶ５４による感染の進
行を５０％まで抑制できることも見い出した。この抑制
活性は、このウイルスのレセプタの種類と関連していた
（しかしながら、ここでは、ポリオウイルスまたはＨＲ
Ｖ２ではなくコクサッキーＡ１３が抑制され、そしてＨ
ＲＶ１４に関する感染力データは報告されていなかった
）。このように、彼らは、結合と感染力抑制との間の直
接の相関関係を示していなかった。更に、下記により詳
しく考察するように、Ｍａｒｌｉｎ、他が得た結果を再
現する試みは不成功に終わり、そしてこのことは、ウイ
ルスのタイターを５０％減少させるためには、より高い
濃度の切形形態のＩＣＡＭ（トランスメンブランＩＣＡ
Ｍよりも１０倍高い）が必要であることを示唆している
。

【００１０】今日まで、誰も、ｔｍＩＣＡＭ−１と同じ
程有効に、ヒトのライノウイルスと結合しそしてその感
染力を有効に減少させる（単離された細胞表面レセプタ
蛋白質を用いたウイルス感染の防止による）薬剤を示す
ことはできなかった、従って、本分野では、ヒトのライ
ノウイルスに対して有効に結合でき、そしてＨＲＶ感染
力を有効に減少させることができる形態のＩＣＡＭ−１
に対する必要性が継続して存在している。

【００１１】

【発明の簡単な要約】本発明は、多量体配置のトランス
メンブランＩＣＡＭ（ｔｍＩＣＡＭ−１）、並びに多量
体配置の非トランスメンブランＩＣＡＭ（ｔＩＣＡＭ）
を提供するものである。非トランスメンブランＩＣＡＭ
は切形ＩＣＡＭ、即ち本質的にカルボキシル細胞内ドメ
インを有していなくそして疎水性メンブランドメインを
有していないＩＣＡＭとしても知られており、そしてこ
れには、ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８
５）の形態が含まれるが、これに限定されるものではな
い。ＩＣＡＭの非トランスメンブラン形態は、連結を容
易にするＩＣＡＭの官能誘導体およびｔＩＣＡＭのミュ
ーテイン（ｍｕｔｅｉｎ）形態を含むことができる。こ
の切形ＩＣＡＭ形態が多量体配置にあり、好適には二量
体として存在している場合、これらはヒトのライノウイ
ルスの結合を増強し、そしてウイルスの感染を減少させ
ることができる。このＩＣＡＭの異なる形態、即ちトラ
ンスメンブランおよび非トランスメンブランは、支持体
に吸着させることによって多量化できる。この支持体は
、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリマ
ー類、並びにアミノデキストラン、或はスペーサーまた
はリンカーの有無に拘らず、ｔＩＣＡＭを吸着できるか
或はｔＩＣＡＭと連結できる種々の不活性ポリマー類か
らできていてもよい。

【００１２】多量体ＩＣＡＭはまた、このＩＣＡＭを、
例えば抗体、蛋白質担体、或は架橋剤と連結させること
によって多量化できる。抗体の例には、抗ＩＣＡＭ抗体
、ＣＬ　２０３が含まれ、適切な蛋白質担体にはアルブ
ミンおよびプロテオグリカン類が含まれ、そして適切な
架橋剤にはヘテロ二官能およびホモ二官能架橋剤、例え
ば二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、イミド
エステル、またはビス−マレイミドヘキサン類が含まれ
る。連結を容易にするため、このＩＣＡＭは、反応活性
を示すアミノ酸残基、例えばリジン、システイン、或は
連結を容易にする部位（類）を与える他のアミノ酸残基
（類）を用いて、カルボキシル末端またはアミノ末端の
どちらかを修飾することができる。これらの種類の修飾
されたＩＣＡＭはミューテインと呼ばれる。加うるに、
このＩＣＡＭは、どちらかの末端を修飾して、オリゴマ
ーミセルの形成を促進させることのできる脂質を含有す
ることができる。多量体ＩＣＡＭを構成するこのＩＣＡ
Ｍは、完全グリコシル化または部分グリコシル化させる
か、或は非グリコシル化であり得る。

【００１３】本発明はまた、リガンド、即ちヒトのライ
ノウイルス、および「主要」群レセプタウイルス類、リ
ンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、熱帯マラリア
原虫（マラリア）などに対するＩＣＡＭおよびそれらの
機能誘導体の結合を増強させるための方法（ここで、こ
のＩＣＡＭは、ある形態およびある立体配置で、該リガ
ンドに供給され、そしてここで、該リガンドに対する該
ＩＣＡＭの結合が増強される）を提供するものである。 このＩＣＡＭの形態は、トランスメンブランまたは非ト
ランスメンブラン（切形）のどちらかであり得る。切形
ＩＣＡＭは、本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有
していなくそして疎水性メンブランドメインを有してい
ないＩＣＡＭである。ＩＣＡＭの好適な切形形態には、
ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）が含
まれる。このＩＣＡＭは、そのカルボキシル末端または
アミノ末端のどちらかを修飾して、多量体ＩＣＡＭの形
成を増強させることができる。これらの修飾には、反応
性を示すアミノ酸残基、例えばリジン、システイン、或
は連結を容易にさせるための部位（類）を与える他のア
ミノ酸残基（類）の付加が含まれる。この方法のＩＣＡ
Ｍのためのヌクレオチド配列は、ベクター、例えばプラ
スミド中に含有させることができ、そしてこのベクター
を宿主細胞、例えば真核もしくは原核細胞に導入するこ
とができる。好適な真核細胞は、哺乳動物の細胞、即ち
チャイニーズハムスター卵巣細胞であり、好適な原核細
胞は大腸菌である。

【００１４】この方法のＩＣＡＭの好適な立体配置は、
多量体であり、二量体が最も好適である。この多量体配
置は、第２ＩＣＡＭと架橋した第１ＩＣＡＭから成るか
、或はＩＣＡＭを支持体に吸着させ、それによって多量
体配置を生じさせることから成なっていてもよい。この
支持体は、高分子量の本質的に不活性なポリマー類、例
えばニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリ
マー類、並びにアミノデキストラン、或はスペーサーま
たはリンカーの有無に拘らず、ＩＣＡＭを吸着できるか
或はＩＣＡＭと連結できる種々のポリマー類であっても
よい。この多量体ＩＣＡＭは、例えば抗体、蛋白質担体
、または架橋剤と連結させることによって多量化できる
。好適な架橋剤には、ヘテロ二官能およびホモ二官能架
橋剤、例えば二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステ
ル、イミドエステル、ビス−マレイミドヘキサン類が含
まれ、好適な蛋白質担体には、アルブミンおよびプロテ
オグリカンが含まれ、好適な抗体の例にはＣＬ　２０３
、およびＨＲＶ結合を妨げないいかなる他の抗体も含ま
れる。

【００１５】本発明はまた、薬学的に許容される溶媒、
希釈剤、補助剤または担体を含有し、そして活性材料と
して、ヒトのライノウイルスへの結合活性およびウイル
ス感染の減少活性を有することによって特徴づけられる
有効量のポリペプチドを含有している新規な薬学的組成
物を提供するものである。

【００１６】本発明の他の面および利点は、本発明を実
施するための数多くの説明的実施例を含む下記の詳細な
説明を考慮するとき明らかになるであろう。

【００１７】

【詳細な説明】

上に示したように、哺乳動物細胞から単離されたｔｍＩ
ＣＡＭ−１は、主要レセプタ群に属するヒトのライノウ
イルス類を中和する能力を有しているが、しかしそれは
、界面活性剤の入っている溶液中に保持されている場合
のみである。ＩＣＡＭ−１の特定の可溶フラグメントは
ウイルスとの結合に対して減少した能力を有しており、
そしてｔｍＩＣＡＭ−１と同じ程有効には感染力を減少
させないことを見い出した。今日まで、誰も、この減少
した能力の理由を確かめることは出来なかった。

【００１８】他の人達によって、ライノウイルスのレセ
プタが五量体の形態で細胞上に存在しているとの提案が
なされた。Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ、　Ｊ．　およびＣｏｌ
ｏｎｎｏ、　Ｒ．、Ｖｉｒｏｌ．、　５８：２９０−２
９５　（１９８６）。しかしながら、ヒーラー細胞と結
合しているライノウイルスおよび抗ＩＣＡＭ−１単クロ
ーン抗体の定量（この共発明者の未公開結果）は、細胞
１個当たり最高で３０，０００ビリオン結合（３５Ｓメ
チオニン標識したＨＲＶの結合により測定）であり、そ
して細胞１個当たり５０，０００〜６０，０００個のＩ
ＣＡＭ−１分子（ＩＣＡＭ−１と、放射能標識したＭａ
ｂの結合により測定）であることがわかった。これらの
結果により、更に、細胞の表面上のＩＣＡＭ−１分子が
、細胞に結合しているＨＲＶ粒子に対して５個というよ
りはむしろ、１および２個のみが結合する可能性がある
ことを試験する研究を促進させた。Ｃ末端トランスメン
ブランドメインが欠失しており、そして哺乳動物細胞の
培地中に分泌させられるところの、遺伝子工学で製造し
た形態の切形ＩＣＡＭ−１を、組換遺伝子を用いて移入
した。そのための遺伝子を用いて安定に移入させた細胞
の消費培地からの、該分泌されたＩＣＡＭ分子の２つ、
即ちｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）
の精製を以下に説明する。溶液−ＨＲＶ結合定量法にお
いて、そしてＨＲＶ中和定量法において、ｔＩＣＡＭ（
４５３）は、ｔｍＩＣＡＭ−１に比較して、ＨＲＶに対
して本質的に減少した（約２００倍）親和性を有するこ
とを見い出した。しかしながら、ｔｍＩＣＡＭ−１、或
はｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）の
いずれかを、最初に、数多くの不溶支持体、例えばニト
ロセルロース、ＰＶＤＦ（二フッ化ポリビニリデン）、
またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）メンブランの
いずれか１つに吸着させ、そして次に、放射性ＨＲＶと
一緒に培養すると、ｔＩＣＡＭ（４５３）のウイルス結
合活性がｔｍＩＣＡＭ−１のそれに匹敵するようになる
。 ＨＲＶに対する多量体ｔＩＣＡＭ（４５３）、或は多量
体ｔＩＣＡＭ（１８５）のこの結合は、ヒーラー細胞上
のＩＣＡＭ−１に対するＨＲＶの結合と同様の特性を有
しており、即ち、これは抗ＩＣＡＭ−１　Ｍａｂで抑制
され、そしてこれは主要レセプタ群のライノウイルスに
とって特異的であり、並びにこれは、細胞に対するライ
ノウイルスの結合と同様な温度依存性を有している（即
ち、３７℃で良く結合し、そして４℃では検出できない
）。

【００１９】ここで用いるところの下記に示す省略形お
よび言葉には下記の定義が含まれているが、必ずしもこ
れに限定されるものではない。

【００２０】 省略形　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　定義
ＩＣＡＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　細胞内
粘着分子　　−　　この蛋白質の短縮されていな　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　い（
トランスメンブラン）および切形（非トランス　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　メンブ
ラン）形態の両方を示すために用いられても　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　よい。

【００２１】 ＩＣＡＭ−１　　　　　　　　　　　　　　細胞内粘着
分子−１、またＩＣＡＭ、ｔｍＩＣＡＭ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−１としても
知られている；短縮されていないトラ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ンスメンブラン
蛋白質を示す。

【００２２】 ｔｍＩＣＡＭ−１　　　　　　　　　　トランスメンブ
ラン細胞内粘着分子−１、またヒト　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　のライノウイルス
レセプタ（ＨＲＲ）としても知ら　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　れている　　−　　
可溶化のため、例えば界面活性剤条　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　件が必要とされる
。

【００２３】 ｓＩＣＡＭ−１　　　　　　　　　　　　トランスメン
ブランと、欠失しているＩＣＡＭ−１　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　の細胞質ドメイ
ンの両方を有している天然に存在す　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　る可溶ＩＣＡＭ−
１；アミノ酸１〜４４２と１１個　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　の新規アミノ酸；フ
ェニルアラリンで置き換えられ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　た末端チロシンを有す
るアミノ酸１〜４５３を含有　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　するｔＩＣＡＭ４５３（
Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　他）から区別さ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　れ得る。

【００２４】 ｔＩＣＡＭ　　　　　　　　　　　　　　　　切形細胞
内粘着分子、非トランスメンブランＩＣＡ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｍとしても
知られている。

【００２５】 ｔＩＣＡＭ（４５３）　　　　　　ＩＣＡＭの切形形態
　　−　　ＩＣＡＭの細胞外アミノ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　末端ドメイン；ト
ランスメンブランドメインと、欠　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　失しているＩＣＡＭ
−１の細胞質ドメインとを有し　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ている；Ｍａｒｌｉｎ
、　他はまた、ｓＩＣＡＭ−１と呼ん　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　でいる。

【００２６】 ｔＩＣＡＭ（１８５）　　　　　　ＩＣＡＭの切形形態
　　−　　トランスメンブランドメ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　インと、欠失して
いるＩＣＡＭ−１の細胞質ドメイ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ンとを有するＩＣＡ
Ｍの細胞外アミノ末端ドメイン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　。

【００２７】「多量化」および「多量体」は、二量化お
よび二量体に限定されるものではなく、これにはＩＣＡ
Ｍ−１分子のいかなる多量体配置、或はウイルスの結合
および感染力の減少に有効なそれらのフラグメントも含
まれる。

【００２８】「トランスメンブラン」は、一般に、疎水
性メンブランに伸びている配列を有しており、そして結
合したメンブランであるＩＣＡＭ−１蛋白質分子の形態
を意味している。

【００２９】「非トランスメンブラン」は、一般に、結
合したメンブランというよりはむしろ、可溶蛋白質とし
て細胞培地中に分泌される蛋白質のいわゆる「切形」形
態、並びに非イオン系界面活性剤中に細胞を溶解するこ
とによって細胞メンブランから可溶化された「トランス
メンブラン」形態を含むＩＣＡＭ−１蛋白質の可溶形態
を意味している。

【００３０】「切形」には、一般に、ＩＣＡＭの短縮さ
れていないトランスメンブラン形態以下のいかなる蛋白
質形態も含まれる。

【００３１】「形態」は、一般にここでは、短縮されて
いない（全長）ＩＣＡＭ形態と、部分的な長さ（部分長
）ＩＣＡＭ形態とを区別するために用い、一方、「（立
体）配置」は、一般に、可能なＩＣＡＭ形態の単量体、
二量体、および多量体配置を区別するために用いる。

【００３２】ＩＣＡＭ−１分子の全ての形態および立体
配置は、単量体または多量体に拘らず、そしてミューテ
インを含む、その全長またはフラグメントに拘らず、こ
の分子が、ウイルスの結合および感染力の減少において
有効性を保持している限り、完全にもしくは部分的にグ
リコシル化されていてもよいか、或は完全に非グリコシ
ル化であってもよい。

【００３３】「リガンド」は、一般にここでは、ＩＣＡ
Ｍの形態および立体配置のいずれかの少なくとも１つと
結合できる何かを含むために用いられ、そしてこれには
、限定されるものではないが、ヒトのライノウイルス、
「主要」群のヒトライノウイルスレセプタと結合する他
のウイルス、リンパ球機能関連抗原−１、および熱帯マ
ラリヤ原虫（マラリヤ）が含まれる。

【００３４】そして、「ヒトのライノウイルス」には、
一般に、Ｈａｍｐａｒｉａｎ、　Ｖ．、　他、Ｖｉｒｏ
ｌ．、　１５９：１９１−１９２　（１９８７）で分類
されているような全てのヒト血細型のヒトライノウイル
スが含まれる。

【００３５】下記の実施例は本発明の実施を説明するも
のである。

【００３６】実施例１は、ライノウイルスの増殖、精製
および定量に関する。

【００３７】実施例２は、ＩＣＡＭ−１に対する単クロ
ーン抗体の生産および単離に関する。

【００３８】実施例３は、短縮されていないＩＣＡＭ−
１　ｃＤＮＡからの非トランスメンブラン切形形態のＩ
ＣＡＭ　ｃＤＮＡの建造に関する。

【００３９】実施例４は、哺乳動物細胞のトランスフェ
クションおよびＩＣＡＭ　ｃＤＮＡの非トランスメンブ
ラン切形形態の発現に関する。

【００４０】実施例５は、ＩＣＡＭ−１の非トランスメ
ンブラン切形形態の単離および精製に関する。

【００４１】実施例６は、ｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡ
Ｍ（１８５）、およびｔＩＣＡＭ（４５３）の放射能標
識、および単クローン抗体に対する保持された結合能力
の立証に関する。

【００４２】実施例７は、トランスメンブランおよびト
ランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ−１のヒトライノ
ウイルス結合の定量に関する。

【００４３】実施例８は、ＣＬ２０３　ＩｇＧ抗体がも
たらすｔＩＣＡＭ（４５３）の架橋に関する。

【００４４】実施例９は、トランスメンブランおよび非
トランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ−１の多量化に
関する。

【００４５】実施例１０は、多量体トランスメンブラン
および多量体非トランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ
−１の感染力−中和定量に関する。

【００４６】そして、実施例１１は、ＩＣＡＭ／ＦＬＡ
−１相互作用の有効な抑制因子としての、トランスメン
ブランおよび切形形態のＩＣＡＭ−１の多量体形態の使
用に関する。

【００４７】

【実施例】実施例１ ライノウイルスの増殖、精製および定量Ａｂｒａｈａｍ
、　Ｇ．、　他、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．、　５１：３４０
　（１９８４）およびＧｒｅｖｅ、　他、Ｃｅｌｌ、　
５６：８３９　（１９８９）中に本質的に記述されてい
るように、ライノウイルスを増殖させ、精製し、そして
定量した。これらの試験のために選択した血細型には、
ＨＲＶ１４、即ちこの分野の標準型、およびＨＲＶ３（
これは、ＨＲＶ１４よりも約１０倍高い、ＩＣＡＭに対
する親和力を有している）が含まれる。ＨＲＶ２（これ
は、「主要」レセプタとよりはむしろ「少数」レセプタ
と結合する）を負の対照として用いた。

【００４８】ライノウイルスＨＲＶ２、ＨＲＶ３、およ
びＨＲＶ１４は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、プラーク
精製し、そして感染させたヒーラー（ＨｅＬａ）−Ｓ３
細胞の溶解産物から単離した。精製したライノウイルス
は、ポリエチレングリコール沈澱およびサクロース勾配
沈降で調製した。細胞の純度は、カプシド蛋白質のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析および電子顕微鏡で測定した。Ｍｉｎ
ｏｒ、　Ｐ．Ｄ．、　Ｇｒｏｗｔｈ著、　「ピコルナウ
イルスの定量および精製」（ａｓｓａｙ　ａｎｄ　ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕ
ｓｅｓ）［「ウイルス学：実用アプローチ」（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ
）、　Ｂ．Ｗ．Ｊ．　Ｍａｈｙ編集、　（Ｏｘｆｏｒｄ
：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、２５ー４１頁］に本質的に記
述されているように、細胞変性効果を記録する制限希釈
感染定量法によって、感染力を定量した。

【００４９】実施例２ ＩＣＡＭ−１に対する単クローン抗体の生産および単離
３週間で３回の間隔で、０．５ｍＬの燐酸塩緩衝食塩水
（ＰＢＳ）中の１０７個無傷ヒーラー細胞を腹こう内注
射することによって、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪのメスのマウ
スの細胞を免疫化させた。２週間後、このマウスは出血
し、そして一定量の血清を、ヒーラー細胞のＨＲＶ１４
感染に対する保護効果を試験するため用いた。陽性のマ
ウスに、最終的に、更に１０７個のヒーラー細胞を注射
し、そして３日後、脾臓の細胞をＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．
６５３骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ、　他、　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２６６：５５０−５５２　（１９７７））に融合
させて、全体で約７００個のハイブリドーマ含有ウエル
を生じさせた。９６個のウエルを有するプレート中で、
３ｘ１０４ヒーラー細胞を、１００μＬの上澄み液と一
緒に３７℃で１時間培養し、次に、この細胞をＰＢＳで
洗浄し、そして充分な量のＨＲＶ１４を加え、２４〜３
６時間で完全な細胞変性効果を生じさせた後、各々のウ
エルを検査した。陽性（感染から保護された）のウエル
を３６時間後記録した。

【００５０】この最初のスクリーン試験で陽性を示した
ウエルから細胞を取り出した後、９６個のウエルを有す
るミクロタイタープレート中で制限希釈することによっ
てクローン化した。これらのウエルから得た上澄み液を
、細胞保護定量法で試験した後、陽性を示すウエルを再
び同定した。ハイブリドーマ含有ウエルの全てが陽性に
なり、クローン集団が得られたことが示されるまで、更
にクローン化を行った。４つのクローン化した細胞系、
およびそれらの相当する抗体が得られ、そしてこれらを
各々、ｃ７８．１Ａ、ｃ７８．２Ａ、ｃ７８．４Ａ、ｃ
７８．５Ａ、ｃ９２．１Ａおよびｃ９２．５Ａで表示し
た。

【００５１】ｃ９２．１Ａを、１９８７年１１月１９日
、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ
ｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ
　２０８５２に寄託し、ＨＢ９５９４と表示された。

【００５２】実施例３ 短縮されていないＩＣＡＭ−１　ｃＤＮＡからの非トラ
ンスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ　ｃＤＮＡの建造Ａ
．ＩＣＡＭ−１　ｃＤＮＡの調製 供給者が推奨する条件下、ＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ　ｃＤ
ＮＡ合成キットを用いて、ＨＥ１細胞からのポリＡ＋Ｒ
ＮＡから、ランダムに開始させたｃＤＮＡを合成した。 プライマーＰＣＲ５．１：（ｇｇａａｔｔｃＡＴＧＧＣ
ＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣ）およびＰＣ
Ｒ３．１：（ｇｇａａｔｔｃＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴ
ＧＧＣＴＴＧＴＧＴＧＴＴ） を用い、２５サイクルのための１００ｎｇのｃＤＮＡを
用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅サイクルは、９４℃
で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で４分間から
なっていた。ＰＣＲ反応の生産物を、ＥｃｏＲ１で消化
させた後、ＥｃｏＲ１消化したファージベクターλＧＴ
１０（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）でクローン化した。 組換ファージクローン体を、ＩＣＡＭ−１特異オリゴヌ
クレオチド：ＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴ
ＣＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧ
ＴＴＣ（ＩＣＡＭ１）および ＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＧＣ
ＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴ（ＩＣ
ＡＭ３） を用いたプラークハイブリッド形成でスクリーンにかけ
た。

【００５３】λＨＲＲ４と名付けた陽性クローン体を選
択した後、精製した。ＥｃｏＲ１消化により挿入断片を
除去した後、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋のＥｃｏＲ
１部位中にサブクローン化した。このクローン体をｐＨ
ＲＲ２と名付けた。この全体の挿入断片の配列を決め、
そしてこれは、Ｇの代わりにＡ　１４６２を単置換した
ＰＣＲ　ＩＣＡＭ−１配列（Ｓｉｍｍｏｎｓ、　他、　
Ｎａｔｕｒｅ、　３３１：６２４　（１９８８）；Ｓｔ
ａｕｎｔｏｎ、　他、Ｃｅｌｌ、　５２：９２５−９３
３　（１９８８））で特性が与えられているような、イ
ニシエーターＡＴＧコドンで始まりＴＧＡ終止コドンで
終わる全体のＩＣＡＭ−１暗号化配列を有することが見
いだされた。同様の変化が、個々の数種のクローン体中
で同定され、従って、これはＩＣＡＭ−１遺伝子の多型
性を表している。

【００５４】Ｂ．ｔＩＣＡＭ−１（４５３）およびｔＩ
ＣＡＭ（１８５）の建造 母型として、短縮されていないＩＣＡＭ−１　ｃＤＮＡ
クローン体ｐＨＲＲ−２を用いたＰＣＲ増幅反応（Ｓａ
ｉｋｉ、　他、　Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３０：１３５０
−１３５４　（１９８５））で、ＩＣＡＭ−１　ｃＤＮ
Ａの修飾形態を創作した。このプラスミドＤＮＡをＥｃ
ｏＲ１で消化させて、該ＩＣＡＭ−１挿入断片を切除し
た後、アルカリ性ホスファターゼを用いて処理し、次の
連結反応段階でこのベクターが再び円形になるのを防止
した。１０ｇの切除ＤＮＡに、下記の条件下： 温度（℃）　　　　　　　　時間（分）９４　　　　　
　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　
　　　　　２７２　　　　　　　　　　　　　　　　１
．５７１　　　　　　　　　　　　　　　　４（最終拡
大）で、ｔＩＣＡＭ−４５３のためのオリゴヌクレオチ
ドプライマーＰＣＲ５．５およびＰＣＲ３．３、そして
ｔＩＣＡＭ−１８５のためのＰＣＲ５．５および３．１
０を用いて１０サイクルのＰＣＲ増幅を受けさせた。Ｐ
ＣＲ５．５は、配列： ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴ
ＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣ（
これは、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩ部位、１２ｂ
ｐ　ＩＣＡＭ−１　５’未翻訳配列、およびシグナルペ
プチドをコード化する第一２４ｂｐからなっている）を
有している。ＰＣＲ３．３は、配列： ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＴＣＡＴＡＣＣＧ
ＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＴＴ（これは、ＥｃｏＲ１
およびＰｓｔ１部位、終止コドン、およびＩＣＡＭ−１
の最後の８個の細胞外アミノ酸（残基４４６−４５３）
をコード化する塩基を補充する２４ｂｐからなっている
）を有している。ＰＣＲ３．１０は、配列： ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＧＧＴＣＴＧ
ＧＡＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧ（これは、Ｘｂａ１およ
びＢａｍＨ１部位、終止コドン、およびＩＣＡＭ−１の
残基１７８−１８５をコード化する塩基を補充する２４
ｂｐからなっている）を有している。

【００５５】このＰＣＲ反応生産物を、ＥｃｏＲ１（ｔ
ＩＣＡＭ（４５３））、或はＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ
１（ｔＩＣＡＭ（１８５））を用いて消化させた後、Ｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）のポリリンカー部位中にクローン化した。この所望
挿入断片を含有しているクローン体は、制限分析および
ＤＮＡ配列決定によって確認された。ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｂａＩを用いて消化することにより、該挿入断片
をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭから切除した後、このＨｉ
ｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の発現ベクターＣＤＭ８
（Ｓｅｅｄ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２３９：８４０　（１
９８７））中に挿入した。ｐＨＲＲ−８．２として表示
したｔＩＣＡＭ（４５３）挿入断片含有クローン体、お
よびｐＨＲＲ２３−１３として表示したｔＩＣＡＭ（１
８５）挿入断片含有クローン体を選択し、そして一層の
配列決定分析を行った。これによって、所望終止コドン
の存在が立証され、そしてＩＣＡＭ−１暗号化配列の選
択された領域の完全性が立証された。

【００５６】ＤＥＡＥ−デキストラン技術を用いて、こ
れらのプラスミドをＣＯＳ細胞中に移入させた後、この
細胞を、分析前７２時間培養した。間接免疫蛍光、およ
びＩＣＡＭ−１に特異な単クローン抗体を用いたＦＡＣ
Ｓで、表面発現を監視した。ＣＯＳ細胞中の一過性発現
、およびｃ７８．４Ａ　Ｍａｂ（単クローン抗体）を用
いた代謝標識（３５Ｓ　システイン）細胞上澄み液の免
疫沈澱の結果、各々、ｐＨＲＲ２３−１３およびｐＨＲ
Ｒ８．２からの４５ｋｄおよび８０ｋｄの可溶ＩＣＡＭ
−１フラグメントの生産が示された。安定なチャイニー
ズハムスター卵巣細胞トランスフェクタント（ｔｒａｎ
ｓｆｅｃｔａｎｔｓ）の調製は、下記の実施例４で記述
する。

【００５７】Ｃ．　　修飾非グリコシル化トランスメン
ブランＩＣＡＭ−１分子 Ｑに対する各々Ｎ−１０３、Ｎ−１１８、Ｎ−１５６お
よびＮ−１７３の同時変異誘発で、修飾した短縮されて
いないＩＣＡＭ−１を製造した。これにより、ＩＣＡＭ
−１分子の細胞外Ｄ２ドメインから４つのＮ−連結グリ
コシル化部位全てを除去する。非グリコシル化トランス
メンブランＩＣＡＭと呼ばれているこのとき得られる分
子は、ＣＯＳ細胞の表面上に発現し、未修飾ＩＣＡＭ−
１に匹敵するレベルで、放射能標識されたＨＲＶ３と結
合することができた。この結果は、ドメイン２（最初の
１８４個のアミノ酸）のグリコシル化はＩＣＡＭ−１に
対するウイルスの結合には不必要であることを示してい
る。

【００５８】非トランスメンブランＩＣＡＭは、同様に
修飾でき、修飾非グリコシル化非トランスメンブランＩ
ＣＡＭ−１分子を生じさせることができると期待される
。

【００５９】Ｄ．　　多量体を形成させるための架橋用
として適切な非トランスメンブラン（切形）ＩＣＡＭ−
１含有反応性残基の遺伝工学的形態の建造Ｃ末端に新規
なリジン残基を付加したＩＣＡＭ−１の４５３アミノ酸
細胞外ドメインから成る分子を、上述したように、ｐＨ
ＲＲ−２　ｃＤＮＡのＰＣＲ修飾により建造した。使用
したプライマーは、ＰＣＲ５．５（上に記述）およびＰ
ＣＲ３．１９（これは次の配列：ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡ
ＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＧＧＡＧ
ＡＧＣＡＣＡＴＴを有し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍ
ＨＩ部位、終止コドン、Ｌｙｓコドン、およびアミノ酸
残基４４６〜４５３をコード化する配列を補充する２４
個の塩基から成る）である。ＣＤＭ８ベクター中へのク
ローン化に続いて、ＣＯＳ細胞中の一過性発現によって
、ｔＩＣＡＭ−４５３Ｋの生産が確認された。安定なＣ
ＨＯ細胞系が、前述したように、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲを
用いた共トランスフェクションによって生じた。

【００６０】ＰＣＲ５．５およびＰＣＲ３．２０（これ
は次の配列： ＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴ
ＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＧＧＣを有し、そして
ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位、終止コドン、Ｌｙｓコ
ドン、および残基１７８〜１８５をコード化する配列を
補充する２４個の塩基から成る）を用いて、同様な方策
を、ｔＩＣＡＭ（１８５）Ｃ末端へのＬｙｓ残基付加に
用いた。一過性ＣＯＳ細胞発現により、ｔＩＣＡＭ−１
８５の生産が確認され、そして安定なＣＨＯ細胞系が前
述したように誘導された。

【００６１】各々が追加的Ｃｙｓ残基を有するｔＩＣＡ
Ｍ（１−４５２）の３つの異なる形態を、短縮されてい
ないＩＣＡＭ−１　ｃＤＮＡの部位特異的変異誘発で建
造した。各々の建造において、Ｅ−４３５　ＧＡＧをＴ
ＡＧに変えることによって終止コドンを導入した。この
ように、このＣ末端はＹ−４５２である。２番目の部位
特異的変異誘発を用いて、残基Ｎ−３３８、Ｔ−３６０
、およびＱ−３８７を各々別々にＣｙｓに変異させた。 所望の変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって確認した
。

【００６２】Ｃｙｓへの変異のために選択した残基は、
これらの領域の表面暴露を予測するための、表面確率に
関するコンピューターで生じさせたプロットを基にして
選択した。また、Ｔ−３６０は、潜在的Ｎ連結グリコシ
ル化の部位であるＮ−３５８の直ぐ近くに存在している
。この３つのＣｙｓ修飾の各々は発現し、そして移入さ
れたＣＯＳ細胞の媒体中に分泌される。還元および非還
元条件下でこの蛋白質を検査した結果、二量体の存在に
関するいかなる示唆も示されなかった。スルフヒドリル
基に対して反応性を示す架橋剤が、多量体形態を得るた
めこのＣｙｓ修飾ｔＩＣＡＭ形態を架橋させるために用
いることができると予測される。

【００６３】実施例４ 細胞のトランスフェクションおよびＩＣＡＭ　ｃＤＮＡ
の非トランスメンブラン切形形態の発現Ａ．　　真核細
胞のトランスフェクションジヒドロ葉酸塩還元酵素（Ｄ
ＨＦＲ）が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣細
胞（ＣＨＯ）を、Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｓ　（Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ、　ＣＡ．）から入手した。ＳＶ４０プロモー
ターの制御下、マウスのジヒドロ葉酸塩還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）を含有しているプラスミドｐＳＶ２　ＤＨＦＲ、
およびｔＩＣＡＭ−４５３、或はＣＤＭ８ベクター（Ｓ
ｅｅｄ　および　Ａｒｕｆｆｏ、　ＰＡＮＳ、　８４：
３３６５−３３６９　（１９８７））中のｔＩＣＡＭ−
１８４建造物と一緒に共移入した。

【００６４】エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）および燐酸カルシウム方法の両方を
用いてトランスフェクションを行った。上記Ｂｅｂｂｉ
ｎｇｔｏｎ。移入したＤＨＦＲ陽性細胞を、無ヌクレオ
シド媒体上の増殖物から選択し、そしてトランスフェク
タントのプールを制限希釈でクローン化させた。

【００６５】次のように、Ｍａｂ　ｃ７８．４Ａおよび
ｃ７８．５Ａを用いた、ＩＣＡＭに関する二部位放射免
疫検定（ＲＩＡ）で、培養の上澄み液を検査することに
よって、ｔＩＣＡＭを分泌する細胞系を同定した。ＩＣ
ＡＭ上の１つのエピトープ（例えば、Ｍａｂ　ｃ７８．
４Ａ）に対する単クローン抗体を、９６個のウエルを有
するプラスチック製プレート（Ｉｍｍｕｎｌｏｎプレー
ト、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．）に吸着させ、このプ
レート上の過剰の結合部位をウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）で制限し、そして次に、培養上澄み液をプレートで
培養した。その後、このプレートを洗浄し、そして、１
２５Ｉ−Ｍａｂ（ＩＣＡＭ上の２番目のエピトープ、例
えばｃ７８．５Ａに対して特異的）を一緒に培養し、そ
して洗浄後、結合した１２５ＩｇＧの量を測定した。ｔ
ＩＣＡＭの濃度を、公知濃度のｔｍ−ＩＣＡＭの標準曲
線に対して、未知濃度から得られるＲＩＡデータを比較
することによって測定した。陽性クローン体を拡張させ
、そしてＭａｂ　ｃ７８．４Ａを用いた代謝標識細胞の
上澄み液を免疫沈澱することによって、ｔＩＣＡＭ形態
の発現を確認した。

【００６６】より一層の試験のため、細胞系ＣＴ．２Ａ
（ｔＩＣＡＭ（４５３））およびＣＤ１２．１Ａ（ｔＩ
ＣＡＭ（１８５））を選択し、そして上記のＢｅｂｂｉ
ｎｇｔｏｎ、　他が記述しているように、メトトレキセ
ート含有媒体中で遺伝子増幅を受けさせた。１００ｎＭ
のメトトレキセートに対して耐性を示すＣＴ．２Ａから
誘導されたクローン体、および１μＭのメトトレキセー
トに対して耐性を示すＣＤ１２．１Ａクローン体を、可
溶切形ＩＣＡＭ−１蛋白質の精製のために用いた。

【００６７】Ｂ．　　原核細胞のトランスフェクション
ウイルス結合の保持には、ＩＣＡＭのウイルス結合ドメ
インのグリコシル化が必要とされていないため（実施例
３Ｃで示したように）、原核細胞、例えば大腸菌は成功
裏に移入され、機能的蛋白質を生産することができると
期待される。

【００６８】実施例５ ＩＣＡＭ−１の非トランスメンブラン切形形態の単離お
よび精製 以前、共出願中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　１３０，３７８お
よびＧｒｅｖｅ、他、Ｃｅｌｌ、　５６：８３９−８４
７　（１９８９）中に、ｃ７８．４Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅＴＭを用いた単クローン抗体アフィニティークロマ
トグラフィーが記述されている。血清含有媒体中に分泌
されるｔＩＣＡＭは、この血清中に混在している蛋白質
の水準が高いため、追加的精製段階が必要とされた。Ｍ
ａｂアフィニティーカラムからの溶離を行う前に、この
カラムを１ＭのＮａＣｌで洗浄して、弱く結合している
蛋白質を除去した。ｔＩＣＡＭ（４５３）に関しては、
このｃ７８．４−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラムから溶
離した部分的精製ｔＩＣＡＭ（４５３）を、１０ｍＭの
トリス（ｐＨ６．０）中に透析させ、モノ−ＱＴＭカラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に吸収させ、そして０〜０
．３ＭのＮａＣｌ勾配で溶離させた。更に、Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ−１２ＴＭカラム上でゲル濾過することによっ
て、ｔＩＣＡＭ１８４を精製した。

【００６９】ＩＣＡＭ−１の非トランスメンブラン切形
形態は、単クローン抗体アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いることなく、標準イオン交換方法を用いて精
製されてもよいと理解される。

【００７０】実施例６ ｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（１８５）、およびｔＩ
ＣＡＭ（４５３）の放射能標識、および単クローン抗体
に対する保持された結合能力の立証 単クローン抗体ｃ７８．４Ａおよびｃ７８．５Ａに対し
て反応性を示すエピトープ類は、配置依存性エピトープ
類であり、従って未変性ＩＣＡＭ構造の保持を確かめる
ための分析手段として使用できる。公知量の精製ＩＣＡ
Ｍを、ｃ７８．４Ａまたはｃ７８．５Ａ　ＩｇＧ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅＴＭと一緒に培養した後、結合した放射
能の画分を測定した。これらの試験によって、この精製
したｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（１８５）、および
ｔＩＣＡＭ（４５３）は、これらの単クローン抗体との
結合能力を完全に保持していることが示された。

【００７１】トランスフェクタントを、３５Ｓシステイ
ンで代謝標識した後、細胞溶解産物（トランスメンブラ
ンＩＣＡＭのための）または培養上澄み液（切形ＩＣＡ
Ｍのための）を製造し、そしてｃ７８．４Ａ　ＩｇＧ−
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビードと一緒に培養した。この
ビードを洗浄し、ＳＤＳを用いて、吸着された蛋白質を
溶離させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｇｒｅ
ｖｅ、　他、Ｃｅｌｌ、　５６：８３９−８４７　（１
９８９）参照。この単離された蛋白質は定量的にｃ７８
．４Ａおよびｃ７８．５Ａ　Ｍａｂと結合することが見
いだされた。

【００７２】従って、このｔＩＣＡＭ（１８５）および
ｔＩＣＡＭ（４５３）は両方共、未変性のＩＣＡＭ構造
を保持していた。

【００７３】実施例７ トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形
態のＩＣＡＭ−１のヒトライノウイルス結合の定量以下
に、種々の形態のＩＣＡＭの結合活性を評価するために
用いた３種の結合定量法を記述する。

【００７４】Ａ．　　ペレット化定量法［３５Ｓ］シス
テイン標識したｔｍＩＣＡＭ−１またはｔＩＣＡＭを、
１００μＬの１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１
５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２、０．１％トリトンＸ−１００中、ＨＲＶ３と
混合した。この混合物を３７℃で３０分間培養し、氷上
で冷却し、２００μＬの１０％グリセロール、０．２Ｍ
のトリエタノールアミン（ｐＨ７．５）から成る敷物の
上に層状に置き、そして１３４，０００ｘｇで３０分間
、４℃で、Ｂｅｃｋｍａｎ空気駆動遠心分離機中で遠心
分離した。上部の２７５μＬを取り出し、そしてＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよびセンチレーションカウンティングでペ
レットを分析した。対照区のＳＤＳゲルを銀染色する実
験により、これらの条件下で本質的に全ての該ＨＲＶ３
がペレット化され、そして本質的に全ての該ＩＣＡＭが
上澄み液中に残存していることが示された。その結果を
表１に示す。

【００７５】

【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　表　　１　　　　　　　　　　　　ＩＣＡＭ　
　　　　　　　　　　　　　ペレツト化ＩＣＡＭ（％）
＊　　　　　　　　ｔｍＩＣＡＭ−１　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１１．６％　　　　　　　　ｔＩ
ＣＡＭ（４５３）　　　　　　　　　　　　　　　　１
．０％　　　　　　　　ｔＩＣＡＭ（１８５）　　　　
　　　　　　　　　　　　４．３％＊　　４回の実験の
平均；これらの値を、直接には、相対親和力に変換する
ことはできない。

【００７６】これらのデータは、ＩＣＡＭの両方の切形
形態はライノウイルスと結合するが、しかしｔｍＩＣＡ
Ｍのそれに比較すると本質的に減少したレベルであるこ
とを示している。

【００７７】Ｂ．　　溶液結合定量法 溶液中のｔｍＩＣＡＭおよびｔＩＣＡＭフラグメントの
相対的親和力に関する定量法情報を得るため、溶液競争
定量法を開発し、ここでは、予め固定化したＩＣＡＭ−
１と３５Ｓ　ＨＲＶ３との結合を抑制するために可溶ｔ
ｍＩＣＡＭまたはｔＩＣＡＭフラグメントを用い、同一
条件下で異なる蛋白質が比較できるように非イオン系界
面活性剤（トリトンＸ−１００）を緩衝液中に入れた。 最初に、ｔｍＩＣＡＭ−１（トリトンＸ−１００の代わ
りに０．１％のオクチルグルコシドの存在下で単離）を
トリス／ＮａＣｌ緩衝液中で１０倍に希釈した後、一晩
、ミクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｌｏｎ−４、　
Ｄｙｎａｔｅｃｈ）の壁に吸着させた。次に、このプレ
ート上の非特異的結合部位を１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで
制限した後、０．１％トリトンＸ−１００／１ｍｇ／ｍ
Ｌ　ＢＳＡ／トリス／ＮａＣｌ中で結合実験を行った。 約２０，０００ｃｐｍの３５Ｓ　ＨＲＶ３を、種々の量
のＩＣＡＭかｔｍＩＣＡＭ、ｔＩＣＡＭ（４５３）また
はｔＩＣＡＭ（１８５）と混合し、３７℃で１時間培養
した後、該ミクロタイタープレートのウエルに添加し、
そして３７℃で３時間培養した。このプレートを洗浄し
た後、結合した放射能を測定した。

【００７８】表２に示すように、ｔｍＩＣＡＭ−１は低
濃度（０．００８μＭ）で、最大値の半分、ウイルスの
結合を抑制したが、一方ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔ
ＩＣＡＭ（１８５）はずっと高い濃度（それぞれ、２．
８μＭおよび７．９μＭ）で抑制し、即ちｔｍＩＣＡＭ
よりも３５０〜約１０００倍高い濃度で抑制した。

【００７９】

【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表２　　　　　　　　　　　　　　
ＩＣＡＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
Ｃ５０＊　　　　　　　　　　　　　　ｔｍＩＣＡＭ　
　　　　　　　　　　　８．０±３．３ｎＭ（Ｎ＝３）
　　　　　　　　　　　　　　ｔＩＣＡＭ（４５３）　
　　　　　　　　２．８±０．６μＭ（Ｎ＝３）　　　
　　　　　　　　　　　ｔＩＣＡＭ（１８５）　　　　
　　　　　７．９±２．８μＭ（Ｎ＝３） ＊　　ＩＣ５０は、ＨＲＶ３結合を５０％抑制するため
に必要な可溶ＩＣＡＭの濃度である。

【００８０】これらのデータは、ｔｍＩＣＡＭ−１より
も低い親和力ではあるが、ｔＩＣＡＭ（４５３）および
ｔＩＣＡＭ（１８５）はライノウイルスと結合すること
を立証し、以前の観察を拡張しており、そしてこのウイ
ルスの結合部位はＩＣＡＭ−１の２つのＮ末端ドメイン
（１８５残基）内に包含されているとする証拠を与えて
いる。

【００８１】Ｃ．　　ドット・ブロット定量法結合活性
を測定するための代替方法を用いたが、ここでは、ｔｍ
ＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔＩＣＡＭ
（１８５）をニトロセルロースのフィルターに吸着させ
、このフィルター上の非特異的結合部位を１０ｍｇ／ｍ
Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で制限した後、放射
能ウイルス、或はＩＣＡＭ−１に対する１２５Ｉ　Ｍａ
ｂを、３７℃で６０分間該フィルターと一緒に培養した
。このフィルターを緩衝液で洗浄した後、このフィルタ
ーをＸ線フィルムに暴露した。

【００８２】該フィルターに結合した放射能の量を、自
動放射線像の濃度計で測定し、そしてＩＣＡＭに結合し
た（ブロットに結合した）１２５Ｍａｂ　ｃ７８．４Ａ
またはｃ７８．５Ａの量を平行して測定することによっ
て、該ブロットに結合したＩＣＡＭの量に対して正常化
させたＨＲＶ３の結合（任意単位で表した）として、こ
のデータを表す。その結果を表３に示す。

【００８３】

【表３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　表３　　　　　　　　　　固定化ＩＣＡＭ
＊に対する３５Ｓ　ＨＲＶ３の結合　　　　　　　　　
ＩＣＡＭ　　　　　　　　　ｔＩＣＡＭ（４５３）　　
　　　　　比ＩＣＡＭ／ｔＩＣＡＭ４５３　　　　　　
　１．２±１．１　　　　　　　　０．５２±０．４５
　　　　　　　　　　　　　２．３ ＊　　５回の実験の平均。データは、３５Ｓ　ＨＲＶ３
結合／１２５Ｉ抗ＩＣＡＭ　Ｍａｂ結合の任意濃度単位
で表す。

【００８４】ｔＩＣＡＭ　１８５を用いた追加的試験を
開始した。結合実験は不確実な結果を示した。立体障害
がある役割を果しているものと予測される。このウイル
スの大きさは約３０ナノメーターである。ｔＩＣＡＭ（
１８５）の長さは１０ナノメーター未満である。スペー
サーまたはリンカーを使用すれば、結合に対してより確
かな結果が得られるであろう。

【００８５】この実験から得られる結果は、このような
定量条件下では、結合した１２５Ｉ　Ｍａｂの量に対し
てウイルスの結合量を正常化させたときのｔｍＩＣＡＭ
−１のレベルに匹敵するレベルで、ｔＩＣＡＭ（４５３
）がライノウイルスと結合できることを示している。更
に、これらの結果は、このｔＩＣＡＭ形態はライノウイ
ルスと結合する能力を有しているが、この結合親和性は
該ｔＩＣＡＭの立体配置に依存していることを示してい
る。 ｔｍＩＣＡＭ−１は小さい多量体（恐らくは二量体）で
あってもよく、そして多量体形態で表されるｔＩＣＡＭ
の表示はこの多量体配置に近いものである。

【００８６】このような仮説を支持する証拠は、上で考
察したように、ライノウイルス粒子の最大数と、細胞と
結合できる抗体分子の最大数との比率が約１．５である
とする定量的結合試験（未公開）から来るものである。 これは、Ｔｏｍａｓｓｉｎｉ、　Ｊ．　他、Ｊ．　Ｖｉ
ｒｏｌ．、　５８：２９０　（１９８６）の以前の研究
（これは、結合には、５個の分子から成る複合体が必要
であることを示唆している）と相反するものである。彼
らの結論は、ゲル濾過のデータに関する誤解した解釈を
基としたものであり、結合した界面活性剤分子を考慮す
ることができなかった。

【００８７】実施例８ ＣＬ２０３　ＩｇＧ抗体がもたらすｔＩＣＡＭ（４５３
）の架橋 ｔｍＩＣＡＭ−１のこのより高い相対的結合活性がその
蛋白質の多量体形態によるものであることの追加的証拠
を得るため、該ｔＩＣＡＭ（４５３）蛋白質をＣＬ２０
３（即ち、ウイルスとＩＣＡＭ−１との結合を抑制しな
いが、残基１８４（Ｓｔａｕｎｔｏｎ、　他、Ｃｅｌｌ
、　５６：８４９　（１９８９）およびＣｅｌｌ、　６
１：２４３　（１９９０））に対する部位Ｃ末端と結合
するところの、ＩＣＡＭ−１に対する単クローン抗体）
と一緒に予備培養した。このように、この抗体は、ｔＩ
ＣＡＭ（４５３）の２つの分子を有効に「架橋」させて
、ｔＩＣＡＭ（４５３）の「二量体」を創作することが
でき、更に、このｔＩＣＡＭ（４５３）の２つの分子の
各々のウイルス結合部位を妨害しないで行うことができ
る。重量比が４：１のＣＬ２０３　ＩｇＧとｔＩＣＡＭ
（４５３）との混合物を競争定量法で試験したとき、こ
の抗体を架橋させたｔＩＣＡＭ（４５３）が、ｔＩＣＡ
Ｍ（４５３）単独よりも７．４倍低い濃度でＨＲＶ３結
合を抑制することを見い出し、これは、二量体または小
さい多量体であるが故に、ｔｍＩＣＡＭ−１がより高い
親和力でライノウイルスと結合するとの考えと一致して
いる。

【００８８】ｔＩＣＡＭの代替多量体形態を創作するた
め、ＩＣＡＭの更に一層修飾した数種の切形形態を、上
記実施例３に記述したようにして建造した。その後、こ
れらの形態は、以下の実施例９で示すように多量化させ
得る。

【００８９】実施例９ トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形
態のＩＣＡＭ−１の多量化 ｔＩＣＡＭを、その単量体形態よりも強化されたウイル
ス結合および中和活性を有する多量体形態に変換するこ
とができる種々の方法がある。例えば、ｔＩＣＡＭ（４
５３）は、不活性ポリマー、例えばアミノデキストラン
（ＭＷ４０，０００）と、ホモ二官能（例えばＮ−ヒド
ロキシスクシニミド（ＮＨＳ）エステル）またはヘテロ
二官能（例えば、ＮＨＳ−エステルと、光活性化可能も
しくはスルフヒドリルに対して反応性を示す基とを含有
しているもの）架橋剤を用いて連結させることができ、
ここでは、このアミノデキストラン上のアミノ基、およ
び該ｔＩＣＡＭ上のアミノ基または他の基が利用される
。適切な架橋剤の数多くの例がＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙのカタログ（Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ、　Ｉｌｌ．）中に見いだされる。

【００９０】ｔＩＣＡＭは、ＮＨＳ−エステルを基とす
る化合物に対して弱い反応性を示すため、遺伝工学で製
造したＣ末端リジン残基を有するｔＩＣＡＭ（実施例３
参照）は、ホモ二官能試薬を用いると支持体に対する連
結効率が改良され、一方、遺伝工学的に製造したＣ末端
システイン残基は、ヘテロ二官能試薬、例えばスルホマ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエス
テル（ＭＢＳ）によって、連結が容易になる。

【００９１】二者択一的に、可溶ｔＩＣＡＭ多量体は、
反応性を示す残基をｔＩＣＡＭのＣ末端中に遺伝工学的
に組み込むことによって創作できる。例えば、ｔＩＣＡ
ＭのＣ末端領域に、比較的疎水性の配列を有する遊離シ
ステイン残基が創作できる（これが、溶媒にさらされる
傾向は大である）。これは、二量体をインサイチューで
創作することを可能にし、二者択一的に、単量体を精製
した後、ジスルフィド交換を二量体によりインビトロで
創作することもできると期待される。

【００９２】もう１つの方法では、同様な位置にリジン
残基の置換を行った後、精製した蛋白質をインビトロで
ホモ二官能ＮＨＳ−エステルで架橋させる必要がある。 上記リジン残基の例は、残基３３８、３６０、３８７で
ある。

【００９３】システイン残基同士の架橋は、遊離システ
イン基を有するｔＩＣＡＭと、ビス−マレイミドヘキサ
ン（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）または
他のビス−マレイミド−同族体とを反応させることによ
って行われ得る。担体分子上のアミノ基に対するｔＩＣ
ＡＭ上の遊離システイン残基の架橋は、ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用
いた反応によって行われ得る。ｔＩＣＡＭ分子上のアミ
ノ基の架橋は、ホモ二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
エステル（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．のカタログ参照）を用いて行われ得る。二者択一的
に、ｔＩＣＡＭ上の炭水化物基を酸化してアルデヒドを
生じさせた後、担体分子上のヒドラジンに対して活性を
有するアミノ基と連結させることができる。

【００９４】実施例１０ トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形
態のＩＣＡＭ−１の感染力−中和定量 ウイルス感染に関する３つの異なる定量方法を用いた。 これらの異なる定量法は、トランスメンブランＩＣＡＭ
および非トランスメンブラン溶解度の相違を考慮したも
のである。

【００９５】Ａ．　　界面活性剤存在下でのプラーク減
少定量法 この定量法の結果は、細胞を死滅させる効果が存続して
いるウイルスの最大希釈度を示すものである。０．１％
のＴＸ１００存在下トランスメンブランＩＣＡＭ蛋白質
と一緒にウイルスを予備培養し、これを順次、培地中に
希釈し、１０６個細胞／ｍＬのヒーラー細胞と一緒に３
０分間培養し、１０倍に希釈した後、種々の希釈度のウ
イルスの入っている９６個のウエルを有するミクロタイ
タープレートの複数のウエル中にプレートアウトさせる
。５日後、感染しているウエルと感染していないウエル
を、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在により点数をつけ、
そしてこのタイターを、元のウイルス１ミリリットル当
たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として表す。 この定量法はＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．　２３９，５７１に記述
されており、ｔｍＩＣＡＭ−１の抗ウイルス活性を示す
ために用いられる（これには、溶液中に保持させるため
界面活性剤の存在が必要とされた）。使用したＩＣＡＭ
蛋白質の濃度は、最初、該予備培養混合物中の濃度であ
るが、しかしながら、このＩＣＡＭ蛋白質は、この感染
を通して一定に存在しているのではなく、ここでは、該
蛋白質を順次希釈する。このｔｍＩＣＡＭを可溶化させ
るためには界面活性剤の存在が必要であるが、この界面
活性剤が存在すると細胞を死滅させ、従って、この順次
的希釈が必要である。

【００９６】Ｂ．　　界面活性剤なしのプラーク減少定
量法 このプラーク減少定量法、即ちより古典的な定量法では
、上述したように、ヒーラー細胞を順次希釈したライノ
ウイルスに感染させるが、界面活性剤は存在していなく
、従って、この定量法はｔｍＩＣＡＭの分析には使用で
きない。この定量法において、該ｔＩＣＡＭは、指示さ
れた濃度で一定して該培地中に存在している。この系で
はｔｍＩＣＡＭ−１（これは界面活性剤の存在を必要と
する）は定量できない、何故ならば、必要とされる界面
活性剤を添加するとヒーラー細胞を死滅させるからであ
る。

【００９７】Ｃ．　　ウイルスおよびＩＣＡＭの一定し
た存在下でのプラーク減少定量法 この定量法は、Ｍａｒｌｉｎ、　他（Ｎａｔｕｒｅ　１
９９０）が利用した方法（ここでは、ＩＣＡＭ蛋白質の
有り無しで、１００ＰＦＵのウイルスにヒーラー細胞の
培養物を感染させた後、細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れ
るまで約４日間培養する）に類似している。その後、こ
の培養物をＣＰＥに関して可視的に記録する。この分析
条件は、上記Ｍａｒｌｉｎと同様であった。点数づけは
、クリスタルバイオレットを用いた染色操作よりはむし
ろ可視的に行った。

【００９８】この定量法では、界面活性剤が全く存在し
ていなく、該ＩＣＡＭが一定して存在しており、そして
この分析法は、時間の任意点で、ウイルス複製／増殖の
減少の程度を示すものである。

【００９９】ウイルス感染に関するこれらの３つの異な
る定量法から得られたデータを表４に要約する。

【０１００】

【表４】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　表　　４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＩＣ５０％（μＭ）＊　　　　　　ＩＣＡＭ　　　　　
　　　　　　　　　定量法：　　Ａ　　　　　　Ｂ　　
　　　　Ｃ　　　　　　ｔｍＩＣＡＭ−１　　　　　　
　　　　　　　　　　０．０３　　　　ＮＤ　　　　　
　ＮＤ　　　　　　ｔＩＣＡＭ（４５３）　　　　　　
　　　　＞２０　　　　　　　０．２　　　　　０．２
　　　　　　ｔＩＣＡＭ（１８５）　　　　　　　　　
　＞２０　　　　　　　ＮＤ　　　　　　ＮＤ ＊　　ＩＣ５０％は、ＨＲＶ３感染を５０％抑制するた
めに必要なＩＣＡＭ蛋白質の濃度として定義される。

【０１０１】これらのデータは、異なる定量系で比較し
たときでさえ、ウイルス感染の減少において、該切形Ｉ
ＣＡＭ蛋白質よりもｔｍＩＣＡＭ−１が有意に活性を示
すことを示している。定量法（Ａ）と定量法（Ｂ）にお
けるｔＩＣＡＭ（４５３）の中和活性の差は、ｔＩＣＡ
Ｍ（４５３）によってもたらされる中和には該培地中に
ｔＩＣＡＭ（４５３）が一定して存在していることが必
要であり、そしてこれは可逆的であることを示している
。この中和が可逆的であることは、定量法（Ａ）で観察
される中和の不足によって示されている。反対に、定量
法（Ａ）において、ｔｍＩＣＡＭ−１の中和活性はｔＩ
ＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）よりも＞
６６７倍高く、そして界面活性剤の存在なしで該培地中
にｔｍＩＣＡＭ−１を一定して存在させることが可能で
ある場合、定量法（Ｂ）ではより高くなる可能性がある
。

【０１０２】これらの結果をＭａｒｌｉｎ、　他の結果
と比較するため、彼らの分析条件を再現する試みを行っ
た。表４に示すように、定量法（Ｂ）と定量法（Ｃ）と
の結果の間に良好な相関関係が存在しているが、ｔＩＣ
ＡＭ（４５３）に関するＩＣ５０％はＭａｒｌｉｎ他で
見られるそれよりも１０倍高い。これが使用したライノ
ウイルスの血細型による相違のためであるか否かを調べ
るため、ＨＲＶ１４およびＨＲＶ５４（Ｍａｒｌｉｎ他
が用いた血細型）を用いてこの定量法を繰り返した。こ
れらの血細型の両方に関するＩＣ５０％は０．２μＭの
ｔＩＣＡＭ（４５３）であり、このことは、ＨＲＶ１４
、ＨＲＶ５４、およびＨＲＶ３の間に血細型の感受性に
関する相違がないことを示している。

【０１０３】この矛盾を解決する試みのため、Ｍａｒｌ
ｉｎ他が用いたのと同様の緩衝液を使用して、それが定
量法（Ｃ）のライノウイルスの感染に影響を与えるか否
かを確認した。Ｍａｒｌｉｎ他は、５０ｍＭトリエタノ
ールアミン（ＴＥＡ）／２０ｍＭトリス含有緩衝液中で
彼らのｓＩＣＡＭ−１蛋白質を製造した。この緩衝液単
独をＨＲＶ３およびＨＲＶ１４の対照感染物（１／１０
倍の容積、最終濃度５ｍＭ　ＴＥＡ／２ｍＭ　トリス）
に加えると、実際上ＣＰＥの完全な抑制が観察された。 従って、いずれかの形態のＩＣＡＭの存在とは関係なく
、ウイルス複製に対して緩衝液が影響を与えている可能
性がある。

【０１０４】実施例１１ ＩＣＡＭ／ＦＬＡ−１相互作用の有効な抑制因子として
の、トランスメンブランおよび切形形態のＩＣＡＭ−１
の多量体形態の使用 ＩＣＡＭ−１の正規な機能は、白血球インテグリンＬＦ
Ａ−１のリガンドとして働くことであり、これらの２つ
の分子間の相互作用が、白血球と種々の他の細胞との間
の粘着をもたらす。細胞上のＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ
−１の間の粘着を抑制するｔＩＣＡＭ（４５３）の能力
を下記のように試験した。実施例７Ｃに記述したように
、ＩＣＡＭ−１をミクロタイタープレートに吸着させた
。ＬＦＡ−１を発現するＪＹ細胞が、ＩＣＡＭ発現細胞
、或はＩＣＡＭ−１をコートした培養皿（Ｓｔａｕｎｔ
ｏｎ、　他、ＪＣＢ）に粘着する。ＪＹ細胞を、３７℃
で３０分間、ｔＩＣＡＭ（４５３）の有り無しで予備培
養した後、該ＩＣＡＭ−１をコートしたプレートに加え
、そして３７℃で６０分間培養した。次に、このミクロ
タイタープレートを洗浄した後、このプレートに付着し
た細胞の数を数えた。

【０１０５】

【表５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表５　　　　　　可溶ＩＣＡＭによ
るＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用の抑制　　　　　
　　　ｔＩＣＡＭ（４５３）（μｇ／ｍｌ）　　　　　
　　　細胞結合制御（％）＊　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　９６　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３００　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９３　　　　　　　　
　　　　　　　　　　６００　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　７５＊　　ＩＣＡＭ
−１をコートしたミクロタイタープレートへの結合；１
０μｇ／ｍＬの抗ＬＦＡ−１または抗ＩＣＡＭ−１　Ｍ
Ａｂは、＜１％に結合を抑制した。

【０１０６】表５で見られるように、高濃度のｔＩＣＡ
Ｍ（４５３）（０．６ｍｇ／ｍＬ）でさえも、ＪＹ細胞
結合に関する低い抑制が観察された。これは、恐らくは
、細胞間の粘着が数千の分子を巻き込む高度の協力工程
であり、そしてｔＩＣＡＭ（４５３）の親和力が低いこ
とによるためであろう。多量体配置のｔＩＣＡＭ（４５
３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）を与えると、細胞に対
するｔＩＣＡＭの親和力が増大し、そして炎症または自
己免疫症における有効な抗粘着剤として働き得る。

【０１０７】前記実施例は、ｔＩＣＡＭ−１の結合およ
び中和活性を本質的に増大させる可溶な多量体形態のｔ
ＩＣＡＭの創作を記述したものである。

【０１０８】本発明を特定の方法および組成で記述して
きたが、本発明を考慮するとき、種々の変化および修飾
が本分野の技術者に思い浮かぶものと理解する。

【０１０９】例えば、ウイルスとの結合部位を有してい
るＩＣＡＭ−１から誘導されるより小さい蛋白質フラグ
メントおよびペプチド類もまた多量体配置で有効である
ことが予測される。多量体ＩＣＡＭはＩＣＡＭ−１／Ｌ
ＦＡ−１相互作用の有効な抑制因子であり得ると期待さ
れる、何故ならば、これらの分子間の親和力は極めて低
く、そしてこれらの２つの分子によってもたらされる細
胞−細胞結合は非常に協力的であるからである。

【０１１０】好適な形態および立体配置は二量体配置の
非トランスメンブラン（切形）ＩＣＡＭであるが、ウイ
ルスとの結合に有効でありそしてウイルスの活性の中和
に有効な他の形態および立体配置を本発明の範囲内に包
含させることの排除を意図したものではない。

【０１１１】更に、通常にメンブラン結合した不溶レセ
プタ蛋白質から可溶な蛋白質形態を製造する本発明の一
般的な方法は、「主要群」のレセプタと結合するウイル
ス以外のウイルスと結合しそしてその感染を減少させる
ために用いられる、他のレセプタ蛋白質の可溶多量体形
態を製造するために用いられ得る。このような他のウイ
ルスには、ポリオ、単純ヘルペス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ
ａｒｒウイルスが含まれる。

【０１１２】上述した説明的実施例中に記述した本発明
の数多くの修飾および変化が本分野の技術者に思い浮か
ぶものと予想される、従って、それについては、付随す
る請求項で明らかとなる制限のみを置くものとする。

【０１１３】従って、この付随する請求項中で請求する
本発明の範囲内に入る同等の変化全てを包含することを
意図するものである。

【０１１４】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。

【０１１５】１．多量体ＩＣＡＭ。

【０１１６】２．上記ＩＣＡＭが非トランスメンブラン
ＩＣＡＭである第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１１７】３．上記非トランスメンブランＩＣＡＭが
本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有していなくそ
して疎水性メンブランドメインを有していない第２項記
載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１１８】４．上記非トランスメンブランＩＣＡＭが
ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８４）から
成る群から選択される１員である第２項記載の多量体Ｉ
ＣＡＭ。

【０１１９】５．上記ＩＣＡＭを支持体に吸着させるこ
とによって多量化させた第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２０】６．上記支持体が不活性ポリマーでありそ
してニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリ
マー、およびアミノデキストランから成る群から選択さ
れる１員である第５項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２１】７．上記多量体ＩＣＡＭを構成要素に連結
させることによって多量化させた第１項記載の多量体Ｉ
ＣＡＭ。

【０１２２】８．上記ＩＣＡＭをどちらかの末端で修飾
した第７項記載の多量体ＩＣＡＭ。 ９．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端で修飾した第８項
記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２３】１０．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端で
修飾して反応性を示すアミノ酸残基を含有させた第８項
記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２４】１１．上記反応性を示すアミノ酸残基がリ
ジンおよびシステインから成る群から選択される１員で
ある第１０項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２５】１２．上記ＩＣＡＭをアミノ末端で修飾し
た第８項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２６】１３．上記ＩＣＡＭをアミノ末端で修飾し
て反応性を示すアミノ酸残基を含有させた第８項記載の
多量体ＩＣＡＭ。

【０１２７】１４．上記反応性を示すアミノ酸がリジン
およびシステインから成る群から選択される１員である
第１３項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２８】１５．上記ＩＣＡＭをどちらかの末端で修
飾してオリゴマーミセルの形成を促進させ得る脂質を含
有させた第８項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１２９】１６．上記構成要素が抗体、蛋白質担体、
および架橋剤から成る群から選択される１員である第７
項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１３０】１７．上記抗体が抗ＩＣＡＭ抗体ＣＬ　２
０３である第１６項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１３１】１８．上記架橋剤がヘテロ二官能およびホ
モ二官能架橋剤から成る群から選択される第１６項記載
の多量体ＩＣＡＭ。

【０１３２】１９．上記架橋剤が二官能Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドエステル、イミドエステルおよびビス−マ
レイミド−ヘキサン類から成る群から選択される１員で
ある第１８項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１３３】２０．上記蛋白質担体がアルブミンおよび
プロテオグリカン類から成る群から選択される１員であ
る第７項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１３４】２１．上記ＩＣＡＭが、充分にグリコシル
化されたＩＣＡＭ、部分的にグリコシル化されたＩＣＡ
Ｍまたは非グリコシル化ＩＣＡＭから成る群から選択さ
れる１員である第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。

【０１３５】２２．改良が、リガンドに対する非トラン
スメンブランＩＣＡＭの結合を強化させる形態および立
体配置の非トランスメンブランＩＣＡＭを、リガンドに
供給する段階から成る、上記リガンドと上記非トランス
メンブランＩＣＡＭとの結合を増強させる方法。

【０１３６】２３．上記非トランスメンブランＩＣＡＭ
が本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有していなく
そして疎水性メンブランドメインを有していない第２２
項記載の方法。

【０１３７】２４．上記非トランスメンブランＩＣＡＭ
がｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）か
ら成る群から選択される１員である第２３項記載の方法
。

【０１３８】２５．上記ＩＣＡＭが多量体配置にある第
２２項記載の方法。

【０１３９】２６．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端ま
たはアミノ末端のどちらかで修飾し、そして多量体ＩＣ
ＡＭの形成が増強された第２２項記載の方法。

【０１４０】２７．上記修飾がカルボキシル末端でのリ
ジン添加から成る第２６項記載の方法。

【０１４１】２８．上記修飾がカルボキシル末端での遊
離システイン添加から成る第２６項記載の方法。

【０１４２】２９．上記多量体配置が二量体から成る第
２５項記載の方法。

【０１４３】３０．上記多量体配置が、第２ＩＣＡＭと
架橋している第１ＩＣＡＭから成る第２５項記載の方法
。

【０１４４】３１．上記多量体配置が、多量体配置を生
じさせるために支持体に吸着させたＩＣＡＭから成る第
２５項記載の方法。

【０１４５】３２．上記支持体が高分子量の本質的に不
活性なポリマー類から成る群から選択される１員から成
る第３１項記載の方法。

【０１４６】３３．上記ポリマーが不活性ポリマーであ
りそしてニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質
ポリマー類、およびアミノデキストランから成る群から
選択される１員である第３２項記載の方法。

【０１４７】３４．上記多量体ＩＣＡＭを構成要素に連
結させることによって多量化させる第３２項記載の方法
。

【０１４８】３５．上記構成要素が抗体、蛋白質担体、
および架橋剤から成る群から選択される１員である第３
４項記載の方法。

【０１４９】３６．上記架橋剤がヘテロ二官能およびホ
モ二官能架橋剤から成る群から選択される１員である第
３５項記載の方法。

【０１５０】３７．上記蛋白質担体がアルブミンおよび
プロテオグリカン類から成る群から選択される１員であ
る第３２項記載の方法。

【０１５１】３８．上記抗体が抗ＩＣＡＭ抗体ＣＬ　２
０３である第３７項記載の方法。

【０１５２】３９．上記リガンドがヒトのライノウイル
ス、主要群レセプタウイルス、リンパ球関連抗原−１（
ＬＦＡ−１）および熱帯マラリア原虫から成る群から選
択される１員である第２２項記載の方法。

【０１５３】４０．薬学的に許容される溶媒、希釈剤、
補助剤または担体を含有し、そして活性材料として、有
効量の第１項記載ポリペプチドを含有している薬学的組
成物。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　多量体ＩＣＡＭ