JPH02481A - 可溶性ｔ４の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及咀凶分ユ 本発明は、可溶性Ｔ４（ｓＴ４）タンパク質の産生に関
する。さらに詳しくは、本発明は、哺乳動物の細胞にお
けるｓＴ４の発現用ベクターの組立ておよび得られた産
生物の精製に関する。

発明の背景 ７４分子は、有効なＴ細胞−標的細胞相互作用の媒介に
関連するいくつかの非多形性Ｔリンパ球表面タンパク質
の１つである。これらの表面夕ンパり質の分析は、成熟
Ｔリンパ球が、Ｔ４またはＴ８表面糖タンパク質いずれ
かの優性発現に基づいて２クラスに区分できることを示
している［ラインヘルツら（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ、　ａｔ
　ａｌ、　）、セル（Ｃｅｌｌ）、１旦：　８２１（１
９８０）］。Ｔ８は、細胞毒性およびサプレッサーＴ細
胞上で発現するのに対して、１４分子は、優性的にヘル
パー１９７８球上で発現する［ラインヘルツら、前ｆｆ
３（１９８０）］。ある種のＴ４Ｔ　’Ｊンパ球は細胞
毒性作用および抑制作用を発揮するため、この機能的差
異は絶対的ではない［トーツスら（Ｔｈｏ＋ｍａｓ、ａ
ｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オフ・エクスベリメンタル
・メディスン（Ｊ　、　ＥＸｐ、　　Ｍｅｄ、）、１５
４：４５９　　（１９８１）；　ミニーアら（Ｍｅｕｅ
ｒ。

ｅｔ　ａｌ、）、プロシーデインゲス・オフ・ナショナ
ル・アカデミ−・オフ・サイエンシス・Ｕ　Ｓ　Ａ　（
Ｐ　ｒｏｅ。

Ｎａ１１．Δｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　ＳＡ）、７９
：４３９５　（１９８２）］。より強固な関係が、Ｔ細
胞サブセットと標的細胞により発現した主要組織適合性
廖合体（ＭＩＩＣ）遺伝子産生物の間に存在する。Ｔｌ
ｌ　Ｔ細胞はクラスＩのＭＩＩＣ分子を発現する標的細
胞と相互に作用するのに対して、Ｔ４７９７８球はＭｌ
ＩＣクラス■遺伝子産生物を発現する標的細胞と相互に
作用する［エングルマンら（Ｅｎｇｌｅｆｆｉａｎ、ｅ
ｔ　ａｔ、）、ジャーナルφオフ・イム７０シイ−（Ｊ
　、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）％土２７：２１２４　　（
１９８１）：クレンスキーら（Ｋ　ｒｅｎｓｋｙ、　ａ
ｔ　ａｌ、）、プロシーデインゲスーオブ・ナショナル
・アカデミ−・オフ・サイエンシス・ＵＳＡ、７９　：
　２３６５　（１９８２）；ビッディソンら（Ｉ３１ｄ
ｄｉｓｏｎ、　ａｔ　ａｌ、　）、ジャーナ／ｌ／−オ
フ・エクスベリメンタル・メディスン、１５６：　１０
６５　　（＋９８２）；スワインら（Ｓ　ｖａｉｎ＋　
ｅｔ　ａ）、　）、イムノールルス（Ｉ　ｇ＋ａ＋ｕｎ
ｏ１．　Ｒｅｓ、　）、７４　＋　１２９　　（１９８
３）］。さらには、Ｔ４およびＴ８に関連するモノクロ
ーナル抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＴ　ｔ４Ｂ胞
機能を抑ｆｆ、Ｉ＋する（エングルマンら、ジャーナル
・オフ・エクスベリメンタル・メディスン、１５４：１
９３（１９８１）；ワイルドら（Ｗｉｌｄｅ、ｅＬ　ａ
ｌ、）、ジャーナル・オフ・イムノロシイ−１１３１：
２１７８（１９８３）］。これらの観察は、７９７８球
の部分母集団と種々の標的細胞との相互作用の特異性は
、各々、Ｔ４およびＴ８とクラスＩｔ　ＭＩＩＣおよび
クラスＩ　ＭＩＩＣタンパク質との組み合わせに起因し
、この認識がＴ細胞機能について不可欠であることを示
している。

ヒトＴ４受容体のｃＤＮ＾配列が知られている［マ、ッ
ドンら（Ｍ　ａｄｄｏｎ、　ｅｔ　ａ　１．　）、セル
、±２＋９３（１９８５）］。完全Ｔ４ブレータンパク
質配列は、推定２３アミノ酸分泌リーダー、３７２アミ
ノ酸表面（ｖ、−Ｖ、）、２３アミノ酸トランスメンプ
ランおよび４０アミノ酸細胞質ドメインからなる長さ４
５８アミノ酸である。表面ドメインは、イムノグロブリ
ン可変部位（ｖ）およびジョイニング部位（Ｊ）に対す
る相同性を２０〜３０％に制限した４つの部位を示す。

表面ドメインにおける５つのイントロン−エクソン境界
のうち４つが、これらＶ−Ｊ部位の接合部付近に生じて
いる。マウスおよびヒツジＴ４タンパク質についての部
分タンパク質配列情報に基づき［クラッソンら（ＣＩａ
ｓｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、　）、イムノゲネテックス（
Ｉ　ｍｍｕｎｏｇｅｎ、　）、２３：１２９（１９８６
）］、表面ドメインにおける６個のシスティンが順次対
となり、３個のジスルフィド結合を得る。アミノ酸配列
に基づくＮ一連結グリコシル化について２つの可能な部
位がある。このＶ−Ｊ相同性、システィン対およびイン
トロン−エクソン構造は、Ｔ４が、該イムノグロブリン
とある構造的類似性を共有することを示唆している。

ヒト免疫不全ウィルス（ＩＩＩＶ）、後天性免疫不全症
候群（Ａ　Ｉ　ＤＳ）　（エイズ）の精神病薬剤は、Ｔ
４　リンパ球に対して著しい親和性を示す。ＩＩＩＶゲ
ノムの分子特性は、該ウィルスが他のレトロウィルスと
同様の全体的ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖもη成を表すこと
を示している［ラットナーら（ＲａＬｎｅｒ、′ｅｔ　
ａｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、ｌ上３：２７
７　　（１９８５）；ワインーホブマンら（Ｗａｉｎ−
Ｈｏｂｇｏｎ、ｅｔ　ａｌ、）、セル、４０：９　　（
１９８５月。該ウィルスのＴ４　リンパ親和性（ｌｙｍ
ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）特性は、Ｔ４受容体に対するその
特異結合により説明することができる。Ｔ４に対するモ
ノクロごナル抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＴ４細
胞の１目Ｙ感染を遮断する［グルグレイ、シュら（Ｄａ
ｌｇｌｅｉｓｈ、ａｔ　ａｌ、）、ネイチャー、ｌ１又
：７６３　　（１９８４）；マクロドウガルら（ＭｃＤ
ｏｕｇａｌ、ｅＬ　ａｌ、）、ジャーナル・オフ・イム
ノロシイ−１上且５：３１５１　　（１９８５）］。非
リンパ球様ならびにリンパ球様ヒト細胞株は、Ｔ４受容
体を欠いており、１１１ｖで感染しえないが、これらの
細胞はクローンされたＴ４遺伝子の導入および発現で感
染に対して感受されやすくなる［マツトンら（Ｍａｄｄ
ｏｎ、ａｔ　ａｌ、）、セル、エヱ：３３３（１９８６
）］。Ｔ４に結合しているウィルスは、ウィルスエンベ
ロープのｇｐ１２０糖タンパク質により媒介される。Ｔ
４タンパク質を、抗−ｅｎｖ抗体と共に溶解１１！ｖ感
染細胞から共沈させることができ、また、逆ニ、ｇｐ１
２０ヲ抗−７４４１１クロ一ン抗体と共に共沈させるこ
とができる。すなわち、Ｔ４に結合しているウィルスは
、ウィルスエンベロープのｇｐ１２０ｔＪｓ９ンパク質
により媒介されることを示す［マクロドゥガルら、サイ
エンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２３上：３８２（１９８
６）］。

エイズは、細胞免疫応答の結果的機能障害とともに、１
４９２８球の障害および最終的には抑制をもたらす。Ｉ
ｎ　ｖｉＬｒｏにおいて、旧Ｖは特異的にＴ４細胞を殺
す［ガロら（Ｇａｌｌｏ、　ａｔ　ａｌ、）、サイエン
ス、λ２４　：４９７　　（１９８４）；サーンガダラ
ンら（Ｓ　ａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　ｅｔ　ａｌ、　
）、サイエンス、２２土：５０６　　（１９８４）；バ
リー−ジノウシ−ら（Ｂ　ａｒｒｅ−５ｒｎｏｕｓｓｒ
、　ｅｔ　ａＬ　）、サイエンス、２２０　：　８６８
　　（１９８３）］、しかしながら、ある種のリンパ球
様および骨髄性細胞は、著しい細胞変性作用を伴うこと
な（生産的に感染しうる［デロッシーら（ＤｅＲｏｓｓ
ｉ、ｅＬ　ａ’１．）、プロシーデインゲス・オフ・ナ
ショナル・アカデミ−・オフ・サイエンスＵＳＡ、ｌ１
：４２９７　　（１９８６）；ガードナーら（Ｇ　ａｒ
Ｌｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　）、サイエンス、２３３　
：　２１５（１９８６）］。Ｉ　ｎ　ｖｉＬｒｏにおい
て、細胞毒性作ｍ　は、旧Ｖエンベロープタンパク質［
ソドロスキーら（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ、ｅｔ　ａｌ、）、
ネイチャー、３２２：４７０　（１９８６月およびＴ４
受容体［ホ牛シー（Ｈｏｘｉｅ、　ａｔ　ａｌ、　）、
サイエンス、２３４　：　１１２３（１９８６）］の発
現レベルに依有する。近年の報告は、細胞崩壊と融合細
胞形成の間の直接的な相関関係を記載している［ヨッフ
ェら（Ｙｏｒｆｅ、ｅＬａｌ、）、プロシーデインゲス
・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンスＵ
ＳＡ、８４　：　１４２９（１９８７）］。しかしなが
ら、細胞崩壊の原因は明らかではなく、それは、細胞融
合の直接の結果または同一細胞内における１ｌＩＶｅｎ
ｖタンパク質とＴ４の共発現の結果でありうる。

エイズウィルスは神経ＦＡ相性ならびにリンパ親和性で
ありうる。エイズには、しばしば、大抵が亜急性脳炎の
結果である中枢神経系（ＣＮＳ）機能障害が付随する。

エイズウィルスＩＩＮ＾およびＤＮＡが、口された脳に
おいて同定され［シャウら（Ｓ　ｈａｙ、　ａｔａｌ、
）、サイエンス、２２ユニ　１７７　　（１９８５）］
、ウィルスはマクロファージおよび星状細胞内にあり、
神経系障害の患者の脳および脳を髄液の両方からウィル
スが単離された［レビーら（Ｌ　ｅｖｙ、　ｅ（ａｌ、
）、ランセト（Ｌａｎｃｅｔ）、ｆｆ：５８６　　（１
９８５）］。これらの観察結果は、エイズウィルスが脳
細胞に感染し、エイズ患者において観察されるＣＮＳ障
害に直接的に関連していることを示唆している。

最近の研究は、ある種の脳組織において、Ｔ４ｍＲ１１
Ａの発現を同定している［マツトンら、前ＩＱ、（１９
８６）］。°２つのＲＩＩＡ種が観察され、一方は大き
さがリンパ球において観察されるものに匹敵し、他方は
より小さなｍＲＮＡである。この縮小したｍＲＮＡによ
りコードされるＴ４タンパク質の特性はまだ明らかにさ
れていない。ＣＮＳの旧Ｖ浸潤に対する脳組織のＴ４発
現の関連性は、現在なおｍ論にすぎない。

灸叫璽要灼 本発明は、ｇＴ４を産生ずる細胞培養からの清澄調整培
地から、可溶性Ｔ４（ｓＴ４）を精製する方法に関する
。該方法は、調整培地をカチオン交換担体と接触させる
ことによりｓＴ４を該担体に成行させ、該担体から該ｓ
Ｔ４を溶出し、該溶出液をアニオン交換担体と接触させ
、該アニオン交換担体からの流出液中のｓＴ４を収集す
ることからなる。

本発明の他の具体例において、ｓＴ４を産生ずる方法は
、以下の工程：　　１）ｓＴ４を発現する哺乳動物細胞
を培養し、２）遠心分離および濾過により培養細胞から
の調整培地を清澄にし、３）該清澄培地をスルホプロピ
ル−セファロース０カラムと接触させ、４）Ｏ〜０．５
Ｍ　ＮａＣｌ２のリニア・グラジェントを用いて該カラ
ムからｓＴ４を溶出し、５）該溶出液を透析して塩を除
去し、６）該透析溶出液をＱ＾トセファロース０カラＡ
【接触させ、７）流出液をセファロース■１２のカラム
に通し、８）着装ｓＴ４を収集することからなる。

第１図の簡単な記載 可溶性Ｔ４の配列：　可溶性Ｔ４のｃＤＮＡ配列は、Ｔ
４ｃＤＮＡの発表された配列から由来し［マツトンら（
Ｍａｄｄｏｎ、　ｅＬ　ａｌ、　）、セル、±２：９３
　（１９８５）］、合成リンカ−をｂｐ１２５２の１１
ρａｎ部位にて加えられている。該合成リンカ−は、ｂ
ｐ１２５８にて翻訳終止フドンを導入している。推定タ
ンパク質配列をヌクレオチド配列の下に示す。リーダー
プロセシング部位が、ｔｈｅ（ｂｐ　ｌ　５２　）とｇ
ｌｎ（ｂｐ　１５５）の間にあると推定される。アミノ
酸配列により決定したｓＴ４タンパク質の最初の２０残
基を、推定タンパク質配列の下に示す。推定配列は「＊
」により示す。

発明の詳細 な説明は、丁４受容体の推定細胞外ドメインからなる可
溶性Ｔ４（ｓＴ４）と称される組換型１４分子を産生ず
る手段を開示する（第１図参照）。Ｔ４受容体のリーダ
ーおよび細胞外ドメインをコードするＴ４ｃＤＮ＾部、
すなわち、Ｐｒｅ−ｓＴ４を用い、哺乳動物細胞におい
てｓＴ４過剰発現の能力を有するベクターが組み立てら
れる。

例えば、公知ＤＮＡ配列を用いる遺伝子を合成すること
により、該配列に基づく標準的クローニング法により、
ならびｌこタンパク質検出、すなわち、丁４発現細胞株
からの（ｊＤＮＡクローンのトランスフェクションとタ
ンパク質に対する抗体での同定による再分離により、８
Ｔ４についてのコーディング配列を得ることができる（
マツトンら、前掲参照）。

ｓＴ４コーディング配列を有するｃＤＮＡクローンは、
オリゴヌクレオチド雑種形成プローブの使用により同定
することができる。該プローブは既知配列の該Ｔ４タン
パク質に基づいてデザインできる。ｓＴ４コーディング
配列を有するクローンを同定する場合、該コーディング
配列を制限エンドヌクレアーゼの使用により切除し、ク
ローニングおよび／または発現ベクター中に挿入するこ
とがで截る。発現ベクターにおいて、Ｓ丁４コーディン
グ配列は、コーディング配列の転写、翻訳およびプロセ
シングに必要なまたは望ましい調節機能に対して活動的
にリンクしている。

調節機能は、例えば、Ｉ？ＮＡポリメラーゼ結合および
転写に要する機能、ならびにポリアゾニレ−ジョンおよ
び転写配列の強化のような他の機能を包含する。例えば
、形質転換クローンのトランスフェクションおよび選択
後まで発現が誘発されないように、プロモーターを調節
することが可能である。本発明の実施において有用なプ
ロモーターは、例えば、ＳＶ４０早期プロモーター、お
よびラウス肉腫ウィルスまたはモロニー肉腫ウィルスの
ロング・ターミナル・リピート（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｎ
ａｌ　ｒｅｐａａＬ）（ＬＴＲ）を包含する。

トランスフェクションに先たち、ｓＴ４ミニ遺伝子、す
なわち、Ｔ４受容体のリーダーおよび細胞外ドメインを
コードする遺伝子を、好ましくは、遺伝選択マーカー系
からなるより大きなりＮＡ分子中に組み入れる。該選択
マーカー系は、トランスフェクションされた宿主細胞に
おいて、容易に検出しうる表現型変化を引き起こすいず
れか１つのまたはＰ（数の遺伝子からなることができる
。かかる表現型変化は、例えば、病巣形成、０４１８ま
たはヒグロマイシンＢに対する耐性遺伝子のような薬剤
耐性であってよく、また牛サンチングアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（ｘｇｐｒＬ）、チミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）およびガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）のよ
うな他の選択マーカーであってもよい。遺伝子増幅を可
能にする選択マーカーを用い、トランスフェクション効
率を増加させるか、またはｍ要なｍ金倉および選択マー
カーの細胞内復製を強化することによりコピー数を増加
させることができる。また、遺伝子のコピー数を増幅す
るのに供するマーカーは、ジヒドロホレートレダクター
ゼ（メトトレキセート耐性）、ＣＡＤ（Ｎ−ホスホンア
セチル−し−アスパラギン酸耐性）およびアデノシン脱
アミノ酵素（２−デオキシコフロマイシン耐性）につい
ての遺伝子を包含する。

哺乳動物細胞における転写および翻訳後、リーダー配列
が開裂するらしく、成熟ｓＴ４が：Ａ整整地地中分泌さ
れる。

本発明の好ましい実施において、ｓＴ４！二遺伝子を、
ヒトＨ−ｒａｓまたはマウスジヒドロホレートレダクタ
ーゼ（ＤＩＩＰＲ）ミニｊｆｔ金倉とリンクして発現ベ
ク′ターを得る。

ｓＴ４　！二ｊ１１伝子を、例えば、ヒトＨ−ｒａｓま
たはマウスＤＩＩＰＲとリンクさせ、選択マーカーおよ
びこれらの遺伝子とのコトランスフェクションを介して
遺伝子発現を選択的に増幅する手段を得る。共通選択マ
ーカーは、例えば、ＤＩＩＦＲ，０４１ｇまたは目的の
遺伝子の単一コピー程に少ない組込みを選択するヒグロ
マイシンを包含する。例えば、ＤＩＩＦＲ系のメトトレ
キセート（ｍｔｘ）での増幅は、遺伝子の過剰発現をも
たらす。

遺伝子発現を増加させる別の手段として、ｒａｓがん原
遺金倉の使用が挙げられる。該ｒａｇ遺伝子ｌＩＴは、
Ｈ−ｒａｓ、　Ｋ−ｒａｓおよびＮ　−ｒａｓ遺伝子を
包含する。本発明の好ましい適用においては、Ｈ−ｒａ
ｓ遺伝子を用いる。

他のＤＮＡ官能基を、ｓＴ４　ミニ遺伝子に直接的また
は間接的にリンクさせるか、あるいは官能基はリンクさ
せなくてもよい（例えば、米国特許第４３９９２１６号
参照）。

哺乳動物細胞の遺伝子産生物の過剰発現は、−時的また
は永続的手段により達成しうる。−時的過剰発現は、ワ
クチニアウィルスベクターの使用のごときウィルス法に
より、または５Ｖ４０ｉＵ製を有する細胞におけるＳＶ
４０基盤ベクターを用いるような遺伝子増幅法により達
成することができる。これらの方法は、結局は、細胞死
にもたらす。永続的過剰発現は、遺伝子増幅についての
選択を介し、またはｒａｓがん原遺金倉の使用を介する
ような同義遺伝子コピーの発生により達成できる。

Ｈ−ｒａｇ遺伝子系を用いるコトランスフェクシリンに
よるｓＴ４タンパク質の過剰発現は、好ましい細胞株が
、接触抑制されたマウス線維芽細胞株であるＮＩＴ−３
Ｔ３細胞株である多くの異なった細胞株を用いることに
より達成することができる。

池の細胞株は、正常なラットの腎臓（Ｎｌ？Ｋ）（ＡＴ
ＣＣ１５７１）細胞株およびラットの胎芽線維芽細胞５
２（ＲＥＦ−５２）細胞株を包含する［マツククルーら
（ＭｃＣｌｕｒｅ、ａｔ　　ａｌ、）、コールド・スプ
リング・ノー−バー・コンファレンス・オン・セル書プ
ロリフエレイシヲン（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒ　Ｃｏｎｒｅｒｅｎｃｅｓｏｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒ
ｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）　、旦：３４５（１９８２月
。

例えば、遺伝子コピー数の増幅を選択的増幅により達成
するＤＩＩＰＲとメトトレキセートとの選択マーカー系
（ＤＩＩＦＲ／ＭＴＸ法）を用いる場合、チャイニーズ
ハムスターの卵巣細胞株（ＣＩＩＯ）が好ましい。

特に、ＤＩＩＰＲの欠失しているＣ１１０細胞を用いる
［ウルラウブら（Ｕ　ｒｌａｕｂ、　ｅｔ　ａｌ、　）
、セル、３３：４０５（１９８３）］。用いることので
きる他の細胞型は、例えば、ＤＩＩＰＲ−であるように
改変されたいずれの哺乳動物細胞も包含する。

ある種のＤＩＩＰＲ細胞型を、正常なりＩＩＦＩ？より
もメトトレキセートに対して感受性の少ない突然変異株
ＤＩＩＦＲ遺伝子と組み合わせて用いてもよい（米国特
許第４３９９２１６号）。原理的に、ＤＩＩＰＲ細胞は
、正常なりＩＩＦＲｊｆｔ伝子と、さら金倉Ｇ４１８耐
性用の遺伝子のごとき優性選択可能な遺伝子とを組み合
わせて用いてもよい［牛ムら（Ｋ　ｉｓ、　ｏＬ　ａｌ
、　）、セル、４ス：１２９　（１９８７）］。トラン
スフェクシｄノは標準方法を用いて行う［例えば、フィ
グラーら（Ｗｉｇｌｅｒ、ｅｔ　ａｔ、）、プロシーデ
インゲス・オン・ナシッナル・アカデミ−・オン・サイ
エンスＵＳＡ、ヱ６　：１３７３　（１９７９）および
コベランドら（Ｃｏｐａｌａｎｄ、　ａｔ　ａｌ、　）
、セル、上ヱ：９９３　（１９７９）参照］。これらの
技法は、例えば、リン酸カルシウム沈７ｍ、　ＤＥＡＥ
−デキストラン誘発飲細胞運動、エレクトロポーレイシ
ランおよびウイルストランスフェクシゴンを包含する。

トランスフェクシゴン後、耐性またはマーカー遺伝子を
収容し、発現する細胞を、選択的薬剤を含有する標準的
吐乳培養培地にて培養することによって得ることができ
る。例えば、ＤＩＩＦＲ欠失細胞のＤＩＩＰＩ＋耐性に
ついての選択は、５〜１５％透析胎児ウシ血清を含有す
るヒボキサンチンおよびチミジン百合のＨａｍ’５ＦＬ
２培地（ギブコ、グランド・アイランド、二ニーヨーク
（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇ　ｒａｎｄ　ｂｌａｎｄ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ））にて行うことができ、ＤＩＩＰＲ
−細胞におけるＤＩＩＰＲ耐性についての選択は、５〜
１５％子ウシ血清およびメトトレキセートを含有するデ
ルベツコ修正イーグル培地（Ｄｅｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍ
ｏｄＨｉｅｄＥ　ａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ
）（Ｇｉｂｃｏ）にて行うことができ、Ｈ−ｒａｓ遺伝
子での形態的形質転換についての選択は５〜ｌＯ％子ウ
シ血清中のＤＭＥＭにて行うことができる。薬剤濃度に
応じて増幅できる耐性遺伝子を有する細胞を、さらに増
ｆｉｔＬ、た薬剤を含有する培地中にて培養することが
できる。ｍ胞培養を３０〜４５°Ｃにて常圧で保持する
。高レベルのｓＴ４タンパク質を発現する選択された細
胞を、ＥＬＩＳＡおよび免疫プロット法のような標準的
免疫方法により同定する。かかる細胞を培養し、産生物
、ｓＴ４タンパク質を収集し、精製する。

調整培地（ＣＭ）は、固体担体に付着した細胞または懸
濁液中の細胞から収集することができる。例えば、ＣＭ
は、ローラーボトルで増殖させ、または固体担体上で増
殖させ、懸濁液または流動床あるいはパック床にて培養
した何首細胞から調製できる。また、ＣＭは、撹拌タン
ク中の懸濁細胞から調製できる。

本発明のｇＴ４は、Ｔ４の細胞外ドメインの誘導体を包
含する。かかる誘導体は、調整培地へのタンパク質分泌
および旧Ｖ　ｅｎｖタンパク質、すなわち、ｇｐ１２０
に対する該タンパク質の親和力に著しい悪影響を及ぼさ
ない付加、欠失または置換からなる。

例えば、１個または数個のアミノ酸をＮ−またはＣ−末
端に付加するこりも、またはＮ−またはＣ−末端から欠
失することもできる。もしくは、１個または数個のアミ
ノ酸、好ましくは４個以下のアミノ酸を内部アミノ酸中
に挿入し、欠失し、または置換することができる。また
、ノルイブリッドタンパク質、すなわち、翻訳融合°が
、ｇＴ４とタンパク質担体、他の抗原または曲のｓＴ４
分子の間で構成され、ポリ−５Ｔ４分子を調製すること
も可能である。

さらにまた、ｓＴ４を担体分子に合成的に接合すること
ができる。

ｓＴ４誘導体の１具体例を、以下の実施例において示す
（実施例４参照）。旧Ｖ　ｅｎｖに対するｓＴ４の親和
力は、既知の親和力を有するｓＴ４分子を用い、または
０ＫＴ４および０ＫＴ４ＡのようなＴ４受容体を認識す
る抗体を用いる競合結合検定により測定することができ
る。本発明の有用な誘導ｓＴ４分子は、実施例４Ｂおよ
び４Ｃに示されるように、　０ＫＴ４＾により調整培地
から選択的に沈澱する。誘導体は、発現後は化学的に、
または発現前は遺伝的にリーダーおよび／または細胞外
ドメインについてのコーディング配列操作により調製す
ることができる。

本発明のｓＴ４は、種々のタンパク質精製法、例えば、
アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水
性クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを
用い、使用した培養培地から精製できる。

ｓＴ４は、一般の基特異性成骨剤、例えば、炭水化物結
合または染料アフィニティー・リガンドを用い、または
ｓＴ４に対して特異的に結合するリガンド、例えば、モ
ノクローナル抗体またはＩＩＩＶ　ｇｐ１２０タンパク
質あるいはその１部を用いるアフィニティー・クロマト
グラフィーにより精製できる。

代表的精製方法は、ｌ）血清不含選択増殖培地における
細胞の増殖、２）調整培地の清澄化、および３　）Ｍ整
地地中に存在する他のタンパク質からの本発明の８１４
の分離からなる。

好ましい方法においては、ｓＴ４を、ｓＴ４分子の物理
特性に基づく一連のクロマトグラフィー工程を用い、血
清不含培養培地から精製する。該！ＩＴ４はまた、同様
のクロマトグラフィー法を用い、血清含有培養培地から
精製してもよい。

ｓＴ４の好ましい精製法においては、培養培地をまず遠
心分離および／または濾過により清澄化し、ついでカチ
オン交換担体、例えば、大部分の混入タンパク質は！Ｊ
ラムを通過するが、ｓＴ４とは結合するカルボキシメチ
ルまたはスルホプロピルカラム、好ましくはＳ−セフ１
０−ス（スルホブロピルセファロース）（ファーマシア
、ビス力タウエイ、ニュージャージ州）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ、Ｐ　１ｓｃａｔａｖａｙ。

Ｎｅｗ　Ｊ　ｅｒｌｌｅｙ）カラムを通す。ついで該タ
ンパク質サンプルをリニア塩グラディエント、例えば、
０〜０．５ＭのＮａＣｌ２を用いて溶出する。次に、好
ましくは透析後、イオン交換カラムを用いて塩を除去す
る。このカラムは、アニオン交換カラム、例えば、ジエ
チルアミノエチルまたは第４級アミ／エチルカラム、好
ましくはＱ−セファロース■（第４級アミノエチルセフ
ァロース）（ファーマシア）カラムであり、該サンプル
中に存在する混入タンパク質が該カラムに結合するが、
ｓＴ４は結合せず、カラム流出２５　街液中に回収でき
る特性を有する。

最終的には、架橋デキストランカラムまたはアガロース
カラムのような残りの混入物質を除去するためのゲル濾
過カラムを用いる。

サイズ排除工程は、分子ｆｉ！１０００〜３０００００
の分離範囲を有する、例えば、約５０μｍ以下の小粒子
充填材を用いて行う。かかるゲルの使用により、残留す
る痕跡世の高分子量混入物を除去できることが判明した
。例えば、平均粒径２０〜４０μｍおよび分子ｍ１００
０〜３０００００の分離範囲を有するセフ１０−ス＠１
２架橋アガａ−ス（ファーマシア・）が挙げられる。

ｓＴ４精製の別法は、ｓＴ４に対するモノクローナル抗
体の使用を包含する。該ｓＴ４タンパク質は、ｓＴ４に
対するモノクローナル抗体が結合するアフィニティー・
ゲル担体を介して清澄培養培地を通すことにより１工程
で精製することができる。該ｓＴ４は抗体結合部位にて
該カラムに結合し、すべての混入タンパク質は該カラム
を介して洗浄される。

ついで、ｇＴ４タンパク質の不活性化を防止する条件下
にて、該ｇＴ４を該カラムから溶出する。

ｓＴ４タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける生体およ
び免疫特性の特徴は、該タンパク質がエイズの予防およ
び治療に有用であることを示す。研究は、該ｓＴ４タン
パク質がウィルスの細胞外および細胞から細胞への蔓延
の抑制剤として作用することを示す。ｓＴ４は、ウィル
スが培養中のＴ４標的細胞に結合することを遮断するこ
とが知られているので、感染したヒトにｓＴ４を投与す
ることは、ウィルスの細胞外蔓延を抑制するように作用
すると考えられる。したがって、ｓＴ４は、エイズ治療
用の予防および治療薬として両方に有用である。

予防薬として、ｓＴ４を、該疾患の可能性の高いヒトに
、またはウィルスに対する抗体の存在により］！！Ｖに
さらされていることを示すヒトに投与する。疾患の初期
段階にてまたはその罹患前に有効ｍのｓＴ４を投与する
ことは、ＩＩＩＹによるＴ４　リンパ球感染を抑制する
ように作用する。治療薬として、＋１１Ｙで感染したヒ
トにｓＴ４を投与することは、ウィルスの細胞外蔓延を
抑制するように作用する。

１１！ｖ感染細胞と池のＴ４　リンパ球の間の融合もま
た、ウィルス蔓延の経路であると思われる。さらに、融
合は、一部、Ｔ４　リンパ球機能障害および、結局は、
感染したヒトにおけるＴ４　リンパ球抑制の原因となり
つる。ＩＩ［ｌ胞融合はウィルスエンベロープの遺伝子
産生物およびＴ４受容体の両方に依存。

しており、０ＫＴ４＾または類似するモノクローナル抗
体（Ｍａｂｓ）により抑制することができる［サノテン
タウら（Ｓ　ａＬｔｅｎｔａｕ、　ｅｔ　ａｌ、　）、
サイエンス（Ｓｅｔａｎｃｅ）、２３／Ｉ　：１１２０
　　（１９８６）］　、ｓＴ４は細胞融合を干渉し、し
たがってウィルスの細胞か十 ら細胞への蔓延およびＴ４　リンパ球機能の喪失の減少
が期待される。

Ｔ４受容体は単形性であるため、ｓＴ４は、あらゆるＩ
ＩＩＶを包含するＴ４受容体の表面ドメインを認識する
ウィルスの万能抑制剤であると考えられる。

ｓＴ４は、他の薬剤と組み合わせ、例えば、逆トランス
クリブターゼ、プロテアーゼまたはｔａｔのような他の
旧Ｖタンパク質に対する薬剤と組み合わせて用いてもよ
い。旧Ｖに対して有効な治療薬は、ウィルス媒介ならび
に感染の細胞から細胞への伝染を予防する。ｓＴ４はま
た、他の抗ウィルス剤、例えば、アジドチミジン（ΔＺ
Ｔ）と組み合わせて用いてもよい。

本発明のｓＴ４タンパク質はまた、Ｔ４細胞機能の抑制
剤として有用である。多数の研究は、免疫耐性、特に自
己免疫疾患の病原および経過ならびに宿主特異的移植片
拒絶におけるＣＤ４受容体（ＣＤ４は、ヒト丁４受容体
および他の曲孔動物細胞におけるその均等物に関する一
般的用語である）に対して臨界的役割を示している。抗
ＣＤ４　Ｍａｂｇでの観察が、特にｇＴ４に関連してい
る。ＣＤ４受容体との組み合わせにより、これらのＭａ
ｂｓのある種のものは自己免疫応答および移植片を巨砲
を改善する。かかる作用の例として、ｉｎ　ｖｉＬｒｏ
におけるＴ−細胞機能の抑制、例えば、抗原誘発増殖、
リンフ才力イン分泌およびある種の抗ＣＤ４　Ｍａｂｓ
によるヘルパー細胞機能の抑制、ネズミ狼そうの罹患阻
止のための抗ＣＤ４　Ｍａｂｓの投与による全身性エリ
テマトーデスの治療、およびマウスＣＤ４受容体に関連
するマウスＭａｂの単一投与が異型移植の許容をもたら
すマウスにおける移植研究が挙げられる。

ＭａｂのＣＤ４への結合の分子配列は明らかでない。Ｍ
ａｂはＣＤ４とそのリガンドとの会合を遮断しえ、該リ
ガンドはＭＩＩＣクラスＨ抗原上の保γｊエピトープで
あることが示唆されている［グリーンスティンら（Ｇｒ
ｅｅｎｇＬａｌｎ　ａｔ　ＩＩｌ、）、アン・インスト
・パスタ−（八ｎｎ、　Ｉ　ｒｖｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ
）、１３８：１３４　　（１９８７参照）およびガイら
（Ｇａｙ　ａｔ　ａｌ、）、アン・インスト・バスタ−
１１３８：　１２７　（１９８７月。しかしながら、こ
れらの同−Ｍ　ａｂｇの少なくともいくつかは、外見上
のクラス「独立経路によりＣＤ４細胞活性化を抑制する
。

ｓＴ４はまた、多分、通常、Ｔ４受容体の表面ドメイン
と相互に作用する細胞外標的分子に結合することにより
、細胞性Ｔ４の競争者としてＴ細胞相互作用を抑制する
と考えられている。このＭａｂｓと８Ｔ４の間の差異は
、■要な機能的結果をもたらしつる。例えば、Ｔ４に対
するいくつかのＭ６ｂ１＋は、Ｔ４細胞に対する応答を
生じるが、ｓＴ４は、　ＭＩＩＣクラス■抗原を発現す
る細胞に対する応答を生じつる。

また、推定クラス■リガ・ンドに対するＴ４の親和力は
、Ｔ４に対するＭａｂｇの高親和力に比較して非常に低
い。かくして、ＭＢｂｇおよびｓＴ４は同一プロセスで
干渉しうるが、それらは異なる標的分子および異なる標
的細胞に影響を及ぼす。

予防薬または治療薬としては、ｓＴ４を非経口的、好ま
しくは静脈内投与する。該薬剤は、例えば、毎日、毎週
または毎月、注入により、または注射により投与するこ
とができる。ｓＴ４の投与量および速度は、循環系にお
いて有効量のｓＴ４を維持するように選択される。別の
投与方法は、透析剤としてｓＴ４を用いる体外的投与で
ある。

本発明のｓＴ４タンパク質はまた、Ｔ４細胞相互作用の
治療剤または抑制剤として作用する天然、合成または組
換体分子を同定する試薬として用いることもできる。

例えば、ｓＴ４タンパク質は、ＥＬＩＳ＾をベースとす
る方法により測定されるタンパク質相互作用についての
検定のようなスクリーニング検定に用いることができ、
Ｔ４受容体表面ドメイン相互作用の競合物質について検
定する他の試薬と相み合わせて用いることのできる生化
学的に純粋な水溶性の試薬を提ｔＲする。例えば、ｓＴ
４は、旧Ｖ　ａｎｖタンパク質またはＩＩＩＶ　ｅｎｖ
タンパク質を含有する混合物に結合するため、ウィルス
結合の抑制剤をスクリーニングするのに用いることがで
きる。ｓＴ４がＨＩＶ　ｅｎｖタンパク質を発現する細
胞に結合することを示すデーターに基づき、ｓＴ４はま
た、ｉｎ　ｖｉｖ。

におけるＩＩＩＶ感染細胞についての選択的標的分子と
じ上世することもできる。標的特異性担体タンパク質と
して、ｓＴ４は、例えば、細胞毒性剤の感染組織へのデ
リバリ−用担体タンパク質として供することもできる。

加えて、Ｔ４受容体が、Ｔ４細胞のクラス制限により示
唆されるような細胞含有抗原においてＭＩＩＣクラス■
抗原と特異的に結合することを示すデーターに基づいて
、ｓＴ４は、クラス■抗体と組み合わせてＴ４１Ｊンパ
球−標的細胞の相互作用の抑制剤についての試験に用い
ることができる。ｓＴ４とその標的分子の間の直接的結
合検定に基づくこれらの例に加えて、ｓＴ４認識に対す
る生化学応答に依有するさらに複雑な検定を行なうこと
も可能である。

ｓＴ４は、それらが相互に作用するＴ４タンｉｔり質ま
たは分子を検出する診断検定に用いることができる。例
えば、Ｔ４およびＴ４細胞ならびにＴ４に対する抗体の
定量は、エイズに関する診断的価値を有する。

加えて、ｓＴ４は、新規な診断薬、例えば、Ｍａｂｓま
たは標準的免疫検定、すなわち、ＥＬＩＳ＾、捕捉イム
ノアッセイ、ラジオイムノアッセイにおいて用いる他の
型の分子を生成するのに用いることができる。ｓＴ４は
、０ＫＴ４．０ＫＴ４Ａおよび丁４受容体の他の表面エ
ピトープの全部でなくても大部分を現わすので、系中の
Ｔ４レベルの絶対量として用いることができ、特に免疫
診断検定に有用である。現在、Ｔ４受容体の定量につい
て何のスタンダードもない。

Ｔ４受容体は、３種の異なる化学環境下、すなわち、酸
化−親水性細胞表面、疎水性膜および還元−親水性細胞
質に存在する。これらの種々の環境が完全な本来の状態
の受容体の単離をほとんど不可能にする。細胞外ドメイ
ンからなるｓＴ４は、可溶性タンパクｆＩｆＩおして細
胞上清中に分泌され、その構造は、受容体表面ドメイン
の表面を模写していると思われる。すなわち、ｓＴ４は
、詳細な構造分析、特にＸ−線結晶学に適している。ｓ
Ｔ４単独および他の相互に作用する分子との複合形の３
次元構造の決定は、ｓＴ４に対する選択的拮抗剤および
作用剤の合理的設計に関する基礎を提供する。

火施倒 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、
これらに限定されるものではない。一般的手技において
用いた酵素は商業的に入手し、実質的に販売者の指示に
従って用いた。別途断わらない限り、操作は、実質的に
、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、　
）、モレキユラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒＬ　ａｂｏｒａＬｏｒｙ）、１９８２の記載に従って
実施した。

実施例１：ベクターの構成 組換えＤＮＡ手技を用い、ヒ）Ｔ４ｃＤＮＡ配列の塩基
対（ｂｐ）　１１２５７　　［マツトンら（Ｍａｄｄｏ
ｎ。

ｅｔ　ａｌ、）、前掲］を・、５ｖ−４０初期プロモー
ターとＴ＾＾終止コドンの間に、つづいてウシ成長ホル
モン遺伝子のポリアゾニレ−ジョン部位に配列した。

このＴ４ｃＤＮＡ配列は、Ｔ４受容体のリーダーおよび
予測した細胞外ドメインをコード化する。このｓＴ４　
ミニ遺伝子を、ヒトＨ−ｒａｓまたはマウスジヒドロホ
レートレダクターゼと合体し、各々、ベクターｐｓＴ４
ｃＩｌｒａｓおよびｐｓＴ４ＤＩＩＦＲを形成した。こ
れらベクターの構成は以下のとおりであった。

ｐｓＴ４ｓａｌの構成：　プラスミドｐｓ７４ｓａｌは
２種の他のプラスミド、ＪＲＴ４およびｐＵｃｓＴ４か
ら構成した。

これらのプラスミドの構成を以下に詳細に示す。

プラスミドＪＲＴ４の構成：　プラスミドＪＲＴ４を形
成するため、プラスミドＤＳＰＩ　［ブフア−ら（Ｐｒ
ａｒｒｅｔａｌ、）、ＤＮＡ、４：４６１　　（１９８
５）］をＸｈｏ　Ｉで切断し、ＳＶ４０ポリＡ？７３期
部位全部位させ、該Ｘｈｏ　１部位をＤＮＡポリメラー
ゼのクレノー・フラグメント（Ｋ　ｌｅｎｏｗ　ｒｒａ
ｇｍｅｎＬ）を用いてフィル・イン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）
　Ｌ、た。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアゼニレ
−シラン部位［ブフア−ら、ＤＮＡ、５　：１１５　（
１９８６）コを、ｒ’ｖｕ　ＩＴおよびＫｐｎｌで切断
し、該Ｋｐｎ　１部位を７４　ＤＩＩＡポリメラーゼで
処理してグランド化した。この２３０ｂｐフラグメント
をＤＳＰ＋に結合し、ＤＳＰＩＢＣＩＩを形成した。

ＤＳＰＩＢＣＩＩをＳｅａ　ＩおよびＳａｌ　Ｉで切断
し、ｇａｌＫカセット（ＳＶ４０初期プロモーター、ｇ
ａｌＫコード化部位およびＢＧＩＩポリＡ部位からなる
）を、５ａｌｌ末端、Ｂｇｌ１１部位およびＳｍａ　Ｉ
末端からなる合成リンカーラ用い、Ｓａｔ　Ｉ　８位に
てＩ）ＵＣｌ３　［ヤニシューベロンら（Ｙ　ａｎｉｓ
ｃｈ−Ｐ　ｅｒｒｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、　）、ジーン（
Ｇ　ｅｎｅ）、３３：　１０３　　（１９８５）コに結
合した。この３部分の結合は、プラスミドＤＳＰＩＢＺ
ＢＧＩ１．　ＪＴをもたらした。

ＳＬｕ　ＩおよびＢｃｌＨで切断し、ｇａｌＫコード部
位を欠失したＤＳＰＩＢＺＢＧＩｌ、　ＪＴを、プラス
ミドｐ７４Ｂから７４ｃＤＮ＾を含有する１　、　７　
ｋｂＥｃｏＲｌ（フィル・イン）−Ｂａ＋＊ｌｌｌａｌ
グメントに結合させ、プラスミドＪＲＴ４を得た。

プラスミドｐＵＣｓＴ４の構成：　プラスミドｐＵＣｓ
丁４を得るため、プラスミドｐＴ４ＢからのＴ４　ｃＤ
ＮＡのｌ１ａｅ■および１ＩｐａＩ［フラグメント（ｉ
ｉ２５ｂｐ）を、合成リンカ−を用い、Ｋｐｎ　Ｉおよ
びＸｂａ　Ｉで切断されたベクターｐＵｃ１８に結合し
た。Ｔ４　ｃＤＮＡのＩＩａａＩｒ末端をｐＵｃｌｇの
Ｋｐｎ　［部位に、合成リンカ−を用い、Ｋｐｎ　［末
端および１ＩａｅＩＩ末端で結合した。Ｔ４　ｃＤＮ＾
のＩＩｐａＵ末端をｐＵｃ１８のＸｂａ　１部位に、合
成リンカ−を用い、ＩＩｐａ［Ｉ末端とＸｂａ　！末端
で結合した。このリンカ−はまた、Ｔ４コード部位のヌ
クレオチド１２５７の後にＴ＾＾停止コードンを導入し
た。得られたプラスミドがｐＵｃｓＴ４であった。

プラスミドｐｓＴ４ｓａｌを得るため、プラスミドＪＲ
Ｔ４をＩ’１ｇ１ＵおよびＳａｃ　Ｅで切断し、９５９
ｂｐフラグメント（ＳＶ４０初期プロモーターおよびＴ
４　ｃＤＮ＾の第１６０２ヌクレオチドからなる）を単
離した。プラスミドｐＵｃｓＴ４をＳａｃ　ＩおよびＸ
ｂａ　Ｉで切断し、６６０ｂｐフラグメント（ヌクレオ
チド６０３〜１２５７からのＴ４　ｃＤＮ＾つづいて合
成リンカ−からのＴＡＡコードンからなる）を単離した
。これら２つのフラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＸｂ
ａ　Ｅで切断し、ＳＶ４０初期プロモーターおよび短縮
しないＴ４コード部位を欠失したＤＳＰＩＢＺＢＣＩｌ
、　ＪＴに結んだ。得られたプラスミドがｐＳ７４ｓａ
ｌであった。

ｐｓＴ４ＤＩＩＰＲの構成：　プラスミドｐｓＴ４ＤＩ
ＩＰＲを得るため、β−グロビンＤＩＩＦＩ？発現カセ
ットを含有するＢｇｌ　［１−Ｂａｍｌｌ　Ｉフラグメ
ントを、ｐｓ７４ｓａｌのＢａｍ１ｌ　１部位に結合し
た。該β−グロビンＤＩＩＰＲ発現カセットは、５゛に
てｌ３ｇ１１１部位を有するように合成リンカ−で修正
したマウスβ−グロビンプロモーター（プラスミドｐＰ
Ｋ２８ｇからの５５０　ｂｐ　ｌ１ｉｎｅｌＩフラグメ
ント　［バーブら（Ｂｅｒｇ、ｅｔ　ａｌ、）、モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　
Ｃｅ１ｌ。

Ｂ　ｉｏｌ、　）、３：１２４６　（１９８３）］）；
］マウスＤ１１ＦＲ：Ｉ−ド部位プラスミドｐｓＶ２−
ＤＩＩＦＲからの７３５ｂｐ　１Ｉｉｎｄ［（フィル・
イン）フラグメント　［スブラマニら（Ｓ　ｕｂｒａｍ
ａｎＬ　ｅｔ　ａｔ、　）％モレキニラーφアンド・セ
ルラー・バイオロジー、上：　８５４（１９８１）］）
　：　ＤＳＰ　１からのＮｈｅ　Ｉ　（フィル・イン）
−Ｂａｍｌｌ　Ｉ　（フィル・イン）　ＳＶ４０ポリＡ
初期部位［プファーら、ＤＮＡ、４：４６１　　（１９
８５）］　　；および］マウスＤＩＩＦＲターミネータ
一部位３゛にてＢａｍ１１１部位を得るように合成リン
カ−で修正したプラスミドｍＤＩＩ９からの９０７　ｂ
ｐ　ｌ１ｉｎｄｌｌｌ（寿＋し・イ〉）フラグメント　
［フラビンら（Ｆ　ｒａｙｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、　）、
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、４：
２９２１　　（１９８４）］からなる。

ｐｓＴ４ｃｌｌｒａｓの構成：　プラスミドｐＭＥＲｃ
ｌｌｒａｓは、ＥｃｏＲＶおよびｌｌ１ｎｄＩ［［（フ
ィル・イン）でプラスミドｐＭＥＲを切断し、ｇａｌＫ
部位を除去し、プラスミドｐｓＫｃｌｌｒａｓからのｃ
ｌｌｒａｓ用のコード部位を有する（ヤエナリ・ヌクレ
アーゼでプラント化にした）８７゜ｂｐ　Ｎｄｅ　Ｔ　
（フィル・イン）−Ｓａｌ　Ｉに結合した［グロスら（
Ｇ　ｒｏｓｓ、　ａｔ　ａｌ、　）、モレキュラー−ア
ンド・セルラー＋バイオロジー、５　：　１０１５（１
９８５）］。

プラスミドｐＭＥＲは、４つの位置でＰＳＶＫとは異な
る［シコンペルリら（Ｓ　ｃｈｕｍｐｅｒｌｉ、　ｅｔ
　ａｔ、　）、プロシーデインゲス・イン・ナショナル
・アカデミ−・イン・サイエンス　ＵＳＡ、ヱ９　：　
２５７　　（１９８２）］。

すなわち、（１）Ｓｍａ　１部位を有するリンカ−の導
入によるｂｐ３４０での１ＩｉｎｄｌｌＴ部位の欠失；
（２）ｂｐｌでのＰｖｕ■へのｐｕｃ９からｌｌ１ｎｄ
ＩＩ［フラグメントまでの３４　ｂｐ　ＥｃｏＲＩの導
入［ビエイラら（ｖｉｅｉｒａ、ａｔ　　ａｌ、）、ジ
ーン、Ｉ　９　：　２５９　　（１９８２）；（３）ｂ
ｐ１５７３〜２２９５での７２２ｂｐ　ｌ１ｐａ　Ｉフ
ラグメントの欠失オ、にヒ（４）Ｓａｌ　１部位を有す
るリンカ−の導入によるｂｐ２７０１での＾ｐａ１部位
の欠失。

可溶性Ｔ４転写カセットをＢｇｌ　ＩＩ　−１３ａｍｌ
ｌ　Ｉフラグメントを介してｐｓ７４ｓａｌから除去し
、ｐＭＥＲｃｌｌｒａｓのＢａＩ！Ｉｌ＋　１部位（Ｓ
Ｙ４　ＧポリＡ初期に対して３°）に結合し、ｐｓＴ４
ｃｌｌｒａｓを得た。

リン酸カルシウム沈澱法により、プラスミドｐｓＴ４ｃ
ｌｌｒａｓ（ｌ　Ｏ１１ｇ　）を、担体ＤＮ＾（Ｎｌ１
１−３Ｔ３ゲノミツクＤＮ＾）１０μｇの存在下、その
前日６０ｍｍの培養皿１つに付き５ｘｌＯ’個の細胞で
接種した＋１１１１−３７３細胞において、Ｇ４１Ｂ耐
性を付与するベクター、プラスミドｐＴＫｎｅｏ　１０
μｇと共に共沈、毀に付した。該細胞を３７°Ｃにて６
時間沈澱したＤＮＡと共にインキユベーシヨンした。該
ＤＩＩＡ沈澱物ヲ除去し、新たな培地（ＤＭＥＭ、　５
％ｐＪ　ｕ　−５ｅｒｕｍ　（フルラボラテブ・リサー
チ・インコーホレイテッド（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖ
ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　Ｉ　ｎｃ、）、レキシント
ン、マサチューセッツ州））を鏡面に加えた。、ｔ５ｆ
ｌＵ胞を１６時間後トリプシナイズし、３個の１００ｍ
ｍ皿に接種し、上記培地中に保持した。病巣（１皿当た
り約５０）が１２〜１４日で現れた。形質転換した病巣
を１１個選択し、増殖させ、ついで５００μｓ／ｍｌの
ゲネチシ７　０４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＩＩ　Ｇ４１
８）（ギブコ・ラボラドリース（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、グランドアイランド、ニューヨー
ク州）を加えた前記培地において、選択用１００ｍｍ皿
１個に付き５ｘｌＯ’細胞を接種した。

１１四のクローンはすべてＧ４１８選択（５００μｓ／
ｍｌ）にて残存しており、標準的免疫プロット法により
Ｉｆ−ｒａｓ（ｐ２１）レベルについてスクリーニング
した。

高レベルの９２１（約２ｎｇｐ２１／μｇトリトンー溶
性タンパク質）を発現したクローンを、ｓＴ４の発現に
ついて検定した。融合性培養を１ｓ３−標識メチオニン
およびシスティンで１８０−４ｒｌＬ’ｌインキユペー
ジジンした。培養上清および細胞溶解産物を、Ｔ４　（
ＯＫＴ４．０ＫＴ４Ａ）およびＴｌ１（ＯＫＴ８）受容
体に特異的なモノクローナル抗体、ｒａｓタンパク質に
対して特異的なポリクローナル抗体または非特異的マウ
スＩｇＧと共にイムノプレシビテーションに付した。約
４５　ｋｄ、予測サイズのｓＴ４のタンパク質を、Ｔ４
受容体に対して膏用である両方のモノクローナル抗体に
より培養培地から特異的に沈澱させた。細胞溶解産物に
おいて、ｓＴ４結合は観測されなかった。予想どおり、
ｐ２１は該細胞から沈澱したが、培養上清からは沈澱し
なかった。精製したｓＴ４と比較して、定量試験は、こ
れらの細胞が比較的低レベル、すなわち、実施例２Ｂに
おいて記載したようにＣＨＯ細胞よりも約１００倍低い
レベルのｓＴ４を産生ずることを示した。

ＤＸＢ−１１細胞、ＤＩＩＰ＋？欠損ＣＨＯ細胞株（ウ
ルラウブら（Ｕ　ｒｌａｕｂ、　ｅｔ　ａｌ、　））を
、６Ｑｍｍ皿、５ｘｌ　Ｏ’細胞で接種した１日後、１
０μｇの担体ＤＮ＾（ＮＩＴ−３Ｔ３ゲノミツクＤＮＡ
）ノ存在下、ｌＯ〜３０μｇのｐｓ７４ＤＩＩＰＲでリ
ン酸カルシウム沈澱法によりトランスフェクションに付
した。細胞を、３７℃にて６時ｎｎ、　ＯＮ＾沈澱１＋
１Ｊでインキユベー７ｇンし、培地を除去し、新たな培
地（Ｆ１２、ｌＯ％ＦＢＳ、１００単位／ｍ１ペニシリ
ンおよびストレプトマイシン）を皿に加えた。１６時間
後、該培地を再度交換し、Ｘ５ｆｍ胞をさらに２４時間
インキュベーションした。

ついで該ｊｌ［Ｉ胞をトリブシナイズし、３個の１００
ｍｍ皿中に接種し、ヌクレオシド不含培地（ヒボキサン
チンおよびチミジン不含のＦ−１２、ｌ　Ｏ％透析ＦＢ
ｓおよび１００単位／ｍｌペニシリンおよびストレプト
マイシン）にて選択した。コロニー（１皿当たり約１０
０個）が７〜ｌＯ日にて現れた。

６皿からのコロニーをプールし、増殖させ、ついで２４
個のウェル培養プレートにおけるウェル１個当たり５ｘ
ｌＯ３および５Ｘ１０’細胞、または１００ｍｍ皿に付
き５ｘｌＯ’細胞にて接種した。

該細胞は、８０ｎＭのメトトレキセート（ｉｉｔｘ）を
含有するヌクレオシド不含培地において、選択を開始す
る３日前に回収した。個々のウェルまたはクローンを、
ｓＴ４発現の融合を検定し、さらに増幅用に選択したも
のを前記富度での２４個のウェル培養プレート中に接種
した。ヌクレオシド不含培地における８００ｎＭのｍｔ
ｘでの選択を接種の３日後に開始した。この選択操作を
、８μＭおよび８０ＩＬＭのｍｔｘでの選択について繰
り返した。

最低限３　ｐｇ／細胞／２４時間で可溶性Ｔ４を発現す
るこの方法を用い、数個の細胞株を誘導した。

実施例３：ｓＴ４の精製 調整培地（ＣＭ）は、ｍｔｘ選択条件下、８５０ｃｗｗ
’のローラーボトル中で増殖させた血清不含付着細胞培
養から調製した。融合時、細胞を、Ｍ　ｇ　ｌ＋および
Ｃａ　”不含リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄
し、増殖培地（ヒボキサンチンおよびチミジン不含１１
ａｍ’＋　Ｆ１２、ｌＯ％胎児ウシ血清、１００単位／
ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンおよび選択的
濃度でのｌ１ｔｘ）を、血清およびＩＩＬＸを除き、１
ｘｌＴｓ（インスリン、トランスフェリンおよびセレニ
ウム（コルラボラティブ・リサーチ社））を加えた同一
培地に置き換えた。２４〜４８時間後、培地を除去し、
選択的増殖培地に置き換えた。ついで、３〜５日以内に
血清不含培地を再度用い、このサイクルを限定すること
なく、すなわち、２箇月間以上繰り返した。ＣＭは、８
０００ｘｇで遠心分離することで清澄させた。ブロオア
ーゼ抑ｊｔ、ｌＩ剤ＰＭｓＰ（フェニルメチルスルホニ
ルフルオリド）をＱ、５ｍＭまで加え、該ＣＭを圧膜濾
過により約１０倍に濃縮した。この濃縮ＣＭを２０００
ｘｇで遠心分離することにより清澄し、アプロチニン、
プロテアーゼ抑制剤（シグマ・ケミカル（Ｓ　ｉｇｍａ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、セント・ルイス、ミズーリ州）
を最終濃度５μｇ／ｍｌまで加えた。サンプルは直接ま
たは一７０℃での貯蔵後に処理した。

濃縮したＣＭサンプルを、ｐＨ６，０の５０ｍＭのＭＥ
Ｓ［２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸］で２
倍に希釈し、０．４５！クロンフイルターを通して応過
した。ついで、サンプルを１００μＭのｐＡＩ’ＭＳＦ
（ｐ−アミノフェニルメチルスルホニルフルオリド）（
カルビオケムーベーリング（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−Ｂ
　ｅｈｒｉｎｇ）、サン・ディエイ、カリフォルニア州
）で処理し、タンパク質濃度１．５〜２．０＋ｇ／ｎ＋
１ゲルでｐＨ６，０の５０ｍＭのＭＥＳで平衡させた５
−ｔｒファロース■（サルホープロピル）（ファーマシ
アＰ−Ｌバイオケミカル（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ　　
Ｐ−ＬＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ビンカタウエイ
（Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージ州）カラ
ム、に加えた。該サンプルを、５０ｍＭのＭＥＳ、　ｐ
Ｈ６、０におけるＯ〜０．５ＭのＮａＣｌ２のりニア−
グラジェントを用いて溶出した。約０．２ＭのＮａＣｌ
２にて溶出したピークフラクションをプールし、１００
μＭまでのｐＡＰＭｓＦで処理した。ｓＴ４を含有する
フラクションを、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫プロット
法により確記した。４°Ｃにて１時間放置した後、サン
プルをζ５ＱｍＭのビス−トリスプロパン［１，３−ビ
ス［トリス−（ヒドロ半ジメチル）メチルアミノコプロ
パン］　、ｐＨ６，０に対して透析した。

サンプルを１００μＭのｐＡＰＭｓＦで処理し、ついで
０．１％チオジグリコール、ｐＨ９，０を、５０ｍＭの
ビス−トリスプロ、バフ（ＤＴＰ）、ｐＨ９，０で平衡
したＱ−セファロース■（第４級アミノエチル）カラム
（ファーマシア）（５ＩＩＩ＋サンプル／ｍｌゲル）に
加えた。該ｓＴ４サンプルは、Ｑ−セファロースに結合
せず、非結合フラクションおよびカラム洗液において回
収した。非結合サンプルを直ちにｐＨ６，０に調整した
。

最終工程にて、５ＱｍＭのリン酸塩、０．１５ＭのＮａ
Ｃｌ２、ｐＨ７，０で平衡させた３０ミクロンのセフ１
０−ス■１２カラム（２，５ｘ４６　　）（ファーマシ
ア）上でクロマトグラフィーに付した。該カラムを３．
０ｍｌ／分の流速にて操作した。ｌｏｍｌの注入液を注
入し、４２分のピークをバッチ法により収集した。該方
法は、約３　ｐｇ／細胞７日を産生ずる細胞株において
総タンパク質２０．０ｍｇ当たり約１．０ｍｇの産物を
生成した。

実施例４：　旦Ｓの特性 Ａ、物理特性 総タンパクＴＪ　２６６度を、比色定ｍＢｃＡタンパク
質検定法（ビシンフニン酸、ピアース・ケミカル社（１
’１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、Ｏツクフ
ォード（Ｒｏｃｃｋｒｏｒｄ）、ｌ１ｌ）を用いて測定
した。絶対濃度を定ｍアミノ酸分析により測定した。精
製したｓＴ４の測定アミノ酸構成を、標準的アミノ酸分
析法を用いて行ない、実験誤差（＋／−１５％）以内で
推定配列に一致することが判明した。最初の２０残基ま
で、Ｉｙｓ−１ｙｓ−ｖａｌ−ｖａｌ−−−一で始まる
以外、配列は予想どおりであった。すなわち、成熟アミ
ン末端は、予測リーダークリップ部位については、＋３
位で開始し［マツトンら（Ｍａｄｄｏｎ、　ｅｔ　ａｔ
、　）、同前記文献、（１９８５）］　、ａｓｎないし
Ｉｙｓの変動により、その位置での予測配列と異なる。

成熟アミノ末端の位置は、マウスおよびヒツジのＣＤ４
タンパク質の測定末端とよく一致する。ａｓｎないしｌ
ｙｓの変動は、配列誤差（単一の塩基変動）または組換
え操作の間に起こる突然変異を示すものであると推測す
る。

Ｂ、イムノ−エピトープ：　モノクローナル抗体０ＫＴ
４および０ＫＴ４＾は、Ｔ４受容体の非干渉表面エピト
ープを認識する［ラオら（Ｒａｏ、ｅｔ　ａｌ、）、セ
ル・イムツル（Ｃｅｌ　ｌ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）
、８０：３１０（ｉ９８３）］。これらの抗体は、非変
性構造に対して特異的であり、それらは、免疫プロット
法における還元５ＤＳ−変性タンパク質に結合しない。

両方の抗体は、以下のイムノブレシピテーション操作を
用いて５ｓＳ−標識培養上清から特異的にｓＴ４を沈澱
させる。

６０ｍｍの培養皿当たりｌＸｌ０’細胞を含有する細胞
産生ｓＴ４培養を、メチオニンおよびシスティン不含で
ＩＴｓを含有するＦ１２培地１．５ｍｌおよび１７０μ
Ｃｉ／ｍｌ［”Ｓ　］メチオニンおよび３０μＣｉ／ｍ
ｌ［”Ｓ　］　システィン（Ｉ　ＣＮバイオメディカル
１社（Ｉ　ＣＮ　　Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、　Ｉ　
ｎｃ、　）、コスタメサ（Ｃｏｓｔａ　Ｍｅｓａ）、カ
リホルニア州）中、３７’Ｃ，１６時間標識化した。清
澄培地（１００μｍ）を、等ｍの沈降緩衝液（ｐＨ７，
５１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮ　ａ　
ＣＱ、０．１％ＮＰ−４０，０，５％非脂肪ドライミル
ク）で希釈し、４℃にて１５分間、ウサギのＩｇ０３μ
ｇと共にインキュベーションし、つづいて４℃にて３０
分間、タンパク質入セファロースビーズ（ファーマシア
、Ｐ−Ｌバイオメデカルズ）３０μｍ（充ｋＡ　容量　
）でインキュベージタンした。予め清澄した上清物を、
４℃にて３０分間、５　ａ　ｇｉ７）ＯＫＴ４．０ＫＴ
４Ａおよび０ＫＴ８（ビー・ラオ、オルト・）１−マシ
ューティカル・コーポレーション（Ｐ、　Ｒａｏ、　Ｏ
ｒｔｈａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｃｏｒｐ、
）、ラリタン（Ｒａｒｉｔａｎ）、ニュージャージ州）
、マウスのｆｇＧ（クーパ・バイオメディカル（Ｃｏｏ
ｐｅｒ　Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、マルバーン（Ｍａ
ｌｖｅｒｎ）、ペンシルペニア州）またはウサギのαマ
ウスＩｇＧ（クーパ・バイオメディカル）と共にインキ
ュベーションした。（ｌＫＴ４．０ＫＴ４＾、０ＫＴ８
、マウスＩｇＧおよびウサギα−マウスＩｇＧは、タン
パク質入セファロースビーズ２０μｌ（充填容ｆｆ１）
で４００にて３０分間インキニベーションすることによ
り沈澱した。沈澱後、該ビーズを沈澱緩衝液２００μｍ
で２回、ＮＰ−ｊＯ（ｇ）および非脂肪ドライミルク不
含沈澱緩衝液２００μｌで１回洗浄した。

該洗浄ビーズを、サンプル緩衝液（ｐＨ６，８１２５ｍ
Ｍのトリス−ＨＣＱ、２０％グリセロール、１゜４Ｍの
β−メルカプトエタノール）２０μｌ中で５分間沸騰さ
せ、上清物を１２．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル上の電気泳動により分析した。

０ＫＴ４Ｂ、　０ＸＴ４Ｃ，０ＫＴ４Ｄ、　０ＫＴ４Ｅ
、　０ＫＴ４Ｆおよび他のＴ４に対して特異的なＭａｂ
ｓで同様な結果が得られた。

これらの結果は、ｓＴ４の構造が、Ｔ４受容体の表面ド
メインを正確にまねていることを示す。

Ｃ０生化学および生物学特性 １、　ｇｐ１２０の認識−５Ｔ４のｇＰ１２０に対する
結合は、本質的にｇｐ１２０と完全長のＴ４受容体の間
の相互作用の測定についての記載に従って検定した［マ
ツクドウガルら（ＭｃＤｏｕｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、）、
前記と同文献、（１９８６）］。この検定において、３
ＳＳ−メチオニンおよび′５３−システィンで標識化し
た感染細胞からの細胞外１１１Ｖの溶解産物（ＬＡＹ　
ｌ系）を、Ｔ４タンパク質と共にインキュベーションす
る。Ｔ４−ｇ＋）１２０複合体を、ａｐ１２０ないし丁
４の結合を妨げない０ＫＴ４抗体と共にイム／ブレシビ
テーシタンに付す。はじめの検定において、ｓＴ４を産
生ずる細胞からのＣＭを、対照ＤＸＢ−１１細胞から同
様に調製し、たＣＭと比較した。ｓＴ４産生細胞からの
ＣＭでインキュベーションシた場合、ＩＩＩＶ　ｇｐ１
２０が／ｌ：Ｎ２したが、０ＸＢ−１１からのＣＭでは
沈澱しなかった。その後の検定において、精製したｓＴ
４は特異的にｇｐ！２０を共沈間した。

２、ＩＩＩＶ結合の競合−ｇｐ１２０のｓＴ４に対する
結合は、ｓＴ４がエイズウィルスの感受性細胞に対する
結合を抑制することを示した。前記０．１において記載
したように、ｓＴ４を有するまたは不含のＣＭを、初期
検定において用いた。ＩＩＩＶを該ＣＭでインキュベー
ションし、　７４　ＯＥＭ細胞株に結合するウィルスを
、マツクドウガルら、前掲（＋９８５）による記載のよ
うに、ＦＩＴＣ？Ｕ合、抗−ＩＩＩＶ抗体およびＰＡＣ
３（フルオレセイン活性化細胞ソーター）でのインキュ
ベーションにより定量した。競合させた非産生細胞（Ｄ
ＸＢ−１１）からのＣＭでは応答が認められなかったの
に対して、ｓＴ４を産生ずる細胞株からのＣＭは、希釈
依存方法におけるＩＩＩＶ結合を抑制した。後期検定に
おいて、８．２μｓ／ｍｌの精１ｓＴ４でのブレインキ
ュベーションは完全にウィルス結合を遮断した。

３、旧Ｖ感染の競合−旧Ｙ感染の抑制は、マツクドウガ
ルら、前掲（１０８５）により記載されている方法によ
り検定した。はじめの検定において、旧Ｖ感染性タイト
レージョンを、約０．１．５ｐｇ／細胞７日にてｓＴ４
を発現する細胞からの濃縮ＣＭの存在下にて実施した。

連続希釈のウィルスを、６倍に濃縮したＣＭにてインキ
ユベーションし、ついでファイトヘムアグルチニン刺激
正常リンパ球に加えた。

−夜インキユベーシッンした後、該細胞を洗浄し、つい
で２ＸＣＭを有する培地中に保持した。ウィルスの存在
を、抗原捕捉検定により、４．８および１２日に検定し
た。ｓＴ４産生細胞からのＣＭは、対照ＣＭまたは無添
加と比較して、ウィルス感染性を９０％抑制した。８．
６μｇ／ｍｌの１μ度の精！２ｓＴ４を用いた場合、ウ
ィルスの１０４感染川ｍでの感染の８日後に感染の４４
−１ｏ抑制が観察された。

【図面の簡単な説明】

第１図は可溶性下４のヌクレオチド配列および推定アミ
ノ酸配列である。 特許出願人　スミスクライン・ベックマン・コーホレイ
シラン 代理　人弁理士青山　葆　はか１名

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ）調整培地をカチオン交換担体と接触させる
   ことにより、ｓＴ４を該担体に吸着させ、 （ｉｉ）ｓＴ４を該担体から溶出し、 （ｉｉｉ）該溶出液をアニオン交換担体と接触させ、 （ｉｖ）該アニオン交換担体からの流出液中のｓＴ４を
   収集することを特徴とするｓＴ４を産生する細胞培養か
   らの清澄調整培地からｓＴ４を精製する方法。
2. （２）カチオン交換担体がカルボキシメチルまたはスル
   ホプロピル担体であり、ｓＴ４を増加塩グラディエント
   で溶出し、アニオン交換担体がＤＥＡＥまたはＱＡＥで
   ある前記第（１）項の方法。
3. （３）さらにアニオン交換担体からの流出液を、サイズ
   排除ゲルに通すことからなる前記第（１）項の方法。
4. （４）サイズ排除ゲルが、粒径５０μｍ以下を有し、分
   子量１０００〜３０００００の分離範囲を有する架橋ア
   ガロースである前記第（４）項の方法。
5. （５）（ｉ）ｓＴ４を発現する哺乳動物細胞を培養し、 （ｉｉ）遠心分離および濾過により調整培地を清澄にし
   、 （ｉｉｉ）該清澄培地をスルホプロピル−セファロース
   カラムと接触させ、 （ｉｖ）０〜０．５ＭのＮａＣｌグラディエントで該カ
   ラムからｓＴ４を溶出し、 （ｖ）溶出液を透析して、塩を除去し、 （ｖｉ）透析溶出液をＱＡＥ−セファロースカラムと接
   触させ、 （ｖｉｉ）流出液をセファロース１２カラムに通し、 （ｖｉｉｉ）精製ｓＴ４を収集することを特徴とするｓ
   Ｔ４を産生する方法。