KR0169728B1

KR0169728B1 - 세포간 부착 분자-2

Info

Publication number: KR0169728B1
Application number: KR1019900003020A
Authority: KR
Inventors: 알란 스프링어 티모씨; 로란 더스틴 마이클; 이. 스타운톤 도날드
Original assignee: 리차드 엘. 콘; 쎈터 포 블러드 리서치 인코포레이티드
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1999-01-15
Also published as: DE69029336D1; CA2011633A1; NO178862C; EP0387668A1; KR900013978A; NO901093D0; AU647017B2; FI100994B; AU5117290A; FI901170A0; EP0387668B1; DE69029336T2; CA2011633C; JP3369166B2; ES2097747T3; MX9203469A; HU901367D0; ATE146222T1; IL93680A0; HU214247B

Abstract

내용 없음.

Description

세포간 부착분자-2

제1도는 LFA-1-피복된 플라스틱에 ICAM-1 및 ICAM-2를 발현하는 형질감염된 COS 세포가 결합했음을 나타내는 도이다.

제2도는 ICAM-2의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 나타내는 도이다.

제3도는 RNA 및 DNA 하이브리드화 분석 결과를 나타내는 도이다.

제4도는 ICAM-1과 ICAM-2의 상동성을 나타내는 도이다.

본 발명은 일군의 임파구가 염증 반응동안에 염증 부위로 이주하여 세포와 상호작용할 수 있도록 세포의 기질을 인지하고 이에 부착하는 과정에 관여하는 세포간 부착분자(ICAM-2)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 세포간 부착분자 ICAM-2에 결합할 수 있는 리간드 분자, 세포간 부착분자의 용도, 및 리간드 분자의 용도에 관한 것이다.

백혈구는 세균 또는 바이러스와 같은 외부 침입 인자에 대항하여 숙주를 적절히 방어하기 위해서 세포 기질에 부착할 수 있어야만 한다. 방어계에 대한 우수한 연구는 문헌[Eisen, H.W., (In: Microbiology, 3rd Ed., Harper ＆ Row, Philadelphia, PA(1980), pp.290-295 and 381-418]에 기술되어 있다. 백혈구는 순환계로부터 염증 진행 부위로 이주할 수 있도록 내피세포에 부착할 수 있어야 한다. 더우기, 백혈구는 정상의 특이적인 면역반응이 일어날 수 있도록 항원-제공 세포에 부착하여야 하며, 최종적으로 백혈구는 바이러스에 감염된 세포 또는 종양세포의 용해가 일어날 수 있도록 적절한 표적세포에 부착하여야 한다.

최근, 이러한 부착을 중재하는데 관여하는 백혈구 표면 분자가 하이브리도마 기술을 이용함에 의해 동정되었다. 간략하면, 사람 T-세포[참조: Davignon, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4535-4539(1981)] 및 마우스 비장세포[참조: Spinger, T. et al. Eur. J. Immunol. 9:301-306(1979)]에 지시된 모노클로날 항체들이 동정되었는데 이들은 백혈구 표면에 결합하여 상기의 부착 관련기능을 억제한다.[참조: Springer, T. et al., Fed. Proc. 44: 2660-2663(1985)]. 이러한 항체로서 동정된 분자를 Mac-1 및 임파구 기능-관련 항원-1(LFA-1)이라고 한다. Mac-1은 대식세포, 과립구 및 거대과립상 임파구상에서 발견된 이종이량체(heterodimer)이다. LFA-1은 대개 임파구에서 발견된 이종이량체이다[참조: Springer. T.A., et al. Immunol. Rev. 68:111-135(1982)]. 이 2개의 분자와 제3의 분자인 p150,95(이는 Mac-1과 유사한 조직 분포를 갖고 있다)는 세포 부착 에 중요한 역할을 한다[Keizer, G.et al., Eur. J. Immunol. 15:1142-1147(1985)]

상기의 백혈구 분자는 당단백질의 CD-18 계열이라고 하는, 당단백질의 관련계열중 일원인 것으로 밝혀졌다[Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803(1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol. 15:1142-1147(1985)]. 이 당단백질 계열은 하나의 α-쇄와 하나의 β-쇄를 지닌 이종이량체로 구성되어 있다. 항원 각각의 α-쇄가 서로 상이하다 해도, β-쇄는 고도로 보존되어 있음이 밝혀졌다[참조: Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803(1983)]. 당단백질 계열의 β-쇄(때때로 CD-18로 언급한다)는 분자량이 95kd인 반면, α-쇄는 분자량이 150kd 내지 180kd인 것으로 밝혀졌다[참조: Springer. T., Fed. Proc. 44:2660-2663(1985)]. 막단백질의 α-소단위가 β-소단위에 의해 공유된 집중적인 상동성을 공유하지는 않지만, 당단백질의 α-소단위를 세밀히 분석한 결과 이들간에는 실질적인 유사성이 있다는 것이 밝혀졌다. LFA-1 관련 당단백질의 α 및 β 소단위간의 유사성에 관한 연구는 문헌[참조: Sanchez-Madrid, F. et al., (J. Exper. Med. 158:586-602(1983); J. Exper. Med. 158:1785-180(1983)]에 기술되어 있다.

백혈구 세포 표면에서 이러한 부착 단백질 계열의 어떠한 일원도 정상적인 양으로써 발현할 수 없는 한 그룹의 환자들이 확인되었다[참조: Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677(1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689(1985)]. 이 환자들로부터의 임파구는 시험관내에서 CD-18 분자 계얼이 항체에 의해 길항되어 온 정상의 대조환자로부터의 임파구의 유사한 결함을 나타내었다. 더우기, 이들 환자는 이들의 세포가 세폭기질에 부착할 수 없기 때문에 정상의 면역반응을 개시할 수 없다[참조: Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44:2671-2677(1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689(1985)]. 이 데이타는 CD-18 계열의 작용성 부착 분자의 결핍으로 인해 임파구가 정상적인 양식으로 부착할 수 없을때 면역반응이 약화됨을 보여준다.

즉, 요약하면, 동물의 건강과 생존성을 유지시켜주는 백혈구의 능력에는 이들이 다른 세포(예: 내피세포)에 부착할 수 있어야함이 요구된다. 이러한 부착은 백혈구의 세포 표면에 존재하는 특이적 수용체 분자를 포함하는 세포-세포 접촉을 필요로 하는 것으로 밝혀졌다. 이들 수용체는 백혈구가 다른 백혈구 또는 내피세포, 및 다른 비-혈관세포에 부착할 수 있도록 해준다. 세포 표면 수용체 분자는 서로 상당히 유관한 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포 표면 수용체 분자가 결핍되어 있는 백혈구를 지닌 사람은 만성적이고 재발성인 감염증, 및 불완전 항체 반응을 포함한 다른 임상증상을 나타낸다.

백혈구 부착은 외래 조직을 동정하여 거부하는 과정과 관련되어 있기 때문에, 이러한 과정을 이해하는 것은 기관이식, 조직이식, 알레르기 및 종양학 분야에서 매우 가치있는 일이다.

본 발명은 세포간 부착분자-2(ICAM-2) 및 이의 작용성 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 ICAM-2의 작용을 억제할 수 있는 항체 또는 항체의 단편, 및 ICAM-2 작용의 다른 억제제에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 상기한 모든 분자의 진단학적 및 치료학적 용도를 포함한다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 실질적으로 천연 오염물이 제거된, 세포간 부착분자 ICAM-2, 또는 이의 작용성 유도체를 포함한다.

또한, 본 발명은 하기 그룹중에서 선택된 하나 이상의 폴리펩타이드를 함유하는 ICAM-2에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 ICAM-2 또는 이의 작용성 유도체를 암호화하거나 발현할 수 있는 재조합 또는 합성 DNA분자를 제공한다.

본 발명은 또한 ICAM-2, 및 ICAM-2의 작용성 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자와 결합할 수 있는 항체, 및 특히 모노클로날 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기의 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포를 제공한다.

본 발명은,

(a) ICAM-2 발현 세포, ICAM-2 발현 세포의 막, ICAM-2, 담체에 결합된 ICAM-2, ICAM-2의 펩타이드 단편 및 담체에 결합된 ICAM-2의 펩타이드 단편으로 이루어진 그룹중에서 선택된 면역원으로 동물을 면역화시키는 단계,

(b) 동물의 비장세포를 골수종 세포주와 융합시키는 단계,

(c) 융합된 비장 및 골수종 세포가 항체 분비 하이브리도마 세포를 형성하도록 허용하는 단계, 및

(d) ICAM-2와 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있는 목적하는 하이브리도마 세포에 대해 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하는, ICAM-2 또는 이의 작용성 유도체와 결합할 수 있는 항체를 생성하는 목적한 하이브리도마 세포의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체;ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2, ICAM-2의 작용성 유도체; 및 ICAM-1 또는 CD-18 분자 계열의 일원이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제로 이루어진 그룹중에서 선택된 소염제를, 염증을 억제하기에 충분한 양으로써 염증의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 제공함을 포함하여, 포유동물에서 특이적인 방어계의 반응으로 생성된 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체 단편; ICAM-2; ICAM-2의 작용성 유도체; 독소-유도체화된 ICAM-2 및 ICAM-2의 독소-유도체화된 작용성 유도체; 및 ICAM-1 또는 CD-18 분자 계열의 일원이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제를 전이를 억제하는데 충분한 양으로써 조혈성 종양세포의 치료를 필요로 하는 환자에게 제공함을 포함하여, 이주용의 CD-18 계열의 일원(특허 LFA-1)을 지닌, 조혈종양 세포의 전이를 억제하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체 단편; ICAM-2; ICAM-2의 작용성 유도체; ICAM-1 또는 CD-18 분자 계열의 일원이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제; CD-18 분자 계열의 독소-유도체화된 일원 및 CD-18 분자 계열의 일원의 독소-유도체화된 작용성 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제를 ICAM-2-발현 종양 세포 성장을 억제하는데 충분한 양으로써 ICAM-2-발현 종양 세포 성장을 억제하는 치료를 필요로하는 환자에게 제공함을 포함하여, ICAM-2-발현 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은

(a) ICAM-2 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자의 존재하에서 ICAM-2 발현 세포 또는 세포의 추출물을 배양하는 단계 및

(b) 핵산분자가 상기의 세포 또는 세포추출물중에 존재하는 상보적인 핵산분자와 하이브리드화 되었는지를 측정하는 단계를 포함하여, ICAM-2 발현 세포의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한,

(a) ICAM-2와 결합할 수 있는 항체, ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편, ICAM-2, ICAM-2의 작용성 유도체 및 ICAM-1 또는 CD-18 분자 계열의 일원이 아닌 ICAM-2의 비면역글로불린 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 소염제를 단독으로, 또는

(b) 면역억제제와 배합하여 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

제1도에서, A)는 ICAM-1 cDNA로 형질감염된 COS세포를 LFA-1-피복된 플레이트상에 팬닝(panning)하고 제1MAb로서 항-ICAM-1-모노클로날 항체 RR1/1을 사용한 간접적인 면역형광 유동 혈구 계산기에 의해 ICAM-1의 발현을 분석한 결과이다[비팬닝세포(점선), 부착되지 않은 세포(파선), 부착 세포(일직선)]. B)는 ICAM-1 또는 ICAM-2를 발현하는⁵¹Cr-표지된 형질감염 COS세포를 MAb의 존재하에서 LFA-1-피복된 플라스틱에 결합시킨 결과이다.

제2도에서, 아미노산 서열의 번호는 시그날 펩타이드의 예상된 절단부위를 수반하는 첫번째 잔기에서 시작하여 매긴 것이다. 소수성의 추정 시그날 펩타이드와 전이막 서열(TM)에 밑줄을 쳤다. 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위는 □로 표시하였다. 추정의 폴리아데닐화 시그날 AATACA에는 윗줄을 그었다. 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위는 □로 표시 하였다. 추정의 폴리아데닐화 시그날 AATACA는 밑줄을 그었다. ICAM-2 cDNA의 쇄 모두는 제조자의 추천(Sequenase,U.S. Biochemical)에 따른 상보적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 연속적인 합성과 디데옥시뉴클레오타이드 쇄 종결 서열분석[참조: Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467(1977)]으로 CDM8내에서 서열분석되었다.

제3도에서, 노던(A 및 B) 및 서던(C) 블롯은 1.1kb의³²P표지된 ICAM-2 cDNA(A및 C)와 하이브리드화시키고 3kb의³²P 표지된 ICAM-1 cDNA(B)와 재하이브리드화시킨다. 버킷(Burkitt) 임파종 세포주인 라모스(Ramos)(1 레인), 내피세포(2 레인), LPS로 3시간동안 자극시킨 내피세포(3 레인), EBV로 사멸시킨 B-임파아구종 세포주인 BBN(4 레인),내피 암 세포주인, 헬라(HeLa)(5 레인), T 임파종 세포주인 저켓(Jurkat)(6 레인) 및 SKW-3(7 레인), 및 전단구 세포주, U937(8 레인)으로부터의 폴리(A)⁺RNA 6㎍(A 및 B). EcoRI(1 내지 3 레인) 또는 Hind III(4 내지 6 레인)으로 분해시킨 B 세포주 BL-2(1 레인 및 4레인),ER-LCL(2 레인 및 5 레인)및 라지(Raji)(3 및 6 레인)으로부터의 게놈성 DNA 6㎍(C). ICAM-2 및 ICAM-1 mRNAs는 화살표로 나타낸다.

제4도에서는, ICAM-2의 전체 201개 잔기의 세포외 서열을 ALIGN 프로그램[참조: Dayhoff, M.O.et al., Methods Enzymol. 91:524-545(1983)]의 사용 및 조사에 의해 ICAM-1 잔기 1 내지 185와 정렬시켰다. ICAM-2 잔기에는 번호를 매겼다. 상동부분은 □로 표시하였다. D1 및 D2는 ICAM-2 및 ICAM-1의 Ig-유사 도메인의 경계면을 나타낸다. ICAM-2의 β쇄 예상 잔기(Chou, D.Y. et al., Biochemistry 13;211-245(1974)에는 윗줄을 긋고, ICAM-1의 것에는 밑줄을 그었다.

본 발명의 한 양태는 LFA-1에 대한 천연의 결합 리간드의 발견에 관한 것이다. 세포 부착의 과정중에 포함되는 CD-18 계열의 것과 같은 분자를 부착분자라 언급한다.

I. LFA-1 및 ICAM-1

백혈구 부착분자 LFA-1은 면역 및 염증시 다른 세포와의, 임파구, 단핵구, 천연 킬러 세포(killer cell)및 과립구 반응을 중재한다[참조: Springer, T.A. et al., Ann, Rev. Immunol.5:223-252(1987)].

LFA-1은 세포간 부착분자 1(ICAM-1)에 대한 수용체이고, 표면 분자는 일부 조직에 구성적으로 발현되며 염증상태의 다른 조직에서 유도된다[참조: Marlin, S.D. et al., Cell 51:813-819(1987); Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254(1986); Dustin, M.L. et al., J. Immunol.Today 9:213-215(1988); 미합중국 특허원 제 07/019,440호(출원일 1987. 2. 26 및 미합중국 특허원 제 07/250,446호(출원일 1988. 9.28 이들 두 특허원은 본 명세서에서 참조문헌으로 인용됨].

LFA-1은 다른 세포 유형과의 항원-특이적 및 항원-독립적인 T 세포 독성인 T 헬퍼(helper), 천연킬러, 과립구 및 단핵구 상호작용 모두에 작용한다. [참조: Springer, T.A. et al., Ann, Rev. Immunol.5:223-252(1987); Kishimoto, T.K. et al., Adv. Immunol.(1988, in press)]. LFA-1은 비공유적으로 연합된 180 및 95kD의 α 및 β 당단백질 소단위를 갖는, 백혈구 인테그린(integrin)이다.

ICAM-1은 상이한 세포유형에 따라 76 내지 114kD의 다양한 질량을 갖는 일본 쇄 당단백질이며 5개의 C-유사 도메인을 지닌 Ig 슈퍼계열(superfamily)의 일원이다[참조: Dustin, M.L. et al., J. Immunol.Today 9:213-215(1988); Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933(1988); Simmons, D. et al., Nature 331:624-627(1988)]. ICAM-1은 광범위한 유형의 세포에서 IFN-｜C, TNF 및 IL-1을 포함하는 사이토킨에 의해 고도로 유도된다[참고: Dustin, M.L. et al., J. Immunol. Today 9:213-215(1988)]. 상피세포, 내피세포 및 섬유 아세포에서의 ICAM-1의 유도는 임파구의 LFA-1 의존적인 부착을 중재한다[참조: Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254(1986); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol. 107:321-331(1988); Dustin, M.L. et al., J. Exp. Med. 167:1323-1340(1988)]. 임파구를 LFA-1 MAb로 예비 처리하거나 다른 세포를 ICAM-1 MAb로 예비 처리하면 부착이 차단된다[참조: Dustin, M.L. et al., J. Immunol. 137:245-254(1986); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol. 107:321-331(1988); Dustin, M.L. et al., J. Exp. Med. 167:1323-1340(1988)]. 인공막내에서 또는 페트리디쉬상에서, 정제된 ICAM-1에 의한 결과의 동일성은 LFA-1 및 ICAM-1이 서로에 대한 수용체임을 입증하는 것이다[참조: Marlin, S.D. et al., Cell 51:813-819(1987); Makgoba, M.W. et al., Nature 331:86-88(1988)]. 명확히 하기 위해, 이들을 본 명세서에는 각각 수용체 및 리간드로 언급한다. ICAM-1에 대한 더욱 상세한 설명은 미합중국 특허원 제 07/045,963호; 제 07/115,798호; 제 07/155,943호; 제 07/189,815호 또는 제 07/250,446호(이들 모든 특허원은 본 명세서에 참조문헌으로 인용된다)에 기술되어 있다.

II. ICAM-2

ICAM-1과 상이한 제2의 LFA-1 리간드가 제시되었다[참조: Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274(1986); Makgoba, M.W. et al., Eur. J. Immunol. 18:637-640(1988); Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol. 107-321-331(1988)]. 본 발명은 이러한 제2의 리간드인 ICAM-2(세포간 부착분자-2)에 관한 것이다.

ICAM-2는 세포분포 및 사이토킨 유도의 결핍 측면에서 ICAM-1과는 다르다. ICAM-2는 2개의 Ig-유사 도메인을 지닌 내막 단백질인 반면, ICAM-1은 5개의 Ig-유사 도메인을 갖는다[참조: Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933(1988); Simmons, D. et al., Nature 331:624-627(1988)]. 특히, ICAM-2는, ICAM-1 또는 ICAM-2가 Ig 슈퍼계열의 다른 일원과 관련된 것보다, ICAM-1의 2개의 N-말단 도메인 대부분과 더욱 밀접히 관련되어 있으며(34%가 동일성), 이러한 사실은 ICAM-2가 동일한 인테그린 계열 수용체와 결합하는 Ig-유사 리간드의 아군임을 입증한다.

III. ICAM-2의 cDNA 클로닝

다양한 방법들을 사용하여 ICAM-2 유전자를 클로닝시킬 수 있다. 이중 한가지 방법은 ICAM-2 유전자를 함유하는 삽입체의 존재에 대해 cDNA 삽입체(ICAM-2 발현 세포로부터 기원함)의 셔틀 벡터 라이브러리를 분석하는 것을 포함한다. 이러한 분석은 세포를 벡터로 형질감염시킨후, ICAM-2의 발현에 대해 검정함으로써 수행할 수 있다.

ICAM-2 cDNA는 Aruffo 및 Seed 방법의 신규 변형법[참조: Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369(1987)]을 부착분자의 리간드를 동정하는데 이용하는 경우, 바람직하게 동정된다. 이 방법에서, cDNA 라이브러리는 ICAM-2를 발현하는 세포(예: 내피세포 또는 Ramos, BBN B, 임파아구종 세포주, U937 단핵성 세포주 또는 SKW3 임파아구종 세포주)로부터 제조한다. cDNA 라이브러리는, 바람직하게는 내피세포로부터 제조한다. 이 라이브러리를 사용하여 ICAM-2를 정상적으로 발현하지 않는 세포(예: COS 세포)를 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 미리 LFA-1으로 피복시킨 페트리디쉬에 넣는다. ICAM-1 또는 ICAM-2 암호화 서열로 형질감염되어 세포 표면에서 이들 리간드중 하나를 발현하는 COS세포는 페트리 디쉬 표면의 LFA-1에 부착할 것이다. 부착되지 않은 세포는 세척해 버린 후, 페트리디쉬로부터 부착 세포를 제거하고 배양한다. 이 세포에서 재조합 ICAM-1 또는 ICAM-2 발현 서열을 제거한 후, 이 서열이 ICAM-1 또는 ICAM-2를 암호화하는지를 결정하기 위해 서열분석한다.

상기 방법의 바람직한 양태로 ICAM-1 발현 세포의 부착을 방지하기 위하여 항-ICAM-1 항체를 페트리디쉬에 가한다. LFA-1에 대한 ICAM-2 형질감염된 COS 세포의 결합은 EDTA 및 항-LFA-1 모노클로날 항체(MAb)에 의해 억제되나, 항-ICAM-1 MAb에 의해서는 억제되지 않는다. 그러므로, 이 양태에서, ICAM-1 발현 세포는 ICAM-1을 통해 페트리디쉬에 부착할 수 없기 때문에 다른 부착되지 않은 세포 모두와 함께 대부분 세척 제거된다. 그 결과, 단지 ICAM-2 발현 세포만이 페트리디쉬에 부착할 수 있다.

따라서, cDNA 클론은 COS 세포내에서 발현시킨후, 플라스틱 페트리디쉬에 미리 결합시킨 정제된 작용적-활성 LFA-1을 사용하여 리간드-함유 COS 세포에 대해 팬닝(panning) 함으로써 스크리닝된다. 팬닝시킨후, 부착되지 않은 세포에는 ICAM-2⁺세포가 포함되어 있지 않은 반면, LFA-1-피복된 플라스틱으로부터 EDTA에 의해 방출된 부착 세포는, 거의 완전한 ICAM-2⁺이다. LFA-1-피복된 플라스틱에 대한 ICAM-1⁺세포의 부착은 RR1/1항-ICAM-1 MAb에 의해 억제될 수 있다.

즉, ICAM-2의 cDNA를 클로닝시키기 위한 상기 방법에 따라, LFA-1-의존성 부착의 ICAM-1-의존성 및 ICAM-1-독립성 성분 모두를 입증하는 cDNA 라이브러리[참고: Dustin, M.L. et al., J. Cell Biol. 107:321-331(1988)]를 내피세포로부터 적절한 플라스미드(예: 플라스미드 벡터 CDM8)를 사용하여 제조한다. ICAM-1 cDNA의 분리 가능성을 감소시키기 위해 존재하는 항-ICAM-1 MAb와 함께 형질감염된 COS 세포를 LFA-1-피복된 페트리디쉬내에서 배양한다. 부착 세포를 EDTA로 용출시키고 플라스미드를 분리한후 이 콜라이내에서 증폭시킨다. 약 3회 주기의 형질감염, 부착, 및 플라스미드 분리와 1회의 사이즈별 분획화를 수행한후, 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 분해시켜 분석할 수 있다. 형질감염에 의해 COS 세포내로 도입시켰을 경우, 1.0kb이상의 삽입체를 지닌 플라스미드의 약 1/3이 LFA-1에 부착하게 된다.

다른 한편, 유전자 코드[참조: Watson, J.D., In: Molecular Biology of the Gene. 3rd Ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA(1977), pp.356-357]를 사용하여 ICAM-2 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 서열을 측정함으로써 ICAM-2의 cDNA 클론을 수득할 수 있다.

ICAM-2 cDNA의 클론은 또한 ICAM-2 단백질의 펩타이드 단편의 아미노산 서열을 동정한 후 ICAM-2 펩타이드를 암호화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브 분자를 작제하기 위한 유전 코드를 사용함으로써 수득할 수 있다. 이어서, 프로브를 사용하여 ICAM-2 단백질을 암호화하는 cDNA 라이브러리(ICAM-2 발현 세포의 cDNA로부터 제조됨)의 일원들을 검출(하이브리드화를 통해)한다.

상기한 바와 같은 기술 또는 이와 유사한 기술을 이용하여 사람 알데하이드 데하이드로게나제[참조: Hsu, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3771-3775(1985)], 피브로넥틴[참조: Suzuki, S. et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J. 4:2519-2524(1985)], 사람 에스트로겐 수용체 유전자[참조: Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7889-7893(1985)], 조직-유형 플라스미노겐 활성화제[참조: Pennica, D. et al., Nature 301:214-221(1983)]및 사람 임신 말기의 태반 알칼리성 포스파타제 상보성 DNA[참조: Kam, W. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA82:8715-8719(1985)」에 대한 유전자들의 클로닝을 성공적으로 수행할 수 있다.

ICAM-2 유전자를 클로닝시키는 또다른 방법으로서는, ICAM-2를 발현할 수 있는 세포로부터의 DNA, 더욱 바람직하게는 cDNA를 발현벡터에 클로닝시켜 발현벡터의 라이브러리를 제조한다. 이어서, 항-ICAM-2 항체와 결합하는 단백질을 발현할 수 있고, ICAM-2또는 ICAM-2 단편과 동일한 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖고 있는 일원에 대하여 라이브러리를 스크리닝한다.

상기의 방법중 한 방법을 사용하여 수득한, 클로닝된 ICAM-2유전자를 발현 벡터에 작동적으로 연결시킨 후, 세균 또는 진핵 세포내로 도입시켜 ICAM-2 단백질을 생산할 수 있다.

이 조작을 위한 기술은 문헌[참조: Maniatis, T. et al., supra]에 기술되어 있으며, 당해 분야에 공지되어 있다.

IV. 본 발명의 제제: ICAM-2 및 이의 작용성 유도체, 작용제 및 길항제

본 발명은 ICAM-2, 이의 작용성 유도체 및 이의 작용제와 길항제에 관한 것이다.

A. ICAM-2의 작용성 유도체

ICAM-2의 작용성 유도체는 ICAM-2의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(작용성 또는 구조적)을 갖는 화합물이다. 용어 작용성 유도체는 분자의 단편, 변이체, 동족체 또는 화학적 유도를 포함한다.

ICAM-2와 같은 분자의 단편은 이 분자의 모든 폴리펩타이드 부류를 언급한다. ICAM-2 활성을 가지고 가용성인(즉, 막 결합되지 않는) ICAM-2의 단편이 특히 바람직하다.

ICAM-2와 같은 분자의 변이체는 전체 분자 또는 이의 단편과 구조상 및 작용상 실질적으로 유사한 분자를 언급한다.

ICAM-2와 같은 분자의 동족체는 전체 분자 또는 이의 단편과 작용상 실질적으로 유사한 분자를 언급한다.

분자 모두가 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 유사한 생물학적 활성을 나타낸다면, 한 분자는 다른 분자에 대해 실질적으로 유사하다라고 언급한다. 따라서, 두 분자중 한 분자의 구조가 다른 분자 구조내에서는 발견되지 않거나, 아미노산 잔기의 서열이 서로 동일하지 않다할지라도 두 분자가 유사한 활성을 나타낼 경우, 이들 두 분자는 본 명세서에서 상기 용어로서 사용될때 변이체를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와같이, 항 분자가 통상적으로 그 분자의 일부는 아니지만 추가의 화학적 잔기를 함유할 경우, 이 분자는 또 다른 분자의 화학적 유도체로 언급될 수 있다. 이러한 잔기는 분자의 가용성, 흡수성, 생물학적 반감기 등을 증진시킬 수 있다. 한편으로, 이 잔기들은 분자의 독성을 감소시킬 수 있고, 분자의 바람직하지 않은 어떠한 부작용 등도 제거시키거나 약화시킬 수 있다. 이러한 효과를 중재할 수 있는 잔기는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)]에 기술되어 있다.

독소-유도체화된 분자는 특정 부류의 화학적 유도체를 구성한다. 독소-유도체화된 분자는 독소 잔기를 함유하는 분자(예, ICAM-2 또는 항체)이다. 세포에 이러한 분자의 결합으로 인해 독소 잔기가 세포와 매우 근접하게 존재하므로 세포 사멸이 촉지된다. 적합한 어떠한 독소잔기라도 사용될 수 있지만, 예를 들면, 리신 독소, 콜레라 독소, 디프테리아 독소, 방사성동위원소 독소, 막-채널-형성 독소 등과 같은 독소를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 잔기를 분자에 커플링시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

약 100개 이하의 잔기를 갖는 ICAM-2의 작용성 유도체가 시험관내 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 경우에 따라 이러한 단편은, 정제된 단백질 또는 조단백질의 타겟화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 변형시킬 수 있다. 생성된 공유결합 유도체를 사용하여 생물학적 활성에 중요한 잔기를 동정할 수 있다.

가장 통상적으로, 시스테이닐 잔디를 α-할로 에세테이트(및 상응하는 아민)(예, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드)와 반응시켜 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 수득한다. 시스테이닐 장기를 또한, 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β(5-이미도조일) 프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시켜 유도체화시킨다.

히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸프로카보네이트와 반응시킴으로써 유도체화시키는데, 이는 이 시약이 히스티딜 측쇄에 대해 비교적 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드 또한 유용한데, 이 반응은 pH 6.0의 0.1M 나트륨 카코딜레이트중에서 수행하는 것이 바람직하다.

리시닐 및 아미노 말단 잔기는 석신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응시킨다. 이들 제제를 사용한 유도체화는 리시닐 잔기는 전하를 반전시키는 효과를 가져온다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 다른 시약은 메틸 피콜린 이미데이트와같은 이미도에스테르; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠 설폰산; 0-메틸-이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트와의 반응을 촉매하는 트랜스 아미나제를 포함한다.

아르기닐 잔기는 하나 또는 수개의 통상적인 시약(예, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온, 및 닌하이드린)과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는, 구아니딘 작용성 그룹의 높은 pK_a때문에 반응을 알칼리성 조건하에서 수행시켜야 하는 것을 필요로 한다. 또한, 이들 시약은 리신 그룹 및 아르기닌 ε-아미노 그룹과 반응할 수도 있다.

티로실 잔기의 특이적 변형에 관한 연구가 집중적으로 이루어져 왔는데, 이중 특히 관심있는 것은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라 니트로메탄과 반응시킴에 의해 분광 표지를 티로실 잔기내로 도입시키는 것이다. 가장 통상적으로는, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 0-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 생성시킨다.¹²⁵I 또는¹³¹I를 사용하여 티로실 잔기를 요오드화함으로써 방사선 면역검정법에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하는데, 이때 클로르아민 T 방법이 적합하다.

카복실 측쇄 그룹(아스파르틸 또는 글루타밀)은 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐)-(4-에틸)카보디이미드 또는 1-에틸-3(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카보디이미드와 같은 카보디이미드(R'-N-C-N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 개질된다. 또한, 하스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환된다.

이작용성 제제를 사용한 유도체화는, ICAM-2 작용성 유도체 융합 폴리펩타이드를 절단시켜 절단된 폴리펩타이드를 방출시킨 다음 이를 회수하는 방법중에 사용하기 위하여 ICAM-2 작용성 유도체 분자를 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합시키는데 유용하다. 통상적으로 사용된 가교결합제는 예를 들면, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시석신이미드 에스테르(예를들면, 4-아지도 살리사이클산과의 에스테르), 디석신이미딜에스테르[예, 3,30g-디티오비스(석신이미딜프로피오네이트)]를 포함한 동이작용성 이미도에스테르, 및 이작용성 말레이미드(예, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄)를 포함한다. 메틸 3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광 존재하에 가교 결합을 형성시킬 수 있는 광적용가능한 중간물질을 생성시킨다. 한편으로, 시아노겐 브로마이드-활성화된 탄수화물과 같은 반응성 수-불용성 매트릭스, 및 미합중국 특허 제 3,969,287호: 제 3,691,016호; 제 4,195,128호; 제 4,247,642호; 제 4,229,537호; 및 제 4,330,440호에 기술된 반응성 기질이 단백질 고정화에 이용된다.

글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 또 한편으로, 이들 잔기는 약 산성 조건하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 양형태는 본 발명의 범위내에 포함된다.

다른 변형으로는 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 테오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 그룹의 메틸화[참조: T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 몇몇 경우에 있어서는, C-말단 카복실 그룹의 아미드화가 있다.

변형된 아미노산 서열을 갖는 ICAM-2 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 제2도에 제시된다. 이러한 변이체로는, 예를들면 제2도에 나타낸 아미노산 서열내 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 또한, 최종 작제물이 바람직한 활성을 가질 경우 최종 작제물 제조에 사용될 수 있다. 명백하게, 변이체를 암호화하는 DNA내에서 이루어질 돌연변이는 서열을 판독 프레임에서 이탈시켜서는 안되며, 바람직하게는 mRNA 2차 구조를 생성시킬 수 있는 상보영역을 생성해서는 안된다[참조: 유럽 공개특허공보 제 75,444호].

유전적 차원에서, 이들 작용성 유도체는 통상적으로, ICAM-2 분자를 암호화하는 DNA중의 뉴클레오타이드를 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해서, 작용성 유도체를 암호화하는 DNA를 생성한후, 재조합 세포 배양물중에서 DNA를 발현시킴으로써 제조된다. 이러한 작용성 유도체는 일반적으로, 천연 동족체와 동일한 정성적(qualitative) 생물학적 활성을 나타낸다. 그러나, 이들 작용성 유도체의 상기 특징들이 정상적으로 생성된 ICAM-2 분자에 대해서는 실질적으로 상이할 수 있다.

아미노산 서열 변이체를 도입하는 부위가 예정되어 있다할지라도, 돌연변이자체는 예정될 필요가 없다. 예를들면, 제시된 부위에서 돌연변이의 수행을 최적화하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 무작위적 돌연변이 유발을 수행할 수 있으며 발현된 ICAM-2 작용성 유도체는 목적 활성을 최적 배합시키기 위해 스크리닝된다. 공지된 서열을 갖는 DNA중의 예정 부위에서 치환 돌연변이체를 제조하기 위한 기술은, 예를들면 부위-특이적 돌연변이 유발로 널리 공지되어 있다.

본 발명에 따른 ICAM-2 작용성 유도체 분자의 제조는 바람직하게는, 앞서 제조된 작용성 유도체 또는 단백질의 비변이체를 암호화하는 DNA의 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 달성된다. 부위-특이적 돌연변이유발은, 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 서열, 및 충분한 수의 인접한 뉴클레오타이드의 사용을 통하여, 충분한 크기와 서열 복합성의 프라이머 서열을 제공하여 가로지른 결실 연결부의 양측에 안정한 듀플렉스(duplex)를 형성시킴으로써 ICAM-2 작용성 유도체를 제조할 수 있게 한다. 일반적으로, 길이가 약 20 내지 25개 뉴클레오타이드인 프라이머가 바람직하며, 이때 서열 연결부의 양측에 있는 약 5 내지 10개 잔기가 변형된다. 일반적으로, 부위-특이적인 돌연변이 유발 기술은 본 명세서내에 참조문헌으로 삽입된 문헌[참조: Adelman et al., DNA 2:183(1983)]에 의해 예시된 바와같이, 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

인식된 바와 같이, 이러한 부위-특이적 돌연변이 유발 기술은 일반적으로 일-본쇄 및 이-본쇄 형태 둘다로 존재하는 파아지 벡터를 사용한다. 부위-지시된 돌연변이 유발에 유용한 대표적인 벡터는, 예를 들면 본 명세서내에 참조문헌으로 삽입된 문헌[참조: Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam(1981)]에 기술된 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지는 용이하게 입수가능하며 이들의 용도는 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 또다른 한편으로는, 일-본쇄 파아지의 복제 오리진을 함유하는 플라스미드 벡터[참조: Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3(1987)]을 사용하여 일-본쇄 DNA를 수득할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 부위-지시된 돌연변이 유발은 먼저, 이의 서열내에 관련 단백질을 암호화하는 DNA서열을 포함하는 일-본쇄 벡터를 수득함으로써 수행한다. 목적한 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는, 예를 들면 문헌[참조: Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 75:5765(1978)]에 기술된 일반적 합성법으로 제조한다. 그 다음, 이 프라이머를 일-본쇄 단백질-서열-함유 벡터와 함께 어닐링시키고, 이.콜라이 폴리머라제 I 클레노우 단편과 같은 DNA -중합 효소를 사용하여 돌연변이-보유 쇄의 합성을 완료시킨다. 따라서, 돌연변이된 서열 및 제2쇄는 목적한 바와같이 돌연변이되어 있다. 그 다음, 이러한 헤테로듀플렉스 벡터(heteroduplex vector)를 사용하여 적절한 세포(예, JM101 세포)를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.

이러한 클론을 선별한후, 돌연변이된 단백질 영역을 제거시킬 수 있으며 이를, 단백질을 생성시키기 위한 적절한 벡터, 일반적으로 적절한 숙주의 형질전환에 사용될수 있는 유형의 발현 벡터내에 놓아둔다.

아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1 내지 30개 잔기, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개 잔기이며, 통상적으로 이러한 결실은 지속된다. 결실은 또한, ICAM-2의 도메인 1 또는 2와 같은 면역글로불린 도메인을 포함할 수도 있다. 아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기로부터 필수적으로 제한되지 않은 길이의 폴리펩타이드로의 아미노 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열재 삽입을 포함한다. 서열재 삽입(즉, 완전한 ICAM-2 분자 서열재에서의 삽입)은 일반적으로 약 1 내지 10개의 잔기, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 잔기일 수 있다. 말단 삽입의 한 예는, 시그날 서열이 숙주 세포에 대해 이종이든 동종이든 간에, 이를 분자의 N-말단에 융합시켜 재조합 숙주로부터의 ICAM-2 작용성 유도체의 분비를 촉진시키는 것을 포함한다.

작용성 유도체의 세번째 그룹은 ICAM-2 분자중의 하나 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 단지 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 이의 위치에 다른 잔기가 삽입된 작용성 유도체이다. 이러한 치환은 바람직하게는, 이 치환이 ICAM-2 분자의 특징을 잘 조절하는데 바람직할 경우, 하기 표에 따라서 이루어진다.

표 1에서의 치환보다 덜 보전적인 치환을 선택함으로써, 즉 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선 구조와 같은, 치환 영역내 폴리펩타이드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 대한 이들의 효과가 더욱 현저하게 상이한 잔기를 선택함으로써 작용성 또는 면역학적 본체의 실질적인 변화가 이루어진다. 이러한 치환은 일반적으로, (a) 글리신 및/또는 프롤린이 또다른 아미노산 에 의해 치환되거나, 결실되거나 삽입되고; (b) 친수성 잔기(예, 세릴 또는 트레오닐)가 소수성 잔기(예, 루이실, 이소루이실, 페닐알라닐, 발릴, 또는 알라닐)로 치환되며; (c) 시스테인 잔기가 또다른 잔기로 치환되고; (d) 양전기를 띈 측쇄를 갖는 잔기(예, 리실, 아르기닐 또는 히스티딜)가 음전기를 띈 잔기(예, 글루타밀 또는 아스파르틸)로 치환되거나; (e) 벌크 측쇄를 갖는 잔기(예, 페닐알라닌)가 이러한 측쇄를 갖지 않는 잔기(예, 글리신)로 치환되는 것으로 기대된다.

대부분의 결실 및 삽입, 및 특히 치환은 ICAM-2 분자의 특징에 있어서의 라디칼 변화를 일으키지 않는 것으로 기대된다. 그러나, 이와 같이 진행되기 앞서 치환, 결실 또는 삽입의 정확한 효과를 예견하기가 어려울 경우, 당해 분야의 전문가는 이러한 효과를 통상의 스크리닝 검정으로 평가할 것으로 인식된다. 예를들면, 작용성 유도체는 일반적으로, 본래의 ICAM-2 분자-암호화 핵산을 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 제조하고, 이 변이체 핵산을 재조합체 세포 배양물중에서 발현시키며, 임의로 예를 들면, 항-ICAM-2 분자 항체 컬럼상에 면역 친화성 흡착(이를 하나 이상의 나머지 면역 에피토프에 결합시킴에 의해 작용성 유도체를 흡수 하도록 하기 위하여)시킴으로써, 세포 배양물로 부터 정제시켜 제조한다.

ICAM-2의 친화성을 증가시키도록 고안된 돌연변이는 ICAM-2중의 동일 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 도입함으로써 개시될 수 있다. 유사하게는, 이러한 변이체 ICAM-2 분자는 ICAM-2중의 동일 위치에 N-연결된 CHO가 결핍된 형태로 제조될 수 있다.

그 다음, 목적하는 특징을 알아보기 위하여, 세포 용해물 도는 정제된 ICAM-1 분자 작용성 유도체의 활성을 적합한 스크리닝 검정으로 스크리닝시킨다. 예를 들면, 적의 면역학적 특닝(예, 제시된 항체에 대한 친화성)의 변화는 경쟁적 유형의 면역검정법으로 측정한다. 면역조절 활성의 변화는 적절한 검정에 의해 측정한다. 산화환원(redox)또는 열 안정성, 생물학적 반감기, 소수성, 단백질 분해에 대한 민감성 또는 담체와 함께 응집되거나 다량체(multimer)로 응집되는 경향과 같은 단백질 특성의 변형은 당해 분야의 전문가에게 널리 공지된 방법으로 검정한다.

B. ICAM-2의 작용제 및 길항제

ICAM-2의 작용제는 이의 어떠한 생물학적 기능도 수행할 수 있는 ICAM-2의 능력을 향상시키서나 증가시키는 화합물이다. 이러한 작용제의 한 예는 세포성 수용체 또는 바이러스성 단백질과 결합하는 ICAM-2의 능력을 증가시키는 제제이다.

ICAM-2의 길항제는 이의 어떠한 생물학적 작용도 수행할 수 있는 ICAM-2의 능력을 감소시키거나 방지하는 화합물이다. 이러한 길항제의 예로는 ICAM-1, ICAM-1의 작용성 유도체, 항-ICAM-2 항체, 항-LFA-1 항체 등이 있다.

본 명세서내에 참조문헌으로 삽입된 미합중국 특허원 제 07/045,963호; 제 07/115,798호; 제07/155,943호; 제 07/189,815호 또는 제 07/250,446호에 기술된 세포성 응집 검정으로 LFA-1의존성 응집을 측정할 수 있으며, 이러한 검정을 수행하여 ICAM-2/LFA-1 응집 정도에 영향을 주는 제제를 동정할 수 있다. 따라서, 이러한 검정을 사용하여 ICAM-2의 작용제 및 길항제를 확인할 수 있다. 길항제는 응집을 중재하는 LFA-1 또는 ICAM-2의 능력에 손상을 가함으로써 작용할 수 있다. 부가적으로, 비-면역글로불린(즉, 화학적)제제는 상기-언급된 검정을 사용하여 검사하여, 이들이 ICAM-2/LFA-1 응집의 작용제인지 또는 길항제인지를 측정한다.

C. 항-ICAM-2 항체

본 발명에 따른 바람직한 면역글로불린 길항제는 ICAM-2에 대한 항체이다. 적합한 항체는 여러가지 다양한 방법으로 수득할 수 있다.

ICAM-2와 같은 항원성 분자는 본래 임파구의 표면에 발현된다. 따라서, 이러한 세포를 복강내 주사하여 적절한 동물내에 도입시키면, 그 결과 ICAM-2 또는 분자들의 CD-18 군의 구성원(member)과 결합할 수 있는 항체가 생성될 것이다. 경우에 따라, 이러한 동물의 혈청을 제거할 수 있으며, 이를, 이들 분자와 결합할 수 있는 폴리클로날 항체의 공급원으로 사용할 수 있다.

또다른 방법으로는, 항-ICAM-2 항체를 유럽 공개특허공보 제 289,034호(Selden, R.F.) 또는 문헌[참조: Selden R.F. et al. Science 236:714-718(1987)]에 기술된 방법을 적용시켜 제조할 수 있다. 이러한 방법의 상기 적용에 따라서, 적합한 동물(즉, 예를 들면 마우스 등)의 세포를, 완전한 ICAM-2 분자 또는 ICAM-2의 단편 둘다를 발현시킬 수 있는 벡터로 형질감염시킨다. 상기 동물의 형질감염된 세포내에서 ICAM-2의 생성은 동물내 면역 방응을 유발시킬 것이며 동물에 의한 항-ICAM-2 항체의 생성을 이끌어 낼 것이다.

또 다른 방법으로, 항-ICAM-2 항체는 ICAM-2 또는 이의 펩타이드 단편을 적당한 동물내에 도입시킴으로써 제조할 수 있다. 면역화된 동물은 이러한 노출에 반응하여 폴리클로날 항체를 생성할 것이다. ICAM-2의 펩타이드 단편을 사용함으로써 단지, 동물을 면역화시키기 위해 사용된 펩타이드 단편중에 함유된 에피토프(들)와만 반응성이 있는 영역 특이적인 항체를 수득할 수 있다.

그러나, 동물(상술된 방법들중 하나로 면역화됨)로부터 비장세포를 제거하고, 이러한 비장세포를 골수종 세포주와 함께 융합시키며, 이러한 융합세포를, ICAM-2와 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포로 형성시키는 것이 바람직하다.

상술한 방법으로 수득된 하이브리도마 세포는 다양한 방법으로 스크리닝시켜 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 목적 하이브리도마 세포를 동정할 수 있다. 바람직한 스크리닝 검정에서, 이러한 분자는 ICAM-2-발현, ICAM-1-비-발현세포의 응집을 억제하는 이들의 능력에 의해 동정된다. 그 다음, 이러한 응집을 억제시킬수 있는 항체를 추가로 스크리닝시켜 이들이 ICAM-2에 결합함에 의해 상기 응집을 억제하는지, 또는 CD-18 분자 계열의 일원과의 결합에 의해 상기 응집을 억제하는지를 측정한다. 분자의 CD-18 계열로부터 ICAM-2를 구별시킬 수 있는 어떠한 수단도 이러한 스크리닝에 사용될 수 있다. 따라서, 예를들면, 항체에 의해 결합된 항원은 면역침전법 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 분석할 수 있다. LFA-1은 발현하지만, ICAM-2는 발현하지 않은(또는 그 반대의 경우)세포와 결합하는 항체의 능력에 대해 스크리닝시킴으로써, 분자의 CD-18 계열의 일원에 결합하는 항체와 ICAM-2와 결합하는 분자를 구별할 수 있다. LFA-1은 발현시키지만 ICAM-2는 발현시키지 않는 세포에 결합하는 항체의 능력은 당해의 숙련가에 의해 통상적으로 사용된 방법으로 검출할 수 있다. 이러한 방법으로는 면역검정(특히 면역 형광성을 사용한 면역검정), 세포 응집, 여과지 결합 연구, 항체 침전 등이 포함된다.

상술된 ICAM-2의 작용성 유도체외에, 본 발명에 따라서 바이러스성 감염 또는 염증 치료에 사용될 수 있는 다른 제제는 ICAM-2 와 결합할 수 있는, ICAM-2에 대한 항체, 항-ICAM-2 항체에 대한 항-유전형 항체 및 수용체 분자, 또는 이러한 분자들의 단편을 포함한다.

사용될 수 있는 ICAM-2(또는 ICAM-2의 작용성 유도체)에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날로 존재할 수 있다.

본 발명에 중요한 항-유전형 항체는 ICAM-2와 경쟁적으로(또는 이것을 제외하고)결합할 수 있다. 이러한 항체는 예를 들면, 항체를 항-ICAM-2 항체로 끌어올린 다음, ICAM-2의 천연의 결합 리간드와 결합하는 능력에 대해 항체를 스크리닝 시킴으로써 수득할 수 있다.

CD-18 분자 계열은 ICAM-2와 결합할 수 있기 때문에, 이러한 분자(예를 들면, α 및 β 소단위 둘다를 갖는 이종이량체로서, 또는 단지 α 또는 β 소단위만으로 구성된 분자로서, 또는 하나의 소단위 또는 두개의 소단위 모두의 단편을 갖는 분자로서)의 투여는 세포에 존재하는 ICAM-2 와 결합하는 HRV와 결쟁(또는 이를 배출)할 수 있다.

본 발명에 따른 항-응집 항체는 다양한 모든 방법으로 동정하여 적정할 수 있다. 예를 들면, ICAM-2를 발현하는 세포(예, 활성화된 내피세포)에 차등적으로 결합하는 항체의 능력, 및 ICAM-2를 발현하지 못하는 세포에 결합하는 이들 항체의 불능을 측정할 수 있다. 세포 응집의 적합한 검정법은 본 명세서내에 참조문헌으로 삽입된 미합중국 특허원 제 07/045,963호; 제 07/115,798호; 제 07/155,943호; 제 07/189,815호 또는 제 07/250,446호에 기술된 것들이다. 한편으론, ICAM-2 또는 ICAM-2의 펩타이드 단편에 결합하는 항체의 능력을 측정할 수 있다. 통상의 전문가에 의해 용이하게 인식된 바와 같이, 상기 검정은 상이한 순서로 변형시키거나 수행하여 각종의 효과있는 스크리닝 검정을 제공할 수 있는데, 이들 방법 각각은 ICAM-1과 결합할 수 있는 항체와 CD-18 분자 계열의 일원과 결합할 수 있는 항체를 동정하고 이들을 구별할 수 있다.

더욱 바람직한 방법에서는, ICAM-2를 발현하는 COS 세포에는 결합하지만, ICAM-2를 발현하지 않는 COS 세포에는 결합되지 않는 능력에 대해 항체를 선별할 수 있다.

D. 본 발명에 따른 제제의 제조

본 발명에 따른 제제는 천연의 방법[예, 동물, 식물, 진균, 세균 등을 유도시켜, ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제를 생성시키거나, 동물을 유도시켜 ICAM-2 와 결합할 수 있는 폴리클로날 항체를 생성시킴]; 합성법[예, 폴리펩타이드를 합성하기위한 메리필드 방법을 사용하여 ICAM-2, ICAM-2의 작용성 유도체, 또는 ICAM-2의 단백질 길항제(면역글로불린 또는 비-면역글로불린)를 합성함]; 하이브리도마 기술(예, ICAM-2와 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 생성시킴); 또는 재조합 기술[예, 다양한 숙주)즉, 효모, 세균, 진균, 배양된 포유동물 세포 등)내에서, 또는 재조합체 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 본 발명의 제제를 생성시킴]에 의해 수득될 수 있다. 사용할 방법의 선택은 편의성, 목적 수율 등과 같은 요인에 따라서 결정될 것이다. 단지 상술된 방법, 공정, 또는 기술중 하나만을 사용하여 특수한 소염제를 제조할 필요는 없으며, 특정 제제를 수득하기 위하여 상술된 제조공정, 방법, 및 기술을 조합하여 사용할 수도 있다.

V. ICAM-2 및 이의 작용성 유도체, 작용제 및 길항제의 용도

A. 염증의 억제

본 발명에 따른 하나의 국면은, CD-18 분자 계열(특히, LFA-1)의 수용체 또는 바이러스성 단백질(예, 리노바이러스의 단백질 등)과 상호작용하는 ICAM-2 및 이의 작용성 유도체의 능력으로부터 기원한다. 당단백질의 CD-18 계열의 일원과 상호작용하는 ICAM-2의 능력으로 인해, 이를 염증을 억제하는데(즉, 방지하거나, 약화시킴)사용할 수 있다.

본 명세서내에 사용된 바와 같은 용어 염증은 특이적 방어 시스템의 반응 및 비-특이적 방어 시스템의 반응 모두를 포함한다.

본 명세서내에 사용된 바와 같이, 용어 특이적 방어 시스템은 특이적 항원의 존재에 대해 반응하는 면역 시스템의 성분을 언급한다. 염증이 특이적 방어 시스템의 반응에 의해 야기되고, 이에 의해 매개되거나 이와 연관될 경우, 염증은 특이적 방어 시스템의 반응으로부터 비롯된 것이다. 특이적 방어 시스템의 반응으로부터 비롯된 염증의 예는 항원(예, 루벨라 바이러스)에 대한 반응, 자가면역 질환, T-세포에 의해 중재된 지연형 과민감성 반응[예를 들면, 맨타욱스 시험(Mantaux test)에서 양성으로 시험된 환자에게서 관측되는 바와같음]등을 포함한다. 만성 염증성 질환 및 이식된 조직 및 기관의 거부반응은 특이적 방어 시스템의 염증성 반응에 관한 추가의 예이다.

본 명세서내에 사용된 바와같이, 비-특이적 방어계의 반응은 면역학적 기억을 할 수 없는 백혈구에 의해 중재된 반응을 언급한다. 이와 같은 세포는 과립구 및 대식 세포를 포함한다. 본 명세서내에 사용된 바와같이, 염증은, 만일 염증이 비-특이적 방어계의 반응에 의해 유발되거나, 중재되거나, 연관될때, 비-특이적 방어계의 반응으로부터 기인한다고 일컫는다. 비-특이적 방어계의 반응으로부터, 최소한 부분적으로 초래되는 염증의 예는 하기의 상태와 관련된 염증을 포함한다: 폐혈증 또는 외상에 대해 2차적인 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)또는 다발성 기관 상해 증후군; 심근 또는 다른 조직의 재관류 상해(reperfusion injury); 급성 사구체 신염; 반응성 관절염; 급성 염증 성분을 갖는 피부병; 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추신경계 염증성 질환; 열상; 혈액투석; 류카페러시스(Leukaphersis); 궤양성 대장염; 크론씨 병(Crohn's disease); 괴사성 소장결장염; 과립구 수주관련 증후군(granulocyte transfusion associated syndrome); 및 사이토킨-유도된 독성.

상기에서 논의된 바와 같이, CD-18 분자 계열의 일원에 대한 ICAM-2 분자의 결합은 세포 부착에 있어 가장 중요하다. 부착 과정을 통해, 임파구는 외래 항원의 존재에 대해 동물을 지속적으로 모니터 할 수 있다. 비록 이러한 과정이 정상적으로 바람직함에도 불구하고, 이들은 또는 기관이식거부, 조직 이식 거부 및 많은 자가면역 질환의 원인이 된다. 그리하여, 세포 부착을 악화시키거나 저해시킬 수 있는 어떠한 수단도 기관이식(특히 신장 이식), 조직이식의 수용대상자, 또는 자가 면역 환자에 있어 매우 바람직하다.

CD-18 계열의 일원에 대한 모노클로날 항체는, 내피와의 결합[참조: Haskard, D. et al., J. Immunol. 137:2901-2906(1986)], 동형 부착[참조문헌: Rothlein R.et al., J. Exp. Med. 163:1132-1149(1986)], 항원 및 미토겐 유도된 임파구의 증식[참조문헌: Davignon, D. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78:4535-4539(1981)], 항체 형성[참조문헌: Fischer, A. et al., J. Immunol. 136:3198-3203(1986)], 및 세포독성 T 세포[참조문헌: Krensky, A.M. et al., J. Immunol. 132: 2180-2182(1984)], 대식세포[참조문헌: Strassman, G. et al., J. Immunol. 136:4328-4333(1986)], 및 항체-의존성 세포의 세포 독성 반응에 관련된 모든 세포들[참조문헌: Kohl, S. et al., J. Immunol.133:2972-2978(1984)]의 용균 활성과 같은 모든 백혈구의 주효(effector)기능을 포함하는 백혈구의 많은 부착 의존성 기능을 억제한다. 상기의 모든 기능중에서, 항체는 백혈구가 적절한 세포기질에 부착하여 결국 최종 산물을 억제하는 능력을 억제시킨다. 이와 같은 기능은, 항체가 ICAM-2/LFA-1 상호작용에 관련되는 한도까지, 항-ICAM-2 항체에 의해 억제될 수 있다.

따라서, ICAM-2와 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 포유류환자에 있어서 소염제로서 사용될 수 있다. 중요하게, 이러한 제제는 부착을 선택적으로 억제할 수 있다는 점에서 일반적인 소염제와 상이하며, 통상적인 제제를 사용할때 발견되는 신장독성과 같은 다른 부작용을 유발하지 않는다.

특히 가용성 형태의 ICAM-2는 CD-18 계열의 일원에 대한 항체와 동일한 방식으로 작용할 수 있으므로, 염증을 억제하는데 사용될 수 있다. 게다가, ICAM-2의 작용성 유도체 및 길항제도 또한 염증을 억제하는데 사용될 수 있다.

1. 지연형 과감작 반응의 억제제

ICAM-2 분자는, 부분적으로, 지연형 과감작 반응과 같은 염증 반응을 일으키는데 필요한 부착 현상을 중재한다. 따라서, ICAM-2 분자에 결합할 수 있는 항체(특히 모노클로날 항체)는 그와 같은 반응의 약화 또는 제거에 있어 치료적 잠재성을 갖는다.

한편, ICAM-2는 ICAM-1/LFA-1 상호작용의 길항제이므로, ICAM-2(특히 가용화된 형태의)또는 이의 작용성 유도체는 지연형 과감작 반응을 억제하는데 사용될 수 있다.

이러한 잠재적 치료용도는 두가지 방식으로 개발될 수 있다. 첫번째로는, ICAM-2에대한 모노클로날 항체를 함유하는 조성물을 지연형 과감작 반응을 경험한 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 이 조성물은 아이비 독소, 오크 독소 등과 같은 항원과 접했었던 개인에게 제공될 수 있는 것이다. 두번째 양태에서는, ICAM-2와 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 연속적인 염증 반응을 방지하기 위해 항원과 함께 환자에게 투여한다. 따라서, ICAM-2-결합 모노클로날 항체와 함께 항원의 추가적인 투여는 항원의 연속적 공급에 대해 개인을 일시적으로 내성화시킨다.

2. 만성염증질환의 치료

LFA-1이 결여된 LAD 환자는 염증 반응을 일으키지 않으므로, LFA-1의 천연 리간드인 ICAM-2의 길항작용 또한 염증 반응을 억제할 것으로 여겨진다. ICAM-2에 대한 항체의 염증 억제 능력은 홍반성 낭창, 자기면역 갑상선염, 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 다발성 경화증, 몇몇 형태의 당뇨병, 레이너드 증후군(Reynaud's Syndrome), 류마티스성 관절염 등과 같은 만성염증질환 및 자가면역 질환의 치료에 있어서 치료적 용도를 위한 기반을 제공한다. 이와 같은 항체는 또한 건선의 치료에 사용될 수도 있다. 일반적으로, ICAM-2와 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 스테로이드 치료 요법을 통해 통상적으로 치료 가능한 질환의 치료에 사용되기도 한다.

본 발명에 따라, 이와같은 염증 및 면역거부 반응은 그러한 치료가 필요한 환자에게 언급한 염증을 억제하는데 충분한 양의 소염제를 제공함으로써 억제(즉 방지 또는 약화)될수 있다. 적합한 소염제는 하기와 같다: ICAM-2와 결합할 수 있는 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2의 작용성 유도체; ICAM-1이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제 또는 LFA-1이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제. 특히 바람직한 것은 ICAM-2의 가용성 작용성 유도체로 구성된 소염제이다. 이와 같은 염증 치료는, LFA-1과 결합할 수 있는 항체; LFA-1과 결합할 수 있는 항체의 작용성 유도체; 및 LFA-1의 비-면역글로불린 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제제의 추가적인 투여를 또한 포함할 수 있다.

본 발명은 면역억제제를 추가적으로 환자에게 제공하는 특이적 방어계의 염증 반응을 억제하기 위한 상기 방법을 또한 포함한다. 이와 같은 제제는 정상적 요구량 보다 낮은 용량으로(즉, 아-최적 용량)제공함이 바람직하다. 아-최적 용량의 사용은 본 발명의 제제의 상승 효과 때문에 가능하다. 적합한 면역억제제의 예로는 덱사메테손, 아자티오프린, ICAM-1, 사이클로스포린 A 등이 포함된다.

3. 비-특이적 염증의 치료

본 발명은 과립구-내피세포 부착이 CD-18 계열의 당단백질과 내피의 상호작용에서 기인한다는 발견으로부터 부분적으로 유래한다. 세포 부착은, 백혈구가 염증부위로 이주하고/하거나 염증의 원인이 되는 다양한 유호 기능을 수행하기 위해 요구되어지기 때문에, 세포 부착을 억제하는 제제는 그러한 염증을 약화 또는 방지할 것이다. 이와 같은 염증 반응은, 면역학적 기억을 할 수 없는 백혈구에 의해 중재되는 비-특이적 방어계의 반응에 기인한다. 이러한 세포로는 과립구 및 대식세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 만일 염증이 비-특이적 방어계의 반응에 의해 야기, 중재, 또는 관련되는 경우, 염증은 비-특이적 방어계에 대한 반응으로부터 기인한다고 일컬어진다. 비-특이적 방어계의 반응으로부터, 최소한 부분적으로 생기는 염증의 예는 하기와 같은 상태와 관련된 염증을 포함한다: 패혈증 또는 손상에 대한 2차 성인성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 다발성 기관 상해 증후군; 심근 또는 기타 조직의 재관류 상해; 급성 사구체 신염; 반응성 관절염; 급성 염증 성분을 지닌 피부염; 급성 화농성 수막염 또는 다른 중추 신경계 염증질환; 열상; 혈액투석; 류카페레시스; 궤양성 대장염; 크론씨 병; 괴사성 소장결장염; 과립구 수주 관련 증후군; 및 사이토킨-유도된 독성.

본 발명의 소염제란 과립구상의 CD-18 복합체와 내피세포의 상호작용을 특이하게 길항작용할 수 있는 화합물이다. 이와 같은 길항제는 ICAM-2, ICAM-2의 작용성 유도체 및 ICAM-1이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제 또는 CD-18 분자 계열의 일원을 포함한다.

B. 기관 및 조직 거부의 억제제

ICAM-2, 특히 가용형태의 ICAM-2는 CD-18 계열의 구성원에 대한 항체와 동일한 방식으로 작용할 수 있기 때문에, 어떠한 세포 부착-의존성 기능에 의해서 야기되는 기관 또는 조직 거부를 억제하는데 사용될 수 있다. 게다가, 향-ICAM-2 항체 및 ICAM-2의 작용성 유도체와 길항제 또한 그러한 거부를 억제하는데 사용될 수 있다.

ICAM-2 및 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체는 포유류 환자에서 기관 또는 조직거부를 방지하거나, 그러한 부작용의 우려없이 자가면역반응을 변형시키는데 사용될 수 있다.

중요한 것은, ICAM-2를 인지할 수 있는 모노클로날 항체의 용도가 HLA 부정합을 갖는 개개인 사이에서도 기관 이식을 수행할 수 있도록 할 수 있다는 점이다.

C. 치료 또는 진단 목적으로 투여된 항원성 물질의 도입에 따른 보조제

예를 들어, 소의 인슐린, 인터페론, 조직-형 플라스미노겐 활성인자 또는 쥐의 모노클로날 항체와 같은 치료제 또는 진단제에 대한 면역 반응은 실질적으로 이러한 제제의 치료적 또는 진단적 가치를 손상시키고, 사실상 혈청 질병과 같은 질환을 야기할 수 있다. 이와같은 상황은 본 발명의 항체의 사용을 통해 치료될 수 있다. 이러한 양태에 있어, 항체는 치료제 또는 진단제와 배합하여 투여된다. 항체의 첨가는 수용체가 제제를 인지하지 못하게 함으로써, 수용체가 그것에 대항한 면역 반응을 개시하지 못하게 한다. 이와 같은 면역 반응의 부재는 환자로 하여금 추가적인 치료제 또는 진단제의 투여를 받아들일 수 있게 한다.

ICAM-2(특히 가용화 형태의)또는 이의 작용성 유도체는 질환의 치료에 있어 ICAM-1 또는 LFA-1와 결합할 수 있는 항체와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 가용형태에서, 이와 같은 분자는 기관 또는 식편 거부 반응을 억제하는데 사용될 수 있다. ICAM-2, 또는 이의 작용성 유도체는 치료제 또는 진단제의 면역원성을 감소시키기 위해 항-ICAM-2 항체에서와 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

D. 종양전이의 억제제

본 발명의 제제는 또한, 이주를 위해 CD-18 계열의 작용성 일원을 필요로 하는 조혈 종양 세포의 전이를 억제하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 양태에 따라서, 이러한 치료가 요구되는 환자에게 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체 단편; ICAM-2; ICAM-2의 작용성 유도체 및 ICAM-1이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제와 같은 제제를 전이억제 충분량으로서 제공한다.

본 발명은 또한 ICAM-2 발현 종양 세포 성장을 억제하는 치료를 필요로 하는 환자에게 성장 억제 충분량의 제제를 제공하여 ICAM-2 발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 적합한 제제로는 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2와 결합할 수 있는 독소-유도체화된 항체 단편; ICAM-2; ICAM-2 의 작용성 유도체; ICAM-1이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제; CD-18 분자 계열의 독소-유도체화된 일원 및 CD-18 계열의 일원의 독소-유도체화된 작용성 유도체를 포함한다.

본 발명은 또한 LFA-1-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하는 데 이는 그러한 치료가 요구되는 환자에게 언급한 성장을 억제시키는데 충분한 양의 독소를 제공함을 포함한다. 적합한 독소는 독소-유도체화된 ICAM-2 또는 ICAM-2의 독소-유도체화된 작용성 유도체를 포함한다.

E. 바이러스 감염의 억제제

최근 ICAM-1이 리노바이러스의 주요 그룹에 의해 수용체로서 파괴되어짐이 밝혀졌다[참조문헌: Greve, J.M. et al., Cell 56:839-847(1989); Staunton, D.E. et al., Cell 56:849-853(1989); Tomassini, J.E. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. (USA)86:4907-4911(1989)-본원의 참조문헌으로 인용함]. 작고, RNA를 함유하며, 단백질-봉입된 피코르나바이러스군에 속하는 리노바이러스는 40 내지 50%의 통상적인 감기를 유발시킨다.[참조문헌: Rueckert, R.R., In: Fields Virology, Fields, B.N. et al., (eds.), Raven Press, NY, (1085)pp 705-738; Sperber. S.J.et al., Antimicr. Agents Chemo. 32:409-419(1988)-본원의 참조문헌으로 인용함]. 100종류 이상의 면역학적으로 비-가교 반응성인 리노바이러스가 규정되어 있고, 이중 90%가 ICAM-1과 결합한다.

ICAM-1 이외에도, 세포부착분자 CD4 및 상보적인 수용체 CR2가 각각 HIV 및 EBV 바이러스에 의해 바이러스 수용체로서 파괴되어짐이 최근에 밝혀졌다[참조문헌: Maddon, P.J., Cell 47:333-348(1986); Fineroth, J.D. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 81:4510-4514(1984)-본원의 참조문헌으로 인용함]. 게다가 ICAM-1과 유사한 Ig 도메인 구조를 갖고 세포 부착에 작용할 수 있는 분자는 폴리오 바이러스 수용체이다[참조문헌: Mendelsohn, C.L.,et al., Cell 56:855-865(1989)].

ICAM-2 및 이의 작용성 유도체는 바이러스[특히 리노바이러스, 및 특히 소혈청형(minor serotype)의 리노바이러스에 의한] 부착 또는 감염을 위한 수용체로서 작용할 수도 있다. 따라서, ICAM-2에 대한 항체(또는 이의 단편), ICAM-2, 또는 ICAM-2의 작용성 유도체는 그러한 부착 또는 감염을 차단함으로써 바이러스 감염을 억제하기 위해 사용될 수 있다.

F. 진단 및 예후 적용

ICAM-2와 결합할 수 있는 모노클로날 항체는 환자내 ICAM-2 발현 및 염증 부위를 이미지화하거나 가시화하는 수단으로서 사용될 수 있다. 이러한 용도에 있어, 모노클로날 항체는 방사성동위원소, 친화성 표지(예, 비오틴, 아비딘 등), 형광성 표지, 상자성 원자, 표지된 항-ICAM-2 항체 등의 사용을 통해 검출 가능하도록 표지된다. 이와 같은 표지화 수행절차는 본 분야에서 널리 공지되어 있다. 진단 이미지화에 있어 항체의 임상적 적용은 하기 문헌에 기술되어 있다[참조: Grossman, H.B., Urol. Clin. North Amer. 13:465-474(1986), Unger, E.C. et al., Invest. Radiol. 20:693-700(1985), and Khaw, B.A. et al., Science 209:295-297(1980)].

ICAM-2 발현의 존재는 또한 ICAM-2를 발현하는 세포의 ICAM-2 유전자 서열 또는 ICAM-2 mRNA 서열에 결합하는 mRNA, cDNA, 또는 DNA와 같은 결합 리간드를 사용하며 검출할 수 있다. 이러한 하이브리드화 검정을 수행하는 기술은 문헌[참조: Maniatis, T. et al., In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY(1982), and by Haymes, B.D. et al., In: Nucleic Acid Hybrization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC(1985)-본원의 참조문헌으로 인용함]에 기술되어 있다.

이와 같이 검출 가능하도록 표지된 항체 부위의 검출은 ICAM-2 발현 또는 종양 발생의 부위를 나타낸다. 한 양태에서 발현의 검사는 조직 또는 혈액의 샘플을 제거하고, 검출되도록 표지된 또는 표지될 수 있는 항체의 존재하에 이 샘플을 항온처리함으로써 행해진다. 바람직한 양태로서, 이러한 기술은 자기적 이미지화, 형광사진법 등을 통한 비침투적 방식으로 행해진다. 이와 같은 진단 시험은 기관이식 수용체의 잠재적 조직 거부의 초기 징조를 검사하는데 사용될 수 있다. 이 검정은 또한 류마치스 관절염 또는 다른 만성 염증질환에 대한 개체의 선호를 측정하기 위한 노력 과정중에 행해질 수도 있다.

예를 들어, 항체 또는 항체 단편을 방사능으로 표지함으로서, 방사면역검정의 사용을 통해 항원을 검출할 수 있다. 방사면역검정(RIA)의 효과적 기술은 문헌 Laboratory Techniques and Biochmistry in Molecular Biology, by Work, T.S., et al., North Holland Publishing Compony, NY(1978), 특히 본원의 참조문헌으로서 삽입되는 Chard, T.가 쓴 An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techiniques이란 제목의 장에서 밝히고 있다. 또한, 형광물질, 효소, 또는 다른 적합한 표지도 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 표지의 유형의 예로는 효소 표지, 방사성동위원소 표지, 비-방사성 동위원소 표지, 형광 표지, 독소 표지, 및 화학발광성 표지를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

적절한 효소표지의 예로는 말레이트 데하이드로게나제, 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 데하이드로게나제, α-글리세롤 포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 페록시다제, 알칼리성 포스파다제, 아스파라기나제, 글루코즈옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제, 아세틸콜린 에스테라제 등을 포함한다.

적합한 방사성 동위원소 표지의 예로는H,In,I,I,P,S,C,Cr,To,Co,Fe,Se,Eu,Y,Cu,Ci,At,Pb,Sc,Pc등을 포함한다. 적합한 비방사성 동위원소 표지의 예로는Gd,Mn,Dy,Tr,Fe 등을 포함한다.

적합한 형광성 표지의 예로는Eu표지, 플루오레세인 표지, 로다민 표지, 피코에리스린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 0-프탈데하이드 표지, 플루어레스카민 표지 등을 포함한다.

화학발광성 표지의 예로는 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지, 아쿼린 표지 등을 포함한다.

VI. 본 발명의 조성물의 투여

ICAM-2의 치료적 효과는 환자에게 완전한 ICAM-2 분자 또는 이의 모든 치료적 활성 펩타이드 단편을 공급함으로서 얻을 수 있다. 특별한 관심은 가용성 ICAM-2의 치료학적 활성 펩타이드 단편에 있다.

ICAM-2 및 이의 작용성 유도체는 재조합 DNA 기술 또는 단백질 분해, 또는 이들 방법을 조합하여 사용함으로서 합성적으로 수득할 수 있다. ICAM-2의 치료학적 이점은 담체에 대한 커플링을 향상시키거나 ICAM-2의 활성을 증가시키기 위해 첨가된 추가의 아미노산 잔기를 지니는 ICAM-2의 작용성 유도체의 사용을 통해서 증가될 수 있다. 본 발명의 영역은, 유도체가 ICAM-2의 생물학적 또는 약리학적 활성을 지니거나 영향을 미치는 한, 특정한 아미노산 잔기가 결여되어 있거나 변경된 아미노산 잔기를 함유하는 ICAM-2의 작용성 유도체를 좀더 포함할 의도이다.

본 발명의 항체 및 본 명세서내에 기술된 ICAM-2 분자 모두는, 만일 이들을 함유하는 제제가 이들 생성물이 정상적이고 천연적으로 함께 발견되는 물질을 실질적으로 함유하지 않는다면 천연 오염물이 실질적으로 제거된 것이라고 한다.

본 발명은, ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 및 생물학적으로 활성인 이의 단편(폴리클로날이거나 모노클로날이든지)에 까지 확장된다. 이러한 항체는 동물에 의해, 또는 조직배양에 의해, 또는 재조합 DNA 방법으로 생성될 수 있다.

환자에게 ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 공급하거나, 수용 대상 환자에게 ICAM-2(또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체)를 공급할때, 제제의 투여량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적 의과상태, 이전의 병력 등에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 비록 더 적거나 많은 용량을 투여할 수 있으나, 수용대상자에게 약 1pg/kg(환자체중) 내지 10mg/kg(환자체중)의 범위 이내인 항체의 용량을 공급하는 것이 바람직하다. 환자에게 ICAM-2 분자 또는 이의 작용성 유도체를 공급할때, 비록 더 적거나 많은 용량이 투여될 수도 있으나 또한 약 1pg/kg(환자체중) 내지 10mg/kg(환자체중)의 범위내 용량을 투여함이 바람직하다. 하기에서 논의되는 바와 같이, 만일 항-ICAM-2 항체가 항-LFA-1 항체와 함께 추가적으로 투여된다면 치료학적 유효량은 적어질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 두 화합물의 투여가 근접시간내에 이루어져 이 두 화합물이 환자의 혈청내에서 동시에 검출될 수 있는 경우, 한 화합물은 다른 화합물과 함께 부가적으로 투여되었다고 일컬어진다.

ICAM-2에 결합할 수 있는 항체 및 ICAM-2 자체 모두는 둘다 환자에게 정맥내, 근육내, 피하내, 장내 또는 비경구적으로 투여된다. 주사에 의해 항체 또는 ICAM-2를 투여할때, 지속적 주입에 의해, 또는 단일 또는 복합 환제에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 제제는 수용환자에게 염증을 억제하기에 충분한 양을 공급하기 위한 의도이다. 만일 약제의 용량, 투여경로 등이 염증을 약화시키거나 방지하기에 충분한 경우 이 양은 염증을 억제하는데 충분하다고 일컬어진다.

항-ICAM-2 항체, 또는 이의 단편은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적 면역 억제제와 배합하여(특히 기관 또는 조직 이식의 수용대상자에게) 투여될 수 있다. 이러한 화합물의 투여는 예방 또는 치료 목적을 위해서이다. 예방적으로 공급되어질때, 면역억제 화합물은 염증 반응 또는 증상에 앞서 공급된다(예를 들어, 기관 또는 조직 이식의 직전, 이식시, 또는 직후가 아니라 기관 거부의 어떠한 증상에 앞서). 화합물의 예방적 투여는 어떠한 연속적 염증 반응(예를들어, 이식된 기관 또는 조직의 거부와 같은)을 방지하거나 약화시키는데 기여한다. 치료학적으로 공급되었을때, 면역억제 화합물은 실제적인 염증(예를들어, 이식된 기관 또는 조직의 거부와 같은)이 발생되었을때 (또는 직후에)공급된다. 화합물의 치료학적 투여는 어떠한 실제적 염증(예를들어, 이식된 기관 또는 조직의 거부와 같은)도 약화시키는데 기여한다.

따라서, 본 발명의 소염제는 염증 발생이전(예측된 염증을 억제하기 위하여) 또는 염증 발생 이후에 공급된다.

만일 조성물의 투여가 수용환자에 의해 허용될 수 있다면 이 조성물은 약물학적으로 허용가능하다고 일컫는다. 이러한 제제는 만일 투여량이 생리학적으로 중요하다면 치료학적 유효량이 투여된다고 일컫는다. 제제는, 만일 이의 존재가 수용환자의 생리에 있어 검출가능한 변화를 초래한다면 생리학적으로 중요하다.

본 발명의 항체 및 ICAM-2 분자는 공지된 방법에 따라 제형화되어 이들 물질 또는 이의 작용성 유도체를 약제학적으로 허용가능한 담체 부형제와의 혼합물로 배합시킴으로서, 약제학적으로 유용한 조성물을 제조할 수 있다. 사람의 다른 단백질, 즉 사람 혈청 알부민을 포함하는 적합한 부형제 및 이의 제형이 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences(16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA(1980)]에 기술되어 있다. 효과적인 투여를 위해 적합한 약제학적으로 허용되는 조성물을 형성하기 위하여, 이러한 조성물은 적당량의 담체 부형제와 함께, 항-ICAM-2 항체 또는 ICAM-2 분자, 또는 이의 작용성 유도체를 함유할 것이다.

추가의 약제학적 방법은 작용의 지속을 조절하기 위해 사용될 수도 있다. 방출이 조절되는 제제는 항-ICAM-2 항체 또는 ICAM-2, 또는 이의 작용성 유도체와 복합되거나 흡수하기 위한 중합체의 사용을 통해 이루어진다. 수송의 조절은 적절한 거대분자(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 또한 프로타민 설페이트) 및 거대분자의 농도 및 방출을 조절하기 위한 삽입방법을 선택함으로서 실행된다. 방출이 조절된 제제에 의한 지속적인 작용을 조절하는 또 다른 가능한 방법은 항-ICAM-2 항체 또는 ICAM-2 분자, 또는 이의 작용성 유도체를 중합물질(예: 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체)의 입자내로 삽입하는 것이다. 다른 방도로서, 이들 제제를 중합체성 입자내로 혼입하는 것 대신, 코아세르베이션 기술(coacervation technique)에 의하거나 계면 중합시킴으로써 제조된 미세캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시 메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타실레이트) 마이크로에멀죤, 나노입자 및 나노캡슐 또는 마이크로 에멀죤내로 이 물질을 넣을 수 있다. 이러한 기술은 문헌[Rimington's Pharmaceutical Sciences(1980)]에 기술되어 있다.

또한, 본 발명은 (a)소염제(예: ICAM-2와 결합할 수 있는 항체; ICAM-2와 결합할 수 있는 항체 단편; ICAM-2; ICAM-2의 작용성 유도체 및 ICAM-1이 아닌 ICAM-2의 비-면역글로불린 길항제), 및 (b)하나 이상의 면역억제제를 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다. 적합한 면역 억제제의 예로는 덱사메테손, 아자티오프린 및 사이클로스포린 A가 포함된다.

이제까지 본 발명에 대해 일반적으로 기술해 왔으며, 이는 예시의 목적으로 준비된 하기 실시예를 참조하여 좀더 쉽게 인식될 것이지만, 본 실시예는 특별한 언급이 없는한 본 발명을 제한할 의도는 아니다.

[실시예 1]

ICAM-2 cDNA의 클로닝

ICAM-2를 암호화할 수 있는 cDNA를 클로닝하기 위해서, COS 세포내에서 발현시켜 cDNA를 선별하는 아루포 및 시드(Aruffo and Seed)의 방법[참조: Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:3365-3369(1987)]의 변형법을 사용하여 플라스틱 패트리 디쉬에 결합된 기능적으로 활성인, 정제된 LFA-1 상에서 리간드-보유 COS 세포를 펜닝한다.

상세히 설명하면, LFA-1을 TS2/4 LFA-1 MAb 세파로즈상에서 면역친화성 크로마토그패피에 의해 SKW-3 용해물로부터 정제하고, 2mM MgCl및 1% 옥틸글루코시드의 존재하 pH 11.5에서 용출시킨다. LFA-1(10㎍/200㎍/6cm 평판)을, 옥틸글루코시드를 2mM MgCl가 함유된 PBS중에서 0.1%로 희석시키고 밤새 4℃에서 항온처리함에 의해 세균용 패트리 디쉬에 결합시킨다. 평판을 1% BSA로 차단하고 PBS/2mM MgCl/0.2% BSA/0.025%아지드/50㎍/ml 젠타마이신 중에 저장한다.

구블러 및 호프만(Gubler and Hoffman)방법에 의한 LPS-자극된 제대정맥 내피세포로부터의 cDNA 라이브러리의 합성을 스타운톤 등이 문헌[참조: Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933(1988)]에 기술한 바와같이 수행한다. 두번째 본쇄를 합성한후 cDNA를 Bst Xl 어뎁터(adaptor)에 연결시키고[참고: Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:3365-3369(1987)]600개 초과의 염기쌍을 갖는 cDNA를 저융점(LMP) 아가로즈겔 전기영동으로 선별한다. 이어서, cDNA를 CDM8에 연결시키고[참고: Seed, B., Nature 329:840-842(1987)], 이.콜라이 숙주MC1061/P3 내로도입시킨뒤 플레이팅하여 5x10개의 콜로니를 수득한다. 이 콜로니를 LB배지중에 현탁시키고, 혼주한 뒤 표준 알칼리 용해법[참조: Maniatis, T. et al., in Molecular Colning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]으로 플라스미드를 제조한다. 50% 융합성 상태에서 10개의 1m COS 세포 평판을 DEAE-덱스트란을 사용하는 플라스미드 cDNA 라이브러리의 10㎍/평판으로 형질감염시킨다[참조: kingston, R.E., in Curent Protocols in Molecular Biology, 9.0.1-9.9.6, Greene Publishing Associates(1987)]. ICAM-2는 내피 및 SKW-3 세포에서 트립신-내성이다. 형질감염 3일 후에 COS 세포를 0.025% 트립신/1mM DETA/HBSS(Gibco)로 처리하여 현탁시키고,Cr-표지된 COS 세포에 대해 후술된 바와같이 LFA-1 피복된 평판상에서 팬닝한다[참조: Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:3365-3369(1987)]. 부착성 세포는 EDTA를 10mM로 가하여 방출시킨다.

플라스미드를 히르트(Hirt) 상등액중의 부착성 COS 세포집단으로부터 회수한다[참조: Hirt, B.J., J. Mol. Biol.26:365-0369(1967)]. 이어서 이 플라스미드로 이.콜라이 균주MC1061/P3을 형질전화시키고 평판상의 콜로니를 LB 배지중에 현탁시켜 모은뒤 알칼리용해법으로 플라스미드를 제조한다. 형질감염된 LFA-1-부착성 COS 세포의 선별 및 플라스미드 회수를 2주기 이상 반복한다. 세번재 주기 후에 수득되는 혼주된 콜로니를 테트라사이클린 18㎍/ml 및 엠피실린 20㎍/ml가 함유된 LB 배지 100ml중에서 포화될 때까지 성장시킨다. 플라스미도를 제조하고 1% LMP-아가로즈 겔 전기영동으로 분획화한 뒤 MC1061/P3을 9개의 상이한 크기의 분획으로부터의 플라스미드를 사용하여 독립적으로 형질전환시킨다. LFA-1에 대한 COS 세포 부착을 촉진하는데 있어 최대의 활성을갖는 분획으로부터 유래된 각각의 플라스미드를 Xbal로 분해시켜 삽입체 크기에 대해 검사하고 COS세포 부착 검정으로 시험한다. 이에 따라 1.1kb이 ICAM-2 cDNA 삽입체를 갖는 한개의 플라스미드인, pCDIC2,27을 수득한다.

부착 검정을 위해, ICAM-2 플라스미드 pCDIC2.27 eHSMS CDM8내의 1.8kd Sall, kpnl 단편[참조: Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933(1988)]을 함유하는 ICAM-1 작제물(2㎍/1m 평판)을 DEAE-덱스트란을 사용하여 COS 세포내로 도입시킨다. COS 세포를 형질감염시킨후 3일 경고하여 0.025% 트립신/1mM EDTA/HBSS와 함께 현탁시키고Cr로 표지시킨다. MAb 5㎍/ml와 함께 2ml PBS/5% FCS/2mM MgCl2/0.025% 아지드(완충제)중의Cr-표지된 약 2x10개의 COS 세포를 1시간동안 25℃에서 LFA-1-피복된 6cm 평판에서 배양한다. 부착되지 않은 세포를 온화하게 흔들고 완충액으로 3번 세척하여 제거한다. 부착 세포를 10mMd의 EDTA를 가하여 용출시키고 γ-계수한다.

상기 처리공정의 실행가능성을 미리 클로닝된 ICAM-1 cDNA 로 형질감염시킨 COS 세포를 사용하여 입증한다(제1A도). ICAM-1 은 25%의 형질감염된 COS 세포에서 발현된다. 패닝후, 부착되지 않은 세포는 ICAM-1세포로부터 제거된 반면, EDTA에 의해 LFA-1- 피복된 플라스틱으로부터 방출된 부착 세포는 거의 완전히 ICAM-1이다. LFA-1-피복된 플라스틱에 대한 ICAM-1세포의 부착은 RR1/1 ICAM-1 MAb에 의해 억제된다. 패트리디쉬상에 피복된 LFA-1은 5주기 초과의 COS 세포 부착 및 EDTA에 의한 용출에 대해 안정하며; 사용 도중에 평판은 4℃에서 Mg와 함께 저장한다.

ICAM-2를 클로닝하기 위해서, 플라스미드 벡터 CDM8 내의 CDNA 라이브러리를 LFA-1-의존성 부착의 ICAM-1-의존성 성분 및 ICAM-1-독립성 성분 모두를 제시하는 내피세포로부터 제조한다[참조: Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol. 07:321-331(1988)]. 형질감염된 COS 세포를 ICAM-1 cDNA의 분리를 방지하기 위해 존재하는 ICAM-1 MAb와 함께 LFA-1-피복된 패트리디쉬내에서 배양한다. 부착 세포를 EDTA로 용출시키고 플라스미드를 분리시킨뒤 이.콜라이에서 증폭시킨다. 형질감염, 부착 및 플라스미드 분리의 3회 주기 및 1회의 크기별 분획화 후에 30개의 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 분석한다. 1.0kb 초과의 삽입체를 함유한 3개의 플라스미드 가운데 형질감염에 의해 COS 세포내로 도입된 하나의 플라스미드가 LFA-1에 대한 부착성을 제공한다.

분리된 플라스미드는 ICAM-1에 형질감염에서 나타난 퍼센트와 유사한, 높은 퍼센트로 형질감염 세포에서 LFA-1에 대한 부착성을 제공한다(제1b도). 부착성은 LFA-1 mAb에 의해 차단되지만, ICAM-2 형질감염체와는 대조적으로 ICAM-1 mAb에 의해서는 차단되지 않는다(제1b도). 더우기, 이 프라스미드로 형질감염된 세포는 4개의 ICAM-2\1 mAb의 패널과 반응하지 않는다. 따라서, 제2의 LFA-1 리간드를 암호화하는 cDNA에 대한 모든 작용성 기준이 충족되고 있으며 이 리간드를 ICAM-2로 지정한다.

[실시예 2]

ICAM-2 cDNA 서열의 성상확인

1052bp의 ICAM-2 cDNA 서열(제2도)은 62bp 50gALC 167bp 30h 비해독 영역을 함유한다. AATAAA와는 대조적으로, 약 2%의 척추동물 mRNA[참조: wickens, M. et al., Science 226:1045-1051(1984)]내에 존재하는 위치 1019에서의 AATACA 폴리아데닐화 시그널에 이어서, 1058bp에 폴리(A) 테일이 위치한다. 가장 긴 개방 판독 프레임은 63번 위치의 첫번째 ATG로 시작하여 885번 위치의 TAG 종결 코돈으로 끝난다. 소수성 분석[참조: Kyte, J. et al., J. Mol. Biol.157:105-132(1982)] 및 절단부위 주위의 아미노산 사용[참조: von Heijne, G., Nucleic Acids Research 14:4683-4690(1986)]으로부터 21개 잔기의 시그널 펩타이드가 예상된다(제2도).

예상된 완전한 서열은 26개 잔기의 추정되는 소수성 전이막 도메인 및 26개 잔기의 세포질성 도메인에 이어지는 1 내지 201번 아미노산의 추정되는 세포외 도메인을 함유한다. 한쪽 편에 트레오닌 및 세린 잔기가 편중하는, 4회전의 추정상 α-나선형 전이막 단편이 양쪽성이라는 것은 막의 평면내에 존지하는 다른 막단백질과 결합하거나 자가-결합하는 가능성을 제시한다. 일반적으로 세포질성 도메인은 염기성이며, 대부분의 세포질성 도메인이 친수성인 반면에 평균적으로 소수성이다. 완전한 폴리펩타이드의 예상 질량은 28,176달톤이며, 예상되는 6개의 N-연결된 글리코실화 부위가 사용되면, 약 46kd의 ICAM-2 당단백질이 생성된다.

[실시예 3]

DNA 및 RNA 하이브리드화 분석

분리된 ICAM-2 cDNA 클론을 노던 및 써던 하이브리도화를 이용하여 분석한다. 노던 블롯은 변성시켜 1% 아가로즈-포름알데하이드 겔을 통해 전기영동[참조: Maniatis, T. et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]시킨 6㎍의 폴리(A)RNA를 사용하고 나일론막(Zeta Probe, BioRad)으로 전기이동시킨다. 이동이 완성됨을 겔의 UV 트랜스-조명 및 블롯의 형광성 사진을 통해 확인한다.

게놈성 DNA를 제조업자가 제시한 양의 다섯배의 EcoRI 및 HindIII 엔도뉴클레아제(New England Biolabs)로 분해시킨다. 0.8% 아가로즈 겔을 통해 전기영동한 후, DNA를 제타탐침(Zeta Probe)에 옮긴다. RNA 및 DNA 블롯을 예비하이드리화하고, 랜덤 프라이밍(Boehringer Mannheim)에 의해 α[P]dXTP로 표지된 ICAM-2 또는 ICAM-1 cDNA를 사용하여 표준방법[참조: Mamiatis, T. et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]에 따라 하이브리드화한다.

1.1kb ICAM-2 cDNA는 1.4kb의 폴리(A)mRNA와 하이브리드화하며, 3.3kb 및 2.4kb ICAM-1 mRNA(제3B도)와는 구별되는 3kb mRNA(제3A도)와는 약하게 하이브리드화한다. mRNA를 LFA-1에 대한 ICAM-1-의존성 및 제2의 리간드-의존성 결합 기능을 특징으로 갖는 세포내에서 검사한다. ICAM-1 mRNA는 LPS에 의해 Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]내피세포내에서 강하게 유도된다(제3B도, 레인 2 및 레인 3). 이와는 대조적으로, ICAM-2 mRNA는 내피세포내에서 기본적으로 강력하게 발현되며 LPS에 의해 추가로 유도되지는 않는다(제3A도, 레인 2 및 3). 이것은 내피세포내의 LFA-1의존성, ICAM-1 독립성 경로의 강한 기본적 및 비-유도적 발현과 ICAM-1-의존성 경로의 유도성에 상관관계가 있다[참조: Dustin, M.L. et al., J. Cell. Biol. 107:321-331(1988)].

ICAM-2 mRNA는, 중간 또는 긴 시간의 자가방사선 노출에서 나타나는 바와 같이, 라모스 및 BBN B임파구, U937 다핵세포 및 SKW3 임파아구 세포주(제3A도, 레인 1, 4, 6 및 8)를 포함하는 다양한 유형의 세포중에 존재한다. 이들중에서, SKW3, U937 및 BBN은 LFA-1세포[참조: Rothlein, R. et al., J. Immunol.137:1270-1274(1986); Makgobas M.W. et al., Eur. J. Immunol. 18:637-640(1988)] 및 LFA-1-의존성 부착의 ICAM-1-의존성 성분만을 나타내는 헬라(Hela) 내피 세포주[참조: Makgoba, M.W. et al., Eur. J. Immunol. 18:637-640(1988)]는 장기간의 자가방사선 노출후에도 ICAM-2 mRNA(제3A도, 레인 5)을 나타내지 않는다. 따라서 ICAM-2의 세포 분포는 LFA-1-의존성 부착의 ICAM-1-독립성 성분과 일치한다.

ICAM-2 cDNA와 하이브리드화된 게놈성 DNA DML 써던 블롯(제3D도)은 주로 단일의 8.2kb EcoRI 단편 및 14kb HindIII 단편을 나타내며, 이는 8kb내에 존재하는 대부분의 암호화 정보를 갖는 단일 유전자를 제시한다.

[실시예 4]

ICAM-1 및 ICAM-2의 아미노산 서열의 비교

LFA-1 리간드로서의 이의 작용성 유사성 때문에, ICAM-2 및 ICAM-1의 아미노산 서열을 비교한다. ICAM-1은 Ig 슈퍼계열의 일원이며 이의 세포외 도메인은 5개의 C-유사 도메인으로 이루어진다. ICAM-2의 201개 아미노산 세포외 도메인은 43 및 56개 잔기의 공간을 두고 떨어진 추정되는 도메인내 디설파이드-결합된 시스테인 및 예상된 β쇄 구조를 갖는 2개의 Ig C-유사 도메인으로 이루어진다(제4도). 현저하게, ICAM-2의 2개의 Ig 유사-도메인은 ICAM-1의 2개의 N-말단 Ig-유사 도메인에 대한 아미노산 서열에 있어 34%가 일치하며(제4도), ALIGN 스코어가 평균 + 15s.d.(표준편차)이고, ICAM-1 도메인 3 및 4와 27%가 일치하며 ALIGN 스코어가 평균 + 3s.d.이다.

NBRF 및 SWISS-PROT 단백질 데이타베이스의 연구는 단지 일부 도메인이 Ig 슈퍼계열의 다른 일원, 주로 HLA 부류 II 항원과 상동성임을 보여준다. ICAM-2는 ICAM-1보다 적은 Ig 도메인의 보존된 잔기 특징을 보여준다. ICAM-2는 부착 분자 NCAM[참조: Cunningham, B.A. et al., Science 236:799-806(1987)]및 MAG[참조: Salzer, J.L. et al., J. Cell Biol. 104:957-965(1987)]의 2개의 N-말단 도메인과 각각 17% 및 19% 일치하는 반면, ICAM-1은 각각 19% 및 20% 일치한다.

임파구 작용 연관된 항원-1(LFA-1)및 세포간 부착 분자-1(ICAM-1)를 T 임파구-중재된 사멸을 차단한 MAb 및 동형 부착을 각각 선별하여 동정한다[참조: Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137:1270-1274(1986); Davignon, D. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78:4535-4539(1981)]. 이와는 대조적으로, ICAM-2는 생화학적 또는 면역학적 기술에 의해서 단백질을 미리 동정할 필요가 없는 작용성 cDNA 선별 공정을 이용하여 확인한다.

ICAM-2의 cDNA 분리는 또다른 LFA-1 리간드의 추정되는 존재를 확인한다. LFA-1에 대한 ICAM-1-의존성 및 ICAM-1-독립성 부착을 특징으로하는 제한된 수의 세포에 ICAM-2의 mRNA의 분포는 ICAM-2가 관찰된 모든 ICAM-1-독립성 LFA-1-의존성 부착의 원인임을 나타낸다.

ICAM-2과 ICAM-1의 2개의 N-말단 도메인은 Ig 슈퍼 계열의 다른 일원과의 유사성 보다는 훨씬 유사한데, 이는 LFA-1에 결합하는 Ig-유사 분자의 서브 계열임을 증명한다. 중요한 것은, ICAM-1의 LFA-1 결합 영역이 도메인 결실 및 체계적인 아미노산 치환에 의해 도메인 1 및 2로 맵화(mapping)된다. 그러므로, 구조적 및 작용적 상동성 모두가 존재한다. ICAM-2은 인테그린(integrin)에 결합하는 Ig-계열 일원의 두번째 예이다. 비록 세포 부착 수용체 사이에 예시된 것은 거의 없다고 할지라도, 인테그린 가운데 세포외 매트릭스 성분에 대한 많은 수용체가 다수의 리간드를 인지하는 것으로 나타나고 있다[참조: Hynes, R. O., Cell 48:549-554(1987); Ruoslahti, E. et al., Science 238:491-497(1987)].

ICAM-1 또는 ICAM-2 모두 RGD 서열을 갖고 있지 않기 때문에, LFA-1에 의한 인지(ricognition) 양상은, 세포외 매트릭스 성분들과 결합하는 인테그린과는 상이 할 수 있다[참조: Hynes, R. O., Cell 48:549-554(1987); Ruoslahti, E. et al., Science 238:491-497(1987)]. Mac-1 및 p150,95(LFA-1과 아주 밀접한 연관이 있는 백혈구 인테그린)에 의해 인지되어지는 세포 리간드는 동일한 Ig 아계열에 속할 수 있다. ICAM-1은, 일반적인 감기의 50%를 유발하는 리노바이러스의 주요 그룹에 대한 수용체임이 최근에 입증됐다. 또한, ICAM-2는 리노바이러스 또는 다른 피코나바이러스에 대한 수용체로서 작용하는것 같다. 따라서, ICAM-2는 이러한 바이러스들로부터의 감염을 억제(다시말하면, 예방 또는 약화)시키기 위한 치료요법에 사용될 수 있다.

LFA-1에 대한 리간드의 한 계열은 이러한 인지 경로의 중요성을 강조하고 있으며, 아마 이런 것이 미세한 특이성과 작용상의 다양성을 부여하는 기작이 될 것이다. ICAM-1과 ICAM-2사이의 여러가지 차이점들은 매우 중요하다. ICAM-1은 대부분의 세포에서 유도성이지만, ICAM-2 발현은 세포의 사이토킨에 의해 영향을 받지 않기 때문에 더 검증되어야 한다. ICAM-1 상의 3가지 부가적인 도메인은, ICAM-2 보다, LFA-1 결합부위를 세포표면으로부터 더 돌출시키고 있으며, 이러한 사실은 LFA-1: ICAM-1 보다 LFA-1:ICAM-2의 상호작용에 대해 더 밀접한 세포-세포간 접촉이 요구됨을 암시하고 있다. ICAM-2에 형질감염된 COS 세포들은 ICAM-1에 형질감염된 COS 세포들보다, 세척강도가 증가함에 따라 LFA-1으로 도포한 플라스틱으로부터 보다 쉽게 분리된다. 이것은 ICAM-2의 작은 크기 때문인 것으로 보이며, 이 작은 크기는 LFA-1이 인공 기질(artificial substrate)에 유착하기에 쉽지 않도록하거나 또는, 친화성에서의 차이를 부여하는 서열상의 차이 때문인것 같다.

ICAM-1과 ICAM-2의 뚜렷이 구별되는 세포질 도메인은 상이한 시그널을 부여하거나 또는 세포표면상에서 다른 위치선정을 유발시킬 수 있다; 마찬가지로, LFA-1에 의해 시그널을 보내는것 또는 세포골격과의 상호작용은, ICAM-1이 결합했느냐 또는 ICAM-2가 결합했느냐에 따라 상이하다.

따라서, ICAM-1과 두번째 LFA-1 카운터-수용체(counter-receptor)인 ICAM-2는 면역글로불린(Ig) 상과 (superfamily)의 아과(subfamily)를 구성한다[참고: Staunton, D.E. et al., Cell 52:925-933(1988); 이것은(본문에서 참고로 인용되고 있음]. ICAM-1은 5개의 Ig-유사 C 도메인들을 갖고 있는 반면, ICAM-2는 2개를 지니고 있는데, 이 둘이 ICAM-1의 아미노 말단과 가장 유사하다. 다양한 세포 유형상에서 발현된 ICAM-1 및 ICAM-2는, 면역반응에 있어서 유도 및 효과기 기능을 포함하는, 다양한 백혈구 부착 의존성 기능들을 지지한다. ICAM-1의 발현은 사이토킨에 의해 고도로 유도성이므로, LFA-1/ICAM-1 부착 시스템은 염증발생 동안에 백혈구의 이동과 위치선정을 안내할 수 있다[참고: Rothlein, R.J. Immunol. 137:1270-1274(1986); Marlin, S.D. et al., Cell 51:813-819(1987); Kishimoto, T.K. et al., Adv. Immunol. 46:149-182(1989); Dustin, M.L. et al., Immunol. Today 9:213-215(1988), 이 모든 문헌은 본문에서 참고로 인용되고 있음].

LFA-1 결합에 있어서 중요한 것으로서 상기에서 정의된 바와 같은 ICAM-1 잔기는, 다른 ICAM들내에 보존되어 있다[참고: Staunton, D.E. et al., Nature 339:61-64(1989), 이 문헌은 본문에서 참고로 인용됨]. 사람의 ICAM-1은 쥐의 ICAM-1과 50%가 동질이고, 사람의 ICAM-2와는 35%가 동질이다[참고: Staunton, D.E. et al., Nature 339:61-64(1989)]. LFA-1에 대한 결합에 가장 결정적인 잔기들인, E34 및 Q73은 쥐의 ICAM-1 및 사람의 ICAM-2 모두에서 보존되고 있다. 이것은, 쥐의 ICAM-1 및 사람의 ICAM-2 모두가(참고: Staunton, D.E. et al., Nature 339:61-64(1989)) 사람의 LFA-1과 결합할 수 있다는 능력과 일치하고 있다. LFA-1 결합에 영향을 미치는, N156에 있어서의 한가지 D2 N-연결된 글리코실화 부위는 ICAM-2에도 또한 보존되어 있다. 리노바이러스-14와 결합하는데 중요한 여러가지 잔기인, Q58, G46, D71, K77 및 R166은 쥐의 ICAM-1 또는 사람의 ICAM-2내에서 보존되어 있지 않으며[참고: Staunton, D.E. et al., Cell 56:849-853(1989), 이 문헌은 본문에서 참고로 인용되었음] 이것은, 쥐의 세포[참고: Colonno, R.J. et al., J. Virol. 57:7-12(1986)]와 ICAM-2가 분명히 리노바이러스-14와 결합할 수 없다는 것과 일치한다.

본 발명이 특정의 양태에 대해서 기술했다 해도, 본 발명을 더욱 변형시킬 수도 있으며 본 출원은 본 발명에 따르는 어떠한 변형, 용도들 또는 본 발명의 적용-일반적으로, 본 발명의 원리 및 본 발명이 속해 있는 분야 내에서 공지된 사실 또는 관습적인 실행내에서 본 발명 명세서 내용으로부터 출발하는것, 전술한 바를 토대로 첨부된 청구범위내에서 결정적인 면을 응용하는 것-등을 커버하고자 한다는 의도를 이해하게 될 것이다.

Claims

세포 또는 바이러스의 표면에 존재하는 분자에 결합할 수 있고, 하기(a)내지(l)로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리펩타이드 하나 이상을 포함하는 세포간 부착 분자-2(ICAM-2) 또는 이의 단편.
세포 또는 바이러스의 표면에 존재하는 분자에 결합할 수 있고, 하기(a) 내지 (l)로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리펩타이드 하나 이상을 함유하는 ICAM-2 또는 이의 단편을 암호화할 수 있는 재조합 DNA 분자.
제1항에 따른 ICAM-2 및 이의 단편으로 이루어진 그룹중에서 선택된 분자에 결합하여 궁극적으로 세포 또는 바이러스의 표면에 존재하는 분자에 결합하는 상기 분자의 능력을 손상시키는 모노클로날 항체.
제3항에 따른 모노클로날 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포.
(a) 동물을 ICAM-2 발현세포로 면역화시키는 단계, (b) 동물의 비장세포를 골수종 세포주와 융합시키는 단계, (c) 융합된 비장 및 골수종 세포가 항체 분비 하이브리도마 세포를 형성하도록 허용하는 단계 및 (d) ICAM-2와 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있는 목적하는 하이브리도마 세포를 수득하기 위해 하이브리도마 세포를 스크리닝하는 단계들을 포함하는, 제4항에 따른 하이브리도마 세포의 생산 방법.
(a) ICAM-2 발현 세포 또는 이의 추출물을, 제2항에 따른 재조합 DNA 분자로부터 전사된 ICAM-2 mRNA와 하이브리도화할 수 있는 핵산 분자의 존재하에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 핵산분자가 언급된 세포 또는 이의 추출물중에 존재하는 상보적인 핵산 분자와 하이브리드화 되었는지를 측정하는 단계들을 포함하여, ICAM-2 발현 세포의 존재를 검출하는 방법.