JP3091527B2 - ヒトライノウイルスレセプタ蛋白質の多量体形態 - Google Patents
ヒトライノウイルスレセプタ蛋白質の多量体形態Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は、ヒトのライノウイルスと有効
に結合しそしてＨＲＶ感染力を有効に減少させることが
できるところの、新規な多量体配置および形態の細胞間
接着分子（ＩＣＡＭ）（これらの蛋白質の短縮されてい
ない形態および切形の形態を含む）に関する。
に結合しそしてＨＲＶ感染力を有効に減少させることが
できるところの、新規な多量体配置および形態の細胞間
接着分子（ＩＣＡＭ）（これらの蛋白質の短縮されてい
ない形態および切形の形態を含む）に関する。
【０００２】ヒトのライノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）
としても知られている短縮されていないＩＣＡＭは、ト
ランスメンブランＩＣＡＭ（ｔｍＩＣＡＭ−１）と呼ば
れており、切形ＩＣＡＭ（ｔＩＣＡＭ）としても知られ
ている非トランスメンブランＩＣＡＭは、短縮されてい
る。多量体配置にあり、好適には二量体として存在して
いる場合、これらの蛋白質は、ヒトのライノウイルス
（ＨＲＶ）の結合を増強し、そしてＨＲＶ感染力を減少
させることができる。更に、これらの多量化された蛋白
質はまた、「主要」群のヒトのライノウイルスレセプタ
（ＨＲＲ）、例えばコクサッキーＡウイルスと結合する
ことが知られている他のウイルスの感染力を減少させる
ためにも用いられ、そしてまた、免疫学的応答に関連し
ている数多くの細胞接着工程にとって重要なところの、
トランスメンブラン細胞間接着物質（ｔｍＩＣＡＭ）と
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）との相互作用
を防止するためにも使用され得る。最後に、これらの多
量化された蛋白質は、特にこの相互作用に影響を与える
ことを意図した他の薬剤の設計に関するＩＣＡＭ−１／
ＨＲＶ相互作用の研究のために用いられてもよい。
としても知られている短縮されていないＩＣＡＭは、ト
ランスメンブランＩＣＡＭ（ｔｍＩＣＡＭ−１）と呼ば
れており、切形ＩＣＡＭ（ｔＩＣＡＭ）としても知られ
ている非トランスメンブランＩＣＡＭは、短縮されてい
る。多量体配置にあり、好適には二量体として存在して
いる場合、これらの蛋白質は、ヒトのライノウイルス
（ＨＲＶ）の結合を増強し、そしてＨＲＶ感染力を減少
させることができる。更に、これらの多量化された蛋白
質はまた、「主要」群のヒトのライノウイルスレセプタ
（ＨＲＲ）、例えばコクサッキーＡウイルスと結合する
ことが知られている他のウイルスの感染力を減少させる
ためにも用いられ、そしてまた、免疫学的応答に関連し
ている数多くの細胞接着工程にとって重要なところの、
トランスメンブラン細胞間接着物質（ｔｍＩＣＡＭ）と
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）との相互作用
を防止するためにも使用され得る。最後に、これらの多
量化された蛋白質は、特にこの相互作用に影響を与える
ことを意図した他の薬剤の設計に関するＩＣＡＭ−１／
ＨＲＶ相互作用の研究のために用いられてもよい。
【０００３】ヒトのライノウイルスは、通常の風邪の原
因となる主要な仲介物である。それらはピコルナウイル
ス科に属し、そしてそれらが結合する宿主細胞のレセプ
タを基準にして分類され得る。Tomassini他、J. Viro
l.、 58: 290 (1986）には、ヒトのライノウイルスの細
胞付着に関連しているレセプタ蛋白質の単離が報告され
ている。１１５個以上の血細型のライノウイルス並びに
数種のコクサッキーＡウイルスの約９０％は、「主要」
ヒトライノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）として呼ばれて
いる単一の通常レセプタと結合し、残りの１０％は他の
１種以上の細胞レセプタと結合する。
因となる主要な仲介物である。それらはピコルナウイル
ス科に属し、そしてそれらが結合する宿主細胞のレセプ
タを基準にして分類され得る。Tomassini他、J. Viro
l.、 58: 290 (1986）には、ヒトのライノウイルスの細
胞付着に関連しているレセプタ蛋白質の単離が報告され
ている。１１５個以上の血細型のライノウイルス並びに
数種のコクサッキーＡウイルスの約９０％は、「主要」
ヒトライノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）として呼ばれて
いる単一の通常レセプタと結合し、残りの１０％は他の
１種以上の細胞レセプタと結合する。
【０００４】最近、この共発明者Greve, J．らによる共
著のCell，56:839 (1989）において、９５，０００ダル
トンの見掛け分子質量を有し、そして前述した細胞間接
着分子（ＩＣＡＭ−１）と呼ばれている細胞表面蛋白質
のヌクレオチド配列から推論されるアミノ酸配列と本質
的に同一なアミノ配列を有する糖蛋白質として、該主要
ＨＲＲを同定した。Simm ons，D.et al.，Nature 331:6
24 (1988)。Staunton，et al.，Cell， 52:925-933 (19
88)。続いて、Staunton, D.E.et al.，Cell,56:849 (19
89)において、ＩＣＡＭ−１がＨＲＶのための主要な表
面レセプタであることを確認した。Staunton, et al.，
Cell， 61:243-254 (1990）も参照。
著のCell，56:839 (1989）において、９５，０００ダル
トンの見掛け分子質量を有し、そして前述した細胞間接
着分子（ＩＣＡＭ−１）と呼ばれている細胞表面蛋白質
のヌクレオチド配列から推論されるアミノ酸配列と本質
的に同一なアミノ配列を有する糖蛋白質として、該主要
ＨＲＲを同定した。Simm ons，D.et al.，Nature 331:6
24 (1988)。Staunton，et al.，Cell， 52:925-933 (19
88)。続いて、Staunton, D.E.et al.，Cell,56:849 (19
89)において、ＩＣＡＭ−１がＨＲＶのための主要な表
面レセプタであることを確認した。Staunton, et al.，
Cell， 61:243-254 (1990）も参照。
【０００５】ＩＣＡＭ−１は、長さが全体を構成するメ
ンブラン蛋白質５０５アミノ酸であり、そしてｉ）この
アミノ酸末端における５個の免疫グロブリン様細胞外ド
メイン（アミノ酸残基１〜４５３）、ｉｉ）疎水性トラ
ンスメンブランドメイン（４５４〜４７７）、およｉｉ
ｉ）カルボキシ末端における短い細胞質ドメイン（４７
８〜５０５）を有している。ＩＣＡＭ−１は、免疫グロ
ブリン超遺伝子系の１員であり、そして白血球分子のた
めのリガンド、リンパ球機能関連分子−１（ＬＦＡ−
１）、インテグリン（integ rin）系の１員として機能
する。ＩＣＡＭ−１に対するＬＦＡ−１の異型結合は、
多様な細胞種の細胞接着をもたらし、そしてこれは、幅
広い範囲の免疫相互作用において重要であり、そして炎
症応答中のシトキンによるＩＣＡＭ−１発現を誘発させ
ることによって、炎症部位に対する白血球の局在化が調
節され得る。ＩＣＡＭ−１の主要構造は、２つの細胞接
着分子、即ち神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）およびミエ
リン関連糖蛋白質（ＭＡＧ）と同族であることが見いだ
された。
ンブラン蛋白質５０５アミノ酸であり、そしてｉ）この
アミノ酸末端における５個の免疫グロブリン様細胞外ド
メイン（アミノ酸残基１〜４５３）、ｉｉ）疎水性トラ
ンスメンブランドメイン（４５４〜４７７）、およｉｉ
ｉ）カルボキシ末端における短い細胞質ドメイン（４７
８〜５０５）を有している。ＩＣＡＭ−１は、免疫グロ
ブリン超遺伝子系の１員であり、そして白血球分子のた
めのリガンド、リンパ球機能関連分子−１（ＬＦＡ−
１）、インテグリン（integ rin）系の１員として機能
する。ＩＣＡＭ−１に対するＬＦＡ−１の異型結合は、
多様な細胞種の細胞接着をもたらし、そしてこれは、幅
広い範囲の免疫相互作用において重要であり、そして炎
症応答中のシトキンによるＩＣＡＭ−１発現を誘発させ
ることによって、炎症部位に対する白血球の局在化が調
節され得る。ＩＣＡＭ−１の主要構造は、２つの細胞接
着分子、即ち神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）およびミエ
リン関連糖蛋白質（ＭＡＧ）と同族であることが見いだ
された。
【０００６】一般的なウイルス、特にライノウイルスの
感染力を減少させるための研究のいくつかの方法には、
次のものが含まれる：ｉ）細胞に対するウイルスの結合
を防止する用途のための、細胞表面レセプタに対する抗
体の開発、ｉｉ）宿主細胞中の抗ウイルス状態を促進す
るためのインターフェロンの使用、ｉｉｉ）ウイルスの
複製を抑制するための種々の薬剤の開発、ｉｖ）ウイル
スカプシド蛋白質／ペプチドに対する抗体の開発、そし
てｖ）単離した細胞表面レセプタ蛋白質を用いたウイル
ス感染の防止（これは特に、細胞表面レセプタのウイル
ス結合ドメインを妨害するものである）。
感染力を減少させるための研究のいくつかの方法には、
次のものが含まれる：ｉ）細胞に対するウイルスの結合
を防止する用途のための、細胞表面レセプタに対する抗
体の開発、ｉｉ）宿主細胞中の抗ウイルス状態を促進す
るためのインターフェロンの使用、ｉｉｉ）ウイルスの
複製を抑制するための種々の薬剤の開発、ｉｖ）ウイル
スカプシド蛋白質／ペプチドに対する抗体の開発、そし
てｖ）単離した細胞表面レセプタ蛋白質を用いたウイル
ス感染の防止（これは特に、細胞表面レセプタのウイル
ス結合ドメインを妨害するものである）。
【０００７】この最後の方法を用いた上記Greve、 他、 C
ell、 56:879 (1989)には、精製したｔｍＩＣＡＭ−１を
インビトロでライノウイルスＨＲＶ３に結合させること
ができたと報告されている。ＨＲＶ２、ＨＲＶ３、およ
びＨＲＶ１４を用いた未公開の結果は、特に、ＩＣＡＭ
−１を以下で更に考察するような特別な形態および立体
配置で供給する条件下で結合化研究を行う場合、ライノ
ウイルスに対する結合能力と、ライノウイルスを中和す
る能力との間に正の相関関係があることを明らかに示し
ている。ＨＲＶ１４およびＨＲＶ２を用いた結果（未公
開）は、ウイルスのレセプタの種類と、インビトロでｔ
ｍＩＣＡＭ−１に結合する能力との間に正の相関関係が
あることを明らかに示している。即ち、主要レセプタで
あるＩＣＡＭ−１は、ＨＲＶ３、ＨＲＶ４、および他の
「主要」レセプタ抗原型と結合でき、そしてそれらを中
和できるが、一方それは、ＨＲＶ２、即ち「少数」レセ
プタ抗原型とは結合することもなく、それを中和するこ
ともない。精製したｔｍＩＣＡＭ−１を用いた更に一層
の試験（未公開）は、ライノウイルスを予めｔｍＩＣＡ
Ｍ−１で処理したとき、プラーク減少定量法においてラ
イノウイルスの感染を有効に抑制（１０ｎＭレセプタで
タイターの５０％の減少、および１００ｎＭレセプタ蛋
白質でタイターの１ログの減少）することを明らかに示
している。これらのデータは、１０ｎＭの見掛け解離定
数を有するヒーラー細胞のＩＣＡＭ−１に対するライノ
ウイルスの親和力と一致しており、そしてこれは、この
ウイルスに対する該レセプタの結合能力と、該ウイルス
を中和する能力との間に直接の関係があることを示して
いた。
ell、 56:879 (1989)には、精製したｔｍＩＣＡＭ−１を
インビトロでライノウイルスＨＲＶ３に結合させること
ができたと報告されている。ＨＲＶ２、ＨＲＶ３、およ
びＨＲＶ１４を用いた未公開の結果は、特に、ＩＣＡＭ
−１を以下で更に考察するような特別な形態および立体
配置で供給する条件下で結合化研究を行う場合、ライノ
ウイルスに対する結合能力と、ライノウイルスを中和す
る能力との間に正の相関関係があることを明らかに示し
ている。ＨＲＶ１４およびＨＲＶ２を用いた結果（未公
開）は、ウイルスのレセプタの種類と、インビトロでｔ
ｍＩＣＡＭ−１に結合する能力との間に正の相関関係が
あることを明らかに示している。即ち、主要レセプタで
あるＩＣＡＭ−１は、ＨＲＶ３、ＨＲＶ４、および他の
「主要」レセプタ抗原型と結合でき、そしてそれらを中
和できるが、一方それは、ＨＲＶ２、即ち「少数」レセ
プタ抗原型とは結合することもなく、それを中和するこ
ともない。精製したｔｍＩＣＡＭ−１を用いた更に一層
の試験（未公開）は、ライノウイルスを予めｔｍＩＣＡ
Ｍ−１で処理したとき、プラーク減少定量法においてラ
イノウイルスの感染を有効に抑制（１０ｎＭレセプタで
タイターの５０％の減少、および１００ｎＭレセプタ蛋
白質でタイターの１ログの減少）することを明らかに示
している。これらのデータは、１０ｎＭの見掛け解離定
数を有するヒーラー細胞のＩＣＡＭ−１に対するライノ
ウイルスの親和力と一致しており、そしてこれは、この
ウイルスに対する該レセプタの結合能力と、該ウイルス
を中和する能力との間に直接の関係があることを示して
いた。
【０００８】ｔｍＩＣＡＭ−１の大規模生産は現在のと
ころ商業的には不可能であるため、更に活性を示す形態
でｔｍＩＣＡＭ−１を維持するためには界面活性剤の使
用が必要であるため、ライノウイルス抑制因子としての
使用のためのレセプタ蛋白質製造の代替手段が望まれて
いる。切形ＩＣＡＭ−１分子を生産させるため遺伝学的
に変質させたｔｍＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ遺伝子の形態
が開発された（並びに、発現生成物を生産する細胞系：
U.S.S.N. 390,662）。これらの切形形態のＩＣＡＭ−１
（ｔＩＣＡＭ（４５３））および（ｔＩＣＡＭ（１８
５））は、該トランスメンブラン領域が欠失しており、
そして細胞培地中に分泌される。それらは、上記Greve、
他、 Cell、 56:879 (1989)中に記述されている定量法に
おいてライノウイルスと結合するが、しかしながら、ｔ
ｍＩＣＡＭ−１に比較して本質的に減少したレベルであ
る。従って、ライノウイルス感染の抑制因子としてのそ
れらの有効性は、ｔｍＩＣＡＭ−１のそれよりも低いと
考えられる。一般的に、共出願中のU.S.S.N. 130,378、
U.S.S.N. 239,570、 U.S.S.N. 262,428、 U.S.S.N. 239,5
71およびU.S.S.N. 390,662参照。
ころ商業的には不可能であるため、更に活性を示す形態
でｔｍＩＣＡＭ−１を維持するためには界面活性剤の使
用が必要であるため、ライノウイルス抑制因子としての
使用のためのレセプタ蛋白質製造の代替手段が望まれて
いる。切形ＩＣＡＭ−１分子を生産させるため遺伝学的
に変質させたｔｍＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ遺伝子の形態
が開発された（並びに、発現生成物を生産する細胞系：
U.S.S.N. 390,662）。これらの切形形態のＩＣＡＭ−１
（ｔＩＣＡＭ（４５３））および（ｔＩＣＡＭ（１８
５））は、該トランスメンブラン領域が欠失しており、
そして細胞培地中に分泌される。それらは、上記Greve、
他、 Cell、 56:879 (1989)中に記述されている定量法に
おいてライノウイルスと結合するが、しかしながら、ｔ
ｍＩＣＡＭ−１に比較して本質的に減少したレベルであ
る。従って、ライノウイルス感染の抑制因子としてのそ
れらの有効性は、ｔｍＩＣＡＭ−１のそれよりも低いと
考えられる。一般的に、共出願中のU.S.S.N. 130,378、
U.S.S.N. 239,570、 U.S.S.N. 262,428、 U.S.S.N. 239,5
71およびU.S.S.N. 390,662参照。
【０００９】1988年9月1日出願のU.S.S.N. 239,571およ
びそのＣＩＰ出願U.S.S.N. 262,428およびU.S.S.N. 39
0,662は、溶液中にトランスメンブラン蛋白質を維持す
るため非イオン系界面活性剤を用いたライノウイルス感
染の抑制因子としてのトランスメンブランライノウイル
スレセプタの使用を意図したものであり、更にトランス
メンブラン細胞間接着分子（ｔｍＩＣＡＭ）の細胞外ド
メイン１、２および３を有し、そして切形形態が可溶化
のための非イオン系界面活性剤の存在を必要としないと
ころの、切形細胞間接着分子（ｔＩＣＡＭ）を意図した
ものであり、そして1987年12月8日出願のU.S.S.N. 130,
378およびそのＣＩＰ出願U.S.S.N. 262,570は、主要ラ
イノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）を発現する移入された
細胞系、および細胞間接着分子としてのＨＲＲの同定を
意図したものであり、そして1989年1月24日出願のU.S.
S.N. 301,192およびそのＣＩＰ出願U.S.S.N. 449,356
は、ｔｍＩＣＡＭに関連しているがｔｍＩＣＡＭとは異
なる天然に存在する可溶ＩＣＡＭ（ｓＩＣＡＭ）（この
ｓＩＣＡＭは、該トランスメンブラン領域および細胞質
領域に伸びているアミノ酸が欠失しており、更に、この
ｓＩＣＡＭはそのＣ末端に１１個のアミノ酸から成る新
規な配列を有している）を意図したものである。次に、
Marlin，S.D.et al.，Nature 344：70（1990）には、可
溶切形形態の、通常はメンブランと結合しているＩＣＡ
Ｍ−１分子（彼らは、これをｓＩＣＡＭ−１と呼んでい
る）の建造および精製が報告されている。これは、トラ
ンスメンブランドメインと、欠失した蛋白質を有する細
胞質ドメインの両方を有しており、そしてこれは、その
カルボキシル末端が控え目に単一置換されていること
で、野生型のアミノ酸配列とは異なっている。これは、
ＩＣＡＭ−１の残基１〜４５２と、Ｃ末端の新規なフェ
ニルアラニン残基とを有している。これらの研究者達
は、細胞とＨＲＶ１４ウイルスとが結合するのを防止す
るためはｓＩＣＡＭ−１が＞５０μｇ／ｍＬのレベルで
必要であることを示した。しかしながら、彼らはまた、
培地中に一定して存在している場合、１μｇ／ｍＬ（１
８ｎＭ）のｓＩＣＡＭ−１がＨＲＶ５４による感染の進
行を５０％まで抑制できることも見い出した。この抑制
活性は、このウイルスのレセプタの種類と関連していた
（しかしながら、ここでは、ポリオウイルスまたはＨＲ
Ｖ２ではなくコクサッキーＡ１３が抑制され、そしてＨ
ＲＶ１４に関する感染力データは報告されていなかっ
た）。このように、彼らは、結合と感染力抑制との間の
直接の相関関係を示していなかった。更に、下記により
詳しく考察するように、Marlin，et al．が得た結果を
再現する試みは不成功に終わり、そしてこのことは、ウ
イルスのタイターを５０％減少させるためには、より高
い濃度の切形形態のＩＣＡＭ（トランスメンブランＩＣ
ＡＭよりも１０倍高い）が必要であることを示唆してい
る。
びそのＣＩＰ出願U.S.S.N. 262,428およびU.S.S.N. 39
0,662は、溶液中にトランスメンブラン蛋白質を維持す
るため非イオン系界面活性剤を用いたライノウイルス感
染の抑制因子としてのトランスメンブランライノウイル
スレセプタの使用を意図したものであり、更にトランス
メンブラン細胞間接着分子（ｔｍＩＣＡＭ）の細胞外ド
メイン１、２および３を有し、そして切形形態が可溶化
のための非イオン系界面活性剤の存在を必要としないと
ころの、切形細胞間接着分子（ｔＩＣＡＭ）を意図した
ものであり、そして1987年12月8日出願のU.S.S.N. 130,
378およびそのＣＩＰ出願U.S.S.N. 262,570は、主要ラ
イノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）を発現する移入された
細胞系、および細胞間接着分子としてのＨＲＲの同定を
意図したものであり、そして1989年1月24日出願のU.S.
S.N. 301,192およびそのＣＩＰ出願U.S.S.N. 449,356
は、ｔｍＩＣＡＭに関連しているがｔｍＩＣＡＭとは異
なる天然に存在する可溶ＩＣＡＭ（ｓＩＣＡＭ）（この
ｓＩＣＡＭは、該トランスメンブラン領域および細胞質
領域に伸びているアミノ酸が欠失しており、更に、この
ｓＩＣＡＭはそのＣ末端に１１個のアミノ酸から成る新
規な配列を有している）を意図したものである。次に、
Marlin，S.D.et al.，Nature 344：70（1990）には、可
溶切形形態の、通常はメンブランと結合しているＩＣＡ
Ｍ−１分子（彼らは、これをｓＩＣＡＭ−１と呼んでい
る）の建造および精製が報告されている。これは、トラ
ンスメンブランドメインと、欠失した蛋白質を有する細
胞質ドメインの両方を有しており、そしてこれは、その
カルボキシル末端が控え目に単一置換されていること
で、野生型のアミノ酸配列とは異なっている。これは、
ＩＣＡＭ−１の残基１〜４５２と、Ｃ末端の新規なフェ
ニルアラニン残基とを有している。これらの研究者達
は、細胞とＨＲＶ１４ウイルスとが結合するのを防止す
るためはｓＩＣＡＭ−１が＞５０μｇ／ｍＬのレベルで
必要であることを示した。しかしながら、彼らはまた、
培地中に一定して存在している場合、１μｇ／ｍＬ（１
８ｎＭ）のｓＩＣＡＭ−１がＨＲＶ５４による感染の進
行を５０％まで抑制できることも見い出した。この抑制
活性は、このウイルスのレセプタの種類と関連していた
（しかしながら、ここでは、ポリオウイルスまたはＨＲ
Ｖ２ではなくコクサッキーＡ１３が抑制され、そしてＨ
ＲＶ１４に関する感染力データは報告されていなかっ
た）。このように、彼らは、結合と感染力抑制との間の
直接の相関関係を示していなかった。更に、下記により
詳しく考察するように、Marlin，et al．が得た結果を
再現する試みは不成功に終わり、そしてこのことは、ウ
イルスのタイターを５０％減少させるためには、より高
い濃度の切形形態のＩＣＡＭ（トランスメンブランＩＣ
ＡＭよりも１０倍高い）が必要であることを示唆してい
る。
【００１０】今日まで、誰も、ｔｍＩＣＡＭ−１と同じ
程有効に、ヒトのライノウイルスと結合しそしてその感
染力を有効に減少させる（単離された細胞表面レセプタ
蛋白質を用いたウイルス感染の防止による）薬剤を示す
ことはできなかった、従って、本分野では、ヒトのライ
ノウイルスに対して有効に結合でき、そしてＨＲＶ感染
力を有効に減少させることができる形態のＩＣＡＭ−１
に対する必要性が継続して存在している。
程有効に、ヒトのライノウイルスと結合しそしてその感
染力を有効に減少させる（単離された細胞表面レセプタ
蛋白質を用いたウイルス感染の防止による）薬剤を示す
ことはできなかった、従って、本分野では、ヒトのライ
ノウイルスに対して有効に結合でき、そしてＨＲＶ感染
力を有効に減少させることができる形態のＩＣＡＭ−１
に対する必要性が継続して存在している。
【００１１】
【発明の簡単な要約】本発明は、多量体配置のトランス
メンブランＩＣＡＭ（ｔｍＩＣＡＭ−１）、並びに多量
体配置の非トランスメンブランＩＣＡＭ（ｔＩＣＡＭ）
を提供するものである。非トランスメンブランＩＣＡＭ
は切形ＩＣＡＭ、即ち本質的にカルボキシル細胞内ドメ
インを有していなくそして疎水性メンブランドメインを
有していないＩＣＡＭとしても知られており、そしてこ
れには、ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８
５）の形態が含まれるが、これに限定されるものではな
い。ＩＣＡＭの非トランスメンブラン形態は、連結を容
易にするＩＣＡＭの官能誘導体およびｔＩＣＡＭのミュ
ーテイン（mutein）形態を含むことができる。この切形
ＩＣＡＭ形態が多量体配置にあり、好適には二量体とし
て存在している場合、これらはヒトのライノウイルスの
結合を増強し、そしてウイルスの感染を減少させること
ができる。このＩＣＡＭの異なる形態、即ちトランスメ
ンブランおよび非トランスメンブランは、支持体に吸着
させることによって多量化できる。この支持体は、ニト
ロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリマー類、
並びにアミノデキストラン、或はスペーサーまたはリン
カーの有無に拘らず、ｔＩＣＡＭを吸着できるか或はｔ
ＩＣＡＭと連結できる種々の不活性ポリマー類からでき
ていてもよい。
メンブランＩＣＡＭ（ｔｍＩＣＡＭ−１）、並びに多量
体配置の非トランスメンブランＩＣＡＭ（ｔＩＣＡＭ）
を提供するものである。非トランスメンブランＩＣＡＭ
は切形ＩＣＡＭ、即ち本質的にカルボキシル細胞内ドメ
インを有していなくそして疎水性メンブランドメインを
有していないＩＣＡＭとしても知られており、そしてこ
れには、ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８
５）の形態が含まれるが、これに限定されるものではな
い。ＩＣＡＭの非トランスメンブラン形態は、連結を容
易にするＩＣＡＭの官能誘導体およびｔＩＣＡＭのミュ
ーテイン（mutein）形態を含むことができる。この切形
ＩＣＡＭ形態が多量体配置にあり、好適には二量体とし
て存在している場合、これらはヒトのライノウイルスの
結合を増強し、そしてウイルスの感染を減少させること
ができる。このＩＣＡＭの異なる形態、即ちトランスメ
ンブランおよび非トランスメンブランは、支持体に吸着
させることによって多量化できる。この支持体は、ニト
ロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリマー類、
並びにアミノデキストラン、或はスペーサーまたはリン
カーの有無に拘らず、ｔＩＣＡＭを吸着できるか或はｔ
ＩＣＡＭと連結できる種々の不活性ポリマー類からでき
ていてもよい。
【００１２】多量体ＩＣＡＭはまた、このＩＣＡＭを、
例えば抗体、蛋白質担体、或は架橋剤と連結させること
によって多量化できる。抗体の例には、抗ＩＣＡＭ抗
体、ＣＬ ２０３が含まれ、適切な蛋白質担体にはアル
ブミンおよびプロテオグリカン類が含まれ、そして適切
な架橋剤にはヘテロ二官能およびホモ二官能架橋剤、例
えば二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、イミ
ドエステル、またはビス−マレイミドヘキサン類が含ま
れる。連結を容易にするため、このＩＣＡＭは、反応活
性を示すアミノ酸残基、例えばリジン、システイン、或
は連結を容易にする部位（類）を与える他のアミノ酸残
基（類）を用いて、カルボキシル末端またはアミノ末端
のどちらかを修飾することができる。これらの種類の修
飾されたＩＣＡＭはミューテインと呼ばれる。加うる
に、このＩＣＡＭは、どちらかの末端を修飾して、オリ
ゴマーミセルの形成を促進させることのできる脂質を含
有することができる。多量体ＩＣＡＭを構成するこのＩ
ＣＡＭは、完全グリコシル化または部分グリコシル化さ
せるか、或は非グリコシル化であり得る。
例えば抗体、蛋白質担体、或は架橋剤と連結させること
によって多量化できる。抗体の例には、抗ＩＣＡＭ抗
体、ＣＬ ２０３が含まれ、適切な蛋白質担体にはアル
ブミンおよびプロテオグリカン類が含まれ、そして適切
な架橋剤にはヘテロ二官能およびホモ二官能架橋剤、例
えば二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、イミ
ドエステル、またはビス−マレイミドヘキサン類が含ま
れる。連結を容易にするため、このＩＣＡＭは、反応活
性を示すアミノ酸残基、例えばリジン、システイン、或
は連結を容易にする部位（類）を与える他のアミノ酸残
基（類）を用いて、カルボキシル末端またはアミノ末端
のどちらかを修飾することができる。これらの種類の修
飾されたＩＣＡＭはミューテインと呼ばれる。加うる
に、このＩＣＡＭは、どちらかの末端を修飾して、オリ
ゴマーミセルの形成を促進させることのできる脂質を含
有することができる。多量体ＩＣＡＭを構成するこのＩ
ＣＡＭは、完全グリコシル化または部分グリコシル化さ
せるか、或は非グリコシル化であり得る。
【００１３】本発明はまた、リガンド、即ちヒトのライ
ノウイルス、および「主要」群レセプタウイルス類、リ
ンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、熱帯マラリア
原虫（マラリア）などに対するＩＣＡＭおよびそれらの
機能誘導体の結合を増強させるための方法（ここで、こ
のＩＣＡＭは、ある形態およびある立体配置で、該リガ
ンドに供給され、そしてここで、該リガンドに対する該
ＩＣＡＭの結合が増強される）を提供するものである。
このＩＣＡＭの形態は、トランスメンブランまたは非ト
ランスメンブラン（切形）のどちらかであり得る。切形
ＩＣＡＭは、本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有
していなくそして疎水性メンブランドメインを有してい
ないＩＣＡＭである。ＩＣＡＭの好適な切形形態には、
ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）が含
まれる。このＩＣＡＭは、そのカルボキシル末端または
アミノ末端のどちらかを修飾して、多量体ＩＣＡＭの形
成を増強させることができる。これらの修飾には、反応
性を示すアミノ酸残基、例えばリジン、システイン、或
は連結を容易にさせるための部位（類）を与える他のア
ミノ酸残基（類）の付加が含まれる。この方法のＩＣＡ
Ｍのためのヌクレオチド配列は、ベクター、例えばプラ
スミド中に含有させることができ、そしてこのベクター
を宿主細胞、例えば真核もしくは原核細胞に導入するこ
とができる。好適な真核細胞は、哺乳動物の細胞、即ち
チャイニーズハムスター卵巣細胞であり、好適な原核細
胞は大腸菌である。
ノウイルス、および「主要」群レセプタウイルス類、リ
ンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、熱帯マラリア
原虫（マラリア）などに対するＩＣＡＭおよびそれらの
機能誘導体の結合を増強させるための方法（ここで、こ
のＩＣＡＭは、ある形態およびある立体配置で、該リガ
ンドに供給され、そしてここで、該リガンドに対する該
ＩＣＡＭの結合が増強される）を提供するものである。
このＩＣＡＭの形態は、トランスメンブランまたは非ト
ランスメンブラン（切形）のどちらかであり得る。切形
ＩＣＡＭは、本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有
していなくそして疎水性メンブランドメインを有してい
ないＩＣＡＭである。ＩＣＡＭの好適な切形形態には、
ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）が含
まれる。このＩＣＡＭは、そのカルボキシル末端または
アミノ末端のどちらかを修飾して、多量体ＩＣＡＭの形
成を増強させることができる。これらの修飾には、反応
性を示すアミノ酸残基、例えばリジン、システイン、或
は連結を容易にさせるための部位（類）を与える他のア
ミノ酸残基（類）の付加が含まれる。この方法のＩＣＡ
Ｍのためのヌクレオチド配列は、ベクター、例えばプラ
スミド中に含有させることができ、そしてこのベクター
を宿主細胞、例えば真核もしくは原核細胞に導入するこ
とができる。好適な真核細胞は、哺乳動物の細胞、即ち
チャイニーズハムスター卵巣細胞であり、好適な原核細
胞は大腸菌である。
【００１４】この方法のＩＣＡＭの好適な立体配置は、
多量体であり、二量体が最も好適である。この多量体配
置は、第２ＩＣＡＭと架橋した第１ＩＣＡＭから成る
か、或はＩＣＡＭを支持体に吸着させ、それによって多
量体配置を生じさせることから成なっていてもよい。こ
の支持体は、高分子量の本質的に不活性なポリマー類、
例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポ
リマー類、並びにアミノデキストラン、或はスペーサー
またはリンカーの有無に拘らず、ＩＣＡＭを吸着できる
か或はＩＣＡＭと連結できる種々のポリマー類であって
もよい。この多量体ＩＣＡＭは、例えば抗体、蛋白質担
体、または架橋剤と連結させることによって多量化でき
る。好適な架橋剤には、ヘテロ二官能およびホモ二官能
架橋剤、例えば二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエス
テル、イミドエステル、ビス−マレイミドヘキサン類が
含まれ、好適な蛋白質担体には、アルブミンおよびプロ
テオグリカンが含まれ、好適な抗体の例にはＣＬ ２０
３、およびＨＲＶ結合を妨げないいかなる他の抗体も含
まれる。
多量体であり、二量体が最も好適である。この多量体配
置は、第２ＩＣＡＭと架橋した第１ＩＣＡＭから成る
か、或はＩＣＡＭを支持体に吸着させ、それによって多
量体配置を生じさせることから成なっていてもよい。こ
の支持体は、高分子量の本質的に不活性なポリマー類、
例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポ
リマー類、並びにアミノデキストラン、或はスペーサー
またはリンカーの有無に拘らず、ＩＣＡＭを吸着できる
か或はＩＣＡＭと連結できる種々のポリマー類であって
もよい。この多量体ＩＣＡＭは、例えば抗体、蛋白質担
体、または架橋剤と連結させることによって多量化でき
る。好適な架橋剤には、ヘテロ二官能およびホモ二官能
架橋剤、例えば二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエス
テル、イミドエステル、ビス−マレイミドヘキサン類が
含まれ、好適な蛋白質担体には、アルブミンおよびプロ
テオグリカンが含まれ、好適な抗体の例にはＣＬ ２０
３、およびＨＲＶ結合を妨げないいかなる他の抗体も含
まれる。
【００１５】本発明はまた、薬学的に許容される溶媒、
希釈剤、補助剤または担体を含有し、そして活性材料と
して、ヒトのライノウイルスへの結合活性およびウイル
ス感染の減少活性を有することによって特徴づけられる
有効量のポリペプチドを含有している新規な薬学的組成
物を提供するものである。
希釈剤、補助剤または担体を含有し、そして活性材料と
して、ヒトのライノウイルスへの結合活性およびウイル
ス感染の減少活性を有することによって特徴づけられる
有効量のポリペプチドを含有している新規な薬学的組成
物を提供するものである。
【００１６】本発明の他の面および利点は、本発明を実
施するための数多くの説明的実施例を含む下記の詳細な
説明を考慮するとき明らかになるであろう。
施するための数多くの説明的実施例を含む下記の詳細な
説明を考慮するとき明らかになるであろう。
【００１７】
【詳細な説明】上に示したように、哺乳動物細胞から単
離されたｔｍＩＣＡＭ−１は、主要レセプタ群に属する
ヒトのライノウイルス類を中和する能力を有している
が、しかしそれは、界面活性剤の入っている溶液中に保
持されている場合のみである。ＩＣＡＭ−１の特定の可
溶フラグメントはウイルスとの結合に対して減少した能
力を有しており、そしてｔｍＩＣＡＭ−１と同じ程有効
には感染力を減少させないことを見い出した。今日ま
で、誰も、この減少した能力の理由を確かめることは出
来なかった。
離されたｔｍＩＣＡＭ−１は、主要レセプタ群に属する
ヒトのライノウイルス類を中和する能力を有している
が、しかしそれは、界面活性剤の入っている溶液中に保
持されている場合のみである。ＩＣＡＭ−１の特定の可
溶フラグメントはウイルスとの結合に対して減少した能
力を有しており、そしてｔｍＩＣＡＭ−１と同じ程有効
には感染力を減少させないことを見い出した。今日ま
で、誰も、この減少した能力の理由を確かめることは出
来なかった。
【００１８】他の人達によって、ライノウイルスのレセ
プタが五量体の形態で細胞上に存在しているとの提案が
なされた。Tomassini、 J. およびColonno、 R.、Virol.、
58:290-295 (1986)。しかしながら、ヒーラー細胞と結
合しているライノウイルスおよび抗ＩＣＡＭ−１単クロ
ーン抗体の定量（この共発明者の未公開結果）は、細胞
１個当たり最高で３０，０００ビリオン結合（35Ｓメチ
オニン標識したＨＲＶの結合により測定）であり、そし
て細胞１個当たり５０，０００〜６０，０００個のＩＣ
ＡＭ−１分子（ＩＣＡＭ−１と、放射能標識したＭａｂ
の結合により測定）であることがわかった。これらの結
果により、更に、細胞の表面上のＩＣＡＭ−１分子が、
細胞に結合しているＨＲＶ粒子に対して５個というより
はむしろ、１および２個のみが結合する可能性があるこ
とを試験する研究を促進させた。Ｃ末端トランスメンブ
ランドメインが欠失しており、そして哺乳動物細胞の培
地中に分泌させられるところの、遺伝子工学で製造した
形態の切形ＩＣＡＭ−１を、組換遺伝子を用いて移入し
た。そのための遺伝子を用いて安定に移入させた細胞の
消費培地からの、該分泌されたＩＣＡＭ分子の２つ、即
ちｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）の
精製を以下に説明する。溶液−ＨＲＶ結合定量法におい
て、そしてＨＲＶ中和定量法において、ｔＩＣＡＭ（４
５３）は、ｔｍＩＣＡＭ−１に比較して、ＨＲＶに対し
て本質的に減少した（約２００倍）親和性を有すること
を見い出した。しかしながら、ｔｍＩＣＡＭ−１、或は
ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）のい
ずれかを、最初に、数多くの不溶支持体、例えばニトロ
セルロース、ＰＶＤＦ（二フッ化ポリビニリデン）、ま
たはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）メンブランのい
ずれか１つに吸着させ、そして次に、放射性ＨＲＶと一
緒に培養すると、ｔＩＣＡＭ（４５３）のウイルス結合
活性がｔｍＩＣＡＭ−１のそれに匹敵するようになる。
ＨＲＶに対する多量体ｔＩＣＡＭ（４５３）、或は多量
体ｔＩＣＡＭ（１８５）のこの結合は、ヒーラー細胞上
のＩＣＡＭ−１に対するＨＲＶの結合と同様の特性を有
しており、即ち、これは抗ＩＣＡＭ−１ Ｍａｂで抑制
され、そしてこれは主要レセプタ群のライノウイルスに
とって特異的であり、並びにこれは、細胞に対するライ
ノウイルスの結合と同様な温度依存性を有している（即
ち、３７℃で良く結合し、そして４℃では検出できな
い）。
プタが五量体の形態で細胞上に存在しているとの提案が
なされた。Tomassini、 J. およびColonno、 R.、Virol.、
58:290-295 (1986)。しかしながら、ヒーラー細胞と結
合しているライノウイルスおよび抗ＩＣＡＭ−１単クロ
ーン抗体の定量（この共発明者の未公開結果）は、細胞
１個当たり最高で３０，０００ビリオン結合（35Ｓメチ
オニン標識したＨＲＶの結合により測定）であり、そし
て細胞１個当たり５０，０００〜６０，０００個のＩＣ
ＡＭ−１分子（ＩＣＡＭ−１と、放射能標識したＭａｂ
の結合により測定）であることがわかった。これらの結
果により、更に、細胞の表面上のＩＣＡＭ−１分子が、
細胞に結合しているＨＲＶ粒子に対して５個というより
はむしろ、１および２個のみが結合する可能性があるこ
とを試験する研究を促進させた。Ｃ末端トランスメンブ
ランドメインが欠失しており、そして哺乳動物細胞の培
地中に分泌させられるところの、遺伝子工学で製造した
形態の切形ＩＣＡＭ−１を、組換遺伝子を用いて移入し
た。そのための遺伝子を用いて安定に移入させた細胞の
消費培地からの、該分泌されたＩＣＡＭ分子の２つ、即
ちｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）の
精製を以下に説明する。溶液−ＨＲＶ結合定量法におい
て、そしてＨＲＶ中和定量法において、ｔＩＣＡＭ（４
５３）は、ｔｍＩＣＡＭ−１に比較して、ＨＲＶに対し
て本質的に減少した（約２００倍）親和性を有すること
を見い出した。しかしながら、ｔｍＩＣＡＭ−１、或は
ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）のい
ずれかを、最初に、数多くの不溶支持体、例えばニトロ
セルロース、ＰＶＤＦ（二フッ化ポリビニリデン）、ま
たはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）メンブランのい
ずれか１つに吸着させ、そして次に、放射性ＨＲＶと一
緒に培養すると、ｔＩＣＡＭ（４５３）のウイルス結合
活性がｔｍＩＣＡＭ−１のそれに匹敵するようになる。
ＨＲＶに対する多量体ｔＩＣＡＭ（４５３）、或は多量
体ｔＩＣＡＭ（１８５）のこの結合は、ヒーラー細胞上
のＩＣＡＭ−１に対するＨＲＶの結合と同様の特性を有
しており、即ち、これは抗ＩＣＡＭ−１ Ｍａｂで抑制
され、そしてこれは主要レセプタ群のライノウイルスに
とって特異的であり、並びにこれは、細胞に対するライ
ノウイルスの結合と同様な温度依存性を有している（即
ち、３７℃で良く結合し、そして４℃では検出できな
い）。
【００１９】ここで用いるところの下記に示す省略形お
よび言葉には下記の定義が含まれているが、必ずしもこ
れに限定されるものではない。
よび言葉には下記の定義が含まれているが、必ずしもこ
れに限定されるものではない。
【００２０】省略形 定義 ＩＣＡＭ 細胞間接着分子 − この蛋白質の短縮されていな い（トランスメンブラン）および切形（非トランス メンブラン）形態の両方を示すために用いられても よい。
【００２１】 ＩＣＡＭ−１ 細胞間接着分子−１、またＩＣＡＭ、ｔｍＩＣＡＭ −１としても知られている；短縮されていないトラ ンスメンブラン蛋白質を示す。
【００２２】 ｔｍＩＣＡＭ−１ トランスメンブラン細胞間接着分子−１、またヒト のライノウイルスレセプタ（ＨＲＲ）としても知ら れている − 可溶化のため、例えば界面活性剤条 件が必要とされる。
【００２３】 ｓＩＣＡＭ−１ トランスメンブランと、欠失しているＩＣＡＭ−１ の細胞質ドメインの両方を有している天然に存在す る可溶ＩＣＡＭ−１；アミノ酸１〜４４２と１１個 の新規アミノ酸；フェニルアラリンで置き換えられ た末端チロシンを有するアミノ酸１〜４５３を含有 するｔＩＣＡＭ４５３（Staunton、 他）から区別さ れ得る。
【００２４】 ｔＩＣＡＭ 切形細胞間接着分子、非トランスメンブランＩＣＡ Ｍとしても知られている。
【００２５】 ｔＩＣＡＭ（４５３） ＩＣＡＭの切形形態 − ＩＣＡＭの細胞外アミノ 末端ドメイン；トランスメンブランドメインと、欠 失しているＩＣＡＭ−１の細胞質ドメインとを有し ている；Marlin、 他はまた、ｓＩＣＡＭ−１と呼ん でいる。
【００２６】 ｔＩＣＡＭ（１８５） ＩＣＡＭの切形形態 − トランスメンブランドメ インと、欠失しているＩＣＡＭ−１の細胞質ドメイ ンとを有するＩＣＡＭの細胞外アミノ末端ドメイン 。
【００２７】「多量化」および「多量体」は、二量化お
よび二量体に限定されるものではなく、これにはＩＣＡ
Ｍ−１分子のいかなる多量体配置、或はウイルスの結合
および感染力の減少に有効なそれらのフラグメントも含
まれる。
よび二量体に限定されるものではなく、これにはＩＣＡ
Ｍ−１分子のいかなる多量体配置、或はウイルスの結合
および感染力の減少に有効なそれらのフラグメントも含
まれる。
【００２８】「トランスメンブラン」は、一般に、疎水
性メンブランに伸びている配列を有しており、そして結
合したメンブランであるＩＣＡＭ−１蛋白質分子の形態
を意味している。
性メンブランに伸びている配列を有しており、そして結
合したメンブランであるＩＣＡＭ−１蛋白質分子の形態
を意味している。
【００２９】「非トランスメンブラン」は、一般に、結
合したメンブランというよりはむしろ、可溶蛋白質とし
て細胞培地中に分泌される蛋白質のいわゆる「切形」形
態、並びに非イオン系界面活性剤中に細胞を溶解するこ
とによって細胞メンブランから可溶化された「トランス
メンブラン」形態を含むＩＣＡＭ−１蛋白質の可溶形態
を意味している。
合したメンブランというよりはむしろ、可溶蛋白質とし
て細胞培地中に分泌される蛋白質のいわゆる「切形」形
態、並びに非イオン系界面活性剤中に細胞を溶解するこ
とによって細胞メンブランから可溶化された「トランス
メンブラン」形態を含むＩＣＡＭ−１蛋白質の可溶形態
を意味している。
【００３０】「切形」には、一般に、ＩＣＡＭの短縮さ
れていないトランスメンブラン形態以下のいかなる蛋白
質形態も含まれる。
れていないトランスメンブラン形態以下のいかなる蛋白
質形態も含まれる。
【００３１】「形態」は、一般にここでは、短縮されて
いない（全長）ＩＣＡＭ形態と、部分的な長さ（部分
長）ＩＣＡＭ形態とを区別するために用い、一方、
「（立体）配置」は、一般に、可能なＩＣＡＭ形態の単
量体、二量体、および多量体配置を区別するために用い
る。
いない（全長）ＩＣＡＭ形態と、部分的な長さ（部分
長）ＩＣＡＭ形態とを区別するために用い、一方、
「（立体）配置」は、一般に、可能なＩＣＡＭ形態の単
量体、二量体、および多量体配置を区別するために用い
る。
【００３２】ＩＣＡＭ−１分子の全ての形態および立体
配置は、単量体または多量体に拘らず、そしてミューテ
インを含む、その全長またはフラグメントに拘らず、こ
の分子が、ウイルスの結合および感染力の減少において
有効性を保持している限り、完全にもしくは部分的にグ
リコシル化されていてもよいか、或は完全に非グリコシ
ル化であってもよい。
配置は、単量体または多量体に拘らず、そしてミューテ
インを含む、その全長またはフラグメントに拘らず、こ
の分子が、ウイルスの結合および感染力の減少において
有効性を保持している限り、完全にもしくは部分的にグ
リコシル化されていてもよいか、或は完全に非グリコシ
ル化であってもよい。
【００３３】「リガンド」は、一般にここでは、ＩＣＡ
Ｍの形態および立体配置のいずれかの少なくとも１つと
結合できる何かを含むために用いられ、そしてこれに
は、限定されるものではないが、ヒトのライノウイル
ス、「主要」群のヒトライノウイルスレセプタと結合す
る他のウイルス、リンパ球機能関連抗原−１、および熱
帯マラリヤ原虫（マラリヤ）が含まれる。
Ｍの形態および立体配置のいずれかの少なくとも１つと
結合できる何かを含むために用いられ、そしてこれに
は、限定されるものではないが、ヒトのライノウイル
ス、「主要」群のヒトライノウイルスレセプタと結合す
る他のウイルス、リンパ球機能関連抗原−１、および熱
帯マラリヤ原虫（マラリヤ）が含まれる。
【００３４】そして、「ヒトのライノウイルス」には、
一般に、Hamparian、 V.、 他、Virol.、 159:191-192 (19
87）で分類されているような全てのヒト血細型のヒトラ
イノウイルスが含まれる。
一般に、Hamparian、 V.、 他、Virol.、 159:191-192 (19
87）で分類されているような全てのヒト血細型のヒトラ
イノウイルスが含まれる。
【００３５】下記の実施例は本発明の実施を説明するも
のである。
のである。
【００３６】実施例１は、ライノウイルスの増殖、精製
および定量に関する。
および定量に関する。
【００３７】実施例２は、ＩＣＡＭ−１に対する単クロ
ーン抗体の生産および単離に関する。
ーン抗体の生産および単離に関する。
【００３８】実施例３は、短縮されていないＩＣＡＭ−
１ ｃＤＮＡからの非トランスメンブラン切形形態のＩ
ＣＡＭ ｃＤＮＡの建造に関する。
１ ｃＤＮＡからの非トランスメンブラン切形形態のＩ
ＣＡＭ ｃＤＮＡの建造に関する。
【００３９】実施例４は、哺乳動物細胞のトランスフェ
クションおよびＩＣＡＭ ｃＤＮＡの非トランスメンブ
ラン切形形態の発現に関する。
クションおよびＩＣＡＭ ｃＤＮＡの非トランスメンブ
ラン切形形態の発現に関する。
【００４０】実施例５は、ＩＣＡＭ−１の非トランスメ
ンブラン切形形態の単離および精製に関する。
ンブラン切形形態の単離および精製に関する。
【００４１】実施例６は、ｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡ
Ｍ（１８５）、およびｔＩＣＡＭ（４５３）の放射能標
識、および単クローン抗体に対する保持された結合能力
の立証に関する。
Ｍ（１８５）、およびｔＩＣＡＭ（４５３）の放射能標
識、および単クローン抗体に対する保持された結合能力
の立証に関する。
【００４２】実施例７は、トランスメンブランおよびト
ランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ−１のヒトライノ
ウイルス結合の定量に関する。
ランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ−１のヒトライノ
ウイルス結合の定量に関する。
【００４３】実施例８は、ＣＬ２０３ ＩｇＧ抗体がも
たらすｔＩＣＡＭ（４５３）の架橋に関する。
たらすｔＩＣＡＭ（４５３）の架橋に関する。
【００４４】実施例９は、トランスメンブランおよび非
トランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ−１の多量化に
関する。
トランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ−１の多量化に
関する。
【００４５】実施例１０は、多量体トランスメンブラン
および多量体非トランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ
−１の感染力−中和定量に関する。
および多量体非トランスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ
−１の感染力−中和定量に関する。
【００４６】そして、実施例１１は、ＩＣＡＭ／ＦＬＡ
−１相互作用の有効な抑制因子としての、トランスメン
ブランおよび切形形態のＩＣＡＭ−１の多量体形態の使
用に関する。
−１相互作用の有効な抑制因子としての、トランスメン
ブランおよび切形形態のＩＣＡＭ−１の多量体形態の使
用に関する。
【００４７】
【実施例】実施例１ ライノウイルスの増殖、精製および定量 Abraham、 G.、 他、J. Virol.、 51:340 (1984）およびGr
eve、 他、Cell、 56:839 (1989）中に本質的に記述され
ているように、ライノウイルスを増殖させ、精製し、そ
して定量した。これらの試験のために選択した血細型に
は、ＨＲＶ１４、即ちこの分野の標準型、およびＨＲＶ
３（これは、ＨＲＶ１４よりも約１０倍高い、ＩＣＡＭ
に対する親和力を有している）が含まれる。ＨＲＶ２
（これは、「主要」レセプタとよりはむしろ「少数」レ
セプタと結合する）を負の対照として用いた。
eve、 他、Cell、 56:839 (1989）中に本質的に記述され
ているように、ライノウイルスを増殖させ、精製し、そ
して定量した。これらの試験のために選択した血細型に
は、ＨＲＶ１４、即ちこの分野の標準型、およびＨＲＶ
３（これは、ＨＲＶ１４よりも約１０倍高い、ＩＣＡＭ
に対する親和力を有している）が含まれる。ＨＲＶ２
（これは、「主要」レセプタとよりはむしろ「少数」レ
セプタと結合する）を負の対照として用いた。
【００４８】ライノウイルスＨＲＶ２、ＨＲＶ３、およ
びＨＲＶ１４は、American Type Culture Collectionか
ら入手し、プラーク精製し、そして感染させたヒーラー
（ＨｅＬａ）−Ｓ３細胞の溶解産物から単離した。精製
したライノウイルスは、ポリエチレングリコール沈澱お
よびサクロース勾配沈降で調製した。細胞の純度は、カ
プシド蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および電子顕微鏡
で測定した。Minor、 P.D.、 Growth著、 「ピコルナウイ
ルスの定量および精製」（assay and purification of
picornaviruses）［「ウイルス学：実用アプローチ」
（Virology：A Practical Approach）、 B.W.J. Mahy編
集、 （Oxford:IRL Press）、25ー41頁］に本質的に記述
されているように、細胞変性効果を記録する制限希釈感
染定量法によって、感染力を定量した。
びＨＲＶ１４は、American Type Culture Collectionか
ら入手し、プラーク精製し、そして感染させたヒーラー
（ＨｅＬａ）−Ｓ３細胞の溶解産物から単離した。精製
したライノウイルスは、ポリエチレングリコール沈澱お
よびサクロース勾配沈降で調製した。細胞の純度は、カ
プシド蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および電子顕微鏡
で測定した。Minor、 P.D.、 Growth著、 「ピコルナウイ
ルスの定量および精製」（assay and purification of
picornaviruses）［「ウイルス学：実用アプローチ」
（Virology：A Practical Approach）、 B.W.J. Mahy編
集、 （Oxford:IRL Press）、25ー41頁］に本質的に記述
されているように、細胞変性効果を記録する制限希釈感
染定量法によって、感染力を定量した。
【００４９】実施例２ ＩＣＡＭ−１に対する単クローン抗体の生産および単離 ３週間で３回の間隔で、０．５ｍＬの燐酸塩緩衝食塩水
（ＰＢＳ）中の１０7個無傷ヒーラー細胞を腹こう内注
射することによって、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪのメスのマウ
スの細胞を免疫化させた。２週間後、このマウスは出血
し、そして一定量の血清を、ヒーラー細胞のＨＲＶ１４
感染に対する保護効果を試験するため用いた。陽性のマ
ウスに、最終的に、更に１０7個のヒーラー細胞を注射
し、そして３日後、脾臓の細胞をP3X63-Ag8.653骨髄腫
細胞（Galfre、 他、 Nature、 266:550-552 (1977））に
融合させて、全体で約７００個のハイブリドーマ含有ウ
エルを生じさせた。９６個のウエルを有するプレート中
で、３ｘ１０4ヒーラー細胞を、１００μＬの上澄み液
と一緒に３７℃で１時間培養し、次に、この細胞をＰＢ
Ｓで洗浄し、そして充分な量のＨＲＶ１４を加え、２４
〜３６時間で完全な細胞変性効果を生じさせた後、各々
のウエルを検査した。陽性（感染から保護された）のウ
エルを３６時間後記録した。
（ＰＢＳ）中の１０7個無傷ヒーラー細胞を腹こう内注
射することによって、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪのメスのマウ
スの細胞を免疫化させた。２週間後、このマウスは出血
し、そして一定量の血清を、ヒーラー細胞のＨＲＶ１４
感染に対する保護効果を試験するため用いた。陽性のマ
ウスに、最終的に、更に１０7個のヒーラー細胞を注射
し、そして３日後、脾臓の細胞をP3X63-Ag8.653骨髄腫
細胞（Galfre、 他、 Nature、 266:550-552 (1977））に
融合させて、全体で約７００個のハイブリドーマ含有ウ
エルを生じさせた。９６個のウエルを有するプレート中
で、３ｘ１０4ヒーラー細胞を、１００μＬの上澄み液
と一緒に３７℃で１時間培養し、次に、この細胞をＰＢ
Ｓで洗浄し、そして充分な量のＨＲＶ１４を加え、２４
〜３６時間で完全な細胞変性効果を生じさせた後、各々
のウエルを検査した。陽性（感染から保護された）のウ
エルを３６時間後記録した。
【００５０】この最初のスクリーン試験で陽性を示した
ウエルから細胞を取り出した後、９６個のウエルを有す
るミクロタイタープレート中で制限希釈することによっ
てクローン化した。これらのウエルから得た上澄み液
を、細胞保護定量法で試験した後、陽性を示すウエルを
再び同定した。ハイブリドーマ含有ウエルの全てが陽性
になり、クローン集団が得られたことが示されるまで、
更にクローン化を行った。４つのクローン化した細胞
系、およびそれらの相当する抗体が得られ、そしてこれ
らを各々、ｃ７８．１Ａ、ｃ７８．２Ａ、ｃ７８．４
Ａ、ｃ７８．５Ａ、ｃ９２．１Ａおよびｃ９２．５Ａで
表示した。
ウエルから細胞を取り出した後、９６個のウエルを有す
るミクロタイタープレート中で制限希釈することによっ
てクローン化した。これらのウエルから得た上澄み液
を、細胞保護定量法で試験した後、陽性を示すウエルを
再び同定した。ハイブリドーマ含有ウエルの全てが陽性
になり、クローン集団が得られたことが示されるまで、
更にクローン化を行った。４つのクローン化した細胞
系、およびそれらの相当する抗体が得られ、そしてこれ
らを各々、ｃ７８．１Ａ、ｃ７８．２Ａ、ｃ７８．４
Ａ、ｃ７８．５Ａ、ｃ９２．１Ａおよびｃ９２．５Ａで
表示した。
【００５１】ｃ９２．１Ａを、1987年11月19日、Americ
an Type Culture Collection、12301 Parklawn Drive、
Rockville、 Maryland 20852に寄託し、ＨＢ９５９４と
表示された。
an Type Culture Collection、12301 Parklawn Drive、
Rockville、 Maryland 20852に寄託し、ＨＢ９５９４と
表示された。
【００５２】実施例３ 短縮されていないＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡからの非トラ
ンスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ ｃＤＮＡの建造 Ａ．ＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡの調製 供給者が推奨する条件下、AmershamTM cDNA合成キット
を用いて、ＨＥ１細胞からのポリＡ＋ＲＮＡから、ラン
ダムに開始させたｃＤＮＡを合成した。プライマーＰＣ
Ｒ５．１：(ggaattcATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC) およびＰＣＲ３．１：(ggaattcTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTG
TT) を用い、２５サイクルのための１００ｎｇのｃＤＮＡを
用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅サイクルは、９４℃
で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で４分間から
なっていた。ＰＣＲ反応の生産物を、ＥｃｏＲ１で消化
させた後、ＥｃｏＲ１消化したファージベクターλＧＴ
１０（StratageneTM）でクローン化した。組換ファージ
クローン体を、ＩＣＡＭ−１特異オリゴヌクレオチド： GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTGGGGCCGCAGGTCCAGTTC(IC
AM1)および CGCTGGCAGGACAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGTGTTCT(IC
AM3) を用いたプラークハイブリッド形成でスクリーンにかけ
た。
ンスメンブラン切形形態のＩＣＡＭ ｃＤＮＡの建造 Ａ．ＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡの調製 供給者が推奨する条件下、AmershamTM cDNA合成キット
を用いて、ＨＥ１細胞からのポリＡ＋ＲＮＡから、ラン
ダムに開始させたｃＤＮＡを合成した。プライマーＰＣ
Ｒ５．１：(ggaattcATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC) およびＰＣＲ３．１：(ggaattcTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTG
TT) を用い、２５サイクルのための１００ｎｇのｃＤＮＡを
用いて、ＰＣＲ増幅を行った。増幅サイクルは、９４℃
で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で４分間から
なっていた。ＰＣＲ反応の生産物を、ＥｃｏＲ１で消化
させた後、ＥｃｏＲ１消化したファージベクターλＧＴ
１０（StratageneTM）でクローン化した。組換ファージ
クローン体を、ＩＣＡＭ−１特異オリゴヌクレオチド： GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTGGGGCCGCAGGTCCAGTTC(IC
AM1)および CGCTGGCAGGACAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGCCGAGGTGTTCT(IC
AM3) を用いたプラークハイブリッド形成でスクリーンにかけ
た。
【００５３】λＨＲＲ４と名付けた陽性クローン体を選
択した後、精製した。ＥｃｏＲ１消化により挿入断片を
除去した後、Bluescript KS+のＥｃｏＲ１部位中にサブ
クローン化した。このクローン体をｐＨＲＲ２と名付け
た。この全体の挿入断片の配列を決め、そしてこれは、
Ｇの代わりにＡ １４６２を単置換したＰＣＲ ＩＣＡＭ
−１配列（Simmons、 他、 Nature、 331:624 (1988)；Sta
unton、 他、Cell、 52:925-933 (1988））で特性が与え
られているような、イニシエーターＡＴＧコドンで始ま
りＴＧＡ終止コドンで終わる全体のＩＣＡＭ−１暗号化
配列を有することが見いだされた。同様の変化が、個々
の数種のクローン体中で同定され、従って、これはＩＣ
ＡＭ−１遺伝子の多型性を表している。
択した後、精製した。ＥｃｏＲ１消化により挿入断片を
除去した後、Bluescript KS+のＥｃｏＲ１部位中にサブ
クローン化した。このクローン体をｐＨＲＲ２と名付け
た。この全体の挿入断片の配列を決め、そしてこれは、
Ｇの代わりにＡ １４６２を単置換したＰＣＲ ＩＣＡＭ
−１配列（Simmons、 他、 Nature、 331:624 (1988)；Sta
unton、 他、Cell、 52:925-933 (1988））で特性が与え
られているような、イニシエーターＡＴＧコドンで始ま
りＴＧＡ終止コドンで終わる全体のＩＣＡＭ−１暗号化
配列を有することが見いだされた。同様の変化が、個々
の数種のクローン体中で同定され、従って、これはＩＣ
ＡＭ−１遺伝子の多型性を表している。
【００５４】Ｂ．ｔＩＣＡＭ−１（４５３）およびｔＩ
ＣＡＭ（１８５）の建造 母型として、短縮されていないＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ
クローン体ｐＨＲＲ−２を用いたＰＣＲ増幅反応（Saik
i、 他、 Science、 230:1350-1354 (1985））で、ＩＣＡ
Ｍ−１ ｃＤＮＡの修飾形態を創作した。このプラスミ
ドＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化させて、該ＩＣＡＭ−１挿
入断片を切除した後、アルカリ性ホスファターゼを用い
て処理し、次の連結反応段階でこのベクターが再び円形
になるのを防止した。１０ｇの切除ＤＮＡに、下記の条
件下：温度（℃） 時間（分） ９４ １ ５５ ２ ７２ １.５ ７１ ４（最終拡大） で、ｔＩＣＡＭ−４５３のためのオリゴヌクレオチドプ
ライマーＰＣＲ５．５およびＰＣＲ３．３、そしてｔＩ
ＣＡＭ−１８５のためのＰＣＲ５．５および３．１０を
用いて１０サイクルのＰＣＲ増幅を受けさせた。ＰＣＲ
５．５は、配列： GGAATTCAAGCTTCTCAGCCTCGCTATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC （これは、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩ部位、１２
ｂｐ ＩＣＡＭ−１ ５’未翻訳配列、およびシグナルペ
プチドをコード化する第一２４ｂｐからなっている）を
有している。ＰＣＲ３．３は、配列： GGAATTCCTGCAGTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT （これは、ＥｃｏＲ１およびＰｓｔ１部位、終止コド
ン、およびＩＣＡＭ−１の最後の８個の細胞外アミノ酸
（残基４４６−４５３）をコード化する塩基を補充する
２４ｂｐからなっている）を有している。ＰＣＲ３．１
０は、配列： TTCTAGAGGATCCTCAAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGG （これは、Ｘｂａ１およびＢａｍＨ１部位、終止コド
ン、およびＩＣＡＭ−１の残基１７８−１８５をコード
化する塩基を補充する２４ｂｐからなっている）を有し
ている。
ＣＡＭ（１８５）の建造 母型として、短縮されていないＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ
クローン体ｐＨＲＲ−２を用いたＰＣＲ増幅反応（Saik
i、 他、 Science、 230:1350-1354 (1985））で、ＩＣＡ
Ｍ−１ ｃＤＮＡの修飾形態を創作した。このプラスミ
ドＤＮＡをＥｃｏＲ１で消化させて、該ＩＣＡＭ−１挿
入断片を切除した後、アルカリ性ホスファターゼを用い
て処理し、次の連結反応段階でこのベクターが再び円形
になるのを防止した。１０ｇの切除ＤＮＡに、下記の条
件下：温度（℃） 時間（分） ９４ １ ５５ ２ ７２ １.５ ７１ ４（最終拡大） で、ｔＩＣＡＭ−４５３のためのオリゴヌクレオチドプ
ライマーＰＣＲ５．５およびＰＣＲ３．３、そしてｔＩ
ＣＡＭ−１８５のためのＰＣＲ５．５および３．１０を
用いて１０サイクルのＰＣＲ増幅を受けさせた。ＰＣＲ
５．５は、配列： GGAATTCAAGCTTCTCAGCCTCGCTATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC （これは、ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄＩＩＩ部位、１２
ｂｐ ＩＣＡＭ−１ ５’未翻訳配列、およびシグナルペ
プチドをコード化する第一２４ｂｐからなっている）を
有している。ＰＣＲ３．３は、配列： GGAATTCCTGCAGTCACTCATACCGGGGGGAGAGCACATT （これは、ＥｃｏＲ１およびＰｓｔ１部位、終止コド
ン、およびＩＣＡＭ−１の最後の８個の細胞外アミノ酸
（残基４４６−４５３）をコード化する塩基を補充する
２４ｂｐからなっている）を有している。ＰＣＲ３．１
０は、配列： TTCTAGAGGATCCTCAAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGG （これは、Ｘｂａ１およびＢａｍＨ１部位、終止コド
ン、およびＩＣＡＭ−１の残基１７８−１８５をコード
化する塩基を補充する２４ｂｐからなっている）を有し
ている。
【００５５】このＰＣＲ反応生産物を、ＥｃｏＲ１（ｔ
ＩＣＡＭ（４５３））、或はＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ
１（ｔＩＣＡＭ（１８５））を用いて消化させた後、Bl
uescriptTM SK+（Stratagene）のポリリンカー部位中に
クローン化した。この所望挿入断片を含有しているクロ
ーン体は、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認
された。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化す
ることにより、該挿入断片をBluescriptTMから切除した
後、このＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の発現ベク
ターＣＤＭ８（Seed、 Nature、 239:840 (1987)）中に挿
入した。ｐＨＲＲ−８．２として表示したｔＩＣＡＭ
（４５３）挿入断片含有クローン体、およびｐＨＲＲ２
３−１３として表示したｔＩＣＡＭ（１８５）挿入断片
含有クローン体を選択し、そして一層の配列決定分析を
行った。これによって、所望終止コドンの存在が立証さ
れ、そしてＩＣＡＭ−１暗号化配列の選択された領域の
完全性が立証された。
ＩＣＡＭ（４５３））、或はＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ
１（ｔＩＣＡＭ（１８５））を用いて消化させた後、Bl
uescriptTM SK+（Stratagene）のポリリンカー部位中に
クローン化した。この所望挿入断片を含有しているクロ
ーン体は、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認
された。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化す
ることにより、該挿入断片をBluescriptTMから切除した
後、このＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の発現ベク
ターＣＤＭ８（Seed、 Nature、 239:840 (1987)）中に挿
入した。ｐＨＲＲ−８．２として表示したｔＩＣＡＭ
（４５３）挿入断片含有クローン体、およびｐＨＲＲ２
３−１３として表示したｔＩＣＡＭ（１８５）挿入断片
含有クローン体を選択し、そして一層の配列決定分析を
行った。これによって、所望終止コドンの存在が立証さ
れ、そしてＩＣＡＭ−１暗号化配列の選択された領域の
完全性が立証された。
【００５６】ＤＥＡＥ−デキストラン技術を用いて、こ
れらのプラスミドをＣＯＳ細胞中に移入させた後、この
細胞を、分析前７２時間培養した。間接免疫蛍光、およ
びＩＣＡＭ−１に特異な単クローン抗体を用いたＦＡＣ
Ｓで、表面発現を監視した。ＣＯＳ細胞中の一過性発
現、およびｃ７８．４Ａ Ｍａｂ（単クローン抗体）を
用いた代謝標識（35Ｓ システイン）細胞上澄み液の免
疫沈澱の結果、各々、ｐＨＲＲ２３−１３およびｐＨＲ
Ｒ８．２からの４５ｋｄおよび８０ｋｄの可溶ＩＣＡＭ
−１フラグメントの生産が示された。安定なチャイニー
ズハムスター卵巣細胞トランスフェクタント（transfec
tants）の調製は、下記の実施例４で記述する。
れらのプラスミドをＣＯＳ細胞中に移入させた後、この
細胞を、分析前７２時間培養した。間接免疫蛍光、およ
びＩＣＡＭ−１に特異な単クローン抗体を用いたＦＡＣ
Ｓで、表面発現を監視した。ＣＯＳ細胞中の一過性発
現、およびｃ７８．４Ａ Ｍａｂ（単クローン抗体）を
用いた代謝標識（35Ｓ システイン）細胞上澄み液の免
疫沈澱の結果、各々、ｐＨＲＲ２３−１３およびｐＨＲ
Ｒ８．２からの４５ｋｄおよび８０ｋｄの可溶ＩＣＡＭ
−１フラグメントの生産が示された。安定なチャイニー
ズハムスター卵巣細胞トランスフェクタント（transfec
tants）の調製は、下記の実施例４で記述する。
【００５７】Ｃ． 修飾非グリコシル化トランスメンブ
ランＩＣＡＭ−１分子 Ｑに対する各々Ｎ−１０３、Ｎ−１１８、Ｎ−１５６お
よびＮ−１７３の同時変異誘発で、修飾した短縮されて
いないＩＣＡＭ−１を製造した。これにより、ＩＣＡＭ
−１分子の細胞外Ｄ２ドメインから４つのＮ−連結グリ
コシル化部位全てを除去する。非グリコシル化トランス
メンブランＩＣＡＭと呼ばれているこのとき得られる分
子は、ＣＯＳ細胞の表面上に発現し、未修飾ＩＣＡＭ−
１に匹敵するレベルで、放射能標識されたＨＲＶ３と結
合することができた。この結果は、ドメイン２（最初の
１８４個のアミノ酸）のグリコシル化はＩＣＡＭ−１に
対するウイルスの結合には不必要であることを示してい
る。
ランＩＣＡＭ−１分子 Ｑに対する各々Ｎ−１０３、Ｎ−１１８、Ｎ−１５６お
よびＮ−１７３の同時変異誘発で、修飾した短縮されて
いないＩＣＡＭ−１を製造した。これにより、ＩＣＡＭ
−１分子の細胞外Ｄ２ドメインから４つのＮ−連結グリ
コシル化部位全てを除去する。非グリコシル化トランス
メンブランＩＣＡＭと呼ばれているこのとき得られる分
子は、ＣＯＳ細胞の表面上に発現し、未修飾ＩＣＡＭ−
１に匹敵するレベルで、放射能標識されたＨＲＶ３と結
合することができた。この結果は、ドメイン２（最初の
１８４個のアミノ酸）のグリコシル化はＩＣＡＭ−１に
対するウイルスの結合には不必要であることを示してい
る。
【００５８】非トランスメンブランＩＣＡＭは、同様に
修飾でき、修飾非グリコシル化非トランスメンブランＩ
ＣＡＭ−１分子を生じさせることができると期待され
る。
修飾でき、修飾非グリコシル化非トランスメンブランＩ
ＣＡＭ−１分子を生じさせることができると期待され
る。
【００５９】Ｄ． 多量体を形成させるための架橋用と
して適切な非トランスメンブラン（切形）ＩＣＡＭ−１
含有反応性残基の遺伝工学的形態の建造 Ｃ末端に新規なリジン残基を付加したＩＣＡＭ−１の４
５３アミノ酸細胞外ドメインから成る分子を、上述した
ように、ｐＨＲＲ−２ ｃＤＮＡのＰＣＲ修飾により建
造した。使用したプライマーは、ＰＣＲ５．５（上に記
述）およびＰＣＲ３．１９（これは次の配列： TTCTAGAGGATCCTCACTTCTCATACCGGGGGGAGAGCACATT を有し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位、終止コ
ドン、Ｌｙｓコドン、およびアミノ酸残基４４６〜４５
３をコード化する配列を補充する２４個の塩基から成
る）である。ＣＤＭ８ベクター中へのクローン化に続い
て、ＣＯＳ細胞中の一過性発現によって、ｔＩＣＡＭ−
４５３Ｋの生産が確認された。安定なＣＨＯ細胞系が、
前述したように、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲを用いた共トラン
スフェクションによって生じた。
して適切な非トランスメンブラン（切形）ＩＣＡＭ−１
含有反応性残基の遺伝工学的形態の建造 Ｃ末端に新規なリジン残基を付加したＩＣＡＭ−１の４
５３アミノ酸細胞外ドメインから成る分子を、上述した
ように、ｐＨＲＲ−２ ｃＤＮＡのＰＣＲ修飾により建
造した。使用したプライマーは、ＰＣＲ５．５（上に記
述）およびＰＣＲ３．１９（これは次の配列： TTCTAGAGGATCCTCACTTCTCATACCGGGGGGAGAGCACATT を有し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位、終止コ
ドン、Ｌｙｓコドン、およびアミノ酸残基４４６〜４５
３をコード化する配列を補充する２４個の塩基から成
る）である。ＣＤＭ８ベクター中へのクローン化に続い
て、ＣＯＳ細胞中の一過性発現によって、ｔＩＣＡＭ−
４５３Ｋの生産が確認された。安定なＣＨＯ細胞系が、
前述したように、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲを用いた共トラン
スフェクションによって生じた。
【００６０】ＰＣＲ５．５およびＰＣＲ３．２０（これ
は次の配列： TTCTAGAGGATCCTCACTTAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGC を有し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位、終止コ
ドン、Ｌｙｓコドン、および残基１７８〜１８５をコー
ド化する配列を補充する２４個の塩基から成る）を用い
て、同様な方策を、ｔＩＣＡＭ（１８５）Ｃ末端へのＬ
ｙｓ残基付加に用いた。一過性ＣＯＳ細胞発現により、
ｔＩＣＡＭ−１８５の生産が確認され、そして安定なＣ
ＨＯ細胞系が前述したように誘導された。
は次の配列： TTCTAGAGGATCCTCACTTAAAGGTCTGGAGCTGGTAGGGGGC を有し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位、終止コ
ドン、Ｌｙｓコドン、および残基１７８〜１８５をコー
ド化する配列を補充する２４個の塩基から成る）を用い
て、同様な方策を、ｔＩＣＡＭ（１８５）Ｃ末端へのＬ
ｙｓ残基付加に用いた。一過性ＣＯＳ細胞発現により、
ｔＩＣＡＭ−１８５の生産が確認され、そして安定なＣ
ＨＯ細胞系が前述したように誘導された。
【００６１】各々が追加的Ｃｙｓ残基を有するｔＩＣＡ
Ｍ（１−４５２）の３つの異なる形態を、短縮されてい
ないＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡの部位特異的変異誘発で建
造した。各々の建造において、Ｅ−４３５ ＧＡＧをＴ
ＡＧに変えることによって終止コドンを導入した。この
ように、このＣ末端はＹ−４５２である。２番目の部位
特異的変異誘発を用いて、残基Ｎ−３３８、Ｔ−３６
０、およびＱ−３８７を各々別々にＣｙｓに変異させ
た。所望の変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって確認
した。
Ｍ（１−４５２）の３つの異なる形態を、短縮されてい
ないＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡの部位特異的変異誘発で建
造した。各々の建造において、Ｅ−４３５ ＧＡＧをＴ
ＡＧに変えることによって終止コドンを導入した。この
ように、このＣ末端はＹ−４５２である。２番目の部位
特異的変異誘発を用いて、残基Ｎ−３３８、Ｔ−３６
０、およびＱ−３８７を各々別々にＣｙｓに変異させ
た。所望の変異の存在は、ＤＮＡ配列決定によって確認
した。
【００６２】Ｃｙｓへの変異のために選択した残基は、
これらの領域の表面暴露を予測するための、表面確率に
関するコンピューターで生じさせたプロットを基にして
選択した。また、Ｔ−３６０は、潜在的Ｎ連結グリコシ
ル化の部位であるＮ−３５８の直ぐ近くに存在してい
る。この３つのＣｙｓ修飾の各々は発現し、そして移入
されたＣＯＳ細胞の媒体中に分泌される。還元および非
還元条件下でこの蛋白質を検査した結果、二量体の存在
に関するいかなる示唆も示されなかった。スルフヒドリ
ル基に対して反応性を示す架橋剤が、多量体形態を得る
ためこのＣｙｓ修飾ｔＩＣＡＭ形態を架橋させるために
用いることができると予測される。
これらの領域の表面暴露を予測するための、表面確率に
関するコンピューターで生じさせたプロットを基にして
選択した。また、Ｔ−３６０は、潜在的Ｎ連結グリコシ
ル化の部位であるＮ−３５８の直ぐ近くに存在してい
る。この３つのＣｙｓ修飾の各々は発現し、そして移入
されたＣＯＳ細胞の媒体中に分泌される。還元および非
還元条件下でこの蛋白質を検査した結果、二量体の存在
に関するいかなる示唆も示されなかった。スルフヒドリ
ル基に対して反応性を示す架橋剤が、多量体形態を得る
ためこのＣｙｓ修飾ｔＩＣＡＭ形態を架橋させるために
用いることができると予測される。
【００６３】実施例４ 細胞のトランスフェクションおよびＩＣＡＭ ｃＤＮＡ
の非トランスメンブラン切形形態の発現 Ａ． 真核細胞のトランスフェクション ジヒドロ葉酸塩還元酵素（ＤＨＦＲ）が欠損しているチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、Cutter L
abs (Berkeley、 CA.）から入手した。ＳＶ４０プロモー
ターの制御下、マウスのジヒドロ葉酸塩還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）を含有しているプラスミドｐＳＶ２ ＤＨＦＲ、
およびｔＩＣＡＭ−４５３、或はＣＤＭ８ベクター（Se
ed および Aruffo、 PANS、 84:3365-3369 (1987)）中の
ｔＩＣＡＭ−１８４建造物と一緒に共移入した。
の非トランスメンブラン切形形態の発現 Ａ． 真核細胞のトランスフェクション ジヒドロ葉酸塩還元酵素（ＤＨＦＲ）が欠損しているチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、Cutter L
abs (Berkeley、 CA.）から入手した。ＳＶ４０プロモー
ターの制御下、マウスのジヒドロ葉酸塩還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）を含有しているプラスミドｐＳＶ２ ＤＨＦＲ、
およびｔＩＣＡＭ−４５３、或はＣＤＭ８ベクター（Se
ed および Aruffo、 PANS、 84:3365-3369 (1987)）中の
ｔＩＣＡＭ−１８４建造物と一緒に共移入した。
【００６４】エレクトロポレーション（electroporatio
n）および燐酸カルシウム方法の両方を用いてトランス
フェクションを行った。上記Bebbington。移入したＤＨ
ＦＲ陽性細胞を、無ヌクレオシド媒体上の増殖物から選
択し、そしてトランスフェクタントのプールを制限希釈
でクローン化させた。
n）および燐酸カルシウム方法の両方を用いてトランス
フェクションを行った。上記Bebbington。移入したＤＨ
ＦＲ陽性細胞を、無ヌクレオシド媒体上の増殖物から選
択し、そしてトランスフェクタントのプールを制限希釈
でクローン化させた。
【００６５】次のように、Ｍａｂ ｃ７８．４Ａおよび
ｃ７８．５Ａを用いた、ＩＣＡＭに関する二部位放射免
疫検定（ＲＩＡ）で、培養の上澄み液を検査することに
よって、ｔＩＣＡＭを分泌する細胞系を同定した。ＩＣ
ＡＭ上の１つのエピトープ（例えば、Ｍａｂ ｃ７８．
４Ａ）に対する単クローン抗体を、９６個のウエルを有
するプラスチック製プレート（Immunlonプレート、Dyna
tech Inc.）に吸着させ、このプレート上の過剰の結合
部位をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で制限し、そして
次に、培養上澄み液をプレートで培養した。その後、こ
のプレートを洗浄し、そして、125Ｉ−Ｍａｂ（ＩＣＡ
Ｍ上の２番目のエピトープ、例えばｃ７８．５Ａに対し
て特異的）を一緒に培養し、そして洗浄後、結合した
125ＩｇＧの量を測定した。ｔＩＣＡＭの濃度を、公知
濃度のｔｍ−ＩＣＡＭの標準曲線に対して、未知濃度か
ら得られるＲＩＡデータを比較することによって測定し
た。陽性クローン体を拡張させ、そしてＭａｂ ｃ７
８．４Ａを用いた代謝標識細胞の上澄み液を免疫沈澱す
ることによって、ｔＩＣＡＭ形態の発現を確認した。
ｃ７８．５Ａを用いた、ＩＣＡＭに関する二部位放射免
疫検定（ＲＩＡ）で、培養の上澄み液を検査することに
よって、ｔＩＣＡＭを分泌する細胞系を同定した。ＩＣ
ＡＭ上の１つのエピトープ（例えば、Ｍａｂ ｃ７８．
４Ａ）に対する単クローン抗体を、９６個のウエルを有
するプラスチック製プレート（Immunlonプレート、Dyna
tech Inc.）に吸着させ、このプレート上の過剰の結合
部位をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で制限し、そして
次に、培養上澄み液をプレートで培養した。その後、こ
のプレートを洗浄し、そして、125Ｉ−Ｍａｂ（ＩＣＡ
Ｍ上の２番目のエピトープ、例えばｃ７８．５Ａに対し
て特異的）を一緒に培養し、そして洗浄後、結合した
125ＩｇＧの量を測定した。ｔＩＣＡＭの濃度を、公知
濃度のｔｍ−ＩＣＡＭの標準曲線に対して、未知濃度か
ら得られるＲＩＡデータを比較することによって測定し
た。陽性クローン体を拡張させ、そしてＭａｂ ｃ７
８．４Ａを用いた代謝標識細胞の上澄み液を免疫沈澱す
ることによって、ｔＩＣＡＭ形態の発現を確認した。
【００６６】より一層の試験のため、細胞系ＣＴ．２Ａ
（ｔＩＣＡＭ（４５３））およびＣＤ１２．１Ａ（ｔＩ
ＣＡＭ（１８５））を選択し、そして上記のBebbingto
n、 他が記述しているように、メトトレキセート含有媒
体中で遺伝子増幅を受けさせた。１００ｎＭのメトトレ
キセートに対して耐性を示すＣＴ．２Ａから誘導された
クローン体、および１μＭのメトトレキセートに対して
耐性を示すＣＤ１２．１Ａクローン体を、可溶切形ＩＣ
ＡＭ−１蛋白質の精製のために用いた。
（ｔＩＣＡＭ（４５３））およびＣＤ１２．１Ａ（ｔＩ
ＣＡＭ（１８５））を選択し、そして上記のBebbingto
n、 他が記述しているように、メトトレキセート含有媒
体中で遺伝子増幅を受けさせた。１００ｎＭのメトトレ
キセートに対して耐性を示すＣＴ．２Ａから誘導された
クローン体、および１μＭのメトトレキセートに対して
耐性を示すＣＤ１２．１Ａクローン体を、可溶切形ＩＣ
ＡＭ−１蛋白質の精製のために用いた。
【００６７】Ｂ． 原核細胞のトランスフェクション ウイルス結合の保持には、ＩＣＡＭのウイルス結合ドメ
インのグリコシル化が必要とされていないため（実施例
３Ｃで示したように）、原核細胞、例えば大腸菌は成功
裏に移入され、機能的蛋白質を生産することができると
期待される。
インのグリコシル化が必要とされていないため（実施例
３Ｃで示したように）、原核細胞、例えば大腸菌は成功
裏に移入され、機能的蛋白質を生産することができると
期待される。
【００６８】実施例５ ＩＣＡＭ−１の非トランスメンブラン切形形態の単離お
よび精製 以前、共出願中のU.S.S.N. 130,378およびGreve、他、Ce
ll、 56:839-847 (1989）中に、ｃ７８．４Ａ−Sepharos
eTMを用いた単クローン抗体アフィニティークロマトグ
ラフィーが記述されている。血清含有媒体中に分泌され
るｔＩＣＡＭは、この血清中に混在している蛋白質の水
準が高いため、追加的精製段階が必要とされた。Ｍａｂ
アフィニティーカラムからの溶離を行う前に、このカラ
ムを１ＭのＮａＣｌで洗浄して、弱く結合している蛋白
質を除去した。ｔＩＣＡＭ（４５３）に関しては、この
ｃ７８．４−SepharoseTMカラムから溶離した部分的精
製ｔＩＣＡＭ（４５３）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ
６．０）中に透析させ、モノ−ＱTMカラム（Pharmaci
a）上に吸収させ、そして０〜０．３ＭのＮａＣｌ勾配
で溶離させた。更に、Sepharose-12TMカラム上でゲル濾
過することによって、ｔＩＣＡＭ１８４を精製した。
よび精製 以前、共出願中のU.S.S.N. 130,378およびGreve、他、Ce
ll、 56:839-847 (1989）中に、ｃ７８．４Ａ−Sepharos
eTMを用いた単クローン抗体アフィニティークロマトグ
ラフィーが記述されている。血清含有媒体中に分泌され
るｔＩＣＡＭは、この血清中に混在している蛋白質の水
準が高いため、追加的精製段階が必要とされた。Ｍａｂ
アフィニティーカラムからの溶離を行う前に、このカラ
ムを１ＭのＮａＣｌで洗浄して、弱く結合している蛋白
質を除去した。ｔＩＣＡＭ（４５３）に関しては、この
ｃ７８．４−SepharoseTMカラムから溶離した部分的精
製ｔＩＣＡＭ（４５３）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ
６．０）中に透析させ、モノ−ＱTMカラム（Pharmaci
a）上に吸収させ、そして０〜０．３ＭのＮａＣｌ勾配
で溶離させた。更に、Sepharose-12TMカラム上でゲル濾
過することによって、ｔＩＣＡＭ１８４を精製した。
【００６９】ＩＣＡＭ−１の非トランスメンブラン切形
形態は、単クローン抗体アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いることなく、標準イオン交換方法を用いて精
製されてもよいと理解される。
形態は、単クローン抗体アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いることなく、標準イオン交換方法を用いて精
製されてもよいと理解される。
【００７０】実施例６ ｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（１８５）、およびｔＩ
ＣＡＭ（４５３）の放射能標識、および単クローン抗体
に対する保持された結合能力の立証 単クローン抗体ｃ７８．４Ａおよびｃ７８．５Ａに対し
て反応性を示すエピトープ類は、配置依存性エピトープ
類であり、従って未変性ＩＣＡＭ構造の保持を確かめる
ための分析手段として使用できる。公知量の精製ＩＣＡ
Ｍを、ｃ７８．４Ａまたはｃ７８．５Ａ ＩｇＧ−Sepha
roseTMと一緒に培養した後、結合した放射能の画分を測
定した。これらの試験によって、この精製したｔｍＩＣ
ＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（１８５）、およびｔＩＣＡＭ
（４５３）は、これらの単クローン抗体との結合能力を
完全に保持していることが示された。
ＣＡＭ（４５３）の放射能標識、および単クローン抗体
に対する保持された結合能力の立証 単クローン抗体ｃ７８．４Ａおよびｃ７８．５Ａに対し
て反応性を示すエピトープ類は、配置依存性エピトープ
類であり、従って未変性ＩＣＡＭ構造の保持を確かめる
ための分析手段として使用できる。公知量の精製ＩＣＡ
Ｍを、ｃ７８．４Ａまたはｃ７８．５Ａ ＩｇＧ−Sepha
roseTMと一緒に培養した後、結合した放射能の画分を測
定した。これらの試験によって、この精製したｔｍＩＣ
ＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（１８５）、およびｔＩＣＡＭ
（４５３）は、これらの単クローン抗体との結合能力を
完全に保持していることが示された。
【００７１】トランスフェクタントを、35Ｓシステイン
で代謝標識した後、細胞溶解産物（トランスメンブラン
ＩＣＡＭのための）または培養上澄み液（切形ＩＣＡＭ
のための）を製造し、そしてｃ７８．４Ａ ＩｇＧ−Sep
haroseTMビードと一緒に培養した。このビードを洗浄
し、ＳＤＳを用いて、吸着された蛋白質を溶離させ、そ
してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Greve、 他、Cell、 5
6:839-847 (1989）参照。この単離された蛋白質は定量
的にｃ７８．４Ａおよびｃ７８．５Ａ Ｍａｂと結合す
ることが見いだされた。
で代謝標識した後、細胞溶解産物（トランスメンブラン
ＩＣＡＭのための）または培養上澄み液（切形ＩＣＡＭ
のための）を製造し、そしてｃ７８．４Ａ ＩｇＧ−Sep
haroseTMビードと一緒に培養した。このビードを洗浄
し、ＳＤＳを用いて、吸着された蛋白質を溶離させ、そ
してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Greve、 他、Cell、 5
6:839-847 (1989）参照。この単離された蛋白質は定量
的にｃ７８．４Ａおよびｃ７８．５Ａ Ｍａｂと結合す
ることが見いだされた。
【００７２】従って、このｔＩＣＡＭ（１８５）および
ｔＩＣＡＭ（４５３）は両方共、未変性のＩＣＡＭ構造
を保持していた。
ｔＩＣＡＭ（４５３）は両方共、未変性のＩＣＡＭ構造
を保持していた。
【００７３】実施例７ トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形
態のＩＣＡＭ−１のヒトライノウイルス結合の定量 以下に、種々の形態のＩＣＡＭの結合活性を評価するた
めに用いた３種の結合定量法を記述する。
態のＩＣＡＭ−１のヒトライノウイルス結合の定量 以下に、種々の形態のＩＣＡＭの結合活性を評価するた
めに用いた３種の結合定量法を記述する。
【００７４】Ａ． ペレット化定量法 ［35Ｓ］システイン標識したｔｍＩＣＡＭ−１またはｔ
ＩＣＡＭを、１００μＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１％トリトンＸ−１００中、Ｈ
ＲＶ３と混合した。この混合物を３７℃で３０分間培養
し、氷上で冷却し、２００μＬの１０％グリセロール、
０．２Ｍのトリエタノールアミン（ｐＨ７．５）から成
る敷物の上に層状に置き、そして１３４，０００ｘｇで
３０分間、４℃で、Beckman空気駆動遠心分離機中で遠
心分離した。上部の２７５μＬを取り出し、そしてＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびセンチレーションカウンティングで
ペレットを分析した。対照区のＳＤＳゲルを銀染色する
実験により、これらの条件下で本質的に全ての該ＨＲＶ
３がペレット化され、そして本質的に全ての該ＩＣＡＭ
が上澄み液中に残存していることが示された。その結果
を表１に示す。
ＩＣＡＭを、１００μＬの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、
１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１％トリトンＸ−１００中、Ｈ
ＲＶ３と混合した。この混合物を３７℃で３０分間培養
し、氷上で冷却し、２００μＬの１０％グリセロール、
０．２Ｍのトリエタノールアミン（ｐＨ７．５）から成
る敷物の上に層状に置き、そして１３４，０００ｘｇで
３０分間、４℃で、Beckman空気駆動遠心分離機中で遠
心分離した。上部の２７５μＬを取り出し、そしてＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびセンチレーションカウンティングで
ペレットを分析した。対照区のＳＤＳゲルを銀染色する
実験により、これらの条件下で本質的に全ての該ＨＲＶ
３がペレット化され、そして本質的に全ての該ＩＣＡＭ
が上澄み液中に残存していることが示された。その結果
を表１に示す。
【００７５】
【表１】 表 １ ＩＣＡＭ ペレツト化ＩＣＡＭ（％）＊ ｔｍＩＣＡＭ−１ １１.６％ ｔＩＣＡＭ（４５３） １.０％ ｔＩＣＡＭ（１８５） ４.３％ ＊ ４回の実験の平均；これらの値を、直接には、相対
親和力に変換することはできない。
親和力に変換することはできない。
【００７６】これらのデータは、ＩＣＡＭの両方の切形
形態はライノウイルスと結合するが、しかしｔｍＩＣＡ
Ｍのそれに比較すると本質的に減少したレベルであるこ
とを示している。
形態はライノウイルスと結合するが、しかしｔｍＩＣＡ
Ｍのそれに比較すると本質的に減少したレベルであるこ
とを示している。
【００７７】Ｂ． 溶液結合定量法 溶液中のｔｍＩＣＡＭおよびｔＩＣＡＭフラグメントの
相対的親和力に関する定量法情報を得るため、溶液競争
定量法を開発し、ここでは、予め固定化したＩＣＡＭ−
１と35Ｓ ＨＲＶ３との結合を抑制するために可溶ｔｍ
ＩＣＡＭまたはｔＩＣＡＭフラグメントを用い、同一条
件下で異なる蛋白質が比較できるように非イオン系界面
活性剤（トリトンＸ−１００）を緩衝液中に入れた。最
初に、ｔｍＩＣＡＭ−１（トリトンＸ−１００の代わり
に０．１％のオクチルグルコシドの存在下で単離）をト
リス／ＮａＣｌ緩衝液中で１０倍に希釈した後、一晩、
ミクロタイタープレート（Immunlon-4、 Dynatech）の壁
に吸着させた。次に、このプレート上の非特異的結合部
位を１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで制限した後、０．１％ト
リトンＸ−１００／１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／トリス／Ｎ
ａＣｌ中で結合実験を行った。約２０，０００ｃｐｍの
35Ｓ ＨＲＶ３を、種々の量のＩＣＡＭかｔｍＩＣＡ
Ｍ、ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）
と混合し、３７℃で１時間培養した後、該ミクロタイタ
ープレートのウエルに添加し、そして３７℃で３時間培
養した。このプレートを洗浄した後、結合した放射能を
測定した。
相対的親和力に関する定量法情報を得るため、溶液競争
定量法を開発し、ここでは、予め固定化したＩＣＡＭ−
１と35Ｓ ＨＲＶ３との結合を抑制するために可溶ｔｍ
ＩＣＡＭまたはｔＩＣＡＭフラグメントを用い、同一条
件下で異なる蛋白質が比較できるように非イオン系界面
活性剤（トリトンＸ−１００）を緩衝液中に入れた。最
初に、ｔｍＩＣＡＭ−１（トリトンＸ−１００の代わり
に０．１％のオクチルグルコシドの存在下で単離）をト
リス／ＮａＣｌ緩衝液中で１０倍に希釈した後、一晩、
ミクロタイタープレート（Immunlon-4、 Dynatech）の壁
に吸着させた。次に、このプレート上の非特異的結合部
位を１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで制限した後、０．１％ト
リトンＸ−１００／１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ／トリス／Ｎ
ａＣｌ中で結合実験を行った。約２０，０００ｃｐｍの
35Ｓ ＨＲＶ３を、種々の量のＩＣＡＭかｔｍＩＣＡ
Ｍ、ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）
と混合し、３７℃で１時間培養した後、該ミクロタイタ
ープレートのウエルに添加し、そして３７℃で３時間培
養した。このプレートを洗浄した後、結合した放射能を
測定した。
【００７８】表２に示すように、ｔｍＩＣＡＭ−１は低
濃度（０．００８μＭ）で、最大値の半分、ウイルスの
結合を抑制したが、一方ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔ
ＩＣＡＭ（１８５）はずっと高い濃度（それぞれ、２．
８μＭおよび７．９μＭ）で抑制し、即ちｔｍＩＣＡＭ
よりも３５０〜約１０００倍高い濃度で抑制した。
濃度（０．００８μＭ）で、最大値の半分、ウイルスの
結合を抑制したが、一方ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔ
ＩＣＡＭ（１８５）はずっと高い濃度（それぞれ、２．
８μＭおよび７．９μＭ）で抑制し、即ちｔｍＩＣＡＭ
よりも３５０〜約１０００倍高い濃度で抑制した。
【００７９】
【表２】 表２ ＩＣＡＭ ＩＣ50＊ ｔｍＩＣＡＭ 8.0±3.3nM(N=3) ｔＩＣＡＭ(453) 2.8±0.6μM(N=3) ｔＩＣＡＭ(185) 7.9±2.8μM(N=3) ＊ ＩＣ50は、ＨＲＶ３結合を５０％抑制するために必
要な可溶ＩＣＡＭの濃度である。
要な可溶ＩＣＡＭの濃度である。
【００８０】これらのデータは、ｔｍＩＣＡＭ−１より
も低い親和力ではあるが、ｔＩＣＡＭ（４５３）および
ｔＩＣＡＭ（１８５）はライノウイルスと結合すること
を立証し、以前の観察を拡張しており、そしてこのウイ
ルスの結合部位はＩＣＡＭ−１の２つのＮ末端ドメイン
（１８５残基）内に包含されているとする証拠を与えて
いる。
も低い親和力ではあるが、ｔＩＣＡＭ（４５３）および
ｔＩＣＡＭ（１８５）はライノウイルスと結合すること
を立証し、以前の観察を拡張しており、そしてこのウイ
ルスの結合部位はＩＣＡＭ−１の２つのＮ末端ドメイン
（１８５残基）内に包含されているとする証拠を与えて
いる。
【００８１】Ｃ． ドット・ブロット定量法 結合活性を測定するための代替方法を用いたが、ここで
は、ｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔ
ＩＣＡＭ（１８５）をニトロセルロースのフィルターに
吸着させ、このフィルター上の非特異的結合部位を１０
ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で制限した
後、放射能ウイルス、或はＩＣＡＭ−１に対する125Ｉ
Ｍａｂを、３７℃で６０分間該フィルターと一緒に培養
した。このフィルターを緩衝液で洗浄した後、このフィ
ルターをＸ線フィルムに暴露した。
は、ｔｍＩＣＡＭ−１、ｔＩＣＡＭ（４５３）またはｔ
ＩＣＡＭ（１８５）をニトロセルロースのフィルターに
吸着させ、このフィルター上の非特異的結合部位を１０
ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で制限した
後、放射能ウイルス、或はＩＣＡＭ−１に対する125Ｉ
Ｍａｂを、３７℃で６０分間該フィルターと一緒に培養
した。このフィルターを緩衝液で洗浄した後、このフィ
ルターをＸ線フィルムに暴露した。
【００８２】該フィルターに結合した放射能の量を、自
動放射線像の濃度計で測定し、そしてＩＣＡＭに結合し
た（ブロットに結合した）125Ｍａｂ ｃ７８．４Ａまた
はｃ７８．５Ａの量を平行して測定することによって、
該ブロットに結合したＩＣＡＭの量に対して正常化させ
たＨＲＶ３の結合（任意単位で表した）として、このデ
ータを表す。その結果を表３に示す。
動放射線像の濃度計で測定し、そしてＩＣＡＭに結合し
た（ブロットに結合した）125Ｍａｂ ｃ７８．４Ａまた
はｃ７８．５Ａの量を平行して測定することによって、
該ブロットに結合したＩＣＡＭの量に対して正常化させ
たＨＲＶ３の結合（任意単位で表した）として、このデ
ータを表す。その結果を表３に示す。
【００８３】
【表３】 表３ 固定化ＩＣＡＭ＊に対する35Ｓ ＨＲＶ３の結合 ICAM tICAM(453) 比ICAM/tICAM453 1.2±1.1 0.52±0.45 2.3 ＊ ５回の実験の平均。データは、35Ｓ ＨＲＶ３結合
／125Ｉ抗ＩＣＡＭ Ｍａｂ結合の任意濃度単位で表す。
／125Ｉ抗ＩＣＡＭ Ｍａｂ結合の任意濃度単位で表す。
【００８４】ｔＩＣＡＭ １８５を用いた追加的試験を
開始した。結合実験は不確実な結果を示した。立体障害
がある役割を果しているものと予測される。このウイル
スの大きさは約３０ナノメーターである。ｔＩＣＡＭ
（１８５）の長さは１０ナノメーター未満である。スペ
ーサーまたはリンカーを使用すれば、結合に対してより
確かな結果が得られるであろう。
開始した。結合実験は不確実な結果を示した。立体障害
がある役割を果しているものと予測される。このウイル
スの大きさは約３０ナノメーターである。ｔＩＣＡＭ
（１８５）の長さは１０ナノメーター未満である。スペ
ーサーまたはリンカーを使用すれば、結合に対してより
確かな結果が得られるであろう。
【００８５】この実験から得られる結果は、このような
定量条件下では、結合した125Ｉ Ｍａｂの量に対してウ
イルスの結合量を正常化させたときのｔｍＩＣＡＭ−１
のレベルに匹敵するレベルで、ｔＩＣＡＭ（４５３）が
ライノウイルスと結合できることを示している。更に、
これらの結果は、このｔＩＣＡＭ形態はライノウイルス
と結合する能力を有しているが、この結合親和性は該ｔ
ＩＣＡＭの立体配置に依存していることを示している。
ｔｍＩＣＡＭ−１は小さい多量体（恐らくは二量体）で
あってもよく、そして多量体形態で表されるｔＩＣＡＭ
の表示はこの多量体配置に近いものである。
定量条件下では、結合した125Ｉ Ｍａｂの量に対してウ
イルスの結合量を正常化させたときのｔｍＩＣＡＭ−１
のレベルに匹敵するレベルで、ｔＩＣＡＭ（４５３）が
ライノウイルスと結合できることを示している。更に、
これらの結果は、このｔＩＣＡＭ形態はライノウイルス
と結合する能力を有しているが、この結合親和性は該ｔ
ＩＣＡＭの立体配置に依存していることを示している。
ｔｍＩＣＡＭ−１は小さい多量体（恐らくは二量体）で
あってもよく、そして多量体形態で表されるｔＩＣＡＭ
の表示はこの多量体配置に近いものである。
【００８６】このような仮説を支持する証拠は、上で考
察したように、ライノウイルス粒子の最大数と、細胞と
結合できる抗体分子の最大数との比率が約１．５である
とする定量的結合試験（未公開）から来るものである。
これは、Tomassini、 J. 他、J. Virol.、 58:290 (198
6）の以前の研究（これは、結合には、５個の分子から
成る複合体が必要であることを示唆している）と相反す
るものである。彼らの結論は、ゲル濾過のデータに関す
る誤解した解釈を基としたものであり、結合した界面活
性剤分子を考慮することができなかった。
察したように、ライノウイルス粒子の最大数と、細胞と
結合できる抗体分子の最大数との比率が約１．５である
とする定量的結合試験（未公開）から来るものである。
これは、Tomassini、 J. 他、J. Virol.、 58:290 (198
6）の以前の研究（これは、結合には、５個の分子から
成る複合体が必要であることを示唆している）と相反す
るものである。彼らの結論は、ゲル濾過のデータに関す
る誤解した解釈を基としたものであり、結合した界面活
性剤分子を考慮することができなかった。
【００８７】実施例８ ＣＬ２０３ ＩｇＧ抗体がもたらすｔＩＣＡＭ（４５
３）の架橋 ｔｍＩＣＡＭ−１のこのより高い相対的結合活性がその
蛋白質の多量体形態によるものであることの追加的証拠
を得るため、該ｔＩＣＡＭ（４５３）蛋白質をＣＬ２０
３（即ち、ウイルスとＩＣＡＭ−１との結合を抑制しな
いが、残基１８４（Staunton、 他、Cell、 56:849 (198
9）およびCell、 61:243 (1990））に対する部位Ｃ末端
と結合するところの、ＩＣＡＭ−１に対する単クローン
抗体）と一緒に予備培養した。このように、この抗体
は、ｔＩＣＡＭ（４５３）の２つの分子を有効に「架
橋」させて、ｔＩＣＡＭ（４５３）の「二量体」を創作
することができ、更に、このｔＩＣＡＭ（４５３）の２
つの分子の各々のウイルス結合部位を妨害しないで行う
ことができる。重量比が４：１のＣＬ２０３ ＩｇＧと
ｔＩＣＡＭ（４５３）との混合物を競争定量法で試験し
たとき、この抗体を架橋させたｔＩＣＡＭ（４５３）
が、ｔＩＣＡＭ（４５３）単独よりも７．４倍低い濃度
でＨＲＶ３結合を抑制することを見い出し、これは、二
量体または小さい多量体であるが故に、ｔｍＩＣＡＭ−
１がより高い親和力でライノウイルスと結合するとの考
えと一致している。
３）の架橋 ｔｍＩＣＡＭ−１のこのより高い相対的結合活性がその
蛋白質の多量体形態によるものであることの追加的証拠
を得るため、該ｔＩＣＡＭ（４５３）蛋白質をＣＬ２０
３（即ち、ウイルスとＩＣＡＭ−１との結合を抑制しな
いが、残基１８４（Staunton、 他、Cell、 56:849 (198
9）およびCell、 61:243 (1990））に対する部位Ｃ末端
と結合するところの、ＩＣＡＭ−１に対する単クローン
抗体）と一緒に予備培養した。このように、この抗体
は、ｔＩＣＡＭ（４５３）の２つの分子を有効に「架
橋」させて、ｔＩＣＡＭ（４５３）の「二量体」を創作
することができ、更に、このｔＩＣＡＭ（４５３）の２
つの分子の各々のウイルス結合部位を妨害しないで行う
ことができる。重量比が４：１のＣＬ２０３ ＩｇＧと
ｔＩＣＡＭ（４５３）との混合物を競争定量法で試験し
たとき、この抗体を架橋させたｔＩＣＡＭ（４５３）
が、ｔＩＣＡＭ（４５３）単独よりも７．４倍低い濃度
でＨＲＶ３結合を抑制することを見い出し、これは、二
量体または小さい多量体であるが故に、ｔｍＩＣＡＭ−
１がより高い親和力でライノウイルスと結合するとの考
えと一致している。
【００８８】ｔＩＣＡＭの代替多量体形態を創作するた
め、ＩＣＡＭの更に一層修飾した数種の切形形態を、上
記実施例３に記述したようにして建造した。その後、こ
れらの形態は、以下の実施例９で示すように多量化させ
得る。
め、ＩＣＡＭの更に一層修飾した数種の切形形態を、上
記実施例３に記述したようにして建造した。その後、こ
れらの形態は、以下の実施例９で示すように多量化させ
得る。
【００８９】実施例９ トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形
態のＩＣＡＭ−１の多量化 ｔＩＣＡＭを、その単量体形態よりも強化されたウイル
ス結合および中和活性を有する多量体形態に変換するこ
とができる種々の方法がある。例えば、ｔＩＣＡＭ（４
５３）は、不活性ポリマー、例えばアミノデキストラン
（ＭＷ４０，０００）と、ホモ二官能（例えばＮ−ヒド
ロキシスクシニミド（ＮＨＳ）エステル）またはヘテロ
二官能（例えば、ＮＨＳ−エステルと、光活性化可能も
しくはスルフヒドリルに対して反応性を示す基とを含有
しているもの）架橋剤を用いて連結させることができ、
ここでは、このアミノデキストラン上のアミノ基、およ
び該ｔＩＣＡＭ上のアミノ基または他の基が利用され
る。適切な架橋剤の数多くの例がPierce Chemical Comp
anyのカタログ（Rockford、 Ill.）中に見いだされる。
態のＩＣＡＭ−１の多量化 ｔＩＣＡＭを、その単量体形態よりも強化されたウイル
ス結合および中和活性を有する多量体形態に変換するこ
とができる種々の方法がある。例えば、ｔＩＣＡＭ（４
５３）は、不活性ポリマー、例えばアミノデキストラン
（ＭＷ４０，０００）と、ホモ二官能（例えばＮ−ヒド
ロキシスクシニミド（ＮＨＳ）エステル）またはヘテロ
二官能（例えば、ＮＨＳ−エステルと、光活性化可能も
しくはスルフヒドリルに対して反応性を示す基とを含有
しているもの）架橋剤を用いて連結させることができ、
ここでは、このアミノデキストラン上のアミノ基、およ
び該ｔＩＣＡＭ上のアミノ基または他の基が利用され
る。適切な架橋剤の数多くの例がPierce Chemical Comp
anyのカタログ（Rockford、 Ill.）中に見いだされる。
【００９０】ｔＩＣＡＭは、ＮＨＳ−エステルを基とす
る化合物に対して弱い反応性を示すため、遺伝工学で製
造したＣ末端リジン残基を有するｔＩＣＡＭ（実施例３
参照）は、ホモ二官能試薬を用いると支持体に対する連
結効率が改良され、一方、遺伝工学的に製造したＣ末端
システイン残基は、ヘテロ二官能試薬、例えばスルホマ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエス
テル（ＭＢＳ）によって、連結が容易になる。
る化合物に対して弱い反応性を示すため、遺伝工学で製
造したＣ末端リジン残基を有するｔＩＣＡＭ（実施例３
参照）は、ホモ二官能試薬を用いると支持体に対する連
結効率が改良され、一方、遺伝工学的に製造したＣ末端
システイン残基は、ヘテロ二官能試薬、例えばスルホマ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエス
テル（ＭＢＳ）によって、連結が容易になる。
【００９１】二者択一的に、可溶ｔＩＣＡＭ多量体は、
反応性を示す残基をｔＩＣＡＭのＣ末端中に遺伝工学的
に組み込むことによって創作できる。例えば、ｔＩＣＡ
ＭのＣ末端領域に、比較的疎水性の配列を有する遊離シ
ステイン残基が創作できる（これが、溶媒にさらされる
傾向は大である）。これは、二量体をインサイチューで
創作することを可能にし、二者択一的に、単量体を精製
した後、ジスルフィド交換を二量体によりインビトロで
創作することもできると期待される。
反応性を示す残基をｔＩＣＡＭのＣ末端中に遺伝工学的
に組み込むことによって創作できる。例えば、ｔＩＣＡ
ＭのＣ末端領域に、比較的疎水性の配列を有する遊離シ
ステイン残基が創作できる（これが、溶媒にさらされる
傾向は大である）。これは、二量体をインサイチューで
創作することを可能にし、二者択一的に、単量体を精製
した後、ジスルフィド交換を二量体によりインビトロで
創作することもできると期待される。
【００９２】もう１つの方法では、同様な位置にリジン
残基の置換を行った後、精製した蛋白質をインビトロで
ホモ二官能ＮＨＳ−エステルで架橋させる必要がある。
上記リジン残基の例は、残基３３８、３６０、３８７で
ある。
残基の置換を行った後、精製した蛋白質をインビトロで
ホモ二官能ＮＨＳ−エステルで架橋させる必要がある。
上記リジン残基の例は、残基３３８、３６０、３８７で
ある。
【００９３】システイン残基同士の架橋は、遊離システ
イン基を有するｔＩＣＡＭと、ビス−マレイミドヘキサ
ン（Pierce Chemical Co.）または他のビス−マレイミ
ド−同族体とを反応させることによって行われ得る。担
体分子上のアミノ基に対するｔＩＣＡＭ上の遊離システ
イン残基の架橋は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシニミドエステルを用いた反応によって行
われ得る。ｔＩＣＡＭ分子上のアミノ基の架橋は、ホモ
二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（例えば、
Pierce ChemicalCo.のカタログ参照）を用いて行われ得
る。二者択一的に、ｔＩＣＡＭ上の炭水化物基を酸化し
てアルデヒドを生じさせた後、担体分子上のヒドラジン
に対して活性を有するアミノ基と連結させることができ
る。
イン基を有するｔＩＣＡＭと、ビス−マレイミドヘキサ
ン（Pierce Chemical Co.）または他のビス−マレイミ
ド−同族体とを反応させることによって行われ得る。担
体分子上のアミノ基に対するｔＩＣＡＭ上の遊離システ
イン残基の架橋は、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシニミドエステルを用いた反応によって行
われ得る。ｔＩＣＡＭ分子上のアミノ基の架橋は、ホモ
二官能Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（例えば、
Pierce ChemicalCo.のカタログ参照）を用いて行われ得
る。二者択一的に、ｔＩＣＡＭ上の炭水化物基を酸化し
てアルデヒドを生じさせた後、担体分子上のヒドラジン
に対して活性を有するアミノ基と連結させることができ
る。
【００９４】実施例１０ トランスメンブランおよび非トランスメンブラン切形形
態のＩＣＡＭ−１の感染力−中和定量 ウイルス感染に関する３つの異なる定量方法を用いた。
これらの異なる定量法は、トランスメンブランＩＣＡＭ
および非トランスメンブラン溶解度の相違を考慮したも
のである。
態のＩＣＡＭ−１の感染力−中和定量 ウイルス感染に関する３つの異なる定量方法を用いた。
これらの異なる定量法は、トランスメンブランＩＣＡＭ
および非トランスメンブラン溶解度の相違を考慮したも
のである。
【００９５】Ａ． 界面活性剤存在下でのプラーク減少
定量法 この定量法の結果は、細胞を死滅させる効果が存続して
いるウイルスの最大希釈度を示すものである。０．１％
のＴＸ１００存在下トランスメンブランＩＣＡＭ蛋白質
と一緒にウイルスを予備培養し、これを順次、培地中に
希釈し、１０6個細胞／ｍＬのヒーラー細胞と一緒に３
０分間培養し、１０倍に希釈した後、種々の希釈度のウ
イルスの入っている９６個のウエルを有するミクロタイ
タープレートの複数のウエル中にプレートアウトさせ
る。５日後、感染しているウエルと感染していないウエ
ルを、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在により点数をつ
け、そしてこのタイターを、元のウイルス１ミリリット
ル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として表
す。この定量法はU.S.S.N. 239,571に記述されており、
ｔｍＩＣＡＭ−１の抗ウイルス活性を示すために用いら
れる（これには、溶液中に保持させるため界面活性剤の
存在が必要とされた）。使用したＩＣＡＭ蛋白質の濃度
は、最初、該予備培養混合物中の濃度であるが、しかし
ながら、このＩＣＡＭ蛋白質は、この感染を通して一定
に存在しているのではなく、ここでは、該蛋白質を順次
希釈する。このｔｍＩＣＡＭを可溶化させるためには界
面活性剤の存在が必要であるが、この界面活性剤が存在
すると細胞を死滅させ、従って、この順次的希釈が必要
である。
定量法 この定量法の結果は、細胞を死滅させる効果が存続して
いるウイルスの最大希釈度を示すものである。０．１％
のＴＸ１００存在下トランスメンブランＩＣＡＭ蛋白質
と一緒にウイルスを予備培養し、これを順次、培地中に
希釈し、１０6個細胞／ｍＬのヒーラー細胞と一緒に３
０分間培養し、１０倍に希釈した後、種々の希釈度のウ
イルスの入っている９６個のウエルを有するミクロタイ
タープレートの複数のウエル中にプレートアウトさせ
る。５日後、感染しているウエルと感染していないウエ
ルを、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在により点数をつ
け、そしてこのタイターを、元のウイルス１ミリリット
ル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）として表
す。この定量法はU.S.S.N. 239,571に記述されており、
ｔｍＩＣＡＭ−１の抗ウイルス活性を示すために用いら
れる（これには、溶液中に保持させるため界面活性剤の
存在が必要とされた）。使用したＩＣＡＭ蛋白質の濃度
は、最初、該予備培養混合物中の濃度であるが、しかし
ながら、このＩＣＡＭ蛋白質は、この感染を通して一定
に存在しているのではなく、ここでは、該蛋白質を順次
希釈する。このｔｍＩＣＡＭを可溶化させるためには界
面活性剤の存在が必要であるが、この界面活性剤が存在
すると細胞を死滅させ、従って、この順次的希釈が必要
である。
【００９６】Ｂ． 界面活性剤なしのプラーク減少定量
法 このプラーク減少定量法、即ちより古典的な定量法で
は、上述したように、ヒーラー細胞を順次希釈したライ
ノウイルスに感染させるが、界面活性剤は存在していな
く、従って、この定量法はｔｍＩＣＡＭの分析には使用
できない。この定量法において、該ｔＩＣＡＭは、指示
された濃度で一定して該培地中に存在している。この系
ではｔｍＩＣＡＭ−１（これは界面活性剤の存在を必要
とする）は定量できない、何故ならば、必要とされる界
面活性剤を添加するとヒーラー細胞を死滅させるからで
ある。
法 このプラーク減少定量法、即ちより古典的な定量法で
は、上述したように、ヒーラー細胞を順次希釈したライ
ノウイルスに感染させるが、界面活性剤は存在していな
く、従って、この定量法はｔｍＩＣＡＭの分析には使用
できない。この定量法において、該ｔＩＣＡＭは、指示
された濃度で一定して該培地中に存在している。この系
ではｔｍＩＣＡＭ−１（これは界面活性剤の存在を必要
とする）は定量できない、何故ならば、必要とされる界
面活性剤を添加するとヒーラー細胞を死滅させるからで
ある。
【００９７】Ｃ． ウイルスおよびＩＣＡＭの一定した
存在下でのプラーク減少定量法 この定量法は、Marlin、 他（Nature 1990）が利用した
方法（ここでは、ＩＣＡＭ蛋白質の有り無しで、１００
ＰＦＵのウイルスにヒーラー細胞の培養物を感染させた
後、細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れるまで約４日間培養
する）に類似している。その後、この培養物をＣＰＥに
関して可視的に記録する。この分析条件は、上記Marlin
と同様であった。点数づけは、クリスタルバイオレット
を用いた染色操作よりはむしろ可視的に行った。
存在下でのプラーク減少定量法 この定量法は、Marlin、 他（Nature 1990）が利用した
方法（ここでは、ＩＣＡＭ蛋白質の有り無しで、１００
ＰＦＵのウイルスにヒーラー細胞の培養物を感染させた
後、細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れるまで約４日間培養
する）に類似している。その後、この培養物をＣＰＥに
関して可視的に記録する。この分析条件は、上記Marlin
と同様であった。点数づけは、クリスタルバイオレット
を用いた染色操作よりはむしろ可視的に行った。
【００９８】この定量法では、界面活性剤が全く存在し
ていなく、該ＩＣＡＭが一定して存在しており、そして
この分析法は、時間の任意点で、ウイルス複製／増殖の
減少の程度を示すものである。
ていなく、該ＩＣＡＭが一定して存在しており、そして
この分析法は、時間の任意点で、ウイルス複製／増殖の
減少の程度を示すものである。
【００９９】ウイルス感染に関するこれらの３つの異な
る定量法から得られたデータを表４に要約する。
る定量法から得られたデータを表４に要約する。
【０１００】
【表４】 表 ４ ＩＣ５０％（μＭ）＊ ＩＣＡＭ 定量法： Ａ Ｂ Ｃ ｔｍＩＣＡＭ−１ 0.03 ND ND ｔＩＣＡＭ（４５３） >20 0.2 0.2 ｔＩＣＡＭ（１８５） >20 ND ND ＊ ＩＣ５０％は、ＨＲＶ３感染を５０％抑制するため
に必要なＩＣＡＭ蛋白質の濃度として定義される。
に必要なＩＣＡＭ蛋白質の濃度として定義される。
【０１０１】これらのデータは、異なる定量系で比較し
たときでさえ、ウイルス感染の減少において、該切形Ｉ
ＣＡＭ蛋白質よりもｔｍＩＣＡＭ−１が有意に活性を示
すことを示している。定量法（Ａ）と定量法（Ｂ）にお
けるｔＩＣＡＭ（４５３）の中和活性の差は、ｔＩＣＡ
Ｍ（４５３）によってもたらされる中和には該培地中に
ｔＩＣＡＭ（４５３）が一定して存在していることが必
要であり、そしてこれは可逆的であることを示してい
る。この中和が可逆的であることは、定量法（Ａ）で観
察される中和の不足によって示されている。反対に、定
量法（Ａ）において、ｔｍＩＣＡＭ−１の中和活性はｔ
ＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）よりも
＞６６７倍高く、そして界面活性剤の存在なしで該培地
中にｔｍＩＣＡＭ−１を一定して存在させることが可能
である場合、定量法（Ｂ）ではより高くなる可能性があ
る。
たときでさえ、ウイルス感染の減少において、該切形Ｉ
ＣＡＭ蛋白質よりもｔｍＩＣＡＭ−１が有意に活性を示
すことを示している。定量法（Ａ）と定量法（Ｂ）にお
けるｔＩＣＡＭ（４５３）の中和活性の差は、ｔＩＣＡ
Ｍ（４５３）によってもたらされる中和には該培地中に
ｔＩＣＡＭ（４５３）が一定して存在していることが必
要であり、そしてこれは可逆的であることを示してい
る。この中和が可逆的であることは、定量法（Ａ）で観
察される中和の不足によって示されている。反対に、定
量法（Ａ）において、ｔｍＩＣＡＭ−１の中和活性はｔ
ＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）よりも
＞６６７倍高く、そして界面活性剤の存在なしで該培地
中にｔｍＩＣＡＭ−１を一定して存在させることが可能
である場合、定量法（Ｂ）ではより高くなる可能性があ
る。
【０１０２】これらの結果をMarlin、 他の結果と比較す
るため、彼らの分析条件を再現する試みを行った。表４
に示すように、定量法（Ｂ）と定量法（Ｃ）との結果の
間に良好な相関関係が存在しているが、ｔＩＣＡＭ（４
５３）に関するＩＣ５０％はMarlin他で見られるそれよ
りも１０倍高い。これが使用したライノウイルスの血細
型による相違のためであるか否かを調べるため、ＨＲＶ
１４およびＨＲＶ５４（Marlin他が用いた血細型）を用
いてこの定量法を繰り返した。これらの血細型の両方に
関するＩＣ５０％は０．２μＭのｔＩＣＡＭ（４５３）
であり、このことは、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ５４、および
ＨＲＶ３の間に血細型の感受性に関する相違がないこと
を示している。
るため、彼らの分析条件を再現する試みを行った。表４
に示すように、定量法（Ｂ）と定量法（Ｃ）との結果の
間に良好な相関関係が存在しているが、ｔＩＣＡＭ（４
５３）に関するＩＣ５０％はMarlin他で見られるそれよ
りも１０倍高い。これが使用したライノウイルスの血細
型による相違のためであるか否かを調べるため、ＨＲＶ
１４およびＨＲＶ５４（Marlin他が用いた血細型）を用
いてこの定量法を繰り返した。これらの血細型の両方に
関するＩＣ５０％は０．２μＭのｔＩＣＡＭ（４５３）
であり、このことは、ＨＲＶ１４、ＨＲＶ５４、および
ＨＲＶ３の間に血細型の感受性に関する相違がないこと
を示している。
【０１０３】この矛盾を解決する試みのため、Marlin他
が用いたのと同様の緩衝液を使用して、それが定量法
（Ｃ）のライノウイルスの感染に影響を与えるか否かを
確認した。Marlin他は、５０ｍＭトリエタノールアミン
（ＴＥＡ）／２０ｍＭトリス含有緩衝液中で彼らのｓＩ
ＣＡＭ−１蛋白質を製造した。この緩衝液単独をＨＲＶ
３およびＨＲＶ１４の対照感染物（１／１０倍の容積、
最終濃度５ｍＭ ＴＥＡ／２ｍＭ トリス）に加えると、
実際上ＣＰＥの完全な抑制が観察された。従って、いず
れかの形態のＩＣＡＭの存在とは関係なく、ウイルス複
製に対して緩衝液が影響を与えている可能性がある。
が用いたのと同様の緩衝液を使用して、それが定量法
（Ｃ）のライノウイルスの感染に影響を与えるか否かを
確認した。Marlin他は、５０ｍＭトリエタノールアミン
（ＴＥＡ）／２０ｍＭトリス含有緩衝液中で彼らのｓＩ
ＣＡＭ−１蛋白質を製造した。この緩衝液単独をＨＲＶ
３およびＨＲＶ１４の対照感染物（１／１０倍の容積、
最終濃度５ｍＭ ＴＥＡ／２ｍＭ トリス）に加えると、
実際上ＣＰＥの完全な抑制が観察された。従って、いず
れかの形態のＩＣＡＭの存在とは関係なく、ウイルス複
製に対して緩衝液が影響を与えている可能性がある。
【０１０４】実施例１１ ＩＣＡＭ／ＦＬＡ−１相互作用の有効な抑制因子として
の、トランスメンブランおよび切形形態のＩＣＡＭ−１
の多量体形態の使用 ＩＣＡＭ−１の正規な機能は、白血球インテグリンＬＦ
Ａ−１のリガンドとして働くことであり、これらの２つ
の分子間の相互作用が、白血球と種々の他の細胞との間
の粘着をもたらす。細胞上のＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ
−１の間の粘着を抑制するｔＩＣＡＭ（４５３）の能力
を下記のように試験した。実施例７Ｃに記述したよう
に、ＩＣＡＭ−１をミクロタイタープレートに吸着させ
た。ＬＦＡ−１を発現するＪＹ細胞が、ＩＣＡＭ発現細
胞、或はＩＣＡＭ−１をコートした培養皿（Staunton、
他、JCB）に粘着する。ＪＹ細胞を、３７℃で３０分
間、ｔＩＣＡＭ（４５３）の有り無しで予備培養した
後、該ＩＣＡＭ−１をコートしたプレートに加え、そし
て３７℃で６０分間培養した。次に、このミクロタイタ
ープレートを洗浄した後、このプレートに付着した細胞
の数を数えた。
の、トランスメンブランおよび切形形態のＩＣＡＭ−１
の多量体形態の使用 ＩＣＡＭ−１の正規な機能は、白血球インテグリンＬＦ
Ａ−１のリガンドとして働くことであり、これらの２つ
の分子間の相互作用が、白血球と種々の他の細胞との間
の粘着をもたらす。細胞上のＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ
−１の間の粘着を抑制するｔＩＣＡＭ（４５３）の能力
を下記のように試験した。実施例７Ｃに記述したよう
に、ＩＣＡＭ−１をミクロタイタープレートに吸着させ
た。ＬＦＡ−１を発現するＪＹ細胞が、ＩＣＡＭ発現細
胞、或はＩＣＡＭ−１をコートした培養皿（Staunton、
他、JCB）に粘着する。ＪＹ細胞を、３７℃で３０分
間、ｔＩＣＡＭ（４５３）の有り無しで予備培養した
後、該ＩＣＡＭ−１をコートしたプレートに加え、そし
て３７℃で６０分間培養した。次に、このミクロタイタ
ープレートを洗浄した後、このプレートに付着した細胞
の数を数えた。
【０１０５】
【表５】 表５ 可溶ＩＣＡＭによるＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用の抑制 ｔＩＣＡＭ(４５３)(μg／ml) 細胞結合制御(％)＊ − １００ １００ ９６ ３００ ９３ ６００ ７５ ＊ ＩＣＡＭ−１をコートしたミクロタイタープレート
への結合；１０μｇ／ｍＬの抗ＬＦＡ−１または抗ＩＣ
ＡＭ−１ ＭＡｂは、＜１％に結合を抑制した。
への結合；１０μｇ／ｍＬの抗ＬＦＡ−１または抗ＩＣ
ＡＭ−１ ＭＡｂは、＜１％に結合を抑制した。
【０１０６】表５で見られるように、高濃度のｔＩＣＡ
Ｍ（４５３）（０．６ｍｇ／ｍＬ）でさえも、ＪＹ細胞
結合に関する低い抑制が観察された。これは、恐らく
は、細胞間の粘着が数千の分子を巻き込む高度の協力工
程であり、そしてｔＩＣＡＭ（４５３）の親和力が低い
ことによるためであろう。多量体配置のｔＩＣＡＭ（４
５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）を与えると、細胞に
対するｔＩＣＡＭの親和力が増大し、そして炎症または
自己免疫症における有効な抗粘着剤として働き得る。
Ｍ（４５３）（０．６ｍｇ／ｍＬ）でさえも、ＪＹ細胞
結合に関する低い抑制が観察された。これは、恐らく
は、細胞間の粘着が数千の分子を巻き込む高度の協力工
程であり、そしてｔＩＣＡＭ（４５３）の親和力が低い
ことによるためであろう。多量体配置のｔＩＣＡＭ（４
５３）またはｔＩＣＡＭ（１８５）を与えると、細胞に
対するｔＩＣＡＭの親和力が増大し、そして炎症または
自己免疫症における有効な抗粘着剤として働き得る。
【０１０７】前記実施例は、ｔＩＣＡＭ−１の結合およ
び中和活性を本質的に増大させる可溶な多量体形態のｔ
ＩＣＡＭの創作を記述したものである。
び中和活性を本質的に増大させる可溶な多量体形態のｔ
ＩＣＡＭの創作を記述したものである。
【０１０８】本発明を特定の方法および組成で記述して
きたが、本発明を考慮するとき、種々の変化および修飾
が本分野の技術者に思い浮かぶものと理解する。
きたが、本発明を考慮するとき、種々の変化および修飾
が本分野の技術者に思い浮かぶものと理解する。
【０１０９】例えば、ウイルスとの結合部位を有してい
るＩＣＡＭ−１から誘導されるより小さい蛋白質フラグ
メントおよびペプチド類もまた多量体配置で有効である
ことが予測される。多量体ＩＣＡＭはＩＣＡＭ−１／Ｌ
ＦＡ−１相互作用の有効な抑制因子であり得ると期待さ
れる、何故ならば、これらの分子間の親和力は極めて低
く、そしてこれらの２つの分子によってもたらされる細
胞−細胞結合は非常に協力的であるからである。
るＩＣＡＭ−１から誘導されるより小さい蛋白質フラグ
メントおよびペプチド類もまた多量体配置で有効である
ことが予測される。多量体ＩＣＡＭはＩＣＡＭ−１／Ｌ
ＦＡ−１相互作用の有効な抑制因子であり得ると期待さ
れる、何故ならば、これらの分子間の親和力は極めて低
く、そしてこれらの２つの分子によってもたらされる細
胞−細胞結合は非常に協力的であるからである。
【０１１０】好適な形態および立体配置は二量体配置の
非トランスメンブラン（切形）ＩＣＡＭであるが、ウイ
ルスとの結合に有効でありそしてウイルスの活性の中和
に有効な他の形態および立体配置を本発明の範囲内に包
含させることの排除を意図したものではない。
非トランスメンブラン（切形）ＩＣＡＭであるが、ウイ
ルスとの結合に有効でありそしてウイルスの活性の中和
に有効な他の形態および立体配置を本発明の範囲内に包
含させることの排除を意図したものではない。
【０１１１】更に、通常にメンブラン結合した不溶レセ
プタ蛋白質から可溶な蛋白質形態を製造する本発明の一
般的な方法は、「主要群」のレセプタと結合するウイル
ス以外のウイルスと結合しそしてその感染を減少させる
ために用いられる、他のレセプタ蛋白質の可溶多量体形
態を製造するために用いられ得る。このような他のウイ
ルスには、ポリオ、単純ヘルペス、Epstein-Barrウイル
スが含まれる。
プタ蛋白質から可溶な蛋白質形態を製造する本発明の一
般的な方法は、「主要群」のレセプタと結合するウイル
ス以外のウイルスと結合しそしてその感染を減少させる
ために用いられる、他のレセプタ蛋白質の可溶多量体形
態を製造するために用いられ得る。このような他のウイ
ルスには、ポリオ、単純ヘルペス、Epstein-Barrウイル
スが含まれる。
【０１１２】上述した説明的実施例中に記述した本発明
の数多くの修飾および変化が本分野の技術者に思い浮か
ぶものと予想される、従って、それについては、付随す
る請求項で明らかとなる制限のみを置くものとする。
の数多くの修飾および変化が本分野の技術者に思い浮か
ぶものと予想される、従って、それについては、付随す
る請求項で明らかとなる制限のみを置くものとする。
【０１１３】従って、この付随する請求項中で請求する
本発明の範囲内に入る同等の変化全てを包含することを
意図するものである。
本発明の範囲内に入る同等の変化全てを包含することを
意図するものである。
【０１１４】本発明の特徴および態様は以下のとうりで
ある。
ある。
【０１１５】１．多量体ＩＣＡＭ。
【０１１６】２．上記ＩＣＡＭが非トランスメンブラン
ＩＣＡＭである第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。
ＩＣＡＭである第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１１７】３．上記非トランスメンブランＩＣＡＭが
本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有していなくそ
して疎水性メンブランドメインを有していない第２項記
載の多量体ＩＣＡＭ。
本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有していなくそ
して疎水性メンブランドメインを有していない第２項記
載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１１８】４．上記非トランスメンブランＩＣＡＭが
ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８４）から
成る群から選択される１員である第２項記載の多量体Ｉ
ＣＡＭ。
ｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８４）から
成る群から選択される１員である第２項記載の多量体Ｉ
ＣＡＭ。
【０１１９】５．上記ＩＣＡＭを支持体に吸着させるこ
とによって多量化させた第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。
とによって多量化させた第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２０】６．上記支持体が不活性ポリマーでありそ
してニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリ
マー、およびアミノデキストランから成る群から選択さ
れる１員である第５項記載の多量体ＩＣＡＭ。
してニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質ポリ
マー、およびアミノデキストランから成る群から選択さ
れる１員である第５項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２１】７．上記多量体ＩＣＡＭを構成要素に連結
させることによって多量化させた第１項記載の多量体Ｉ
ＣＡＭ。
させることによって多量化させた第１項記載の多量体Ｉ
ＣＡＭ。
【０１２２】８．上記ＩＣＡＭをどちらかの末端で修飾
した第７項記載の多量体ＩＣＡＭ。 ９．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端で修飾した第８項
記載の多量体ＩＣＡＭ。
した第７項記載の多量体ＩＣＡＭ。 ９．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端で修飾した第８項
記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２３】１０．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端で
修飾して反応性を示すアミノ酸残基を含有させた第８項
記載の多量体ＩＣＡＭ。
修飾して反応性を示すアミノ酸残基を含有させた第８項
記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２４】１１．上記反応性を示すアミノ酸残基がリ
ジンおよびシステインから成る群から選択される１員で
ある第１０項記載の多量体ＩＣＡＭ。
ジンおよびシステインから成る群から選択される１員で
ある第１０項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２５】１２．上記ＩＣＡＭをアミノ末端で修飾し
た第８項記載の多量体ＩＣＡＭ。
た第８項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２６】１３．上記ＩＣＡＭをアミノ末端で修飾し
て反応性を示すアミノ酸残基を含有させた第８項記載の
多量体ＩＣＡＭ。
て反応性を示すアミノ酸残基を含有させた第８項記載の
多量体ＩＣＡＭ。
【０１２７】１４．上記反応性を示すアミノ酸がリジン
およびシステインから成る群から選択される１員である
第１３項記載の多量体ＩＣＡＭ。
およびシステインから成る群から選択される１員である
第１３項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２８】１５．上記ＩＣＡＭをどちらかの末端で修
飾してオリゴマーミセルの形成を促進させ得る脂質を含
有させた第８項記載の多量体ＩＣＡＭ。
飾してオリゴマーミセルの形成を促進させ得る脂質を含
有させた第８項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１２９】１６．上記構成要素が抗体、蛋白質担体、
および架橋剤から成る群から選択される１員である第７
項記載の多量体ＩＣＡＭ。
および架橋剤から成る群から選択される１員である第７
項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１３０】１７．上記抗体が抗ＩＣＡＭ抗体ＣＬ ２
０３である第１６項記載の多量体ＩＣＡＭ。
０３である第１６項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１３１】１８．上記架橋剤がヘテロ二官能およびホ
モ二官能架橋剤から成る群から選択される第１６項記載
の多量体ＩＣＡＭ。
モ二官能架橋剤から成る群から選択される第１６項記載
の多量体ＩＣＡＭ。
【０１３２】１９．上記架橋剤が二官能Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドエステル、イミドエステルおよびビス−マ
レイミド−ヘキサン類から成る群から選択される１員で
ある第１８項記載の多量体ＩＣＡＭ。
スクシニミドエステル、イミドエステルおよびビス−マ
レイミド−ヘキサン類から成る群から選択される１員で
ある第１８項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１３３】２０．上記蛋白質担体がアルブミンおよび
プロテオグリカン類から成る群から選択される１員であ
る第７項記載の多量体ＩＣＡＭ。
プロテオグリカン類から成る群から選択される１員であ
る第７項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１３４】２１．上記ＩＣＡＭが、充分にグリコシル
化されたＩＣＡＭ、部分的にグリコシル化されたＩＣＡ
Ｍまたは非グリコシル化ＩＣＡＭから成る群から選択さ
れる１員である第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。
化されたＩＣＡＭ、部分的にグリコシル化されたＩＣＡ
Ｍまたは非グリコシル化ＩＣＡＭから成る群から選択さ
れる１員である第１項記載の多量体ＩＣＡＭ。
【０１３５】２２．改良が、リガンドに対する非トラン
スメンブランＩＣＡＭの結合を強化させる形態および立
体配置の非トランスメンブランＩＣＡＭを、リガンドに
供給する段階から成る、上記リガンドと上記非トランス
メンブランＩＣＡＭとの結合を増強させる方法。
スメンブランＩＣＡＭの結合を強化させる形態および立
体配置の非トランスメンブランＩＣＡＭを、リガンドに
供給する段階から成る、上記リガンドと上記非トランス
メンブランＩＣＡＭとの結合を増強させる方法。
【０１３６】２３．上記非トランスメンブランＩＣＡＭ
が本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有していなく
そして疎水性メンブランドメインを有していない第２２
項記載の方法。
が本質的にカルボキシル細胞内ドメインを有していなく
そして疎水性メンブランドメインを有していない第２２
項記載の方法。
【０１３７】２４．上記非トランスメンブランＩＣＡＭ
がｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）か
ら成る群から選択される１員である第２３項記載の方
法。
がｔＩＣＡＭ（４５３）およびｔＩＣＡＭ（１８５）か
ら成る群から選択される１員である第２３項記載の方
法。
【０１３８】２５．上記ＩＣＡＭが多量体配置にある第
２２項記載の方法。
２２項記載の方法。
【０１３９】２６．上記ＩＣＡＭをカルボキシル末端ま
たはアミノ末端のどちらかで修飾し、そして多量体ＩＣ
ＡＭの形成が増強された第２２項記載の方法。
たはアミノ末端のどちらかで修飾し、そして多量体ＩＣ
ＡＭの形成が増強された第２２項記載の方法。
【０１４０】２７．上記修飾がカルボキシル末端でのリ
ジン添加から成る第２６項記載の方法。
ジン添加から成る第２６項記載の方法。
【０１４１】２８．上記修飾がカルボキシル末端での遊
離システイン添加から成る第２６項記載の方法。
離システイン添加から成る第２６項記載の方法。
【０１４２】２９．上記多量体配置が二量体から成る第
２５項記載の方法。
２５項記載の方法。
【０１４３】３０．上記多量体配置が、第２ＩＣＡＭと
架橋している第１ＩＣＡＭから成る第２５項記載の方
法。
架橋している第１ＩＣＡＭから成る第２５項記載の方
法。
【０１４４】３１．上記多量体配置が、多量体配置を生
じさせるために支持体に吸着させたＩＣＡＭから成る第
２５項記載の方法。
じさせるために支持体に吸着させたＩＣＡＭから成る第
２５項記載の方法。
【０１４５】３２．上記支持体が高分子量の本質的に不
活性なポリマー類から成る群から選択される１員から成
る第３１項記載の方法。
活性なポリマー類から成る群から選択される１員から成
る第３１項記載の方法。
【０１４６】３３．上記ポリマーが不活性ポリマーであ
りそしてニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質
ポリマー類、およびアミノデキストランから成る群から
選択される１員である第３２項記載の方法。
りそしてニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ＤＥＡＥ、脂質
ポリマー類、およびアミノデキストランから成る群から
選択される１員である第３２項記載の方法。
【０１４７】３４．上記多量体ＩＣＡＭを構成要素に連
結させることによって多量化させる第３２項記載の方
法。
結させることによって多量化させる第３２項記載の方
法。
【０１４８】３５．上記構成要素が抗体、蛋白質担体、
および架橋剤から成る群から選択される１員である第３
４項記載の方法。
および架橋剤から成る群から選択される１員である第３
４項記載の方法。
【０１４９】３６．上記架橋剤がヘテロ二官能およびホ
モ二官能架橋剤から成る群から選択される１員である第
３５項記載の方法。
モ二官能架橋剤から成る群から選択される１員である第
３５項記載の方法。
【０１５０】３７．上記蛋白質担体がアルブミンおよび
プロテオグリカン類から成る群から選択される１員であ
る第３２項記載の方法。
プロテオグリカン類から成る群から選択される１員であ
る第３２項記載の方法。
【０１５１】３８．上記抗体が抗ＩＣＡＭ抗体ＣＬ ２
０３である第３７項記載の方法。
０３である第３７項記載の方法。
【０１５２】３９．上記リガンドがヒトのライノウイル
ス、主要群レセプタウイルス、リンパ球関連抗原−１
（ＬＦＡ−１）および熱帯マラリア原虫から成る群から
選択される１員である第２２項記載の方法。
ス、主要群レセプタウイルス、リンパ球関連抗原−１
（ＬＦＡ−１）および熱帯マラリア原虫から成る群から
選択される１員である第２２項記載の方法。
【０１５３】４０．薬学的に許容される溶媒、希釈剤、
補助剤または担体を含有し、そして活性材料として、有
効量の第１項記載ポリペプチドを含有している薬学的組
成物。
補助剤または担体を含有し、そして活性材料として、有
効量の第１項記載ポリペプチドを含有している薬学的組
成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/00 15/00 Ｃ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アラン・マツクレランド アメリカ合衆国コネチカツト州06475オ ールドセイブルツク・スクールハウスロ ード300 (56)参考文献 欧州特許出願公開365837（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/00 - 19/00 A61K 31/00 - 48/00 A61P 1/00 - 43/00 C12N 5/00 - 5/28 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 単量体状トランスメンブラン細胞間接着
分子１（ｔｍＩＣＡＭ−１）およびｔｍＩＣＡＭ−１の
単量体状フラグメントよりなる群からそれぞれ独立に選
ばれる２種もしくはそれ以上の単量体からなり、ただ
し、該各単量体はヒトライノウイルス（ＨＲＶ）結合部
位を含んでいなければならず、そしてただし、該単量体
から構成される多量体が二量体である場合には、該単量
体は共にｔｍＩＣＡＭ−１であることはできず、また、
該単量体の少なくとも２つは、相互に、天然のｔｍＩＣ
ＡＭ−１の多量体立体配置に似ているように配向されて
いる多量体薬剤であって、該多量体薬剤がそれを構成す
る少なくとも１つの単量体に関して増強されたウイルス
への結合を示す、主要ヒトライノウイルスレセプタ群の
ウイルスに結合しその感染力を低下させるための多量体
薬剤。
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP3091527B2 (ja) |
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