NO178862B

NO178862B - Fremgangsmåte for fremstilling av intracellulært adhesjonsmolekyl - 2 eller et funksjonelt derivat derav

Info

Publication number: NO178862B
Application number: NO901093A
Authority: NO
Inventors: Timothy Alan Springer; Michael Loran Dustin; Donald E Staunton
Original assignee: Blood Res Center
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1996-03-11
Also published as: HU214247B; EP0387668B1; MX9203469A; HU901367D0; AU5117290A; CA2011633C; JPH0361486A; ATE146222T1; EP0387668A1; ES2097747T3; KR0169728B1; CA2011633A1; JP3369166B2; KR900013978A; FI100994B; NZ232833A; NO178862C; NO901093L; DE69029336D1; NZ245651A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av ICAM-2 eller et funksjonelt derivat derav, hovedsakelig fritt for naturlige kontaminanter, og hvori nevnte ICAM-2 eller funksjonelle derivat derav inneholder minst ett polypeptid valgt fra gruppen bestående av: (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-; (b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-; (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-; (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-; (e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-; (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-; (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-;

(j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-;

(k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I-: og

(1) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

Det intracellulære adhesjonsmolekyl - 2 ("ICAM-2") er involvert i den prosess, gjennom hvilken lymfocyttpopulasjoner gjenkjenner og adhererer til cellulære substrater, slik at de kan vandre til betennelsessteder og reagere med celler under betennelsesreaksjoner. Det beskrives i tillegg ligandmolekyler som er istand til å binde til ICAM-2 intracellulære adhesjonsmolekyler, og bruksområder for det intracellulære adhesjonsmolekyl og ligandmolekylene.

Leukocytter må være istand til å bindes til cellulære substrater for å beskytte verten effektivt mot fremmede organismer slik som bakterier eller virus. En utmerket over-sikt over forsvarssystemet er gitt av Eisen, H.W., (I: Micro-biology, 3. utg., Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), s. 290-295 og 381-418). De må være istand til å binde seg til endotelceller, slik at de kan vandre fra blodbanen til steder der betennelse foregår. Videre må de binde seg til antigen-presenterende celler, slik at en normal, spesifikk immun-reaksjon kan opptre, og endelig må de binde seg til passende målceller, slik at lysing kan opptre av viralt infiserte celler eller tumorceller.

Nylig ble leukocytt-overflatemolekyler som inngikk i formidling av slik binding identifisert ved bruk av hybridomteknologi. I korthet ble monoklonale antistoffer rettet mot humane T-celler (Davignon, D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:4535-4539 (1981)) og musemilteeller (Springer, T. et al, Eur. J. Immunol. 9:301-306 (1979)) identifisert og som bandt til leukocyttoverflater og hemmet bindingsrelaterte funksjoner som beskrevet ovenfor (Springer, T. et al., Fed. Proe. 44:2660-2663 (1985)). Molekylene som ble identifisert ved disse antistoffene ble kalt Mac-1 og lymfocyttfunksjon-assosiert antigen-1 (LFA-1). Mac-1 er en heterodimer funnet på makrofager, granulocytter og store granulære lymfocytter. LFA-1 er en heterodimer som ble funnet på de fleste lymfocytter (Springer, T.A. et al., Immunol. Rev. 68:111-135 (1982)). Disse to molekylene pluss et tredje molekyl, pl50,95 (som har en vevsdistribusjon lik Mac-1) spiller en rolle i cellulær adhesjon (Keizer, G. et al., Eur. J. Immunol 15:1142-1147

(1985)).

De ovenfor beskrevne leukocyttmolekyler ble funnet å være medlemmer av en relatert familie av glykoproteiner (Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803

(1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol. 15:1142-1147

(1985)), som er betegnet "CD-18-familien" av glykoproteiner. Denne glykoproteinfamilie består av heterodimere som har én alfakjede og én betakjede. Skjønt alfakjeden på hver av antigenene var forskjellige fra hverandre, ble betakjeden funnet å være sterkt konservert (Sanches-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983)). Betakjeden i glykoprotein-familien (av og til referert til som "CD18") ble funnet å ha en molekylvekt på 95 kd, mens alfakjedene ble funnet å variere fra 150 kd til 180 kd (Springer T., Fec. Proe. 44:2660-2663

(1985)). Skjønt alfa subenhetene i membranproteinene ikke har den utstrakte homologi som beta-subenhetene deler, har en detaljert analyse av alfa-subenhetene i glykoproteinene avslørt at der er betydelige likheter mellom dem. Oversikter over likhetene mellom alfa- og beta-subenhetene i LFA-1-relaterte glykoproteiner er gitt av Sanches-Madrid F. et al.,

(J. Exper. Med. 158:586-602 (1983); J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983)).

En gruppe individer er blitt identifisert som ikke er istand til å uttrykke normale mengder av noe medlem av denne adhesjons-proteinfamilie på deres leukocyttoverflate (Anderson, D.C et al., Fed. Proe. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C, et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Lymfocytter fra disse pasienter viste in vitro-defekter lik normale personer hvis CD-18-molekylfamilie hadde blitt anta-gonisert (hemmet) av antistoffer. Videre var disse individer ikke istand til å frembringe en normal immunrespons på grunn av manglende evne av deres celler til å adherere til cellulære substrater (Anderson, D.C. et al., Fed. Proe. 44:2671-2677

(1985); Anderson D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668-689

(1985)). Disse resultater viser at immunreaksjoner blir redusert når lymfocytter ikke er istand til å adherere på en normal måte på grunn av mangel på funksjonelle adhesjonsmolekyler av CD-18-familien.

Sammenfattet krever således evnen til leukocyttene når det gjelder å opprettholde helsen og levedyktigheten til et dyr, at de er istand til å adherere til andre celler (slik som endotelceller). Denne adhesjon er blitt funnet å kreve celle-celle-kontakter som involverer spesifikke reseptormolekyler tilstede på celleoverflaten til leukocyttene. Disse resep-torene setter en leukocytt istand til å adherere til andre leukocytter eller til endoteliale, og andre ikke-vaskulære celler. Celleoverflatereseptormolekylene er funnet å være sterkt relatert til hverandre. Mennesker, hvis leukocytter mangler disse celleoverflatereseptormolekylene viser kroniske og gjentatte infeksjoner, såvel som andre kliniske symptomer, inklusive defekte antistoffresponser.

Siden leukocyttadhesjon inngår i prosessen, hvori fremmed vev blir identifisert og forkastet, blir en forståelse av denne prosess av betydelig verdi i organtransplantasjons-feltene, vevstransplantasjon, allergi og onkologi (læren om kreft).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særpreget ved

trinnene:

a) oppbygging av et rekombinant DNA-molekyl som inneholder en nukleinsyresekvens som koder for nevnte ICAM-2 eller funksjonelle derivat derav, operativt knyttet til en ekspresjonskontrollsekvens; b) innføring av nevnte DNA-molekyl i en bakterie- eller en eukaryot vertscelle;

c) dyrking av nevnte vertscelle, og

d) isolering av ICAM-2'et eller det funksjonelle derivat

derav syntetisert av nevnte vertscelle.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 viser binding av transfektere COS-celler som uttrykker ICAM-1 og ICAM-2 i LFA-l-dekket plastikk. A) COS-celler transfektert med ICAM-1 cDNA ble lagt ut på LFA-1-dekkete skåler og produksjonen av ICAM-1 ble analysert ved indirekte immunofluorescens flow cystometri med anti-ICAM-1 monoklonal antistoff RR1/1 som primært MAb. Ikke utlagte celler (prikket linje), ikke-adherente celler (stiplet linje), adherente celler (helopptrukken linje). B) <51>Cr-merket transfekterte COS-celler som produserer ICAM-1 eller ICAM-2 ble bundet til LFA-l-dekket plastikk i nærvær av MAb. Fig. 2 viser nukleotidet og aminosyresekvensen til ICAM-2. Aminosyresekvensen er nummerert og begynner med det første residuet etterfulgt det antatte klyvningssted for signal-peptidet. Det hydrofobe antatte signalpeptid og transmembran-sekvenser (TM) er understreket. Potensielle N-bundet glykosyleringsseter er bokset inn. Det sannsynlige polyadenyler-ingssignal AATACA er merket med en linje over. Begge trådene til ICAM-2 cDNA ble sekvensert med CDM8 ved sekvensiell syntese av komplementære oligonukleotidprimere og dideoksy-nukleotid kjedetermineringssekvensering (Sanger, F. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)) ifølge produsentens anbefalinger (Sequenase, U.S. Biochemical). Fig. 3 viser resultatene av RNA og DNA hybridiseringsanalyser. Northern (A og B) og Southern (C) blots ble hybridisert til den 1,1 kb <32>P-merkete ICAM-2 cDNA (A og C) og rehybridisert til 3 kb <32>P-merket ICAM-1 cDNA (B). (A og B) 6 Mg av poly(A)<+> RNA fra Burkitt lymfomcellelinjen, Ramos (spor 1), endotelceller (spor 2), endotelceller stimulert i tre

timer med LPS (spor 3), en EBV udødeliggjort B-lymfoblast-cellelinje, BBN (spor 4), etpitelial karsinomcellelinje, HeLa (spor 5), T-lymfomcellelinjer, Jurkat (spor 6) og SKW-3 (spor 7), og en promonocyttcellelinje, U937 (spor 8). (C) 6 ug av

genomisk DNA fra B-cellelinjer BL-2 (spor 1 og 4), ER-LCL (spor 2 og 5) og Raji (spor 3 og 6) fordøyet med EcoRI (spor 1-3) eller Hindlll (spor 4-6). ICAM-2 og ICAM-1 mRNA er indikert ved piler.

Fig. 4 viser ICAM-2-homologi til ICAM-1. Den hele 201 rest ekstracellulære sekvens av ICAM-2 ble sammenlignet med ICAM-1 rester 1-185 ved bruk av ALIGN-program (Dayhoff, M.O. et al., Metods Enzymol. 91:524-545 (1983)) og ved inspeksjon. ICAM-2-rester er nummerert. Identitetene er bokset inn. Dl og D2 indikerer grensen av Ig-lignende domener til ICAM-2 og ICAM-1. /3-tråd prediksjon (Chou, P.Y et al., Biochemistry 13:211-245 (1974)) av ICAM-2 er merket med en linje over, og de av ICAM-1 er understreket.

I den foreliggende oppfinnelse beskrives oppdagelsen av en naturlig bindingsligand til LFA-1. Molekyler, slik som de i CD-18-familien som er involvert i den cellulære adhesjons-prosess blir referert til som "adhesjonsmolekyler".

I. LFA- 1 og ICAM- 1

Leukocytt-adhesjonsmolekylet LFA-1 formidler et bredt spekter av lymfocytt, monocytt, naturlig drapscelle og granulocytt-interaksjoner med andre celler i immunologi og betennelse (Springer, T.A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252

(1987)).

LFA-1 er en reseptor for intracellulær adhesjonsmolekyl i (ICAM-1), et overflatemolekyl er konstitutivt (vedvarende) uttrykt på visse vev og indusert på andre ved betennelse (Marlin et al., Cell 51:813-819 (1987); Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986); Dustin, M.L. et al., Immunol. Today 9:213-215 (1988); US-patentsøknad serie nr. 07/019 440 innsendt 26. februar 1987 og US-patentsøknad serie nr. 07/250 446 innsendt 28. september 1988, begge søknader er herved inhkorporert ved referanse).

LFA-l-funksjoner er både antigen-spesifikke og antigen-uavhengig T-cytotoksisk, T-hjelper, naturlig dreper, granulocytt og monocytt-interaksjoner med andre celletyper (Springer, T.A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987); Kishimoto, T.K. et al., Adv. Immunol. (1988, under trykking). LFA-1 er en leukocytt-integrin med ikke-kovalent forbundet a-og /?-glykoprotein subenheter på 180 og 95 kD.

ICAM-1 er et enkeltkjedeglykoprotein med varierende masse i forskjellige celletyper fra 7 6-114 kD og er medlem av lg superfamilien med fem C-lignende domener (Dustin, M.L. et al., Immunol. Today, 9:213-215 (1988); Staunton, D.E. et al., Cell, 52:925-933 (1988); Simmons, D. et al., Nature, 331:624-627 (1988)) . ICAM-1 er høygradig induserbar med cytokiner deriblant IFN--y, TNF og IL-1 på et vidt spekter av celletyper (Dustin, M.L. et al., Immunol Today, 9:213-215 (1988)). Induksjon av ICAM-1 på epitelceller, endotelialceller og fibroblaster formidler LFA-l-avhengig adhesjon til lymfocytter (Dustin, M.L. et al., J. Immunol., 137:245-254 (1986); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol., 107:321-331 (1988); Dustin, M.L. et al., J. Exp. Med., 167:1323.1340 (1988)). Adhesjon blir blokkert ved forbehandling av lymfocytter med LFA-1 MAb eller forbehandling av andre celler med ICAM-1 MAb (Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol., 107:321-331 (1988); Dustin, M.L. et al., J. Exp. Med., 167:1323-1340 (1988). Identiske resultater med renset ICAM-1 i kunstige membraner eller på petriskåler demonstrerer at LFA-1 og ICAM-1 er reseptorer for hverandre (Marlin, S.D. et al., Cell, 51:813-819 (1987); Makgoba, M.W. et al., Nature, 331:86-88 (1988)). For klarhets skyld blir de herved referert til henholdsvis som "reseptor" og "ligand". Videre beskrivel-ser av ICAM-1 er gitt i US-patentsøknad serie nr. 07/045 963, 07/115 798; 07/155 943; 07/189 815 eller 07/250 446, alle disse søknadene er heri innkorporert i deres helhet ved referanse.

II. ICAM- 2

En annen LFA-l-ligand, forskjellig fra ICAM-1, er blitt postulert (Rothlein, R. et al., J. Immunol., 137:1270-1274

(1986); Makgoba, M.W. et al., Eur. J. Immunol., 18:637-640

(1988); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol., 107:321-331

(1988). Den foreliggende oppfinnelse dreier seg om denne annen ligand, betegnet "ICAM-2" (for "intracellulær adhesjonsmolekyl - 2") .

ICAM-2 er forskjellig fra ICAM-1 i celledistribusjon og 1 mangel på cytokininduksjon. ICAM-2 er et integrert membran-protein med 2 Ig-lignende domener, mens ICAM-1 har 5 Ig-lignende domener (Staunton, D.E. et al., Cell, 52:925-933

(1988); Simmons, D. et al., Nature, 331:624-627 (1988)). ICAM-2 er bemerkelsesverdig mer nært relatert til de to mest N-terminale domener av ICAM-1 (34% identitet) enn både ICAM-1 eller ICAM-2 er til andre medlemmer av lg superfamilien, og demonstrerer derved en subfamilie av Ig-lignende ligander som binder den samme integrin familiereseptoren.

III. cDNA- kloning av ICAM- 2

Enhver av de forskjellige fremgangsmåter kan benyttes til å klone ICAM-2-genet. Én slik fremgangsmåte omfatter analyse av et shuttle-vektorbibliotek av cDNA-innskudd (som stammer fra en ICAM-2 uttrykkende celle) for nærværet av et innskudd som inneholder ICAM-2-genet. En slik analyse kan gjennomføres ved å transfektere celler med vektoren og så måle ICAM-2-produksjon.

ICAM-2 cDNA identifiseres fortrinnsvis når en ny modifikasjon av fremgangsmåten til Aruffo og Seed (Seed, B. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:3365-3369 (1987)) benyttes for å identifisere ligander til adhesjonsmolekyler. I denne metode blir et cDNA-bibliotek utviklet fra celler som produserer ICAM-2 (slik som endotelceller eller Ramos, BBN B lymfbblastoid, U937 monocytt, eller SKW3 lymfoblastoid, cellelinjer). cDNA-biblioteket blir fortrinnsvis fremstilt fra endotelceller. Dette bibliotek blir benyttet til å transfektere celler som ikke normalt uttrykker ICAM-2 (slik som COS-celler). De transfekterte cellene blir overført til en petriskål som er blitt på forhånd dekket med LFA-1. COS-celler som er blitt transfektert med enten ICAM-1- eller ICAM-2-kodende sekvenser, og som produserer én av disse ligander på deres celleoverflate vil adherere til LFA-1 på overflaten av petriskålen. Ikke-adherente celler blir vasket vekk, og de adherente cellene blir så fjernet fra petriskålen og dyrket. Det rekombinante ICAM-1- eller ICAM-2-DNA som produserer sekvenser i disse celler, blir så fjernet og sekvensert for å bestemme om det koder for ICAM-1 eller ICAM-2.

I en foretrukket utførelsesform av den ovenfor beskrevne metode blir anti-ICAM-1 antistoff tilsatt petriskålen for å hindre adherering av ICAM-1-produserende celler. Binding av ICAM-2-transfekterte COS-celler til LFA-1 blir hemmet med EDTA og anti-LFA-1 monoklonalt antistoff ("MAb"), men blir ikke hemmet ved anti-ICAM-1-MAb. Således er i denne utførelsesform de ICAM-l-produserende celler ikke istand til å hefte til petriskålen gjennom ICAM-1 og blir derfor for det meste vasket vekk sammen med alle de andre ikke-adherente celler. Som et resultat er bare de celler som uttrykker ICAM-2 istand til å adherere til petriskålen.

Således blir cDNA-klonene undersøkt ved hjelp av ekspresjon i COS-celler, og ved utsåing for ligandbærende COS-celler ved bruk av funksjonelt aktivt renset LFA-1 som tidligere er blitt bundet til plastikk petriskåler. Etter utsåing blir ikke-adherente celler fjernet fra ICAM-2<+->celler, mens adherente celler frigjort fra LFA-l-dekket plastikk ved EDTA er nesten fullstendig ICAM-2<+>. Adherering av ICAM-l<+->celler til LFA-l-dekket plastikk kan bli hemmet med RR1/1 antistoff-ICAM-1 MAb.

Således blir, ifølge denne metode for kloning av cDNA for ICAM-2, et cDNA-bibliotek utviklet fra endotelceller som demonstrerer både ICAM-l-avhengige og ICAM-2-uavhengige komponenter i LFA-l-avhengig adhesjon (Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol., 197:321-331 (1988)) ved bruk av et passende plasmid, såsom plasmidvektor CDM8. Transfekterte COS-celler blir inkubert i LFA-l-dekkete petriskåler med anti-ICAM-1 MAb som er tilstede for å redusere sannsynligheten når det gjelder å isolere ICAM-1 cDNA. Heftende celler blir eluert med EDTA og plasmider blir isolert og amplifisert (forsterket) i E. coli. Etter omtrent tre cykler av transfeksjon, adheranse, og plasmidisolering og en størrelsesfraksjonering kan plasmidene analyseres ved restriksjonsendonukleasekløyving. Omtrent 1/3 av plasmidene som har innskudd større enn 1 kb når de er innsatt i COS-celler ved transfeksjon, ga hefting til LFA-1.

Alternativt kan et cDNA-klon for ICAM-2 oppnås ved bruk av den genetiske kode (Watson, J.D., i: Molecular Biology of the Gene, 3. utg., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), s. 356-357) for å bestemme sekvensen til et polynukleotid som er istand til å kode for ICAM-2-proteinet.

Et klon av ICAM-2 cDNA kan også oppnås ved å identifisere aminosyresekvensene til peptidfragmenter i ICAM-2-proteinet og så bruke den genetiske kode for å konstruere nukleotidprobemolekyler som er istand til å kode for ICAM-2-peptidet. Proben blir så brukt for å oppdage (via hybridisering) de medlemmene av et cDNA-bibliotek (laget fra cDNA av ICAM-2-produserende celler) som koder for ICAM-2-proteinet.

Teknikker slik som, eller liknende til, de beskrevet ovenfor er blitt benyttet på en vellykket måte for kloning av gener for humane aldehyddehydrogenaser (Hsu, L.C. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:3771-3775 (1985)), fibronektin (Suzuki, S. et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J., 4:2519-2524

(1985)), den humane østrogenreseptor (Walter, P. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:7889-7893 (1985)), vevstypeplas-minogenaktivator (Pennica, D. et al., Nature, 301:214-221

(1983)) og human benevnt plasental alkalisk fosfatase-komplementært DNA (Kam, W. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:8715-8719 (1985)). I ennå en annen alternativ vei for å klone ICAM-2-genet blir et bibliotek ekspresjonsvektorer laget ved kloning av DNA, eller heller cDNA, fra en celle som er istand til å produsere ICAM-2 i en ekspresjonsvektor. Biblioteket blir så screenet (undersøkt) for medlemmer som er istand til å produsere et protein som binder til ICAM-2 antistoff og som har en nukleotidsekvens som er istand til å kode for polypeptider som har den samme aminosyresekvensen som ICAM-2 eller fragmenter av ICAM-2. Det klonede ICAM-2-genet oppnådd ved bruk av enhver av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, kan operativt bindes til en ekspresjonsvektor og introduseres i bakterie- eller eukaryote celler for å produsere ICAM-2-protein. Teknikker for slike manipuleringer er beskrevet av Maniatis, T. et al., supra, og er vel kjent på området. IV. Forbindelser i den foreliggende oppfinnelse: ICAM- 2 og dens funksjonelle derivater, agonister og antagonister Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremstilling av ICAM-2 og dens funksjonelle derivater.

A. Funksjonelle derivater av ICAM- 2

Et "funksjonelt derivat" av ICAM-2 er en forbindelse som har en biologisk aktivitet (enten funksjonell eller strukturell) som er vesentlig lik med en biologisk aktivitet til ICAM-2. Betegnelsen "funksjonelle derivater" er ment å inkludere "fragmenter", "varianter", "analoger" eller "kjemiske derivater" av et molekyl.

Et "fragment" av et molekyl, slik som ICAM-2 er ment å referere til enhver polypeptid undergruppe av molekylet. Fragmenter av ICAM-2 som har ICAM-2-aktivitet og som er løselige, (ikke membranbundet) blir spesielt foretrukket.

En variant av et molekyl slik som ICAM-2 er ment å referere til et molekyl som er vesentlig lik i struktur og funksjon til enten det hele molekyl eller til et fragment av dette.

En "analog" av et molekyl slik som ICAM-2 er ment å referere til et molekyl som er vesentlig lik i funksjon til enten det hele molekylet eller til et fragment av dette.

Et molekyl er nevnt å være "vesentlig likt" til et annet molekyl hvis begge molekylene har vesentlig like strukturer eller hvis begge molekyler har en lik biologisk aktivitet. Således, forutsatt at to molekyler innehar en lik aktivitet, er de betraktet å være varianter slik den betegnelse er brukt her, selvom strukturen av én av molekylene ikke er funnet i den andre, eller hvis sekvensen av aminosyrerester ikke er identisk.

Som benyttet her, kalles et molekyl "et kjemisk derivat" av et annet molekyl når det inneholder tillegg kjemiske deler som normalt ikke er en del av molekylet. Slike deler kan forbedre molekylets løselighet, absorpsjon, biologisk halveringstid osv. Delene kan alternativt redusere toksisiteten til molekylet, eliminere eller svekke enhver uønskete sidevirkning til molekylet, osv. Delene som er istand til å formidle slike effekter beskrives i Remington's Pharmaceutical Sciences

(1980).

"Toksinderivatiserte" molekyler består av en spesiell klasse av kjemiske derivater. Et "toksinderivatisert" molekyl er et molekyl (slik som ICAM-2 eller et antistoff) som inneholder en toksindel. Bindingen av et slikt molekyl til en celle bringer toksindelen i sterk nærhet med cellen og derved fremmer celledød. Enhver passende toksindel blir benyttet, imidlertid er det å foretrekke å benytte toksiner som f.eks. ricintoksinet, koleratoksinet, difteritoksinet, radioisotop-toksiner, membran-kanal-dannende toksiner osv. Fremgangsmåte for å koble slike deler til et molekyl er vel kjent i feltet.

Funksjonelle derivater av ICAM-2 som har opptil 100 rester kan fremstilles ved in vitro syntese. Hvis ønskelig, kan slike fragmenter modifiseres ved å reagere de riktige aminosyrerester i det rensete eller urensete protein med en organisk derivatiserende forbindelse som er istand til å reagere med selekterte sidekjeder eller enderester. De resulterende kovalente derivater kan benyttes til å identifisere rester som er viktige for biologisk aktivitet.

Cysteinylrester omsettes særlig med a-haloacetater (og korresponderende aminer), slik som kloreddiksyre eller klor-eddiksyreamid, til å gi karboksylmetyl- eller karboksyamido-metylderivater. Cysteinylrester blir også derivatisert gjennom reaksjon med bromtrifluoraceton, a-brom-)3-(5-imidozoyl)-propionsyre, kloracetylfosfat, N-alkylmaleimid, 3-nitro-2-pyridyldisulfid, metyl-2-pyridyldisulfid, p-klormerkuri-benzoat, 2-klormerkuri-4-nitrofenol eller klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.

Histidylrester derivatiseres ved reaksjon med dietyl-prokarbonat ved pH 5,5-7,0 fordi denne forbindelse er relativt spesifikk for histidyl-sidekjeden. Para-bromfenacylbromid er også brukbar; reaksjonen blir fortrinnsvis utført i 0,1 M natriumkakodylat ved pH 6,0.

Lysinyl og aminoterminale rester blir reagert med rav syreanhydrid eller andre karboksylsyreanhydrider. Derivatisering med disse forbindelser har den virkning at det reverserer ladningen på lysinylrestene. Andre passende forbindelser for å derivatisere a-amino-inneholdende rester inkluderer imidoestere slik som metylpikolinimidat; pyri-doksalfosfat; pyridoksal; klorborhydrid; trinitrobenzen-sulfonsyre; O-metylissurea; 2,4-pentandion og transaminase-katalysert reaksjon med glyoksylat.

Arginylrester blir modifisert gjennom reaksjon med én eller flere konvensjonelle reagenser, blant dem fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-cykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av argininrester krever at reaksjonen blir utført i alkaliske betingelser på grunn av den høye pKa til den guanidin-funksjonelle gruppen. Videre kan disse forbindelser bli reagert med gruppene til lysin såvel som arginin-epsilon-aminogruppen.

Den spesifikke modifisering av tyrosylrester per se er blitt studert på en omfattende måte, med særlig interesse i å introdusere spektralmarkører i tyrosylrestene ved å reagere med aromatiske diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Mest vanlig blir N-acetylimidizol og tetranitrometan benyttet til å danne henholdsvis O-acetyltyrosylforbindelser og 3-nitroderivater. Tyrosylrester blir jodert ved bruk av <1>25I eller 13<1>I for å lage merkete proteiner til bruk i radio-immunmålinger, kloramin-T-metoden er hensiktsmessig.

Karboksyl-sidegrupper (aspartyl eller glutamyl) blir selektivt modifisert ved reaksjon med karbodiimider (R'-N-C-N-R') slik som l-cykloheksyl-3-(2-morfolinyl-(4-etyl)karbodiimid eller l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre blir aspartyl- og glutamylrester konvertert til asparaginyl-og glutaminylrester gjennom reaksjon med ammoniumioner.

Derivatisering med bifunksjonelle forbindelser er egnet for å kryssbinde en ICAM-2-funksjonell derivatmolekyl til en vannuløselig bærer eller overflate for bruk i metoden for å kløyve et ICAM-2-funksjonelt derivatfusjonspolypeptid for å frigjøre og gjenvinne det flyvede polypeptid. Vanlig benyttede kryssbindingsubstanser inkluderer f.eks. 1,1-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, N-hydroksy-succinimidestere, f.eks. estere med 4-azidosalicylsyre, homobifunksjonelle imidoestere, inkludert disuccinimidylestere slik som 3,3'-ditiobis(succinimidylpropionat) og bifunksjonelle maleimider slik som bis-N-maleimido-1,8-oktan. Derivatiserende forbindelser, slik som metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]-propioimidat gir fotoaktiverbare mellomprodukter som er istand til å danne kryssbindinger i nærvær av lys. Alternativt blir reaktive vannuløselige bærere, slik som cyanogenbromid-aktiverte karbohydrater og de reaktive substrater beskrevet i US-patent nr. 3 969 287: 3 691 016; 4 195 128: 4 247 642; 4 229 537 og 4 330 440, benyttet for proteinmobilisering.

Glutaminyl- og asparaginylrester blir ofte deamidert til de korresponderende glutamyl- og aspartylrester. Alternativt blir disse rester deamidert under mildt sure betingelser.

Andre modifikasjoner inkluderer hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksygrupper av seryl og threonyl-rester, metylering av a-aminogruppene til lysin, arginin og histidin sidekjeder (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, s. 79-86 (1983)), acetylering av det N-terminale amin, og, i visse tilfeller, amidering av C-terminale karboksylgrupper.

Funksjonelle derivater av ICAM-2 som har forandret amino-syresekvenser, kan også utvikles ved mutering i DNA. Nukleo-tidsekvensen som koder for ICAM-2-genet, er vist i fig. 2. Slike varianter inkluderer f.eks. delesjoner fra, eller innskudd eller substitusjoner i restene innenfor aminosyresekvensen som vist i fig. 2. Enhver kombinasjon av delesjon, innskudd og substitusjon kan også utføres for å nå den endelige konstruksjon, forutsatt at den endelige konstruksjon innehar den ønskete aktiviteten. Det er selvfølgelig at mutasjonene som vil bli gjort i DNA som koder for varianten, ikke må bringe sekvensen utenfor leserammen, og vil fortrinnsvis ikke forårsake komplementære regioner som kunne produsere sekundær mRNA-struktur (se EP Patent Application Publication nr. 75 444).

På det genetiske nivå blir disse funksjonelle derivatene vanligvis laget ved sete-rettet mutagenese av nukleotidene i DNA som koder for ICAM-2-molekylet, derved produseres DNA som koder for det funksjonelle derivat, og deretter uttrykker DNA i rekombinant cellekultur. De funksjonelle derivatene viser typisk den samme kvalitative biologiske aktivitet som den naturlig forekommende analog. De kan imidlertid variere betraktelig i slike egenskaper med hensyn til det normalt produserte ICAM-2-molekylet.

Mens setet for å introdusere en aminosyresekvensvariasjon er forhåndsbestemt, behøver mutasjon per se ikke være forhåndsbestemt. F.eks. for å optimalisere utførelsen av en mutasjon på et gitt sted, kan tilfeldig mutagenese bli utført i målkodon eller regionen og det uttrykte ICAM-2-funksjonelle derivatet undersøkt for den optimale kombinasjon med hensyn til ønsket aktivitet. Teknikker for å gjøre substitusjons-mutasjoner på forhåndsbestemte seter i DNA som har en kjent sekvens er vel kjente, f.eks. setespesifikk mutagenese.

Utvikling av et ICAM-2-funksjonelt derivatmolekyl blir fortrinnsvis oppnådd ved sete-spesifikk mutagenese av DNA som koder for et tidligere utviklet derivat, eller en ikke-variabel variasjon av proteinet. Sete-spesifikk mutagenese tillater produksjon av ICAM-2-funksjonelle derivater ved bruk av spesifikke oligonukleotidsekvenser som koder for DNA-sekvensen i den ønskete mutasjon, såvel som et tilstrekkelig antall tilstøtende nukleotider, for å gi en primersekvens av tilstrekkelig størrelse og sekvenskompleksitet til å danne en stabil dupleks på begge sider av delesjonsovergangen som blir traversert. Typisk blir en primer på omkring 20-25 nukleotider i lengde foretrukket, med omkring 5-10 rester på begge sider av overgangen til den sekvens som blir forandret. Generelt er teknikken av sete-spesifikk mutagenese vel kjent på området, som eksemplifisert ved publikasjoner som Adelman et al., DNA, 2:183 (1983).

Det vil være klart at den sete-spesifikke mutageneseteknikk typisk benytter en fagvektor som eksisterer i både en enkelttrådet og dobbelttrådet form. Typiske vektorer brukbare i sete-rettet mutagenese inkluderer vektorer som M13-fagen, f.eks. som beskrevet av Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, utg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Disse fagene er greit kommersielt tilgjengelig, og deres bruk er generelt vel kjent til de som er dyktige i feltet. Alternativt kan plasmid-vektorer som inneholder en enkelttrådet fag origo for replikasjon (Veira et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)) bli benyttet for å oppnå enkelttrådet DNA.

Generelt blir sete-rettet mutagenese ifølge dette utført ved først å oppnå en enkelttrådet vektor som inkluderer innenfor en sekvens en DNA-sekvens som koder for det relevante protein. En oligonukleotid primer som har den ønskete muterte sekvens blir laget, vanligvis syntetisk, f.eks. ved metoden til Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:5765 (1978). Denne primer blir så bundet til den enkelttrådete protein-sekvensinneholdende vektor, og behandlet med DNA-polymer-iserende enzymer, slik som E. coli polymerase I Klenow-fragment, til å komplettere syntesen av den mutasjonsbærende tråd. Således bærer en mutert sekvens og den andre tråd den ønskete mutasjon. Denne heterodupleks vektor blir så brukt til å transformere passende celler, slik som MJlOl-celler, og kloner blir selektert som inkluderer rekombinante vektorer som bærer det muterte sekvensarrangement.

Etter at en slik klon er selektert, kan den muterte proteinregion fjernes og plasseres i en passende vektor for proteinproduksjon, generelt en ekspresjonsvektor av den type som kan bli benyttet for transformasjon av en passende vert.

Aminosyresekvensdelesjoner varierer generelt fra omkring 1-30 rester, fortrinnsvis 1-10 rester, og er typisk sammen-hengende. Delesjoner kan også omfatte en immunglobulindomene, slik som domene 1 eller 2 i ICAM-2. Aminosyresekvens-insersjoner inkluderer amino- og/eller karboksylterminale fusjoner av fra én rest til polypeptider av i hovedsak ubegrensete lengder, såvel som intrasekvensinsersjoner av enkelte eller multiple aminosyrerester. Intrasekvensinnskudd (dvs. innskudd med den komplette ICAM-2-molekylsekvensen) kan omfatte generelt fra omtrent 1 til 10 rester, fortrinnsvis 1-5. Et eksempel på et terminalt innskudd inkluderer en fusjon av en signalsekvens, være seg heterolog eller homolog til vertscellen, til den N-terminale del av molekylet for å underlette sekresjonen av det ICAM-2-funksjonelle derivat fra rekombinante verter.

Den tredje gruppe av funksjonelle derivater er de der minst én aminosyrerest i ICAM-2-molekylet, og fortrinnsvis bare én, er blitt fjernet og en forskjellig rest innsatt i dens plass. Slike substitusjoner blir fortrinnsvis gjort ifølge den etterfølgende tabell når det er ønskelig å finmodulere egenskapene til ICAM-2-molekylet.

identitet ble gjort ved å selektere substitusjoner som er mindre konservative enn de i tabell 1, dvs. å selektere rester som varierer mer signifikant i deres effekt på å opprettholde (a) strukturen til polypeptidryggraden i området for substitusjonen, f.eks. som en flat eller heliks-lignende konforma-sjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet på målsetet, eller (c) massen av sidekjeden. Substitusjonene som generelt er ventet, er de der (a) glycin og/eller prolin er substituert ved en annen aminosyre eller er deletert eller innsatt; (b) et hydrofilt residue, f.eks. seryl eller threonyl, er substituert for (eller ved) en hydrofob rest, f.eks. leucyl, isoleucyl, fenylalanyl, valyl eller alanyl; (c) en cysteinrest er substituert for (eller ved) enhver annen rest; (d) en rest som har en elektropositiv sidekjede, f.eks. lysyl, arginyl eller histidyl, er substituert for (eller ved) en rest som har en elektronegativ ladning, f.eks. glutamyl eller aspartyl; eller (e) en rest som har en massiv sidekjede, f.eks. fenylalanin, er substituert for (eller ved) én som ikke har slik sidekjede, f.eks. glycin.

De fleste delesjoner og innskudd, og substitusjoner særlig, er ikke ventet å gi radikale forandringer i egenskapene til ICAM-2-molekylet. Imidlertid, når det er vanskelig å forutsi den eksakte effekt av substitusjonen, delesjonen eller innskuddet på forhånd til utførelsen, vil en erfaren i feltet forstå at effekten vil bli evaluert ved rutinemålemetoder. F.eks., et funksjonelt derivat blir typisk laget ved sete-spesifikk mutagenese av den opprinnelige ICAM-2-molekylkodende nukleinsyre, ekspresjon av den bestemte nukleinsyre i rekombinant cellekultur, og etter valg, rensning fra andre cellekulturer, f.eks. ved immunaffinitetsadsorpsjon på en anti-lCAM-2-molekyl antistoffsøyle (for å absorbere det funksjonelle derivat ved å binde det til minst én gjenværende immunepitol).

Mutasjoner gjort for å øke affiniteten til ICAM-2 kan ledes ved introduksjon av aminosyrerester som er tilstede i homologe posisjoner i ICAM-1. På lignende måte kan slike mutante ICAM-2-molekyler bli laget som mangler N-bundet CHO på

homologe posisjoner i ICAM-1.

Aktiviteten til cellelysatet eller renset ICAM-1-molekyl-funksjonelt derivat blir så undersøkt i en passende screening-assay etter den ønskete egenskap. F.eks. en forandring i den immunologiske egenskap til den funksjonelle derivat, slik som affinitet for et gitt antistoff, blir målt ved en kompetitiv type immunoassay. Forandringer i immunmoduleringaktivitet blir målt ved den passende metode. Modifikasjoner av slike protein-egenskaper som redox eller termisk stabilitet, biologisk halveringstid, hydrofobisitet, følsomhet i proteolytisk degradering eller tendensen til å agregere med bærere eller til multimere blir målt ved metoder vel kjent for en fagmann på området.

B. Aqonister og antagonister av ICAM- 2

En "agonist" av ICAM-2 er en forbindelse som forsterker eller øker egenskapen til ICAM-2 å utføre enhver av dets biologiske funksjoner. Et eksempel på en slik agonist er en forbindelse som øker ICAM-2' s evne til å binde til en cellulær reseptor eller viralt protein.

En "antagonist" til ICAM-2 er en forbindelse som reduserer eller hindrer egenskapen til ICAM-2 å utføre noen av dens biologiske funksjoner. Eksempler på slike antagonister inkluderer ICAM-1, funksjonelle derivater av ICAM-1, anti-ICAM-2-antistoff, anti-LFA-l-antistoff osv.

Den cellulære aggregasjonsmålemetode beskrevet i US-patentapplikasjon serienr. 07/045 963; 07/115 798; 07/155 943; 07/189 815 eller 07/250 446, alle disse søknader har herved blitt innkorporert ved referanse i deres fullstendige form, er istand til å måle LFA-l-avhengig aggregering og kan benyttes til å identifisere forbindelser som affiserer omfanget av ICAM-2/LFA-l-aggregering. Således kan slike målemetoder bli benyttet til å identifisere agonister og antagonister til ICAM-2. Antagonister kan virke ved å hindre egenskapet til LFA-1 eller til ICAM-2 når det gjelder å formidle aggregering. I tillegg kan ikke-immunglobulin (f.eks. kjemiske) forbindelser bli undersøkt ved bruk av den ovenfor beskrevne målemetode, til å bestemme hvorvidt de er .agonister eller antagonister til ICAM-2/LFA-l-aggregering.

C. Anti- ICAM- 2- antistoff

Den foretrukne immunglobulinantagonist er et antistoff til ICAM-2. Passende antistoffer kan oppnås på en rekke forskjellige måter.

Et antigent molekyl, slik som ICAM-2, er naturlig uttrykt på overflatene til lymfocyttene. Således vil innføring av slike celler i et passende dyr, som ved intraperitoneal injeksjon, resultere i produksjon av antistoffer som er istand til å binde ICAM-2 eller medlemmer av CD-18-familien av molekyler. Hvis ønskelig kan serum til et slikt dyr bli fjernet og benyttet som en kilde til polyklonale antistoffer som er istand til å binde disse molekylene.

Alternativt kan anti-ICAM-2-antistoffet bli produsert ved tilpasning av metoden til Seldon, R.F., (europeisk patent-søknad publikasjon nr. 289 034) eller Seldon, R.F. et al., (Science, 236:714-718 (1987)). Ifølge med en slik tilpasning av denne metoden blir cellene til et passende dyr (slik som f.eks. en mus osv.) transfektert med en vektor som er istand til å uttrykke enten det intakte ICAM-2-molekylet eller et fragment av ICAM-2. Produksjonen av ICAM-2 i de transfekterte celler til dyret vil utløse en immunrespons i dyret og leder til produksjon av anti-ICAM-2-antistoffer i dyret.

Alternativt kan ICAM-2-antistoffer bli laget ved å innføre ICAM-2 eller peptidfragmenter av dette inn i et passende dyr. Det immuniserte dyret vil produsere polyklonalt antistoff i respons til slik eksponering. Bruk av peptidfragmenter til ICAM-2 tillater en å oppnå regionspesifikke antistoffer som er reaktive bare mot epitop(er) som er inneholdt i peptid-fragmentene benyttet til å immunisere dyrene.

Det er imidlertid å foretrekke å fjerne miltcellene fra dyrene (immunisert i en av de måter som er beskrevet ovenfor) for å fusjonere slike miltceller med en myelom cellelinje og å tillate slike fusjonsceller å danne en hybridomcelle som utskiller monoklonale antistoffer som er istand til å binde

ICAM-2.

Hybridomcellene oppnådd på den måten som er beskrevet ovenfor, kan bli screenet ved en rekke metoder for å identifisere de ønskete hybridomceller som utskiller antistoff som er istand til å binde ICAM-2. I en foretrukket undersøkelses-metode blir slike molekyler identifisert ved deres evne til å hemme aggregeringen av ICAM-2-produserende, ICAM-1 ikke-produserende celler. Antistoffer som er istand til å hemme slik aggregering blir så videre undersøkt for å bestemme hvorvidt de hemmer slik aggregering ved å binde til ICAM-2 eller til et medlem av CD-18-familien av molekyler. Ethvert middel som er istand til å skille ICAM-2 fra CD-18-familien av molekyler kan bli benyttet i en slik undersøkelse. Slik kan f.eks. antigenet bundet av antistoffet bli analysert ved immunopresipitasjon og polyakrylamidgelelektroforese. Det er mulig å skille mellom de antistoffer som binder til medlemmer av CD-18-familien av molekyler fra de som binder ICAM-2 ved å undersøke for egenskapet til antistoffet, å binde til celler som uttrykker LFA-1, men ikke ICAM-2 (eller vice versa). Egenskapen til et antistoff å binde til en celle som uttrykker LFA-1, men ikke ICAM-2, kan bli oppdaget ved hjelp av vanlige fremgangsmåter som er benyttet av de med ordinær dyktighet. Slike fremgangsmåter inkluderer immunoassays (spesielt de som benytter immunofluorescens), cellulær agglutinasjon, filter-bindingsstudier, antistoffpresipitering osv.

I tillegg til de ovenfor beskrevne funksjonelle derivater av ICAM-2, kan andre forbindelser som kan bli benyttet ifølge den foreliggende oppfinnelse i behandlingen av virale infeksjoner eller betennelser inkludere antistoff til ICAM-2, anti-idiotypiske antistoffer til anti-ICAM-2-antistoffer og reseptormolekyler eller fragmenter av slike molekyler, som er istand til å binde ICAM-2.

Antistoffene til ICAM-2 (eller funksjonelle derivater til ICAM-2) som kan bli benyttet, kan være enten polyklonale eller monoklonale.

De anti-idiotypiske antistoffer av interesse for den foreliggende oppfinnelse er istand til å binde i konkurranse med (eller med eksklusjon av) ICAM-2. Slike antistoffer kan bli oppnådd f.eks. ved å utvikle antistoff til et anti-ICAM-2-antistoff, og så screene antistoffet for evnen til å binde en naturlig bindingsligand til ICAM-2.

Siden molekylene av CD-18-familien er istand til å binde ICAM-2, er tilførsel av slike molekyler (f.eks. som heterodimere som har både alfa og beta subenheter, eller som molekyler bestående av bare én alfa eller én beta subenhet, eller som molekyler som har fragmenter av den ene eller begge subenheter) istand til å konkurrere med (eller ekskludere) HRV for binding til ICAM-21 tilstede på celler.

De anti-aggregerende antistoffer i den foreliggende oppfinnelse kan bli identifisert og titrert på en rekke forskjellige måter. F.eks. kan man måle antistoffenes evne til å binde til celler som uttrykker ICAM-2 (slik som aktiverte endotelceller) på forskjellig måte, og deres manglende evne til å binde til celler som ikke uttrykker ICAM-2. Passende målemetoder for cellulær aggregering er beskrevet i US-patent-søknad serienr. 07/045 963; 07/115 798; 07/155 943; 07/189 815 eller 07/250 446. Alternativt kan antistoffenes evne til å binde til ICAM-2 eller til peptidfragmenter i ICAM-2 måles. Som det er åpenbart for fagmannen, kan de ovenfor nevnte målemetoder modifiseres eller utføres i en forskjellig rekkefølge til å gi en rekke av potensielle screeningmetoder, som hver er istand til å identifisere og skille mellom antistoffer som er istand til å binde ICAM-1 til medlemmer av CD-18-familien av molekyler.

I en mer foretrukket fremgangsmåte kan antistoff selekteres etter dets evne til å binde til COS-celler som uttrykker ICAM-2, men ikke til COS-celler som ikke uttrykker ICAM-2.

D. Produksjon ifølge den foreliggende oppfinnelse av forbindelsene

Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelse kan bli oppnådd ved naturlige prosesser (slik som f.eks. ved å indusere dyr, planter, sopp, bakterier osv. til å produsere en ikke-immunglobulinantagonist av ICAM-2, eller ved å indusere et dyr til å produsere polyklonale antistoffer som er istand til å binde ICAM-2); ved syntetiske fremgangsmåter (slik som f.eks. ved å bruke Merrifield-metoden for syntetiske polypeptider til å syntetisere ICAM-2, funksjonelle derivater av ICAM-2, eller proteinantagonister av ICAM-2 (enten immunglobulin eller ikke-immunglobulin)); ved hybridomteknologi (slik som f.eks. til å produsere monoklonale antistoffer som er istand til å binde ICAM-2); eller ved rekombinant teknologi (slik som f.eks. til å produsere forbindelser i den foreliggende oppfinnelse i forskjellige vertsceller (f.eks. gjær, bakterier, fungi, dyrkete pattedyrceller osv.), eller fra rekombinante plasmider eller virale vektorer). Valget av metoden som skal benyttes vil avhenge av faktorer slik som praktisk letthet, ønsket utbytte osv. Det er ikke nødvendig å benytte bare én av de ovenfor beskrevne metoder, prosedyrer eller teknologier til å produsere en spesiell anti-inflammatorisk forbindelse; de ovenfor beskrevne prosedyrer, metoder og teknologier kan bli kombinert for å oppnå en spesiell forbindelse.

V. BRUKSOMRÅDER FOR ICAM- 2 OG DETS FUNKSJONELLE

DERIVATER. AGONISTER OG ANTAGONISTER

A. Undertrykkelse av betennelse

Ett aspekt stammer fra evnen til ICAM-2 og dets funksjonelle derivater til å reagere med reseptorer av CD-18-familien av molekyler, spesielt LFA-1 eller med virale proteiner (slik som proteinene til rhinovirus etc). Ved hjelp av ICAM-2's evne når det gjelder å reagere med medlemmer av CD-18-familien til glykoproteiner, kan den benyttes til å undertrykke (f.eks. å forhindre eller svekke) betennelse (inflammasjon).

Betegnelsen "inflammasjon" benyttet her er ment å inkludere både reaksjonene til det spesifikke forsvarssystem og reaksjonene til det ikke-spesifikke forsvarssystem.

Her blir betegnelsen "spesifikt forsvarssystem" ment å referere til den komponent av immunsystemet som reagerer med eksisterende spesifikke antigener. Betennelse resulterer fra en respons fra det spesifikke forsvarssystem hvis betennelsen er forårsaket av, formidlet ved eller assosiert med en reaksjon fra det spesifikke forsvarssystem. Eksempler på betennelse som resulterer fra en respons av det spesifikke forsvarssystem inkluderer responsen mot antigener slik som rebella-virus, autoimmunsykdommer, forsinket type hyper-sensitivitetsrespons formidlet av T-celler (som sett f.eks. i individer som gir "positiv" test i Mantaux-prøven) etc. Kroniske inflammatoriske sykdommer og avvisning av transplantert vev og organer blir videre eksempler på betennelsesreaksjoner i det spesifikke forsvarssystem.

Her er en reaksjon fra det ikke-spesifikke forsvarssystem ment å referere til en reaksjon som er formidlet av leukocytter som ikke er istand til immunologisk hukommelse. Slike celler inkluderer granulocytter og makrofager. Som benyttet herved blir betennelse ansett å resultere fra en respons i det ikke-spesifikke forsvarssystem, hvis betennelsen blir forårsaket av, formidlet ved eller er assosiert med en reaksjon i det ikke-spesifikke forsvarssystem. Eksempler på betennelse som resulterer, i det minste delvis, av en reaksjon i det ikke-spesifikke forsvarssystem, inkluderer betennelse assosiert med tilstander slik som: voksent respiratorisk distress-syndrom (ARDS) eller multiple organskadesyndromer sekundære til septic eller traumer; reperfusjonsskader i myokard eller andre vev; akutt glomerulonefritt; reaktiv artritt; dermatoser med akutte inflammatoriske komponenter; akutt purulent meningitt eller andre sentralnervesysteminflammatoriske sykdommer; termisk skade, hemodialysis; leukaferese; ulcerøs kolitt; Crohns sykdom; nekrotiserende enterokolitt; granulocytt transfusjonsassosierte syndromer og cytokin-indusert toksisitet.

Som diskutert ovenfor, er bindingen av ICAM-2-molekyler til medlemmer av CD-18-familien av molekyler av sentral betydning i cellulær adhesjon. Gjennom adhesjonsprosessen er lymfocytter istand til å overvåke kontinuerlig et dyr etter nærvær av fremmede antigener. Skjønt disse prosesser er normalt ønskelige, er de også årsaken til avvisning av organ-transplantat, vevstransplantatawisning og mange autoimmunsykdommer. Derfor ville enhver forbindelse som er istand til å redusere eller hemme cellulær adhesjon være sterkt ønskelig for mottakere av organtransplantater (særlig nyretransplan-tater), vevstransplantater eller for autoimmunpasienter.

Monoklonale antistoffer mot medlemmer av CD-18-familien hemmer mange adhesjonsavhengige funksjoner i leukocytter, inkludert binding til endotel (Haskard, D. et al., J. Immunol., 137:2901-2906 (1986)), homotypiske adhesjoner (Rothlein R. et al., J. Exp. Med., 163:1132-1149 (1986)), antigen og mitogen indusert proliferasjon av lymfocytter (Davignon, D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:4535-4539

(1981)), antistoffdannelse (Fischer, A. et al., J. Immunol., 136:3198-3203 (1986)) og effektorfunksjoner til alle leukocytter slik som lytisk aktivitet til cytotoksiske T-celler (Krensky, A.M. et al., J. Immunol., 132:2180-2182 (1984)), makrofager (Strassman, G. et al., J. Immunol., 136:4328-4333

(1986)) og alle celler som er involvert i antistoff-avhengige cellulære cytotoksisitetsreaksjoner (Kohl, S. et al., J. Immunol., 133:2972-2978 (1984)). I alle av de ovenfor nevnte funksjoner hemmer antistoffene evnen til leukocytten å adherere til det riktige cellulære substrat og hemmer derved det endelige resultatet. Slike funksjoner, i den utstrekning de involverer ICAM-2/LFA-l-interaksjoner, kan bli undertrykket med anti-ICAM-2-antistoff.

Således kan monoklonale antistoffer som er istand til å binde ICAM-2 bli benyttet som anti-inflammatoriske forbindelser i et pattedyr. Signifikant er det at slike forbindelser adskiller seg fra generelle anti-inflammatoriske forbindelser i det at de er istand til å hemme selektivt adhesjon, og ikke gi andre bivirkninger slik som nefro-toksisitet som foreligger med konvensjonelle substanser.

Siden ICAM-2, særlig i løselig form, er istand til å virke på den samme måte som et antistoff på medlemmer av CD-18-familien, kan det bli benyttet til å undertrykke betennelse. Videre kan de funksjonelle derivater og antagonister av ICAM-2 bli benyttet til å undertrykke betennelse.

1. Suppressorer av forsinket type hvpersensitivitets-reaksioner

ICAM-2-molekyler formidler, delvis, adhesjonsfenomener som er nødvendig for å starte inflammatoriske reaksjoner slik som forsinket hypersensitivitetsreaksjoner. Således har antistoffer (spesielt monoklonale antistoffer) som er istand til å binde ICAM-2-molekyler terapeutisk potensial i svekkelsen eller elimineringen i slike reaksjoner.

Alternativt, siden ICAM-2 er en antagonist til ICAM-l/LFA-1-interaksjonen, kan ICAM-2 (særlig i solubilisert form) eller dets fuksjonelle derivater bli benyttet til å undertrykke forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner.

Disse potensielle terapeutiske bruksområder kan bli utforsket på én av to måter. Først kan en blanding som inneholder et monoklonalt antistoff mot ICAM-2 bli tilført en pasient som lider av forsinket type hypersensitivitets-reaks joner. F.eks. kan slike forbindelser gis til et individ som har vært i kontakt med antigener slik som giftig eføy, giftig ek osv. I den andre utførelsesformen blir det monoklonale antistoff som er istand til å binde ICAM-2 tilført en pasient sammen med et antigen for å forhindre en etter-følgende inflammatorisk reaksjon. Således kan tilleggstilfør-selen av et antigen med en ICAM-2-bindende monoklonalt antistoff temporært gi et individ toleranse ved etterfølgende eksponering av dette antistoff.

2. Terapi av kronisk inflammatorisk sykdom

Siden LAD-pasienter som mangler LFA-1 ikke starter en inflammatorisk respons, antas det at å antagonisere LFA-1's naturlige ligand, ICAM-2, også vil hemme en inflammatorisk respons. Antistoffers mot ICAM-2 evne til å hemme betennelse gir basis for deres terapeutiske anvendelse i behandlingen av kroniske inflammatoriske sykdommer og autoimmunsykdommer, slik som lupus erythematosus, autoimmun thyroiditt, eksperimentell allergisk encephalomyelitt (EAE), multippel sklerose, visse former for diabetes, Reynauds syndrom/ rheumatoid artritt osv. Slike antistoffer kan også bli benyttet som en terapi i behandlingen av psoriasis. Generelt kan monoklonale antistoffer som er istand til å binde ICAM-2 bli benyttet i behandlingen av de sykdommer som for tiden blir behandlet med steroidbehandling.

Slike inf lammatoriske og immunawisningsresponser kan undertrykkes (dvs. enten hindres eller svekkes) ved å gi et individ som trenger slik behandling en mengde med anti-inflammatorisk forbindelse tilstrekkelig til å undertrykke nevnte betennelse. Egnede anti-inflammatoriske forbindelser inkluderer: et antistoff som er istand til å binde ICAM-2; et fragment av et antistoff, hvis fragment er istand til å binde ICAM-2; ICAM-2; et funksjonelt derivat av ICAM-2; en ikke-immunglobulinantagonist av ICAM-2 andre enn ICAM-1 eller en ikke-immunoglobulinantagonist av ICAM-2 andre enn LFA-1. Spesielt foretrukket er anti-inflammatoriske forbindelser bestående av et løselig, funksjonelt derivat av ICAM-2. Slik anti-inflammatorisk behandling kan også inkludere tilleggs-tilførselen av en forbindelse selektert fra gruppen som består av: et antistoff som er istand til å binde LFA-1; et funksjonelt derivat av et antistoff, nevnte funksjonelle derivat som er istand til å binde LFA-1; og en ikke-immunglobulinantagonist av LFA-1.

De ovenfor beskrevne metoder undertrykker en inflammatorisk respons i det spesifikke forsvarssystem, i hvilken en immun-suppressiv forbindelse blir gitt i tillegg til et individ. En slik forbindelse gis fortrinnsvis i en lavere dose (f.eks. en "suboptimal" dose) enn den som ville normalt kreves. Bruken av en suboptimal dose er mulig på grunn av den synergistiske effekt av forbindelsene fremstilt i den foreliggende oppfinnelse. Eksempler på passende immunosuppressive forbindelser inkluderer deksametheson, azathioprin, ICAM-1, cyklosporin A osv.

3. Terapi for ikke- spesifikk betennelse

Den foreliggende oppfinnelse stammer delvis fra oppdagelsen at granulocytt-endotelcelle-adhesjon stammer fra interaksjonen til glykoproteiner i CD-18-familien med endotelet. Siden cellulær adhesjon kreves for at leukocytter kan bevege seg til steder med betennelse og/eller utføre forskjellige effektorfunksjoner som bidrar til betennelse, vil forbindelser som hemmer cellulær adhesjon svekke eller forhindre slik betennelse. Slike inflammatoriske reaksjoner skyldes reaksjoner av det "ikke-spesifikke forsvarssystem" som formidles av leukocytter som ikke er istand til immunologisk hukommelse. Slike celler inkluderer granulocytter og makrofager. Her antas betennelse å stamme fra en respons i det ikke-spesifikke forsvarssystem, hvis betennelsen er forårsaket av, formidlet ved eller forbundet med en reaksjon i det ikke-spesifikke forsvarssystem. Eksempler på betennelser som stammer, i det minste delvis, fra en reaksjon i det ikke-spesifikke forsvarssystem inkluderer betennelse forbundet med tilstander som: voksen respiratorisk distress-syndrom (ARDS) eller multipple organskadesyndromer sekundær fra sepcis eller traume; reperfusjonsskade i myokard eller andre vev; akutt glomerulonefritt; reaktiv artritt; dermatoser med akutte inflammatoriske komponenter; akutt purulent meningitt eller andre sentralnervesysteminflammatoriske sykdommer, termisk skålde; hemodialyse; leukoforese, ulcerativ kolitt, Crohns sykdom; nekrotiserende enterokolitt; granulocytt transfusjonsassosierte syndromer og cytokin-indusert toksisitet.

De anti-inflammatoriske forbindelser i den foreliggende oppfinnelse er forbindelser som er istand til spesifikt å motvirke interaksjonen mellom CD-18-komplekset på granulocytter og endotelcelle. Slike antagonister omfatter: ICAM-2; et funksjonelt derivat av ICAM-2; og en ikke-immunblogisk antagonist av ICAM-2 annet enn ICAM-1, eller et medlem av CD-18-familien av molekyler.

B. Suppressorer av organ og vevsawisninq

Siden ICAM-2, spesielt i løselig form, er istand til å virke på samme måte som et antistoff overfor medlemmer av CD-18-familien, kan det bli benyttet til å undertrykke organ- og vevsawisning forårsaket av enhver av de cellulære adhesjonsavhengige funksjoner. Videre kan også anti-ICAM-2-antistoff og de funksjonelle derivater og antagonister av ICAM-2 bli benyttet til å undertrykke slik forkastelse.

ICAM-2 og antistoffer som er istand til å binde ICAM-2 kan bli benyttet for å forhindre organ- og vevsforkastelse, eller å modifisere auto-immunresponser uten frykten for slike bivirkninger, i pattedyr.

Det er viktig at bruken av monoklonale antistoffer som er istand til å gjenkjenne ICAM-2 kan tillate utførelse av organ-transplantasjon endog mellom individer som har HLA ufor-likelighet. C. Hielpeforbindelse for å introdusere antigent materiale tilført for terapeutiske eller diagnostiske formål Immunresponser til terapeutiske eller diagnostiske forbindelser, slik som f.eks. bovint insulin, interferon, vevstype plasminogenaktivator .eller muse-monoklonale antistoffer reduserer på en vesentlig måte deres terapeutiske eller diagnostiske verdi og kan faktisk forårsake sykdommer, slik som serum-syke. En slik situasjon kan bli forhindret gjennom bruk av antistoffer i den foreliggende oppfinnelse. I denne utførel-sesform vil slike antistoffer bli tilført i kombinasjon med den terapeutiske eller diagnostiske forbindelse. Tillegget av antistoffer forhindrer mottakeren fra å gjenkjenne forbindelsen og derfor hindrer mottakeren fra å starte en immunrespons mot det. Fraværet av slik immunrespons gir som resultat at pasienten kan motta tilleggstilførsler av den terapeutiske eller diagnostiske forbindelse.

ICAM-2 (særlig i løselig form) eller dets funksjonelle derivater kan bli benyttet om hverandre med ICAM-1 eller med antistoffer som er istand til å binde til LFA-1 i behandlingen av sykdom. Således kan slike molekyler i løselig form bli benyttet til å hemme organ- eller transplantatawisning. ICAM-2 eller dens funksjonelle derivater kan bli benyttet på den samme måte som anti-ICAM-2-antistoffer for å redusere immuno-genisiteten til terapeutiske eller diagnostiske forbindelser.

D. Suppressorer av tumormetastase

Forbindelsene fremstilt i den foreliggende oppfinnelse kan også bli benyttet for å undertrykke metastaten til en hemato-poetisk tumorcelle som krever et funksjonelt medlem av CD-18-familien for vandring. Ifølge dette blir en pasient med behov for slik behandling gitt en mengde med en forbindelse (slik som et antistoff istand til å binde ICAM-2; et toksinderivatisert antistoff istand til å binde ICAM-2; et fragment av et antistoff, fragmentet er istand til å binde ICAM-2; et toksinderivatisert fragment av et antistoff, fragmentet er istand til å binde ICAM-2; ICAM-2; et funksjonelt derivat av ICAM-2; og en ikke-immunglobulinantagonist av ICAM-2 annet enn ICAM-1) tilstrekkelig til å undertrykke nevnte metastase.

Oppfinnelsen muliggjør å undertrykke veksten til en ICAM-2-produserende tumorcelle som omfatter, når det blir gitt til en pasient med behov for slik behandling, en mengde av en forbindelse som er tilstrekkelig til å undertrykke nevnte vekst. Passende forbindelser inkluderer et antistoff som er istand til å binde til ICAM-2; et toksinderivatisert antistoff som er istand til å binde ICAM-2; et fragment av et antistoff, fragmentet er istand til å binde ICAM-2; et toksinderivatisert fragment av et antistoff, fragmentet er istand til å binde ICAM-2; ICAM-2; et funksjonelt derivat av ICAM-2; en ikke-immunglobulinantagonist av ICAM-2 annet enn ICAM-1; et toksinderivatisert medlem av CD-18-familien av molekyler; og et toksinderivatisert funksjonelt derivat av et medlem av CD-18-familien av molekyler.

Oppfinnelsen muliggjør å undertrykke veksten av en LFA-1-produserende tumorcelle som omfatter, når det blir gitt til en pasient med behov for slik behandling, en mengde av et toksin som er tilstrekkelig til å undertrykke nevnte vekst. Passende toksiner inkluderer et toksinderivatisert ICAM-2, eller et toksinderivatisert funksjonelt derivat av ICAM-2.

E. Suppressorer av viralinfeksjon

ICAM-1 har nylig blitt vist å bli benyttet som en reseptor av hovedgruppen av rhinovirus (Greve, J.M. et al., Cell, 56:839-847 (1989); Staunton, D.E. et al., Cell, 56:849-853

(1989); Tomassini, J.E. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86:4907-4911 (1989). Rhinovirus, medlemmer av de små, RNA-inneholdende protein-innkapslede picornavirus-familie, forårsaker 40-50% av vanlige forkjølelser (Rueckert, R.R., i: Fields Virology, Fields, B.N. et al., (utg.), Raven Press, NY,

(1985) s. 705-738, Sperber, S.J. et al., Antimicr. Agents Chemo., 32:409-419 (1988). Over 100 immunologisk ikke-kryssreaktive rhinovirus er blitt definert, av hvilke 90% binder ICAM-1.

Foruten ICAM-1 har celleadhesjonsmolekylet CD4 og komple-mentreseptoren CR2 blitt funnet nylig å bli benyttet som henholdsvis virusreseptorer for HIV- og EBV-virus (Maddon, P.J., Cell, 47:333-348 (1986); Fingeroth, J.D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:4510-4514 (1984). Videre er et molekyl med en lg domenstruktur lik ICAM-1 og som kan fungere i cellulær adhesjon en poliovirusreseptor (Mendelsohn, CL. et al., Cell, 56:855-865 (1989)).

ICAM-2 og dets funksjonelle derivater kan virke som reseptorer for viral (særlig av rhinovirus og spesielt rhinovirus av den mindre serotypen) forankring eller infeksjon. Således kan antistoff til ICAM-2 (eller fragmenter av dette), ICAM-2 eller funksjonelle derivater av ICAM-2, bli benyttet til å blokkere slik forankring eller infeksjon og derved undertrykke viral infeksjon.

F. Diagnostiske og prognostiske bruksområder

Monoklonale antistoffer som er istand til å binde ICAM-2 kan bli benyttet som et middel for billeddannelse eller for å visualisere stedene for ICAM-2-ekspresjon og betennelse i en pasient. I slik bruk er de monoklonale antistoffene merket, slik at de kan oppdages, gjennom bruken av radioisotoper, affinitetsmarkører (slik som biotin, avidin osv) fluorescer-ende markører, paramagnetiske atomer, merket anti-ICAM-2-antistoff osv. Fremgangsmåter for å utføre slik merking er vel kjent i feltet. Klinisk applikasjon av antistoffer til diagnostisk billeddannelse er gjennomgått av Grossman, H.B.,

Uroi. Clin. North Amer., 13:465-474 (1986)), Unger, E.C. et

al., Invest. Radiol., 20:693-700 (1985)), og Khaw, B.A. et al., Science, 209:295-297 (1980)).

Tilstedeværelsen av ICAM-2-ekspresjon kan også bli oppdaget ved bruk av bindingsligander, slik som mRNA, cDNA eller DNA

som binder til ICAM-2-gensekvenser, eller til ICAM-2-mRNA-sekvenser, i celler som produserer ICAM-2. Teknikker for å

utføre slike hybridiseringsmetoder er beskrevet av Maniatis,

T. et al., i Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold-

spring Harbor, NY (1982), og av Haymes, B.D. et al., i Nucleic Acid Hybrization, a Practical Approach, IRL Press, Washington,

DC (1985), hvis referanser er herved innkorporert ved

referering.

Oppdagelsen av steder med slike merkete antistoffer som kan detekteres indikerer et sted for ICAM-2-ekspresjon eller tumorutvikling. I én utførelsesform blir denne undersøkelse for ekspresjon gjort ved å fjerne vevsprøver eller blod og inkubering av slike prøver med antistoffer som er eller som kan bli merket, slik at de kan oppdages. I en foretrukket utførelsesform blir denne teknikk utført på en ikke-invasiv måte gjennom bruk av magnetisk billeddannelse, fluorografi osv. Slik diagnostisk test kan bli benyttet i å overvåke organtransplantmottakere for tidlige tegn på potensiell vevsforkastelse. Slike metoder kan også bli utført for å

bestemme et individs risiko for reumatoid artritt eller andre kronisk inflammatoriske sykdommer.

F.eks. er det mulig ved radioaktiv merking av antistoffer eller antistoff-fragmenter å oppdage antigenet ved bruk av radioimmunassay. En god beskrivelse av et radioimmunassay (RIA) kan bli funnet i Laboratory Technigues and Biochemistry in Molecular Biology, av Work, T.S. et al., North Holland Publishing company, NY (1978) med spesiell referanse til til kapittelete med tittel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Technigues" ved Chard, T. Alternativt kan et fluoriserende enzym eller andre passende markører bli benyttet.

Eksempler på markørtype som kan bli benyttet inkluderer,

men er ikke begrenset til, enzymmarkører, radioisotopmarkører, ikke-radioaktive isotopmarkører, fluoriserende markører, toksinmarkører og markører som frigjør kjemiluminisens.

Eksempler på passende enzymmarkører inkluderer malat-dehydrogenase, stafylokokk nuklease, delta-5-steroid isomerase, gjær-alkohol dehydrogenase, alfa-glycerolfosfat-dehydrogenase, triosefosfatisomerase, peroksidase, alkalisk fosfatase, asparaginase, glukoseoksidase, beta-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glucose-6-fosfatdehydrogenase, glukoamylase, acetylkjolinesterase osv.

Eksempler på passende radioisotopmarkører inkluderer <3>H, mln, 125I, 131I, 32P, 3<5>S, "c, 5<1>Cr, 5<7>To, 5<8>Co, 59Fe, 75Se, 152Eu,

90Y, 6<7>Cu, 21<7>Ci, 21<1>At, 2<12>Pb, 47Sc, <109>Pd, osv. Eksempler på passende ikke-radioaktive isotopmarkører inkluderer <1>5<7>Gd, <55>Mn, 162Dy, 5<2>Tr, <56>Fe, osv.

Eksempler på passende fluoriserende markører inkluderer en <152>Eu-markør, en fluoresceinmarkør, en rhodaminmarkør, en fykoerytrinmarkør, en fykocyaninmarkør, en allofykocyanin-markør, en o-ftaldehydmarkør, en fluorescaminmarkør osv.

Eksempler på markører som gir kjemilumnisens inkluderer en luminalmarkør, en isoluminalmarkør, en aromatisk akridinester-markør, en imidazolmarkør, en akridinsaltmarkør, en oksalat-estermarkør, en luciferinmarkør, en luciferasemarkør, en aequorinmarkør, osv.

VI. TILFØRSEL AV FORBINDELSENE I DEN FORELIGGENDE OPPFINNELSE

De terapeutiske effekter til ICAM-2 kan oppnåes ved å gi en pasient hele ICAM-2-molekylet eller ethvert terapeutisk aktivt peptidfragment av dette. Av spesiell interesse er terapeutisk aktive peptidfragmenter av ICAM-2 som er løselige.

ICAM-2 og dets funksjonelle derivater kan oppnåes enten syntetisk, gjennom bruk av rekombinant DNA-teknologi, eller ved proteolyse, eller ved en kombinasjon av slike metoder. De terapeutiske fordeler ved ICAM-2 kan økes gjennom bruk av funksjonelle derivater av ICAM-2 som har ekstra aminosyrerester tilføyet for å formidle kobling til bærer eller til å øke aktiviteten av ICAM-2. Rammen av den foreliggende oppfinnelse er videre ment å inkludere funksjonelle derivater av ICAM-2 som mangler visse aminosyrerester, eller som inneholder forandrede aminosyrerester, så lenge som slike derivater sitter eller innehar en biologisk eller farmakologisk aktivitet til ICAM-2. Både antistoffene og ICAM-2-molekylet beskrevet her er sagt å være "hovedsakelig fritt for naturlige kontaminerende substanser" hvis preparater som inneholder dem er hovedsakelig fritt for materialer som disse produkter normalt og naturlig er funnet sammen med.

Når en pasient tilføres antistoffer eller fragmenter av dette istand til å binde ICAM-2, eller når ICAM-2 gis (eller et fragment, variant eller derivat av dette) til en mottaker-pasient, vil dosen som tilføres av forbindelsen variere avhengig av slike faktorer som pasientens alder, vekt, høyde, kjønn, generelle medisinske tiltak, tidligere medisinske historie osv. Generelt er det ønskelig å gi mottakeren en dose med antistoff som er i området av fra omkring 1 pg/kg til 10 mg/kg (kroppsvekt på pasienten), skjønt en lavere eller høyere dose kan bli tilført. Når ICAM-2-molekyler eller deres funksjonelle derivater gis til en pasient, er det å foretrekke å gi slike molekyler i en dose som også varierer fra omkring 1 pg/kg til 10 mg/kg (kroppsvekt til pasient), skjønt en lavere eller høyere dose kan også bli tilført. Som diskutert nedenfor, kan den terapeutisk effektive dose bli senket hvis anti-ICAM-2-antistoffet er i tillegg tilført med et anti-LFA-1-antistoff. En forbindelse kan ansees administrert sammen med en annen forbindelse når tilførselen av de to forbindelser er så nær hverandre i tid at begge forbindelser kan bli oppdaget på samme tid i pasientens serum.

Både antistoffet som er istand til å binde ICAM-2 og ICAM-2 selv kan bli tilført pasienter intravenøst, intramuskulært, subkutant, entéralt eller parenteralt. Når antistoff eller ICAM-2 gis ved injeksjon, kan tilførselen være kontinuerlig infusjon eller enkle eller multiple injeksjoner.

Forbindelsene fremstilt i den foreliggende oppfinnelse er ment å bli gitt til mottakerpersoner i en mengde som er tilstrekkelig til å undertrykke betennelse. En mengde er sagt å være tilstrekkelig til å "undertrykke" betennelse hvis dosen, administrasjonsruten osv. av forbindelsen er tilstrekkelig til å svekke eller hindre betennelse.

Anti-ICAM-2-antistoff, eller et fragment av dette, kan bli tilført enten alene eller i kombinasjon med én eller flere tilleggsimmunosuppressive forbindelser (spesielt til en mottaker av et organ eller vevstransplantat). Tilførselen av slike forbindelser kan være for enten "profylaktiske" eller "terapeutisk" formål. Når gitt profylaktisk, er de immunosuppressive forbindelser tilført forut for en inflammatorisk respons eller symptom (f.eks. forut for, ved, eller kort etter) tidspunktet for et organ- eller vevstransplantat, men før symptomer på organforkastelse). Den profylaktiske tilførsel av forbindelsen(e) tjener til å forhindre eller svekke en etterfølgende betennelsesrespons (slik som f.eks. forkastelse av et transplantert organ eller vev osv.). Når gitt terapeutisk, blir den (de) immunosuppressive forbindelsen (e) gitt ved (eller kort etter) begynnelsen av et symptom på aktuell betennelse (slik som f.eks. organ- eller vevsforkastelse). Den terapeutiske tilførsel av substansen(e) tjener til å svekke enhver aktuell betennelse (slik som f.eks. forkastelsen av et transplantert organ eller vev).

De anti-inflammatoriske forbindelser fremstilt i den foreliggende oppfinnelse kan således gis enten før begynnelsen på betennelse (slik som for å undertrykke en antatt betennelse) eller etter starten på betennelsen.

Et preparat er sagt å være "farmakologisk akseptabelt" hvis dets tilførsel kan bli tolerert av en mottakende pasient. En slik forbindelse er sagt å bli tilført i en "terapeutisk effektiv mengde" hvis mengden tilført er fysiologisk signifikant. En forbindelse er fysiologisk signifikant hvis dens nærvær resulterer i en målbar forandring i fysiologien til en mottakende pasient.

ICAM-2-molekylene fremstilt i den foreliggende oppfinnelse kan bli formulert ifølge kjente prosedyrer for å fremstille farmasøytisk brukbare preparater, hvorved disse forbindelser, eller deres funksjonelle derivater, blir kombinert i en blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Passende hjelpesubstanser og deres formulering, inklusive andre humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin, er beskrevet f.eks. i Remingtons Pharmaceutical Sciences (16. utg., Osol, A., utg. Mack, Easton PA (1980)). For å lage en farmasøytisk akseptabel forbindelse egnet for effektiv tilførsel, vil slike preparater inneholde en effektiv mengde av ICAM-2-molekyl, eller deres funksjonelle derivater, sammen med en passende mengde av bærer.

Ytterligere farmasøytiske teknikker kan bli benyttet for å - kontrollere virkningens varighet. Kontrollerte frigjørings-preparater (depotpreparater) kan oppnåes ved bruk av polymere for å kompleksbinde eller absorbere anti-ICAM-2-antistoff eller ICAM-2 eller deres funksjonelle derivater. Den kontrollerte tilførsel kan bli utøvet ved å selektere passende makromolekyler (f.eks. polyestere, polyaminosyrer, polyvinyl, pyrrolidon, etylenvinylacetat, metylcellulose, karboksymetyl-cellulose, eller protamin, sulfat) og konsentrasjon av makromolekyler såvel som metodene for innkorporering for å kontrollere frigjøring. En annen mulig metode til å kontrollere virkningens varighet via kontrollerte frigjøringsprepa-rater er å inkludere ICAM-2-molekyler eller deres funksjonelle derivater i partikler av et polymert materiale, slik som polyestere, polyaminosyrer, hydrogeler, poly(melkesyre) eller etylenvinylacetatkopolymerer. Alternativt, istedet for å inkorporere disse forbindelsene i polymere partikler, er det mulig å inkludere disse materialene i mikrokapsler som er laget f.eks ved samlingsteknikker eller ved interfase-polymerisering, f.eks. henholdsvis hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler og poly(metylmetacylat), eller i kolloidale medisinske tilføringssystemer, f.eks. liposomer, albuminmikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remingtons Pharmaceutical Sciences (1980).

Et farmasøytisk preparat kan bestå av ICAM-2, et funksjonelt derivat av ICAM-2; og en ikke-immunglobulinantagonist av ICAM-2 annen enn ICAM-1, og (b) minst én imraunosuppressiv forbindelse. Eksempler på egnede immunosuppressive forbindelser inkluderer: deksametheson, azathioprin og cyklosporin A.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

KLONING AV ICAM-2 cDNA

For å klone cDNA som er istand til å kode for ICAM-2, ble en modifikasjon av fremgangsmåten til Aruffo og Seed (Seed, B. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:3365-3369 (1987)) benyttet for å selektere cDNA ved ekspresjon i COS-celler etter søking for ligandbærende COS-celler på funksjonelt aktivt, renset LFA-1 bundet til plastikk-petriskåler.

I detalj ble LFA-1 renset fra SKW-3-lysat ved immunaffini-tetskromatografi på TS2/4 LFA-1 MAb Sepharose og eluert ved pH 11,5 i nærvær av 2 mM MgCl2 og 1% oktylglukosid. LFA-1 (10 Atg/200 /il/6 cm skål) ble bundet til bakterie-petriskåler ved å fortynne oktylglukosid til 0,1% i PBS med 2 mM MgC12 og inkubering over natten ved 4°C. Skåler ble blokkert med 1% BSA og lagret i PBS/2 mM MgCl2/0,2% BSA/0,025% azid/50 jug/ml gentamyein.

Syntese av et cDNA-bibliotek fra LPS-stimulert umbilikale vene-endotelceller ved metoden til Gubler og Hoffman ble utført som beskrevet av Staunton et al. (Staunton, D.E. et al., Cell, 52:925-933 (1988)). Etterfulgt av annen tråd-syntese ble cDNA ligert til Bst XI adaptorer (Seed, B. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:3365-3369 (1987)) og cDNA >600 bp ble selektert ved lavt smeltepunkts (LMP) agarosegel-elektroforese. cDNA ble så ligert til CDM8 (Seed, B., Nature, 329:840-842 (1987)), innført i E. coli-vert MC1061/P3 og utplatet for å oppnå 5 x 10<5> kolonier. Koloniene ble suspendert i LB-medium, samlet og plasmid preparert ved standard alkali-lysemetode (Maniatis, T. et al., i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Ti 10 cm skåler av COS-celler ved 50% konfluens ble transfektert med 10 /xg/plate av plasmid cDNA-bibliotek ved bruk av DEAE-dekstran (Kingston, R.E., i Current Protocols in Molecular Biology, 9.0.1-9.9.6, Greene Publishing Associates (1987)). ICAM-2 er trypsinresistent på endotel og SKW-3-celler. COS-celler tre dager postinfeksjon ble suspendert ved behandling med 0,025% trypsin/1 mM EDTA/HBSS (Gibco) og utsådd (Seed, B. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:3365-3369 (1987)) på LFA-1-dekkete plater som beskrevet nedenfor for <51>Cr-merkete COS-celler. Adherente celler ble frigjort ved tilsetning av EDTA til 10 mM.

Plasmid ble gjenvunnet fra den adherente populasjon av COS-celler i Hirt supernatanter (Hirt, B.J., J. Mol. Biol., 26:365-369 (1967)). E. coli-stamme MC1061/P3 ble så transformert med plasmidet, kolonier på skålene ble suspendert i LB-medium, samlet og plasmid preparert ved alkalilysemetoden. Seleksjon av LFA-1-adherente transfekterte COS-celler og plasmidgjenkjennelse ble gjentatt for to videre cykluser. Samlete kolonier oppnådd etter den tredje cyklus ble dyrket til metning i 100 ml av LB-medium med 18 ug/ ml tetracyklin og 20 /Ltg/ml ampicillin. Plasmid ble preparert og fraksjonert ved hjelp av 1% LMP-agarose gelelektroforese, og MC1061/P3 ble transformert separat med plasmid fra ni forskjellige størrelsesfraksjoner. Individuelle plasmider fra fraksjonen med den største aktivitet i å promotere COS-celleadhesjon til LFA-1 ble undersøkt for innskuddstørrelse ved digestion med Xbal og testet i COS-celleadheransemåling. Dette ga et plasmid med et ICAM-2 cDNA-innskudd på 1,1 kb, pCDIC2.27.

For adhesjonstestmetoder ble ICAM-2-plasmid pCDIC2.27 eller en ICAM-1-konstruksjon som inneholdt 1,8 kg Sali, Kpnl-fragment (Staunton, D.E. et al., Cell, 52:925-933 (1988)) i CDM8 (2 /xg/10 cm skål) introdusert i COS-celler ved bruk av DEAE-dekstran. COS-celler ble suspendert med 0,025% trypsin/1 mM EDTA/HBSS tre dager etter transfeksjon og merket med <51>Cr. Omtrent 2 x 10<5><51>Cr-merkete COS-celler i 2 ml PBS/5% FCS/2 mM MgCl2/0,025% azid (buffer) med 5 /ug/ml av det indikerte MAb ble inkubert i LFA-l-dekket 6 cm skåler ved 25°C i en time. Ikke-heftende celler ble fjernet ved svak risting og tre vasker med buffer. Heftende celler ble eluert ved tilsetning av EDTA til 10 mM og -y-tellet.

Gjennomføringen av denne fremgangsmåte ble demonstrert ved bruk av COS-celler som var transfektert med det tidligere klonet ICAM-1 cDNA (fig. IA). ICAM-1 ble uttrykt på 25% av de transfekterte COS-celler. Etter utsåing ble ikke-heftende celler fjernet fra ICAM-l<+->celler, mens heftende celler frigitt fra LFA-l-dekket plast med EDTA var omtrent fullstendig ICAM-1<+>. Adhesjon av ICAM-l<+->celler til LFA-l-dekket plast ble hemmet med RR1/1 ICAM-1 MAb. LFA-l-dekket på petriskålene var stabile over 5 cykluser av COS-celleadhesjon og eluering med EDTA; skålene ble lagret med Mg<2+> ved 4°C mellom bruk.

For å klone ICAM-2 ble et cDNA-bibliotek i plasmidvektor CDM8 preparert fra endotelceller, som viste både de ICAM-1-avhengige og ICAM-l-uavhengige komponenter av LFA-l-avhengig adhesjon (Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol., 107:321-331

(1988)). Transfekterte COS-celler ble inkubert i LFA-l-dekkete petriskåler med ICAM-1 MAb tilstede for å forhindre isolering av ICAM-1 cDNA. Heftende celler ble eluert med EDTA og plasmider ble isolert og amplifisert i E. coli. Etter tre cykler med transfeksjon, adhesjon og plasmidisolering, og én størrelsesfraksjonering, ble 30 plasmider analysert ved restriksjonsendonukleasefordøyelse. Av tre med innskudd over 1,0 kb, ga ett plasmid introdusert i COS-celler ved transfeksjon adheranse til LFA-1.

Det isolerte plasmidet ga adhesjon til LFA-1 i en høy prosentdel av de transfekterte cellene, lik den prosentdel sett ved ICAM-1-transfeksjon (fig. IB). Adhesjon ble blokkert ved LFA-1 mAb, men i kontrast til ICAM-1 transfektanter, ikke av ICAM-1 mAb (fig. IB). Videre reagerte ikke celler transfektert med dette plasmid med et panel på fire ICAM-1 mAb. Således var alle funksjonelle kriterier for et cDNA som koder for en annen LFA-1-ligand oppfylt, og liganden ble betegnet ICAM-2.

Eksempel 2

KARAKTERISERING AV ICAM-2 cDNA-SEKVENS

ICAM-2 cDNA-sekvensen på 1052 bp (fig. 2) inneholder en 62 bp 5' og et 167 bp 3' ikke-translatert region. Et AATACA poly-adenyleringssignal ved posisjon 1019, som i kontrast til AATAAA opptrer i omtrent 2% av vertebrate mRNA (Wickens, M. et al., Science, 226:1045-1051 (1984)), er etterfulgt ved 1058 bp av en poly(A)-hale. Den lengste åpne leseramme begynner med den første ATG ved posisjon 653 og ender med en TAG-termi-neringskodon ved posisjon 885. Hydrofobisitetsanalyse (Kyte, J. et al., J. Mol. Biol., 157:105-132 (1982)) og bruk av aminosyrer rundt klyvningsstedene (von Heijne, G., Nucleic Acids Research, 14:4683-4690 (1986)) forutsier et 21 rest signalpeptid (fig. 2).

Den forutsagte modne sekvens inneholder fra aminosyre 1 til 201 et sannsynlig ekstracellulær domene etterfulgt av et 26 residue hydrofobt antatt transmembrandomene og et 26 residue cytoplasmatisk domene. Fire svinger av det forutsagte a-heliske transmembransegment er amfipatisk, med threonin- og serin-rester orientert på én side, hvilket antyder muligheten av selv-assosiasjon eller assosiasjon med andre membran-proteiner i planet til membranen. Den cytoplasmatiske domene er vanligvis basisk, og i kontrast til de fleste cytoplasmatiske domener som er hydrofile, har gjennomsnittlig hydrofobisitet. Den forutsagte masse av det modne polypeptid er 28 176 dalton, som hvis de seks forutantatte N-bundete glykosyleringsseter blir benyttet, ville resultere i et ICAM-2-glykoprotein på omtrent 46 Kd.

Eksempel 3

DNA OG RNA HYBRIDISERINGSANALYSER

De isolerte ICAM-2 cDNA-kloner ble analysert ved bruk av både Northern og Southern hybridisering. Northern blots benyttet 6 jug av poly (A)+ RNA som var denaturert og elektro-foresert gjennom en 1% agarose-formaldehydgel (Maniatis, T. et al., i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) og elektro-overført på en nylon-membran (Zeta Probe, BioRad). En fullstendig overføring ble bekreftet ved UV trans-illuminering av gelen og fluorescent fotografi av blottet.

Det genomiske DNA ble fordøyet med fem ganger produsentens anbefalte mengde av EcoRI og Hindlll endonuklease (New England Biolabs). Etterfulgt av elektroforese gjennom en 0,8% agarose-gel ble DNA overført til Zeta Probe. RNA- og DNA-blot ble prehybridisert og hybridisert der standard prosedyrer ble fulgt (Maniatis, T. et al., i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) ved bruk av ICAM-2 eller ICAM-1 cDNA merket med a[<32>P]d XTP ved vilkårlig priming (Boehringer Mannheim).

1,1 kb ICAM-2 cDNA hybridiseret til en 1,4 kb poly(A)<+> mRNA og svakt til et 3 kb mRNA (Fig. 3A) forskjellig fra 3,3 kb og 2,4 kb ICAM-1 mRNA (fig. 3B). mRNA ble undersøkt i celler som har vært karakterisert funksjonelt for ICAM-l-avhengig og sekundær ligandavhengig binding til LFA-1. ICAM-1 mRNA blir sterkt indusert i endotelceller med LPS (fig. 3B, spor 2 og 3). Derimot blir ICAM-2 mRNA sterkt uttrykt basalt i endotelceller og blir ikke indusert videre med LPS (fig. 3A, spor 2 og 3). Dette korrelerer med sterkt basal og ikke-induserbar ekspresjon av den LFA-l-avhengige ICAM-l-uavhengige vei i endotelceller og induserbarhet av den ICAM-l-avhengige vei (Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol., 107:321-331 (1988)).

ICAM-2 mRNA er tilstede i en stor variasjon av celletyper inkludert Ramos og BBN B lymfoblastoid, U937 monocytisk, og SKW3 lymfoblastoid cellelinjer (fig. 3A, spor 1, 4, 6 og 8) som vist ved moderate eller lange autoradiogrameksponeringer. Av disse har SKW3, U937 og BBN blitt vist å vise LFA-1-avhengig, ICAM-l-uavhengig adhesjon til LFA-l<+->celler (Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986); Makgoba, M.W. et al., Eur. J. Immunol. 18:637-640 (1988)) og til LFA-l-dekket plastikk. Den HeLa epiteliale cellelinjen som viser bare den ICAM-l-avhengige komponent av LFA-l-avhengig adhesjon (Makgoba, M.W. et al., Eur. J. Immunol., 18:637-640

(1988)), viser ingen ICAM-2 mRNA (fig. 3A, spor 5) endog etter forlenget autoradiogrameksponering. Celledistribusjonen av ICAM-2 er således i tråd med den ICAM-l-uavhengige komponent av LFA-l-avhengig adhesjon.

Southern blots av genomisk DNA (fig. 3D) hybridisert med ICAM-2 cDNA viste et enkelt hovedsakelig EcoRI-fragment av 8,2 kb og HindiII-fragment av 14 kb, som antyder et enkelt gen med mesteparten av den kodende informasjon tilstede i 8 kb.

Eksempel 4

SAMMENLIGNING AV AMINOSYRESEKVENSENE TIL ICAM-1 OG ICAM-2

På grunn av deres funksjonelle liket som LFA-l-ligander, ble aminosyresekvensene til ICAM-2 og ICAM-1 sammenlignet. ICAM-1 er et medlem av lg super familien, og dets ekstracellulære domene består fullstendig av fem C-liknende domener. Den 201 aminosyre ekstracellulære domene av ICAM-2 består av 2 lg C-liknende domener, med sannsynlige intradomene-disulfid-bundede cysteiner som er 43 og 56 residuer fra hverandre og av en forutsagt ^-struktur (fig. 4). Det er bemerkelsesverdig at de to Ig-liknende domener av ICAM-2 er 34% identiske i amino-syresekvens med de to N-terminale mest Ig-liknende domener av ICAM-1 (fig. 4) med en ALIGN-score 15 s.d. over gjennomsnittet og 27% identisk til ICAM-1 domener 3 og 4, med en ALIGN score 3 s.d. over gjennomsnittet.

Søk i NBRF og SWISS-PROT protein databaser ga bare parti-elle domenehomologier med andre medlemmer av lg superfamilien, først og fremst med HLA klasse II antigener. ICAM-2 viser noe færre konserverte residuer som karakteristisk for Ig-domener enn det ICAM-1 gjør. ICAM-2 er henholdsvis 17% og 19% identisk med de to N-terminale domener av adhesjonsmolekylene NCAM (Cunningham, B.A. et al., Science, 236:799-806 (1987)) og MAG (Salzer, J.L. et al., J. Cell. Biol., 104:957-965 (1987)), mens ICAM-1 er henholdsvis 19% og 20% identisk.

Lymfocyttfunksjon-assosiert antigen-1 (LFA-1) og inter-cellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) ble identifisert henholdsvis ved å selektere MAb som blokkerte T-lymfocytt-formidlet drap, og homotypisk adhesjon (Rothlein, R. et al., J. Immunol, 137:1270-1274 (1986)); Davignon, D. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:4535-4539 (1981)). I motsetning er ICAM-2 blitt definert ved bruk av en funksjonell cDNA-seleksjonsprosedyre som ikke krever tidligere identifikasjon av proteinet ved biokjemiske eller immunologiske teknikker. Isolering av et cDNA for ICAM-2 bekrefter den postulerte eksistensen av en alternativ LFA-1-ligand. Fordeling av mRNA for ICAM-2 på et begrenset antall celler som er blitt karakterisert for ICAM-l-avhengig og ICAM-l-uavhengig adhesjon til LFA-1, tyder på at ICAM-2 kunne forklare alle de observerte ICAM-l-uavhengige LFA-l-avhengige adhesjoner.

ICAM-2 og de to N-terminale domerer av ICAM-1 er meget mer like hverandre enn de er like andre medlemmer av lg superfamilien, hvilket viser en subfamilie av Ig-liknende molekyler som binder seg til LFA-1. Det er betydningsfullt at LFA-1-bindingsregionen til ICAM-1 er blitt lokalisert til domenene 1 og 2 ved domenedelesjon og systematisk aminosyresubstitusjon. Således er der både strukturell og funksjonell homologi. ICAM-2 er det andre eksempel på et lg familiemedlem som binder til en integrin. Skjønt det er lite presidens blant celleadhe-sjonsreseptorer, har et antall av reseptorer for ekstracellulære matrikskomponenter blant integrinene vist å gjenkjenne multiple ligander (Hynes, R.O., Cell, 48:549-554

(1987); Ruoslahti, E. et al., Science, 238:491-497 (1987)).

Hverken ICAM-1 eller ICAM-2 inneholder en RGD-sekvens, og således kan måten for gjenkjennelse av LFA-1 variere fra integriner som binder ekstracellulære matrikskomponenter (Hynes, R.O., Cell, 48:549-554 (1987), Ruoslahti, E. et al., Science, 238:491-497 (1987)). De cellulære ligander gjenkjent av Mac-1 og pl59,95, leukocyttintegriner nær beslektet med LFA-l, kan tilhøre den samme Ig-subfamilie. ICAM-1 er nylig vist å være en reseptor for hovedgruppen av rhinovirus som forårsaker 50% av de vanlige forkjølelser. ICAM-2 kan også funksjonere som en reseptor for rhinovirus eller andre picornavirus. Således kan det benyttes i en terapi til å undertrykke (f.eks. forhindre eller svekke) infeksjon fra slik virus.

En familie av ligander for LFA-1 understreker viktigheten av denne gjenkjennelsesvei og kan være en mekanisme for å overføre en fin spesifisitet og funksjonell diversitet. Flere forskjeller mellom ICAM-1 og ICAM-2 er av potensiell viktig-het. ICAM-1 er induserbar på de fleste celler, mens ICAM-2-ekspresjon ikke affiseres av cytokiner på cellene så langt testet. De tre tilleggsdomener på ICAM-1 antas å projisere dets LFA-l-bindingssete videre fra celleoverflaten enn det til ICAM-2 og derved antyde at nærmere celle-celle-kontakt ville kreves for LFA-1:ICAM-2 enn for LFA-1:ICAM-l-interaksjon. ICAM-2 transfekterte COS-celler frigjøres lettere enn ICAM-1 transfekterte COS-celler fra LFA-l-belagt plast, ettersom vaskeskjærkraften er øket. Dette kan skyldes den mindre størrelse av ICAM-2 som kan gjøre det mindre tilgjengelig til LFA-1 på det artifisielle substratet, eller til forskjeller i sekvens som fører til forskjeller i affinitet.

De forskjellige cytoplasmatiske domener av ICAM-1 og ICAM-2 kan overføre forskjellige signaler eller forårsake forskjellig lokalisering på celleoverflaten; på samme måte signalisering eller interaksjon med cytoskjelettet ved LFA-1 kan variere avhengig av hvorvidt ICAM-1 eller ICAM-2 er bundet.

ICAM-1 og en annen LFA-1 motreseptor, ICAM-2, utgjør således en subfamilie av immunoglobulin (lg) superfamilien (Staunton, D.E. et al., Cell, 52:925-933 (1988). ICAM-1 har fem Ig-liknende C-domener, mens ICAM-2 har to, som er mest homologe med de aminoterminale domener av ICAM-1. ICAM-1 og ICAM-2, uttrykt på en rekke celletyper, støtter forskjellige leukocytt-adhesjonsavhengige funksjoner inklusive induksjon og effektorfunksjoner i immunresponsen. ICAM-l-ekspresjon induseres sterkt av cytokiner, og således er LFA-1/ICAM-1-adhesjonssystemet istand til å styre leukocyttvandring og lokalisering under inflammasjon (Rothlein, R., J. Immunol., 137:1270-124 (1986); Marlin, S.D., et al., Cell, 51:813-819

(1987); Kishimoto, T.K. et al., Adv. Immunol., 46:149-182

(1989); Dustin, M.L. et al., Immunol. Today, 9:213-215 (1988).

ICAM-l-rester som er blitt definert ovenfor som viktige for LFA-l-binding er konservert i andre ICAM (Staunton, D.E. et al., Nature, 339:61-64 (1989). Human ICAM-1 er 50% identisk med mus ICAM-1 og 35% identisk for human ICAM-2 (Staunton, D.E. et al., Nature, 339:61-64 (1989). Residuene som er mest kritiske for LFA-l-binding, E34 og Q73, er konservert både i muse-ICAM-1 og human ICAM-2. Dette er i tråd med egenskapen til både mus ICAM-1 og human ICAM-2 (Staunton, D.E. et al.,

Nature, 339:61-64 (1989)) til å binde human LFA-1. Et D2 N-

bundet glykosyleringssete på en N156, som influerer LFA-l-binding, er også konservert i ICAM-2. Flere rester som er viktige for rhinovirus-14-binding, Q58, G46, D71, K77 og R166

er ikke konservert i mus ICAM-1 eller human ICAM-2 (Staunton, D.E.et al., Cell, 56:849-853 (1989), hvilket er i overens-stemmelse med den tilsynelatende mangel hos museceller (Colonno, R.J. et al., J. Virol., 57:7-12 (1986)) og ICAM-2

til å binde rhinovirus-14.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av ICAM-2 eller et funksjo-

nelt derivat derav, hovedsakelig fritt for naturlige kontaminanter, og hvori nevnte ICAM-2 eller funksjonelle derivat derav inneholder minst ett polypeptid valgt fra gruppen bestående av: (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-; (b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-; (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-; (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-; (e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-; (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-; (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-I-l-V-T-V-V-S-V-L-L-; (k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I-: og (1) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-,karakterisert ved trinnene: a) oppbygging av et rekombinant DNA-molekyl som inneholder en nukleinsyresekvens som koder for nevnte ICAM-2 eller funksjonelle derivat derav, operativt knyttet til en ekspresjonskontrollsekvens; b) innføring av nevnte DNA-molekyl i en bakterie-eller en eukaryotisk vertscelle; c) dyrking av nevnte vertscelle; og d) isolering av ICAM-2'et eller det funksjonelle derivat derav syntetisert av nevnte vertscelle.