FI100994B - Menetelmä valmistaa ICAM-2 ja yhdistelmä-DNA-molekyyli - Google Patents

Description

100994

Menetelmä valmistaa ICAM-2 ja yhdistelmä-DNA-molekyyli - För-farande för framställning av ICAM-2 och en rekombinant-DNA-molekyl Tämä keksintö koskee menetelmää valmistaa solujen välistä kiin-nikemolekyyli-2:ta ("ICAM-2"), joka osallistuu prosessiin, jolla imusolupopulaatiot tunnistavat solusubstraatit ja kiinnittyvät näihin, jolloin ensin mainitut kykenevät kulkeutumaan tulehdus-kohtiin ja olemaan vuorovaikutuksessa solujen kanssa tulehdusreaktioissa. Tämä keksintö koskee edelleen yhdistelmä DNA-mole-kyylejä, jotka kykenevät koodittomaan ICAM-2-kiinnikemolekyyle-jä.

Valkosolujen on kyettävä kiinnittymään solusubstraatteihin pystyäkseen kunnolla puolustamaan isäntää vieraita hyökkääjiä kuten bakteereita tai viruksia vastaan. Erinomaisen katsauksen puolustusjärjestelmästä esittää Eisen, H.W. (Microbiology. 3. painos, Harper & Row, Philadelphia, PA, 1980, ss. 290-295 ja 381-418). Valkosolujen on kyettävä kiinnittymään endoteelisolui-hin voidakseen siirtyä verenkierrosta ajankohtaisiin tulehdus-kohtiin. Lisäksi niiden on sitouduttava antigeenin käsittäviin soluihin, jotta normaali spesifinen immuunivaste voisi muodostua, ja lopuksi niiden on kiinnityttävä tarkoituksenmukaisiin kohdesoluihin, jotta virustartunnan saaneissa soluissa tai kasvainsoluissa tapahtuisi lyysi.

Äskettäin hybridoomatekniikan avulla tunnistettiin näitä kiinnittymisiä välittäviä valkosolupintamolekyylejä. Suppeasti, tunnistettiin monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat ·. ihmisen T-soluja vastaan (Davignon, D., et ai. . Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 2&:4535-4539 (1981)) ja hiiren pernasoluja vastaan (Springer, T., et ai·., Eur. J. Immunol. 2:301-306 (1979)), ja jotka sitoutuivat valkosolujen pintaan ja estivät edellä kuvatut kiinnittymiseen liittyvät funktiot (Springer T., et ai.. Fed. Proc. £4.:2660-2663 (1985)). Näiden vasta-aineiden tunnistamat molekyylit nimettiin Mac-l:ksi ja imusolufunktioliitteiseksi 100994 2 antigeeni-1:ksi (LFA-1). Mac-1 on heterodimeeri, jota esiintyy syöjäsolujen, jyvässolujen ja suurien jyväisten imusolujen pinnalla. LFA-1 on heterodimeeri, jota esiintyy valtaosan imusoluista pinnalla (Springer, T.A., et ai.. Immunol. Rev. £2.:111-135 (1982)). Näillä kahdella molekyylillä, sekä kolmannella molekyylillä: pl50,95 (jonka kudosjakauma on samankaltainen kuin Mac-l:n) on osa solukiinnittymisessä (Keizer, G., et ai.. Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)).

Edellä kuvattujen valkosolumolekyylien todettiin kuuluvan suku-laisglykoproteiinien ryhmään (Sanchez-Madrid, F., et ai..

J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983); Keizer, G.D., et ai..

Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)), jota kutsutaan glykopro-teiini-"CD-18-ryhmäksi". Tämä glykoproteiiniryhmä koostuu hete-rodimeereistä, joilla on yksi α-ketju ja yksi β-ketju. Vaikka näiden antigeenien α-ketjut ovat erilaiset, β-ketjut todettiin erittäin säilyviksi (Sanchez-Madrid, F., et ai.. J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983)). Todettiin, että glykoproteiiniryhmän (jota toisinaan kutsutaan "CDl8:ksi") β-ketjun molekyylipaino oli 95 kd:tä, kun puolestaan α-ketjujen molekyylipainon todettiin vaihtelevan 150 kd:stä 180 kd:hen (Springer, T., Fed. Proc. 11 :2660-2663 (1985)). Vaikka membraaniproteiinien a-alayksiköi-den välillä ei ole β-alayksiköille ominaista laajaa homologiaa, glykoproteiinien α-alayksiköitä huolellisesti analysoimalla on todettu, että niiden välillä esiintyy huomattavia yhtäläisyyksiä. Katsauksia LFA-l-liitteisten glykoproteiinien alfa- ja beeta-alayksiköiden välisistä samankaltaisuuksista esittävät Sanchez-Madrid, F., et ai. (J. Exper. Med. 158:586-602 (1983); J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983)).

On tunnistettu joukko yksilöitä, jotka eivät kykene ilmentämään normaaleja määriä yhtään tämän kiinnikeproteiiniryhmän jäsentä valkosolujensa solupinnoilla (Anderson, D.C., et ai.. Fed. Proc. 44.:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et ai. . J. Infect. Dis.

152: 668-689 (1985)). Näistä potilaista saadut imusolut osoittivat in vitro samankaltaisia puutteita, kuin normaalit verrokki- 3 100994 potilaat, joiden CD-18-molekyyliryhmän toiminnan estivät vasta-aineet. Niinikään nämä yksilöt eivät kyenneet muodostamaan normaalia immuunivastetta, mikä johtui heidän solujensa kyvyttömyydestä kiinnittyä solusubstraatteihin (Anderson, D.C., et ai.. Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et ai.. J. Infect. Pis. 152:668-689 (1985)). Nämä tiedot osoittavat, että immuunireaktiot laimenevat silloin, kun imusolut eivät kykene kiinnittymään normaalilla tavalla CD-18-ryhmän funktionaalisten kiinnikemolekyylien puuttumisen johdosta.

Täten yhteenvetona: valkosolujen kyky pitää eläin terveenä ja elinkelpoisena edellyttää, että valkosolut kykenevät kiinnittymään toisiin soluihin (kuten endoteelisoluihin). Tämän kiinnittymisen on todettu edellyttävän solu-solukontakteja, joihin liittyy spesifisiä reseptorimolekyylejä, joita esiintyy valkosolujen solupinnoilla. Nämä reseptorit mahdollistavat valkosolun kiinnittymisen muihin valkosoluihin tai endoteelisoluihin, ja muihin ei-verisuonisoluihin. Solupinnan reseptorimolekyylit on todettu erittäin likeisesti toisiaan muistuttaviksi. Henkilöt, joiden valkosoluista puuttuvat nämä solupinnan reseptorimolekyylit, kärsivät kroonisista ja toistuvista tulehduksista sekä muista kliinisistä oireista, mukaan lukien puutteelliset vasta-ainevasteet.

Koska valkosolujen kiinnittyminen liittyy prosessiin, jossa vieraskudos tunnistetaan ja torjutaan, tämän prosessin ymmärtämisellä on runsaasti merkitystä elinsiirtojen, kudossiirtojen, yliherkkyyden ja kasvainopin aloilla.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että transformoidaan isäntäsolu ekspressiovektorilla, joka sisältää ICAM-2 koodaavan informaation, ja viljellään mainittua transformoitua isäntäsolua olosuhteissa, joissa mainitut solut ekspressoivat ICAM-2, joka valmistettu ICAM-2 kykenee sitoutumaan solun tai viruksen pinnalla olevaan molekyyliin, ja lisäksi sisältää ainakin yhden seuraavan polypeptidin: 100994 4 (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-; (b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-; (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-; (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-; (e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-; (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-; (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-; (k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I- ja (l) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

Keksintö koskee edelleen yhdistelmä-DNA-molekyyliä, jolle on tunnusomaista se, että se kykenee koodittamaan ICAM-2:n, joka kykenee koodittamaan ainakin yhden seuraavan polypeptidin: (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-; (b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-; (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-; (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-; (e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-; (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-; (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-; (k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I- ja (l) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-, *' ja joka molekyyli kykenee lisäksi ilmentämään ICAM-2:n jossain solussa.

Keksintö mahdollistaa ICAM-2:n ilmentävän solun läsnäolon toteamisen, jolloin: s 100994 (a) solua tai solu-uutetta inkuboidaan nukleiinihappomolekyylin läsnäollessa, joka kykenee hybridoitumaan ICAM-2-mRNA:hän; ja (b) määritetään, onko nukleiinihappomolekyyli hybridoitunut komplementaariseen nukleiinihappomolekyyliin, jota esiintyy sanotussa solussa tai sanotussa solu-uutteessa.

Kuvio 1 esittää transfektoitujen COS-solujen, jotka ilmentävät ICAM-l:n ja ICAM-2:n, sitoutumista LFA-l:llä päällystettyyn muoviin. A) COS-soluja, jotka oli transfektoitu ICAM-1-cDNA:11a, seulottiin LFA-l-päällysteisissä maljoissa ja ICAM-1:n ilmentyminen analysoitiin käyttäen epäsuoraa immuunifluoresenssivirtaussytometriaa, jolloin primaari-MAb:nä ensimmäisenä monoklonaalisena vasta-aineena) oli ICAM-1-vastainen monoklonaalinen vasta-aine RRl/1. Levittymättä jääneet solut: pisteviiva; ei-kiinnittyneet solut: katkoviiva; kiinnittyneet solut: yhtenäinen viiva. B) 5lCr-leimattuja transfek-toituja COS-soluja, jotka ilmentävät ICAM-l:n tai ICAM-2:n, sidottiin LFA-l:llä päällystettyyn muoviin MAb:n läsnäollessa.

Kuvio 2 esittää ICAM-2:n nukleotidi- ja vastaavasti aminohappo-sekvenssiä. Aminohapposekvenssi on numeroitu lähtien ensimmäisestä jäännöksestä signaalipeptidin ennakoidun lohkeamiskohdan jälkeen. Hydrofobinen oletettu signaa-lipeptidi ja transmembraanisekvenssit (TM) on alleviivattu. Mahdolliset N-kytkentäglykosylaatiokeskukset on merkitty laatikolla. Oletetun polyadenylaatiosignaalin ·. AATACA päälle on merkitty viiva. ICAM-2-cDNA:n molemmat säikeet sekventoitiin CDM8:ssa käyttämällä komplementaaristen oligonukleotidialukkeiden sarjasynteesiä ja dideoksi-ketjupäätysekventointia (Sanger, F., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. Π2Δ 11:5463-5467 (1977)) valmistajan suositusten mukaan (Sequenase, U.S. Biochemical).

s 100994

Kuvio 3 esittää RNA- ja DNA-hybridisaatio-analyysien tulokset.

Northernin (A ja B) ja Southernin (C) blot-kopiot hyb-ridoitiin 1,1 ke:n 32P-leimattuun ICAM-2-cDNA:han (A ja C), ja uudelleenhybridoitiin 3 ke:n 32P-leimattuun ICAM-l-cDNA:han (B). (A ja B) 6 μg poly(A)+ RNA:ta: Burkittin lymfomasolulinja, Ramos (vyöhyke 1); endotee-lisoluja (vyöhyke 2); 3 tunnin ajan LPS:llä stimuloituja endoteelisoluja (vyöhyke 3); EBV-immortalisoitu B-varhaisimusolulinja, BBN (vyöhyke 4); epiteelikarsinoo-masolulinja, HeLa (vyöhyke 5); T-lymfomasolulinjoja, Jurkat (vyöhyke 6) ja SKW-3 (vyöhyke 7); ja promono-syyttisolulinjoja, U937 (vyöhyke 8). (C) 6 μg genomi- DNA:ta: B-solulinjoja BL2 (vyöhykkeet 1 ja 4); ER-LCL (vyöhykkeet 2 ja 5) ja Raji (vyöhykkeet 3 ja 6); pilkottuna EcoRI:llä (vyöhykkeet 1-3) tai HindIII:lla (vyöhykkeet 4-6). ICAM-2- ja ICAM-l-mRNA:t on merkitty nuolilla.

Kuvio 4 esittää ICAM-2:n ja ICAM-l:n välistä homologiaa. ICAM-2:n solunulkoinen 201 jäännöksen sekvenssi kokonaisuudessaan asetettiin ICAM-1-jäännöksien 1 - 185 rinnalle käyttäen ALIGN-ohjelmaa (Dayhoff, M.O., et ai. Methods Enzymol. 21.:524-545 (1983)) ja havainnointia. ICAM-2-jäännökset on numeroitu. Samankaltaisuudet on osoitettu merkitsemällä laatikko. Dl ja D2 osoittavat ICAM-2:n ja ICAM-1:n Ig-kaltaisten alueiden rajan. ICAM-2:n β-säie-ennusteiden (Chou, P.Y., et ai.. Biochemistry 13:211-245 (1974)) päälle ja ICAM-l:n vastaavien alle on merkitty viiva.

Esillä olevan keksinnön yksi näkökohta koskee LFA-1:n luontaisen sitoutumisligandin löytymistä. CD-18-ryhmämolekyylien kaltaisia molekyylejä, jotka osallistuvat solukiinnittymisprosessiin, kutsutaan "kiinnikemolekyyleiksi".

7 100994 I. LFA-1 ja ICAM-1

Valkosolukiinnikemolekyyli LFA-1 välittää laajaa joukkoa imusolujen, monosyyttien, luontaisten tappajasolujen ja jyvässolujen vuorovaikutuksia muiden solujen kanssa immuuni- ja tulehdusreaktioissa (Springer, T.A., et ai.. Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987) .

LFA-1 on solujen välisen kiinnikemolekyyli-1:n (ICAM-l:n) reseptori; pintamolekyyli ilmentyy konstitutiivisesti muutamissa kudoksissa ja toisissa tulehduksen yhteydessä (Marlin, S.D., et ai. Call SI:813-819 (1987); Dustin, M.L., et ai., J Immunol. 122:245-254 (1986); Dustin M.L., et ai.. Immunol. Today 9:213-215 (1988); US-hakemusjulkaisu sarja n:o 07/019,440, joka jätettiin 26. helmikuuta 1987, ja US-hakemusjulkaisu sarja n:o 07/250,446, joka jätettiin 28. syyskuuta 1988, jotka molemmat hakemusjulkaisut sisällytetään tähän viitteiksi).

LFA-1 toimii sekä antigeenispesifisissä että antigeeneistä riippumattomissa T-solumyrkky-, T-avustajasolu-, luontainen tappajasolu-, jyvässolu- ja monosyyttivuorovaikutuksissa muiden solutyyppien kanssa (Springer, T.A., et ai.. Ann. Rev. Immunol 2:223-252 (1987); Kishimoto, T.K., et ai.. Adv. Immunol. (1988, painossa)). LFA-1 on valkosoluintegriini, joka käsittää ei-kovalenttisesti toisiinsa liittyneet a- ja β-glykoproteiiniala-yksiköt, jotka ovat kooltaan 180 ja vastaavasti 95 kd:tä.

ICAM-1 on yhden ketjun käsittävä glykoproteiini, jonka molekyy-lipaino vaihtelee solutyypin mukaan: 76 - 114 kD:tä, ja joka kuuluu Ig-super-ryhmään, jossa esiintyy viisi C-tyypin aluetta (Dustin, M.L., et ai.. Immunol. Today 9:213-215 (1988); Staunton, D.E., et ai., Cell 52:925-933 (1988); Simmons, D., et ai.. Nature 331:624-627 (1988)). ICAM-1 on helposti indusoitavissa sytokiineilla, mukaan lukien IFN-γ, TNF ja IL-1, suuressa joukossa erilaisia soluja (Dustin, M.L., et ai.. Immunol. Today 2:213-215 (1988)). ICAM-1-induktio epiteelisolu-, endoteelisolu- 100994 8 ja sidekudosmuodostussolupinnoilla välittää LFA-l-riippuvaista imusolujen kiinnittymistä (Dustin, M.L., et ai.. J.Immunol. 122:245-254 (1986); Dustin, M.L., et ai.. J.Cell. Biol.

107:321-331 (1988); Dustin, M.L., et ai.. J.Exp. Med.

122: 1323-1340 (1988)). Kiinnittymisen estää imusolujen esikäsittely LFA-l-MAb:llä tai toisen solun esikäsittely ICAM-l-MAb:llä (Dustin, M.L., et ai.. J. Immunol. 137:245-254 (1986); Dustin, M.L., et al_. J. Cell. Biol. 107:321-331 (1988); Dustin, M.L., et ai.. J. Exp. Med. 167:1323-1340 (1988)). Identtiset tulokset, jotka saatiin puhdistetulla ICAM-l:llä synteettisissä membraa-neissa tai petrimaljoissa, osoittavat, että LFA-1 ja ICAM-l ovat toistensa reseptoreita (Marlin, S.D., et ai.. Cell 51:813-819 (1987); Makgoba, M.W., et ai.. Nature 331:86-88 (1988)). Selvyyden vuoksi niitä kutsutaan tässä "reseptoriksi" ja vastaavasti "ligandiksi". ICAM-l:tä kuvataan edelleen US-hakemusjulkaisuissa sarja n:ot 07/045,963; 07/115,798; 07/155,943; 07/189,815; ja 07/250,446, jotka kaikki hakemusjulkaisut kokonaisuudessaan sisällytetään tähän viitteiksi.

II. ICAM-2

On esitetty, että löytyy toinen, ICAM-l:stä poikkeava LFA-1-ligandi (Rothlein, R., et ai.. J. Immunol. 137:1270-1274 (1986); Makgoba, M.W., et ai.. Eur. J. Immunol. 18:637-640 (1988); Dustin, M.L., et ai.. J. Cell. Biol. 107:321-331 (1988)). Esillä oleva keksintö koskee tätä toista ligandia, jota kutsutaan "ICAM-2:ksi" (täydellinen nimi: "solujen välinen kiinnikemole-kyy1i-2").

* ICAM-2 eroaa ICAM-l:stä solujakaumassa ja sytokiini-induktion puuttumisessa. ICAM-2 on metnbraaniin integroitunut proteiini, jolla on kaksi Ig-kaltaista aluetta, kun taas ICAM-l:llä on viisi Ig-kaltaista aluetta (Staunton, D.E., et ai.. Cell 21:925-933 (1988); Simmons, D., et ai.. Nature 331:624-627 (1988)). Merkittävästi, ICAM-2 muistuttaa huomattavasti enemmän ICAM-l:n kahta lähinnä N-päätyä sijaitsevaa aluetta (34 %:n homologia) 9 100994 kuin kumpikaan ICAM-1 tai ICAM-2 muistuttaa muita Ig-superryhmän jäseniä, mikä osoittaa Ig-kaltaisten ligandien alaryhmän olemassa olon, jonka jäsenet sitoutuvat samaan integriiniryhmäresepto-riin.

III. ICAM-2:n cDNA-kloonaus ICAM-2-geenin kloonaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista menettelytavoista. Erään tällaisen menetelmän mukaan analysoidaan cDNA-inserteistä (jotka on saatu ICAM-2:n ilmentävistä soluista) koostuvaa sukkulavektorikirjastoa sellaisen insertin läsnäolon suhteen, joka sisältäisi ICAM-2-geenin. Tällainen analyysi voidaan suorittaa transfektoimalla solut vektorilla ja määrittämällä sitten ICAM-2:n ilmentyminen.

ICAM-2-cDNA identifioidaan edullisesti käyttämällä uutta muunnosta Aruffon ja Seedin menettelytavasta (Seed, B., et ai..

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365-3369 (1987)) kiinnikemole-kyylien ligandien tunnistamiseksi. Tämän menetelmän mukaan valmistetaan cDNA-kirjasto ICAM-2:n ilmentävistä soluista (kuten endoteelisoluista tai Ramos-, BBN-B-varhaisimusolu-, U937-mono-syytti-, tai SKW3-varhaisimusolusolulinjöistä). Edullisesti cDNA-kirjasto valmistetaan endoteelisoluista. Tällä kirjastolla transfektoidaan soluja, jotka eivät normaalisti ilmennä ICAM-2:ta (kuten COS-solut). Transfektoituja soluja siirretään petri-maljaan, joka on edeltäpäin päällystetty LFA-l:llä. COS-solut, jotka on transfektoitu joko ICAM-1:tä tai ICAM-2:ta koodattavilla sekvensseillä ja jotka ilmentävät jommankumman näistä ligan-deista solupinnoillaan, kiinnittyvät LFA-l:een petrimaljapinnal-la. Ei-kiinnittyneet solut pestään pois, minkä jälkeen kiinnittyneet solut poistetaan petrimaljasta jatkoviljeltäviksi. ICAM-l:n tai ICAM-2:n ilmentävät yhdistelmäsekvenssit poistetaan sitten näistä soluista ja sekventoidaan sen selvittämiseksi, koodittaako sekvenssi ICAM-1:tä vai ICAM-2:ta.

100994 10

Edellä kuvatun menetelmän edullisessa suoritusmuodossa ICAM-1-vastaista vasta-ainetta lisätään petrimaljaan ICAM-1:n ilmentävien solujen kiinnittymisen estämiseksi. ICAM-2:lla transfektoi-tujen COS-solujen sitoutumisen LFA-l:een estävät EDTA ja LFA-1-vastainen monoklonaalinen vasta-aine ("MAb"), mutta sitä ei estä ICAM-1-vastainen MAb. Täten tässä suoritusmuodossa ICAM-l:n ilmentävät solut eivät kykene kiinnittymään petrimaljaan ICAM-l:n välityksellä ja tulevat siksi valtaosin pestyiksi pois yhdessä muiden ei-kiinnittyvien solujen kanssa. Seurauksena tästä vain ICAM-2:n ilmentävät solut kykenevät kiinnittymään petrimaljaan.

Täten cDNA-kloonit seulotaan ilmentämällä ne COS-soluissa sekä seulomalla esiin ligandin käsittävät COS-solut käyttämällä funktionaalisesta aktiivista, puhdistettua LFA-l:tä, joka on edeltäpäin sidottu petrimaljoihin. Seulonnan jälkeen ei-kiinnittyneiden solujen joukossa ei ole juuri lainkaan ICAM-2+-soluja, kun taas kiinnittyneet solut, jotka irrotetaan LFA-l-päällysteisestä muovista EDTA-liuoksella, ovat lähes yksinomaan ICAM-2+-tyyppiä. ICAM-1+-solujen kiinnittyminen LFA-l-päällysteiseen muoviin voidaan estää ICAM-l-vastaisella MAb:llä RR1/1.

Täten tämän menetelmän mukaan ICAM-2-cDNA:n kloonaamiseksi valmistetaan cDNA-kirjasto endoteelisoluista, jotka käsittävät LFA-1:stä riippuvaisen kiinnittymisen sekä ICAM-l-riippuvaisen että ICAM-l:stä riippumattoman komponentin (Dustin, M.L., et ai. . J. Cell. Biol. 107;321-331 (1988)), käyttäen sopivaa plasmidia, kuten plasmidivektoria CDM8. Transfektoituja COS-soluja inkuboidaan LFA-l:llä päällystetyissä petrimaljoissa ICAM-1-vastaisen MAb:n läsnäollessa, millä pienennetään todennäköisyyttä sille, että eristetyksi tulee ICAM-l-cDNA-sekvenssejä. Kiinnittyneet solut eluoidaan EDTA-liuoksella eroon, minkä jälkeen plasmidit eristetään ja niitä vahvistetaan E. colissa. Noin kolmen kierroksen, jotka käsittävät transfektoinnin, kiinnittämisen ja plasmidin eristämisen, sekä yhden kokofraktioinnin " jälkeen plasmideja voidaan analysoida restriktioendonukleaaseil- 100994 11 la pilkkomalla. Noin 1/3 plasmideista, jotka sisältävät kooltaan yli 1,0 ke-.n inserttejä, kiinnittyi LFA-l:een COS-soluihin transfektoituina.

Vaihtoehtoisesti ICAM-2-cDNA-klooni voidaan saada käyttämällä geneettistä koodia (Watson, J.D., kirjassa Molecular Biology of the Gene. 3. painos, toim. W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977, ss. 356-357) sellaisen polynukleotidisekvenssin määrittämiseksi, joka pystyy koodittamaan ICAM-2-proteiinia.

ICAM-2-cDNA-klooni voidaan saada myös tunnistamalla ICAM-2-proteiinin peptidifragmenttien aminohapposekvenssejä ja sitten käyttämällä geneettistä koodia oligonukleotidikoetinmolekyylien rakentamiseksi, jotka kykenevät koodittamaan ICAM-2-peptidin. Koettimia käytetään sitten niiden cDNA-kirjasto- (joka valmistetaan ICAM-2:n ilmentävien solujen cDNA:sta) jäsenien toteamiseksi (hybridoimalla), jotka koodattavat ICAM-2-proteiinin.

Käyttämällä edellä kuvattuja, tai niitä muistuttavia, tekniikoita on menestyksekkäästi onnistuttu kloonaamaan ihmisen aldebydi-dehydrogenaasien geenejä (Hsu, L.C., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3771-3775 (1985)), fibronektiinigeenejä (Suzuki, S., St.ai./ Eur. Mol. Biol. Oraan. J. 4:2519-2524 (1985)), ihmisen estrogeenireseptorigeeni (Walter, P., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 02.'· 7889-7893 (1985)), kudostyypin plasminogeeniakti-vaattorigeenejä (Pennica, D., et ai.. Nature 301:214-221 (1983)) ja ihmisen istukan alkalista fosfataasigeeniä komplementoiva DNA (Kam, W., St ai.> Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8715-8719 (1985)) .

Edelleen seuraava vaihtoehtoinen tapa ICAM-2-geenin kloonaamiseksi on valmistaa ilmennysvektorikirjasto kloonaamalla DNA:ta, tai edullisemmin cDNArta, solusta, joka kykenee ilmentämään ICAM-2:n, ilmennysvektoriin. Sitten kirjasto seulotaan jäseniensä suhteen, jotka kykenevät ilmentämään proteiinin, joka : sitoutuu ICAM-2-vastaiseen vasta-aineeseen ja jota vastaava 100994 12 nukleotidisekvenssi kykenee koodittamaan polypeptidejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-2:lla tai jollain ICAM-2-fragmentilla.

Kloonattu ICAM-2-geeni, joka on saatu millä tahansa edellä kuvatulla menetelmällä, voidaan operatiivisesti kytkeä ilmennys-vektoriin ja viedä bakteerisoluun tai eukaryoottisiin soluihin ICAM-2-proteiinin tuottamiseksi. Tekniikoita tällaisia menettelyitä silmälläpitäen esittävät Maniatis, T., et ai.. supra. ja nämä tekniikat ovat alalla erittäin tunnettuja.

IV. KEKSINNÖN MUKAISET VAIKUTTAVAT AINEET: ICAM-2 JA SEN FUNKTIONAALISET JOHDANNAISET, AGONISTIT JA ANTAGONISTIT

Esillä oleva keksintö koskee ICAM-2:ta, sen "funktionaalisia johdannaisia" ja sen "agonisteja" ja antagonisteja".

A. ICAM-2:n funktionaaliset johdannaiset ICAM-2:n funktionaalinen johdannainen on yhdiste, jolla on biologista aktiivisuutta (joko funktionaalista tai rakenteellista), joka on oleellisesti samanlaista kuin ICAM-2:n biologinen aktiivisuus. Ilmaisun "funktionaalinen johdannainen" tarkoitetaan kattavan molekyylin "fragmentit", "variantit", "analogit" tai "kemialliset johdannaiset".

Jonkin molekyylin, kuten ICAM-2:n, "fragmentilla" tarkoitetaan molekyylin mitä tahansa polypeptidialaryhmää. Erityisen edullisia ovat ICAM-2-fragmentit, joilla on ICAM-2-aktiivisuutta ja jotka ovat liukoisia (eli eivät ole sitoutuneet membraaniin).

Molekyylin, kuten ICAM-2:n, "variantilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on oleellisesti samanlainen rakenteensa ja funktionsa osalta kuin joko koko kyseinen molekyyli tai sen fragmentti.

13 100994

Molekyylin, kuten ICAM-2:n, "analogilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on oleellisesti samanlainen funktionsa osalta kuin joko koko kyseinen molekyyli tai sen fragmentti.

Molekyyliä sanotaan "oleellisesti samanlaiseksi" kuin toinen molekyyli, jos molekyylien rakenteet ovat oleellisesti samanlaiset tai jos niillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Täten edellyttäen, että kahdella molekyylillä on samanlainen aktiivisuus, ne katsotaan varianteiksi, koska tätä ilmaisua käytetään tässä yhteydessä, vaikka yhden molekyyleistä rakenne ei esiintyisikään toisessa, tai vaikka aminohappojäännöksien muodostamat sekvenssit eivät olisikaan identtiset.

Tässä käytettynä molekyylin sanotaan olevan toisen molekyylin "kemiallinen johdannainen", kun se sisältää ylimääräisiä kemiallisia ryhmiä, jotka eivät normaalisti ole osa kyseistä molekyyliä. Tällaiset ryhmät saattavat parantaa molekyylin liukoisuutta, imeytymistä, biologista puoliintumisaikaa jne. Nämä ryhmät voivat vaihtoehtoisesti vähentää molekyylin myrkyllisyyttä, poistaa tai heikentää molekyylin mahdollista epätoivottavaa sivuvaikutusta jne. Tällaisia vaikutuksia aikaansaamaan kykeneviä ryhmiä esitetään kirjassa Remington1 s Pharmaceutical Sciences. 1980.

Molekyylien "toksiinijohdannaiset" muodostavat "kemiallisten johdannaisten" erityisluokan. Molekyylin "toksiinijohdannainen" on molekyyli (kuten ICAM-2 tai vasta-aine), joka sisältää tok-siiniosuuden. Tällaisen molekyylin sitoutuminen soluun vie tok-siiniosuuden lähelle solua, jolloin viimemainittu edistää solun kuolemista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa toksiiniosuut-ta; kuitenkin edullisesti käytetään esimerkiksi seuraavia toksiineja: risiinitoksiini, koleratoksiini, difteriatoksiini, radio-isotooppitoksiinit, membraanikäytävän muodostavat toksiinit jne. Menettelyitä tällaisten osuuksien kytkemiseksi molekyyliin tunnetaan alalla.

100994 14 ICAM-2:n funktionaalisia johdannaisia, jotka sisältävät korkeintaan noin 100 jäännöstä, voidaan kätevästi valmistaa in vitro -synteesillä. Haluttaessa tällaisia fragmentteja voidaan modifioida saattamalla puhdistetun tai epäpuhtaan proteiinin kohdeami-nohappojäännökset reagoimaan orgaanisen johdannaismuodostusyh-disteen kanssa, joka kykenee reagoimaan selektiivisten sivuketjujen tai päätyjäännöksien kanssa. Saatuja kovalenttisia johdannaisia voidaan käyttää jäännöksien tunnistamiseksi, jotka ovat tärkeitä biologiselle aktiivisuudelle.

Kysteinyylijäännökset saatetaan tavallisimmin reagoimaan a-halo-geeniasetaattien (ja vastaavien amiinien) kanssa, kuten kloori-etikkahapon tai klooriasetamidin kanssa, karboksimetyyli- tai karboksiamidometyylijohdannaisten saamiseksi. Kysteinyylijäännöksistä muodostetaan johdannaisia myös saattamalla ne reagoimaan bromitrifluoriasetonin, a-bromi-β-(5-imidatsoyyli)propioni-hapon, klooriasetyylifosfaatin, N-alkyylimaleimidien, 3-nitro-2-pyridyylidisulfidin, metyyli-2-pyridyylidisulfidin, p-kloorielohopeabentsoaatin, 2-kloorielohopea-4-nitrofenolin tai kloori-7-nitrobentso-2-oksa-l,3-diatsoiin kanssa.

Histidyylijäännöksistä muodostetaan johdannaisia saattamalla ne reagoimaan dietyyliprokarbonaatin kanssa pH:ssa 5,5 - 7,0, koska tämä yhdiste on verraten spesifinen histidyylisivuketjulle. Para-bromifenasyyli on myös käyttökelpoinen; reaktio suoritetaan edullisesti 0,1 M natriumkakodylaattiliuoksessa pH:ssa 6,0.

Lysinyyli- ja aminopäätyjäännökset saatetaan reagoiman meripih-kahappoanhydridin tai muiden karboksyylihappoanhydridien kanssa.

.. Johdannaismuodostuksen näitä yhdisteitä käyttämällä vaikutuksesta lysinyylijäännöksien varaus muuttuu vastakkaismerkkiseksi. Muita sopivia reagensseja johdannaisten muodostamiseksi a-aminon sisältävistä jäännöksistä ovat imidoesterit kuten metyylipiko-liinimidaatti; pyridoksaalifosfaatti; pyridoksaali; klooriboro-hydridi; trinitrobentseenisulfonihappo; O-metyyli-isourea; 2,4- 100994 15 pentaanidioni; ja johdannaisen muodostaminen transaminaasilla katalysoidussa reaktiossa glyoksylaatin kanssa.

Arginyylijäännöksiä modifioidaan saattamalla ne reagoimaan yhden tai useamman tavanomaisen reagenssin kanssa, joita ovat esimerkiksi fenyyliglyoksaali, 2,3-butaanidioni, 1,2-sykloheksaanidio-ni ja ninhydriini. Johdannaisten muodostaminen arginiinijäännöksistä edellyttää, että reaktio suoritetaan aikalisissä olosuhteissa, mikä johtuu funktionaalisen guanidiiniryhmän korkeasta pKa-arvosta. Lisäksi nämä reagenssit saattavat reagoida arginii-nin epsilon-aminoryhmän ohella lysiiniryhmien kanssa.

Tyrosyylijäännöksien spesifistä modifiointia sinänsä on laajalti tutkittu, jolloin erityistä kiinnostusta on kohdistettu spektri-leimojen liittämiseen tyrosyylijäännöksiin saattamalla ne reagoimaan aromaattisten diatsoniumyhdisteiden tai tetranitrometaa-nin kanssa. Tavallisimmin käytetään N-asetyyli-imidatsolia ja tetranitrometaania O-asetyylityrosyylimuodon ja vastaavasti 3-nitrojohdannaisten saamiseksi. Tyrosyylijäännökset jodataan käyttämällä 125I:tä tai 131I:tä leimattujen proteiinien valmistamiseksi radioimmuunimäärityksessä käytettäviksi, missä sopii käytettäväksi kloramiini-T-menetelmä.

Karboksyylisivuryhmiä (aspartyyli tai glutamyyli) modifioidaan selektiivisesti saattamalla ne reagoimaan karbodi-imidien (R'-N-C-N-R') kuten l-sykloheksyyli-3-(2-morfolinyyli-(4-etyyli)karbodi-imidin tai l-etyyli-3-(4-atsonia-4,4-dimetyyli-pentyyli)karbodi-imidin kanssa. Lisäksi aspartyyli- ja glutamyyli jäännökset muutetaan asparaginyyli- ja glutaminyylijäännöksik-·. si saattamalla ne reagoimaan ammoniumionien kanssa.

Johdannaisen muodostaminen bifunktionaalisia yhdisteitä käyttämällä soveltuu funktionaalisen ICAM-2-johdannaismolekyylin ris-tikytkemiseksi ei-vesiliukoiseen kantajamatriisiin tai -pintaan käytettäväksi menetelmässä funktionaalisten ICAM-2-johdannaisten fuusiopolypeptidien lohkomiseksi lohkotun polypeptidin irrotta- 16 100994 miseksi ja talteen saamiseksi. Tavanomaisesti käytettyjä risti-kytky-yhdisteitä ovat esim. 1,1-bis(diatsoasetyyli)-2-fenyyli-etaani, glutaarialdehydi, N-hydroksisukkinimidiesterit, esimerkiksi 4-atsidosalisyylihapon kanssa muodostetut esterit, homobi-funktionaaliset imidoesterit, mukaan lukien disukkinimidyylies-terit kuten 3,3'-ditiobis(sukkinimidyylipropionaatti), ja bi-funktionaaliset maleimidit kuten bis-N-maleimido-1,8-oktaani. Sellaisilla johdannaismuodostusyhdisteillä kuten metyyli-3-[(p-atsidofenyyli)ditio]propionimidaatti saadaan valolla aktivoitavia välituotteita, jotka kykenevät muodostamaan ristisidok-sia valon läsnäollessa. Vaihtoehtoisesti proteiinin immobilisoi-miseksi käytetään reaktiivisia ei-vesiliukoisia matriiseja kuten syaanibromidilla aktivoituja hiilihydraatteja ja reaktiivisia substraatteja, joita kuvataan US-patenttijulkaisuissa n:ot 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; ja 4,330,440.

Glutaminyyli- ja asparaginyylijäännökset deaminoidaan usein vastaaviksi glutamyyli- ja aspartyylijäännöksiksi. Vaihtoehtoisesti nämä jäännökset deaminoidaan lievästi happamissa olosuhteissa. Näiden jäännöksien kumpi tahansa muoto kuuluu tämän keksinnön piiriin.

Muita modifikaatioita ovat proliinin ja lysiinin hydroksylaatio, seryyli- tai treonyylijäännöksien fosforylaatio, lysiini-, argi-niini- ja histidiinisivuketjujen alfa-aminoryhmien metylointi (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties.

W.H. Freeman & Co., San Francisco, ss. 79-86, 1983), N-pääty-amiinin asetylointi ja joissain tapauksissa C-päätykarboksyyli-* ryhmien amidointi.

ICAM-2:n funktionaalisia johdannaisia, joiden aminohapposekvenssiä on muutettu, voidaan valmistaa myös mutatoimalla DNA:ta. ICAM-2-geeniä koodittava nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 2. Tällaisia variantteja ovat esimerkiksi kuviossa 2 esitetyn mukaiseen aminohapposekvenssiin suoritetut deleetiot tai inser- 100994 17 tiot tai substituutiot. Lopulliseen rakenteeseen pääsemiseksi voidaan suorittaa myös mikä tahansa deleetion, insertion ja substituution yhdistelmä edellyttäen, että lopullisella rakenteella on haluttu aktiivisuus. Ilmeistä on, että varianttia koodittavaan DNArhan tehdyt muutokset eivät saa siirtää sekvenssiä pois lukualueelta, jolloin ne myöskään eivät edullisesti aikaansaa komplementaarisia alueita, jotka voisivat tuottaa sekundaarisen mRNA-rakenteen (katso EP-hakemusjulkaisu n:o 75,444) .

Geneettisellä tasolla nämä funktionaaliset johdannaiset valmistetaan tavallisesti suorittamalla nukleotidien paikkaohjautuva mutatointi ICAM-2-molekyyliä koodittavassa DNArssa kyseistä funktionaalista johdannaista koodittavan DNA:n saamiseksi, minkä jälkeen saatu DNA ilmennetään yhdistelmäsoluviljelmässä. Funktionaaliset johdannaiset osoittavat tyypillisesti samaa kvalitatiivista biologista aktiivisuutta kuin luontaisesti esiintyvä analogi. Ne saattavat kuitenkin erota huomattavasti näissä ominaispiirteissä normaalisti tuotetusta ICAM-2-molekyylistä.

Vaikka kohta, johon aminohapposekvenssivariaatio tehdään, määritetään ennalta, mutaation sinänsä ei tarvitse olla ennalta määrätty. Esimerkiksi mutaation tietyssä kohdassa antaman tuloksen optimoimiseksi voidaan suorittaa satunnaismutatointi kohde-kodonissa tai -alueella ja seuloa sitten ilmentyvät funktionaaliset ICAM-2-johdannaiset halutun aktiivisuuden optimiyhdistel-män saamiseksi. Tekniikoista substituutiomutaatioiden suorittamiseksi ennalta määrättyihin kohtiin DNA-.ssa, jonka sekvenssi tunnetaan, ollaan alalla hyvin selvillä, jolloin esimerkkinä mainitaan paikkaspesifinen mutatointi.

Tämän mukaisesti ICAM-2:n funktionaalinen johdannaismolekyyli valmistetaan edullisesti käyttämällä sellaisen DNA:n paikka-spesifistä mutatointia, joka koodittaa proteiinin aiemmin valmistettua funktionaalista johdannaista tai sen ei-varianttimuo-toa. Paikkaspesifistä mutatointia käyttämällä voidaan valmistaa 18 100994 ICAM-2:n funktionaalisia johdannaisia käyttämällä spesifisiä oligonukleotidisekvenssejä, jotka koodattavat halutun mutaation käsittävää DNA-sekvenssiä, sekä riittävää määrää viereisiä nukleotideja riittävän kokoisen ja sekvenssiltään riittävän kompleksisen alukesekvenssin saamiseksi stabiilin dupleksin muodostamiseksi ylitettävän deleetioliitoksen kummallekin puolelle. Tyypillisesti edullinen on aluke, jonka pituus on noin 20 - 25 nukleotidia, jolloin muutetaan noin 5-10 jäännöstä sekvenssi-liitoksen kummaltakin puolelta. Yleensä ottaen paikkaspesifisen mutatoinnin tekniikka on alalla hyvin tunnettu kuten ilmenee esimerkiksi julkaisusta Adelman, et ai. . DNA 2.:183 (1983), joka liitetään tähän viitteeksi.

Kuten tiedetään, paikkaspesifisessä mutatointitekniikassa käytetään tyypillisesti faagivektoria, joka esiintyy sekä yksi-että kaksisäikeisessä muodossa. Tyypillinen vektori, joka soveltuu paikkaohjautuvaan mutatointiin, on esimerkiksi M13-faagi, kuten julkistaneet Messing et ai.. Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, toim. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), joka liitetään tähän viitteeksi. Tällaisia faageja on vaikeuksitta kaupallisesti saatavana ja alan ammattilaiset ovat yleensä hyvin perillä niiden käytöstä. Vaihtoehtoisesti yksisäikeisen DNA:n saamiseksi voidaan käyttää plasmidi-vektoreita, jotka sisältävät yksisäikeisen faagin replikaatio-alkukohdan (Veira et ai.. Meth. Enzvmol. 153:3 (1987)).

Yleensä ottaen tässä paikkaohjautuva mutatointi suoritetaan muodostamalla ensin yksisäikeinen vektori, joka sisältää sekvenssissään haluttua proteiinia koodattavan DNA-sekvenssin. Oligo-nukleotidialuke, joka sisältää halutun mutatoidun sekvenssin, valmistetaan yleensä synteettisesti, esimerkiksi käyttämällä Crea et ai. . Proc. Natl. Acad. Sei, USA 25.:5765 (1978), menetelmää. Tämä aluke juotetaan sitten yksisäikeiseen, proteiinisek-venssin sisältävään vektoriin ja tuotetta käsitellään DNA:ta polymeroivilla entsyymeillä kuten E. coli-polymeraasi-I:n Klenow-fragmentti, mutaation käsittävän säikeen synteesin lop 100994 19 puunsaattamiseksi. Täten mutatoitu sekvenssi ja toinen säie käsittävät halutun mutaation. Tällä heterodupleksivektorilla transformoidaan sitten sopivia soluja, kuten JMlOl-soluja, ja valikoidaan kloonit, jotka sisältävät mutatoidun sekvenssijärjestelyn käsittäviä yhdistelmävektoreita.

Sitten kun klooni on valittu, mutatoitu proteiinialue voidaan poistaa ja sijoittaa sopivaan vektoriin proteiinin tuottamiseksi, yleensä sen tyyppiseen ilmaisuvektoriin, joka soveltuu tarkoituksenmukaisen isännän transformointiin.

Aminohappodeleetiot käsittävät yleensä noin 1-30 jäännöstä, edullisemmin 1-10 jäännöstä, ja tyypillisesti ovat jatkuvia. Deleetiot voivat niinikään käsittää immunoglobuliinialueen, kuten ICAM-2:n alue 1 tai 2. Aminohappoinsertioita ovat amino-ja/tai karboksyylipäätyfuusiot, jotka käsittävät pituudeltaan aikeen yhdestä jäännöksestä oleellisesti rajoittamattoman mittaisen polypeptidin, sekä yhden tai useamman aminohappojäännöksen insertio ketjun sisälle. Ketjunsisäiset insertiot (eli insertiot, jotka suoritetaan ICAM-2-molekyylin täydellisen sekvenssin sisäpuolelle) voivat yleensä käsittää noin 1-10 jäännöstä, edullisemmin 1-5 jäännöstä. Esimerkki päätyinser-tiosta on signaalisekvenssin, joka on isäntäsoluun nähden joko heterologinen tai homologinen, fuusio molekyylin N-päätyyn ICAM-2:n funktionaalisen johdannaisen erityksen yhdistelmäisännästä helpottamiseksi.

Kolmannen ryhmän funktionaalisia johdannaisia muodostavat johdannaiset, joissa ICAM-2-molekyylin ainakin yksi aminohappojäännös, ja edullisesti vain yksi, on poistettu ja toinen jäännös insertoitu sen paikalle. Tällaiset substituutiot suoritetaan edullisesti seuraavan taulukon mukaan haluttaessa hienosäätää ICAM-2-molekyylin ominaispiirteitä.

20 100994 TAULUKKO 1

Alkuperäinen jäännös Korvausesimerkki

Ala gly; ser

Arg lys

Asn gin; his

Asp glu

Cys ser

Gin asn

Glu asp

Gly ala; pro

His asn; gin

Ile leu; vai

Leu ile; vai

Lys arg; gin; glu

Met leu; tyr; ile

Phe met; leu; tyr

Ser thr

Thr ser

Trp tyr

Tyr trp; phe

Vai ile; leu

Huomattavia muutoksia funktionaaliseen tai immunologiseen identiteettiin tehdään valitsemalla rohkeampia substituutioita kuin esitetty taulukossa 1, eli valitsemalla jäännöksiä, jotka poikkeavat vaikutukseltaan enemmän suhteessa (a) polypeptidirungon rakenteen säilymiseen substituutio-alueella, esimerkiksi levy-tai heeliks-konformaationa, (b) molekyylin varaukseen tai hybro-“ fobisuuteen kohdekeskuksessa, tai (c) sivuketjun kokoon. Todennäköisiä substituutioita ovat yleensä korvaukset, joissa (a) glysiini ja/tai proliini korvataan toisella aminohapolla tai poistetaan tai insertoidaan; (b) hybrofiilinen jäännös, esim. seryyli tai treonyyli, sijoitetaan hybrofobisen jäännöksen tilalle (tai korvataan viimemainitulla), jolloin vaihtoparina 100994 21 voi olla esim. leusyyli, isoleusyyli, fenyylialanyyli, valyyli tai alanyyli; (c) kysteiinijäännös sijoitetaan muun jäännöksen tilalle (tai korvataan muulla jäännöksellä); (d) jäännös, jolla on elektropositiivinen sivuketju, esim. lysyyli, arginyyli tai histidyyli, sijoitetaan jäännöksen, jolla on negatiivinen sähkö-varaus, tilalle (tai korvataan viimemainitulla), jolloin vaihto-parina voi olla esim. glutamyyli tai aspartyyli; tai (e) jäännös, jolla on suurikokoinen sivuketju, esim. fenyylialaniini, sijoitetaan jäännöksen, jolla ei ole tällaista sivuketjua, tilalle (tai korvataan viimemainitulla), jolloin vaihtoparina voi olla esim. glysiini.

Useimpien deleetioiden ja insertioiden, ja erityisesti substituutioiden, ei odoteta aiheuttavan radikaaleja muutoksia ICAM-2-molekyylin ominaispiirteisiin. Kuitenkin silloin, kun substituution, deleetion tai insertion vaikutusta on vaikea ennen sen tekemistä ennustaa täsmällisesti, alan ammattilainen huomaa, että vaikutuksen voi arvioida tavanomaisissa seulontakokeissa. Esimerkiksi funktionaalinen johdannainen valmistetaan tyypillisesti suorittamalla natiivia ICAM-2-molekyyliä koodittavan nukleiinihapon paikkaspesifinen mutatointi, ilmentämällä variantti-nukleiinihappo yhdistelmäsoluviljelmässä ja mahdollisesti puhdistamalla se soluviljelmästä, esimerkiksi käyttämällä immuuni-affiniteettiadsorptiota ICAM-2-molekyylin vastaisen vasta-aineen käsittävään kolonnimateriaaliin (funktionaalisen johdannaisen absorboimiseksi sitomalla se ainakin yhteen jäljellä olevaan immuuniepitooppiin).

Mutaatioita, joiden on määrä lisätä ICAM-2:n affiniteettia, . voidaan ohjata liittämällä mukaan aminohappojäännöksiä, jotka esiintyvät homologisissa asemissa ICAM-l:ssä. Vastaavasti voidaan valmistaa mutantti-ICAM-2-molekyylejä, joista puuttuu N-kytketty CHO homologisissa asemissa ICAM-l:ssä.

Solulysaatin tai puhdistetun funktionaalisen ICAM-l-molekyyli-: johdannaisen aktiivisuus seulotaan sitten halutun ominaispiir- 22 100994 teen suhteen sopivalla seulonta-analyysilla. Esimerkiksi muutos funktionaalisen johdannaisen immunologisessa luonteessa, kuten sen affiniteetissa tietyn vasta-aineen suhteen, mitataan käyttämällä kilpailevaa tyyppiä edustavaa immuunimääritystä. Muutoksia immunomodulaattoriaktiivisuudessa mitataan käyttäen tarkoituksenmukaista määritystä. Muutoksia proteiinin sellaisissa ominaisuuksissa kuten redoks- tai lämpöstabiilisuus, biologinen puoliintumisaika, hydrofobisuus, alttius proteolyyttiselle hajoamiselle tai taipumus aggregoitua kantajiin tai multimeereiksi määritetään menetelmillä, jotka alan keskimääräinen taitaja hyvin hallitsee.

B. ICAM-2:n agonistit ja antagonistit ICAM-2:n "agonisti" on yhdiste, joka tehostaa tai lisää ICAM-2:n kykyä suorittaa sen minkä tahansa biologisen funktion. Esimerkki tällaisesta agonistista on yhdiste, joka lisää ICAM-2:n kykyä sitoutua solureseptoriin tai virusproteiiniin.

ICAM-2:n "antagonisti" on yhdiste, joka alentaa tai estää ICAM-2:n kykyä suorittaa sen minkä tahansa biologisen funktion. Esimerkkejä tällaisista antagonisteista ovat ICAM-1, ICAM-l:n funktionaaliset johdannaiset, ICAM-2-vastainen vasta-aine, LFA-1-vastainen vasta-aine jne.

Soluaggregaatiomäärityksillä, joita kuvataan US-hakemusjulkaisuissa sarja n:ot 07/045,963; 07/115,798; 07/155,943; 07/189,815; ja 07/250,446, jotka kaikki hakemusjulkaisut kokonaisuudessaan on sisällytetty tähän viitteiksi, kyetään mittaa-·. maan LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, ja niitä voidaan käyttää yhdisteiden tunnistamiseksi, joilla on vaikutusta ICAM-2/LFA-1-aggregsation asteeseen. Täten näitä määrityksiä voidaan käyttää ICAM-2:n agonistien ja antagonistien tunnistamiseksi. Antagonistit voivat vaikuttaa heikentämällä LFA-1:n tai ICAM-2:n kykyä välittää aggregeatiota. Lisäksi voidaan tutkia ei-immunoglobu-liini- (eli kemiallisia) yhdisteitä käyttäen edellä kuvattua 100994 23 määritystä sen määrittämiseksi, ovatko kyseiset yhdisteet ICAM-2/LFA-l-aggregaation agonisteja vai antagonisteja.

C. ICAM-2-vastainen vasta-aine

Esillä olevan keksinnön mukainen edullinen immunoglobuliini-antagonisti on ICAM-2-vastainen vasta-aine. Sopivia vasta-aineita voidaan saada lukuisilla eri tavoilla.

ICAM-2:n kaltaiset antigeenimolekyylit ilmentyvät luontaisesti imusolujen pinnalla. Näin muodoin viemällä tällaisia soluja sopivaan eläimeen, esimerkiksi vatsaonteloon ruiskuttamalla jne., saadaan tuotetuksi vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-2:een tai CD-18-molekyyliryhmän jäseniin. Haluttaessa tällaisesta eläimestä voidaan eristää seerumia käytettäväksi näihin molekyyleihin sitoutumaan kykenevien polyklonaalisten vasta-aineiden lähteenä.

Vaihtoehtoisesti ICAM-2-vastaisia vasta-aineita voidaan tuottaa soveltamalla Seldenin, R.F. (EP-hakemusjulkaisu n:o 289,034) tai Seldenin, R.F., et ai. (Science 236:714-718 (1987)) menetelmää. Tämän menetelmän sanotun sovellutuksen mukaan sopivasta eläimestä (kuten esimerkiksi hiirestä jne.) saadut solut transfektoi-daan vektorilla, joka kykenee ilmentämään joko ehyen ICAM-2-molekyylin tai ICAM-2-fragmentin. Eläimen transfektoitujen solujen tuottaessa ICAM-2:ta eläin kehittää immuunivasteen, mikä johtaa ICAM-2-vastaisten vasta-aineiden muodostumiseen kyseisessä eläimessä.

Vaihtoehtoisesti ICAM-2-vastaisia vasta-aineita voidaan valmistaa viemällä ICAM-2, tai sen peptidifragmentti, sopivaan eläimeen. Immunoitu eläin tuottaa polyklonaalista vasta-ainetta vasteena tällaiseen altistukseen. Käyttämällä ICAM-2-peptidi-fragmentteja voidaan saada aluespesifisiä vasta-aineita, jotka reagoivat vain epitoopin tai epitooppien kanssa, jotka sisältyivät eläintä immunoitaessa käytettyihin peptidifragmentteihin.

100994 24

Edullisesti kuitenkin eläimistä (jotka on immunoitu jollain edellä kuvatulla tavalla) otetaan pernasoluja, jotka fuusioidaan myeloomasolulinjaan, minkä jälkeen saatujen fuusiosolujen annetaan muodostaa hybridoomasolu, joka erittää ICAM-2:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita.

Edellä kuvatun mukaisesti saadut hybridoomasolut voidaan seuloa jollain lukuisista menetelmistä haluttujen, ICAM-2:een sitoutuman kykenevää vasta-ainetta erittävien hybridoomasolujen tunnistamiseksi. Edullisessa seulontamäärityksessä tällaiset molekyylit tunnistetaan niiden kyvystä estää ICAM-2:n ilmentävien, ICAM-l:n ei-ilmentävien solujen aggregaatio. Tämän aggregaation estämään kykenevät vasta-aineet seulotaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, estävätkö ne kyseisen aggregaation sitoutumalla ICAM-2:een vai CD-18-molekyyliryhmän johonkin jäseneen. Tällaisessa seulonnassa voidaan käyttää mitä tahansa tapaa ICAM-2:n erottamiseksi CD-18-ryhmän molekyyleistä. Täten esimerkiksi vasta-aineen sitoma antigeeni voidaan määrittää käyttämällä immuunisaostusta ja elektroforeesia polyakryyliamidigeelissä.

Vasta-aineet, jotka sitoutuvat CD-18-molekyyliryhmän jäseniin, on mahdollista erottaa ICAM-2:een sitoutuvista seulomalla vasta-aineen kyvyn suhteen sitoutua soluihin, jotka ilmentävät LFA-1:n, mutta eivät ICAM-2:ta (tai päinvastoin). Vasta-aineen kyky sitoutua LFA-l:n mutta ei ICAM-2:ta ilmentävään soluun voidaan ' » todeta millä tahansa alan keskimääräisten taitajienkin tavanomaisesti käyttämällä tavalla. Tällaisia menettelyitä ovat immuunimääritykset (erityisesti sellaiset, joissa hyödynnetään immuunifluoresenssia), soluagglutinaatio, suodatinsitoutumisko-keet, vasta-ainesaostus jne.

«

Edellä kuvattujen ICAM-2:n funktionaalisten johdannaisten ohella muita aineita, joita voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisesti virustartunnan tai -tulehduksen hoitamiseksi, ovat ICAM-2-vastainen vasta-aine, ICAM-2-vastaisten vasta-aineiden anti-idiotyyppiset vasta-aineet ja reseptorimolekyylit tai 25 100994 tällaisten molekyylien fragmentit, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-2:een.

ICAM-2:n (tai ICAM-2:n funktionaalisten johdannaisten) vastaiset vasta-aineet, jotka soveltuvat käytettäviksi, voivat olla joko polyklonaalisia tai monoklonaalisia.

Esillä olevan keksinnön kannalta kiinnostavat anti-idiotyyppiset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan kilpaillen lCAM-2:n kanssa (tai sen syrjäyttäen). Tällaisia vasta-aineita voidaan saada esimerkiksi tuottamalla ICAM-2-vastaisen vasta-aineen vastainen vasta-aine, joka sitten seulotaan kyvyn suhteen sitoutua ICAM-2:n luontaiseen sitoutumisligandiin.

Koska CD-18-ryhmän molekyylit kykenevät sitoutumaan ICAM-2:een, antamalla näitä molekyylejä (esimerkiksi heterodimeereinä, joilla on sekä a- että β-alayksikkö, tai molekyyleinä, jotka koostuvat vain a-, tai vain β-alayksiköstä, tai molekyyleinä, jotka koostuvat jommastakummasta tai kummastakin alayksiköstä peräisin olevista fragmenteista) ne saadaan kilpailemaan HRV:n kanssa (tai syrjäyttämään se) sitoutumisessa solujen käsittämään ICAM-21:een.

Tämän keksinnön mukaiset aggregaation estävät vasta-aineet voidaan tunnistaa ja titrata jollain lukuisista eri tavoista. Esimerkiksi voidaan mitata vasta-aineiden kyky sitoutua diffe-rentiaalisesti soluihin, jotka ilmentävät ICAM-2:n (kuten aktivoidut endoteelisolut), ja niiden kyvyttömyys sitoutua soluihin, jotka eivät ilmennä ICAM-2:ta. Soluaggregaation määritykseen soveltuvat menetelmät, joita kuvataan UShakemusjulkaisuissa sarja n:ot 07/045,963; 07/115,798; 07/155,943; 07/189,815; ja 07/250,446, jotka kaikki hakemusjulkaisut kokonaisuudessaan on sisällytetty tähän viitteiksi. Vaihtoehtoisesti voidaan mitata vasta-aineiden kyky sitoutua ICAM-2reen tai ICAM-2-peptidifrag-mentteihin. Kuten alan keskimääräinenkin taitaja helposti havainnee, edeltäviä määrityksiä voidaan modifioida, tai ne voi 26 100994 daan suorittaa erilaisessa keskinäisessä järjestyksessä, jolloin saadaan joukko erilaisia mahdollisia seulontamäärityksiä, joista kullakin kyetään tunnistamaan ja erottamaan toisistaan vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een ja toisaalta CD-18-molekyyliryhmän jäseniin.

Edullisemmassa menetelmässä vasta-aine voidaan valita sen kyvyn suhteen sitoutua COS-soluihin, jotka ilmentävät ICAM-2:n, mutta ei COS-soluihin, jotka eivät ilmennä ICAM-2:ta.

D. Keksinnön mukaisten vaikuttavien aineiden valmistus Tämän keksinnön mukaiset vaikuttavat aineet voidaan saada tuloksena luontaisista prosesseista (kuten esimerkiksi indusoimalla eläin, kasvi, sieni, bakteeri jne., tuottamaan eiimmunoglobu-liini-ICAM-2-antagonistia tai indusoimalla eläin tuottamaan ICAM-2:een sitoutumaan kykeneviä polyklonaalisia vasta-aineita); synteettisillä menetelmillä (kuten esimerkiksi käyttämällä Merrifieldin menetelmää polypeptidien syntetisoimiseksi ICAM-2:n, ICAM-2:n funktionaalisten johdannaisten tai ICAM-2:n prote-iiniantagonistien (joko immunoglobuliini- tai eiimmunoglobu-liini-) syntetisoimiseksi; hybridoomatekniikkaa käytteen (kuten esimerkiksi ICAM-2:een sitoutumaan kykenevien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi); tai yhdistelmätekniikalla (kuten esimerkiksi tämän keksinnön mukaisten vaikuttavien aineiden tuottamiseksi erilaisissa isännissä (eli hiivoissa, bakteereissa, sienissä, nisäkässoluviljelmissä jne.), tai yhdistelmäplas-mideista tai virusvektoreista). Käytettävän menetelmän valinta on riippuvainen sellaisista tekijöistä kuten kätevyys, haluttu saanto jne. Tietyn tulehdusvastaisen yhdisteen tuottamiseksi ei välttämättä tarvitse käyttää vain yhtä edellä kuvatuista menetelmistä, prosesseista tai tekniikoista; edellä kuvattuja prosesseja, menetelmiä ja tekniikoita voidaan yhdistää tietyn vaikuttavan aineen saamiseksi.

27 100994

V. ICAM-2:n JA SEN FUNKTIONAALISTEN JOHDANNAISTEN, AGONISTIEN

JA ANTAGONISTIEN KÄYTTÄJÄ A. Tulehduksen tukahduttaminen

Esillä olevan keksinnön eräs näkökohta perustuu ICAM-2:n ja sen funktionaalisten johdannaisten kykyyn olla vuorovaikutuksessa CD-18-ryhmämolekyylien reseptorien, erityisesti LFA-l:n tai virusproteiinien kanssa (kuten nuhavirusproteiinien jne.)· Koska ICAM-2 kykenee olemaan vuorovaikutuksessa CD-18-glykoproteiini-ryhmän jäsenten kanssa, sitä voidaan käyttää tulehduksen tukahduttamiseksi (eli estämiseksi tai heikentämiseksi).

Ilmaisulla "tulehdus" tarkoitetaan tässä käytettynä sekä spesifisen puolustusjärjestelmän että ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktioita.

Tässä käytettynä ilmaisulla "spesifinen puolustusjärjestelmä" tarkoitetaan immuunijärjestelmän sitä osaa, joka reagoi spesifisten antigeenien läsnäoloon. Tulehduksen sanotaan olevan seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, sen välittää tai siihen liittyy spesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksista, jotka ovat seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, ovat antigeenivasteet esimerkiksi vihurirokkovirusta vastaan, autoimmuunisairaudet, T-solujen välittämä viivästynyt yliherkkyysvaste (joka esiintyy esimerkiksi Mantaux-kokeessa "positiivisen" tuloksen antavissa yksilöissä) jne. Krooniset tulehdussairaudet ja kudos- tai elinsiirteen hylkiminen ovat samoin esimerkkejä .. spesifisen puolustusjärjestelmän tulehdusreaktioista.

Tässä käytettynä "ei-spesifisen puolustusjärjestelmän" reaktiolla tarkoitetaan reaktiota, jota välittävät immunologista muistia vailla olevat valkosolut. Tällaisia soluja ovat jyvässolut ja syöjäsolut. Tässä tulehduksen sanotaan olevan seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen 28 100994 aiheuttaa, sitä välittää tai siihen liittyy eispesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksista, jotka ovat ainakin osittain seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktiosta, ovat tulehdukset, jotka liittyvät seuraavan kaltaisiin tiloihin: hengityksen vajaatoiminta (ARDS) tai monielin-vaurio-oireyhtymät, jotka ovat verenmyrkytyksen tai trauman sekundaarireaktioita; sydänlihaksen tai muun kudoksen reper-fuusiovamma; akuutti munuaiskerästen tulehdus; reaktiivinen niveltulehdus; ihotaudit, joihin liittyy akuutteja tulehduksellisia komponentteja; akuutti märkäinen aivokalvontulehdus tai muu keskushermoston tulehdussairaus; lämpövaurio; keinomunuaishoito; valkosolujen erotus; haavainen paksusuolen tulehdus,

Crohnin sairaus kuoliota aiheuttava suolistotulehdus; jyvässolu-transfuusioliitteiset oireyhtymät; ja sytokiinien aiheuttama myrkytys.

Kuten edellä esitetty, ICAM-2-molekyylien sitoutumisella CD-18-ryhmän molekyyleihin on keskeinen merkitys solukiinnittymisessä. Kiinnittymistapahtuman välityksellä valkosolut kykenevät jatkuvasti tarkkaileman eläintä vierasantigeenien läsnäolon varalta. Vaikka nämä tapahtumat ovat normaalisti toivottavia, ne ovat kuitenkin niinikään syypäitä elinsiirrehyljintään, kudossiirre-hyljintään ja moniin autoimmuunisairauksiin. Täten jokin keino, jolla kyetään heikentämään tai estämään solukiinnittymistä, olisi erittäin toivottava käytettäväksi elinsiirrevastaanotta-jilla (erityisesti munuaissiirtopotilailla), kudossiirrevas-taanottajilla ja autoimmuunisairauspotilailla.

CD-18-ryhmän jäsenten vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet estävät monia valkosolujen kiinnittymisriippuvaisia funktioita, mukaan lukien sitoutuminen endoteeliin (Haskard, D., et ai..

J. Immunol. 137:2901-2906 (1986)), homotyyppiset kiinnittymiset (Rothlein, R., et ai.. J. Exp. Med. 163:1132-1149 (1986)), antigeeni- ja mitogeeni-indusoitu imusolujen lisääntyminen (Davignon, D., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:4535-4539 (1981)), vasta-ainemuodostus (Fischer, A., et ai.. J. Immunol.

29 100994 136:3198-3203 (1986)), ja kaikkien valkosolujen effektorifunk-tiot, kuten sytotoksisten T-solujen lyyttinen aktiivisuus (Krensky, A.M., et ai.. J. Immunol. 132:2180-2182 (1984)), syöjäsolujen (Strassman, G., et ai.. J. Immunol. 136:4328-4333 (1986)), ja kaikkien solujen, jotka osallistuvat vasta-aine-riippuvaisiin solusytotoksisuusreaktioihin (Kohl, S., et ai..

J. Immunol. 133:2972-2978 (1984)). Kaikissa edeltävissä funktioissa vasta-aineet estävät valkosolun kykyä kiinnittyä sopivaan solusubstraattiin, mikä puolestaan estää lopullisen seurauksen. Tällaiset funktiot, sikäli niihin liittyy ICAM-2/LFA-l-vuorovai-kutuksia, voidaan tukahduttaa ICAM-2-vastaisella vasta-aineella.

Täten ICAM-2:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää tulehdusvastaisina aineina nisäkäskoh-teessa. Merkittävää on, että nämä vaikuttavat aineet poikkeavat tavanomaisista tulehdusvastaisista aineista siinä, että ne kykenevät selektiivisesti estämään kiinnittymisen, eivätkä tuo mukanaan sivuvaikutuksia, kuten myrkyllisyys munuaisille, joita tavataan tavanomaisten vaikuttavien aineiden yhteydessä.

Koska ICAM-2, erityisesti liukoisessa muodossa, kykenee vaikuttaman samalla tavalla kuin CD-18-ryhmän jäsenen vastainen vasta-aine, sitä voidaan käyttää tulehduksen tukahduttamiseksi. Lisäksi myös ICAM-2:n funktionaalisia johdannaisia ja antagonisteja voidaan käyttää tulehduksen tukahduttamiseksi.

1. Viivästyneiden yliherkkyysreaktioiden tukahduttajat ICAM-2-molekyylit välittävät osittain kiinnittymistapahtumia, • t jotka ovat välttämättömiä tulehdusreaktioiden kuten viivästy neiden yliherkkyysreaktioiden saamiseksi. Täten ICAM-2-mole-kyyleihin sitoutumaan kykenevillä vasta-aineilla (erityisesti monoklonaalisilla vasta-aineilla) on terapeuttisia mahdollisuuksia tällaisten reaktioiden heikentämisessä tai poistamisessa .

* * 30 100994

Vaihtoehtoisesti koska ICAM-2 on ICAM-l/LFA-1-vuorovaikutuksen antagonisti, ICAM-2:ta (erityisesti liuenneessa muodossa) tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää viivästyneiden yliherkkyysreaktioiden tukahduttamiseksi.

Näitä terapeuttisia käyttömahdollisuuksia voidaan hyödyntää jommallakummalla kahdesta tavasta. Ensinnäkin koostumusta, joka sisältää ICAM-2-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan antaa viivästynyttä tyyppiä edustavista yliherkkyysreaktioista kärsivälle potilaalle. Esimerkiksi näitä koostumuksia voitaisiin antaa henkilölle, joka on ollut kosketuksissa myrkkymuratin, myrkkytammen jne. kaltaisiin antigeeneihin. Toisessa suoritusmuodossa ICAM-2:een sitoutumaan kykenevää monoklonaalista vasta-ainetta annetaan potilaalle antigeenin kanssa myöhemmän tulehdusreaktion estämiseksi. Täten antigeenin antaminen ICAM-2:een sitoutuvan monoklonaalisen vasta-aineen ohella saattaa tilapäisesti saada yksilön sietämään myöhemmän altistumisen tuolle antigeenille.

2. Kroonisen tulehdussairauden terapia

Koska LAD-potilaat, joilta puuttuu LFA-1, eivät tuota tuleh-dusvastetta, arvellaan, että LFA-1:n luontaisen ligandin, ICAM-2:n, antagonismi samoin estää tulehdusvasteen. ICAM-2-vastaisten vasta-aineiden kyky estää tulehdus muodostaa perustan niiden terapeuttiselle käytölle kroonisten tulehdussairauksien ja autoimmuunisairauksien hoidossa, kuten punahukan, autoimmuunikilpi-rauhastulehduksen, kokeellisen allergisen aivojen ja selkäytimen tulehduksen (EAE), multippeliskleroosin, sokeritaudin joidenkin muotojen, Reynaudin oireyhtymän, nivelreuman jne., hoidossa.

Näitä vasta-aineita voidaan käyttää myös terapiana hilsetys-taudin hoidossa. Yleensä ottaen ICAM-2reen sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää sellaisten sairauksien hoitamiseksi, joita tällä hetkellä hoidetaan steroidi-terapialla.

31 100994

Esillä olevan keksinnön mukaan tällaiset tulehdus- ja immuuni-hyljintävasteet voidaan tukahduttaa (eli ne voidaan estää tai niitä voidaan heikentää) antamalla tällaista hoitoa tarvitsevalle kohteelle tulehdusvastaista ainetta määrä, joka on riittävä tukahduttamaan sanotun tulehduksen. Sopivia tulehdusvastaisia aineita ovat: ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aine; ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-ainefragmentti; ICAM-2; ICAM-2:n funktionaalinen johdannainen; muu ICAM-2:n ei-immuno-globuliiniantagonisti kuin ICAM-1 tai muu ei-immunoglobuliini-ICAM-2-antagonisti kuin LFA-1. Erityisen edullisia ovat tuleh-dusvastaiset aineet, jotka koostuvat ICAM-2:n liukoisesta funktionaalisesta johdannaisesta. Tällaiseen tulehdusvastaiseen hoitoon voi niinikään kuulua, että annetaan lisäksi vaikuttavaa ainetta, joka on jokin seuraavista: LFA-1:een sitoutumaan kykenevä vasta-aine; LFA-1:een sitoutumaan kykenevä vasta-aineen funktionaalinen johdannainen; ja LFA-1:n ei-immunoglobuliinian-tagonisti.

Keksintöön kuuluvat edelleen edellä kuvatut menetelmät spesifisen puolustusjärjestelmän tulehdusvasteen tukahduttamiseksi, jolloin menetelmän mukaan kohteelle annetaan lisäksi immuunivastetta heikentävää ainetta. Tällaista ainetta annetaan edullisesti alhaisempi annos (eli "sub-optimaalinen", toisin sanoen opti-mitasoa alhaisempi, annos), kuin sitä normaalisti tarvittaisiin. Suboptimaalisen annoksen käytön mahdollistaa tämän keksinnön mukaisten vaikuttavien aineiden synergiavaikutus. Esimerkkejä sopivista immuunivastetta heikentävistä aineista ovat deksame-tasoni, atsatiopriini, ICAM-1, syklosporiini-A, jne.

3. Ei-spesifisen tulehduksen hoito

Esillä oleva keksintö perustuu osittain havaintoon, että jyväs-solu-endoteelisolukiinnittyminen on seurausta CD-18-ryhmän glykoproteiinien ja endoteelin välisestä vuorovaikutuksesta.

Koska solukiinnittyminen on välttämätöntä, jotta valkosolut voisivat migroitua tulehduskohtiin ja/tai suorittaa erilaisia 32 100994 tulehdukseen myötävaikuttavia effektorifunktioita, solukiinnit-tymisen estävät aineet heikentävät tällaista tulehdusta tai estävät sen. Tällaiset tulehdusreaktiot ovat seurausta "ei-spesifisen puolustusjärjestelmän" reaktioista, joita välittävät immunologista muistia vailla olevat valkosolut. Näitä soluja ovat jyvässolut ja syöjasolut. Tässä käytettynä tulehduksen sanotaan olevan seurausta ei-spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, sitä välittää tai siihen liittyy ei-spesifisen puolustusjärjestelmän reaktio. Esimerkkejä tulehduksista, jotka ovat ainakin osittain seurausta eispesifi-sen puolustusjärjestelmän reaktioista, ovat seuraavan kaltaisiin tiloihin liittyvät tulehdukset: hengityksen vajaatoiminta (ARDS) tai monielinvaurio-oireyhtymät, jotka ovat verenmyrkytyksen tai trauman sekundaarireaktioita; sydänlihaksen tai muun kudoksen reperfuusiovamma; akuutti munuaiskerästen tulehdus; reaktiivinen niveltulehdus; ihotaudit, joihin liittyy akuutteja tulehduksellisia komponentteja; akuutti märkäinen aivokalvontulehdus tai muu keskushermoston tulehdussairaus; lämpövaurio; keinomunuaishoito; valkosolujen erotus; haavainen paksusuolen tulehdus;

Crohnin sairaus; kuoliota aiheuttava suolistotulehdus; jyvässo-lutransfuusioliitteiset oireyhtymät; ja sytokiinien aiheuttama myrkytys.

Tämän keksinnön mukaiset tulehdusvastaiset aineet ovat yhdisteitä, jotka kykenevät spesifisesti vastustamaan jyvässolujen käsittämän CD-18-kompleksin ja endoteelisolujen välistä vuorovaikutusta. Tällaisia antagonisteja ovat: ICAM-2; ICAM-2:n funktionaalinen johdannainen; ja muu ei-immunoglobuliini-ICAM-2-antagonisti kuin ICAM-1; tai CD-18-molekyyliryhmän jäsen.

B. Elin- ja kudoshyljinnän tukahduttajat

Koska ICAM-2, erityisesti liukoisessa muodossa, kykenee vaikuttamaan samalla tavalla kuin CD-18-ryhmän jäsenen vastainen vasta-aine, sitä voidaan käyttää elin- tai kudoshyljinnän tukahduttamiseksi, jonka on aiheuttanut jokin solukiinnittymisestä 33 100994 riippuvainen funktio. Lisäksi ICAM-2-vastaista vasta-ainetta ja ICAM-2:n funktionaalisia johdannaisia ja antagonisteja voidaan niinikään käyttää hyljinnän tukahduttamiseksi.

ICAM-2:ta ja ICAM-2:een sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita voidaan käyttää nisäkäskohteessa elin- tai kudoshyljinnän estämiseksi tai autoimmuunivasteiden modifioimiseksi pelkäämättä erilaisia sivuvaikutuksia.

Merkittävää on, että käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät tunnistamaan ICAM-2:n, saattaa olla mahdollista suorittaa elinsiirtoja jopa HLA-ei-yhteensopivien yksilöiden välillä.

C. Apuaine annettaessa antigeenimateriaalia terapeuttisessa tai diagnostisessa tarkoituksessa

Immuunivasteet sellaisia terapeuttisia tai diagnostisia aineita kuten esimerkiksi nautainsuliinia, interferonia, kudostyypin plasminogeeniaktivaattoria tai hiiren monoklonaalisia vasta-aineita vastaan alentavat huomattavasti tällaisten aineiden terapeuttista tai diagnostista arvoa, ja voivat itse asiassa aiheuttaa sairauksia kuten allergisen reaktion elimistöön tuotua seerumia vastaan. Tällaista tilannetta voidaan helpottaa käyttämällä esillä olevan keksinnön mukaisia vasta-aineita. Tässä suoritusmuodossa näitä vasta-aineita annettaisiin yhdessä terapeuttisen tai diagnostisen aineen kanssa. Vasta-aineita lisäämällä estetään vastaanottajaa tunnistamasta vaikuttavaa ainetta, jolloin estetään vastaanottajaa käynnistämästä immuunivastetta sitä vastaan. Seurauksena tällaisen immuunivasteen puuttumisesta potilaalle voidaan antaa terapeuttista tai diagnostista ainetta suurempina määrinä.

ICAM-2:ta (erityisesti liuotetussa muodossa) tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää vaihtovuoroisesti ICAM-l:n tai LFA-l:een sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden kanssa 34 100994 sairauden hoitamiseksi. Täten liuotetussa muodossa tällaisia molekyylejä voidaan käyttää elin- tai siirrehyljinnän estämiseksi. ICAM-2:ta tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää samaan tapaan kuin ICAM-2-vastaisia vasta-aineita terapeuttisten tai diagnostisten aineiden immunogeenisyyden alentamiseksi .

D. Kasvaimien etäispesäkkeiden muodostuksen tukahduttajat

Esillä olevan keksinnön mukaisia vaikuttavia aineita voidaan käyttää myös etäispesäkkeiden muodostuksen tukahduttamiseksi vertamuodostavasta kasvainsolusta, joka tarvitsee migraatioonsa CD-18-ryhmän funktionaalista jäsentä. Esillä olevan keksinnön tämän suoritusmuodon mukaan tällaista hoitoa tarvitsevalle potilaalle annetaan sanotun etäispesäkkeiden muodostuksen tukahduttamaan riittävä määrä vaikuttavaa ainetta (kuten ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aine; ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aineen toksiinijohdannainen; ICAM-2reen sitoutuman kykenevä vasta-ainefragmentti; ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aineen toksiinijohdannaisfragmentti; ICAM-2; ICAM-2:n funktionaalinen johdannainen; ja muu ei-immunoglobuliini-ICAM-2-antagonisti kuin ICAM-1).

Keksintöön kuuluu myös menetelmä ICAM-2:n ilmentävän kasvain-solun kasvon tukahduttamiseksi, jolloin menetelmän mukaan tällaista hoitoa tarvitsevalle potilaalle annetaan sanotun kasvun tukahduttamaan riittävä määrä vaikuttavaa ainetta. Sopivia vaikuttavia aineita ovat ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aine; ICAM-2:een sitoutuman kykenevä vasta-aineen toksiinijoh-dannainen; ICAM-2teen sitoutumaan kykenevä vasta-ainefragmentti; ICAM-2reen sitoutumaan kykenevä vasta-aineen toksiinijohdannais-fragmentti; ICAM-2; ICAM-2:n funktionaalinen johdannainen; muu ei-immunoglobuliini-ICAM-2-antagonisti kuin ICAM-1; tai CD-18-ryhmämolekyylin toksiinijohdannainen; ja CD-18-ryhmämolekyylin funktionaalinen toksiinijohdannainen.

35 100994

Keksintöön kuuluu samoin menetelmä LFA-l:n ilmentävän kasvain-solun kasvun tukahduttamiseksi, jolloin menetelmän mukaan tällaista hoitoa tarvitsevalle potilaalle annetaan sanotun kasvun tukahduttamaan riittävä määrä toksiinia. Sopivia toksiineja ovat ICAM-2:n toksiinijohdannainen tai ICAM-2:n funktionaalinen toksiinijohdannainen.

E. Virustulehduksen tukahduttajat

Nuhaviruksien pääasiallisen ryhmän on vastikään osoitettu syrjäyttävän ICAM-1:n reseptorina (Greve, J.M., et ai.. Cell 52.:839-847 (1989); Staunton, D.E., et ai.. Cell 56:849-853 (1989); Tomassini, J.E., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA ÄSj.4907-4911 (1989) , jotka julkaisut liitetään tähän viitteiksi) . Nuhavirukset, jotka kuuluvat pieniin, RNA:ta sisältävien ja proteiinikapseloitujen picorna-viruksien ryhmään, aiheuttavat 40-50 % tavanomaisista vilustumisista (Rueckert, R.R., kirjassa: Fields Virology. Fields, B.N., et ai. (toim.), Raven Press, NY, 1985, ss. 705-738; Sperber, S.J., et ai.. Antimicr. Agents Chemo. 22:409-419 (1988), jotka julkaisut liitetään tähän viitteiksi) . On tunnistettu yli 100 immunologisesti ei-ristireaktii-vista nuhavirusta, ja näistä 90 % sitoutuu ICAM-l:een.

HI- ja EB-viruksien on vastikään todettu syrjäyttävän ICAM-l:n ohella solukiinnikemolekyylin CD4 ja vastaavasti komplementti-reseptorin CR2 virusreseptoreina (Maddon, P.J., Cell 47:333-348 (1986); Fingeroth, J.D., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 21:4510-4514 (1984), jotka julkaisut sisällytetään tähän viitteiksi) . Edelleen molekyyli, jolla on samankaltainen Ig-alueen rakenne kuin ICAM-l:llä ja joka mahdollisesti osallistuu solu-kiinnittymiseen, on poliovirusreseptori (Mendelsohn, C.L., et ai.. Cell 56:855-865 (1989)).

ICAM-2 ja sen funktionaaliset johdannaiset voivat toimia reseptoreina virealisessa kiinnittymisessä (erityisesti nuhaviruksien ja etenkin vähäisemmän serotyyppiryhmän nuhaviruksien kiinnitty 36 100994 misessä) tai tartunnassa. Täten ICAM-2:n vastaista vasta-ainetta (tai sen fragmentteja), ICAM-2:ta tai ICAM-2:n funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää tällaisen kiinnittymisen tai tartunnan salpaamiseksi ja siten virustulehduksen tukahduttamiseksi .

F. Diagnostisia ja prognostisia sovellutuksia ICAM-2reen sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää keinona, jolla kuvataan tai visualisoidaan ICAM- 2-ilmentymis- ja tulehduskohdat potilaassa. Tällaisessa käytössä monoklonaaliset vasta-aineet leimataan todettavalla tavalla käyttämällä radio-isotooppeja, affiniteettileimoja (kuten bio-tiini, avidiini jne.), fluoroivia leimoja, paramagneettisia atomeja, leimattua ICAM-2-vastaista vasta-ainetta jne. Menettelyt tällaisten leimauksien suorittamiseksi ovat alalla tunnettuja. Vasta-aineiden kliinistä käyttöä diagnostisessa kuvantamisessa käsittelevät Grossman, H.B., Urol. Clin. North Amer. 13.: 465-474 (1986); Unger, E.C., et ai.. Invest. Radioi. 20:693-700 (1985); ja Khaw, B.A., et ai.. Science 209:295-297 (1980).

ICAM-2-ilmentymisen läsnäolo voidaan todeta myös käyttämällä sitoutumisligandeja, kuten mRNA:ta, cDNA:ta tai DNA:ta, joka sitoutuu ICAM-2-geenisekvensseihin tai ICAM-2-mRNA-sekvensseihin ICAM-2:n ilmentävissä soluissa. Tekniikoita tällaisten hybridi-saatiomäärityksien suorittamiseksi kuvaavat Maniatis, T., ai.. käsikirjassa Molecular Cloning. A Laboratory Manual.

Coldspring Harbor, NY, 1982; ja Haymes, B.D., et al.. kirjassa Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC, 1985, jotka viitteet liitetään tähän viitteiksi.

Tällaisten todettavilla leimoilla leimattujen vasta-aineiden sijaintikohtien toteaminen osoittaa ICAM-2-ilmentymiskeskuksen tai kasvainkehityksen kohdan. Eräässä suoritusmuodossa tämän ilmentymisen esiintyminen tutkitaan ottamalla kudos- tai ve-“ rinäytteitä, joita inkuboidaan vasta-aineiden läsnäollessa, 37 100994 jotka on leimattu tai jotka voidaan leimata todettavalla leimalla. Edullisessa suoritusmuodossa tämä tekniikka toteutetaan ei-invasiivisesti käyttämällä magneettikuvantamista, fluorografiaa jne. Tällaista diagnostista koetta voidaan käyttää elinsiirre-vastaanottajien tarkkailemiseksi kudoshyljinnän varhaisten merkkien varalta. Tällaisia määrityksiä voidaan suorittaa myös pyrittäessä määrittämään jonkin yksilön taipumus nivelreumaan tai muihin kroonisiin tulehdussairauksiin.

Esimerkiksi leimaamalla vasta-aineet tai vasta-ainefragmentit radioaktiivisella leimalla on mahdollista todeta antigeeni radioimmuunimeärityksiä käyttämällä. Hyvä kuvaus radioimmuuni-määrityksestä (RIA) löytyy kirjasta Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology. Work, T.S., et al.. North Holland Publishing Company, NY, (1978), jolloin erityisesti viitataan kappaleeseen, jonka otsikko on "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" (suom. "Johdanto radioimmuunimääritykseen ja liittyviin tekniikoihin"), Chard, T., joka sisällytetään tähän viitteeksi. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää fluoroivia, entsyymi- tai muita sopivia leimoja.

Esimerkkejä leimatyypeistä, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, ovat mainittuihin rajoittumatta entsyymileimat, radio-isotooppileimat, ei-radioaktiiviset isotooppileimat, fluoroivat leimat, toksiinileimat ja kemiluminoivat leimat.

Esimerkkejä sopivista entsyymileimoista ovat malaattidehydroge-naasi, stafylokokkinukleaasi, Δ-5-steroidi-isomeraasi, hiivan alkoholidehydrogenaasi, a-glyserolifosfaattidehydrogenaasi, trioosifosfaatti-isomeraesi, peroksidaasi, alkalinen fosfataasi, asparaginaasi, glukoosioksidaasi, β-galaktosidaasi, ribonukleaa-si, ureaasi, katalaasi, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, glukoamylaasi, astyylikoliiniesteraasi jne.

Esimerkkejä sopivista radio-isotooppileimoista ovat 3H, 1:L1In, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Fu, 38 100994 90Y, 67CU< 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd jne. Esimerkkejä sopivista ei-radioaktiivisista leimoista ovat 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, 55Fe, jne.

Esimerkkejä sopivista fluoroivista leimoista ovat 152Eu-leima, fluoroiva leima, rodamiinileima, fykoerytriinileima, fykosyanii-nileima, allofykosyaniinileima, o-ftalaldehydileima, fluores-amiinileima jne.

Esimerkkejä kemiluminoivista leimoista ovat luminaalileima, iso-luminaalileima, aromaattinen akridiniumesterileima, imidatsoli-leima, akridiniumsuolaleima, oksalaattiesterileima, lusiferiini-leima, lusiferaasileima, aekoriinileima jne.

VI. KEKSINNÖN MUKAISTEN KOOSTUMUSTEN ANTO

ICAM-2:n terapeuttiset vaikutukset voidaan saada antamalla potilaalle ICAM-2-molekyyliä kokonaisena tai sen jotain terapeuttisesti aktiivista peptidifragmenttia. Erityisen kiinnostavia ovat ICAM-2:n liukoiset terapeuttisesti aktiiviset peptidifragmentit.

ICAM-2 ja sen funktionaaliset johdannaiset voidaan saada joko synteettisesti käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tai proteo-lyyttisesti tai tällaisten menetelmien yhdistelmää käyttäen.

ICAM-2:n terapeuttisia etuja voidaan lisätä käyttämällä funktionaalisia ICAM-2-johdannaisia, jotka sisältävät ylimääräisiä aminohappojäännöksiä, jotka on lisätty tehostamaan kytkeytymistä kantajaan tai ICAM-2:n aktiivisuuden nostamiseksi. Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluvat edelleen ICAM-2:n funktionaaliset johdannaiset, joista puuttuvat tietyt aminohappojäännökset, tai jotka sisältävät muutettuja aminohappojäännöksiä, kunhan tällaisilla johdannaisilla on ICAM-2:n biologinen tai farmakologinen aktiivisuus tai ne osoittavat mainittuja.

Sekä esillä olevan keksinnön mukaisten vasta-aineiden ja tässä julkistetun ICAM-2-molekyylin sanotaan "oleellisesti ei sisältä- 39 100994 vän luontaisia kontaminantteja", jos niitä sisältävät valmisteet oleellisesti eivät sisällä materiaaleja, joiden yhteydessä näitä tuotteita normaalisti ja luontaisesti esiintyy.

Keksinnön piiriin kuuluvat vasta-aineet ja niiden biologisesti aktiiviset fragmentit (riippumatta siitä, ovatko vasta-aineet polyklonaalisia vai monoklonaalisia), jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-2:een. Näitä vasta-aineita voidaan tuottaa joko eläimessä, tai kudosviljelmässä tai yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen.

Kun potilaalle annetaan vasta-aineita, tai niiden fragmentteja, jotka kykenevät sitoutuman ICAM-2:een, tai kun vastaanottavalle potilaalle annetaan ICAM-2:ta (tai sen fragmenttia, varianttia tai johdannaista), annetun vaikuttavan aineen annostus vaihtelee sellaisista tekijöistä riippuen kuten potilaan ikä, paino, pituus, sukupuoli, yleinen terveydentila, aiempi lääketieteellinen historia jne. Yleensä ottaen on toivottavaa antaa vastaanottajalle vasta-aineannostus, joka on noin 1 pg/kg - 10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka alhaisempia tai korkeampia annostuksiakin voidaan antaa. Kun potilaalle annetaan ICAM-2-molekyylejä tai niiden funktionaalisia johdannaisia, näitä molekyylejä annetaan edullisesti annostus, joka samoin on noin 1 pg/kg - 10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka alhaisempia tai korkeampia annostuksiakin voidaan antaa. Kuten alla esitetty, terapeuttisesti tehokasta annosta voidaan alentaa, jos ICAM-2-vastaisen vasta-aineen ohella annetaan LFA-1-vastaista vasta-ainetta. Tässä käytettynä yhtä yhdistettä sanotaan annettavan toisen yhdisteen ohella, jos näitä kahta yhdistettä anne-. taan ajallisesti niin lähellä toisiaan, että kumpaakin yhdistettä voidaan samanaikaisesti todeta potilaan seerumista.

Sekä ICAM-2:een sitoutumaan kykenevää vasta-ainetta että itse ICAM-2:ta voidaan antaa potilaille laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, ruoansulatuskanavan sisäisesti tai ruuansulatuskanavan ulkopuolisesta. Kun vasta-ainetta tai 40 100994 ICAM-2:ta annetaan ruiskeena, anto voi tapahtua jatkuvan neste-siirron tai yksittäisen tai monikertaisen ruiskeen välityksellä.

Esillä olevan keksinnön mukaisia vaikuttavia aineita on tarkoitus antaa vastaanottaville kohteille määrä, joka riittää tukahduttamaan tulehduksen. Määrän sanotaan riittävän "tukahduttamaan" tulehduksen, jos vaikuttavan aineen annostus, antotie luonteeltaan jne. ovat riittävät heikentämään tulehdusta tai estämään sen.

ICAM-2-vastaista vasta-ainetta tai sen fragmenttia voidaan antaa joko yksinään tai yhdistettynä yhteen tai useampaan muuhun immuunivastetta heikentävään aineeseen (erityisesti elin- tai kudossiirteen vastaanottajalle). Tällaista yhdistettä tai tällaisia yhdisteitä voidaan antaa joko "ennaltaehkäisevässä" tai "terapeuttisessa" tarkoituksessa. Kun yhtä tai useampaa immuunivastetta heikentävää yhdistettä annetaan ennalta ehkäisevästi, se tai ne annetaan ennen kuin mitään tulehdusvastetta tai -oiretta ilmenee (esimerkiksi ennen kuin tai samalla kun potilaalle siirretään tai pian sen jälkeen kun potilaalle on siirretty elin- tai kudossiirre, mutta ennen kuin ilmenee mitään oireita elimen hyljinnästä). Yhdisteen/-eiden ennaltaehkäisevän annon tehtävänä on estää mahdollinen myöhempi tulehdusvaste tai heikentää sitä (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen jne. hyijintä). Kun yhtä tai useampaa immuunivastetta heikentävää ainetta annetaan terapeuttisesti, se/ne annetaan samanaikaisesti varsinaisen tulehduksen oireiden (kuten esimerkiksi elimen tai kudoksen hyljinnän) käynnistymisen kanssa (tai pian sen jälkeen) . Yhdisteen/-eiden terapeuttisen annon tehtävänä on heikentää mahdollista varsinaista tulehdusta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hyijintä).

Tämän keksinnön mukaisia tulehdusvastaisia aineita voidaan täten antaa joko ennen tulehduksen käynnistymistä (ennakoidun tulehduksen tukahduttamiseksi) tai tulehduksen käynnistymisen jälkeen.

41 100994

Koostumuksen sanotaan olevan "farmakologisesti hyväksyttävä", jos vastaanottava potilas kykenee sietämään sen annon. Tällaista vaikuttavaa ainetta sanotaan annettavan "terapeuttisesti tehokas määrä", jos annetulla määrällä on fysiologista merkitystä. Vaikuttavalla aineella on fysiologista merkitystä, jos sen läsnäolon seurauksena vastaanottavan potilaan fysiologiassa tapahtuu todettava muutos.

Tämän keksinnön mukainen vasta-aine ja mukaiset ICAM-2-molekyylit voidaan koostaa tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumuksien valmistamiseksi, jolloin näitä materiaaleja tai niiden funktionaalisia johdannaisia yhdistetään seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Sopivia kantajia ja niiden koostamista, mukaan lukien muiden humaanipro-teiinien, esim. humaaniseerumialbumiinin, kuvataan esimerkiksi käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences" (16. painos, toim. Osol, A., toim. Mack, Easton, PA (1980)). Tehokkaaseen antoon sopivan farmaseuttisesti hyväksyttävän koostumuksen muodostamiseksi tällaiset koostumukset sisältävät tehokkaan määrän ICAM-2-vastaista vasta-ainetta tai ICAM-2-molekyyliä tai niiden funktionaalisia johdannaisia yhdessä sopivan määrän kantajaa kanssa.

Muita farmaseuttisia menetelmiä voidaan käyttää vaikutuksen keston kontrolloimiseksi. Kontrolloidun vapautumisen valmisteita voidaan saada käyttämällä polymeerejä, joihin ICAM-2-vastainen vasta-aine, ICAM-2 tai niiden funktionaaliset johdannaiset komp-leksoidaan tai absorboidaan. Kontrolloituun lääkkeenantoon voidaan päästä valitsemalla tarkoituksenmukaisia makromolekyylejä (esimerkiksi polyesterit, polyaminohapot, polyvinyylipyrrolido-ni, etyleenivinyyliaseteatti, metyyliselluloosa, karboksimetyy-liselluloosa tai protamiinisulfaatti) ja niiden tarkoituksenmukaiset pitoisuudet sekä koostamismenetelmät vapautumisen kontrolloimiseksi. Toinen mahdollinen menetelmä kontrolloidun vapautumisen valmisteiden vaikutuksen keston säätelemiseksi on sisällyttää ICAM-2-vastainen vasta-aine tai ICAM-2-molekyylejä tai 100994 42 niiden funktionaalisia johdannaisia polymeerimateriaalihiukka-siin, jolloin materiaaleina tulevat kyseeseen polyesterit, poly-aminohapot, hydrogeelit, poly(maitohappo) tai etyleeni-vinyyli-asetaattikopolymeerit. Vaihtoehtoisesti näiden vaikuttavien aineiden sisällyttämiselle polymeerihiukkasiin ne on mahdollista sisällyttää mikrokapseleihin, jotka on valmistettu esimerkiksi koaserveatiotekniikoilla tai välipintapolymeroinnilla, esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosa- tai gelatiinimikrokapseleihin ja vastaavasti poly(metyylimetakrylaatti)mikrokapseleihin, tai voidaan käyttää kolloidista lääkkeenantojärjestelmää, esimerkiksi liposomeja, albumiinimikropalloja, mikroemulsioita, nanohiuk-kasia ja nanokapseleita tai makroemulsioita. Tällaisia tekniikoita julkistetaan käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1980).

Keksintöön kuuluu edelleen farmaseuttinen koostumus, joka käsittää: (a) tulehdusvastaisen aineen (kuten ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aine; ICAM-2:een sitoutumaan kykenevä vasta-aine-fragmentti; ICAM-2; ICAM-2:n funktionaalinen johdannainen; muu ei-immunoglobuliini-ICAM-2-antagonisti kuin ICAM-1, ja (b) ainakin yhden immuunivastetta heikentävän aineen. Esimerkkejä sopivista immuunivastetta heikentävistä aineista ovat: deksametaso-ni, atsatiopriini ja syklosporiini-A.

Kuvattuamme nyt yleisesti keksintöä esitetty voidaan helpommin ymmärtää tutustumalla seuraaviin esimerkkeihin, jotka esitetään havainnollistamismielessä ja joiden ei tarkoiteta rajaavan tätä keksintöä, ellei nimenomaan siten mainittu.

ESIMERKKI 1

ICAM-2-cDNA:n KLOONAAMINEN

ICAM-2:ta koodittamaan kykenevän cDNA:n kloonaamiseksi käytettiin muunnosta Aruffon ja Seedin menettelystä (Seed, B., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365-3369 (1987)) cDNA-sekvenssien valikoimiseksi COS-soluissa ilmentämällä ligandin käsittävien 43 100994 COS-solujen esiin seulomiseksi käyttäen funktionaalisesti aktiivista, puhdistettua ja muovisiin petrimaljoihin sidottua LFA-1: tä.

Yksityiskohtaisesti LFA-1 puhdistettiin SKW-3-lysaatista immuu-niaffiniteettikromatografisesti TS2/4-LFA-1-MAb-Sepharosehart-sissa eluoiden pH:ssa 11,5 2 mM MgCl2-pitoisuuden läsnäollessa l-%:sella oktyyliglukosidiliuoksella. LFA-1 (10 /xg/200 μ1/6 cm:n malja) sidottiin bakteriologisiin petrimaljoihin laimentamalla oktyyliglukosidia 0,1 %:n pitoisuuteen PBSrään, joka käsitti pitoisuuden 2 mM MgCl2, ja inkuboimalla seoksella yön yli 4°C:ssa. Maljapinnat salvattiin käytteen l-%:sta BSA-liuosta, minkä jälkeen maljoja säilytettiin PBS.-ssä, joka käsitti pitoisuudet 2 mM MgCl2, 0,2 % BSA:ta, 0,025 % atsidia ja 50 μg/ml gentamysiiniä.

cDNA-kirjasto syntetisoitiin LPS:llä stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluista Gublerin ja Hoffmanin menetelmällä kuten kuvanneet Staunton et ai. (Staunton, D.E., et ai.. Cell 52:925-933 (1988)). Syntetisoitiin toinen säie ja cDNA ligatoitiin BstXl-siltasekvensseihin (Seed, B., et ai.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA £1:3365-3369 (1987)), minkä jälkeen valikoitiin cDNA-sekvenssit, jotka olivat kooltaan yli 600 ep:tä, käyttäen geelielektroforee-sia alhaisen sulamispisteen (LMP) agaroosissa. Sitten cDNA ligatoitiin CDM8:aan (Seed, B. Nature 329:840-842 (1987)), siirrettiin E. coli -isäntään MC1061/P3, joka maljoitettiin 5 x 105 pesäkkeen saamiseksi. Pesäkkeet lietettiin LB-kasvualustaan, yhdistettiin ja plasmidi valmistettiin käyttämällä tavanomaista alkalinen lyysi-menetelmeä (Maniatis, T., et ai.. käsikirjassa Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Kymmeneen (10) 10 cm:n COS-solumaljaan, joissa solujen yhteenkasvamisaste oli 50 %, transfektoitiin 10 μg/τnalja plasmidi-cDNA-kirjastoa DEAE-dekstraania käyttäen (Kingston, R.E., lähteessä Current Protocols in Molecular Biology. 9.0.1-9.9.6, Greene Publishing Associates, 1987). ICAM-2 on trypsiiniresistentti endoteeli- ja SKW-3-soluilla. Kolmen (3) 44 100994 päivän kuluttua transfektoinnista COS-solut lietettiin seokseen, jossa oli 0,025 % trypsiiniä ja pitoisuus 1 mM EDTA HBSS:ssä (Gibco), minkä jälkeen saatu liete levitettiin (Seed, B., et &L·., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365-3369 (1987)) LFA-l:llä päällystettyihin maljoihin kuten kuvattu alla 51Cr-leimatuille COS-soluille. Kiinnittyneet solut irrotettiin lisäämällä EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM.

Plasmidi otettiin talteen kiinnittyneestä COS-solupopulaatiosta Hirtin supernatanteista (Hirt, B.J., J. Mol. Biol. 26:365-369 (1967)). Sitten plasmidilla transformoitiin E. coli-kanta MC1061/P3, maljoille muodostuneet pesäkkeet lietettiin LB-kasvu-alustaan, yhdistettiin ja plasmidi valmistettiin käyttämällä alkalinen lyysi -menetelmää. LFA-l:een kiinnittyneiden transfak-toitujen COS-solujen valikointi ja plasmidin talteenotto toistettiin vielä kaksi kertaa. Kolmannelta (3.) kierrokselta saatuja yhdistettyjä pesäkkeitä kasvatettiin kyllästyspisteeseen asti 100 ml:ssa LB-kasvualustaa, joka sisälsi 18 μ9/πι1 tetrasykliiniä ja 20 μg/ml ampisilliiniä. Plasmidi valmistettiin ja fraktioitiin käyttäen geelielektroforeesia l-%:ssa LMP-agaroosigeelissä, minkä jälkeen MC106l/p3 transformoitiin erikseen yhdeksästä (9) eri kokofraktiosta saadulla plasmidilla. Fraktion yksittäisiä plasmideja, joiden aktiivisuus COS-solukiinnittymisen LFA-l:een edistämisessä oli suurin, analysoitiin insertin koon suhteen pilkkomalla Xbal:llä sekä COS-solukiinnittymismäärityksessä.

Tällöin saatiin yksi plasmidi, joka sisälsi 1,1 ke:n ICAM-2-cDNA-insertin, pCDIC2.27.

Kiinnittymismäärityksiä silmälläpitäen ICAM-2-plasmidia pCDIC2.27 tai ICAM-1-rakennetta, joka sisälsi 1,8 ke:n SaiI/Kpnl-fragmentin (Staunton, D E., et ai.. Cell 52:925-933 (1988)) CDM8:ssa (2 μg/10 cm:n malja), siirrettiin COS-soluihin DEAE-dekstraania käyttäen. COS-soluja lietettiin seokseen, jossa oli 0,025 % trypsiiniä ja pitoisuus 1 mM EDTA HBSS:ssä, kolmen (3) päivän kuluttua transfektoinnista ja ne leimattiin 51Cr:llä. 51Cr-leimattuja COS-soluja pitoisuutena noin 2 x 105 2 ml:ssa 45 100994 PBS:ää, jossa oli 5 % FCS:ää, pitoisuus 2 mM MgCl2, 0,025 % atsidia (puskuri) ja 5 μg/ml ilmoitettua MAbrtä, inkuboitiin LFA-1:llä päällystetyissä 6 cm:n maljoissa 25°C:ssa tunnin ajan.

Ei-kiinnittyneet solut poistettiin heiluttamalla maljoja kevyesti ja pesemällä kolmeen (3) kertaan puskurilla. Kiinnittyneet solut eluoitiin lisäämällä maljoihin EDTArta pitoisuuteen 10 mM ja suoritettiin eluaattien γ-laskenta.

Tämän menettelyn käyttökelpoisuus osoitettiin käyttämällä COS-soluja, jotka oli transfektoitu aiemmin kloonatulla ICAM-lcDNA:-11a (kuvio IA). ICAM-1 ilmentyi 25 %:ssa transfektoiduista COS-soluista. Seulonnan jälkeen ei-kiinnittyneiden solujen joukossa ei ollut juuri ollenkaan ICAM-l+-soluja, kun taas kiinnittyneet solut, jotka irrotettiin LFA-1:llä päällystetystä muovista EDTArta käyttämällä, olivat lähes yksinomaan ICAM-1+-tyyppiä. ICAM-l+-solujen kiinnittyminen LFA-l-päällysteiseen muoviin estyi ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1. LFA-lrllä päällystetyt petrimaljat olivat stabiileja yli viidellä (5) COS-solukiinnitys- ja EDTA eluointikierroksella; maljoja säilytettiin Mg2+-ionien läsnäollessa 4°C:ssa käyttökertojen välillä.

ICAM-2:n kloonaamiseksi valmistettiin cDNA-kirjasto plasmidi-vektoriin CDM8 endoteelisoluista, jotka osoittavat LFA-l-riippu-vaisen kiinnittymisen sekä ICAM-l-riippuvaisen että ICAM-1:stä riippumattoman komponentin (Dustin, M.L., et ai.. J. Cell. Biol.

107:321-331 (1988)). Transfektoituja COS-soluja inkuboitiin LFA-1:llä päällystetyissä petrimaljoissa ICAM-1-vastaisen mono-klonaalisen vasta-aineen läsnäollessa ICAM-l-cDNA-sekvenssien eristämisen estämiseksi. Kiinnittyneet solut eluoitiin EDTA-liuoksella, minkä jälkeen plasmidit eristettiin ja niitä vahvistettiin E. colissa. Kolmen (3) kierroksen, jotka käsittivät transfektoinnin, kiinnittämisen ja plasmidin eristämisen, sekä yhden kokofraktioinnin jälkeen 30 plasmidia analysoitiin res-triktioendonukleaasilla pilkkomalla. Kolmesta (3) plasmidista, 46 100994 jotka käsittivät yli 1,0 ke:n insertin, yksi plasmidi, joka transfektoitiin COS-soluihin, kiinnittyi LFA-l:een.

Eristetty plasmidi aikaansai kiinnittymisen LFA-l:een korkeassa prosentuaalisessa osuudessa transfektoituja soluja, jolloin osuus vastasi ICAM-l-transfektoinnin yhteydessä esiintyvää prosenttiosuutta (kuvio IB). Kiinnittymisen salpasi LFA-l-vas-tainen MAb, mutta vastakkaisesti ICAM-l-transfektantteihin nähden, ei ICAM-1-vastainen MAb (kuvio 18). Lisäksi tällä plas-midilla transfektoidut solut eivät reagoineet neljästä (4) ICAM-l-vastaisesta MAb:stä koostuvan paneelin kanssa. Täten kaikki toista LFA-l-ligandia koodattavalle cDNArlle asetetut kriteerit olivat tulleet täytetyiksi ja ligandi nimettiin "ICAM-2:ksi".

ESIMERKKI 2

ICAM-2-CDNA-SEKVENSSIN KARAKTERISOINTI

1052 ep:n ICAM-2-cDNA-sekvenssi (kuvio 2) sisältää 62 ep:n 5'- ja 167 ep:n 31-ei-translatoituvan alueen. AATACA-polyadeny-laatiosignaalia asemassa 1019, joka vastoin kuin AATAAA esiintyy noin 2 %:ssa selkärankais-mRNA-sekvenssejä (Wickens, M., et ai.. Science 226:1045-1051 (1984)), seuraa 1058 ep:n poly(A)lisuke.

Pisin avoin lukualue alkaa ensimmäisestä ATG-kodonista asemassa t · 63 ja päättyy TAG-päätöskodoniin asemassa 885. Analysoimalla hydrofobisuutta (Kyte, J., et ai.. J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)) ja tutkimalla aminohappojäännöskäytäntöä lohkeamiskoh-tien lähettyvillä (von Heijne, G., Nucleic Acids Research 14.:4683-4690 (1986)) ennustettiin 21 jäännöksen signaalipeptidi (kuvio 2).

Ennustettu kypsä sekvenssi sisältää aminohaposta 1 jäännökseen 201 oletetun solunulkoisen alueen, jota seuraa 26 jäännöksen hydrofobinen oletettu transmembraanialue ja 26 jäännöksen sytoplasma-alue. Neljä (4) käännöstä oletetussa or-heelikstrans-membraanisegmentissä ovat amfipaattisia treoniini- ja seriini- 47 100994 jäännöksien jäädessä toisella puolelle, mikä viittaa itseliitty-mismahdollisuuteen tai liittymismahdollisuuteen muihin membraa-niproteiineihin membraanin tasossa. Sytoplasma-alue on epätavallisen emäksinen ja keskimääräisen hydrofobinen vastoin kuin useimmat sytoplasma-alueet, jotka ovat hydrofiilisiä. Kypsälle polypeptidille ennustettu massa on 28,176 daltonia, josta - jos ennustetut kuusi (6) N-kytkentäglykosylaatiokeskusta tulevat käytetyiksi - saataisiin noin 46 Kd:n ICAM-2-glykoproteiini.

ESIMERKKI 3

DNA- ja RNA-HYBRIDISAAT10-ANALYYSIT

Eristettyjä ICAM-2-cDNA-klooneja analysoitiin käyttäen sekä Northernin että Southernin hybridisaatiota. Northernin blot-kopioissa käytettiin 6 mikrogrammaa poly(A)+-RNA:ta, joka denaturoitiin ja jolla sitten suoritettiin elektroforeesi 1 % aga-roosi/formaldehydigeelissä (Maniatis, T., et ai.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)), minkä jälkeen saadut tuotteet siirrettiin sähködiffuu-siolla nylonkalvolle (Zeta Probe, BioRad). Siirron täydellisyydestä varmistuttiin läpivalaisemalla geeli UV-valolla ja ottamalla blot-kopiosta fluoroiva valokuva.

Genomi-DNA-sekvenssejä pilkottiin viiteen (5) kertaan valmistajan suosittamalla määrällä EcoRI- ja HindiII-endonukleaaseja (New England Biolabs). Pilkkomistuotteilla suoritettiin elektroforeesi 0,8-%:sessa agaroosigeelissä, minkä jälkeen DNA:t siirrettiin Zeta Probe -kalvolle. RNA- ja DNA-blot-kopioita esihyb-ridoitiin ja hybridoitiin käyttäen vakiomenettelyitä (Maniatis, T., et ai.. Molecular Colonina: h. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) ja ICAM-2- tai ICAM-1-cDNA-sekvenssejä, jotka oli leimattu alfa[32P]dXTP:eillä satunnaispohjustamalla (Boehringer Mannheim).

1,1 ke:n ICAM-2-cDNA hybridoituu 1,4 ke:n poly(A)+-mRNA:han ja heikosti 3 ke:n mRNA:han (kuvio 3A), eroten 3,3 ke:n ja 2,4 ke:n 48 100994 ICAM-l-mRNA:sta (kuvio 3B). mRNA:ta tutkittiin soluissa, joita oli karakterisoitu funktionaalisesti ICAM-l-riippuvaisen ja toisesta ligandista riippuvaisen sitoutumisen LFA-l:een suhteen.

LPS indusoi voimakkaasti ICAM-l-mRNA:ta endoteelisoluissa (kuvio 3B, vyöhykkeet 2 ja 3). Sitä vastoin ICAM-2-mRNA ilmentyy voimakkaalla perustasolla endoteelisoluissa, eikä LPS indusoi sitä voimakkaampaan ilmentymiseen (kuvio 3A, vyöhykkeet 2 ja 3). Tämä on vastaavaisuussuhteessa LFA-1-riippuvaisen, ICAM-l:stä riippumattoman reitin voimakkaaseen perus- ja ei-indusoituvaan ilmentymiseen endoteelisoluissa ja ICAM-l-riippuvaisen reitin indu-soitavuuteen (Dustin, M.L., et ai.. J. Cell. Biol. 107:321-331 (1988)).

ICAM-2-mRNA:ta esiintyy laajassa valikoimassa solutyyppejä mukaan lukien Ramos- ja BBN-B-varhaisimusolu-, U937-monosyytti ja SKW3-varhaisimusolusolulinjoissa (kuvio 3A, vyöhykkeet 1, 4, 6 ja 8), mikä osoitetaan suorittamalla autoradiokuvaus käyttäen keskimääräistä tai pitkää valotusaikaa. Näistä SKW3:n, U937:n ja BBN:n on osoitettu osoittavan LFA-1-riippuvaista, ICAM-l:stä riippumatonta kiinnittymistä LFA-1+-soluihin (Rothlein, R., et ai.. J. Immunol. 137:1270-1274 (1986); Makgoba, M.W., et ai,,

Eur. J. Immunol. 18:637-640 (1988)) ja LFA-l-päällysteiseen muoviin. HeLa-epiteelisolulinja, joka osoittaa pelkästään LFA-1-riippuvaisen kiinnittymisen ICAM-l-riippuvaisen komponentin (Makgoba, M.W., et ai.. Eur. J. Immunol. 18:637-640 (1988)), ei osoita ICAM-2-mRNA:ta (kuvio 3A, vyöhyke 5) pitkässäkään autora-diogrammivalotuksessa. ICAM-2:n solujakauma on täten yhdenmukainen LFA-l-riippuvaisen kiinnittymisen ICAM-l:stä riippumattoman komponentin kanssa.

ICAM-2-cDNA:n hybridoidun genomi-DNA:n Southern-blot-kopioissa (kuvio 3C) esiintyi yksi yksittäinen pääasiallinen 8,2 ke:n EcoRI-fragmentti sekä 14 ke:n Hindlll-fragmentti, mikä viittaa siihen, että kyseessä on yksittäinen geeni, jossa valtaosa kooditiedosta esiintyy 8 ke:n palasessa.

49 100994 ESIMERKKI 4

ICAM-1:n ja ICAM-2:n AMINOHAPPOSEKVENSSIEN VERTAILU

Koska ICAM-2 ja ICAM-1 ovat funktionaalisesti samanlaisia LFA-1-ligandeina, niiden aminohapposekvenssejä verrattiin keskenään.

ICAM-1 kuuluu Ig-super-ryhmään ja sen solunulkoinen alue koostuu kokonaisuudessaan viidestä (5) C-kaltaisesta alueesta. ICAM-2:n 201 aminohappojäännöksen solunulkoinen alue koostuu kahdesta (2) Ig-C-kaltaisesta alueesta, jolloin oletetut alueen sisäiset di-sulfidisilloilla sidotut kysteiinit sijaitsevat 43 ja 56 jäännöksen päässä toisistaan, sekä ennustetusta β-säierakenteesta (kuvio 4). Merkittävää on, että ICAM-2:n kyseisten kahden (2) Ig-kaltaisen alueen aminohapposekvensseillä on 34 %:n homologia ICAM-1:n kahteen lähinnä N-päätyä sijaitsevaan Ig-kaltaiseen alueeseen nähden (kuvio 4), jolloin ALIGN-ohjelman mukainen tulos on 15 standardipoikkeamaa keskiarvon yläpuolella, ja 27 %:n homologia ICAM-l-alueisiin 3 ja 4 nähden, jolloin ALIGN-tulos on 3 standardipoikkeamaa keskiarvon yläpuolella.

Suorittamalla atk-haku NBRF- ja SWISS-PROT-proteiinitietokan-noissa saatiin vain osittaisia aluehomologioita muihin Ig-super-ryhmän jäseniin nähden, tällöin pääasiassa HLA-luokan II anti-geeneihin nähden. ICAM-2:ssa esiintyy jonkin verran harvempia säilyviä alueita, jotka ovat tunnusomaisia ICAM-1:n Ig-alueille. ICAM-2:n homologia kiinnikemolekyylien NCAM (Cunnigham, B.A., et ai.. Science 236:799-806 (1987)) ja MAG (Salzer, J.L., et ai.. J. Cell. Biol. 104:957-965 (1987)) kahteen N-päätyaluee-seen nähden on 17 % ja vastaavasti 19 %, kun puolestaan ICAM-1:n vastaava homologia on 19 % ja vastaavasti 20 %.

Imusolufunktioliitteinen antigeeni-1 (LFA-1) ja solujen välinen kiinnikemolekyyli-1 (ICAM-1) identifioitiin valikoimalla MAb, joka salpasi T-imusoluvälitteisen solukuoleman ja vastaavasti homotyyppisen kiinnittymisen (Rothlein, R., et ai.. J. Immunol. 122:1270-1274 (1986); Davignon, D., et ai,, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 22.:4535-4539 (1981) ) . Sitä vastoin ICAM-2 on määritelty 50 100994 käyttäen funktionaalisen cDNA:n valikointimenettelyä, joka ei edellytä proteiinin aiempaa tunnistusta biokemiallisilla tai immunologisilla tekniikoilla.

ICAM-2-cDNA:n eristäminen varmentaa vaihtoehtoisen LFA-l-ligan-din oletetun olemassa olon. ICAM-2-mRNA:n jakautuminen rajoitettuun määrään soluja, joille on tunnusomaista ICAM-2-riippuvainen ja ICAM-l:stä riippumaton kiinnittyminen LFA-l:een, viittaa siihen, että ICAM-2 olisi vastuussa kaikesta havaitusta ICAM-1:stä riippumattomasta LFA-1-riippuvaisesta kiinnittymisestä.

ICAM-2 ja ICAM-1:n kaksi N-päätyaluetta muistuttavat toisiaan huomattavasti enemmän kuin ne muistuttavat muita Ig-superryhmän jäseniä, mikä osoittaa Ig-kaltaisten, LFA-1:een sitoutuvien molekyylien alaryhmän olemassa olon. Merkittävää on, että ICAM-l:n LFA-1-sitoutumisalue on kartoitettu alueisiin 1 ja 2 aluede-leetiolla ja systemaattisesti aminohappoja korvaamalla. Täten kyseessä on sekä rakenteellinen että funktionaalinen homologia. ICAM-2 on toinen esimerkki Ig-ryhmäjäsenestä, joka sitoutuu integriiniin. Vaikka solukiinnittymisreseptorien joukosta löytyy vähän ennakkotapauksia, integriineistä lukuisten solunulkoisten matriisikomponenttireseptorien on osoitettu tunnistavan monia ligandeja (Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987); Ruoslahti, E., et ai.. Science 213.:491-497 (1987)).

Sen paremmin ICAM-1 kuin ICAM-2:kaan ei sisällä RGD-sekvenssiä, jolloin LFA-1-tunnistuksen tyyppi voi poiketa solunulkoisiin matriisikomponentteihin sitoutuvien integriinien vastaavasta (Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987); Ruoslahti, E., et ai..

Science 238:491-497 (1987)). Mac-l:n ja pl50,95:n, jotka ovat LFA-1:tä likeisesti muistuttavia valkosoluintegriinejä, tunnistamat soluligandit saattavat kuulua samaan Ig-alaryhmään. ICAM-1 on vastikään osoitettu reseptoriksi nuhaviruksien valtaryhmälle, jonka jäsenet aiheuttavat 50 % tavanomaisista vilustumisista.

ICAM-2 toimii mahdollisesti myös reseptorina nuhaviruksille tai : muille picorna-viruksille. Täten sitä voidaan käyttää terapiassa 51 100994 tällaisten viruksien aiheuttamien tulehdusten tukahduttamiseksi (eli estämiseksi tai heikentämiseksi).

LFA-1:n ligandiryhmän olemassa olo korostaa tämän tunnistus-reitin merkitystä, joka saattaa olla mekanismi, jolla saadaan spesifisyyden hienosäätö ja funktionaalista moninaisuutta.

Joukolla ICAM-1:n ja ICAM-2:n välisiä eroja on mahdollisesti tärkeä merkitys. ICAM-1 on indusoituva lähes kaikissa soluissa, kun taas ICAM-2:n ilmentymiseen eivät vaikuta tähän asti testatut solusytokiinit. ICAM-1:n kolmen (3) ylimääräisen alueen arvellaan siirtävän sen LFA-l-sitoutumiskeskuksen kauemmas solupinnasta kuin ICAM-2:n vastaava, mikä viittaa siihen, että LFA-1:ICAM-2-vuorovaikutus edellyttäisi likeisempää solu-solu-kontaktia kuin LFA-1:ICAM-1-vuorovaikutus. ICAM-2:lla transfek-toidut COS-solut irtoavat helpommin kuin ICAM-1:llä transfek-toidut COS-solut LFA-l-päällysteisestä muovista pesun leikkaus-voimaa nostettaessa. Tämä johtuu mahdollisesti ICAM-2:n pienemmästä koosta, mikä tekee siitä mahdollisesti LFA-l:lle huonommin tavoitettavan keinotekoisella substraatilla, tai sekvenssierois-ta, jotka aiheuttavat eroja affiniteetissa.

ICAM-1:n ja ICAM-2:n erilaiset sytoplasma-alueet voivat aiheuttaa erilaisia signaaleja tai erilaisen sijainnin solupinnalla; samoin signallointi tai LFA-1:n vuorovaikutus solun tukiverkoston kanssa saattavat vaihdella sen mukaan, onko ICAM-1 tai ICAM-2 sitoutunut.

ICAM-1 ja toinen LFA-l-vastareseptori, ICAM-2, muodostavat täten immunoglobuliini- (Ig-) super-ryhmän (Staunton, D.E., et ai..

Cell £2.:925-933 (1988), joka viite sisällytetään tähän viitteeksi) alaryhmän. ICAM-1 käsittää viisi (5) Ig-kaltaista C-aluetta, kun taas ICAM-2 käsittää kaksi (2) tällaista aluetta, jotka ovat erittäin homologisia ICAM-1:n aminopäätyalueisiin nähden. ICAM-1 ja ICAM-2 tukevat lukuisissa erilaisissa solutyypeissä ilmennettyinä erilaisia valkosolukiinnittymisriippuvaisia funktioita : mukaan lukien immuunivasteen induktio- ja effektorifunktiot.

52 100994 ICAM-l:n ilmentyminen indusoituu voimakkaasti sytokiineilla ja siten LFA-l/ICAM-lkiinnittymisjärjestelmä kykenee ohjaamaan valkosolujen migraatiota ja sijoittumista tulehduksen yhteydessä (Rothlein, R., J. Immunol. 137:1270-1274 (1986); Marlin, S.D., et ai.. Cell 51:813-819 (1987); Kishimoto, T.K., et ai..

Adv. Immunol. 46:149-182 (1989); Dustin, M.L., et al..,., Immunol.

Today £:213-215 (1988), jotka kaikki julkaisut sisällytetään tähän viitteiksi).

ICAM-1-jäännökset, jotka edellä on määritelty tärkeiksi LFA-l-sitoutumisen kannalta, ovat säilyviä muissa ICAM-lajeissa (Staunton, D.E., et ai.. Nature 33 9:61-64 (1989), joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi). Humaani-ICAM-1 on 50%:sesti identtinen hiiri - ICAM-1 :een nähden ja 35-%.-sesti identtinen humaani-1CAM-2:een nähden (Staunton, D.E., et ai.. Nature 339:61-64 (1989)). LFA-1-sitoutumisen kannalta keskeisimmät jäännökset, E34 ja Q73, ovat säilyviä sekä hiiri-ICAM-1:ssä että humaani-ICAM-2:ssa. Tämä on yhdenmukaista sekä hiiri-ICAM-1:n että humaani-ICAM-2:n kyvyn kanssa (Staunton, D.E., et ai..

Nature 339:61-64 (1989)) sitoutua humaani-LFA-1:een. Yksi D2-N-kytkentäglykosylaatiokeskus kohdassa N156, joka vaikuttaa LFA-1-sitoutumiseen, on säilyvä myös ICAM-2:ssa. Useat jäännökset, joilla on tärkeä merkitys nuhavirus-14:n sitoutumisessa, Q58, G46, D71, K77 ja R166, eivät ole säilyviä hiiri-ICAM-1:ssä tai humaani-ICAM-2:ssa (Staunton, D.E., et ai.. Cell 56:849-853 (1989), joka julkaisu sisällytetään tähän viitteeksi), mikä on yhdenmukaista hiirisolujen (Colonno, R.J., et ai.. J.Virol.

£2=7-12 (1986)) ja ICAM-2:n ilmeisen kyvyttömyyden kanssa sitoutua nuhavirus-14:ään.

Vaikka keksintöä on kuvattu sen spesifisten suoritusmuotojen avulla, tulee huomata, että siihen voidaan tehdä muitakin modifikaatioita ja tämän patenttihakemuksen määrä on kattaa keksinnön kaikki muunnokset, käytöt tai sovellutukset, jotka yleensä ottaen noudattavat keksinnön periaatteita, jolloin mukaan lue-: taan sellaiset poikkeamat tässä esitetystä, jotka kuuluvat 100994 53 keksinnön koskeman alan tunnettuun tai tavanomaiseen käytäntöön ja joihin voidaan soveltaa edellä esitettyjä oleellisia ominaispiirteitä oheisten patenttivaatimuksien puitteissa.

·

Claims (2)

100994

1. Menetelmä valmistaa ICAM-2, tunnettu siitä, että transformoidaan isäntäsolu ekspressiovektorilla, joka sisältää ICAM-2 koodaavan informaation, ja viljellään mainittua transformoitua isäntäsolua olosuhteissa, joissa mainitut solut ekspres-soivat ICAM-2, joka valmistettu ICAM-2 kykenee sitoutumaan solun tai viruksen pinnalla olevaan molekyyliin, ja lisäksi sisältää ainakin yhden seuraavan polypeptidin: (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-; (b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-; (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-; (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-; (e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-; (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-; (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-; (k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I- ja (l) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-.

2. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se kykenee koodittamaan ICAM-2:n, joka kykenee koodittamaan ainakin yhden seuraavan polypeptidin: (a) -S-S-F-G-Y-R-T-L-T-V-A-L-; (b) -D-E-K-V-F-E-V-H-V-R-P-K-; (c) -G-S-L-E-V-N-C-S-T-T-C-N-; (d) -H-Y-L-V-S-N-I-S-H-T-D-V-; (e) -S-M-N-S-N-V-S-V-Y-Q-P-P-; (f) -F-T-I-E-C-R-V-P-T-V-E-P-; (g) -G-N-E-T-L-H-Y-E-T-F-G-K-; (h) -T-A-T-F-N-S-T-A-D-R-E-D-; : (i) -H-R-N-F-S-C-L-A-V-L-D-L-; 100994 (j) -M-V-I-I-V-T-V-V-S-V-L-L-; (k) -S-L-F-V-T-S-V-L-L-C-F-I- ja (l) -M-G-T-Y-G-V-R-A-A-W-R-R-, ja joka molekyyli kykenee lisäksi ilmentämään ICAM-2:n jossain solussa. 100994 Patentfarav