PT98394B

PT98394B - Processo para a preparacao de formas multimericas da proteina receptora de rinovirus humano

Info

Publication number: PT98394B
Application number: PT98394A
Authority: PT
Inventors: Jeffrey M Greve; Alan Mcclelland
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1990-07-20
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 1999-01-29
Also published as: FI913470A0; AU652567B2; EP0468257A1; EP0987329A2; ZA915678B; ES2134762T3; KR100208847B1; DK0468257T3; EP0987329A3; ATE184049T1; DE69131564T2; JP3091527B2; IE912552A1; KR930002511A; FI913470A; FI105687B; PT98394A; DE69131564D1; AU8117691A; IL98866A0

Description

referido processo de preparação consiste, essencialmente, em se proceder à multimerização de referida ICAM quer por adsorção a um suporte que por acoplagem de um membro.

FUNDAMENTO DO INVENTO

O presente invento está relacionado com novas configurações multiméricas e formas da molécula de adesão intercelular (ICAM), incluindo formas de tamanho completo e truncadas destas proteínas, que se ligam eficazmente a rinovírus humano e podem eficazmente reduzir a infecciosidade de HRV,

ICAM de tamanho completo, também conhecido como receptor de rínovirus humane» CHRR), é designado ICAM transmembranar CtmICAM-í)? formas ICAM não transmembranares, também conhecidas como ICAM truncado CtICAM), têm menos do que o tamanho completo. Quando numa configuração muitimérica, de preferência como dímeros, estas proteínas apresentam maior ligação dos rinovírus humanos CHRV) e são capazes a infecciosidade de HRV» Em adição, estas proteínas muitimerízad-as podem também ser usadas para reduzir a infecciosidade de outras vírus que se sabe ligarem—se ao principal grupo de receptores de rinovírus humano CHRR), como seja o vírus da poliomielite, e podem também ser usados para bloquear a interaeção com a molécula de adesão intracelular transmembranar CtmICAM) com o antigénio-í associado à função de linfócitos CLFA—í) crítico para muitos processos de adesão celular envolvidos na resposta imunológica» Finalmente estas proteínas muitimerizadas podem ser usadas para estudar a interseção ICAM-l/HVR especialmente no que respeita á programação ds outras drogas dirigidas no sentido de afectar esta ligação,

Os rinovírus humanos são o principal agente causador da constipação vulgar, Eles pertencem podem ser classifiçados com base no à família dos picornavírus e receptor da célula hospedeira a que se ligam» Tomassiní, et ai.« 3« Virol», 58 s 29© Cl986) descreveram o isolamento ds uma proteína receptora envolvida na ligação derinovírus humano às células» Aproximadamente 9©X dos

1=^.-

nado receptor principal de rinovírus humano (HRR); os restantes Í0% ligam-se a um ou mais ds outros receptores celulares»

Recentemente» Greve.

et

Cell, Sós 839 ¢1989) co-autores com os co-invsntores deste invento, identifiçaram o principal HRR como uma glicoproteína com um peso molecular aparente de 9500© daltons e tendo uma sequência ds aminoácidos essencialmente idêntica à deduzida a partir da sequência de nucleótidos ds uma proteína da superfície celular anteriormente descrita designada molécul oiinmons, D» et a 1», de adesão interceiular (ICAM—1)»

Cell, 52s925—933 ÍÍ988). Subsequentemente, Staunton, D.E», et al», Cell, 5όϊ849 (1989), confirmaram qus ICAM-1 é o principal receptor da superfície celular para HRV» Ver também, Staunton, et al», Cel1, 61s243-254 (í99©)»

ICAM-1 ê uma proteína de membrana integral com 505 aminoácidos e tems i) cinco domínios extracelulares do tipo imunoglobulina no extremo amina (resíduos de aminoácidos 1-453), ii) um domínio transmembranar hidrofóbico (454-477) e iii) um domínio citoplasmático curto no extremo carbonilo (478-505). ICAM-1 è um membro da família de supergenes da imunoglobulina e funciona como um ligando para a molécula de leucóctosdesignada molécula associada à função ds leucócitos-í (LFA—1)« um membro da família das integrinas» A ligação heterotípica de LFA-l a ICAM-1 medeia a adesão celular de diversos tipos ds células e é importante numa larga gama de interacçSes imunes; s indução da expressão ds ICAM-1 por citocinas durante a resposta inflamatória pode regular a mobilização ds leucócitos para os sítios de inflamação» Encontrou-se que a estrutura primária de ICAM—1 é homóloga de duas moléculas de adesão celular, i.e», molécula de adesão às molécula

C MAS)

Foram seguidas várias abordagens para diminuir a infecciosidade de virus em geral a ds rinovírus em particular, incluindo? i) desenvolvimento de anticorpos contra o receptor da superfície celular para usar no faloqussmento da ligação do vírus para promover um estado iii) desenvolvimento de

è. célula, ii) utilização de interferão anti-viral nas células hospedeiras? vários agentes para inibir a replicação virai? iv) desenvolvimento de anticorpos contra proteínas/peptídeos da cápside virai? e v) bloqueio da infecção virai com proteína do receptor da superfície celular isolada, que especificamente bloqueia o domínio de ligação virai ao receptor da superfície celular.

Usando esta última abordagem» Greve, et a(

Cell,

568879 (1989), supra, descreveu que tmICAM-í purificada poderá ligar-se a rinovírus HRV3 in vitro. Resultados não publicados com HRV2, HRV3 e HRV14 demonstram uma correlação positiva entre a capacidade ds ligação a rinovírus s a capacidade ds neutralizar rinovírus particularmente se os estudos de ligação forem realizados nas condições em que ICAM-í é apresentado numa forma e configuração particulares como discutido infra. Resultados (não publicados) usando HRV14 e HRV2 demonstram uma correlação positiva entre a classe de receptores dos vírus e a capacidade de ligação a fcmICAM-1 in vitro. Ou seja, ICAM-1 sendo o principal receptor pode ligar—se a HRV3, HRV4 e outros serotipos do recep— tor principal e neutralizá-los, ao mesmo tempo não se ligando ou neutralizando HRV2, um serotipo de receptor menor. Outros estudos (não publicados), usando tmICAM—1, demonstram que ele inibe eficazmente a infecciosidade de rinovírus num ensaio de redução de placas quando o rinovírus é pré-tratado com tmICAM-í C5©% de redução do título com rceptor 10 nM e redução de um loq

consistentes com a afinidade de rinovírus para ICAM-i de células HeLa, a qual tem uma constante de dissociação aparente de 10 nM e indicaram uma relação directa entre a capacidade do receptor para se ligar ao vírus s para neutralizar o vírus»

Devido à produção em larga escala ds tmlCAM-1 não ser presentemente viável economicamente e devido à manutenção de tmlCAM numa forma activa requerer a utilização de detergentes, são desejáveis meios alternativos de produção de uma proteína receptor para usar como um inibidor de rinovírus» Ferram desenvolvidas formas do gene de cDNA de tmlCAM-1 (assim como linhas celulares que produzem os produtos de expressão;. U.S.S.N» 390,662) que foram geneticamente alteradas para produzir moléculas truncadas de ICAM-Í» Estas formas (11CAM ( 453) e 11CAN(185)) não são secretaoas para meio de rinovírus no ensaio descrito em Greve, et al truncadas de ICAM-Í sossuem a região transmembranar e :ultura celular

Elas ligam-se

Cel 1

56s879 (1989), supra, se bem que em níveis substancialmente reduzidos relativamente a tm ICAM-1„ Assim.

a sua eticacia :omo inibidores da infecciosidade ds rinovírus parece ser inferior à de tmICAM-1,

Ver pedidos de patente copendentes, ,S»N, 130,378!

U.

,S.N.

U.S.S.N» 262,428? U»S„S»iM» 239,571; e U=U„S»M» 390,662

U.S.S.hl. 239,571 entregue em 1 de Setembro de 198S e seus pedidos de Patente CIP U.S.S.N. 26-2,428 e b,S»S»M» 360,662 são dirigidos à utilização de receptor de rinovírus transmembranar coavo um inibidor da infecciosidade de rinovírus usando detergente não iónica para manter a proteína transmembranar em solução e às moléculas de adesão intercelular truncadas (tICAM) tendo os domínios extracelulares 1, 2 e 3 das moléculas de adesão intercelular transmembranar (tmlCAM) e cujas formas truncadas não requerem a presença de detergente não iónico para solubilizaçãoi

U»S»3,N» 130,378 entregue em 8 de DeseilÍbro, 1987 e o seu Pedido de Patente CIP U»S»S„N 262,57© são dirigidos a linhas celulares transfectadas que expressam o principal receptor de rinovírus CHRR) e à identificação de HRR como molécula de adesão intercelular? e por slCAM não possuir os aminoácidoí que

Janeiro, 1989 e o
>ão dirigidos	a uma
distinta de	tmICAM
abrangem a	região
iSriXÇiSO BStâ [tremo C#	slCAM
Π», Nature,	344ϊ7©

Subsequentemente, Marlin, S»D„, e (199©), descreveu a construção e a. purificação de uma forma truncada solúvel da molécula ICfiM-l normalmenteligada à membrana que eles designaram sICAM-l. Ela tem o domínio transmembranar e o domínio citoplasmático da proteína eliminados e difere da sequência de aminoácidos tipo selvagem por uma substituição conservada no seu extremo carbonilo» Ela é composta pelos resíduos í-452 ds ICAM—1 e de um novo resíduo fenilalanina no extremo C« Estes investigadores demonstraram que slCASi-l era necessária em níveis >5© ggZml piara evitar a ligação ds HRV14 ãs células» No entanto, eles também encontraram que sICAM-1 a Ipg/ml <18 nM> quando presente continuamente no meio de cultura, também foi capaz de inibir em 50% a progressão ds uma infecção por HRV54» A actividade inibidora estava correlacionada com a classe de receptor do vírus, uma vez que o vírus coxackie mas não o poliovírus ou HRV2 foi inibido? os dados de infecciosidade para HRV14 não são no entanto descritos» Assim, eles não demonstram uma correlação directa entre a ligação e a inibição da infecciosidade» Ainda, conforme descrito mais detalhadamente infra, tentativas para reproduzir os resultadas obtidos por Marlin» et al«» não foram coroadas de êxito e sugeriram mais alta da forma truncada de transmembranar5 para produzir u que é necessário ΧξΠξΡλ Içhncen tração ICAM t10 vezes mais do que de ICAM ma redução ds 5(5% no título virai»

Até agora se ligue e reduza humano (através do isolada do receptor tmIC AM-íj assim, co ninguém foi capaz de demonstrar um agente que eficazmente a Ínfecciosidade do rinovírus bloqueamsnto da infecção virai com proteína da superfície celular) tão eficazmente como rtinua a existir a necessidade de uma forma de

ICAM-1 que possa ligar-se eficazments a rinovírus humano e possa eficazmente reduzir a ínfecciosidade de HRV,.

BREVE SUMÁRIO DO INVENTO

São proporcionadas pelo invento configuraçSes mui timericas de ICAM não transmembranar ítICAM). ICAM não transmembranar é também conhecido como ICAM truncado» i.e», ICAM substancialmente sem o domínio intracelular carbonilo e sem o domínio hidrofóbico de membrana e inclui mas não está limitado às formas ds tICAMÍ453) e tICAMíiSS). As formas não transmembranares de ICAM podem incluir derivados funcionais de ICAM e formas muteína de tICAM para facilitar a acoplagem» Quando as formas truncadas de ICAM estão numa, configuração multimérica, de preferência como dímeros, elas apresentam maior ligação a rinovírus humano e são capazes de reduzir a ínfecciosidade virai» As diferentes formas de ICAM, transmembranar ε não transmembranar, podem ser multimerizadas por adsorção a um suporte» este suporte pode ser feito ds materiais tais como nitrocelulose, PVDF, DEAE, polímeros de lípidos, assim como amino-dextrano ou uma variedade de polímeros inertes que podem ser adsorvidos ou podem ser acoplados a tICAM, sem ou com um sspaçador ou ligante»

ICAM multimêrica pode acoplagem de ICAM por exemplo a uro ou um reagente de ligação cruzad inclui anticorpo anti-ICAM, CL 2®3 incluem albumina e proteoglicanõs;

a. Um exemplo de um anticorpo ? veículos proteicos adequados e reagentes de ligação cruzada adequados incluem reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais e homobifuncionais tais como ésteres bifuncionais de N-hidroxi-succinimida, imidoèsteres ou bis-maleimido-hexanos. Para facilitar a acoplagem, a ICAM pode ser modificada no extremo carbonilo ou no extremo amina com um resíduo de aminoácido como a lisina, císteina ou outros resíduos de aminoácidos que proporcionem um ou mais sítios que facilitem o acoplamento, estes tipos de ICAM modificados são referidos como muteínas» Em adição, a ICAM pode ser modificada em ambos os extremos para compreender um lípido capaz de promover a formação de micelas de oligómeros» A ICAM compreendendo a ICAM multimêrica pode ser totalmente glicosiiada, parcialmente glicosiiada ou não glicosiiada» invento também proporciona métodos para o aumento ds ligação de ICAM e seus derivados funcionais a um ligando, i.e», rinovírus humano e vírus do principia grupo de receptores, antigénio-1 associado à função de linfócitos (LFA-1), Plasmodium falciparum (malária) e similares, em que a ICAM seja apresentada numa forma e numa configuração ao ligando e em que a ligação da ICAM ao ligando é aumentada» A forma de ICAM pode ser transmem— branar ou não transmembranar (truncada)» A ICAM truncada é ICAM substancialmente sem o domínio carbonilo intracelular e sem o domínio hidrófobo de membrana» As formas truncadas de ICAM incluem t1CAM(453) e t1CAM(185)» A ICAM pode ser modificada extremo carbonilo ou no extremo amina para aumentar a formação de ICAM multimêrica» Estas modificações podem incluir a adição tíe resíduas de aminoácidos reactivos tais como lisina, císteina ou outros resíduos de aminoácidos que proporcionem um sítio para no

-9· facilitar a acoplagem. A sequência da nucleátido's^:'.^lp’ar‘à a ICAM do método pode vector pode estar contida num vector, como seja um plasmídeo e o ser introduzido numa célula hospedeira, por exemplo células eucarióticas ou preferida é uma célula de hamster chinês? a célula pr procarióticas» A célula eucariótica mamífero, i»e=, células de ovário de ocariótica preferida é E« coli»

A configuração preferida da ICAM do método é multimérica, sendo dimérica a mais preferida» A configuração multimérica pode compreender uma primeira ICAM ligada de forma cruzada ou pode compreender ICAM adsorvida a um suporte para assim gerar uma configuração multimérica» 0 suporte pode ser de alto peso molecular e polímeros substaneialmente inertes tais como nitrocelulose, PVDF, DEAE, polímeros de lípidos e amino-dextrano, ou uma variedade de polímeros que podem adsorver e podem ser acoplados & ICAM, com ou sem um espaçador ou ligante. A ICAM multimérica pode ser muitimerizada por acoplamento por exemplo a um anticorpo, um veiculo proteico ou um reagente de ligação cruzada» Reagentes de ligação cruzada preferidos incluem reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais ou homobifuncionais tais como ésteres bifun-

cionais de N-hidroxi-succinimída, imidoésteres, um bis-maleimido-hexanos? veículos proteicos preferidos incluem albumina e protsoglicanos? um exemplo de um anticorpo preferido inclui CL2©3 e quaisquer outros anticorpos que não interfiram com a ligação de HRV.

Também são proporcionados pelo invento novas composiçSes farmacêuticas compreendendo um solvente, diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável, e como ingrediente activo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo caracterizado por ter actividade de ligação a rinovírus e redução da infectividade virai»

serão

Outros aspectos e vantagens do presenxé'. mvento aparentes tendo em consideração a descrição detalhada que se segue que inclui numerosos exemplos ilustrativos do modo de realização do invento.

DESCRIçao DETALHADA

Conforme observado supra, tmlCAM-í isolada a partir de células ds mamífero tem a capacidade neutralizar rinovírus humano pertencente ao grupo principal de receptores, mas apenas se mantido em solução com detergente. Certos fragmentos solúveius de ICAM-Í possuem a capacidade de ligação a infecciosidade tão eficazmente quanto ninguém foi capaz de descobrir qual a razão desta capacidade reduzida.

vírus e não reduzem a tmICAM 1» Até à data

Foi proposto por outros investigadores que o receptor do rinovírus existe nas células numa forma pentamérica» Tomassini, 3„, e Colonno, R„, J» Virol». 58s29®~295 (1986). No entanto, a quantificação (resultados não publicados dos co-inventores) do rinovírus e do anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 que se liga a

células Hela revelou um máximo de 30000 viriSes célula (determinado pela ligação ds HRV marcado com na) e 500®®-6®®®® moléculas de ICAM-1 por célula ligados por S—me t i on i— (determinado pela ligação do Mab marcado radioactivamente a ICAM-1). Estes resultados sugeriram outros estudos para examinar a possibilidade de em vez ds cinco apenas entre í e 2 moléculas de ICAM-1 na superfície de células estarem ligadas por partícula de HRV ligada à célula»

Formas manipuladas por engenharia genética de ICAM-Í truncado que não possuem o domínio transmembranar C-terminal são secretadas para o meio de cultura de células de mamífero

transfectadas com ο gene recombinante. A purifUéàção de duas destas moléculas XCAIj secretadas tICAMC453) e tlCAMCÍ85), derivadas do meio de cultura de células estavelmente transfectadas com os genes está descrito abaixo. Num ensaio de ligação a HRV em solução e num ensaio de neutralização de HRV encontrou-se que tICAMC453) tem avidez substanciaimente reduzida (aproximadamente duzentas vezes) para HRV relativamente a tmlCAfj-l» No entanto, quando tmICAN-í ou tICAN(453) ou tICAM(185)é primeiro adsorvido a qualquer um de uma série de suportes insolúveis, tais como membranas de nitrocelulose, PVDF (difluoreto de polivinilideno) ou DEAE (dietilaminoetilo) e depois incubado com HRV radioactivo, a actividade de ligação a virus de tICAM(453) torna-se comparável à de tmICAN-1. Esta ligação de tlCAM multimérica(453) ou de tlCAMÍ185) multimérica a HRV tem as mesmas propriedades da ligação de HRV a ICAM--Í nas células Helas é inibida por Mabs anti-ICAN-1, é específico para rinovírus do principal grupo receptor e tem a mesma dependência da temperatura da ligação de rinovírus a células (Le,, liga-se bem a 37°C e não há ligação de tec táve 1 a 4’^:'C) .

Conforme aqui ê usado são incluídas as seguintes abreviaturas e termos que não são necessariamente limitadas pelas definições que se seguem.

-12Abreviatura

ICAM

ICAM-1 tmICAM-1

5ICAM-1 tICAM tICAM(453) tICftMílSS)

Definição '

Molécula de adesão intercelular - pode ser usado para incluir formas de tamanha completo (transmembranares) e truncadas (não transmembranares) da proteína.

Molécula de adesão intercelular-1, também conhecida como ICAM, tmICAM-l? significando a proteína transmembranar de tamanho completo.

Molécula de adesão intercelular transmembranar, também conhecida como receptor de rinovírus humano (HRR)-requere e.g,, condiçSes que envolvem detergentes para ser solubi1i saca,

Uma ICAM-1 solúvel natural tendo eliminados o domínio transmembranar e o domínio citoplasmático de ICAM—1? aminoácidos 1-442 mais 11 aminoácidos novos? diferente da de Stauton et al. ÍICAM453 que consiste nos aminoácidos 1-453 com a tirosina terminal substituída com fenilalanina.

Molécula de adesão intracelular truncada, também conhecida como ICAM não transmembranar.

Forma truncada tíe ICAM - domínio terminal amina extracelular de ICAM? tendo eliminados o domínio transmembranar e o domínio citoplasmático de ICAM-1? também referido como sICAM-1 por Marlin, st al..

Forma truncada ds ICAM - domínio terminal amina extracelular de ICAM tendo o eliminados o domínio transmembranar e o domínio citoplasmático de ICAM-1.

Muitimerização e muitiméricos incluem mas não estão limitados à dimerização e dimérico e incluem qualquer

Μ

configuração multimérica da molécula lL'AM-1 ousètr, fragmento, que ê eficaz na redução da ligação virai e infecciosidade;

transflisinbrsnar geralmente significa formas da molécula proteica ICAfi-i que possuem uma sequência hodrofóbica que atravessa a membrana e que estão ligadas à membrana?

não transmembranar” geralmente significa formas solúveis da proteína ICAM-1 incluindo as chamadas formas “truncadas da proteína que, em vez de estarem ligadas à membrana são secretadas para o meio de cultura celular como proteínas solúveis, assim como formas transmembranares” que foram solubilizadas a partir das membranas celulares por lise das células em detergente não iónico;

truncado geralmente inclui qualquer forma de proteína que seja menor do que o tamanho completo da forma transmembranar de tamanho completo de ICAM;

forma é geralmente usado aqui para distinguir entre formas ICAM de tamanho completo e parciais? enquanto que configuração é geralmente usado para distinguir entre configurações monomêricas, diméricas & mui timéricas das possíveis formas de } ICAM;

todas as formas e configurações da molécula de ICAM-1, de tamanho completo ou um seu fragmento, incluindo muteínas, monomêricas ou diméricas, podem total ou parcialmente glicosila^z das ou totalmente não glicosiladas, desde que a molécula permaneça eficaz na redução da ligação e infecciosidadss virais;

ligando é geralmente usado aqui para incluir qualquer coisa capaz de fazer a ligação a pelo menos uma das formas e configurações de ICAM e incluem mas não estão limitados a rinovírus humanos, outros vírus que se liguem ao receptor do principal grupo de rinovírus humanos, antigénio-1 associado à função de linfócitos e Flasmodium falciparum (malária)? e “rinovírus humanos” -geralmente incluí todos os serotipos humanos de rínvírus humanos conforme catalogado em Hamparian, V», et al., Virol., 159:191-192 (1987).

Os exemplos que se seguem ilustram a realização do invento»

Exemplo í está relacionado com o crescimento, purificação e ensaia de rinovírus?

o Exemplo 2 está relacionado com a produção e isolamento dos anticorpos monoclonais contra ICAM-1?

o Exemplo 3 está relacionado com a construção de formas truncadas transmembranares de cDNA de ICAM a partir de cDNA de ICAM de tamanho completo?

o Exemplo 4 estâ relacionada com a transfecção de células ds mamífero e expressão de formas truncadas não transmembranares de cDNA de ICAM?

o Exemplo 5 estâ relacionado com o isolamento e purificação ds formas truncadas não transmembranares de ICAM-1?

o Exemplo ó está relacionado com a marcação radioactiva de tmlGAM-l, tlCAMClSS) ε tICAM(453) e demonstração da retenção da capacidade de ligação aos anticorpos monoclonais?

I

e c r an smem o r anar es rinovírus humano de formas truncadas de XCAM--Í 5 transmemoranare® o Exemplo 8 está relacionado com a ligação cruzada tICAMí453J mediada pelo anticorpo IgG CL203;

o Exemplo 9 está relacionado com a muitimerização formas transmembranares e não transmembranares truncadas ICAIM-15

Uss ae o Exemplo í© está relacionado com o ensaio de neutralização da infecciosidade de formas transmembranares muitimêricas e formas truncadas não transmembranares muitimêricas de ICAM-is e o Exemplo

5tá relacionado com a formas muitimêricas de formas transmembranares e truncadas

Utó de

ECAM:omo inibidores eficazes da interseção ICAM/FLA-í,

EXEMPLO 1

CRESCIMENTO, PURIFICAÇÃO E ENSAIO DE RINOVfRUS

Os rinovírus foram crescidos, purificados ε ensaiados eesencialmente como descrito em Abraham, G = et al«, 3« Virol,, 51s340 (1984) e Greve, et al,, Çel1, 56:839 (1989)= Os serotipos escolhidos para estes- estudos incluem HRV14, o padrão no campo e HRV3 que tem aproximadamente 10 vezes mais afinidade para ICAM do que HRV14. HRV2 que se liga ao receptor “minor em vez de ao receptor major”, foi usado como testemunha negativa.

Os rinovírus HRV'

HRV3 e HRV14 foram adquiridos à

American Type Culture Collection, purificados por placa e isolados a partir de lisados de células HeLa~S3 infectadas, Os rinovírus purificados foram preparados por precipitação com polietilenoglicol e sedimentação em gradientes de sacarose» A pureza, da preparação virai foi testada por análise de SDS-PAGE das proteínas da câpside e por microscopia electrónica, A foi quantificada por ensaio de diluição limite da avaliando o efeito citopátieo como descrito por

Growth assay and purification of picornaviruses, Em Vitologys A Praticai Approach, B»W«3,, ed i n f ec c i os i d ad e infecciasidade Minor, P.D.,

C Oxf ord s 1RL Press)

H4Í

EXEMPLO 2

PRODUÇÃO E ISOLAMENTO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA ICAM-1

Murganhos fêmea BALB/cByJ foram imunizados por injecção intrapéritonéal de 1©' células HeLa intactas em 0,5 ml de tampão de fosfatos salino (PBS) três vezes com intervalos de 3 semanas, Duas semanas mais tarde os murganhos foram sangrados e amostras de soro foram testadas relativamente a efeitos protectores contra

a infecção de células HeLa por HRV14. Os múrglànhos positivos 7 receberam uma injecção de? reforço final de 10' células HeLa 3 dias mais tarde as células do baço foram fundidas com células de mieloma P3X63~AgS.633 CGalfre, et al „ , Nature, 266s550-532 (19773) para produzir um total de aproximadamente 70© cavidades contendo hibridomas. Cada uma das cavidades foi testada por 4 zncubação de 3 x í© células HeLa em placas de 96 cavidades com 10© gl ds sobrenadante durante 1 hora a 37°Cj as células foram então lavadas com PBS e adicionada uma quantidade suficiente de HRV14 para dar efeito citopático completo em 24-36 horas» As cavidades positivas (protegidas da infecção) foram contadas às 36 horas.

As células primeiro rastreio e microtitulação de 96 foram testados no ensaio positivas foram novamente realizadas até todas as foram removidas das cavidades positivas no danadas por diluição limite sm placas de cavidades. Os sobrenadantes destas cavidades positivas indicando a obtenção de uma linhas celulares clonsdas, e respectivos e designados c78,íA, c78.2A, c78.4A, c respec ci vamente.

de protecção celular e as cavidades identificadas» Outras clonagens foram cavidades contendo hibridomas serem população c1ona1. anticorpos foram

78.5A, c92.ÍA e

Quatro obtidos

C92.5A,

C92.ÍA foi depositado sm 19 de Novembro, 1987 na American Type Culture Collection, 123©í Park Iam Drive, Rockville, Maryland 20852 e foi designado HB

9594

EXEMPLO 3

CONSTRUçaO DE FORMAS NSQ TRANSMEMBRANARES TRUNCADAS DE cDNA DE

ICAM A PARTIR DE cDNA DE ICAM-1 DE TAMANHO COMPLETO

Preparação -da cDNA de ICAM-1 cDNA iniciado ao acaso foi sintetizado a partir de RNA poliA+ derivado de células HEI usando um kit de síntese de cDNA TM

Amersham nas condições recomendadas pelo fornecedor» A amplifito cação por PCR foi realizada usando 1©0 nq de cDNA durante ciclos usando iniciadores PCR 5.Is ΐggaattcATGGCTCCCAGCAGCCCCCGGCCC) e

PCR 3.1s í gaattcTCXAGGGAGGCGTGGCTTGTBTGTT).

Os ciclos de amplificação consistiram em 94 *C 1 min, 55°C 2 min e 72°C 4 min» 0 produto da reacção PCR foi digerido com EcoRl e clonado no vector fago lambda GTÍÔ digerido com EcoRl (StrataqeTM ne ' ). Os clones de fagos recombinantes foram despistados por hibridação de placas usando oligonucleótidos específicos de ICAM-1:

BAGSTBTTCTCAAACAGCTCCAGCCCTTSGGGCCSCAGSTCCAGTTC CICAM1) e

CGCTGGCAGBACAAAGGTCTSGASCTGGTAGSG6GCCGA66TBTTCT (ICAM3).

Um clone positivo designado lambdaHRR4 foi seleccionado e purificado» A inserção foi removida por digestão com EcoRl e subclonatía no sítio EcoRl de Bluescript KS-Κ Este clone foi designado pHRR2« Toda a inserção foi sequenciada e encontrou-se ter toda a sequência codificadora de ICAM—1 começando com o codão iniciador ATS e terminando com o codão de paragem TGA conforme especificado pela sequência ICAM—1 obtida, por PCR (Simmons, et àls.? jfature, 33ÍSÓ24 (1988); Stauton, et al». Cell» 52s925-933 (1988)) por uma única substituição de A 1462 por G» Esta mesma.

i - Λ

19alteração foi identificada em vários clones 'independentes e portanto representa um polimorfismo do gene ICAM-1»

B. CQNSTRUç%Q DE tICAM-1(455) £ tICAM(185)

Criaram-se formas modificadas de de amplificação por PCR (SaiRi 1354 (1985)) usando como molde o cl cDNA de ICAM—1 pur s ot al», Science, one de cDNA de ICAM-1 reacções 230;1350de tamanho completo pHRR-2. 0 DNA de plasmídeo foi digerido com EcoRI para retirar a inserção ICAM-1 e tratado com fosfatase alcalina para evitar a recircularização do vector nos passos de ligação subsequentes» Dez ng de DMA molde foram sujeitos a í© ciclos de amplificação por PCR usando oligonucleótidos iniciadores PCR5»5 e PCR3»3 para nas seguintes condições;

tICAM-453 e PCR5,

IO para tICAM-185

Temperatura (*C)

Tempo (mins)

1,5 (extensão final)

PCR5.5 tem a sequência;

BSAATTCAAGCTTCTCASCCTCSCTATGGCTCCCAeCASCCCCCSeCCC o qual consiste em sítios EcoRI e HindIII, 12 pb da sequência 5³não traduzida de ICAM-1 e os 24 primeiros pb codificadores do peptídeo sinal»

PCR3»3 tem a sequência;

8SAATTCCT8CAGTCACTCATACC8S8888ASA8CACATT

Λ. J

- S S C - ^y'^/ que consiste em sítios EcoRI e PstI, um codão de·-paragem e 24 pb complementares das bases codificadoras de pelo menos 8 aminoácidos extracelularss de ICAM-1 (resíduos 446-453).

PCR3.1® tem a sequência:

TTCTAGAGGATCCTCAAAAGGTCTGGAGCTGGTASGGGG que consiste sm sítios Xbal e BamHI, um codão de paragem e 24 pb complementares das bases codificadoras dos resíduos Í78-ÍS5 de ICAM-Í,

Os produtos de reacção PuR foram digeridos com EcoRI (tl'CAM(453)) ou com EcoRI e BamHI (tICAMí185)) ε danados no tm ·*· sítio poli-adaptador de Bluescripf ‘ SK CStratagsne)» Os clones contendo as inserções pretendidas foram verificados por análise de restrição e sequenciação de DNA. TM serções foram retiradas do Bluescripf por digestão com HindIII e Xbal e inseridos no vector de expressão CDM8 (Seed, Nature, 239;84® (1987) nos sítios

HindIII e Xbal. Um clone tendo pHRR~8.2 e um clone contendo pHRR23-13 foram seleccionados e a i n serç ão 11C AM(453) a inserção tICAM(185) designado designado sujeitos a sequenciação extensiva. Isto confirmou a existência dos codSes de paragem pretendidos e a integridade das regiões- seleccionadas da sequência codificadora de ICAM-1.

Estes plasmídeos foram transfectadas para células COS usando as técnicas de BEAE—dextrano e as células foram cultivadas 72 horas antes do ensaio. A expressão na superfície foi controlada por FACS usando imunofluorescência indirecta e um anticorpo monoclonal específico de ICAM—1. A expressão transitória em células COS e imunoprecipitação dos sobrenadantes de células marcadas metabolicamente ('^S cisteína) com Mab c78.4A (anticorpo monoclonal) demonstrou a produção de fragmentos deveis de 45 Kd e 8® Kd derivados ds pHRR23-l^

ICAM-Í solúpHRRS

respectivamente» A preparação da transfecMrri'tè^\,..-éstáveis de células de ovário de hamster chinês está descrita abaixo no Exempla 4«

C» Moléculas ICAM-1 transmembranares modificadas não qlicosiladas

Fez-se uma ICAM-Í de tamanho completo modificada por mutagénese simultânea de ÍM-Í03_S N-Í18, N-Í56 s N-Í73 cada uma para Q» Isto remove os quatro sítios de glicosílação ligados em N do domínio extracelular D2 da molécula de ICAM-Í, A molécula resultante, referida como ICAM transmembranar não glicosilada, foi expressa na superfície de células COS ε foi capaz de se ligar a HRV3 marcado radioactivamsnte em níveis comparáveis a ICAM-Í não modificada» Este resultado demonstrou, que a glicosílação do domínio 2 (os primeiros 184 aminoácidos) não é necessária para a ligação do vírus a ICAM-i,

Espera-se que ICAM não transmembranar possa ser modificada de forma semelhante para dar moléculas ICAM-1 não transmemn branares não gIicosi1adas» <4

D. Construção de formas obtidas por engenharia genética de ICAM-1 não transmembranar (truncada) contendo resíduos reactivos adequados à ligação cruzada para formar multímeros

Uma molécula consistindo no domínio extracelular de 453 aminoácidos de ICAM—1 com a adição de um novo resíduo lisina no extremo C foi construída por modificação de PCR do cDNA de pHRR-2 como descrito atrás» Gs iniciadores usados foram PCR5.5 · (descrito supra) e pcR 3·« 19 que tem a sequências

TTCTASASSATCCTCACTTCTCATACCGGGGGGAGAGCACATT e consiste nos sítios Xbal e BamHI, um codão de paragem, um codão Lis e 24 bases complementares da sequência codificadora dos

resíduos de aminoácidos 446 a 453, Após clonaggnY Pti .vèctor CDM8, a produção de LICAM-453K foi confirmada por expressão transitória em células COS. Obtiveram-se linhas celulares estáveis CHO por cotransfecção com pSV2-DHFR como descrito anteriormente.

A mesma estratégia foi usada para adicionar um residuo Lis ao extremo C de tXCAMílB5) usando PCR5.5, e PCR3.20 que tem a sequências

TTCTAGASBATCCTCACTTAAAGBTCTBBAGCTBBTAGGGBBC ε consiste em sítios Xbal e BamHI., um codão de paragem, um codão Lis e 24 bases complementares da sequência codificadora dos resíduos 178 a 185. fi expressão transitória de células COS confirmou a produção de tICAM-185 e linhas celulares CHO estáveis foram obtidas como descrito anteriormente.

Três formas modificadas de tICAMC1-452) cada uma contendo um resíduo Cis adicional foram construirias por mutagénese dirigida do cDNA de ICAM-1 de tamanho completo» Em cada uma das construções foi introduzido um codão de paragem isodando E-453 8AS para TAG» O extremo C é portanto Y-452» Os resíduos N-338, T-360 e Q-387 foram cada um deles mutagenizsdos separadamente para Cis usando uma segunda mutagénese dirigida. A presença das mutações pretendidas foi confirmada por sequenciação ds DNA»

Os resíduos seleccionados para mutação para Cis foram seleccionados com base num gráfico gerado por computador da probabilidade de superfície que prevê a exposição na superfície destas regiões. Também, T—360 está numa, maior proximidade de M-358 que é um sítio de potencial glicosilação ligada em FM» Cada uma das três modificações Cis foi expressa e secretaria oara o meio das células COS transfectadas. A análise das proteínas em condições redutoras e não redutoras não mostrou qualquer indicação da presença de dímeros» Foi antecipado que os reagentes de >* 'ί

ligação cruzada reactivos com grupos sulf idril-cPí -pode ser usada para ligar as formas tICAM modificadas em Cis para se obter formas muitiméricas.

EXEMPLO 4

TfiftNSFECçaO DE CéLULAS E EXPRESSÃO DE FORMAS TRUNCADAS N%0

TRANSMEMBRANARES DE cDNA DE ICAM

XA, transfecção dg células eucarióticas

Células de ovário de hamster chinês (CHO) deficientes di-hidrofulato-reduta.se (DHFR) foram adquiridas a Cutter Labs CBerkeley, CA)» As células foram cotransfectadas com o plasmídeo pSV2 DHFR que contem o gene da di-hidrofolato-redutase (DHFR) sob controle do promotor do SV4S e com construções tICAM-453 ou tICA.M-184 rio vector CDMS (Seed and Aruffo, PNAS» 84;3365-3369 (1987))»

As transfgecções foram feitas usando os métodos de electroporação e do fosfata de cálcio,, Bebbington, supra. As células transfectadas DHFR-posítivas foram seleccionadas por crescimento em meios sem nucleósidos e conjuntos de transfectantes foram clonados por diluição limite»

Linhas celulares que secretam tICAM foram identifiçadas testando os sobrenadantes de cultura com um radio—imunoensaio (RIA) de dois sítios para ICAM usando os Mabs c7S»4A e c78.5A como se seque. Um anticorpo monoclonal contra um epítopo em ICAM (por exemplo,Mab c78»4A) foi adsorvido ao plástico de placas de 96 cavidades (placas Immunlon, Dynatech Inc.), o excesso de sítios de ligação nas placas foi bloqueada com albumina do soro bovina (BSft)e depois os sobrenadantes- das culturas incubados com j nc* as placas» As placas foram então lavadas e incubadas com ⁱ-’^JI-Mata (dirigido contra um segundo epítopo em ICAM por e:

«í e após lavagem determinada a quantidade de “^'-‘IgS ímpio, c7S,= 5A)

A concentração de tICAM foi determinada comparando o dados de RIA desconhecidos

contra uíns curva padrão de tm-ICAM era concentraçõs conhecidas. Os clones positivos foram expandidos e a expressão das formas tICAM foi confirmada por imunoprecipitação de sobrenadantes de células marcadas metabolicamente com Mab c78»4A«

(tICAM<135)) foram seleccionadas para estudos posteriores e foram sujeitos a estudos de amplificação de genes em meios contendo metotrexato como descrito por Bebbington, et al., supra» Um clone derivado de CT.2A resistente a metotrexato 1®@ nM e um clone CDÍ2.ÍA resistente a metotrexato 1 μΜ foram usados para a purificação de proteínas ICAM-1 truncadas solúveis»

B» Transfecção de células procarióticas

Devido ao facto da glicosilação do domínio de ligação ao vírus de ICAM não ser necessário para reter a ligação a vírus (como demonstrado no Exemplo 30, previu-se que as células procarióticas, tais como E. coli podem ser transfectadas com êxito para produzir proteínas funcionais»

EXEMPLO 5

ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE FORMAS TRUNCADAS NÃO TRANSMEMBRAMARES

DE ICAM-1 usanoo c/8»4A-bepharose foi copendente U.S..S.N» 130,378 e CÍ9S9). tICAM secretada para o

A cromatografia de afinidade com anticorpos monoclonais anteriormente descrita no pedido Greve, et al», Cell, 56:839-847 meio contendo soro necessitou de passos de purificação adicionais devido ao elevado nível de proteína contaminante no soro» Antes da eluição da coluna de afinidade com Mab, a coluna foi lavada com IM NaCl para remover » · λ>

*·. K £ C Λ as proteínas f r-acaroente ligadas» Para tICAM(453)_s a tICAM(453) TM pareialmente purificada eluida da coluna de c78»4-Sepharose' foi dialisada contra ÍO mM Tris ídH 6,0), adsorvid-a numa coluna mono

TM (Pharmacia) e eluida comum gradiente €>-·©,3M NaCl tICAM184 foi ainda purificada por filtração em gel TM se-12 » Foi também reconheciCso que as numa coluna de Superoformas truncadas não transmembranares de ICAM-Í podem ser purificadas usando metodologia de permuta iónica sem usar cromatografia de afinidade com anticorpos.

EXEMPLO 6

MARCAÇÃO RADIOACTIVA DE tmICAM-ί, tICAMISS E tICAM455 E DEMONSTRAÇÃO DE RETENçaO SA CAPACIDADE PARA LIGAçgQ AOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

Os epitopos reactivos com os anticorpos monoclonais c78»4A ec78»5A são epitopos conformacionalmente dependentes ε podem assim ser usadas como sondas analíticas para confirmação d-a retenção da estrutura ICAM nativa» Quantidades conhecidas de ICAM purificada foram incubadas com c78»4A ou c78.5A IgG—Sepharose¹e determinada a fracção da radioactivídade ligada» Estas experiências mostram que tmICAM—1, tICAM~i(í85) e tICAM(453) purificadas retêm totalmente a capacidade de ligação a estes anticorpos monoclonais»

Os transfectantes foram marcados metabolicamente com 35 '~S cisteína e os lisadas celulares (para ICAM transmembranar) ou sobrenadantes de cultura (para ICAM truncada) foram preparados e incubados com esferas de c78»4A IgG—Sepharose ^^» As esferas foram lavadas e as proteínas adsorvidas foram eluidas com SDS e analisadas por SDS-PAGE? ver Greve, -et al», Cell, 56;838-847 (1989))»

Encontrou-se que as proteínas isoladas estavam quániiiafcivamente ligadas aos Mabs c7S„4A e c78»5A.

Assim, tlCAMílSS) e tICAM(453) têm ambos a estrutura nativa de ICAM.

EXEMPLO 7

ENSAIOS DE LISAçgQA RINOVÍRUS HUMANO DE FORMAS TRUNCADAS TRANSMEMBRANARES E NSO TRAN5MEMBRANARES DE ICAM-1

Desc re ve para avaliar a act e a seguir três ensaios de ligação usados idade de ligação das várias formas ds ICAM.

A. Ensaio de sedimentação tnICAM-ί ou tlCAM marcado com C' Slcísteina foi misturado com HRV3 em Í00 μΐ de 10 mM HEPES ípH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl„, imlj CaCl₇, 0,1% Triton X-100. A mistura foi incubada durante 3® minutos a 37*C, arrefecida em gelo, colocada sobre uma almofada de sacarose de 200 pl ds glicerola a í©%, trístanolamina 0,2M ípH 7,5) e centrifugado numa centrífuga Beckman a 13400® xg durante 30 minutos a 4'-C. Os 275 μΐ de cima foram removidos ε o sedimento foi analisado por SDS-ΡΑΘΕ e contagem de cintilação,, A coloração com prata dos géis de SDS das experiências testemunhas indicou que essencialmente todo o HRV3 sedimenta nestas condiçSes e essencialmente todo o ICAM fica no sobrenadante. Os resultados estão apresentados na Tabela 1.

t ABE.LA í

ICAM tmICAM-i tICAM(453) tICAMC185) % DE ICAM sedimentada^ ί ί , 6%

1,0% § média de 4 experiências? estes números não podem ser directamente convertidos em afinidades relativas»

Estes dados mostram que ambas as formas truncadas de ICAM sa ligam a rinovírus, mas em níveis substancialmente reduzidos reiativamente aos de tmlCAM»

B« Ensaio de ligação em solução

Para se obter informação quantitativa sobre a afinidade relativa dos fragmentos de tmlCAM e tICAM em solução, desenvolveu-se um ensaio de competição em solução em que tmlCAM solúvel ou fragmentas de tmlCAM solúveis foram usados para inibir a ligação de '‘“S HRV3 a ICAM-Í previamente imobilizada? detergente não iénico ÍTriton X-l©@) foi incluído nos tampões de forma a que proteínas diferentes pudessem ser comparadas em condiçSes idênticas» Primeiro, tmICAM-1 (isolado na presença de 0,1% octilglucosído em vez de Triton X-100) foi diluida í© vezes em tampão Tris/NaCl e deixado a adsorver às paredes de uma placa de microtitulação CImmunIon-4, Dynatech) durante a noite» Qs sítios tíe ligação inespecífica nas placas foram então bloqueados com 1© mg/ml de BSA e feitas experiências de ligação em ®,1% Triton X-10/ 1 mg/ml de BSA/Tris/NaCl« Aproximadamente 2©©©© cpm de '“S HRV3 foram misturados com quantidades variáveis de ICAM ou de tmlCAM, t!CAM(453) ou tICAMC185), incubados durante 1 hora a 37*C e depois adicionados às cavidades de placas de microtitulação e

incubados durante 3 horas a 37°C. As determinada a radioactividade ligada»

Como se mostra na Tabela Z, vírus em metade do valor máxima com c μΜ) enquanto t.ICAM(453) e tICAMÍ185 muito superiores (2,8 μΜ e 7,9 μΜ, quase 1©©© vezes mais do que tmlCAM.

placas foram lavadas e tmICAM-1 inibe a ligação do oncentrações baixas (0,0008 T inibem em concentrações respectivamente; ou 35© a

		TABELA	2
ICAM			ΙΟ^φ?
tmlCAM		8,©	± 3,3	nM	<N=3)
tICAM(453)		2,8	± ©,ó	μΜ	(Ν=·'3)
tICAMí185)		7,9	_í_ í-% i~« X X _? O	μΜ	CN=3)
$ IC-,, é a 50	concen tração	de ICAM solúvel	necessária
ligação de	HRV3 em 5©% =

Estes resultados confirmam e ampliam as observações anteriores de que tICAM(453) e tICAMÍ185) ligam-se a rinovírus mas com afinidades inferiores a tnICAM-í e proporcionam evidência de que o sítio de ligação a vírus está englobado dentro dos dois domínios N-terminais (185 resíduos) de ICAM-Í»

C» Ensaio de dot-blot”

Foi utilizado um método alternativo de medição da actividade de ligação em que tmlCAM-Ι, tICAM(453) ou tICAMdSS) foram adsorvidos a filtros de nitrocelulose». Inespecificos nos filtros foram bloqueados

O 5sítios de ligação com 10 mg/ml de

ζ:

albumina sérica bovina CBSft) e vírus radioactiVô^:;f.òu··'' ‘‘‘I Mab a ICAM-1 incubado com o filtro durante 60 minutos a 37°C» Os filtros foram lavados com tampão ε os filtros foram expostos a filme ds raios X»

A quantidade de radioactividade ligada aos filtros foi determinada por densitomstria dos autorradiogramas e os resultados são expressos como ligação de HRV3 Cem unidades arbitrárias) normalizada para a quantidade de ICAM ligada ao filtro por uma 125 determinação paralela da quantidade de Mab c78.4A ou c78.5A ligado ao ICAM Cligado ao filtro). Os resultados estão apresentados na Tabela 3.

TABELA 3

Ligação de HRV3 a ICAM imobilizada*

ICAM tICAM(453) razão ICAM/tICAM453 i,2 ± 1,1 ± 0,45

t Média de 5 experiências.: 0 densitométricas arbitrárias ¹²⁵I Mab anti-ICAM» de ultado e· 1igação stá expresso ^{Qe 35}S HRV em unidades /ligação de

Furam realizados estudos adicionais com tICAM 185« Experiências de ligação demonstraram resultados equívocos. Foi antecipado que limitação espacial possa desempenhar um papel, 0 tamanho do vírus é de aproximadamente 3© nanómetros. 0 comprimento de fíCAMClBS) è inferior a 10 nanómetros. A utilização de um espaçador ou ligante proporcionariam melhor acesso para a ligação .

Os resultados desta

Os resultados desta experiência indifcáte que nestas condições ds ensaio tICAM(453) é capaz de se ligar a rinovírus em níveis comparáveis aos de tmICAM-í quando a quantidade de vírus ligado for normalizada para a quantidade

Ainda, estes resultados indicam que as capazes ds se ligarem a rinovírus está dependente da configuração de multímero pequeno (provavelmente um dímero) e a apresentação de tICAii numa forma multimérica simula esta configuração multimérica»

de ⁱ’^iOI Mab ligado» formas de tICAM são mas que a avidez da ligação tICAM» tmICAM-1 pode ser um

Evidência que suporta esta hipótese deriva de estudos quantitativos de ligação (não publicados), em que a proporção entre o número máximo de partículas de rinovírus e o número máxima de moléculas de anticorpo que se pode ligar ãs células é de aproximadamente 1,5 como discutido supra« Isto contrasta com trabalho anterior de Tomassini, J. et al , 3» Virol», 5Ss290 (1986), que sugeriram a necessidade de um complexo ds cinco moléculas para a ligação» A sua conclusão baseou-se numa interpretação errada dos resultados de filtração em gel que falharam por não tomarem em consideração as moléculas de detergente ligadas»

EXEMPLO 8

LIBAçaO CRUZADA DE tICAM(453) MEDIADA PELO ANTICORPO IqG CL203

Para proporcionar evidência adicional de que a maior actividade de ligação relativa de tmICAM-í é devida a uma. forma multimérica da proteína, a proteína tICAM(453) foi pré-incubada com CL203, um anticorpo monoclonal contra ICAM-1 que não inibe & ligação do vírus a ICAM-1 e que se liga a um sítio C-terminal relativamente ao resíduo 184 Staunton» et al»» Cell» 56:849

(19895 e Cell, 61s243 (19905 α antietírpõ 'pode fazer eficazmente a ligação cruzada de duas moléculas de tlCAM<453) para criar dímeros de tICAM<453) sem no entanto bloquear o sitio de ligação ao vírus em cada uma das duas moléculas de tICAM(453), Quando uma mistura de lg© CL203 e tICAM(453) numa proporção de 4sl foi testada no ensaio de competição, encontrou-se que tICAM(453) interligada com o anticorpo inibia a ligação de HRV3 numa concentração 7,4 vezes mais baixa do que t.ICAM(453) sózinha consistente com a ideia ds qus tICAM-1 se liga com maior afinidade ao rinovírus devido a ser um dímero ou um multímero pequeno.

Para criar formas muitiméricas alternativas de tICAM, construiram-se várias outras formas truncadas modificadas de ICAM como descrito supra, no Exemplo 3« Estas formas podem ser multimerizadas como descrito no Exemplo 9, abaixo,

EXEMPLO 9

MULTlMERIZAçSP DE FORMAS TRUNCADAS TRANSMEMBRAMARE5 £ NSO TRANSIÍEMBR AMARES DE ICAM-1

Existem várias maneiras de tICAM se poder converter numa forma multimérica tendo maiores ligação ao vírus e actividade de neutralização relativamente à forma monomérica, Por exemplo, tICAM(453) pode ser acoplado a um polímero inerte, como seja amino—dextrano CPM 40000) usando reagentes de ligação cruzada homobifuncionais (tais como ésteres de M—hidroxi—succinimidâ (NHS)) ou. heterobifuncionais (tais como os contendo MHS-êster e grupos reactivos fotoactiváveis ou sulfidrilo) utilizando o grupo amina do amino-dextrano e um grupo amina ou outro em tICAM. Uma série de exemplos de reagentes de ligação cruzada adequados podem ser encontrados no catálogo da Pierce Chemical Company (Rockford,

111«)

Coma tlCAM reage fracamente com os compostos baseados em ésteres de NHS, uma tlCAM com um resíduo lisina C-terminal conseguida por engenharia genética (ver Exemplo 35 melhoraria a eficácia da acoplagem a suportes com reagentes homobifuncionais enquanto que resíduos císteina C-terminais conseguidos por engenharia genética facilitariam a acoplagem de reagentes heterobifuncionais tais como éster de sulfomaleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida (MBS), podem ser engenharia de cístsiComo alternativa, multímeros de tlCAM solúvel criados através resíduos reactivos colocados por genética no extremo C de t-ICAM. Por exemplo, resíduos na livres podem ser criados em sequ@nc.ias relativamente hidrofílicas na região C-terminal de tlCAM Ca qual teria uma maior tendência para estar exposta solvente). Foi antecipado que isto permitiria a criação de dímeros in si tu; como alternativa, poderiam ser purificados monómeros e criados dímeros in vitro por ligsção dissulfureto..

Uma outr bordagem requere colocação de resíduos

lisina em posições semelhantes e purificada in vitro com ésteres exemplos de tais resíduos lisina o ligação cruzada de proteína de NHS homobifuncionais, São ; resíduos 339, 36® e 397.

Nos resíduos císteina a ligação cruzada uns aos outros deve ser conseguida por reacção de tlCAM com grupos císteina livres com bis—maleimido-hexano (Pierce Chemical Co»; ou outros análogos de bis-maleimida, A ligação cruzada de resíduos de císteina. livres em tlCAM a grupos amina nas moléculas veículo pode ser conseguido por reacção com éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimida. Os grupos amina de ligação cruzada em moléculas tlCAM podem ser conseguidos com ésteres de N—hidroxi— —succinimida homobifuncionais (por exemplo, ver o catálogo da

Pierce Chemical Co,)» Como alternativa, os grupos açúcar em tICAM podem ser oxidados para aldeídos e acopladas a grupos amima activados com hidrazina numa molécula veículo,

EXEMPLO 10

ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO DA INFECCIOSIDADE DE FORMAS TRUNCADAS

TRANSMEMBRANARES E NÃO TRANSMEMBRANARESDE ICAM-1

Usaram-se trãs ensaios diferentes para determinar a infecciosidade virai» Estes diferentes ensaios fêm em consideração as diferenças na solubilidades de ICAM transmembranar e não transmembranar,

A, Ensaio de redução de o lacas n-a presença de detergente

Os resultados deste ensaio indicam que a dilução mais alta do vírus é a que ainda será eficaz para matar células» 0 vírus foi pré-incubado com a proteína ICAM transmembranar na presença de í% TXÍ@@, seriadamente diluído para o meio de 6 cultura, incubado durante 30 minutos com células HeLa a 1© células/ml, diluído 10 vezes ε semeada em cavidades de uma pica de microtitulação tíe 96 cavidades tendo diferentes diluições de vírus» Usou-se 0,1% TX100 como testemunha positiva» Após 5 dias as cavidades foram cantadas como infectadas ou não pela presença de efeito citopático ÍCPE) e o título expresso como unidades formadoras de placas/ml CRFUZml) do vírus original» Este ensaio foi descrito em U,S«S„N» 239,571 e foi usado para demonstrar a actividade anti-viral de tmICAM-1 ía qual requere a presença de detergente psra ficar em solução)»A concentração da proteína ICAM usada é a concentração inicial na mistura de pré-incubação? no entanto, a proteína ICAM não está presente continuamente durante a infecção pois a proteína é diluída seriadamente» Se bem que a i Ά- T

presença de detergente seja necessária para solubxlizar tmlCAM, a presença do detergente mata as células? dai a necessidade de diluições seriadas.

B·= Ensaio de redução de placas na ausência de detergente

Neste ensaio de redução de placas, um ensaio mais tradicional, células HeLa são infectadas com diluições seriadas de rinovírus como atrás, mas o detergente não está presente? assim, este ensaio não pode ser usado para testar tmICAM» Neste ensaio a tlCAM está presente continuamente no meio de cultura na concentração indicada. tmICAM-ί Cqe requere a presença de detergente) não pode ser testada neste sistema devido à adição do detergente necessário matar as células HeLa»

C» Ensaio de redução__de placas na presença contínua de vírus e

ICAM

Este ensaio é semelhante ao utilizado por Marlin, et al., (Nature 19903 por uma cultura de células HeLa ser infectada com 100 PFU de vírus na presença ou ausência da proteína ICAM e cultivadas durante cerca de 4 dias até ser aparente o efeito citopático CCPE). As culturas foram então contadas relativamente a CPE a olho nú» As condições do ensaio foram as mesmas de Marlin, supra» A contagem foi feita visualmente em lugar de um processo de coloração usando violeta cristal»

Neste ensaio, não está presente detergente continuamente e este ensaio mede uma redução na replicação/propagação de vírus num ponto arbitrário do tempo»

Os resultados destes três ensaios diferentes para a infecciosidade virai está resumido na Tabela 4« t <·* ί

TABELA 4

ICAM tnsaio;

r· tICAM-1 tICAM(453)

L S5)

IC507. íuM>*

ND

0/

ND ©,:

Estes resultados indicam que a tmICAM-í é significativamente mais activa na redução da infecciosidade virai do que as proteínas ICAM truncadas, mesmo quando comparado em sistemas de ensaio diferentes. As diferenças na actividade de neutralização de tICAM(453) no ensaio (A) e no ensaio (B) indica que a neutralização mediada por tICAM(453) tICAM(453) no meio de cultura ε ê reversível neutralização requere a presença contínua de q f_act_o gg _a er reversível estã indicado pela neutralização observada no ensaio (A), Pelo contrário, a actividade ds neutralização de tnICAM-í é >667 vezes superior è de t.ICAMÍ453) e à de tlCAMClSS) no aubSncia ds ensaio (A) e poderá ser mesmo possível ter tmICAM-1 presente continuamente no meio de cultura na ausência de detergente»

Para comparar estes resultados com os de Marlin, et al„, fez-se uma tentativa para reproduzir as suas condições de ensaio,. Como se mostra na Tabela 4, existe uma boa correlação entre os resultados no ensaio CB) e no ensaio ÍC), se bem que a IC5©% para tICAM(453) seja 10 vezes superior ao observado por Marlin, et al» Para determinar se isto ê devido a uma diferença no serotipo tío rinovírus usado, o ensaio foi repetido com HRVÍ4 e HRV54 í© serotipo usado por Marlin, et ai»), A IC5©%para ambos os maior no ensaio tos £ Ο* ί

serotipos foi d-e 0,2 μΜ tICAMC453), indicando que não existe diferença na sensibilidade do serotipo entre HRV14, HRV54 s HRV3.

Para tentar resolver esta discrepância usaram-se os mesmos tampões ds Marlin, et al. para ver se eles afectavam a infecciosidade de rinovírus no ensaio CC) . Marlin, et ai» a. sua. proteína s-ICAM num tampão contendo trietanolamina 5© (TEA)/2©mM Tris» Quando este tampão sózinho foi adicionado infecções testemunha Ci/Í© do TEA/2mM Tris) ds HRV3 e HRV14, volume, concnetracão final 5 mM õíS mM observou-se virtualmente inibição completa de CPE» Assim» é possível que possa haver efeitos devidos ao tampão na replicação do vírus não relacionado com a. presença ds qualquer forma de ICAM»

EXEMPLO íí

UTILIZAÇÃO DE FORMAS MULTIMÉRICAS DE FORMAS TRANSMEMMBRANARES E

TRUNCADAS DE ICAM-1, COMO INIBIDORES EFICAZES SA INTERACÇÃO DE

ICAM/FLA-1 to'

A função normal de ICAM-1 é servir como ligando da integrina da leucócitos LFA-l; a interacção entre estas duas moléculas conduz à adesão entre leucócitos e uma variedade de outras células» A capacidade de tICAM(453) para inibir a. adesão entre ICAM—í e LFA-l nas células foi examinada como se segue» ICAM-1 foi adsorvida. a placas de micro ti. tu lação como descrito no Exemplo 7C„ Células JY, as quais expressam LFA—1, aderem a células que expressam ICAM ou a placas ds cultura revestidas com ICAM-1 (Staunton, et al», JCB)» As células JY foram pré-incubadas na presença ou ausência de tICAM(453) durante 30 minutos a 37*C e depois adicionadas a placas revestidas com ICAM—1 e incubadas durante ó© minutos a 37®C» As placas- de microtitulação foram

- í f Ο ' .

então lavadas e o número de células aderentes às’ placas foi contado»

TABeLA

Inibição da interacção LFA-l/íCAM-í pela ICAli solúvel tICAM/45õ) (uq/ml)

Í00 300 A 00 % de ligação das células testemunhai

10©

Q3f $ Ligação a placas de microtitulação revestidas com ICAM-15 10 pg/ml de MAb anti-LFA-1 ou anti-ICAM-í inibiu a ligação em <í%.

Como se pode ver na Tabela 5, mesmo em concentrações elevadas de tICAM(453) <0,6 mg/ml), observou-se inibição mínima da ligação de células JY» Isto é provavelmente devido a um processo altamente cooperativo envolvendo .milhares de moléculas e a afinidade de tICAMÍ453) é baixa» A apresentação de tICAM<453) ou de tICAMCÍ85) numa configuração multimérica aumentará a afinidade da tICAM para células ε poderá servir como um agente anti-adesivo eficaz nas doenças inflamatórias ou auto-imunes»

Qs exemplos anteriores descrevem a criação de formas multiméricas solúveis de tICAM que substanciaImenta aumentam a ligação de tICAM-1 e a actividade de neutralização,

S-e bem que o presente invento tenha sido descrito em termos de métodos e composições específicos os familiarizados com a matéria verão que são possíveis variações e modificações do presente invento

99Por exemplo, pode-se antecipar que f r^géèâtps''' proteicos mais pequenos e peptídeos derivados de ICAM-Í que ainda contêm o sítio de ligação ao virus também serão eficazes numa configuração muitimérica» Pode-se também prever que ICAM multimérica pode ser um inibidor eficaz da interaeção ICAM-Í/LFft—1, uma vez que a afinidade entre estas duas moléculas é muito baixa e a ligação célula-célula sendo mediada por estas duas células é altamente cooperativa«

ICAM não

Se bem que a t r an sme m b r a n a r forma e configuração preferidas seja (truncada) na configuração dimérica.

uma não se pretende excluir outras formas e configurações eficazes na ligação ds vírus e eficazes na neutralização da actividade viraldo âmbito do presente invento»

Ainda, é antecipado que o método geral do invento para a preparação de formas solúveis- de proteína a partir de proteínas receptoras normalmente ligadas a membranas possa ser usado para preparar formas multiméricas solúveis de outras proteínas receptores úteis para a ligação de vírus e diminuição da sua infeccio— sidade diferentes dos que se ligam ao receptor do grupo major« Tais vírus incluem polio, herpes simplex e Epstein~Barr.

Numerosas modificações e variações no invento como descrito nos exemplos ilustrativos atrás espera-se que possam ocorrer e consequentemente apenas as limitações tais como surgem nas reivindicações apensas deverão ser colocadas»

Assim pretende—se que as reivindicações apensas cubram, todas as variações equivalentes que estejam dentro do âmbito do invento tal como reivindicado»

Claims

REIVINDICAÇÕES:

l^â. - Processo para a obtenção de uma ICAM (molécula de adesão intercelular) multimérica, caracterizado por a referida ICAM ser multimerizada por:

a) adsorção com suporte; ou

b) acoplagem a um membro.
2^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado a por a referida ICAM ser ICAM não transmembranar.
3 -. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a referida ICAM não transmembranar não possuir substancialmente o domínio intracelular carboxilo nem o domínio hidrofóbico membranar.
4^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a referida ICAM não transmembranar ser um membro seleccionado do grupo constituído por tICAM(453) e tICAM(184).
5^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida ICAM ser multimerizada por adsorção a um suporte.
6^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por o referido suporte ser um polímero inerte e ser um membro seleccionado do grupo constituído por nitrocelulose, PVDF, DEAE, polímero de lípidos e amino-dextrano.
7^a. - Processo para a obtenção de uraa ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida ICAM multimérica ser multimerizada por acoplagera a um membro.
8^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por a referida ICAM ser modificada em ambos os extremos.
9^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por a referida ICAM ser modificada no extremo carbonilo.
10^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por a referida ICAM ser modificada no extremo carbonilo para conter um resíduo de aminoácido reactivo.
11^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por o referido aminoácido reactivo ser um membro seleccionado do grupo constituido por lisina e císteina.
12^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por a referida ICAM ser modificada no extremo amina.
13^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por a referida ICAM ser modificada no extremo amina para conter um resíduo de aminoácido reactivo.
14^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por o referido aminoácido reactivo ser um membro seleccionado do grupo constituído por lisina e císteina.
15^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por a referida ICAM ser modificada em ambos os extremos para conter um lípido capaz de de promover a formação de micelas de oligómeros.
16®. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por o referido membro ser um membro seleccionado do grupo constituído por um anticorpo, um veículo proteico e um reagente de ligação cruzada.
17 ^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por o referido anticorpo ser o anticorpo antilCAM CL 203.
18^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por o referido agente de ligação cruzada ser seleccionado do grupo constituído por reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais e homobifuncionais.
19^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por o referido reagente de ligação cruzada ser um membro seleccionado do grupo constituído por ésteres bifuncionais de N-hidroxi-succinimida, imidoésteres e bis-maleimido-hexanos.
20^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por o referido veículo proteico ser um membro seleccionado do grupo constituído por albumina e proteoglicanos.
21^a. - Processo para a obtenção de uma ICAM multimérica de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida ICAM ser um membro seleccionado do grupo constituído por ICAM totalmente glicosilada, ICAM parcialmente glicosilada ou ICAM não glicosilada.
22^a. - Método aperfeiçoado para aumentar a ligação de ICAM não transmembranar a um ligando, caracterizado por o referido aperfeiçoamento consistir na apresentação da referida ICAM não transmembranar, obtida de acordo com a Reivindicação 2, ao referido ligando numa forma e configuração tal que a ligação da referida ICAM não transmembranar ao referido ligando seja aumentada.
23^a. - Método de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por a referida ICAM não transmembranar ser ICAM substancialmente sem o domínio carbonilo intracelular e sem o domínio hidrofóbico de membrana.
24®. - Método de acrodo com a Reivindicação 23, caracterizado por a referida ICAM não transmembranar ser um membro seleccionado do grupo constituído por tICAM(453) e tICAM(l85).
25^a. - Método de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por a referida ICAM estar numa configuração multimérica.
26^a. - Método de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por a referida ICAM estar modificada no extremo carbonilo ou no extremo amina e em que é aumentada a formação de ICAM multimérica.
27 ^a. - Método de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por a referida modificação compreender a adição de lisina ao extremo carbonilo.
28 ^a. - Método de acordo com a Reivindicação 26, caracterizado por a referida modificação compreender a adição de císteina livre ao extremo carbonilo.
29^a. - Método de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por a referida configuração multimérica englobar a dimérica.
30^a. - Método de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por a referida configuração multimérica compreender uma primeira ICAM ligada a uma segunda ICAM.
31^a. - Método de acordo com a Reivindicação 25, caracte· rizado por a referida configuração multimérica compreender ICAM adsorvida a um suporte para gerar uma configuração multimérica.
32^a. - Método de acordo com a Reivindicação 31, caracte rizado por o referido suporte compreender um membro seleccionado do grupo constituído por polímeros de elevado peso molecular e substaneialmente inertes.
33^a. - Método de acordo com a Reivindicação 32, caracte rizado por o referido polímero ser um polímero inerte e ser um membro seleccionado do grupo constituído por nitrocelulose, PVDF, DEAE, polímeros lípidicos e amino-dextrano.
34^a. - Método de acordo com a Reivindicação 32, caracte rizado por a referida ICAM multimérica ser multimerizada por acoplagem a um membro.
35^a. - Método de acordo com a Reivindicação 34, caracterizado por o referido membro ser seleccionado do grupo constituído por um anticorpo, um veículo proteico e um agente de ligação cruzada.
36^a. - Método de acordo com a Reivindicação 35, caracterizado por o referido reagente de ligação cruzada ser um membro seleccionado do grupo constituído por reagentes de ligação cruzada homobifuncionais e heterobifuncionais.
37^a. - Método de acordo com a Reivindicação 32, caracte· rizado por o referido veículo proteico ser um membro seleccionado do grupo constituído por albumina e proteoglicanos.
38^a. - Método de acordo com a Reivindicação 37, caracte rizado por o referido anticorpo ser o anticorpo anti-ICAM CL203.
39^a. - Método de acordo com a Reivindicação 22, caracte rizado por o referido ligando ser um membro seleccionado do grupo constituído pelo principal grupo receptor de rinovírus humano, antigénio-1 associado a linfócitos (LFA-1) e Plasmodium falciparum.
40^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se misturar um solvente, diluente, adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável e como ingrediente activo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de acordo com a Reivindicação 1.