PT91834B - Processo para a preparacao de moleculas de adesao intercelular e de ligantes que promovem a ligacao destas moleculas bem como de agentes terapeuticos e de diagnostico que os contem - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Domínio da invenção
A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de derivados funcionais solúveis de moléculas de adesão intercelular tais como ICAM-1 que estão envolvidos no processo através dos quais populações de linfócitos reconhecem e aderem a substratos celulares de tal modo que podem migrar para locais de inflamação e interactuar com as células durante reacções inflamatórias. A presente invenção refere-se adicionalmente a moléculas de ligandos capazes de junção a essas moléculas de adesão intercelular, a um ensaio de selecção para esses ligandos e a usos para a molécula de adesão intercelular, para as moléculas do ligando e para o ensaio de selecção.
Descrição da técnica relacionada
Os leucócitos devem ser capazes de se fixarem a substratos no sentido de defenderem o hospedeiro contra invasores estranhos, tais como bactérias ou vírus. Encontra-se publicada uma excelente revisão do sistema de defesa por Eisen, H.W., (In:
Microbiology, 3a Ed. Harper & Row, Philadelphia PA (1980), pp. 290-295 e 381-418) . Os leucócitos devem ser capazes de se fixarem a células endoteliais de modo a poderem migrar a partir da circulação para locais de inflamação em actividade. Além disso devem fixar-se a células que apresentem antigenes de modo a que possa ocorrer uma resposta imune específica normal, e finalmente devem fixar-se a células visadas apropriadas de maneira que possa ocorrer a lise de células infectadas com vírus ou de células tumorais.
Recentemente as moléculas da superfície dos leucócitos envolvidas na mediação destas fixações foram identificadas utilizando-se a tecnologia dos hibridomas. Em resumo, foram identificados os anticorpos monoclonais dirigidos contra células T humanas (Davignon, D. et al., proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 4535-4539 (1981)) e células de baço de rato (Springer, T. et al. Eur. J. Immunol. 9: 301-306 (1979) ) que se ligam a superfícies de leucócitos e inibem as funções relacionadas com a fixação descritas acima (Springer, T. et al., Fed. Proc. 44: 2660-2663 (1985)). As moléculas identificadas por aqueles anticorpos foram denominadas Mac-1 e Antigene-1 associado a Função de Linfócito (LFA-1) . O Mac-1 é um heterodímero que se encontra nos macrofagos, granulócitos e grandes linfocitos granulares. O LFA1 é um heterodímero que se encontra na maior parte dos linfocitos (Springer, T.A., et al. Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982)). Estas duas moléculas, mais uma terceira molécula, p!50,95 (que tem uma distribuição nos tecidos semelhante a Mac1) desempenham um papel na adesão celular (Keiser, G. et al.,
Eur. J. Immunol. | 15: 1142-1147 (1985)). | ||
Verificou-se | que as moléculas | dos | leucócitos acima |
mencionadas eram membros de uma | família | relacionada de | |
glicoproteínas | (Sanchez-Madrid, F. et | al., | Exper. Med. 158: |
1785-1803 (1983) | ι ; Keizer, G.D. et al | ., Eur. | J. Immunol. 15: |
X-
1142-1147 (1985) ) . Esta família de glicoproteínas é composta por heterodímeros que têm uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Apesar de as cadeias alfa de cada um dos antigenes diferirem umas das outras, verificou-se que a cadeia beta se mantinha em alto grau sem alterações (Sanchez-Madrid, F. et al., Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)). Verificou-se que a cadeia beta da família de glicoproteínas (por vezes referida como CD18) tinha um peso molecular de 95 kd enquanto que se verificou que as cadeias alfa variavam de 150 kd a 180 kd (Springer, T., Fed. Proc. 44: 26602663 (1985)). Apesar de as subunidades de alfa das proteínas da membrana não participarem da homologia extensiva como as subunidades de beta participam, uma análise mais pormenorizada de subunidades de alfa das glicoproteínas revelaram que existem substanciais semelhanças entre elas. São feitas revisões das semelhanças entre as subunidades de alfa e beta das glicoproteínas relacionadas com LFA-1 por Sanchez-Madrid, F. et al, Exper. Med. 158: 586-602 (1983)); J. Exper. Med. 158: 17851803 (1983).
Identificou-se um grupo de indivíduos que são incapazes de exprimir quantidades normais de qualquer membro desta família de proteínas de adesão nas superfícies celulares dos seus leucócitos (Anderson, D.C., et al., Fed. Proc. 44: 2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Pis. 152: 668-689 (1985)). Linfocitos desses pacientes mostraram in vitro defeitos semelhantes a linfocitos normais de que a família LFA-1 de moléculas tivesse sido antagonizada por anticorpos. Além disso, estes indivíduos eram incapazes de dar uma resposta imune normal devido à incapacidade das suas células para aderir a substratos celulares (Anderson, D.C., et al., Fed, Proc. 4 4: 2671-2677 Andersen, D.C., et al., J. Infect. Pis.. 152: 668-689 (1985)). Estes dados mostram que as respostas imunes são mitigadas quando os linfocitos são incapazes de aderir dum modo normal devido à falta de moléculas de adesão funcionais da família LFA-1.
Assim, em resumo, a capacidade dos linfócitos de manter a saúde e viabilidade de um animal requer que eles sejam capazes de aderir a outras células (tais como células endoteliais) . Verificou-se que esta aderência requer contactos célula-célula que envolvem moléculas receptoras específicas presentes na superfície das células dos linfócitos. Estes receptores capacitam um linfócito para aderir a outros linfócitos ou a células endoteliais ou outras células não vasculares. As moléculas receptoras da superfície da célula estão altamente relacionadas umas com as outras como se tem verificado. Os seres humanos a cujos linfócitos faltam estas moléculas receptoras da superfície das células mostram infecçoes crónicas e recorrentes, bem como outros sintomas clínicos incluindo respostas de anticorpo defecientes.
Dado que a adesão de linfócitos está envolvida no processo através do qual qualquer tecido estranho é identificado e rejeitado, uma compreensão deste processo é de valor significativo nos campos da transplantação de orgãos, enxerto de tecidos, alergia e oncologia.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a derivados funcionais solúveis da Molécula de Adesão Intercelular (ICAM-1). A presente invenção refere-se adicionalmente a anticorpos e a fragmentos de anticorpos capazes de inibir a função da ICAM-1 e a outros inibidores da função da ICAM-1; e a análises capazes de identificar estes inibidores. A invenção inclui adicionalmente utilizações para diagnóstico e terapêuticas de todas as moléculas acima descritas.
A invenção refere-se ainda aos derivados da molécula referida que são adicionalmente capazes de se ligarem a uma molécula presente à superfície de um linfócito.
A invenção refere-se adicionalmente aos derivados da molécula de adesão intercelular ICAM-1 referida que estão marcados de modo a permitirem a sua detecção.
A invenção inclui adicionalmente uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar derivados funcionais solúveis de
ICAM-1.
A invenção também inclui um processo para recuperar ICAM-1 numa forma substancialmente pura que compreende as seguintes fases:
a) solubilizar ICAM-1 a partir das membranas de células que exprimem ICAM-1, para formar uma preparação de ICAM-1 solubilizada,
b) introduzir a preparação de ICAM-1 solubilizada numa matriz
de afinidade, matriz esta que contém anticorpos capazes de se ligarem a ICAM-1, | |
C) | permitir a ligação de ICAM-1 ao anticorpo da matriz de afinidade, |
d) | remover da matriz qualquer composto incapaz de ligação ao anticorpo e |
e) | recuperar a ICAM-1 numa forma substancialmente pura por eluição de ICAM-1 a partir da matriz. |
A invenção inclui adicionalmente um anticorpo capaz de |
ligação a uma molécula seleccionada do grupo constituído por um derivado funcional solúvel de ICAM-1.
A invenção refere-se também a um processo para o tratamento de inflamação resultante de uma resposta do sistema de defesa específico num mamífero que compreende proporcionar a um indivíduo com necessidade de um tal tratamento uma quantidade de um agente anti-inflamatório suficiente para suprimir a inflamação; sendo o agente anti-inflamatório constituído por um derivado funcional solúvel de ICAM-1.
A invenção refere-se também a um processo de suprimir as metásteses de uma célula de um tumor hematopoiético que requeira um membro funcional da família de LFA-1 para migração, processo esse que compreende proporcionar a um doente que necessite de tal tratamento uma quantidade de um agente anti-inflamatório suficiente para suprimir a metástese; sendo o agente antiinflamatório constituído por um derivado funcional solúvel de ICAM-1.
A invenção refere-se taambém a um processo de suprimir o crescimento de uma célula de um tumor que expresse LFA-1, processo esse que compreende proporcionar a um doente que necessite de tal tratamento uma quantidade de uma toxina suficiente para suprimir esse crescimento; sendo a toxina seleccionada do grupo constituído por um derivado funcional solúvel de ICAM-1 derivatizado com uma toxina.
A invenção refere-se também a um processo para a determinação da presença e para a localização de uma célula de um tumor que expressa um membro da família de moléculas de LFA-1 num indivíduo que se suspeite de possuir uma tal célula, que compreende:
a) incubar uma amostra de tecido do referido indivíduo na presença de uma composição que contém um derivado funcional solúvel de ICAM-1 marcado de modo detectável, e
b) detectar o referido ligando de junção que se encontra ligado a um membro da família de moléculas de LFA-1 presente na referida amostra de tecido.
A invenção inclui adicionalmente uma composição farmacêutica, que compreende:
a) um derivado funcional solúvel de ICAM-1, e
b) pelo menos um aagente imunossupressor seleccionado do grupo constituído por: dexametasona, azatioprina e ciclosporina
A.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 mostra sob a forma de diagrama a adesão entre uma célula normal e uma célula com deficiência em LFA-1.
A Figura 2 mostra sob a forma de diagrama o processo de adesão de célula normal/normal.
A Figura 3 mostra a cinética de agregação celular na ausência de (X) ou na presença de 50 ng/ml de PMA (O).
A Figura 4 mostra a coagregação entre as células LFA-1- e LFA-1+. Células transformadas EBV (104) marcadas com diacetato de carboxifluoresceína, como designado na figura, foram misturadas com 105 células autologas não marcadas (barras a cheio) ou células JY (barras vazias) na presença de PMA. Depois de 1,5 horas as células marcadas, em agregados ou livres, foram numeradas usando a análise qualitativa do Exemplo 2. A percentagem de células marcadas em agregados é evidenciada. Mostra-se um ensaio representativo de dois.
A Figura 5 mostra a imunoprecipitação de ICAM-1 e de LAF-1 a partir das células JY. Os lisados de Triton X-100 de células JY (pistas 1 e 2) ou tampão de lise para comparação (pistas 3 e 4) foram imunoprecipitados com anticorpos capazes de ligação a
ICAM-1 (pistas 1 e 3) ou com anticorpos capazes de ligação a LFA-1 (pistas 2 e 4). 0 painel A mostra resultados sob condições redutoras; o painel B mostra resultados obtidos sob condições não redutoras. Os pesos moleculares padrão correram na pista S.
A Figura 6 mostra a cinética dos efeitos de IL-1 e de interferão gama na expressão de ICAM-1 em fibroblastos dérmicos humanos. Os fibroblastos dérmicos humanos foram cultivados até uma densidade de 8 χ IO4 células/alvéolo de 0,32 cm2. Adicionouse IL-1 (10 U/ml, circulos fechados) ou interferão gama recombinante (10 U/ml, quadrados abertos) e no tempo indicado arrefeceu-se o ensaio a 4°C e realizou-se uma análise de ligação indirecta. O desvio padrão não excedeu 10%.
A Figura 7 mostra a dependência de concentração dos efeitos de IL-1 e de gama interferão sobre a ICAM-1. Os fibroblastos dérmicos humanos foram cultivados até uma densidade de 8 χ 104 células/0,32 cm2/alvéolo. Adicionaram-se IL-2 (círculo aberto), 11-1 humano recombinante (quadrado aberto), IL-1 de rato recombinante (quadrado a cheio), interferão gama humano recombinante (círculos a cheio) e interferão beta recombinante (triângulo aberto) na diluição indicada e incubaram-se durante 4 horas (IL-1) ou 16 horas (interferão gama e beta). Os resultados indicados são as médias de determinações em quadruplicado; o desvio padrão não excedeu 10%.
A Figura 8 mostra a sequência de nucleótidos e de ácidos aminados do ADNc de ICAM-1. O primeiro ATG está na posição 58. As sequências traduzidas correspondentes aos peptídeos trípticos de ICAM-1 estão sublinhadas. O presumível peptideo de sinal hidrofóbico e as sequências de transmembrana têm um sublinhado forte. Os locais de glicosilação N-ligada estão enquadrados. O sinal de poliadenilação AATAAA na posição 2976 tem um traço por cima. A sequência apresentada é para o clone de ADNc de HL-60. O
ADNc de célula endotelial foi sequenciado na maior parte do seu comprimento e mostrou apenas diferenças mínimas.
A Figura 9 mostra os domínios homólogos de ICAM-1 e as relações com a família de supergenes de imunoglobulina. (A) alinhamento de 5 domínios homólogos (Dl-5). Dois ou mais resíduos idênticos que alinham estão enquadrados. Os resíduos que se mantêm duas ou mais vezes nos domínios de NCAM, bem como os resíduos que se conservam nos domínios dos conjuntos C2 e Cl foram alinhados com as repetições internas de ICAM-1. A localização das cadeias β previstas no domínio de ICAM-1 está marcada com barras e letras minúsculas por cima dos alinhamentos, e a localização conhecida de cadeias β nos domínios de imunoglobulina C é marcada com barras e letras maiúsculas por baixo do alinhamento. A posição da presumível ponte de dissulfureto entre os domínios de ICAM-1 é indicada por S-S. 0 alinhamento (B-D) de domínios de proteína homólogos aos domínios de ICAM-1; as proteínas foram inicialmente alinhadas por busca nas bases de dados NBRF usando o programa FASTP. As sequências de proteína são MAG, NCAM, domínio V de subunidade α de receptor de células T, cadeia ΙςΜμ e glicoproteína α-1-Β.
A Figura 10 mostra uma comparação por meio de diagrama das estruturas secundárias de ICAM-1 e de MAG.
A Figura 11 mostra células línfoblastóides B transformadas por EBV LFA-1 positivas ligadas a ICAM-1 em membranas planares.
A Figura 12 mostra a ligação de linfoblastos T e de células de linfoma T LFA-l-positivos a ICAM-1 em vesículas de ligação plástica.
A Figura 13 mostra a inibição de ligação de células JY linfoblastóides B que se ligam a ICAM-1 em vesículas ligadas a plástico por pré-tratamento de células ou de vesículas com anticorpos monoclonais.
A Figura 14 mostra o efeito da temperatura na ligação de linfoblastos T a ICAM-1 em vesículas ligadas a plástico.
A Figura 15 mostra a necessidade de catiões divalentes para a ligação de linfoblastos T a ICAM-1 em vesículas ligadas a plástico.
A Figura 16 mostra o efeito de anticorpos de anti-adesão na capacidade das células mononucleares de sangue periférico de proliferarem em resposta ao reconhecimento do antigene associado às células T OKT3. OKT3 indica a adição do antigene.
A Figura 17 mostra o efeito de anticorpos de antiadesão na capacidade das células mononucleares de sangue periférico de proliferarem em resposta ao reconhecimento do mitogene de células T não específico, concanavalin A. CONA indica a adição de concanavalin A.
A Figura 18 mostra o efeito de anticorpos de antiadesão na capacidade de células mononucleares de sangue periférico de proliferarem em resposta ao reconhecimento do antigene da hemocianina de Megathura crenulata (Keyhole limpet hemocyanin). A adição da hemocianina de Megathura crenulata às células é indicado por KLH.
A Figura 19 mostra o efeito de anticorpos de antiadesão na capacidade de células mononucleares de sangue periférico de proliferarem em resposta ao reconhecimento do antigene toxoide
do tétano. A adição do antigene toxoide do tétano às células é indicado por AGN.
A Figura 20 apresenta a ligação dos anticorpos monoclonais RR1/1, R6.5, LB2 e CL203 a mutantes de supressão de ICAM-1.
A Figura 21 apresenta a ligação dos mutantes de supressão de ICAM-1 a LFA-1.
A Figura 22 apresenta os epitopos reconhecidos por anticorpos monoclonais de anti-ICAM-1 RR1/1, R6.5, LB2 e CL203.
A Figura 23 apresenta a capacidade de ligação de mutantes de ICAM-1 no domínio 2 a LFA-1.
A Figura 24 apresenta a capacidade de ligação de mutantes de ICAM-1 no domínio 3 a LFA-1.
A Figura 25 apresenta a capacidade de ligação de mutantes de ICAM-1 no domínio 1 a LFA-1.
A Figura 26 representa o alinhamento dos domínios aminoterminais de ICAM-1.
DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS
Um aspecto da presente invenção diz respeito à descoberta de um ligante de junção natural a LFA-1. Moléculas como as da família LFA-1, que estão envolvidas no processo de adesão celular, são referidas como moléculas de adesão.
O ligante de junção natural da presente invenção é designado por Molécula-1 de Adesão Intercelular (Intercellular Adhesion
Molecule-1) ou ICAM-1. A ICAM-1 é uma glicoproteína de 76 a 97 Kd. A ICAM-1 não é um heterodímero. A presente invenção referese a ICAM-1 e aos seus derivados funcionais. Um derivado funcional de ICAM-1 é um composto que possui uma actividade biológica (quer seja funcional ou estrutural) que é substancialmente semelhante à actividade biológica de ICAM-1. 0 termo derivados funcionais é entendido incluir fragmentos, variantes, análogos ou derivados químicos duma molécula. Um fragmento de uma molécula tal como ICAM-1 é entendido referir-se a qualquer subconjunto de polipeptídeos da molécula. São especialmente preferidos os fragmentos de ICAM-1 que possuem actividade de ICAM-1 e que são solúveis (isto é sem ligação a membrana). Um variante da molécula tal como ICAM-1 é entendido referir-se a uma molécula substancialmente semelhante em estrutura e função seja à molécula inteira seja a um seu fragmento. Diz-se que uma molécula é substancialmente semelhante a uma outra molécula se ambas as moléculas têm estruturas substancialmente semelhantes ou se ambas as moléculas possuem actividade biológica semelhante. Assim, contanto que duas moléculas possuam uma actividade semelhante, elas são consideradas variantes na acepção com que este termo é aqui usado mesmo se a estrutura de uma das moléculas não existe na outra ou se a sequência de resíduos de ácidos aminados não é idêntica. Um análogo de uma molécula tal como ICAM-1 é entendido referir-se a uma molécula substancialmente semelhante em função seja à molécula inteira seja a um seu fragmento. Como se usa aqui, diz-se que uma molécula é um derivado químico de uma outra molécula quando contém fracções químicas adicionais que não são normalmente uma parte de molécula. Tais fracções podem melhorar a solubilidade da molécula, a absorção, a semivida biológica, etc.. As fracções podem em alternativa diminuir a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar qualquer efeito lateral indesejável da molécula, etc.. Estão descritas fracções capazes de mediar tais efeitos em Remington's Pharmaceutical
Sciences (1980). As moléculas de toxina derivatizada constituem uma classe especial de derivados químicos. Uma molécula de toxina derivatizada é uma molécula (tal como ICAM1 ou um anticorpo) que contém uma fracção de toxina. A ligação de tal molécula a uma célula trás a fracção de toxina para a proximidade restrita da célula e por isso provoca a morte da célula. Qualquer fracção de toxina adequada pode ser utilizada; contudo é preferível utilizar toxinas tais como, por exemplo, toxina de rícino, toxina de difeteria, toxinas radioisotópicas, toxinas que formam canal de membrana, etc.. Os processos para acoplar tais fracções especialidade.
a uma molécula são bem conhecido na
Uma molécula antigénica tal família de moléculas LFA-1 são superfícies dos linfócitos. Por células num animal apropriado, como ICAM-1 ou membros da naturalmente expressos nas isso a introdução de tais por exemplo por injecção intraperitoneal, etc., dará como resultado a produção de anticorpos capazes de ligação a ICAM-1 ou a membros da família de moléculas LFA-1. Se desejarmos, o soro de um tal animal pode ser retirado e usado como fonte de anticorpos policlonais capazes de ligação a essas moléculas. É contudo preferível remover esplenócitos a partir de tais animais, para fundir as células de baço referidas com uma linha de células de mieloma e permitir que tais células de fusão formem uma célula hibridoma que segrega anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM-1 ou a membros de família de moléculas LFA-1.
As células de hibridoma obtidas do modo descrito acima podem ser seleccionadas por uma variedade de métodos para identificar as células de hibridoma pretendidas que segregam anticorpo capaz de ligação quer a ICAM-1 quer a membros da família de moléculas LFA-1. Num ensaio de selecção preferido as referidas moléculas são identificadas pela sua capacidade de inibir a agregação de utilizado nesta selecção. pelo anticorpo pode células transformadas por vírus Epstein-Barr. Os anticorpos capazes de inibir esta agregação são mais tarde seleccionados para determinar se inibem esta agregação por ligação a ICAM-1 ou a um membro da família de moléculas LFA-1. Qualquer meio capaz de distinguir ICAM-1 da família de moléculas LFA-1 pode ser Assim, por exemplo, o antigene ligado ser analisado por exemplo por imunoprecipitação e por electroforese em gel de poliacrilamida. Se o antigene ligado é um membro da família de moléculas LFA-1, então verificar-se-á que o antigene imunoprecipitado é um dímero, enquanto que se o antigene é ICAM-1 ter-se-á imunoprecipitado espécies de peso molecular simples. Em alternativa, é possível distinguir entre estes anticorpos que se ligam a membros da família de moléculas LFA-1 daqueles que se ligam a ICAM-1 por selecção pela capacidade do anticorpo se ligar a células tais como granulócitos que exprimem LFA-1, mas não ICAM-1. A capacidade de um anticorpo (conhecido por inibir a agregação celular) para se ligar a granulócitos indica que o anticorpo é capaz de ligação a LFA-1. A ausência de tal ligação é indicativa de um anticorpo capaz de reconhecer ICAM-1. A capacidade de um anticorpo de se ligar a uma célula tal como um granulócito pode ser detectada por meio de técnicas comummente utilizadas. Tais meios incluem análises imunológicas, aglutinação celular, estudos de ligação em filtro, precipitação de anticorpos, etc..
Os anticorpos de anti-agregação da presente invenção podem em alternativa ser identificados por medição da sua capacidade de se ligarem diferencialmente às células que expressam ICAM-1 (tais como células endoteliais activadas), e da sua incapacidade de se ligarem a células que não conseguem expressar ICAM-1. Como será brevemente apreciado pelos conhecedores da matéria, os ensaios citados podem ser modificados, ou realizados numa ordem sequencial diferente para fornecer uma variedade de análises de
selecção potenciais cada uma das quais é capaz de identificar e descriminar entre anticorpos capazes de ligação a ICAM-1 e membros da família de moléculas LFA-1.
Os agentes anti-inflamatórios da presente invenção podem ser obtidos por processos naturais (tais como, por exemplo, por indução num animal, fungo, bactéria, etc., para produzir um antagonista não imunoglobulina de ICAM-1, ou por induzir um animal a produzir anticorpos policlonais capazes de ligação a ICAM-1); por métodos de síntese (tais como, por exemplo, usando o método de Merrifield de síntese de polipeptídeos para sintetizar ICAM-1, derivados funcionais de ICAM-1 ou antagonistas de proteína de ICAM-1 (quer imunoglobulina ou nãoimunoglobulina); por tecnologia de hibridoma (tal como, por exemplo, para produzir anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM-1); ou por tecnologia recombinante (tal como, por exemplo, para produzir os agentes anti-inflamatórios da presente invenção em diversos hospedeiros (i.e., em fermentos, bactérias, fungos, células de mamíferos cultivadas, etc.), ou a partir de plasmídeos recombinantes ou de vectores virais). A escolha de cada método a empregar dependerá acima de tudo de factores tais como conveniência, rendimento desejado, etc.. Não é necessário empregar sómente um dos métodos, processos, ou tecnologias acima descritos para produzir um agente anti-inflamatório particular; os processos, métodos e tecnologias acima descritos podem combinar-se no sentido de obter um agente anti-inflamatório particular.
A. Identificação do Parceiro de Ligação de LFA-1 (ICAM-1)
1. Análise de Agregação dependente de LFA-1
Muitas células transformadas por vírus de Epstein-Barr apresentam agregação. Esta agregação pode ser realçada na presença de ésteres de forbol. Verificou-se que esta agregação homotípica (isto é, agregação envolvendo sómente um tipo de células) é bloqueada por anticorpos anti-LFA-1 (Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)), cuja referência está incorporada aqui por referência). Assim o grau de ligação dependente de LFA-1 pode ser determinada por análise do grau da formação do agregado expontâneo ou dependente do éster de forbol.
Um agente que interfere com a agregação dependente de LFA-1 pode ser identificado através do uso de uma análise capaz de determinar se o agente interfere quer com o agregado expontâneo quer com o dependente do éster de forbol das células transformadas por vírus de Epstein-Barr. A maior parte das células transformadas por vírus de Epstein-Barr podem ser utilizadas num tal ensaio sempre que as células sejam capàzes de expressar a molécula de receptor de LFA-1. Estas células podem ser preparadas de acordo com a técnica de Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984), cuja referência é aqui incorporada por citação. Apesar de ser possível empregar quaisquer destas células na análise de ligação dependente de LFA-1 da presente invenção, é preferível empregar células da linha de células JY (Terhost, C.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73: 910 (1976)). As células podem ser cultivadas em qualquer meio adequado; contudo é altamente preferível cultivar as células no meio de cultura RMPI 1640 suplementado com soro fetal de vitela a 10% e 50 ug/ml de gentamicina (Laboratórios Gibco, NY). As células devem ser cultivadas sob condições adequadas para a proliferação de células de mamífero (isto é, a >' lie* uma temperatura de geralmente 37 °C, numa atmosfera de 5% de C02, a uma humidade relativa de 95%, etc.).
2. Ligação de LFA-1 a ICAM-1
Foram identificados indivíduos humanos a cujos linfócitos falta a família de moléculas de receptor de LFA-1 (Anderson, D.C. et al., Fed. Proc. 44: 2671-2677 (1985); Andersen, D.C. et al., J. Infect. dis. 152: 668-689 (1985)). Diz-se de tais indivíduos que sofrem de Deficiência de Adesão dos Leucócitos (Leukocyte Adhesion Deficiency = LAD) . As células transformadas por EBV de tais indivíduos não conseguem agregarse quer expontaneamente quer em presença de ésteres de forbol na análise de agregação atrás citada. Quando estas células são misturadas com células que expressam LFA-1 verificou-se agregação (Rothlein, R et al., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)) (Figura 1) . Muito importante é que estes agregados não se formam se estas células eram incubadas na presença de anticorpos anti-LFA-1. Assim, apesar de que a agregação requeria LFA-1, a capacidade das células com deficiência em LFA-1 para formar agregados com células que contêm LFA-1 indicava que o parceiro de ligação de LFA-1 não era LFA-1 mas em vez disso uma molécula de adesão celular não descoberta previamente. A Figura 1 mostra o mecanismo de adesão celular.
B. Molécula-1 de Adesão Intercelular (ICAM-1)
A nova molécula de adesão intercelular foi identificada em primeiro lugar e parcialmente caracterizada de acordo com o processo de Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986) cuja referência é aqui incorporada por citação. Para detectar a molécula ICAM-1, os anticorpos monoclonais foram preparados com células de baço de rato imunizado com células de indivíduos geneticamente deficientes em expressão em LFA-1. Os anticorpos resultantes foram seleccionados pela sua capacidade de inibir a agregação das células que expressam LFA-1 (Figura 2) . Em pormenor, a molécula ICAM-1, foram imunizados ratos com células B transformadas por EBV de pacientes LAD que não expressam o antigene de LFA-1. As células de baço destes animais foram em seguida removidas, fundidas com células de mieloma, deixando-se que se tornassem células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais. As células B de indivíduos normais transformadas por EBV que exprimem LFA-1 foram depois incubadas na presença do anticorpo monoclonal da célula de hibridoma a fim de identificar qualquer anticorpo monoclonal que fosse capaz de inibir a agregação expontânea medida pelo éster de forbol dependente de LFA-1 das células B transformadas por EBV. Uma vez que as células de hibridoma tinham sido derivadas de células que nunca tinham encontrado o antigene LFA-1 não se produziu qualquer anticorpo monoclonal para LFA-1. Assim qualquer anticorpo que se verifique inibir a agregação deve ser capaz de ligação a um antigene, que, apesar de não ser LFA-1, participa no processo de adesão de LFA-1. Apesar de se poder utilizar qualquer método para obter tais anticorpos monoclonais, é preferível obter anticorpos monoclonais de ligação a ICAM-1 por imunização de ratos BALB/C usando as vias e programas descritos por Rothlein, R. et al., (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)) com células mononucleares de sangue periférico transformadas por vírus de Epstein-Barr a partir de indivíduos deficientes em LFA1. Tais células são descritas por Springer, T. A., (J, Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984)).
Num método preferido para a geração e detecção de anticorpos capazes de ligação a ICAM-1, imunizam-se ratos quer com células transformadas por EBV que expressam tanto ICAM-1 como LFA-1 quer de preferência com células endoteliais activadas por TNF que expressam ICAM-1 mas não LFA-1. Num método especiaimente
preferido para gerar células de hibridoma que produzem anticorpos anti-ICAM-1, um rato Balb/C foi imunizado sequencialmente com células JY e com células diferenciadas U937 (ATCC CRL-1593) . As células de baço desses animais são removidas, fundidas com células de mieloma, possibilitando-se que desenvolvam em células de hibridoma produtoras de anticorpos. Os anticorpos são seleccionados pela sua capacidade de inibir a agregação induzida pelo éster de forbol dependente de LFA-1 de uma linha de células transformadas por EBV, tais como células JY, que expressam tanto o receptor LFA-1 como ICAM1. Como foi mostrado por Rothlein, R. et al., (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1987)), anticorpos capazes de inibir esta agregação são depois ensaiados para verificação da sua capacidade de inibir a agregação induzida pelo éster de forbol de uma linha de células, tal como SKW3 (Dustin, M., et al., J. Exper. Med. 165: 672-692 (1987)) cuja capacidade para se agregar expontaneamente na presença do éster de forbol é inibida por um anticorpo capaz de ligação a LFA-1 mas não é inibida por anticorpos anti-ICAM-1. Os anticorpos capazes de inibir a agregação induzida pelo éster de forbol de células tais como células JY, mas incapazes de inibir a agregação induzida pelo éster de forbol de células tais como células SKW3 são provavelmente anticorpos anti-ICAM-1. Em alternativa, os anticorpos que são capazes de ligação a ICAM-1 podem ser identificados por selecção de anticorpos que são capazes de inibir a agregação dependente de LFA-1 de células que expressam LFA (tal como células JY) mas são incapazes de ligação a células que expressam LFA-1 mas pouco ou nada ICAM-1 (tais como granulócitos normais) ou são capazes de ligação a células que expressam ICAM-1 mas não LFA-1 (tais como células endoteliais activadas por TNF) . Uma outra alternativa consiste em imunoprecipitar a partir de células que expressam ICAM-1, LFA-1, ou ambas, usando anticorpos que inibem a agregação dependente de LFA-1 de células, tais como células JY, e, através de SDS-PAGE ou de um método equivalente, determinar algumas características moleculares da molécula precipitada com o anticorpo. Se a característica é a mesma que a de ICAM-1 então o anticorpo pode ser aceite como sendo um anticorpo anti-ICAM-1.
Usando anticorpos monoclonais preparados do modo descrito acima, a molécula ICAM-1 de superfície da célula foi purificada e caracterizada. A ICAM-1 foi purificada a partir de células ou de tecido humano usando cromatografia de afinidade de anticorpo monoclonal. Neste método um anticorpo monoclonal que reage com ICAM-1 é acoplado a uma matriz inerte de uma coluna. Qualquer método de realizar tal acoplamento pode ser utilizado; contudo é preferível usar o método de Oettgen, H.C. et al., J. Biol, Chem. 259: 12034 (1984). Quando se passa um lisado celular através da matriz, as moléculas de ICAM-1 presentes são absorvidas e retidas pela matriz. Alterando o pH ou a concentração de iões da coluna as moléculas ICAM-1 ligadas podem ser eluídas da coluna. Apesar de poder ser utilizada qualquer matriz apropriada, é preferível empregar Sepharose (Pharmacia) para material da matriz. A formação de matrizes de coluna e o seu uso na purificação de proteínas são bem conhecidas na especialidade.
Dum modo conhecido normalmente pelos técnicos, as análises acima descritas podem ser usadas para identificar compostos capazes de atenuar ou de inibir a velocidade ou a extensão da adesão celular.
A ICAM-1 é uma glicoproteína de superfície de célula expressa em células não hematopoiêticas, tais como células endoteliais vasculares, células epiteliais tímicas, algumas outras células epiteliais e fibroblastos, e em células hematopoiêticas, tais como macrofagos de tecido, blastos de linfócito T estimulados por mitogénio e células B centradas germinais, e células dentríticas em amígdalas, gânglios linfáticos e placas de Peyer. A ICAM-1 é expressa em alto grau
em células endoteliais vasculares, em áreas de células T, em gânglios linfáticos e em amígdalas que mostram hiperplasia reactiva. A ICAM-1 é expressa em pequenas quantidades em linfócitos de sangue periférico. A diferenciação estimulada por ésteres de forbol de algumas linhas de células mielomonocíticas aumenta em alto grau a expressão de ICAM-1. Deste modo, a ICAM-1 é preferencialmente expressa em locais de inflamação e não é geralmente expressa por células inactivas. A expressão de ICAM-1 em fibroblastos dérmicos é aumentada três a cinco vezes quer pela interleuquina 1 quer pelo interferão gama a níveis de 10 U/ml durante um período de 4 a 10 horas, respectivamente. A indução é dependente da síntese de ARNm. e de proteína e é reversível.
A ICAM-1 apresenta heterogeneidade no peso molecular em diferentes tipos de células com um peso molecular de 97 kd nos fibroblastos, 114 kd na linha de células mielomonocíticas U937 e 90 kd nas células linfoblastóides B JY. Verificou-se que a biossíntese de ICAM-1 envolve um precursor intracelular de aproximadamente 73 kd. A forma não N-glicosilada resultante do tratamento com tunicamícina (que inibe a glicosilação) tem um peso molecular de 55 kd.
A ICAM-1 isolada a partir de células U937 estimuladas com éster de forbol ou a partir de células fibroblásticas dá um produto maioritário idêntico com um peso molecular de 60 kd depois da desglicosilação. Os anticorpos monoclonais ICAM-1 interferem com a adesão dos blastos de fito-hemaglutinina a linhas de células com deficiência em LFA-1. O tratamento prévio de fibroblastos, mas não linfócitos, com anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM-1 inibe a adesão linfócitofibroblasto. Também se verificou que o tratamento prévio de linfócitos, mas não de fibroblastos, com anticorpos contra LFA-1 inibe a adesão linfócito-fibroblasto.
A ICAM-1 é, assim, o ligante de junção do complexo 18 CD em leucócitos. É induzível em fibroblastos e em células endoteliais in vitro por mediadores inflamatórios tais como IL-1, interferão gama e factor de necrose de tumor num período de tempo consentâneo com a infiltração de linfócitos em lesões inflamatórias in vivo (Dustin M. L., et al., J. Immunol. 137: 245-254, (1986); Prober, J. S., et al., J. Immunol. 137: 18931896 (1986) ) . Além disso a ICAM-1 é expressa em células nãohematopoiéticas tal como células endoteliais vasculares, células endoteliais tímicas ou outras células epiteliais e fibroblastos e em células hematopoiéticas tais como macrófagos de tecidos, blastos de linfócito T estimulados por mitogenes e células B de centro germinal e células dendríticas em amígdlas, gânglios linfáticos e placas de Peyer (Dustin, M. L., et al., J. Immunol. 137: 245-254, (1986). A ICAM-1 é expressa em queratinocitos em lesões inflamatórias benignas tais como eczema alérgico, líquen plano, exantema, urticária e doenças bullous. As reacções alérgicas da pele provocadas pela aplicação de um hepteno na pele ao qual o paciente é alérgico revelam uma expressão de ICAM-1 forte nos queratinocitos. Por outro lado a aplicação de pensos tóxicos na pele não revela expressão de ICAM-1 nos A ICAM-1 está presente nos queratinocitos das lesões da pele de várias perturbações dermatológicas e a expressão de ICAM-1 é induzida em lesões de ensaios de pensos alérgicos enquanto os queratinocitos das lesões de ensaios de pensos tóxicos não conseguem expressar ICAM-1.
queratinocitos. biópsias das
A ICAM-1 é, portanto, um substracto celular ao qual se podem fixar os linfócitos, de modo que os linfócitos possam migrar para locais de inflamação e/ou levando a efeito várias funções efectoras que contribuem para essa inflamação. Estas funções incluem a produção de anticorpos, lise de células alvo
infectadas por vírus, etc.. 0 termo inflamação tal como é usado na presente invenção deve incluir sómente as reacções do sistema de defesa específico e não específico. 0 termo sistema de defesa específico tal como usado aqui refere-se ao componente do sistema imunitário que reage à presença de antigenes específicos. Diz-se que a inflamação resulta de uma resposta do sistema de defesa específico se a inflamação for causada por, for mediada por ou for associada com a reacção do sistema de defesa específico. Exemplos de inflamações resultantes da resposta do sistema de defesa específico incluem a resposta a antigenes tais como vírus de rubéola, doenças autoimunes, resposta de hipersensibilidade de tipo retardado mediada por células T (como foi visto, por exemplo em indivíduos com resposta positiva no teste de Mantaux), psoríase, etc..
Uma reacção do sistema de defesa não específico é uma resposta mediada por leucócitos incapazes de memória imunológica. Estas células incluem granulócitos e macrófagos. No sentido que lhe é dado na presente memória descritiva, diz-se que uma inflamação resulta de uma resposta do sistema de defesa não específico se a inflamação é causada por, mediada por ou está associada a uma reacção do sistema de defesa não específico. Exemplos de inflamação que resulta, pelo menos em parte, de uma reacção do sistema de defesa não específico incluem a inflamação associada a condições tais como: síndrome da dificuldade respiratória do adulto (SDRA) ou síndromes de afecção de órgãos múltiplos secundários a septicemia ou a trauma; afecção por reperfusão de tecidos do miocárdio ou outros; glomerulonefrite aguda; artrite reactiva; dermatoses com componentes de inflamação aguda; meningite purulenta aguda ou outras afecções inflamatórias do sistema nervoso central; lesões térmicas; hemodiálise; leucaferese; colite ulcerosa; doença de Crohn; enterocolite necrozante; síndromes associados a transfusão de granulocitos; e toxocidade induzida por citoquinas.
De acordo com a presente invenção, os derivados funcionais de ICAM-1, e especialmente os derivados que contêm fragmentos ou variantes mutantes de ICAM-1 que possuem os domínios 1, 2 e 3, podem ser usados no tratamento ou na terapia destas reacções do sistema de defesa não específico. São especialmente preferidos para este tratamento ou esta terapia os fragmentos ou variantes mutantes de ICAM-1 que contêm o domínio 2 de ICAM-1. São preferidos de modo ainda especial para este tratamento ou esta terapia os fragmentos ou variantes mutantes de ICAM-1 que contêm o domínio 1 de ICAM-1.
C. Clonagem do gene de ICAM-1
Qualquer procedimento de uma grande variedade pode ser utilizado para clonar o gene de ICAM-1. Um destes métodos impõe a análise de inserções de ADNc um banco de um vector vai e vem de (derivados de uma célula que expressa ICAM-1) para a presença de uma inserção que contenha o gene de ICAM-1. Tal análise pode ser levada a cabo por transferência de células com o vector e em seguida analisando para expressão de ICAM-1. 0 método preferido para clonagem deste gene impõe determinar-se a sequência de ácidos aminados da molécula de ICAM-1. Para realizar esta tarefa a proteína de ICAM-1 pode ser purificada e analisada por sequenciadores. Em alternativa, a molécula pode ser fragmentada como com brometo de cianogéno ou com proteases tais como papaína, quimotripsina ou tripsina (Oike,' Y. et al., J. Biol. Chem. 257: 9751-9758 (1982); Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209-215 (1983)). Apesar de ser possível determinar a sequência integral de ácidos aminados da ICAM-1, é
Λ-
preferível determinar a sequência de fragmentos peptídicos da molécula. Se os peptídeos são maiores que o comprimento de 10 ácidos aminados a informação da sequência é geraimente suficiente para permitir cionar um gene tal como o gene para
ICAM-1.
A sequência de resíduos de ácido aminado num peptídeo é designada aqui quer através do uso das suas designações de três letras comummente empregues quer pelas suas designações de uma única letra. Uma lista dessas designações de 3 letras e de 1 letra encontra-se em livros de texto tal como Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY (1979). Quando uma tal sequência é listada verticalmente, o resíduo amino-terminal deve estar no cimo da lista e o resíduo carboxi-terminal do peptídeo deve estar ao fundo da lista. De um modo semelhante, quando é listada horízontalmente, a extremidade amino-terminal deve estar na extremidade da esquerda enquanto a extremidade carboxi-terminal deve estar na extremidade da direita. Os resíduos de ácidos aminados num peptídeo podem ser separados por hífens. Tais hífens devem servir sómente para facilitar a apresentação da sequência. Como exemplo puramente ilustrativo, a sequência de ácidos aminados designada por:
-Gly-Ala-Ser-Pheindica que um resíduo de Ala está ligado ao grupo carboxilo de Gly, e que um resíduo de Ser está ligado ao grupo carboxilo do resíduo de Ala e ao grupo amina de um resíduo Phe. A designação indica além disso que a sequência de ácidos aminados contém o tetra peptídeo Gly-Ala-Ser-Phe. A designação não deve ser entendida como limitando a sequência de ácidos aminados a este único tetrapeptídeo, mas deve incluir (1) o tetrapeptídeo que tem um ou mais resíduos de ácidos aminados ligados quer ao seu terminal amino quer ao seu terminal carboxi, (2) o tetrapeptídeo que tem um ou mais resíduos de ácidos aminados ligados tanto ao seu terminal amino como ao seu terminal carboxi, (3) o tetrapeptídeo que não tem resíduos adicionais de ácidos aminados.
Uma vez que um ou mais fragmentos peptídicos adequados tenham sido sequenciados, as sequências de ADN capazes de codificá-los são examinadas. Devido a que o código genético é degenerado, mais do que um codão pode ser usado para codificar um ácido aminado particular (Watson, J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), pp. 356-357). Os fragmentos peptídicos são analisados a fim de identificar sequências de ácidos aminados que possam ser codificadas por oligonucleótidos que tenham o mais baixo grau de degenerescência. Isto é realisado de preferência por identificação de sequências que contenham ácidos aminados que são codificados sómente por um codão simples. Apesar de ocasionalmente tais sequências de ácidos aminados poderem ser codificadas só por um oligonucleótido simples, frequentemente a sequência de ácidos aminados pode ser codificada por um qualquer de um conjunto de oligonucleótidos semelhantes. É importante que, enquanto que todos os membros do conjunto contém oligonucleótidos que são capazes de codificar o fragmento peptídico e assim contém potencialmente a mesma sequência de nucleótidos que o gene que codifica para o fragmento peptídico, sómente um membro do conjunto contém a sequência de nucleótidos que é idêntica à sequência de nucleótidos deste grupo. Como este membro está presente dentro do conjunto e é capaz de hibridar para ADN mesmo em presença de outros membros do conjunto, é possível empregar o conjunto não fraccionado de oligonucleótidos do mesmo modo em que se empregaria um oligonucleotido simples para clonar o gene que codifica para o peptideo.
Dum modo exactamente análogo ao descrito acima, pode empregar-se um oligonucleótido (ou conjunto de oligonucleótidos) que tenha uma sequência de nucleótidos que é complementar à sequência de nucleótidos ou conjunto de sequências que é capaz de codificar para o fragmento peptídico.
Um oligonucleótido adequado ou conjunto de oligonucleótidos que é capaz de codificar para um fragmento do gene de ICAM-1 (ou que é complementar de um tal oligonucleótido ou conjunto de oligonucleótidos) é identificado (usando o procedimento acima descrito), sintetizado e hibridado, por meios bem conhecidos da especialidade, contra um ADN ou, de preferência, contra um preparado de ADNc derivado de células humanas que são capazes de expressar sequências de genes de ICAM-1. Técnicas de hibridação de ácidos nucleicos são apresentadas por Maniatis, T. et al., In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982) e por Haymes, B.D. et al., In: Nucleic acid Hybrization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), indicações estas que são aqui incorporadas por referência. A fonte de ADN ou de ADNc terá sido de preferência enriquecida para sequências de ICAM-1. Tal enriquecimento pode mais facilmente ser obtido a partir de ADNc obtido por extracção de ARN de células cultivadas sob condições que induzem a síntese de ICAM-1 (tal como U937 cultivadas em presença de ésteres de forbol, etc.).
Técnicas tais como ou semelhantes àquelas descritas acima têm sucessivamente permitido a clonagem de genes para dehidrogenases de aldeído humanas (Hsu, L.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 3771-3775 (1985)), fibronectina (suzuki, S. et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J. j4: 2519-2524 (1985), gene receptor de estrogénio humano (Walter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 7889-7893 (1985), activador de plasminogéno de tipo de tecido (Pennica, D. et al., Nature 301: 214-221 (1983)) e ADN complementar de fosfatase alcalina placentária de termo humana (kam, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 8715-8719 (1985)).
Numa via alternativa preferida de clonagem do gene de ICAM1, prepara-se um banco de vectores de expressão por clonagem de ADN ou de preferência de ADNc de uma célula capaz de exprimir ICAM-1 num vector de expressão. 0 banco é então submetido a selecção para membros capazes de expressar uma proteína que se liga ao anticorpo anti-ICAM-1 e que tem uma sequência de nucleótidos que é capaz de codificar para polipeptídeos que têm a mesma sequência de ácido aminados que a ICAM-1 ou fragmentos de ICAM-1.
gene de ICAM-1 cionado, obtido através dos métodos descritos atrás, pode ser operacionalmente ligado a um vector de expressão e introduzido em células bacterianas ou eucarióticas para produzir proteína ICAM-1. Técnicas para tais manipulações são apresentadas por Maniatis, et al., supra, e são bem conhecidas na especialidade.
D. Utilizações de Análises de Agregação Dependente de LFA-1
A análise descrita acima, capaz de medir a agregação dependente de LFA-1, pode ser utilizada para identificar agentes que actuam como antagonistas para inibir a extensão da agregação dependente de LFA-1. Tais antagonistas podem actuar destruindo a capacidade de LFA-1 ou de ICAM-1 para mediar a agregação. Assim, tais agentes incluem imunoglobulinas tal como um anticorpo capaz de ligação quer a LFA-1 quer a ICAM-1. Adicionalmente, agentes não-ímunoglobulina (i.e., químicos) podem ser examinados, usando a análise acima descrita, para determinar se são antagonistas da agregação de LFA-1.
«=»Ε. Utilizações de Anticorpos Capazes de Ligagão a Proteínas
Receptoras de ICAM-1
1. Agentes anti-inflamatórios
Os anticorpos monoclonais para membros do complexo CD 18 inibem muitas funções dependentes de adesão de leucócitos incluindo a ligação a endotélio Haskard, D., et al., J. Immunol. 137: 2901-2906 (1986)), adesões homotípicas (Rothlein, R., et al., J. Exp. Med. 163: 1132-1149 (1986)), proliferação induzida por antigenes e mitogenes de linfócitos (Davignon, D. et al·., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 4535-4539 (1981)), formação de anticorpos (Fischer, A., et al., J. Immunol. 136: 3198-3203 (1986)) e funções efectoras de todos os leucócitos tais como actividade lítica de células T citotóxicas (Krensky, A.M., et al., J. Immunol. 132: 2180-2182 (1984)), macrófagos (Strassman, G., et al., J. Immunol. 136: 4328-4333 (1986)) e todas as células envolvidas em reacções de citoxidade celular dependente de anticorpos (Kohl, S., et al., J. Immuno 1. 133: 2972-2978 (1984)). Em todas as funções referidas os anticorpos inibem a capacidade do leucócito de aderir ao substrato celular apropriado, o qual por seu turno inibe o resultado final.
Como discutido acima, a ligação de moléculas de ICAM-1 aos membros da familia LFA-1 de moléculas é de importância fundamental na adesão celular. Através do processo de adesão, os linfócitos são capazes de monitorizar de modo continuo um animal no que se refere à presença de antigenes estranhos. Apesar de estes processos serem normalmente desejáveis, eles são também a causa da rejeição no caso de transplantações de orgãos, de rejeição de enxertos de tecido e de muitas doenças autoimunes. Assim quaisquer meios capazes de atenuar ou inibir a adesão celular seriam altamente desejáveis em receptores de
transplantações de orgãos e de enxertos de tecidos ou em doentes autoimunes.
Os anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM-1 são altamente desejáveis como agentes anti-inflamatórios num indivíduo mamífero. Significativamente, tais agentes diferem do geral dos agentes anti-inflamatórios na circunstância de que eles são capazes de inibirem a inibição de modo selectivo e não oferecem outros efeitos secundários tais como netrotoxicidade que é encontrada com agentes convencionais. Os anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM-1 podem no entanto ser usados para prevenir a rejeição de orgãos ou tecidos, ou para modificar as respostas autoimunes sem o receio de tais efeitos secundários no indivíduo mamífero.
É importante notar que o uso de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer ICAM-1 pode permitir a realização de transplantes de orgãos mesmo entre indivíduos que tenham incoerência de HLA.
2. Supressores de Reacção Hipersensitiva de Tipo Retardado
Uma vez que as moléculas de ICAM-1 são expressas a maior parte das vezes em locais de inflamação, tais como aqueles sítios envolvidos em reacção hipersensitiva de tipo retardado, os anticorpos (especialmente os anticorpos monoclonais) capazes de ligação a moléculas de ICAM-1 têm potencial terapêutico na atenuação ou eliminação de tais reacções. Esta utilização do potencial terapêutico pode ser explorada por um qualquer de dois modos. Primeiro, uma composição contendo um anticorpo monoclonal contra ICAM-1 pode ser administrada ao paciente que tem reacção sensitiva de tipo retardado. Por exemplo, tais composições podem ser dadas a um indivíduo que tenha estado em contacto com antigenes tais como toxicoendro, sumagre venenoso, etc.. Na segunda concretização, o anticorpo monoclonal capaz de ligação a ICAM-1 é administrado a um doente em conjunto com um antigene a fim de evitar uma reacção inflamatória subsequente. Assim, a coadministração de um antigene e de um anticorpo monoclonal de ligação a ICAM-1 podem tornar temporariamente um indivíduo tolerante para a subsequente apresentação de um tal gene.
3. Terapêutica para Doenças Inflamatórias Crónicas
Uma vez que pacientes com LAD desprovidos de LFA-1 não dão uma resposta inflamatória, acredita-se que o antagonismo do ligante natural de LFA-1, também inibirá uma resposta inflamatória. A capacidade de anticorpos contra ICAM-1 para inibir a inflamação fornece a base para o seu uso terapêutico no tratamento de doenças inflamatórias crónicas e doenças autoímunes, tal como lupus eritematoso, tiroidite autoímune, encefalomielite alérgica experimental (EAE), esclerose múltipla, algumas formas de sindroma de Reynaud diabético, artrite reumetóide, etc.. No geral, os anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM-1 podem ser utilizados no tratamento daquelas doenças correntemente tratadas através de terapia com esteróides.
4. Aplicações em diagnóstico e prognóstico detectados afinidade
Uma vez que a ICAM-1 é expressa principalmente em locais de inflamação, os anticorpos monoclonais capazes de ligação a ICAM1 podem ser empregues como um meio de dar imagem ou visualizar os locais de infecção e de inflamação num paciente. Em tal utilização, os anticorpos monoclonais são marcados para serem através do uso de radioisótopos, marcações de (tal como biotina, avidina, etc.) marcações fluorescentes, átomos paramagnéticos, etc.. Os procedimentos para realizar tal marcação são conhecidos na especialidade. A aplicação clínica de anticorpos para fornecer imagem para diagnóstico são revistos por Grossman, H.B., Urol. Clin, North
Amer. 13: 465-474 (1986), Unger, E.C., et al., Invest. Radiol.
20: 693-700 (1985) e Khaw, B.A., et al·., Science 209: 295-297 (1980).
A presença de inflamação pode ser também detectada através do uso de ligantes de junção tais como ARNm, ADNc ou ADN que se ligue às sequências do gene de ICAM-1 ou às sequências do ARNm de ICAM-1 de células que expressam ICAM-1. As técnicas para realizar tais análises de hibridação são descritas por Maniatais, T. (supra).
A detecção de focos de tais anticorpos marcados de forma detectável é indicativa de um local de inflamação ou de desenvolvimento de tumor. Numa forma de concretização, este exame de inflamação é feito por remoção de amostras de tecido ou sangue e incubação de tais amostras na presença de anticorpos marcados de forma detectável. Numa forma de concretização preferida, esta técnica é feita dum modo não invasivo através do uso de desenvolvimento magnética de imagem, de fluorografia, etc.. Um tal teste de diagnóstico pode ser empregue na monitorização em receptores de transplante de orgãos de sinais precoces de potencial rejeição. Tais análises podem também ser conduzidas em tentativas para determinar uma propensão pessoal para a artrite reumatóide ou outras doenças inflamatórias crónicas.
5. Adicional para a Introdução de Material Antigénico
Administrado com Intenções Terapêuticas ou de Diagnóstico
As respostas imunes a agentes terapêuticos ou de diagnóstico tais como, por exemplo, insulina de bovino, interferão, aetivador de plasminogéneo de tipo de tecido ou anticorpos
monoclonais de murino prejudicam substancialmente o valor da terapêutica ou do diagnóstico de tais agentes e podem de facto causar doenças tal como a doença do soro. Uma tal situação pode ser remediada através do uso dos anticorpos da presente invenção. Nesta concretização, tais anticorpos poderiam ser administrados em combinação com o agente terapêutico ou de diagnóstico. A adição de anticorpos evita que o receptor reconheça o agente, e além disso evita que o receptor de dar início a uma resposta imune contra este agente. A falta de uma tal resposta imune resulta na capacidade do paciente para receber administrações adicionais do agente terapêutico ou de diagnóstico.
F. Utilizações da Molécula-1 de Adesão Intercelular (ICAM-1)
A ICAM-1 é um parceiro de ligação de LFA-1. Como tal, a ICAM-1 ou os seus derivados funcionais podem ser empregues por permuta com anticorpos capazes de ligação a LFA-1 no tratamento da doença. Assim, na forma solubilizada, tais moléculas podem ser empregues para inibir uma inflamação, uma rejeição de orgão, uma rejeição de enxerto, etc.. A ICAM-1 ou os seus derivados funcionais podem ser usados da mesma maneira que anticorpos anti-ICAM para diminuir a imunogeneicidade de agentes terapêuticos ou de diagnóstico.
A ICAM-1, os seus derivados funcionais e os seus antagonistas podem ser usados para bloquear as metásteses ou a proliferação de células de tumor que expressam quer ICAM-1 quer LFA-1 nas suas superfícies. Podem ser usados variados métodos para realizar tal objectivo. Por exemplo, a migração de células hematopoiéticas requer a ligação LFA-l-ICAM-1. Os antagonistas de tal ligação contudo suprimem esta migração e bloqueiam a metástese de células de tumor da linhagem de leucócitos. Em alternativa, moléculas de toxina derivatizada capazes de ligação quer de ICAM-1 quer de um membro da família de moléculas LFA-1 podem ser administradas ao paciente. Quando tais moléculas de toxina derivatizada se ligam a células de tumor que expressam ICAM-1 ou um membro da família de moléculas LFA-1, a presença da toxina mata a célula de tumor deste modo inibindo a proliferação do tumor.
G. Utilizações de Antagonistas de Não-Imunoglobulina de Adesão dependente de IGAM-1
A adesão dependente de ICAM-1 pode ser inibida por antagonistas de não-imunoglobulina que são capazes de ligação quer a ICAM-1 quer a LFA-1. Um exemplo de um antagonista nãoimunoglobulina de ICAM-1 é LFA-1. Um exemplo de um antagonista não-imunoglobulina que se liga a LFA-1 é ICAM-1. Através do uso das análises acima descritas podem ser identificados e purificados antagonistas não-imunoglobulina adicionais. Os antagonistas não-imunoglobulina de adesão dependente de ICAM-1 podem ser usados com o mesmo fim que os anticorpos para LFA-1 ou que os anticorpos para ICAM-1.
H. Adiministração das Composições da Presente Invenção
Os efeitos terapêuticos da ICAM-1 podem ser obtidos proporcionando a um paciente a molécula de ICAM-1 inteira ou quaisquer fragmentos peptídicos terapeuticamente activos de ICAM-1.
A ICAM-1 e os seus derivados funcionais podem ser obtidos quer por via sintética, mediante a utilização de tecnologia recombinante, ou por via proteolítica. As vantagens terapêuticas da ICAM-1 podem ser aumentadas através do uso de derivados funcionais de ICAM-1 que possuam ácidos aminados adicionais integrados a fim de facilitar o acoplamento a um suporte ou a fim de aumentar a actividade da ICAM-1. 0 âmbito da presente invenção inclui ainda os derivados funcionais da ICAM-1 a que faltam alguns resíduos de ácidos aminados ou que contêm resíduos de ácidos aminados alterados sempre que estes derivados apresentem a capacidade de afectar a adesão celular.
Tanto os anticorpos da presente invenção como a molécula de ICAM-1 descritos na presente especificação são classificados como substancialmente isentos de contaminantes naturais se os preparados que os contêm estão substancialmente isentos dos materiais com que estes produtos são normalmente encontrados no estado natural.
A presente invenção abrange os anticorpos e os fragmentos biologicamente activos de anticorpos (sejam policlonais ou monoclonais) que têm capacidade de se ligarem a ICAM-1. Estes anticorpos podem ser produzidos por um animal, por cultura de tecidos ou por técnicas de ADN recombinante.
Ao administrar a um paciente os anticorpos ou os respectivos fragmentos com capacidade de ligação a ICAM-1 ou ao administrar ICAM-1 (ou um seu fragmento, variante ou derivado) a um paciente, a dose do agente administrativo variará de acordo com factores como a idade, o peso, a altura, o sexo, a condição clínica geral, a história médica anterior, etc. do paciente. Em geral é desejável proporcionar ao paciente uma dosagem de anticorpo que esteja na gama de desde cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg (de peso corporal do paciente), se bem que se possa administrar uma dosagem inferior ou superior. Para proporcionar moléculas de ICAM-1 ou dos seus derivados funcionais a um paciente é preferível administrar estas moléculas numa dosagem que se estende desde cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg (de peso corporal do paciente) , se bem que possa ser administrada uma dosagem inferior ou superior. Conforme discutido seguidamente, a dose terapêutica eficaz pode ser reduzida se o anticorpo antiICAM-1 é administrado conjuntamente com um anticorpo anti-LFA-1. Na presente memória descritiva dois anticorpos (ou os seus derivados funcionais são considerados como administrados conjuntamente a um paciente se são administrados ao paciente com uma proximidade temporal de tal ordem que é possível detectar ambos os compostos no soro do paciente.
Tanto o anticorpo capaz de ligação a ICAM-1 como a própria ICAM-1 podem ser administrados aos pacientes por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, entérica ou parentérica. Quando se administra o anticorpo ou a ICAM-1 por injecção, a administração pode ser por perfusão contínua ou por injecções isoladas numa única ou em várias doses.
Os agentes anti-inflamatórios da presente invenção destinamse a ser proporcionados aos indivíduos receptores numa quantidade suficiente para suprimir a inflamação. Diz-se que uma quantidade é suficiente para suprimir a inflamação se a dosagem, a via de administração, etc., do agente são suficientes para atenuar ou evitar a inflamação.
O anticorpo anti-ICAM-1, ou um seu fragmento, pode ser administrado quer isoladamente quer em combinação com um ou vários agentes imuno-supressores adicionais (especialmente para um receptor de uma transplantação de um orgão ou de tecido) . A administração de tais composto(s) pode ser realizada com intenção profilática ou terapêutica. Quando proporcionado(s) com finalidade profilática, o(s) composto(s) imuno-supressores são proporcionados antes de qualquer resposta inflamatória ou sintoma (por exemplo, antes de, durante ou imediatarnente depois) do momento de uma transplantação de um orgão ou de tecido mas antes de quaisquer sintomas de rejeição do orgão). A administração profilática do(s) composto(s) serve para prevenir ou atenuar qualquer resposta inflamatória subsequente (tal como, por exemplo, rejeição de um orgão ou tecido transplantado, etc.). Quando proporcionado com finalidade terapêutica o(s) composto(s) imuno-supressores são fornecidos durante (ou imediatarnente depois) do início de um sintoma de inflamação já manifesto (tal como, por exemplo, rejeição de um orgão ou de tecido). A administração terapêutica de um composto(s) serve para atenuar qualquer inflamação já manifesta (tal como, por exemplo, a rejeição de um orgão ou de tecido transplantado).
Os agentes anti-inflamatórios da presente invenção podem, deste modo, ser fornecidos quer antes do início de uma inflamação (de modo a suprimir uma inflamação prevista) ou depois do início da inflamação.
Diz-se que a composição é farmacologicamente aceitável se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. Diz-se que um tal agente está numa quantidade terapeuticamente aceitável se a quantidade administrada é fisiologicamenté significativa. Um agente é fisiologicamenté significativo se a sua presença resulta numa mudança detectável na fisiologia de um paciente recipiente.
As moléculas de anticorpo e de ICAM-1 da presente invenção podem ser incorporadas em formulações de acordo com técnicas conhecidas para a preparação de composições farmacêuticas úteis, combinando estes materiais ou os seus derivados funcionais numa mistura com uma substância veicular farmaceuticamente activa. As substâncias veiculares adequadas e a respectiva formulação, tais como de outras proteínas humanas, por exemplo albumina de soro
humano, são descritas, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1980)). A fim de formar uma composição farmaceuticamente aceitável adequada para a administração eficaz, tais composições deverão conter uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-ICAM-1 ou da molécula de ICAM-1 ou dos seus derivados funcionais juntamente com uma quantidade adequada de uma substância veicular.
Podem ser utilizadas outras técnicas farmacêuticas para regular a duração da acção. As preparações de libertação regulada podem ser conseguidas mediante o uso de polímeros para complexar ou para absorver o anticorpo anti-ICAM-1 ou a ICAM-1 ou os seus derivados funcionais. A libertação regulada pode ser conseguida por selecção das macromoléculas adequadas (por exemplo poliésteres, poliácidos aminados, polivinilpirrolidona, acetato de etilenovinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose ou sulfato de protamina) e da concentração das macromoléculas bem como dos métodos de incorporação a fim de regular a libertação. Outro método possível para regular a duração da acção por meio de preparados de libertação regulada consiste em incorporar as moléculas do anticorpo anti-ICAM-1 ou de ICAM-1 ou dos seus derivados funcionais em partículas de um material polimérico tal como poliésteres, poliácidos aminados, hidrogéis, ácido poliláctico ou copolímeros de etileno-acetato de vinilo. Em alternativa, em vez de incorporar estes agentes em partículas poliméricas, é possível aprisionar estes materiais em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo em microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e em microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, ou em sistemas de libertação de produtos farmacêuticos sob forma coloidal, por exemplo lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas ou em macroemulsões. Tais técnicas Pharmaceutical Sciences (1980)
Uma vez descrita de um modo geral a invenção, esta será mais facilmente compreendida por referência aos exemplos que se seguem, os quais são apresentados com a finalidade de ilustrarem a presente invenção e não devem ser considerados como limitando o seu âmbito, a menos que tal seja especificado.
EXEMPLO 1
Células de Mamíferos em Cultura
Geralmente, as células transformadas por EBV e os hibridomas da presente invenção foram mantidos em meio de cultura RMPI 1640, suplementado com L-glutamina 20 mM, 50 gg/ml de gentamicina, e soro fetal de bovino a 10% (ou fetal de vitela) . As células foram cultivadas a 37 °C numa atmosfera de ar com 5% de CO2 e de 95% de humidade.
Para estabelecer transformantes de vírus de Epstein-Barr (EBV) foram incubadas durante 16 horas 106 células T extraídas de células mononucleares de sangue periférico/ml em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal de vitela (FCS) e 50 pg/ml de gentamicina com sobrenadantes contendo EBV de células B95-8 (Thorley-Lawson, D.A. et al., J. Exper. Med. 146: 495 (1977)). Foram colocadas células em alíquotas de 0,2 ml em 10 alvéolos de uma placa de microtitulação. O meio foi substituído por meio RPMI 1640 (suplementado com 20% de soro fetal de vitela e 50 pg/ml de gentamicina) até se verificar o crescimento das células. As células cresceram na maioria dos alvéolos e foram expandidos no mesmo meio. Estabeleceram-se blastos de fito39 hemaglutinina (PHA) a IO6 células/ml em meio RPMI 1640 (suplementado com 20% de soro fetal de vitela) contendo uma diluição de 1:800 de PHA-P (Difco Laboratories, Inc., Detroit,
MI) . Expandiram-se linhas | de PHA com | meio | condicionado | com |
interleuquina 2 (IL-2) e | reforçaram-se | semanalmente com | PHA | |
(Cantrell, D.A. et al., J. | . Exper. Med. | 158: | 1895 (1983)) | . 0 |
processo acima descrito foi divulgado por Springer, T. et al., J. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984), cuja referência se encontra aqui incorporada por referência. As células obtidas por meio do processo acima descrito são então seleccionadas com anticorpos anti-LFA-1 a fim de determinar se expressam os antigenes LFA-1. Tais anticorpos foram descritos por SanchezMadrid, F. et al., J. Exper. Med. 158: 1785 (1983).
EXEMPLO 2
Análises de Agregação e Adesão Celular
A fim de avaliar a extensão da adesão celular, foram usadas análises de agregação. As linhas de células usadas em tais análises foram lavadas duas vezes com meio de RPMI 1640 contendo tampão de Hepes 5 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis) e foram ressuspendidas a uma concentração de células/ml de 2xl06. Adicionaram-se 50 μΐ de sobrenadantes de anticorpos monoclonais apropriados ou 50 μΐ de meio completo com ou sem anticorpos monoclonais purificados, 50 μΐ de meio completo contendo 200 ng/ml do éster de forbol miristato-acetato de forbol (PMA) e 100 μΐ de células a uma concentração de 2xl06 células/ml em meio completo a placas de microtitulação de 96 alvéolos de fundo raso (N°. 3596; Costar, Cambridge, MA) . Deste modo foi obtida uma ng/ml de PMA as concentração final de 50 células/alvéolo. Deixou-se e 2x10 de sedimentarem células espontaneamente e o grau de agregação foi marcado após períodos de tempo variados. Os resultados variaram de 0 a 5+, onde 0 indicava que essencialmente nenhuma célula estava em aglomerados; 1+ indicava que menos de 10% das células estavam em agregados; 2+ indicava que menos de 50% das células estavam agregados; 3+ indicava que até 100% das células estavam em pequenos aglomerados soltos; 4+ indicava que até 100% das células se tinham agregado em aglomerados maiores; e 5+ indicava que 100% das células estavam em agregados grandes muito compactos. A fim de obter uma estimativa mais precisa da adesão celular, adicionaram-se os reagentes e as células a tubos de poliestireno de 5 ml, na mesma ordem acima descrita. Os tubos foram colocados numa placa de um agitador orbital a 37°C. Após 1 hora a aproximadamente 200 rpm introduziram-se 10 μΐ da suspensão celular num hemocitómetro e o número de células livres foi determinado. Determinou-se a percentagem de agregação pela seguinte equação:
número de células livres % agregação = 100 x (1- -------------------------------) número de células introduzidas
O número de células introduzidas na fórmula acima é o número de células por ml num tubo de comparação contendo apenas células e meio completo que não foi incubado. O número de células livres na equação anterior é igual ao número de células não agregadas por ml dos tubos da experiência. Os processos acima foram descritos por Rothlein, R., et al., J. Exper. Med. 163: 11321149 (1986).
EXEMPLO 3
LFA-1 Agregação Celular Dependente
A análise qualitativa de agregação descritiva no Exemplo 2 foi efectuada usando a linha de células JY transformada por Epstein-Barr. Por adição de PMA ao meio de cultura nas placas de microtitulação, verificou-se a agregação das células. Gravações vídeo efectuadas durante o decurso do processo mostraram que as células JY no fundo dos alvéolos da placa de microtitulação eram móveis e apresentavam membranas activas enrugadas e movimentos de pseudopódios. 0 contacto entre os pseudopódios de células vizinhas resultava muitas vezes em aderência célula-célula. Quando a aderência era mantida, a região de contacto celular deslocava-se para o urópode. Era possível manter o contacto, apesar dos movimentos vigorosos da célula e da tracção das células em direcções opostas. A diferença primária entre células tratadas por PMA e células não tratadas parecia estar na estabilidade destes contactos, uma vez formados. Com PMA, os agregados de células desenvolveram-se, crescendo em tamanho à medida que células adicionais aderiam à sua periferia.
Como segundo meio de medição da adesão, usou-se a análise quantitativa descrita no Exemplo 2. Agitaram-se suspensões de células a 200 rpm durante 2 horas, transferiram-se para um hemocitómetro e contaram-se as células que não estavam agregadas. Na ausência de PMA, 42% (D.P. = 20%, N = 6) de células JY encontravam-se em agregados após 2 horas, enquanto que células JY incubadas em condições idênticas com 50 ng/ml de PMA tinham 87% (D.P. = 8%, N = 6) das células em agregados.
Estudos cinéticos de agregação mostraram que o PMA aumentava a velocidade e a grandeza da agregação em todos os períodos de tempo ensaiados (Figura 3).
EXEMPLO 4
Inibição de Agregação das Células Usando Anticorpos Monoclonais Anti-LFA-1
A fim de examinar os efeitos de anticorpos monoclonais antiLFA-1 na agregação celular induzida por PMA, estes anticorpos foram adicionados a células incubadas, de acordo com a análise de agregação qualitativa do Exemplo 2. Verificou-se que os anticorpos monoclonais inibiam a formação de agregados de células, quer na presença quer na ausência de PMA. Tanto o fragmento F(ab')2 como o Fab' de anticorpos monoclonais contra a cadeia alfa de LFA-1 foram capazes de inibir a agregação celular. Enquanto que essencialmente 100% das células formaram agregados na ausência de anticorpo anti-LFA-1, verificou-se que menos de 20% das células estavam em agregados quando se adicionou o anticorpo. Os resultados desta experiência foram descritos por Rothlein, R. et al.,(J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)).
EXEMPLO 5
O Receptor LFA-1 é Necessário para a Agregação Celular
Foram preparadas células linfoblastóides transformadas por EBV de doentes, do modo descrito no Exemplo 1. Estas células foram verificadas por meio de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer LFA-1 e constatou-se que as células eram deficientes em LFA-1.
A análise qualitativa de agregação descrita no Exemplo 2 foi utilizada, usando as células deficientes em LFA-1 acima células não agregar-se descritas. Estas células não conseguiram, espontaneamente, mesmo na presença do PMA.
EXEMPLO 6
A Descoberta de ICAM-1
As células deficientes em LFA-1 do Exemplo 5, foram marcadas com diacetato de carboxifluoresceina (Patarroyo, M. et al., Cell Immunol. 63: 237-248 (1981)). As células marcadas foram misturadas numa proporção de 1:10 com células autólogas ou JY e a percentagem de células marcadas com fluoresceína em agregados foi determinada de acordo com o processo de Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986). Verificou-se que as células deficientes em LFA-1 eram capazes de se co-agregar com células que expressavam LFA-1 (Figura 4).
A fim de determinar se o LFA-1 era importante apenas na formação de agregados ou na sua manutenção, foram adicionados aos agregados já formados anticorpos capazes de se ligarem ao LFA-1 acima descritos. Verificou-se que a adição de anticorpos desfazia fortemente a agregação realizada. Gravações de vídeo efectuadas durante o decurso do processo confirmaram que a adição dos anticorpos monoclonais para agregados já formados começava a causar disrupção ao fim de 2 horas (Quadro 1) . Após adição de anticorpos monoclonais contra LFA-1, os movimentos pseudopódicos e as mudanças na forma das células individuais nos agregados continuavam inalterados. As células individuais dissociaram-se gradualmente a partir da periferia do agregado; ao fim de oito horas, a maioria das células estava dispersa. Na gravação vídeo do processo, a separação de agregados formados por anticorpos monoclonais LFA-1, parecia equivalente ao
processo de agregação na ausência de anticorpo monoclonal LFA-1 em sentido contrário.
QUADRO 1
Capacidade de Anticorpos Monoclonais Anti-LFA-1 para Separar
Agregados já Formados de Células JY Induzidas por PMA | |||
Exp. | 2 ha | Contagem de Agregação | |
1 h | |||
-mAb | -mAb | ||
1 | 4 + | 4 + | l+b |
2 | 3+ | 4 + | l+c |
3 | 5+ | 5+ | l+d |
A agregação | na análise qualitativa | em placa de | microtitulação |
foi avaliada visualmente. Com anti-LFA-1 presente durante o período de análise, a agregação foi menor que 1+
a. Grau de agregação imediatamente antes da adição de anticorpo monoclonal ao fim de 2 horas.
b. Tsl/18 + Tsl/22.
c. Tsl/18.
d. Tsl/22.
EXEMPLO Ί
Necessidade de Iões Divalentes para Agregação Dependente de LFA-1
As adesões dependentes de LFA-1 entre células T citotóxicas e células visadas requerem a presença de magnésio (Martz, E. J. Cell. Biol. 84: 584-598 (1980)). A agregação de células JY induzida por PMA foi experimentada para verificação de dependência de catiões divalente. As células JY não conseguiram agregar-se (usando a análise do Exemplo 2) em meio isento de iões de cálcio ou magnésio. A adição de magnésio divalente promoveu a agregação a concentrações tão baixas como 0,3 mM. A adição de iões de cálcio, por si só, teve pouco efeito. Verificou-se, no entanto, que os iões de cálcio aumentavam a capacidade de os iões de magnésio promoverem a agregação induzida por PMA. Quando se adicionaram iões de cálcio a 1,25 mM ao meio, verificou-se que concentrações de iões de magnésio tão baixas como 0,02 milimolares, promoviam a agregação. Estes dados mostram que a agregação de células dependente de LFA-1 necessita de iões de magnésio e que iões de cálcio, embora insuficientes por si só, podem ter um efeito sinergético com os iões de magnésio, de modo a permitir a agregação.
EXEMPLO 8
O Isolamento de Células de Hibridoma Capazes de Expressar Anticorpos Monoclonais Anti-ICAM-1
Isolaram-se anticorpos monoclonais capazes de se ligar ao ICAM-1 de acordo com o método de Rothlein, R. et al., J. Immuno1. 137: 1270-1274 (1986), cuja referência se considera aqui incorporada por referência. Deste modo, imunizaram-se
intraperitonealmente 3 ratos BALB/C, com células mononucleares de sangue periférico transformadas por EBV de um indivíduo deficiente em LFA-1 (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160: 1901 (1984)) . Foram usadas aproximadamente 107 células em 1 ml de meio RPMI 1640 para cada imunização. As imunizações foram administradas 45, 29 e 4 dias antes das células de baço terem sido removidas dos ratos, a fim de produzirem as linhas de células de hibridomas desejadas. No terceiro dia, antes da remoção das células de baço, foi dado aos ratos um adicional de 107 células em 0,15 ml de meio (por via intravenosa).
Fundiram-se células de baço isoladas a partir dos animais acima descritos com células de mieloma P3X73Ag8.653 numa proporção de 4:1, de acordo com o protocolo de Galfre, G. et al., Nature 266: 550 (1977). Introduziram-se alíquotas das células de hibridoma resultantes numa placa de microtitulação de 96 alvéolos. Os sobrenadantes do hibridoma foram seleccionados com respeito à inibição de agregação e um hibridoma inibidor (de mais de 600 alvéolos testados) foi cionado e subclonado por diluição limitante. Este subclone foi designado Rrl/1. 1.1. (seguidamente designado Rrl/1).
Verificou-se que o anticorpo monoclonal Rrl/1 inibia de modo regular a agregação estimulada por PMA da linha de células JY que expressa LFA-1. O anticorpo monoclonal Rrl/1 inibia a agregação no mesmo grau ou ligeiramente menos que alguns anticorpos monoclonais das sub-unidades alfa ou beta de LFA-1. Pelo contrário, o anticorpo monoclonal de comparação contra MLA, que se expressa abundantemente em células JY, não inibiu a agregação. O antigene ligado pelo anticorpo monoclonal Rrl/1 é definido como molécula-1 de adesão intercelular (interceluiar adhesion molécula-1 - ICAM-1).
EXEMPLO 9
Uso de Anticorpos Monoclonais Anti-ICAM-1 para Caracterizar a Molécula de ICAM-1
A fim de determinar a natureza de ICAM-1 e, particularmente, para determinar se a ICAM-1 era diferente de LFA-1, foram imunoprecipitadas proteínas celulares, usando o anticorpo monoclonal Rrl/1. A imunoprecipitação foi realizada de acordo com o método de Rothlein, R. et al., (J. Immunul 137: 1270-1274 (1986)). Lisaram-se células JY a 5 χ 107 células/ml em Triton X100 a 1%, NaCL 0,14 m, Tris 10 mM a pH 8,0, com fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, recentemente adicionado e 0,2 unidades por ml de aprotinina inibidora de tripsina (mistura de lise) durante 20 minutos a 4°C. Centrifugaram-se os lisados a 10 000 x g durante 10 minutos e realizou-se um tratamento prévio para tornar a solução límpida com 50 μΐ de uma suspensão a 50% de CNBr activado e C1-4B de Sefarose temperada com glicina durante 1 hora a 4°C. Imunoprecipitou-se um mililitro de lisado com 20 μΐ de uma suspensão a 50% do anticorpo monoclonal Rrl/1 ligado de um dia para o outro a Sefarose C1-4B (1 mg/ml), a 4°C (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160: 1901 (1984)). 0 anticorpo monoclonal ligado a Sepharose foi preparado usando activação por CNBr de Sepharose CL-4B em tampão de carbonato, de acordo com o método de March, S. et al., (Anal. Biochem. 60: 149 (1974) ) . Submeteram-se imunoprecipitados lavados a SDS-PAGE e coloração por prata, de acordo com o processo de Morrissey, J.H. Anal. Biochem. 117: 307 (1981).
Após diluição das proteínas com tampão de amostra de SDS (Ho, M.K. et al., J. Biol. Chem. 258: 636 (1983)) a 100°C, as amostras foram divididas ao meio e submetidas a electroforese (SDS-8% PAGE) sob condições redutoras (Figura 5A) ou não redutoras (Figura 5B). As bandas com pesos moleculares de 50 kd e 25 kd correspondiam às cadeias pesada e leve de imunoglobulinas da Sepharose com anticorpo monoclonal (Figura 5A, pista 3) . Foram também observadas quantidades variáveis de outras bandas, na gama de pesos de 25 a 50 kd, mas não foram vistos em precipitados de células leucémicas reticuloendoteliais, que abrangiam apenas uma banda de peso molecular de 90 kd. Verificou-se que a sub-unidade alfa de 177 kd e a sub-unidade beta de 95 kd de LFA-1 migravam de modo diferente da ICAM-1 sob condições redutoras (Figura 5A, pista 2) e não redutoras (Figura 5B, pista 2).
A fim de determinar o efeito de anticorpo monoclonal Rrl/1 na agregação de linfoblastos PHA, usou-se a análise de agregação quantitativa descrita no Exemplo 2. Deste modo, estimularam-se células blásticas de células T durante 4 dias, com PHA, lavaramse cuidadosamente e em seguida cultivaram-se durante 6 dias na presença de meio condicionado por IL-2. Verificou-se que a PHA era interiorizada durante esta cultura de 6 dias e não contribuía para a análise de agregação. Em três análises diferentes, com diferentes preparações de blastos de células T, os anticorpos monoclonais ICAM-1 inibiram regularmente a agregação (Quadro 2).
QUADRO 2
Inibição pelo Anticorpo Monoclonal Rrl/1 de Agregação de Linfoblastos de PHA Estimulados por PMA
% | % | |||
Exp. | PMA | ACM | de agregação de inibiçãob | |
lc | Control | 9 | ||
+ | Control | 51 | 0 | |
+ | HLA-A, B | 58 | -14d | |
+ | LFA-1 alpha | 31 | 39 | |
+ | ICAM-1 | 31 | 39 | |
2e | - | Control | 10 | - |
+ | Control | 78 | 0 | |
+ | LFA-1 beta | 17 | 78 | |
+ | ICAM-1 | 50 | 36 | |
3f | - | - | 7 | |
+ | Control | 70 | ||
+ | HLA-A, B | 80 | -14 | |
+ | LFA-3 | 83 | -19 | |
+ | LFA-1 alpha | 2 | 97 | |
+ | LFA-1 beta | 3 | 96 | |
+ | ICAM-1 | 34 | 51 | |
a. A | agregação de | linfoblastos | induzidos | por PHA, estimulada |
com 50 ng/ml | de PMA, foi | avaliada | indirectamente por |
contagem microscópica do número de células não agregadas, como se descreve no Exemplo 2.
b. Inibição percentual relativa a células tratadas com PMA e anticorpo monoclonal X63.
c. A agregação foi medida 1 hora após a adição simultânea de anticorpo monoclonal e de PMA. As células foram agitadas a 175 rpm.
d. Um número negativo indica realce percentual de agregação.
e. A agregação foi medida 1 hora após a adição simultânea de anticorpo monoclonal e de PMA. As células foram separadas por centrifugação a 200 x G durante 1 minuto, incubadas a
37°C por 15 minutos, ressuspensas cuidadosamente e agitadas durante 45 minutos a 100 rpm.
f. Trataram-se previamente as células com PMA durante 4 horas a 37°C. Após a adição de anticorpo monoclonal, os tubos foram incubados a 37°C estacionariamente por 20 minutos e agitados a 75 rpm durante 100 minutos.
Os anticorpos monoclonais de LFA-1 eram, consequentemente, maia inibidores do que os anticorpos monoclonais de ICAM-1, enquanto que os anticorpos monoclonais de HLA-A, B e LFA-3 não tinham qualquer efeito. Estes resultados indicam que, dos anticorpos monoclonais testados, apenas os capazes de se ligar a LFA-1 ou a ICAM-1 eram capazes de inibir adesão celular.
EXEMPLO 10
Preparação de Anticorpo Monoclonal de ICAM-1
Imunização
Um rato BALB/C foi imunizado por via intraperitoneal (i.p.) com 0,5 ml de 2 χ 107 de células JY em meio de RPMI durante 103 dias e 24 dias antes da fusão. No quarto e terceiro dias antes da fusão, imunizaram-se ratos i.p. com 107 de células U937 diferenciadas por PMA em 0,5 ml de meio de RPMI.
Diferenciação de células U937
As células U937 (ATCC CRL-1593) foram diferenciadas por incubação a 5 x 105/ml em RPMI com 10% de soro fetal de bovino, 1% de glutamicina e 50 pg/ml de gentamicina (meio completo) contendo 2 ng/ml de 12-miristato-acetato de forbol (PMA) num recipiente estéril de polipropileno. No terceiro dias desta incubação, metade do volume de meio foi removido e substituído com meio completo fresco contendo PMA. No quarto dia as células foram separadas, lavadas e preparadas para imunização.
Fusão
Fundiram-se células de baço de ratos imunizados com células de mieloma P3 x 63 Ag8-653 numa proporção de 4:1 de acordo com Galfre et al. (Nature 266:550 (1977)). Após a fusão, inocularamse as células numa placa de microtitulação de 96 alvéolos de fundo raso a 105 células de baço/alvéolos.
Selecção de células positivas anti-ICAM-1
Após uma semana, submeteram-se 50 μΐ do sobrenadante à análise de agregação qualitativa do Exemplo 2, usando JY e SKW-3 como linhas de células agregantes. Seleccionaram-se as células dos sobrenadantes que inibiam a agregação de células JY mas não SKW-3 e clonaram-se estas células duas vezes utilizando diluição limitante.
Esta experiência teve como resultado a identificação e a clonagem de três linhas separadas de hibridoma, que produziam anticorpos monoclonais anti-ICAM-1. Os anticorpos produzidos por estas linhas de hibridoma eram IgG2a, IgG2b e IgM, respectivamente. À linha de células de hibridoma que produzia o anticorpo anti-ICAM-1 IgG2a, foi dada a designação de R6'5'D6'E9'B2. O anticorpo produzido pela linha de células de hibridoma preferida foi designado por R6'5'D6'E9'B2 (aqui referido como R6-5-D6).
EXEMPLO 11
Expressão e Regulação de ICAM-1
A fim de se calcular a expressão ICAM-1, desenvolveu-se uma análise radioimunológica. Nesta análise, foi iodado Rrl/1 purificado, usando iodogénio a uma actividade específica de 10 uCi/gg. Cultivaram-se células endoteliais em placas de 96 alvéolos e trataram-se como se descreve para cada experiência. As placas foram arrefecidas a 4°C, colocando-as num compartimento frio durante 0,5 a 1 hora e não imediatamente em gelo. As monocamadas foram lavadas 3 vezes com meio completo frio e depois incubadas 30 minutos a 4°C com 125I RR1/1. As monocamadas foram então lavadas 3 vezes com meio completo. O 125I ligado foi liberto, usando NaOH 0,1 N, e medido. A actividade específica de 125I RR1/1 foi ajustada, usando RR1/1 não marcado para obter um sinal linear acima do nível de densidades de antigene encontrado neste estudo. Foi determinada a ligação não específica na presença de excessos de milhares de vezes de RR1/1 não marcados e esta ligação não específica foi subtraída da ligação total para se obter a ligação específica.
À expressão de ICAM-1 medida usando a análise radioimunológica acima descrita, é aumentada nas células endoteliais da veia umbilical humana (CEVUH) e nas células endoteliais da veia safena humana (CEVSH), por IL-1, TNF, LPS e IFN gama (Quadro 3). As células endoteliais da veia safena foram usadas neste estudo para confirmar os resultados das células endoteliais da veia umbilical em células endoteliais da veia cava inferior em cultura derivada de tecido adulto. A expressão básica de ICAM-1 é 2 vezes mais alta nas células endoteliais daa veia safena do que nas células endoteliais da veia umbilical. A exposição de células endoteliais da veia umbilical a IL-1 alfa recombinante, IL-1 beta e TNF gama, aumenta a expressão de ICAM53
10 a 20 vezes. 11-1 alfa, TNF e LPS foram os indutores mais potentes e IL-1 foi menos potente numa base de peso e também a concentrações saturantes para a resposta (Quadro 3). IL-1 beta a 100 ng/ml aumentou a expressão de ICAM-1 9 vezes mais na CEVUH e 7,3 vezes mais na CEVSH, com metade do aumento máximo ocorrendo a 15 ng/ml. 0 rTNF a 50 ng/ml, aumentou a expressão de ICAM-1 16 vezes mais na CEVUH e 11 vezes mais na CEVSH com metade dos efeitos máximos a 0,5 ng/ml. O interferão gama produziu um aumento significativo na expressão de ICAM-1, de 5,2 vezes mais no CEVUH ou 3,5 vezes mais no CEVSH, a 10 000 U/ml. O efeito de LPS a 10 μg/ml era semelhante em grandeza ao do rTNF. Combinações paralelas destes mediadores tiveram como resultado efeitos aditivos ou levemente menos do que aditivos na expressão de ICAM-1 (Quadro 3). A titulação cruzada de rTNF com rIL-1 beta ou rINF gama não mostrou sinergismo entre estes, a concentrações sub-óptimas ou óptimas.
Uma vez que o LPS aumentou a expressão de ICAM-1 nas células endoteliais, a níveis algumas vezes encontrados em meios de cultura, foi encarada a possibilidade de que a expressão de ICAM-1 basal possivelmente seria devida ao LPS. Quando foram analisadas várias quantidades de soro, verificou-se que o soro com baixa concentração de endotoxina dava uma expressão basal de ICAM-1 25% mais baixa. Todos os resultados aqui relatados referem-se a células endoteliais cultivadas em soro de baixa endotoxina. No entanto, a inclusão do antibiótico polimixina B que neutraliza o LPS a 10 μg/ml diminui a expressão de ICAM-1 em mais 25% (Quadro 3) . 0 aumento na expressão de ICAM-1 no tratamento com IL-1 ou TNF não foi efectuado pela presença de 10 μς/πιΐ de polimixina B, o que é compatível com os baixos níveis de endotoxina nestas preparações (Quadro 3).
QUADRO 3
Anticorpos Monoclonais Anti-ICAM-1
Condição (16h) l25I Ligado Especificamente (CPM)
CEVUH CEVSH
comparação | 603 | + | 11 | - | 1132 | + | 31 | - |
100 ng/ml rIL-1 beta | 5680 | + | 633 | 9x | 8320 | + | 766 | 7,3x |
50 ng/ml rIL-1 alfa | 9910 | + | 538 | 16x | - | - | ||
50 ng/ml rTNF alfa | 9650 | + | 1500 | 16x | 12690 | + | 657 | 11,2x |
10 gg/ml LPS | 9530 | + | 512 | 16x | 10459 | + | 388 | 9,2x |
10 ng/ml rIFN gama | 3120 | + | 308 | 5.2x | 4002 | + | 664 | 3, 5x |
rIL-1 beta + rTNF | 1469 | + | 1410 | 24x | 16269 | + | 660 | 14x |
rIL-1 beta + LPS | 13986 | + | 761 | 23x | 10870 | + | 805 | lOx |
rIL-1 beta + rIFN gama | 7849 | + | 601 | 13x | 8401 | + | 390 | 7, 4x |
rTNF + LPS | 15364 | + | 1241 | 24x | 16141 | + | 1272 | 14x |
rTNF + rIFN gama | 13480 | + | 1189 | 22x | 13238 | + | 761 | 12x |
LPS + IFN gama | 10206 | + | 320 | 17x | 10987 | + | 668 | lOx |
polimixina B (10 μg/ml) | 480 | + | 23 | - | - | — | ||
polimixina B + rIL-1 | 5390 | + | 97 | llx | - | - | ||
polimixina B + rTNF | 9785 | + | 389 | 20x | - | - | ||
1 μg/ml LPS | 7598 | + | 432 | 13x | - | - | ||
polimixina B + LPS | 510 | + | 44 | l.lx |
A regulação da expressão de ICAM-1 para níveis superiores em CEVUH e CEVSH- CEVUH ou CEVSH foi ensaiaada por inoculação de placas de 96 alvéolos a 1:3 de uma monocamada confluente e permitisse que crescessem de modo a reunir-se. As células foram então tratadas com os materiais ou meios indicados durante 16
$ .X horas e realizou-se a análise de RIA como nos métodos. Todas as situações foram feitas em quadriplicado.
EXEMPLO 12
Cinética de Indução de ICAM-1 por Interleuquina 1 e por
Interferão Gama
A cinética dos efeitos de Interleuquina 1 e do Interferão gama na expressão de ICAM-1 nos fibroblastos dérmicos foi determinada usando a análise de ligação IgG anti-rato de cabra com 125I, de Dustin, M.L. et al. (J. Immunol. 137: 245-254 (1986); cuja referência se considera aqui incorporada por referência). Para realizar esta análise de ligação, cultivaramse fibroblastos dérmicos humanos em placas de microtitulação de 96 alvéolos, a uma densidade de 2 a 8 χ IO4 células/alvéolo (0,32 cm2). As células foram lavadas duas vezes com meio completo RPMI 1640, como se descreve no Exemplo 1. As células foram lavadas adicionalmente uma vez com solução de sal equilibrada de Hanks (SSEM) HEPES 10 mM, NaN3 a 0,05% e soro bovino fetal inactivado pelo calor a 10%. A lavagem com este tampão de ligação foi feita a 4°C. A cada alvéolo, adicionaramse 50 μΐ do tampão de ligação acima descrito a 50 μΐ do sobrenadante de hibridoma apropriado com X63 e W6/32 como amostras de comparação negativa e positiva, respectivamente. Depois da incubação durante 30 minutos a 4°C, com agitação suave, os alvéolos foram lavados duas vezes com tampão de ligação, e adicionou-se o segundo anticorpo de IgG anti-rato de cabra 125I a 50 nCi em 100 μΐ. O anticorpo anti-rato de cabra 125I foi preparado usando iodogénio (Pierce), de acordo com o método de Fraker, P.J. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 849 (1978)) . Depois de 30 minutos a 4°C, os alvéolos foram lavados duas vezes com 200 μΐ de tampão de ligação e a camada celular foi dissolvida, adicionando 100 μΐ de NaOH 0,1 N. Esta solução e uma lavagem de 100 μΐ foram analisados num contador gama 5 500 de Beckman. A radioactividade ligada especifica em impulsos por minuto, foi calculada como [cpm com anticorpo monoclonal]-[cpm com X631], Todas as fases, incluindo a indução com reagentes específicos, foram levados a cabo em quadriplicado.
O efeito da interleuquina-1 com um período de semi-vida para indução de ICAM-1 de 2 horas foi mais rápido do que o do interferão gama com um período de semi-vida de 3,75 horas (Figura 6) . O tempo decorrido para voltar aos níveis de repouso de ICAM-1 pareciam depender do ciclo da célula ou da taxa do crescimento da célula. Nas células em equilíbrio, os efeitos da interleuquina-1 e do interferão gama são estáveis por 2 ou 3 dias, enquanto que em culturas de fase de crescimento exponencial, a expressão de ICAM-1 está perto da linha de base 2 dias depois da remoção destes agentes indutores.
As curvas de resposta em relação à dose para indução de ICAM-1 por interleuquina-1 humana e de rato recombinantes, e para interferão gama humano recombinante, são apresentadas na Figura 7. Descobriu-se que o interferão gama e a interleuquina-1 tinham dependências de concentração similares com efeitos quase idênticos, a 1 ng/ml. As interleuquinas 1 recombinantes de rato e humana também têm curvas similares, mas são muito menos eficazes do que as preparações de interleuquina 1 humana para a indução da expressão de ICAM-1.
A ciclo-hexamida, um inibidor de síntese de proteínas, e a actinomicina D, um inibidor de síntese de ARNm, eliminam os efeitos tanto da interleuquina 1 como do interferão gama na expressão de ICAM-1 em fibroblastos (Quadro 4) . Além disso, a tunicamicina, um inibidor de glicosilação ligada a N, só inibia o efeito da interleuquina 1 em 43%. Estes resultados indicam que a síntese de proteína e de ARNm, mas não a glicosilação ligada a
N, são necessários para o aumento estimulado pela interleuquina e pelo interferão gama da expressão de ICAM-1.
QUADRO 4
Efeitos de Ciclo-hexamida, Actinomicina D e Tunicamicina na Indução de ICAM-1 por IL 1 e INF gama nos Fibroblastos Dérmicos Humanos3
Tratamento | 125I IgG anti-rato de cabra, ligado específicamente (cpm) | |
anti-ICAM-1 | anti-HLA-A,B,C | |
Comparação (4 hr) | 1524 + 140 | 11928 + 600 |
+ cicloheximida | 1513 + 210 | 10678 + 471 |
+ actinomicina D | 1590 + 46 | 12276 + 608 |
+ tunicamicina | 1461 + 176 | 12340 + 940 |
11 1 (10 U/ml) (4 hr) | 4264 + 249 | 12155 + 510 |
+ cicloheximida | 1619 + 381 | 12676 + 446 |
+ actinomicina D | 1613 + 88 | 12294 + 123 |
+ tunicamicina | 3084 + 113 | 13434 + 661 |
IFN- (10 U/ml) (18 hr) | 4659 + 109 | 23675 + 500 |
+ cicloheximida | 1461 + 59 | 10675 + 800 |
+ actinomicina D | 1326 + 186 | 12089 + 550 |
a. Cultivaram-se fibroblastos humanos até uma densidade de 8 x 104 células/alvéolos de 0,32 cm2. Os tratamentos foram levados a cabo num volume final de 50 μΐ contendo os reagentes indicados. Foram adicionadas ciclo-hexamida, actinomicina D e tunicamicina, a 20 μg/ml, 10 μΜ e 2 μg/ml, respectivamente, ao mesmo tempo que as citoquinas. Todos os valores são médias de alvéolos em quadriplicado £ DP.
EXEMPLO 13
A distribuição de Tecido de ICAM-1
Foram efectuados estudos histoquímicos em tecido congelado de orgãos humanos a fim de determinar a distribuição de ICAM-1 no timo, em gânglios linfáticos, intestino, pele, rim e fígado. Para realizar esta análise, fixaram-se em acetona durante 10 minutos secções de tecidos congelados (4 μπι de espessura) de tecidos humanos normais e coraram-se com anticorpo monoclonal RR1/1 por uma técnica de imunoperoxidase que empregou o método complexo de avidina-biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) descrito por Cerf-Bensussan, N. et al. (J. Immunol. 130: 2615 (1983)). Após a incubação com o anticorpo, as secções foram incubadas consecutivamente com IgG anti-rato de cavalo biotinilada e com complexos de peroxidase avidina-biotinilada. As secções foram, por fim, mergulhadas numa solução contendo 3amino-9-etil-carbazolo (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) para desenvolver uma reacção colorida. Em seguida as secções foram fixadas em formaldeído a 4% 5 minutos e foram contrastadas com hematoxilina. Para amostras de comparação tomaram-se secções incubadas com anticorpos monoclonais não relacionados, em vez do anticorpo Rrl/1.
Verificou-se que a ICAM-1 tinha uma distribuição muito semelhante à dos antigenes da classe II do complexo de histocompatibilidade maioritário (MHC). A maioria dos vasos sanguíneos (tanto pequenos como grandes) em todos os tecidos mostravam coloração de células endoteliais com anticorpo ICAM-1. A coloração endotelial vascular era mais intensa nas áreas interfoliculares (para-corticais), em gânglios linfáticos, amígdalas e manchas de Peyer, em comparação com os vasos do rim, fígado e pele normal. No fígado, a coloração era bastante restrita às células de cobertura sinusoidais; os hepatócitos e as coberturas de células endoteliais, principalmente as veias e artérias portais, não foram coradas.
Na medula do timo, foi observada uma coloração difusa de células grandes e um padrão dentrítico de coloração. No córtice, o tipo de coloração era focal e predominantemente dentrítico. Os timócitos não foram corados. No tecido linfóide periférico, as células centrais germinais dos folículos linfóides secundários foram intensamente coloridas. Em alguns folículos linfóides, o padrão de coloração era principalmente dentrítico, sem coloração reconhecível de linfócitos. Foi também observada uma coloração ténue de células na zona exterior. Além disso, as células dentríticas com extensões citoplasmáticas (células reticulares interdigitais) e um pequeno número de linfócitos nas áreas interfoliculares ou paracorticais foram corados com o anticorpo de ligação de ICAM-1.
Foram coradas células semelhantes a macrófagos nos gânglios linfáticos e na mucosa do intestino delgado. Células semelhantes a fibroblastos (células fusiformes) e células dentríticas espalhadas no estroma da maioria dos orgãos estudados, foram coradas com o anticorpo de ligação ICAM-1. Não se descortinou qualquer coloração nas células indeterminantes de Langerhans na epiderme. Não foi observada qualquer coloração no tecido muscular liso.
A coloração das células epiteliais foi essencialmente vista na mucosa das amígdalas. Apesar de os hepatócitos, o epitélio
das vias biliares, as células epiteliais intestinais e as células epiteliais tubulares no rim não se corarem na maioria das circunstâncias, secções de tecido de rim normal obtido de um especímen de uma nefrectomia com carcinoma de células renais apresentou coloração de muitas células tubulares próximas para ICAM-1. Estas células tubulares também se coraram com um anticorpo de ligação anti-HLA-DR.
Resumindo, o ICAM-1 é expressado em células não hematopoiéticas, como células endoteliais vasculares, e em células hematopoiéticas, como macrófagos de tecidos e blastos de linfócitos C estimulados por mitogene. Verificou-se que a ICAM-1 era expressa em pequenas quantidades nos linfócitos de sangue periférico.
EXEMPLO 14
Purificação de Anticorpo Monoclonal de ICAM-1 Cromatografia de Afinidade
Esquema de purificação geral
A ICAM-1 foi purificada a partir de células ou de tecido humano, usando cromatografia de afinidade de anticorpo monoclonal. 0 anticorpo monoclonal Rrl/1, reactivo com ICAM-1, foi primeiro purificado e acoplado a uma matriz de coluna inerte. Este anticorpo é descrito por Rothlein, R. et al. J. Immunol. 137; 1270-1274 (1986), e Dustin, M.L. et al. (J.
Immunol. 137: 245 (1986)) . A ICAM-1 foi dissolvida a partir de membranas de células por lise das células num detergente não iónico, o Triton X-100, a um pH quase neutro. O lisado celular contendo a ICAM-1 dissolvida foi então passado através de précolunas projectadas para remover materiais que se ligam de modo não específico ao material da matriz da coluna e em seguida através da matriz da coluna de anticorpo monoclonal, permitindo que a ICAM-1 se ligasse ao anticorpo. A coluna do anticorpo foi então lavada com uma série de tampões detergentes de lavagem aumentando o pH para pH 11,0. Durante estas lavagens, a ICAM-1 ficou ligada à matriz do anticorpo, enquanto que os contaminantes não ligados e debilmente ligados foram eliminados. A ICAM-1 ligada foi depois eluida especificamente da coluna, por aplicação de uma mistura de detergente de pH 12,5.
Purificação do anticorpo monoclonal Rrl/1 e acoplagem covalente a Sepharose CL-4B.
O anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 Rrl/1 foi purificado a partir do fluído ascítico de ratos portadores de hibridomas, ou de sobrenadantes de cultura de hibridomas, por técnicas normais de precipitação de sulfato de amónio e cromatografia de afinidade da proteína A (Ey, et al., Immunochem. 15: 429 (1978)). A IgG purificada ou IgG de ratazana (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) foi acoplada covalentemente à Sepharose CL4B (Pharmacia, Upsala, Suécia) usando uma modificação do método de March et al. (Anal. Biochem. 60: 149 (1974)). Resumidamente, a Sepharose CL-4B foi lavada em água destilada, activada em 40 mg/ml de CNBr em K2HPO4 5 M (pH aproximadamente 12) , durante 5 minutos e depois lavada a fundo com Hcl 0,1 mM a 4°C. A Sepharose filtrada e activada foi ressuspensa com um volume igual de anticorpo purificado (2-10 mg/ml em NaHCO3 0,1 M, NaCl 0,1 M). A suspensão foi incubada por 18 horas a 4°C, com rotação recíproca lenta. O sobrenadante foi então analisado para determinar a presença de anticorpos desligados medindo a absorvância a 280 nm e os restantes locais reactivos na Sepharose activada, foram saturados, juntando glicina a 0,05 M. O êxito do acoplamento foi normalmente superior a 90%.
Solubilização detergente de membranas preparadas a partir de baço humano.
Todos os processos foram efectuados a 4°C. Baço humano congelado (fragmentos de 200 g) de pacientes com leucemia de células reticuloendoteliais foi mergulhado em gelo, em 200 ml de solução tris-salina (tris 50 mM, NaCl 0,14 M, pH 7,4 a 4°C) contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,2 U/ml de aprotinina, e iodocetalmida 5 mM. O tecido foi cortado em pedaços pequenos e foi homogeneizado a 4°C com um homogenizador de potência Tekmar. O volume foi então ajustado a 300 ml com solução tris-salina e foram adicionados 100 ml de Tween 40 a 10% (Monopalmitato de polioxietileno sorbitol) em solução trissalina, para alcançar uma concentração de 2,5% de Tween 40.
Para preparar membranas, o homogeneizado foi extraído usando três batidas de um homogeneizador de Dounce ou, de preferência, um homogeneizador de Potter Elvejhem de Teflon, e em seguida centrifugado a 1000 x g durante 15 minutos. O sobrenadante foi retido e a massa foi re-extraída em 200 ml de Tween 40 a 2,5% em solução tris-salina. Depois da centrifugação a 1000 x g durante 15 minutos, os sobrenadantes de ambas as extracções foram combinados e centrifugados a 150 000 x g, durante 1 hora, para agregar as membranas. As membranas foram lavadas por ressuspensão em 200 ml de solução tris-salina e foram centrifugadas a 150 000 x g durante 1 hora. O sólido de membranas foi ressuspenso em 200 ml de solução de tris-salina e homogeneizada com um homogeneizador motorizado e um almofariz de Teflon, até a suspensão ter uma turvação uniforme. 0 volume foi então preenchido até 900 ml com solução de tris-salina e adicionou-se N-lauroil-sarcosina, até uma concentração final de 1%. Depois de agitar a 4°C durante 30 minutos, o material insolúvel no lisado por detergente foi retirado por centrifugação a 150000 x g, durante 1 hora. Adicionou-se então
Triton X-100 ao sobrenadante até uma concentração final de 2% e o lisado foi agitado a 4°C durante 1 hora.
Dissolução por detergente de células linfoblastóides B JY
A linha de células linfoblastóides B JY transformadas por EBV cresceu em RPMI-1640, contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS) e HEPES 10 mM, até uma densidade aproximada de 0,8 - 1,0 x 105 células/ml. A fim de aumentar a expressão superficial das células de ICAM-1, foi adicionado 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) até 25 ng/ml durante 8 a 12 horas antes da colheita das células. Foi também adicionado vanadato de sódio (50 μΜ) às culturas durante este período. As células foram reunidas por centrifugação a 500 x g durante 10 minutos e lavadas duas vezes na solução salina equilibrada de Hank (HBSS) por ressuspensão e centrifugação. As células (aproximadamente 5 g por 5 litros de cultura) foram lisadas em 50 ml de tampão de lise (NaCl 0,14 M, Tris 50 mM a pH 8,0, Triton X-100 a 1%, 0,2 U/ml de aprotinina, PMSF 1 mM, 50 μΜ de vanadato de sódio) por agitação a 4°C durante 30 minutos. Os núcleos não lisados e os resíduos insolúveis foram removidos por centrifugação a 10 000 x g por 15 minutos, seguida de centrifugação do sobrenadante a 150 000 x g durante 1 hora e filtração do sobrenadante através de papel de filtro Whatman de 3mm.
Cromatografia de afinidade de ICAM-1 para estudos de estrutura.
Para purificação de ICAM-1 em larga escala para ser usado em estudos de estrutura usou-se uma coluna de 10 ml de Rrl/1 de Sepharose CL-4B (acoplada a 2,5 mg de anticorpo/ml de gel) e duas pré-colunas de 10 ml de Sepharose CL-4B, temperadas com glicina e IgG de ratazana acoplada a Sepharose CL-4B (2 mg/ml). As colunas foram ligadas em séries e lavadas previamente com 10 volumes de coluna de tampão de lise, 10 volumes de coluna de
tampão de pH 12,5 (trietilamina 50 mM, Triton X-100 a 0,1%, pH
12,5 a 4°C), seguido por equilíbrio com 10 volumes de coluna de tampão de lise. Um litro de lisado por detergente de baço humano foi carregado com um caudal de 0,5 a 1,0 ml por minuto. As duas pré-colunas foram usadas para remover material não especificamente ligado do lisado antes da passagem através da coluna de Sepharose Rrl/1.
Depois de carregada, a coluna de Sepharose Rrl/1 e o ICAM-1 ligado foi lavada sequencialmente a um caudal de 1 ml/minuto com um mínimo de 5 volumes de coluna de cada uma das seguintes soluções: 1) tampão de lise; 2) Tris 20 mM a pH 8,0/NaCl 0,14 M/Triton X-100 a 0,1%; 3) glicina 20 mM pH 10,0/Triton X-100 a 0,1%, e 4) trietilamina 50 mM a pH 11,0/Triton X-100 a 0,1%. Todas as misturas de lavagem continham PMSF 1 mM e 0,2 U/ml de aprotinina. Depois da lavagem, a ICAM-1 de ligação restante foi eluida com 5 volumes de coluna de tampão de eluição (trietilamina 50 mM Triton X-100 a 0,1% pH 12,5 a 4°C) a um caudal de 1 ml/3 minutos. A ICAM-1 eluida foi reunida em fracções de 1 ml e imediatamente neutralizada pela adição de 0,1 ml de Tris 1 M a pH 6,7. Identificaram-se as fracções contendo ICAM-1 por electroforese em SDS poliacrilamida de alíquotas de 10 μΐ (Springer et al., J. Exper. Med. 160: 1901 (1984)), seguido de uma coloração por prata (Morrissey, J.H., Anal. Biochem. 117: 307 (1981)). Nestas condições a maior parte da ICAM-1 foi eluida num volume de coluna, aproximadamente, com uma pureza superior a 90%, a julgar pelos electroferogramas corados com prata (uma pequena quantidade de IgG, lixiviada da matriz de afinidade, era o contaminante principal). As fracções contendo ICAM-1 foram combinadas e concentradas, aproximadamente 20 vezes mais, usando microconcentradores Centricon-30 (Amicon, Danvers, MA) . A ICAM-1 purificada foi avaliada por análise de proteína Lowry de uma alíquota precipitada por etanol do volume reunido:
produziram-se aproximadamente 50 gg de ICAM-1 pura a partir de 200 g de baço humano.
Aproximadamente 200 μg de ICAM-1 purificada, foram submetidos a um segundo estágio de purificação, por electroforese de gel de SDS-poliacrilamida. A banda representando a ICAM-1 foi visualizada embebendo o gel em KCL 1 Μ. A região de gel que continha a ICAM-1 foi, então, cortada e electro-eluída, de acordo com o método de Hunkapiller et al., Meth. Enzymol. 91: 227-236 (1983) . A proteína purificada tinha um grau de pureza superior a 98%, a julgar pela coloração de prata e por SDS-PAGE.
Purificação de afinidade de ICAM-1 para estudos funcionais
A ICAM-1 foi purificada para uso em estudos funcionais a partir de lisados por detergentes de células JY, tal como descrito acima, mas numa escala mais pequena (uma coluna de 1 ml de Sepharose Rrl/1), e com as modificações seguintes. Todas as soluções continham 50 μΜ de vanadato de sódio. Depois de lavar a coluna com tampão de pH 11,0, contendo 0,1% de Triton X-100, a coluna foi lavada outra vez com 5 volumes de colunas do mesmo tampão, contendo 1% de n-octil-beta-D-glucopiranosido (octilglucósido) em lugar de 0,1% de Triton X-100. O detergente de octilglucósido desloca o Triton X-100 ligado à ICAM-1 e, ao contrário do Triton X-100 pode ser removido subsequentemente por diálise. A ICAM-1 foi então dissolvida com tampão de pH 12,5, contendo 1% octilglucósido em vez de 0,1% de Triton X-100 e foi analisado e concentrado, como acima descrito.
EXEMPLO 15
Características da ICAM-1 Purificada
A ICAM-1 purificada a partir de baço humano, migra em gel de SDS-poliacrilamida sob a forma de uma banda larga de Mr de 72 000 a 91 000. A ICAM-1 purificada a partir de células JY também migra sob a forma de uma banda larga de Pm de 7 6 500 a 97 000. Estes Pm situam-se na gama mencionada para imunoprecipitados de ICAM-1 de diferentes fontes celulares: Pm = 90 000 para células JY, 114 000 na linha de células mielomonocíticas U937 e 97 000 em fibroblastos (Dustin et al., J. Immunol. 137: 245 (1986)). Esta gama ampla de Pm foi atribuída a um grau de glicosilação elevado, mas variável. O precursor não glicosilado tem um Mr de 55 000 (Dustin et al.). A proteína purificada quer a partir das células JY quer de baço humano retém a sua actividade antigénica como evidência pela sua capacidade de religação à coluna de afinidade original e, por imunoprecipitação com RRl/l-Sepharose e electroforese de SDS-poliacrilamida.
Para produzir fragmentos de peptídeos de ICAM-1, foram reduzidos aproximadamente 200 gg com ditriteitol 2 mM/2% de SDS, seguido de alquilação com ácido iodoacético 5 mM. A proteína foi precipitada com etanol e dissolvida em NH4CO3 0,1 M/CaCl 10,1 mM/0,1% de zwittergent 3-14 (Calbiochem), e digerida com 1% p/p de tripsina a 37°C durante 4 horas, seguido de uma digestão adicional com 1% de tripsina, durante 12 horas a 37°C. Os peptídeos trípticos foram purificados por HPLC de fase inversa, usando uma coluna C4 (Vydac) de 0,4 x 15 cm. Os peptídeos foram eluídos com um gradiente linear de 0% a 60% de acetonitrilo, em ácido trifluoroacético a 0,1%. Submeteram-se peptídeos seleccionados a análise de sequência num microsequenciador de fase gasosa (Applied Biosystems). A informação sobre as sequências obtidas deste estudo é apresentada no Quadro 5.
QUADRO 5
Sequência de Ácidos Aminados dos Peptídeos Trípticos da ICAM-1
Resíduo de ácido _ aminado 50a 50b 4 6a 46b X 45 K AA J U O Ml
1 | [T/V] | A | (V/A) | E | V | s | L | E | A | L | V | L |
2 | F | S | Q | P | E | F | N | L | G | L | T | L/E |
3 | L | I | T | A | L | P | P | D | S | G | L | P/ (G |
4 | T | S | F | A | A | T | L | V | I | P | ||
5 | V | L | P | P | P | V | R | L | E | G/Y | ||
6 | Y | G | L | L | N | T | P | V | T | N/L | ||
7 | P | W | P | P | V | Y | Q | T | P | (N) | ||
8 | T | P | I | I | T/I | G | G | C | P/V | (Q) | ||
9 | S | F | G | (G) | L | - | L | S | K | (E) | ||
10 | E | E | (Q) | - | D | E | T | (D) | ||||
11 | A | S | D/P | K | S | L | S | |||||
12 | G/S | V | V | P | F | F | C | |||||
13 | A | T | D | Q | S | E | D | |||||
14 | G | V | W | V/L | A | - | Q | |||||
15 | I | K | T | P | ||||||||
16 | S | K | ||||||||||
17 | A | |||||||||||
18 | P | |||||||||||
19 | X | |||||||||||
20 | Q | |||||||||||
21 | L |
( ) = Sequência de confiança baixa.
[ ] = Sequência de confiança muito baixa.
/ = Indica ambiguidade na sequência; o ácido aminado mais provável é catalogado primeiro.
a = Peptídeo maior, b = Peptídeo menor.
EXEMPLO 16 gene para ICAM-1 pode ser clonado usando qualquer de vários procedimentos. Por exemplo a informação da sequência de ácidos aminados obtida por meio da sequênciação dos fragmentos de ICAM-1 provenientes do tratamento com tripsina (Quadro 5) pode ser usada para identificar uma sequência oligonucleótidica que corresponderia ao gene de ICAM-1. Em alternativa o gene de ICAM-1 pode ser clonado usando um anticorpo anti-ICAM-1 a fim de detectar clones que produzem ICAM-1.
Clonagem do gene para ICAM-1 por meio da utilização de sondas oligonucleotidicas
Por meio do uso do código genético (Watson, J.D., em: Molecular Biology of the Gene, 3a Ed., W.A. Benjamim, Inc., Menlo Park, CA (1977)) é possível identificar um ou vários oligonucleotídos diferentes, cada um dos quais tem a capacidade de codificar os peptideos trípticos de ICAM-1. A probabilidade que um oligonucleotido particular constitua de facto a sequência real de codificação de ICAM-1 pode ser estimada por consideração das relações de emparelhamento anormal de bases e a frequência com que um codão particular é realmente usado (para codificar para um ácido aminado particular) em células eucarióticas. Estas regras de utilização de codões são descritas por Lathe, R., et al., J. molec. Biol. 183: 1 - 12 (1985) . Usando as regras de utilização de codões de Lathe, identifica-se um único oligonucleótido ou um conjunto de oligonucleótidos contendo uma sequência de nucleótidos teoricamente mais provável (isto é, a sequência de nucleótidos com a redundância mais baixa) com capacidade para codificar as sequências peptídicas trípticas de
ICAM-1.
oligonucleótido ou o conjunto de oligonucleótidos contendo a sequência teoricamente mais provável com capacidade de codificar os fragmentos de ICAM-1 é utilizado para identificar a sequência de um oligonucleótido ou de um conjunto de oligonucleótidos complementares com capacidade de hibridar com a sequência ou com o conjunto de sequências mais prováveis. Um oligonucleótido contendo uma sequência complementar como estas pode ser utilizado como sonda para identificar e isolar o gene de ICAM-1 (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Tal como descrito anteriormente na secção C, é possível clonar o gene de ICAM-1 a partir de preparações de ADN eucariótico que se suponha conter este gene. A fim de identificar e clonar o gene que codifica para a proteína ICAM-1 submete-se a uma selecção um banco de ADN verificando a respectiva capacidade para hibridar com as sondas de oligonucleótidos acima descritas. Uma vez que é provável que apenas existam duas cópias do gene para ICAM-1 numa célula normal diplóide, e uma vez que é possível que o gene para ICAM-1 possa ter longas sequências não transcritas intercaladas (intrões) cuja clonagem não é pretendida, é preferível isolar as sequências que codificam para ICAM-1 a partir de um banco de ADNc preparado a partir de ARNm de uma célula produtora de ICAM1 em vez de um banco de ADN genómico. As preparações de ADN ou de ADNc apropriadas são cindidas com enzimas ou fragmentadas aleatoriamente e são em seguida ligadas em vectores recombinantes. A capacidade destes vectores recombinantes para hibridação com as sondas oligonucleotídicas acima descritas é então medida. Descrevem-se procedimentos de hibridação por
exemplo em Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) ou em Haymes, B.T., et al·., Nucleic Acid Hybridization: A Praticai Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra (1985). Os vectores que se verificar serem capazes de hibridar nestas condições são então analisados a fim de determinar a extensão e a natureza das sequências de ICAM-1 que contêm. Com base unicamente em considerações estatísticas, é possível identificar inequivocamente um gene que codifica para a molécula de ICAM-1 (por selecção de hibridação) usando uma sonda oligonucleótidica de apenas 18 nucleótidos.
Deste modo, resumidamente, a identificação real das sequências peptídicas de ICAM-1 permite a identificação da sequência teórica mais provável, ou de um conjunto de sequências nestas circunstâncias, capazes de codificar para o peptideo. Por construção de um oligonucleótido complementar desta sequência teórica (ou por construção de um conjunto de oligonucleótidos complementares do conjunto dos oligonucleótidos mais prováveis), obtém-se uma molécula de ADN (ou um conjunto de moléculas de ADN) com a capacidade de funcionarem como sonda a fim de identificar e isolar o gene para ICAM-1.
Usando as sequências peptídicas de ICAM-1 do Quadro 5 determinou-se a sequência mais provável de um oligonucleótido capaz de codificar para os peptideos AA e J (Quadro 6 e 7, respectivamente). Sintetizaram-se oligonucleótidos complementares destas sequências e purificaram-se para serem usados como sondas a fim de isolar sequências do gene de ICAM-1. Geraram-se bancos de ADNc de dimensões seleccionadas adequados a partir do poli(A)+ ARN de células HL-60 induzidas por PMA e de células endoteliais da veia umbilical estimulada por PS. Preparou-se um banco de ADNc de dimensão seleccionada usando poli(A)+ ARN de células HL-60 induzidas por PMA de acordo com o método de Gubler, U., et al., (Gene 25: 263-269 (1983)) e Corbi, A., et al., (EMBQ J. 6: 4023-4028 (1987), cujas referências são incorporadas por referência na presente especificação.
Preparou-se um banco de ADNc de dimensão seleccionada usando poli(A)+ ARN de células endoteliais da veia umbilical estimuladas durante 4 horas com 5 pg/ml de PS. O ARN foi extraído por homogeneização das células em isotiocianato de gunidínio 4 M e por ultracentrifugação do sobrenadante através dum gradiente de CsCl (Chirgwin, J.M., et al., Biochem. 18: 5294-5299 (1979)). Isolou-se Poli(A)+ ARN a partir da mistura de espécies totais de ARN usando cromatografia em oligo-(dT)celulose (Tipo 3, Collaborative Research) (Aviv, H., et al., Proc. Natl. acad. Sei (USA) 69: 1408-1412 (1972)).
QUADRO 6
Oligonucleótido Complementar da Sequência Nucleotídica mais provável capaz de codificar para o Peptídeo de ICAM-1 AA
Resíduo Ácido Aminado de ICAM-1 | Peptídeo AA de ICAM-1 | Sequência mais provável que Codifica para peptídeo AA | Sequência Complemen tar |
5' | 3' | ||
162 | Glu | G | C |
A | T | ||
G | c | ||
163 | Leu | C | G |
T | A | ||
G | C | ||
164 | Asp | G | C |
A | T | ||
C | G |
QUADRO 6 (continuação)
Oligonucleótido Complementar da Sequência Nucleótidica mais provável capaz de codificar para o Peptideo de ICAM-1 AA
Residuo de Ácido Aminado de ICAM-1 | Peptideo AA de ICAM-1 | Sequência mais provável que | Sequência Complemen- tar | |
Codifica peptideo | para AA | |||
165 | Leu | C | G | |
T | A | |||
G | C | |||
166 | Arg | C | G | |
G | C | |||
G | C | |||
167 | Pro | C | G | |
C | G | |||
c | G | |||
168 | Gin | c | G | |
A | T | |||
G | c | |||
169 | Gly | G | c | |
G | c | |||
C | G | |||
170 | Leu | C | G | |
T | A | |||
G | C | |||
171 | Glu | G | C | |
A | T | |||
G | c | |||
172 | Leu | C | G | |
T | A | |||
G | C | |||
173 | Phe | T | A | |
T | A | |||
T | A | |||
174 | Glu | G | C | |
A | T | |||
G | c | |||
3' | 5' | |||
175 | Asn | A | T | |
A | T | |||
C | G | |||
176 | Thr | A | T | |
C | G | |||
C | G | |||
177 | Ser | U | A | |
C | G | |||
A | ||||
3' | 5' |
QUADRO 7
Oligonucleótido Complementar da Sequência Nucleotídica mais provável capaz de codificar para o Peptideo de ICAM-1 J
Resíduo de ácido Aminado de ICAM-1 | Peptideo AA de ICAM-1 | Sequência mais provável que Codifica para o peptideo AA | Sequência Complemen- tar |
5' | 3' | ||
19 | Vai | G | C |
T | A | ||
G | C | ||
20 | Thr | A | T |
C | G | ||
C | G | ||
21 | Cys | T | A |
G | C | ||
C | G | ||
22 | Ser | T | A |
C | G | ||
c | G | ||
23 | Thr | A | T |
C | G | ||
c | G | ||
24 | Ser | T | A |
c | G | ||
c | G | ||
25 | Cys | T | A |
G | C | ||
T | A | ||
26 | Asp | G | C |
A | T | ||
C | G | ||
27 | Gin | C | G |
A | T | ||
G | C | ||
28 | Pro | C | G |
C | G | ||
c | G | ||
29 | Lys | A | T |
A | T | ||
3' | 5' |
A primeira cadeia de ADNc foi sintetizada usando 8 pg de poli(A)+ ARN, transcriptase inversa de virus da mieloblastose de aves e um iniciador oligo(dT). 0 híbrido ADN-ARN foi digerido com Rnase H (BRL) e a segunda cadeia foi sintetizada usando polimerase I de ADN (New England Biolabs). 0 produto foi metilado com metilase de Eco RI (New England Biolabs), ligada através de extremidades alinhadas a adaptadores Eco RI (New England Biolabs), digerida com Eco RI e seleccionada por dimensão num gel de agarose de baixo ponto de fusão. 0 ADNc maior do que 600 pb foi ligado λ gtlO previamente digerido com Eco RI e desfosforilado (Stratagene) . O produto da ligação foi em seguida acondicionado (Stratagene gold).
Os bancos de células endoteliais da veia umbilical e HL-60 foram em seguida cultivadas em placa a 20 000 PFU/150 mm. O ADN recombinante foi transferido em duplicado para filtros de nitrocelulose, foi desnaturado em NaOH 0,5 M/NaCl 1,5 M, neutralizado em Tris 1 M a pH 7,5/NaCl 1,5 M e aquecido a 80°C durante 2 horas (Benton, W.D., et al., Science 196: 180-182 (1977). Os filtros foram pré-hibridados e hibridados em SSC 5x contendo solução de Denhardt 5x, NaPO4 50 mM e 1 gg/ml de ADN de esperma de salmão. A pré-hibridação foi levada a efeito a 45°C durante 1 hora.
A hibridaçâo foi levada a efeito usando oligonucleótidos de sentido oposto de 32 pb de (5'-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) ou de 47 pb de (5'GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCCAGGTCCAGCTC) baseados, do modo acima discutido, nos peptideos trípticos de ICAM-1 J e AA, respectivamente (Quadros 6 e 7) (Lathe, R., J. Molec. Biol., 183: 1-12 (1985)). Os oligonucleótidos foram marcados com γ(32P)ATP usando quinase de polinucleótidos T4 e sob condições recomendadas pelo fornecedor (New England Biolabs). Após hibridaçâo dum dia para o outro, lavaram-se os filtros duas vezes com SSC 2x/SDS a 0,1% durante 30 minutos a 45°C. Isolaram75 .2
se destas placas os fagos que mostraram hibridação. Estes fagos foram purificados por sucessivos ciclos de hibridação e selecção.
Clonagem do gene para ICAM-1 mediante o uso de anticorpo antiICAM-1 gene para ICAM-1 pode em alternativa ser cionado mediante o uso de um anticorpo anti-ICAM-1. 0 ADN, ou de preferência o ADNc, é extraído e purificado a partir de uma célula com capacidade de expressar ICAM-1. 0 ADNc purificado é fragmentado (por fragmentação mecânica, por digestão com endonucleases, etc.) para dar um conjunto de fragmentos de ADN ou de ADNc. Os fragmentos de ADN ou de ADNc deste conjunto são então clonados num vector de expressão a fim de produzir um banco genómico de vectores de expressão cujos membros contenham cada um um único fragmento cionado de ADN ou de ADNc.
EXEMPLO 17
Análise dos clones de ADNc
ADN fágico dos clones positivos foi digerido com Eco RI e foi examinado por análise de Southern usando um ADNc de um clone como sonda. As inserções de ADNc de dimensão máxima que foram caapazes de hibridação cruzada foram subclonadas no local Eco RI do vector plasmídico pGEM 4Z (Promega) . Os subclones de HL-60 contendo o ADNc tanto numa orientação como na orientação contrária foram suprimidos por digestão com exonuclease III (Henikoff, S., Gene28: 351-359 (1984)) de acordo com as recomendações do fabricante (Erase-a-Base, Promega). Os ADNc's progressivamente suprimidos foram então clonados e submetidos a sequenciação de terminação de cadeia de didesoxinucleótido (Sanger, F. et al., Proc. Natt. Acad. Sei (USA) 74: 5463-5467 (1977)) de acordo com as recomendações do fabricante (Sequenase, U.S. Biochemical). As regiões 5' e de codificação do ADNc de HL60 foram completamente sequenciadas nas duas cadeia e a região 3' foi sequenciada aproximadamente a 70% nas duas cadeia. Sequenciou-se um ADNc endotelial representativo ao longo da maior parte do seu comprimento por clonagem sistemática de fragmentos de enzimas de restrição de reconhecimento de 4 pb.
Estabeleceu-se a sequência de ADNc de um dos ADNc's das células HL-60 e de uma das células endoteliais (Figura 8) . A sequência de 3023 pb contém uma região 5' não traduzida curta e uma região 3' de 1,3 kb não traduzida com um sinal de poliademilação de consenso na posição 2966. O quadro de leitura livre maais comprido começa no primeiro ATG na posição 58 e acaba com um tripleto de terminação TGA na posição 1653. A identidade entre a sequência de áacidos aminados traduzida e as sequências determinadas de 8 diferentes peptideos tripticos totalizando 91 ácidos aminados (sublinhados na Figura 8) confirmam que se isolaram clones de ADNc de ICAM-1 autênticos. As sequências de ácidos aminados dos peptideos tripticos de ICAM-1 são apresentados no Quaadro 8.
QUADRO 8
Sequência de ácidos aminados de peptideos tripticos de ICAM-1
Peptideo
Resíduos
J
U
X
AA
K
Sequência
14-29 | X | G | S | V | L | V | T | C | S T | S | C | D | Q | P | K |
30-39 | L | L | G | I | E | T | P | L | (P) | (K) | |||||
78-85 | (T) | F | L | T | V | Y | X T | ||||||||
89-95 | V | E | L | A | P | L | P | ||||||||
161-182 | X | E | L | D | L | R | P | Q G | L | E | -- | ||||
L | F | E | X | T | S | A | P | X Q | L | ||||||
232-246 | L | N | P | T | V | T | Y | G | X D | S | F | S | A | X | |
282-295 | S | F | P | A | P | N | V | (T/I) | L | X | K | P | Q | (V/L) |
— indica que a sequência continua na linha seguinte.
As sequências sublinhadas foram usadas para preparar sondas oligonucleotídicas.
A análise de hidrofobicidade (Kytr, J., et al., J. Molec. Biol. 157: 105-132 (1982)) sugere a presença de uma sequência de sinal de 27 resíduos. A atribuição da glutamina +1 está de acordo com a impossibilidade verificada de obter a sequência Nterminal de 3 preparações diferentes da proteína ICAM-1; a glutamina pode ciclizar-se para formar ácido piroglutâmico, dando como resultado uma extremidade N-terminal bloqueada. A sequência traduzida de 1 a 453 é predominantemente hidrofílica, seguindo-se um domínio transmembranal presumível hidrofóbico de 24 resíduos. O domínio transmembranal é seguido imediatamente por vários resíduos com carga incluídos no domínio presumivelmente citoplasmático de 27 resíduos.
A dimensão prevista da cadeia do polipeptídeo maduro é de 55 219 Daltons, em concordância excelente com a dimensão observada de 55 000 para a ICAM-1 desglicosilada (Dustin, M.L., et al., J. Immunol, 137: 245-254 (1986)). Prevêem-se oito locais de glicosilação ligada a N. A ausência de asparagina nas sequências peptidicas trípticas de dois destes locais confirma a sua glicosilação e a sua orientação extracelular. Tomando como base 2 500 Daltons por hidrato de carbono ligado a N de alto conteúdo em manose, prevê-se uma dimensão de 75 000 para o precursor ICAM-1 em comparação com os seis observados de 73 000 Daltons (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)). Após conversão do hidrato de carbono complexo de alto conteúdo em manose, a glicoproteína ICAM-1 tem 76 a 114 Kd, conforme o tipo de célula (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)). Deste modo o ICAM-1 é uma proteína de membrana integral altamente glicosilada mas, fora esse aspecto, normal.
EXEMPLO 18
ICAM-1 é um Membro de Ligação de Integrina da família de
Supergenes da Imunoglobulina alinhamento das repetições internas de ICAM-1 foi levado a efeito usando o programa de alinhamento de proteínas Microgenie (Queen, C., et al., Nucl. Acid. Res., 12: 581-599 (1984)) seguido de inspecção. 0 alinhamento de ICAM-1 com IgM, N-CAM e MAG foi levado a efeito usando os programas Microgenie e ALIGN (Dayhoff, M.O., et al., Meth. Enzymol. 91: 524-545 (1983)). Fezse uma busca em quatro bases de dados de sequências de proteínas mantidas pela National Biomedical Research Foundation para tentar encontrar similaridades de sequências proteicas usando o programa FASTP de William e Pearson (Lipman, D,J., et al., Science. 227: 1435-1439 (1985)).
Uma vez que a ICAM-1 é um ligando de uma integrina, não era de esperar que fosse um membro da família dos supergenes das imunoglobulinas. No entanto a inspecção da sequência ICAM-1 mostra que preenche todos os critérios propostos para ser considerado membro da família de supergenes das imunoglobulinas. Estes critérios são discutidos mais adiante.
domínio extracelular completo da ICAM-1 é constituído por 5 domínios homólogos semelhantes a imunoglobulinas, os quais são apresentados alinhados na Figura 9A. Os domínios 1 a 4 têm 88, 97, 99 e 99 resíduos de comprimento, respectivamente, e estão por conseguinte no domínio de dimensões normais para Ig; o domínio 5 está truncado em 68 resíduos. Buscas na base de dados NBRF usando o programa FASTP revelaram homologias significativas com membros da família de supergenes das imunoglobulinas, incluindo os domínios C da IgM e de IgG, o
domínio variável de subunidade α do receptor das células T e a glicoproteína beta alfa 1 (Figura 9B-D).
Usando a informação acima, comparou-se a sequência de ácidos aminados da ICAM-1 com as sequências de ácidos aminados de outros membros da família de supergenes das imunoglobulinas.
Foram diferenciaados três tipos de domínios de superfamílias de Ig, V, Cl e C2. Tanto o domínio V como os domínios C são constituídos por 2 folhas β ligadas entre si pela ligação de dissulfureto intra-domínios; o domínio V contém 9 cadeias β anti-paralelas enquanto que os domínios C têm 7. Os domínios constantes foram divididos nos conjuntos Cl e C2 com base nos resíduos característicos apresentados na Figura 9A. 0 conjunto Cl inclui proteínas envolvidas no reconhecimento de antigenes. 0 conjunto C2 inclui vários receptores Fc e proteínas envolvidas na adesão, incluindo CD2, LFA-3, MAG e NCAM. Verificou-se que os domínios de ICAM-1 eram mais fortemente homólogos com domínios do conjunto C2, colocando a ICAM-1 neste conjunto; este facto reflecte-se numa mais forte similitude com os resíduos conservados em C2 do que em Cl, como se apresenta para as cadeias β Β-F na Figura 9. Além disso, é possível alinhar os domínios da ICAM-1 muito melhor com as cadeias β A e G dos domínios C2 do que com estas cadeias nos domínios V e Cl, permitindo reforçar bons alinhamentos ao longo de todo o domínio C2. Nas Figuras 9B e 9C mostram-se os alinhamentos dos domínios C2 de NCAM, MAG e glicoproteína β alfa 1; a identidade vai de 28 a 33%. Também se mostram os alinhamentos com um receptor Va de uma célula T de 27% de identidade e do domínio C3 IgM de 34% de identidade (Figuras 9B,9D).
Uma das mais importantes caracteristicas dos domínios das imunoglobulinas é a existência de pontes de dissulfureto entre
as cisteínas das cadeias β B e F que estabilizam a sandwich da folha β; na ICAM-1 as cisteínas são mantidas em todos os casos, excepto na cadeia f do domínio 4 onde se encontra uma leucina que pode fazer frente na sandwich e estabilizar o contacto, conforme proposto para alguns outros domínios dos conjuntos V e C2. A distância entre as cisteínas (43, 50, 52 e 37 resíduos) é como descrita para o conjunto C2.
A fim de verificar a presença de ligações de dissulfureto intracadeias na ICAM-1, submeteu-se ICAM-1 de células endoteliais a SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras. A ICAM-1 de células endoteliais foi usado porque apresenta uma menor heterogeneidade de glicosilação do que a ICAM-1 de células esplénicas JY ou filiformes e permite uma maior sensibilidade a desvios de Mr. Por conseguinte, purificou-se a ICAM-1 a partir de culturas de células endoteliais da veia umbilical estimulada durante 16 horas por LPS (5 pg/ml) por cromatografia de imunoafinidade, tal como descrito acima. Ressuspendeu-se ICAM-1 precipitada por acetona em tampão de amostra (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970)) com 0,25% de 2-mercaptoetanol ou iodoacetamida 25 mM e levou-se a 100°C durante 5 min. As amostras foram submetidas a SDS-PAGE 4670 e coloração por prata 4613. A ICAM-1 das células endoteliais tinha um Mr aparente de 100 kd sob condições redutoras e de 96 kd sob condições não redutoras sugerindo fortemente a presença de pontes de dissulfureto intracadeia na ICAM-1 nativa.
Por meio da utilização da sequência primária para prever a estrutura secundária (Chon, P.Y., et al., Biochem 13: 211-245 (1974)) encontrou-se as cadeias tipo β em cada domínio de ICAM1, como se esperava, marcadas de a até g na Figura 9A parte superior, exactamente de acordo com a previsão de um domínio de imunoglobulina e correspondendo às posições das cadeias A a H nas imunoglobulinas (Figura 9A, parte inferior). No domínio 5 faltam as cadeias A e C mas, uma vez que estas formam os bordos das superfícies, as superfícies podem ainda formar-se, talvez com a cadeia D tomando o lugar da cadeia C, como foi proposto para alguns outros domínios C2; a ligação de dissulfureto característica entre as cadeias B e F não seria afectada. Deste modo, os critérios para a dimensão do domínio, a homologia das sequências, a manutenção das cisteínas formando as presumíveis ligações de dissulfureto intra-domínios, a presença de ligações de dissulfureto e a estrutura prevista da superfície β são todos satisfeitos pela inclusão da ICAM-1 na faamília de supergenes de imunoglobulina.
Verificou-se que a ICAM-1 é mais fortemente homóloga com as glicoproteínas NCAM e MAG do conjunto C2. Este facto é de particular interesse uma vez que tanto a NCAM como o MAG são mediadoras da adesão célulaa-célula. A NCAM é importante nas interacções neurónio-neurónio e neuro-muscular (Cunningham,
B.A., et al., Science 236: 799-806 (1987)), enquanto que a MAG é importante nas interacções neurónio-oligodendrócitos e oligodendrócito-oligodendrócito durante a mielinação (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105: 1893-1899 (1987)). A expressãao de NCAM e de MAG na superfície celular é regulada de acordo com o desenvolvimento durante a formação do sistema nervoso e a mielinação, respectivamente, em analogia com a indução regulada da ICAM-1 na inflamação (Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. _5: 223-252 (1987)). A ICAM-1, a NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236: 799-806 (1987)), e a MAG (Salzer, J.L. et al., J.Cell Biol. 104: 957-965 (1987)) são similares na estrutura geral além de serem homólogas, uma vez que qualquer delas é uma glicoproteína de membrana integral constituída por 5 domínios C2 que formam a região extracelular N-terminal, se bem que na NCAM esteja presente alguma sequência adicional não semelhante a Ig entre o último domínio C2 e o domínio
transmembranal. A ICAM-1 alinha-se ao longo de todo o seu comprimento, incluindo os domínios transmembranal e citoplasmático, com a MAG com 21% de identidade; encontra-se a mesma % de identidade na comparação dos 5 domínios de ICAM-1 e de NCAM-1. Na Figura 10 mostra-se uma comparação por meio de um diagrama das estruturas secundárias da ICAM-1 e da MAG. Uma comparação domínio a domínio mostra que o nível de homologia entre os domínios das moléculas de ICAM-1 e de NCAM (x + desvio padrão 21 +2,8% e 18,6 + 3,8% respectivamente) é semelhante ao nível de homologia da comparação dos domínios da ICAM-1 com os domínios da NCAM e da MAG (20,4 + 3,7 e 21,9 + 2,7, respectivamente) . Se bem que haja evidência de divisão alternativa nas regiões C-terminais de NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236: 799-806 (1987)); Barthels, D., et al., EMBQ J. 6: 907-914 (1987)) e do MAG (Lai, C., et al., Proc. Natt. Acad. Sei (USA) 84: 4377-4341 (1987)), não se encontrou qualquer evidência deste facto na sequenciação de clones de ICAM-1 de HL60 ou endotelial ou em estudos da espinha dorsal proteica da ICAM-1 e do precursor em vários tipos de células (Dustin, M.L., et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)).
A ICAM-1 funciona como um ligante para LFA-1 em interaeções entre linfócitos e vários tipos diferentes de células. Os linfócitos ligam-se à ICAM-1 incorporados em camadas duplas de membrana artificiais e esta ligação necessita da existência de LFA-1 no linfócito, demonstrando directamente a interaeção de
LFA-1 com a ICAM-1 (Marlin, S.D., et_al., Cell 51: 813-819 (1987)). A LFA-1 é uma integrina dos leucócitos e não tem características de imunoglobulina. As integrinas leucocitárias incluem uma subfamília de integrinas. As outras duas subfamílias são mediadoras nas interaeções célula-matriz e reconhecem a sequência RGD no interior dos respectivos ligandos que incluem a fibronectina, a vitromectina, o colagênio e o fibrinogénio (Hynes, R.O., Cell 48: 459-554 (1987)); Ruoslahti, E., et al·.,
Science 238: 491-497 (1987)). As integrinas leucocitárias só são expressas nos leucócitos, estão envolvidas nas interacções célula-célula e os únicos ligandos conhecidos são ICAM-1 e iC3b, um fragmento do componente complementar C3 que não apresenta características semelhantes a uma imunoglobulina reconhecido por Mac-1 (Kishimoto, T.K., et al., In
Typing III, McMichael, M. (ed.), Springer-Verlag, e que e henkoyte
New York '1987'
Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987); Anderson, D.C., (1987)). No Quadro 9 et al., Ann. Rev. Med. 38: 175-194 apresentam-se possíveis peptideos da sequência ICAM-1, com base em análise sequencial, que são reconhecidos por LFA-1.
QUADRO 9
Peptideos da sequência de ICAM-1 possivelmente reconhecidos por LFA-1
-L-R-G-E-K-E-L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E-P-R-G-G-S-P-G-N-N-R-K-Q-K-D-S-Q-P-M-T-P-E-R-V-K-L-A-P-L-P-S-R-R-D-N-H-G-A-N-F-S-D-L-R-P-Q-G-L-EA ICAM-1 constitui o primeiro exemplo de um membro da família de supergenes de imunoglobulina que se liga a uma integrina. Se bem que ambas estas famílias desempenhem um papel importante na adesão celular, a interacção entre elas não tinha sido ainda prevista. Pelo contrário, as interacções dentro da superfamília de genes de imunoglobulina são bastante comuns. É muito possível que se venham a encontrar outros exemplos de interacçãao entre as famílias das integrinas e das imunoglobulinas. A LFA-1 reconhece um ligando diferente da ICAM1 (Springer, T.A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)) e a integrina leucocitária Mac-1 reconhece um ligando diferente de C3bi na adesão neutrófilo-neutrófilo (Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med. 38: 175-194 (1987)). Além disso, vesículas contendo MAG purificada ligam-se a neurites, que são MAG, e portanto a MAG deve ser capaz de interacção heterofílica com um receptor diferente (Poltorak, M. et al., J. Cell Biol. 105: 1893-1899 (1987)).
Foi sugerido que o papel da NCAM nas interacções celulares neural-neural e neural-muscular seja devido a interacções homofílicas NCAM-NACAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236: 799-806 (1987)). O papel importante de Mag nas interacções entre voltas girantes adjacentes de células de Schwann que envolvem os axónios durante a formação da bainha pode ser devido a interacção com um receptor diferente ou a interacção homofílica MAG-MAG. A homologia com NCAM e a ocorrência frequente de interacções domínio-domínio dentro da família de supergenes de imunoglobulinas levanta a possibilidade de que a ICAM-1 possa participar em interacções homofílicas bem como em interacções hetrofílicas ICAM-1. LFA-1. No entanto a ligação de células B linfoblásticas que co-expressam densidades semelhantes de LFA-1 e de ICAM-1 a ICAM-1 em monocamadas celulares artificiais pode ser completamente inibida por meio de pré-tratamento dos linfoblastos B com ACM de LFA-1, enquanto que a aderência não é afectada pelo pré-tratamento dos linfoblastos com ACM de LFA-1. O pré-tratamento da monocamada com ACM de ICAM-1 suprime completamente a ligação (Dustin, M.L., et al., J. Immunol 137: 245-254 (1986)). Estas constatações mostram que, se chegam a ocorrer interacções homofílicas de ICAM-1, estas devem ser muito mais fracas do que
as interacções heterofílicas com LFA-1.
A possibilidade de que as integrinas leucocitárias reconheçam ligandos de um modo fundamentalmente diferente está de acordo com a presença de uma sequência de 180 resíduos nas respectivas sub-unidades α, o que pode ser importante na capacidade de ligação dos ligandos e que não está presente nas integrinas que reconhecem RGD (Corbi, A., et al, EMBO J. 6: 4023-4028 (1987) ) . Se bem que tenha sido proposto que a Mac-1 reconheça a sequência RGD presente em iC3b 5086, não há qualquer sequência RGD na ICAM-1 (Fig. 8) . Este facto está em concordância com a incapacidade do peptídeo fibronectina GRGDSP e do peptídeo de regulação GRGESP de inibirem a adesão ICAM-LFA1 (Marlin, D.D., et al., Cell 5JL: 813-819 (1987)). No entanto, existem sequências relacionadas tais como PRGGS e RGEKE em regiões da ICAM-1 que se prevê constituam ciclos entre as cadeias β a e b do domínio 2 e c e d do domínio 2, respectivamente (Fig. 9), que deste modo estão acessíveis para reconhecimento. Constitui um facto de interesse a circunstância de a molécula MAG homóloga conter uma sequência RGD entre os domínios 1 e 2 (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105: 18931899 (1987); Salzer, J.L., et al., J. Cell Biol. 104: 957-965 (1987)).
EXEMPLO 19
Análise de mancha de Southern e Northerm
Foram realizadas análises de mancha de Southern usando 5 gg de ADN genómico extraído de três linhas de células: BL2, uma linha de células de linfoma de Burkitt (oferta do Dr. Gilbert Lenoir); e linhas de células JY e Er-LCL linfoblastóide B transformada por ESV.
Os ADNs foram digeridos com 5X a quantidade recomendada pelos fornecedores de endonucleases Bam HI e ECO RI (New England Biolabs). Após electroforese através de um gel de agarose a 0,8%, os ADNs foram transferidos para uma membrana de nylon (Zeta Probe, Biorad). 0 filtro foi pré-hibridado e hibridado de acordo com procedimentos normais usando ADNc de ICAM obtido a partir de HL-60 marcado com a-(32P)d XTP' s por iniciação aleatória (Boehringer Mannheim). Realizaram-se análises de mancha de Northern usando 20 μg de ADN total ou 6 pg de poli(A)' ARN. O ARN foi desnaturado, separado por electroforese através de um gel de agarose-formaldeído a 1% e electrotransferido para Zeta Probe. Os filtros foram pré-hibridados e hibridados conforme anteriormente descrito (Staunton, D.E., et al., EMBO., J. 6: 3695-3701 (1987)) usando a sonda de ADNc de HL-60 das sondas oligonucleotídicas marcadas por 32P (descritas acima).
As análises de mancha de Southern usando a sonda de ADNc de 3 Kb e ADN genómico digerido com Bam HI e EcoRI mostraram fragmentos predominantes simples que hibridam de 20 e de 8 Kb, respectivamente, sugerindo a ocorrência de um único gene e sugerindo que a maior parte da informação de codificação está presente na fracção de 8 Kb. Em análises de mancha de 3 linhas de células diferentes não há evidência de polimorfismo dos fragmentos de restrição.
EXEMPLO 20
Expressão do Gene de ICAM-1
Um vector de expressão é um vector que (devido à presença de sequências apropriadas de regulação de transcrição e/ou de tradução) é capaz de expressar uma molécula de ADN (ou de ADNc)
que tenha sido clonada no vector e deste modo produzir um polipeptídeo ou uma proteína.
A expressão das sequências clonadas ocorre quando o vector de expressão é introduzido numa célula hospedeira apropriada. Quando se utiliza um vector de expressão procariótico, então a célula hospedeira apropriada pode ser qualquer célula procariótica capaz de expressar as sequências clonadas. De modo semelhante, se se emprega um vector de expressão eucariótico, então a célula hospedeira apropriada poderá ser qualquer célula eucariótica capaz de expressar as sequências clonadas. É importante notar que, uma vez que o ADN eucariótico pode conter sequências intercaladas e uma vez que estas sequências não podem ser correctamente processadas em células procarióticas, é preferível empregar ADNc de uma célula que seja capaz de expressar ICAM-1 a fim de produzir um banco de vectores de expressão genómico procariótico. Os procedimentos para preparar ADNc e para produzir um banco genómico são descritos por Maniatis, T., et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
banco genómico de vectores de expressão acima descrito é usado para produzir um banco de células hospedeiras (cada uma das quais contém um membro do banco de vectores). 0 vector de expressão pode ser introduzido numa célula hospedeira por uma qualquer de variadas técnicas (por exemplo, transformação, transfecção, fusão de protoplastos, electroporação, etc.). 0 banco de células contendo os vectores de expressão é propagado por clonagem e os seus membros são avaliados individualmente (por uma análise imunológica) a fim de determinar se produzem uma proteína capaz de ligação a anticorpo anti-ICAM-1.
Os vectores de expressão destas células que produzem uma proteína capaz de ligação a anticorpo anti-ICAM-1 são então
portanto se contêm) o gene de ICAM-1 completo, se expressam (e contêm) apenas um fragmento do gene de ICAM-1 ou se expressam (e contêm) um gene cujo produto, embora relacionado imunologicamente com a ICAM-1, não é ICAM-1. Se bem que uma análise como esta possaa ser realizada por qualquer técnica conveniente, é preferível determinar a sequência de nucleótidos do fragmento de ADN ou de ADNc que foi clonado no vector de expressão. Estas sequências nucleótidicas são em seguida examinadas para determinar se são capazes de codificar para polipeptídeos contendo a mesma sequência de ácidos aminados dos fragmentos de digestão tríptica da ICAM-1 (Quadro 5).
Um vector de expressão que contém uma molécula de ADN ou de ADNc que codifica o gene de ICAM-1 pode, deste modo, ser reconhecido: (i) pela capacidade para dirigir a expressão de uma proteína que é capaz de ligação a anticorpo anti-ICAM-1; e (ii) pela presença de uma sequência nucleótidica que é capaz de codificar para qualquer dos fragmentos trípticos da ICAM-1. A molécula de ADN cionada de um vector de expressão como os descritos pode ser retirada do vector de expressão e isolada sob forma pura.
EXEMPLO 21
Actividades Funcionais de ICAM-1 Purificada
Nas células, normalmente, a ICAM-1 funciona como uma proteína de superfície associada com a membrana celular. Por conseguinte a função da ICAM1 purificada foi ensaiada depois de uma molécula ter sido reconstituída em membranas lipídicas artificiais (lipossomas ou vesículas) por dissolução da proteína em lípidos solubilizados por detergentes após remoção do detergente por diálise. A ICAM-1 purificada a partir de células JY e eluída no detergente octilglucósido, conforme descrito acima, foi reconstituída em vesículas e as vesículas contendo ICAM-1 foram fundidas em lamelas de vidro ou em alvéolos de cultura em plástico a fim de permitir a detecção de células que se liguem à proteína.
Preparação de membranas planares e de vesículas ligadas a plástico
Preparam-se vesículas pelo método de Gay et al., (J. Immunol. 136: 2026 (1986)). Resumidamente, dissolveram-se fosfatidilcolina de ovo e colesterol em clorofórmio e misturaram-se numa proporção molar de 7:2. A mistura de líptidos foi seca por rotação sob uma corrente de azoto até se obter uma película fina e em seguida foi liofilizada durante 1 hora a fim de eliminar completamente os traços de clorofórmio. A película lipídica foi em seguida dissolvida em octilglucósido a 1%/NaCl 0,14 M/tris 20 mM (pH 7,2) até uma concentração final de fosfatidilcolina de 0,1 mM. Aproximadamente 10 gg de ICAM-1 purificada ou de glicoforina humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , utilizada como glicoproteína de membrana de comparação, foram adicionados a cada ml de lípidos dissolvidos. A solução proteína-lípidos-detergente foi então dialisada a 4°C contra 3 mudanças de 200 volumes de tris 20 mM/NaCl 0,14 M a pH 7,2 e uma mudança de HBSS.
As membranas planares foram preparadas pelo método de Brian et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 6159 (1984). Ferveram-se lamelas de vidro (11 mm de diâmetro) durante 15 minutos numa diluição de 1:6 de detergente 7X (Linbro), lavaram-se dum dia para o outro em água destilada, passaram-se por etanol a 70% e secaram-se ao ar. Colocou-se no fundo de cada alvéolo, numa placa de 24 alvéolos, uma gota de 80 gg de suspensão das vesículas contendo ICAM-1 ou glicoforina e as lamelas de vidro preparadas conforme descrito foram postas cuidadosamente a flutuar na superfície. Após 20 a 30 minutos de incubação à temperatura ambiente os alvéolos foram cheios com HBSS e as lamelas foram invertidas a fim de virar a membrana planar para cima. Os alvéolos foram em seguida lavados abundantemente com HBSS a fim de eliminar as vesículas não ligadas. A membrana planar nunca foi exposta ao ar.
Durante as experiências com membranas planares fundidas a superfície de vidro verificou-se que as vesículas contendo ICAM1 se ligavam directamente à superfície de plástico de placas de cultura de tecidos multi-alvéolos e que conservavam a actividade funcional, conforme evidenciado pela ligação específica de células. Estas vesículas são seguidamente referidas por vesículas ligadas ao plástico (plastic-bound vesicles = PBV), uma vez que a natureza das vesículas lipídicas ligadas ao plástico não foi determinada. As vesículas ligadas ao plástico foram preparadas por adição de 30 μΐ de uma suspensão de vesículas directamente ao fundo dos alvéolos em bandejas de
cultura de tecidos | de 96 alvéolos | (Falcon), | seguida de incubação | |
e lavagem, de modo análogo ao | descrito | para as | membranas | |
planares. | ||||
Análises de adesão | celular | |||
As análises | de adesão | celular | foram | realizadas |
essencialmente de | modo idêntico | para as membranas | planares e |
para as vesículas ligadas ao plástico, com a única diferença de que o número de células e os volumes para as análises para PBV foram reduzidos para um quinto dos valores usados em análises de membranas planares.
Prepararam-se linfocitos T de indivíduos normais para comparação e de um paciente com Deficiência de Adesão aos Leucócitos (Leukocite Adhesion Deficiency = LAD) cujas células não tinham capacidade para expressar LFA-1 (Anderson, D.C. et al., J. Infect. Pis. 152: 668 (1985)) por cultura de células mononucleares de sangue periférico com 1 μg/ml de concavalina A (Con-A) em meio RPMI-1640 mais FCS a 20% a 5 X 105 células/ml durante 3 dias. Em seguida as células foram lavadas duas vezes com RPMI e uma vez com metil-alfa-D-manopiranosido a fim de eliminar a lecitina residual da superfície celular. As células foram cultivadas em meio RPMI/FCS a 20% contendo 1 ng/ml de IL-2 recombinante e foram usadas entre 10 e 22 dias depois do início da cultura.
A fim de detectar a ligação das células às membranas planares ou a PBV, marcaram-se com isótopos radioactivados células blásticas Con-A, as linhas de células linfoma T SKW-3 e JY linfoblastóides B transformadas por EBV (positiva em relação a LFA-1) e a linha de células linfoblastóides deficientes em LFA-1 (BBN) (derivada a partir do paciente 1, Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1986)) por incubação de 1 x 107 células em 1 ml de meio RPMI-1640/FCS a 10% com 100 μCi de Na51CrC>4 durante 1 hora a 37°C, seguida de quatro lavagens com meio RPMI-1640 a fim de eliminar a marcação não incorporada. Em experiências de bloqueio de anticorpos monoclonais, submeteramse células ou vesículas ligadas ao plástico a pré-tratamento com 20 μg/ml de anticorpo purificado em meio RPMI-1640/FCS a 10% a 4°C durante 30 minutos, seguido de 4 lavagens para eliminar o anticorpo não ligado. Em experiências sobre os efeitos de catiões divalentes sobre a ligação celular, as células foram lavadas uma vez com Ca21, HBSS isento de Mg21 mais 10% de FCS dialisado, e adicionou-se CaCl e MgCl até às concentrações indicadas. Em todas as experiências as células e as membranas planares ou as PBV foram pré-equilibradas à temperatura apropriada (4°C, 22°C ou 37°C) no tampão de análise apropriado.
A fim de medir a ligação das células a ICAM-1 purificada, centrifugaram-se durante 2 minutos a 25 x g células marcadas com 51Cr (5 χ 105 transformantes de EBV em análises de membranas planares; 1 χ 105 transformantes de EBV ou células SKW-3 e 2 x 105 células blásticas Con-A em análises de PBV) sobre as membranas planares ou as PBV, incubando em seguida a 4°C, 22°C ou 37°C durante uma hora. Após a incubação, eliminaram-se as células não ligadas por oito ciclos de enchimento e aspiração com tampão pré-equilibrado à temperatura apropriada. Determinouse a quantidade de células ligadas por solubilização do conteúdo dos alvéolos com NaOH 0,1 N/Triton X-100 a 1% e contagem num contador gama. Determinou-se a percentagem de ligação dividindo o resultado em cpm do valor associado às células. Em análises de membranas planares o valor em cpm foi corrigido para a razão entre a superfície das lamelas e a superfície dos alvéolos de cultura.
Nestas análises, as células linfoblastóides B transformadas por EBV, as células T de linfoma SKW-3 e os linfoblastos T Con-A ligaram-se especificamente a ICAM-1 em membranas artificiais (Figuras 11 e 12) . A ligação era específica uma vez que as células se ligaram de modo muito fraco às membranas planares ou a vesículas de comparação contendo quantidades equivalentes de outra glicoproteína de superfície das células humanas, a glicoforina. Além disso, os transformantes por EBV positivos em relação a LFA-1 e os blastos ligaram-se, enquanto que as células correspondentes negativas em relação a LFA-1 não se conseguiram ligar em quantidade significativa, demonstrando que a ligação era dependente da presença de LFA-1 nas células.
Tanto a especialidade da ligação das células como a dependência de LFA-1 celular foram confirmados em experiências de bloqueio de anticorpos monoclonais (Figura 13). Foi possível inibir a ligação de células JY em 97% quando as PBV contendo ICAM-1 foram tratadas previamente com o anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 Rrl/1. 0 tratamento prévio das células com o mesmo anticorpo teve um efeito reduzido. Pelo contrário, o anticorpo monoclonal anti-LFA-1 Tsl/18 inibiu a ligação em 96%, mas apenas quando o tratamento prévio foi feito às células e não às PBV. Um anticorpo de comparação TS2/9 reactivo com LFA-3 (um antigene de superfície dos linfócitos diferente) não teve qualquer efeito de inibição significativo quando se efectuou o tratamento prévio quer nas células quer nas PBV. Esta experiência demonstra que a ICAM-1 medeia nas membranas artificiais só por si, e não qualquer contaminante presente em pequena quantidade, a adesão celular observada e que a adesão é dependente da existência de LFA-1 na célula a ligar.
A ligação de células a ICAM-1 em membranas artificiais também apresentou duas outras características do sistema de adesão dependente de LFA-1: dependência da temperatura e necessidade da presença de catiões divalentes. Como se mostra na Figura 14, os blastos Con-A ligam-se a ICAM-1 em PBV mais eficazmente a 37°C, parcialmente a 22°C e muito fracamente a 4°C. Como se mostra na Figura 15, a ligação era completamente dependente da presença de iões divalentes. A concentrações fisiológicas era suficiente apenas Mg2+ para a máxima ligação das células, enquanto que Ca2+ isoladamente produzia níveis de ligação muito baixos. No entanto Mg2+ a um décimo da concentração normal com Ca2+ apresentava um efeito sinergístico e produzia a ligação máxima.
Resumidamente, a especificidade da ligação das células a ICAM-1 purificada incorporada em membranas artificiais, a inibição específica com anticorpos monoclonais e a dependência da temperatura e de catiões divalentes demonstram que a ICAM-1 é um ligando específico para o sistema de adesão dependente de LFA-1.
EXEMPLO 22
Expressão de ICAM-1 e de HLA-DR em Reacções Alérgicas e ao Ensaio do Penso Tóxico
Estudaram-se biópsias da pele de cinco indivíduos normais no que respeita à respectiva expressão de ICAM-1 e de HLA-DR. Verificou-se que enquanto que as células endoteliais em alguns vasos sanguíneos normalmente expressam ICAM-1, não existe expressão de ICAM-1 em queratinócitos de pele normal. Não se observou coloração de HLA-DR em qualquer queratinócito de biópsias de pele normal. Estudou-se então a cinética da expressão de ICAM-1 e de antigenes da classe II em células em biópsias de lesões da pele alérgicas e tóxicas. Verificou-se que metade dos indivíduos estudados tinham queratinócitos que expressavam ICAM-1 quatro horas após a aplicação do hapteno (Quadro 10). Havia um aumento na percentagem de indivíduos que expressavam ICAM-1 nos seus queratinócitos com o tempo de exposição ao hapteno bem como um aumento na intensidade da coloração indicando maior expressão de ICAM-1 por queratinócito até às 48 horas. De facto, nesse momento uma quantidade de queratinócitos em todas as biópsias apresentaram coloração positiva para ICAM-1. às 72 horas (24 horas após se ter retirado o hapteno), sete dos oito indivíduos ainda tinham expressão de ICAM-1 nos seus queratinócitos, enquanto a expressão de ICAM-1 num indivíduo decaiu entre 48 e 72 horas.
QUADRO 10
Cinética da Indução de ICAM-1 e de HLA-DR em Queratinócitos de
Biópsias dos Ensaios de Penso Alérgico | |||||
Tempo após apli- | N° | . de | Apenas | Apenas | ICAM-1 + |
cação do penso (h) | biópsias | ICAM-1 | HLA-DR | + HLA-DR | |
Pele normal | 5 | 0 | 0 | 0 | |
Ensaio do penso alérgico 4 | 6 | 3a | 0 | 0 | |
8 | 9 | 3 | 0 | 0 | |
24 | 8 | 7 | 0 | 0 | |
48b | 8 | 5 | 0 | 3 | |
72 | 8 | 6 | 0 | 1 |
a) As amostras foram consideradas positivas se pelo menos se coraram pequenos conjuntos de queratinócitos. b) Todos os pensos foram retirados neste momento.
Histologicamente o padrão de coloração para ICAM-1 nos queratinócitos de biópsias colhidas quatro horas após a aplicação do hapteno era normalmente em pequenos conjuntos, às 48 horas, a ICAM-1 era expressa na superfície da maioria dos queratinócitos, não se verificando qualquer diferença entre o centro e a periferia da lesão. A intensidade da coloração diminuía à medida que os queratinócitos estavam mais próximos do stratum corneum. Esta verificação foi feita em biópsias colhidas tanto do centro como da periferia das lesões. Também nesse momento o ensaio do penso era positivo (infiltração, eritema e vesículas). Não se observou qualquer diferença na expressão da ICAM-1 quando se aplicaram diferentes haptenos nos indivíduos sensíveis. Além dos queratinócitos, a ICAM-1 também era expressa
em algumas células mononucleares e células endoteliais no local da lesão.
A expressão de HLA-DR em queratinocitos em lesões alérgicas da pele era menos frequente do que a de ICAM-1. Nenhum dos indivíduos estudados tinha lesões com queratinocitos que adquiriam coloração positiva para HLA-DR até 24 horas após a aplicação do hapteno. De facto, apenas quatro amostras submetidas a biópsia tinham queratinocitos que expressavam HLADR e nenhuma biópsia tinha queratinocitos que eram positivos em relação a HLA-DR e não de ICAM-1 (Quadro 10).
Em contraste com a lesão do ensaio do penso alérgico, a lesão do ensaio do penso tóxico, induzida com óleo de cróton ou com sulfato de sódio e laurilo tinha queratinocitos que apresentavam pouca ICAM-1 ou nenhuma nas respectivas superfícies em todos os momentos do ensaio (Quadro 11) . De facto, às 48 horas após a aplicação do penso, que era o momento óptimo para a expressão de ICAM-1 nos indivíduos do ensaio do penso alérgico, apenas um dos 14 indivíduos do ensaio do penso tóxico tinha expressão de ICAM-1 nos queratinocitos nas suas lesões. Também em contraste com as biópsias do ensaio do penso alérgico, não havia expressão de HLA-DR nos queratinocitos das lesões de ensaios do penso tóxico.
Estes dados indicam que a ICAM-1 é expressa em inflamação de origem imune e não em inflamação de origem tóxica, e deste modo a expressão de ICAM-1 pode ser usada para distinguir entre inflamaçãao de origem imune e de origem tóxica, tal como uma insuficiência renal aguda em pacientes com transplantes do rim em que é difícil de determinar se a insuficiência é devida à rejeição ou à nefrotoxicidade do agente terapêutico de imunosupressão. A biópsia renal e a avaliação da regulação para o aumento da expressão de ICAM-1 permitirão uma diferenciação da rejeição de origem imune e da reacção de toxicidade de origem não-imune.
QUADRO 11
Cinética da Indução de ICAM-1 e de HLA-DR em Queratinocitos de
Biópsias dos Ensaios | do Penso | Tóxico | ||
Tempo após aplicação do penso (h) | N°. de biópsias | Apenas ICAM-1 | Apenas HLA-DR | ICAM-1 + HLA-DR |
4 | 4 | 0 | 0 | 0 |
8 | 3 | Ia | 0 | 0 |
24 | 3 | 1 | 0 | 0 |
48b | 14 | 1 | 0 | 0 |
72 | 3 | 1 | 0 | 0 |
a) As amostras foram consideradas positivas se pelo menos se coraraam pequenos conjuntos de queratinocitos.
b) Todos os pensos foram retirados neste momento.
EXEMPLO 23
Expressão de ICAM-1 e de HLA-DR em Doenças Cutâneas Benignas
Estudaram-se células de biópsias de pele de pacientes com vários tipos de doenças inflamatórias da pele no que respeita à sua expressão de ICAM-1 e de HLA-DR. Uma quantidade de queratinocitos em biópsias de eczema de contacto alérgico, de penfigóide/pênfigo e de líquen plano expressavam ICAM-1. As biópsias de líquen plano mostraram a coloração mais intensa com um padrão similar a ou ainda mais forte do que o observado nas biópsias de ensaios de penso alérgico de 48 horas (Quadro 12) . Em concordância com os resultados observados no ensaio de penso alérgico, a coloração de ICAM-1 mais intensa foi observada em locais de infiltração intensa de células mononucleares. Além ensaiadas foram de HLA-DR em disso, 8 de 11 biópsias de líquen plano positivas no que se refere à expressão queratinocitos.
A expressão de ICAM-1 nos queratinocitos de biópsias da pele de pacientes com exantema e urticária foi menos pronunciada. Apenas quatro de sete pacientes ensaiados com estas doenças tinham queratinocitos que expressavam ICAM-1 no local da lesão. A expressão HLA-DR foi encontrada apenas num paciente e em conjunto com ICAM-1.
As células endoteliais e alguns infiltrados de células mononucleares de todas as doenças de pele inflamatórias benignas ensaiadas expressavam ICAM-1 em graus variáveis.
QUADRO 12
Expressão de ICAM-1 e de HLA-DR em Queratinocitos de Doenças cutâneas Benignas
Diagnóstico | N° . de casos | Apenas ICAM-1 | Apenas HLA-DR | ICAM-1 + + HLA-DR |
Eczema alérgico | ||||
de contacto | 5 | 3a | 0 | 2 |
Líquen plano | 11 | 3 | 0 | 8 |
Penfigóide/ | ||||
/Pênfigo | 2 | 2 | 0 | 0 |
Exantema | 3 | 2 | 0 | 0 |
Urticária | 4 | 1 | 0 | 1 |
a) As amostras foram consideradas como positivas se pelo menos se corarem pequenos conjuntos de queratinocitos.
EXEMPLO 24
Expressão de ICAM-1 em Queratinocitos de Lesões de Pele de Psoriase
Estudou-se a expressão de ICAM-1 em biópsias de pele de 5 pacientes com psoriase antes do início e periodicamente durante o tratamento com PUVA. Foram obtidas biópsias de 5 pacientes com psoriase clássica confirmada histologicamente. As biópsias foram colhidas sequencialmente antes e durante o período indicado de tratamento com PUVA. Administrou-se PUVA 3 a 4 vezes por semana. As biópsias foram colhidas da periferia das placas de psoriase de cinco pacientes e foram, além disso, colhidas biópsias de pele clinicamente normal em quatro dos pacientes.
As amostras de biópsias de pele frescas foram congeladas e conservadas em azoto líquido. Secaram-se ao ar dum dia para o outro à temperatura ambiente secções criostáticas de 6 mícrons, fixaram-se em acetona durante 10 minutos e coraram-se imediatamente ou embrulharam-se em folha de alumínio e guardaram-se a -80°C até serem coradas.
A coloração foi realizada do modo seguinte. Incubaram-se as secções com anticorpos monoclonais e coraram-se pelo método da imunoperoxidase em três fases (Stein, H., et al., Ad. Câncer Res. 42: 67-147, (1984), usando um substrato de diaminobenzidina H2O2. Usaram-se amígdalas e gânglios linfáticos para amostras de comparação positivas para coloração anti-ICAM-1 e HLA-DR. Para amostras de comparação negativas usaram-se tecidos corados na ausência de anticorpo primário.
Os anticorpos monoclonais contra HLA-DR foram adquiridos de Becton Dickinson (Montainview, Califórnia). O anticorpo antiICAM-1 monoclonal era R6-5-D6. A Ig anti-rato de coelho de suíno
100
conjugada com peroxidase foram adquiridos de DAKAPATTS, Copenhaga, Dinamarca. 0 tetracloridrato de diaminobenzidina foi obtido de Sigma (St. Louis, Mo.).
Os resultados do estudo mostram que as células endoteliais em alguns vasos sanguíneos expressam ICAM-1 tanto em pele doente como em pele normal mas a intensidade de coloração e o número de vasos sanguíneos que expressam ICAM-1 aumentou nas lesões da pele de psoríase. Para além disso, o padrão de expressão de ICAM-1 em queratinocitos de lesões de psoríase não tratada dos cinco pacientes variava desde apenas pequenos conjuntos de células coradas até muitos queratinocitos corados. Durante o decurso do tratamento com PUVA, a expressão de ICAM-1 em 2 dos pacientes (paciente 2 e 3) mostrou uma redição considerável que procedeu ou coincidiu com a remissão clínica (Quadro 13) . Os pacientes 1, 4 e 5 tiveram diminuições e aumentos da expressão de ICAM-1 durante o tratamento com PUVA, os quais coincidiram com remissões e recidivas clínicas, respectivamente. Não havia expressão de ICAM-1 em queratinocitos de pele normal antes ou depois do tratamento com PUVA. Este facto indica que o PUVA não induz ICAM-1 em queratinocitos de pele normal.
É de salientar a observação de que a densidade do infiltrado de células mononucleares estava em relação com a quantidade de expressão de ICAM-1 nos queratinocitos. Esta observação diz respeito tanto à diminuição do número de células mononucleares em lesões duraante o tratamento com PUVA quando a expressão de ICAM-1 também diminuiu como ao aumento do número de células mononucleares durante o tratamento com PUVA quando a expressão de ICAM-1 nos queratinocitos era mais pronunciada. As células endoteliais e as células mononucleares da pele são também positivas em relação a ICAM-1. Em pele clinicamente normal, a expressão de ICAM-1 estava confinada às células endoteliais sem classificação de queratinocitos.
101
A expressão de HLA-DR em queratinócitos era variável. Não houve qualquer biópsia positiva para HLA-DR que fosse também positiva em relação a ICAM-1.
Em resumo, estes resultados mostram que antes do tratamento a expressão de ICAM-1 é pronunciada nos queratinócitos e está relacionada com um infiltrado denso de células mononucleares. Durante o tratamento com PUVA verifica-se uma diminuição pronunciada da coloração de ICAM-1 em paralelo com a melhoria clínica. Histologicamente o infiltrado dermal também diminuiu. Quando era óbvia uma recidiva clínica durante o tratamento, a expressão de ICAM-1 nos queratinócitos aumentava, bem como a densidade do infiltrado dérmico. Quando se verificava uma remissão clínica durante o tratamento, havia uma diminuição da coloração da ICAM-1 nos queratinócitos em concordância, bem como uma diminuição no infiltrado dérmico. Deste modo, a expressão de ICAM-1 nos queratinócitos correspondia à densidade do infiltrado de células mononucleares da derme. Estes dados mostram que a resposta clínica ao tratamento com PUVA tinha como resultado uma diminuição pronunciada da expressão de ICAM-1 nos queratinócitos paralelamente com um declinio mais moderado das células mononucleares. Este facto indica que a expressão de ICAM-1 nos queratinócitos é responsável pelo início e pela manutenção da infiltração dérmica e que o tratamento com PUVA provoca a redução da ICAM-1, a qual por seu turno reduz a infiltração dérmica e a resposta inflamatória. Os dados também indicam que havia uma expressão variável de HLA-DR nos queratinócitos durante o tratamento com PUVA.
A expressão de ICAM-1 nos queratinócitos de lesões de psoríase está em concordância com o grau de gravidade clínica da lesão bem como com a dimensão da infiltração dérmica. Deste modo a ICAM-1 desempenha um papel central na psoríase e a inibição da
102 sua expressão e/ou a inibição da sua interacção com o complexo CD 18 sobre as células mononucleares constituirá um tratamento efectivo da doença. Além disso, a monitorização da expressão de ICAM-1 nos queratinocitos constituirá um meio eficaz de diagnóstico e de prognóstico, bem como de avaliação do curso de terapia da psoríase.
QUADRO 13
Expressão Sequencial por Queratinocitos em Lesões com Psoríase (PS) e em Pele clinicamente Normal (N) antes e durante o Tratamento com PUVA
Tempo antes e | paciente n°. | |||||||
durante o trata- | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
mento com PUVA | PS | PS | N | PS N | PS | N | PS | N |
0 | + | + | - | ++ | + + | — | +++ | - |
1 dia | + | |||||||
1 semana | + | + | - | - | ++ | - | + | - |
0 | ||||||||
2 semanas | ++ | + | + | - | + | - | ||
3 semanas | ++ | |||||||
Ar | 0 | |||||||
4 semanas | + + | + | - | - | + + | - | ||
Ar | * | |||||||
5-6 semanas | - | - | - | - | ||||
0 | ||||||||
7 semanas | (++) | (+) | +++ | - | ||||
Ar | Ar | |||||||
10 semanas | (+) | — | — |
+++ Muitos queratinocitos positivos ++ Alguns queratinocitos positivos
103
+ Queratinocitos positivos em focos (+) Muito poucos queratinocitos positivos esporádicos
Ausência de coloração positiva * Remissão clínica
Recidiva clínica
EXEMPLO 25
Expressão de ICAM-1 e de HLA-DR em Doenças Cutâneas Malignas
Ao contrário das condições cutâneas benignas, a expressão de ICAM-1 com queratinocitos de lesões da pele malignas era muito mais variável (Quadro 13) . Dos 23 linfomas de células T cutâneos estudados, foram identificados queratinocitos positivos para ICAM-1 em apenas 14 casos. Havia uma tendência para os queratinocitos de biópsias de lesões de micose fungóide perderem expressão de ICAM-1 com o progresso da doença para estádios mais avançados. No entanto, a expressão de ICAM-1 foi observada numa proporção variável dos infiltrados de células mononucleares da maior parte das lesões de linfoma de células T cutâneas. Entre os restantes linfomas estudados, quatro de entre oito tinham queratinocitos que expressavam ICAM-1. Dos 29 pacientes com doenças cutâneas malignas examinados, 5 tinham queratinocitos que expressavam HLA-DR sem expressarem ICAM-1 (Quadro 14).
104
QUADRO 14
Expressão de ICAM-1 e de HLA-DR em Queratinocitos de Doenças Cutâneas Malignas
Diagnóstico | N° .de casos | Apenas ICAM-1 | Apenas HLA-DR | ICAM + + HLA-DR |
CTCL, MFI | 8 | Ia | 0 | 4 |
CTCL, MFII-III | 10 | 1 | 2 | 5 |
CTCL, SS | 3 | 1 | 0 | 2 |
CTCL, Células grandes 2 | 0 | 2 | 0 | |
CBCL | 2 | 0 | 0 | 1 |
Leucemia cutânea | 3 | 1 | 1 | 1 |
Histiocitose X | 1 | 0 | 0 | 0 |
a) As amostras | foram consideradas | como positivas | se pelo |
menos se corarem pequenos conjuntos de queratinocitos.
EXEMPLO 26
Efeito de Anticorpos Anti-ICAM-1 na Proliferação de Células Mononucleares no Sangue Periférico Humano
A proliferação das células mononucleares do sangue periférico humano é induzida pela presença e pelo reconhecimento de antigenes ou de mitogenes. Certas moléculas, como o mitogene concanavalina A ou o anticorpo OKT3 de ligação de células T, causam a ocorrência de uma proliferação não específica de células mononucleares no sangue periférico.
As células mononucleares do sangue periférico são heterogéneas no sentido de que são compostas por sub-populações
105
de células que são capazes de reconhecer antigenes específicos. Quando uma célula mononuclear do sangue periférico que é capaz de reconhecer um antigene específico particular encontra o antigene, induz-se a proliferação dessa sub-população de células mononucleares. 0 toxóide do tétano e a hemocianida da Megathura crenulata (Keyhole Limpet hemocyanin) são exemplos de antigenes que são reconhecidos por sub-população de células mononucleares periféricas mas não são reconhecidos por todas as células mononucleares periféricas em indivíduos sensibilizados.
Ensaiou-se a capacidade do anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 R6-5-D6 para inibir as respostas poliferativas das células mononucleares do sangue periférico em sistemas conhecidos por necessitarem de adesões célula-célula.
Purificaram-se células mononucleares do sangue periférico em gradientes de Ficoll-Paque (Pharmacia), de acordo com as instruções do fornecedor. A seguir a uma concentração na interface, as células foram lavadas três vezes com meio RPMI 1640 e foram cultivadas em placas de microtitulação de 96 alvéolos de fundo plano a uma concentração de 106 células/ml em meio de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, glutamina 2 mM e gentamicina (50 gg/ml).
Adicionou-se o antigene às células, seja o mitogene de células T, concanavalina A (0,25 gg/ml); o anticorpo OKT3 de ligação de células T (0,001 gg/ml); hemocianina de Megathura crenulata (10 g/ml) ou toxóide de tétano (diluição a 1:100 da origem) e cultivaram-se as células como descrito acima na presença ou na ausência de anticorpo anti-ICAM (R6-5-D6; concentração final de g/ml). Cultivaram-se as células durante
3,5 dias (experiência com concanavalina A), 2,5 dias (experiência com OKT3) ou 5,5 dias (experiências com hemocianina
106
de Megathura crenulata e com toxóide de tétano) antes de terminar as experiências.
Dezoito horas antes de terminar a experiência adicionaramse 2,5 gCi de H-timidina às culturas. Determinou-se a proliferação celular por medida da incorporação de timidina no ADN pelas células mononucleares do sangue periférico. A timidina incorporada foi reunida e contada num contador de cintilação líquida (Merluzzi et al., J. Immunol. 139: 166-168 (1987)). Os resultados dessas experiências são apresentados na Figura 16 (experiência com concanavalina A) , Figura 17 (experiência com OKT3), Figura 18 (experiência com hemocianina de Megathura crenulata) e Figura 19 (experiência do toxóide de tétano).
Verificou-se que o anticorpo anti-ICAM-1 inibe as respostas proliferativas ao mitogene de células T não específicas, ConA; o antigene associado a células T não específicas, OKT-3; e os antigenes específicos, hemocianina de Megathura crenulata e toxóide de tétano, em células mononucleares. A inibição pelo anticorpo anti-ICAM-1 era comparável à do anticorpo anti-LFA-1 sugerido que a ICAM-1 é um ligando funcional da LFA-1 e que este antagonismo da ICAM-1 inibirá as respostas específicas do sistema de defesa.
EXEMPLO 27
Efeito do Anticorpo Anti-ICAM-1 na Reacção de Linfócitos Mistos
Como discutido acima, a ICAM-1 é necessária para interacções celulares efectivas durante uma resposta imune mediada por meio de adesão celular dependente de LFA-1. A indução de ICAM-1 durante as respostas imunes ou as doenças inflamatórias permite a interacçâo de leucócitos entre si e com células endoteliais.
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Quando se cultivam linfócitos de dois indivíduos não relacionados na presença uns dos outros, observou-se a transformação dos blastos e a proliferação celular dos linfócitos. Esta resposta de uma população de linfócitos à presença de uma segunda população de linfócitos é conhecida como uma reacção de linfócitos mistos (mixed lymphocyte reaction = MLR) e é análoga à resposta de linfócitos à adição de mitogénios (Immunology The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J., John Wiley & Sons, NY (1982), pp. 453-458).
As experiências foram levadas a efeito para determinar o efeito dos anticorpos monoclonais anti-ICAM na MLR humana. Estas experiências foram conduzidas como se segue. 0 sangue periférico foi obtido de dadores normais saudáveis por venipunctura. 0 sangue foi colhido em tubos com heparina e foram diluídos 1:1 à temperatura ambiente com solução salina equilibrada G de Puck (GIBCO) . A mistura de sangue (20 ml) foi depositada numa camada sobre 15 ml de um gradiente de densidade de Ficoll/Hypaque (Pharmacia, densidade = 1,078, temperatura ambiente) e foi centrifugada a 100 X g durante 20 minutos. A interface foi então separada e lavada 3 x em solução G de Puck. As células foram contadas num hemacitómetro e ressuspensas em meio de cultura RPMI-1640 (GIBCO) contendo 0,5% de gentamicina, L-glutamina 1 mM (GIBCO) e 5% de soro AB humano inactivado pelo calor (56°C, 30 min) (Flow Laboratories) (seguidamente referido por meio de cultura RPMI).
Usou-se nestas experiências anti-ICAM-1 de rato (R6-5-D6). Todos os anticorpos monoclonais (preparados a partir de ascites por Jackson Immuno Research Laboratories, Boston, MA) foram usados sob a forma de preparações de IgG purificadas.
108
As células mononucleares de sangue periférico (peripheral blood mononuclear cells = PMMC) foram cultivadas no meio a 6,25 χ 105 células/ml em placas de microtitulação de fundo redondo Limbro (n°. 76-013-05). Irradiaram-se células estimuladoras de um dador separado a 1000 R e cultivaram-se com células receptivas à mesma concentração. O volume total por cultura era de 0,2 ml. As amostras de comparação incluíam apenas células receptivas bem como apenas células estimuladoras. As placas de cultura foram incubadas a 37°C numa atmosfera de ar humidificado com 5% de CO2 durante 5 dias. Os alvéolos de cultura foram agitados com 0,5 pCi de timidina tritiada (3HT) (New England Nuclear) durante as últimas 18 horas da cultura. Em alguns casos levou-se a efeito uma MLR de duas vias. O protocolo foi o mesmo excepto que as células do segundo dador não foram inactivadas por irradiação.
As células foram colhidas em filtros de fibra de vidro usando um amostrador múltiplo automático (Skatron, Noruega), e foram enxaguadas com água e metanol. Os filtros foram secos numa estirpe e analisados num contador de cintilação liquida Beckman (LS-3801) em Aquasol. Os resultados foram calculados sob a forma de médias + desvio padrão em 6 culturas individuais.
O Quadro 15 mostra que os anticorpos monoclonais anti-ICAM-1 purificados inibem a MLR de um modo dependente da dose com supressão aparente significativa a 20 ng/ml. A IgG purificada tinha pouco ou nenhum efeito. A supressão de MLR pelo anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 ocorre quando o anticorpo é adicionado nas primeiras 24 horas de cultura (Quadro 16).
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QUADRO 15
Efeito do Anticorpo Anti-ICAM-1 na Reacção de Linfócitos de uma Via
Incorporação a) e Células | de 3HT (CPM) Estimuladoras | do anticorpo b) | c) em Células | Receptivas |
- | - | - | 445d | + 143 |
- | + | - | 148 | + 17 |
+ | — | — | 698 | ± 72 |
+ | + | - | 42,626 | + 1,579 |
+ | + mlgG (10 | .0 μ5) | 36, 882 + 1, | 823 (14%) |
+ | + mlgG (0, | 4 μ5) | 35,500 + 1, | 383 (17%) |
+ | + mlgG (0, | 02 μς) | 42,815 + 1, | 246 ( 0%) |
+ | + R6-5-D6 | (10.0 μς) | 8,250 + | 520 (81%) |
+ | + R6-5-D6 | ( 0.4 μg) | 16,142 + | 858 (62%) |
+ | + R6-5-D6 | (0.03 μ9) | 28,844 + 1, | 780 (32%) |
a) Células Receptivas (6,25 x 105/ml).
b) Células Estimuladoras (6,25 x 105/ml, irradiadas a 1000 r)
c) Anticorpo Monoclonal Purificado a ICAM-1 (R6-5-D6) ou IgG de rato purificada (mlgG) às concentrações finais (pg/ml).
d) Média + DP das culturas 5 a 6, os números entre parêntesis indicam inibição em percentagem da MLR.
110
QUADRO 16
Tempo de Adição de Anti-ICAM-1
Ral Sb) Adiçõesc
Incorporação de 3 *HT (CPM)
Tempo de adição do meio ou do anticorpo
Dia | 0 | Dia | 1 | Dia 2 | ||||||
- | - | meio | 205' | 1 + | 14 | 476 + | 132 | 247 | + | 75 |
- | + | meio | 189 | + | 16 | nde | nd | |||
+ | - | meio | 1,860 | + | 615 | nd | nd | |||
+ | + | meio | 41,063 | + | 2,940 | 45,955 + | 2, 947 | 50,943 | + 3, | 072 |
+ | + | R6-5-D6 | 17,781 | + | 1,293 | 38,409 + | 1, 681 | 47,308 | i 2 / | 089 |
(57%) | lf | (16%) | (7%) |
a) Células Receptivas (6,25 x 105/ml)
b) Células Estimuladoras (6,25 x 105/ml, irradiadas a 1000 R)
c) Adicionou-se meio de cultura ou anticorpo monoclonal purificado anti-ICAM-1 (R6-5-D6) a 10 μς/πιΐ no dia 0 a 24 horas de intervalo.
d) Média + DP das culturas 4 a 6
e) nd = não efectuado
f) Percentagem de inibição.
Em resumo, a capacidade do anticorpo contra ICAM-1 para inibir a MLR mostra que os anticorpos monoclonais anti-ICAM-1 têm utilidade terapêutica na rejeição aguda de enxertos. Os anticorpos monoclonais anti-ICAM-1 também têm utilidade terapêutica em adecções mediadas imunológicas relacionadas dependentes de células reguladas por LFA-l/ICAM-1 a interacções celulares.
111
Estas experiências descritas mostram que a adição de anticorpos monoclonais anti-ICAM-1 inibe a reacção de linfocitos mistos (MLR) quando efectuada durante as primeiras 24 horas de reacção. Além disso a ICAM-1 é regulada com tendência a aumentar nos monócitos do sangue periférico humano durante a cultura in vitro.
Além disso, verificou-se que a ICAM-1 não é expressa em linfocitos ou em monócitos de sangue periférico humano. A ICAM-1 é regulada com tendência a aumentar nos monócitos de células cultivadas isoladamente ou de células cultivadas em conjunto com células de dadores não relacionados numa reacção de linfocitos mistos usando análises citométricas de caudal normais (Figura 20). Esta regulação para o aumento da ICAM-1 nos monócitos pode ser usada como indicador de inflamação, particularmente se a ICAM-1 é expressa em monócitos frescos de indivíduos com inflamação aguda ou crónica.
A especificidade da ICAM-1 para monócitos activados e a capacidade do anticorpo contra ICAM-1 para inibir uma MLR sugerem que os anticorpos monoclonais contra ICAM-1 podem ter utilidade potencial para diagnóstico e para terapia na rejeição aguda de enxertos e nas adecções mediadas pelo sistema imune relacionadas que requerem interacções célula a célula.
EXEMPLO 28
Efeitos Sinergísticos da Administração Combinada de Anticorpos Anti-ICAM-1 e Anti-LFA-1
Conforme se apresenta no Exemplo 27, a MLR é inibida pelo anticorpo anti-ICAM-1. A MLR pode também ser inibida pelo anticorpo anti-LFA-1. A fim de determinar se a administração
112
combinada dos anticorpos anti-ICAM-1 e anti-LFA-1 teria um efeito realçado ou sinergístico, levou-se a efeito uma anáalise de MLR (realizada conforme descrito no Exemplo 27) na presença de várias concentrações dos dois anticorpos.
Esta análise de MLR revelou que a combinação de anti-ICAM-1 com anti-LFA-1, a concentrações às quais nenhum dos anticorpos isoladamente inibe consideravelmente a MLR, é significativamente mais potente na inibição da resposta por MLR (Quadro 17) . Este resultado indica que as terapias que envolvem a co-administração do anticorpo anti-ICAM-1 (ou de fragmentos deste) e de anticorpo anti-LFA-1 (ou de fragmentos deste) têm a capacidade de proporcionar uma terapia anti-inflamatória melhorada. Esta terapia melhorada permite a administração de doses inferiores do anticorpo em relação à que seria de outro modo terapeuticamente efectiva e tem importância em circunstâncias nas quais as altas concentrações de anticorpos individuais induzem uma resposta anti-idiotípica.
QUADRO 17
Efeitos de várias Doses de Anti-ICAM-1 e de Anti-LFA-1 (R3-1) na Reacção de Linfócitos Mistos % de Inibição
Concentração (pg/ml)
Anti-ICAM-1 (R6-5-D6)
Anti-LFA-1 | 0 | .004 | .02 | .1 | .5 | 2.5 |
0.0 | 0 | 7 | 31 | 54 | 69 | 70 |
0.0008 | 1 | 7 | 28 | 48 | 62 | 71 |
0.004 | 0 | 13 | 30 | 50 | 64 | 72 |
0.02 | 29 | 38 | 64 | 75 | 84 | 86 |
0.1 | 92.5 | 90 | 91 | 92 | 92 | 92 |
0.5 | 93 | 90 | 90 | 92 | 93 | 91 |
113
EXEMPLO 29
Efeitos Aditivos da Administração Combinada de Doses Sub-óptimas de Anti-ICAM-1 e de outros Agentes Imuno-supressores no MLR
Como se demonstrou no Exemplo 28, o MLR é inibido por combinações de anticorpos anti-ICAM-1 e anti-LFA-1. No sentido de determinar se a administração combinada de anti-ICAM-1 e outros agentes imuno-supressores (tal como dexametasona, azatioprina, ciclosporina A ou esteróides (tais como por exemplo, prednisona, etc.) teria também efeitos de intensificação, realizaram-se análises MLR usando concentrações sub-óptimas (isto é concentrações que são inferiores às concentrações às quais o agente seria fornecido isoladamente a um indivíduo) de R6-5-D6 em conjunção com outros agentes imunosupressores como para o protocolo no Exemplo 27.
Os dados indicam que os efeitos inibidores de R6-5-D6 são pelo menos aditivos com os efeitos inibidores de doses subóptimas de dexametasona (Quadro 18), azatioprina (Quadro 19) e ciclosporina A (Quadro 20). Este facto implica que os anticorpos anti-ICAM-1 podem ser eficazes na redução das doses necessárias de imuno-supressoras conhecidos, reduzindo deste modo os seus efeitos tóxicos secundários. Utilizando um anticorpo anti-ICAM-1 (ou um seu fragmento) para conseguir esta imuno-supressão, é possível combinar a administração do anticorpo (ou um seu fragmento) quer com um agente imuno-supressor adicional único ou com uma combinação de mais de um agente imuno-supressor adicional.
114
QUADRO 18
Efeito de Anti-ICAM-1 e Dexametasona no MLR Humano
Grupo | Inibidor | Incorporação | Inibição | |
(ng/ml) | 3HT (CPM) | % | ||
Meio | - | 156 | - | |
Estimuladores (S) | - | 101 | - | |
Responders ® | - | 4,461 | - | |
R x S | 34,199 | — | ||
R x S | R6-5-D6 (8) | 26,224 | 23 | |
R x S | Dex (50) | 14,158 | 59 | |
R x S R6 | -5-D6 (8) + Dex | (50) 7,759 | 77 | |
QUADRO | 19 | |||
Efeito de Anti-ICAM-1 | e Azatiopirina | no MLR Humano | ||
Grupo | Inibidor | Incorporação | Inibição | |
(ng/ml) | 3HT (CPM) | % | ||
Meio | 78 | |||
Estimuladores (S) | - | 174 | - | |
Responders ® | - | 3, 419 | - | |
R x S | 49, 570 | |||
R x S | R6-5-D6 (8) | 44,374 | 11 | |
R x S | Azatioprina | (D | 42,710 | 14 |
R x S R6-5-D6 (8) | + Azatioprina 1 | ;i) 34,246 | 31 |
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QUADRO 20
Efeito de Anti-ICAM-1 e Ciclosporina A no MLR Humano
Grupo | Inibidor (ng/ml) | Incorporação 3HT (CPM) | Inibição % |
Meio | 87 | ||
Estimuladores (S) | - | 206 | - |
Responders ® | - | 987 | - |
R x S | 31,640 | ||
R x S | R6-5-D6 (8) | 26,282 | 17 |
R x S | CyA (10) | 23,617 | 25 |
R x S | R6-5-D6 (8) + CyA | (10) 19,204 | 39 |
CyA: Ciclosporina A
EXEMPLO 30
Efeito do Anticorpo Anti-ICAM-1 na Supressão da Rejeição de Orgãos Alógenos Transplantados
A fim de demonstrar o efeito do anticorpo anti-ICAM-1 na supressão da rejeição de um orgão alógeno transplantado, fizeram-se transplantações alógenas de rins para macacos Cynomolgus de acordo com o método descrito por Cosimi et al·., (Transplant. Proces. 13: 499-503 (1981)), com a modificação de que se usou Valium e cetamina para anestesia.
Deste modo, a transplantação do rim foi levada a efeito essencialmente como se segue: Levaram-se a efeito enxertos renais heterotrópicos em macacos Cynomolgus de 3 a 5 kg,
116 essencialmente como descrito por Marquet (Marquet et al., Medicai Primatology, Part II, Basileia, Karger, p. 125 (1972)) após indução de anestesia com Valium e cetamina. Construiram-se anastomases extremidade-para-lado dos vasos renais do dador num retalho de aorta ou de veia cava usando sutura 7-0 de Prolene. O ureter do dador foi retirado com uma espátula e implantado na bexiga por abordagem extravesical (Taguchi, Y., et al., em Dausset et al., (eds.), em: Advances in Transpiantation Baltimore, Williams & Wilkins, p. 393 (1968)). A função renal foi avaliada por determinações de creatinina do soro semanais ou bi-semanais. Além disso obtiveram-se biópsias frequentes do enxerto para exame histopatológicas e realizaram-se autópsias completas em todos os receptores não sobreviventes. Na maioria dos receptores, realizou-se nefrectomia bilateral na ocasião da transplantação e a morte urémica subsequente foi considerada como o ponto final da sobrevivência do enxerto. Em alguns receptores efectuaram-se nefrectomia nativa unilateral e ligação ureteral contralateral na ocasião da transplantação. Quando ocorreu rejeição dos enxertos, a ligação do ureter autólogo foi então removida resultando a restauração da função renal normal e a oportunidade de continuar a monitorização imunológica do animal receptor.
Administrou-se o anticorpo monoclonal R6-5-D6 diariamente durante 12 dias antes do transplante a uma dose de 1 a 2 mg/kg dia. Os níveis de creatinina no soro foram determinados periodicamente a fim de monitorizar a rejeição. O efeito do anticorpo anti-ICAM-1 naa rejeição pelo sistema imune dos rins alógenos é apresentado no Quadro 21.
117
QUADRO 21
Actividade de R6-5-D6 no Prolongamento da Sobrevivência de Aloenxerto Renal em Protocolos Profiláticos no Macaco3 Cynomolgus
Macaco | Dose de R6-5-D6 (mg/kg) | Dias de sobrevivência /pós-tratamento |
controlo 1 | 8 | |
controlo 2 | - | 11 |
controlo 3 | - | 11 |
controlo 4 | - | 10 |
controlo 5 | - | 9 |
controlo 6 | - | 10 |
M15 | 1.0 | 20 |
M19 | 1.0 | |
Ml 7 | 1.5 | 30 |
M25 | 1.0 | 29 |
M23 | 2.0 | llc |
M27 | 0.5 | 34 |
M7 | 0.5 | 22 |
Mil | 0.5 | 26 |
MIO | 0.5 | 22 |
M8 | 0.5 | 2 6d |
a Foi dado aos macacos R6-5-D6 durante 12 dias consecutivos com início dois dias antes da transplantação.
b Causa da morte desconhecida. Havia evidência de malária latente.
c Morreu com enfarte renal d Ainda vivo a 15 de Agosto de 1988.
Os resultados mostram que o anticorpo R6-5-D6 foi eficaz no prolongamento das vidas dos macacos que receberam transplantes alogénicos de rim.
118
EXEMPLO 31
Efeito do Anticorpo Anti-ICAM-1 na Supressão da Rejeição Aguda de orgãaos Transplantados
No sentido de mostrar que o anticorpo anti-ICAM-1 é eficaz num modelo agudo de rejeição de transplantações, testou-se também o anticorpo R6-5-D6 num modelo agudo ou terapêutico de rejeição. Neste modelo transplantaram-se rins de maacaco (usando o protocolo descrito no Exemplo 30) e foram dados préoperatoriamente 15 mg/kg de ciclosporina A (CyA) i.m. até se atingir uma função renal estável. A dose de CyA foi então reduzida para administração bisemanal em aumentos de 2,5 mg/kg até que a rejeição ocorreu de acordo com a indicação dada pela subida dos níveis de creatinina no sangue. Nesta altura, administrou-se R6-5-D6 durante 10 dias e a duração da sobrevivência foi observada. É importante notar que neste protocolo a dose de CyA permanece sub-óptima, uma vez que não se altera quando ocorre o episódio da rejeição aguda. Neste modelo animais de controlo histórico (N=5) sem qualquer auxílio de anticorpos sobrevivem de 5 a 14 dias desde o início do episódio de rejeição. Até à data, testaram-se seis animais usando R6-5-D6 neste protocolo (Quadro 22) . Dois destes animais ainda sobrevivem (M12, 31 dias e M5, 47 dias a seguir à administração de R6-5-D6) . Dois animais viveram 38 e 55 dias a seguir ao início da terapia de R6-5-D6 e dois animais morreram por outras causas que não a rejeição aguda (um animal morreu da toxicidade de CyA e o outro morreu enquanto se estava a dar R6-5-D6 sob anestesia). Este modelo aproxima-se mais estreitamente da situação clínica na qual R6-5-D6 seria usado inicialmente.
119
QUADRO 22
Actividade de R6-5-D6 no Prolongamento da Sobrevivência de Aloenxertos Renais em Protocolos Terapêuticos no Macaco3 Cynomolgus
Macaco | Dia do Episódiob de Rejeição | Dias de Sobrevivência/ /Pós-Tratamento |
Controlosc | 14-98 | 5-14 |
M24 | 41 | 38 |
M21 | 34 | dd |
M3 | 41 | 55 |
M9 | 12 | lle |
M12 | 37 | > 31 |
M5 | 26 | > 47f |
a Aos macacos foram dados 1 a 2 mg/kg de R6-5-D6 durante 10 dias consecutivos a seguir ao início da rejeição.
b Dia no qual os níveis de creatinina aumentaram como resultado da redução da dose de CyA e começou a terapia de R6-5-D6.
c Testaram-se 5 animais usando o protocolo terapêutico descrito acima excepto em que não houve qualquer auxílio da terapia. Os dias de sobrevivência/pós-tratamento representam os dias de sobrevivência após terem começado a subir os níveis de creatinina.
d Morreu enquanto sob anestesia. Os níveis de creatinina eram baixos.
e Morreu da toxicidade de CyA. Os níveis de creatinina eram baixos.
f Ainda vivo a 15 de Agosto de 1988.
120
EXEMPLO 32
Construção Genética e Expressão de Derivados Truncados de ICAM-1
No seu estado natural, a ICAM-1 é uma proteína de ligação da membrana da célula que contém uma região extracelular de 5 domínios semelhantes a imunoglobulina, um domínio de transmembrana e um domínio citoplasmático. Era desejável a construção de derivados funcionais de ICAM-1 que não tivessem o domínio da transmembrana e/ou o domínio citoplasmático de modo a que pudesse ser gerada uma forma segregada solúvel de ICAM-1. Estes derivados funcionais foram construídos por mutagénese dirigida ao oligonucleótido do gene de ICAM-1 seguida pela expressão em células de macaco depois de transfecção com o gene mutante.
Pelo método de Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82: 488-492 (1985)) foram geradas mutações no gene de ICAM-1 que tiveram como resultados substituições de ácidos aminados e/ou derivados truncados. 0 ADNc de ICAM-1 preparado como descrito acima foi digerido com as endonucleases de restrição Sal 1 e Kpn 1 e o fragmento de ADN de 1,8 kb resultante foi subclonado no vector de plasmídeo CDM8 (Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84: 3365-3369 (1987)). Uma estirpe de E.coli dut~, ung~ (BW313/P3) foi então transformada com esta construção, designada por pCD1.8C. Recuperou-se a partir dos transformantes um molde de cadeia simples que contém uracilo por infecção com o fago auxiliar R408 (StratageneR) . Geraram-se em seguida ADNc's mutantes de ICAM-1 por iniciação da síntese da segunda cadeia com um oligonucleótido que possui bases desemparelhadas e subsequente transformação de um hospedeiro unq+ (MC1061/P3) com o heteroduplex resultante. Os mutantes foram isolados por busca dos locais de restrição de endonuclease criados de novo introduzidos pelo oligonucleótido mutante. A proteína ICAM-1
121 mutante foi expressa pela transfecção de células Cos-7 com o ADN mutante no vector de expressão eucariótico CDM8 usando processos de DEAE-Dextran normais (Selden, R.F. et al., In: Current
Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds.) página 9.2.1-9.2.6 (1987)).
Preparou-se um derivado funcional truncado de ICAM-1 sem os domínios de transmembrana e citoplasmáticos mas contendo a região extracelular que possui todos os 5 domínios semelhantes a imunoglobulina. Um oligonucleótido mutante de 30 pb (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) foi usado para transformar os codões para os ácidos aminados tirosina (Y) e ácido glutâmico (E) nas posições 452 e 453, respectivamente, para uma fenilalanina (F) e um codão de paragem de tradução (TAG) . O mutante foi isolado pelo seu único local de restrição Xba e foi designado Y452E/F, TAG.
A fim de expressar a proteína mutante, transfectaram-se células COS com três subclones mutantes (n°. 2, n°. 7 e n°. 8). Três dias depois da transfecção com os três subclones mutantes, os sobrenadantes das culturas e os lisados de células foram analisados por imunoprecipitação com o anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 RR1/1 e SDS-PAGE. A ICAM-1 foi precipitada a partir de sobrenadantes de culturas de células transfectadas com subclones mutantes n°. 2 e n°. 8, mas não de lisados por detergentes destas células. O peso molecular da ICAM-1 encontrado na cultura sobrenadante era aproximadamente inferior em 6 kd com relação à forma de membrana de ICAM-1, o que é consistente com a dimensão prevista a partir do ADN mutante. Deste modo, este derivado funcional da ICAM-1 foi excretado sob a forma de uma proteína solúvel. Em contraste, a ICAM-1 não foi imunoprecipitada a partir dos sobrenadantes de cultura de células transfectadas com ICAM-1 nativa, demonstrando que a forma de membrana da ICAM-1 não se liberta das células Cos. Para
122 além disso, não foi imunoprecipitada qualquer ICAM-1 a partir de qualquer dos sobrenadantes de cultura ou dos lisados de células a partir de células de controlo negativo transfectadas com uma imitação.
A ICAM-1 truncada segregada pelas células transfectadas foi purificada por cromatografia de imunoafinidade com um anticorpo específico de ICAM-1 (R6-5-D6) e ensaiada para verificação da actividade funcional numa análise de ligação celular. Depois da purificação na presença do detergente octilglucósido, as preparações que continham a forma de ICAM-1 nativa ou truncada segregada foram diluídas até uma concentração final de octilglucósido de 0,25% (uma concentração abaixo da concentração micelar crítica do detergente). Permitiu-se que estas preparações de ICAM-1 se ligassem às superfícies de placas de plástico de 96 alvéolos (Nunc), a fim de produzir ligações de ICAM-1 a uma fase sólida. Depois de retirar por lavagem o produto não ligado, aproximadamente 75 a 80% e 83 a 88% de células SKW-3 contendo LFA-1 à superfície ligaram-se especificamente às formas nativas e truncadas de ICAM-1, respectivamente. Estes dados demonstram que o derivado funcional de ICAM-1 solúvel truncado segregado reteve tanto a reactividade imunológica como a capacidade para mediar a adesão dependente de ICAM-1, propriedades que são características da ICAM-1 nativa.
Um derivado funcional de ICAM-1 a que falta sómente o domínio citoplasmático foi preparado por métodos semelhantes. Um oligonucleótido de 25 pb (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) foi usado para alterar o codão para o ácido aminado 476 (Y) para um codão de paragem de tradução TAG. O mutante foi designado Y476/TAG. Por análise de imunoprecipitação e SDS-PAGE das células Cos transfectadas com o mutante detectou-se uma forma de ligação de membrana de ICAM-1 com o peso molecular com aproximadamente menos 3 kd do que a ICAM-1 nativa. A imunofluorescência
123
indirecta das células Cos transfectadas por mutante apresenta um padrão de coloração ponteado semelhantes à ICAM-1 nativa expressa em células endoteliais humanas estimuladas por LPS. Finalmente as células transfectadas com o ADN mutante ligam-se especificamente a LFA-1 purificado sobre superfícies de plástico dum modo semelhante às células Cos transfectadas com ADN de ICAM-1 nativa (Quadro 23).
QUADRO 23
Capacidade de Células que Expressam ICAM-1 ou um Derivado Funcional de ICAM-1 para se ligarem a LFA-1
TRANsfecção | % de Células que Expressam ICAM-1 que se ligam a LFA-1 na Presença de: | |
nenhum Anticorpo | Prl/1 | |
Imitação | 0 | 0 |
ICAM-1 NATIVA | 20 | 0 |
y477tag | 20 | 0 |
EXEMPLO 33
Mapeamento de Domínios Funcionais de ICAM-1
Estudos sobre ICAM-1 revelaram que a molécula possui 7 domínios. Cinco destes domínios são extracelulares (sendo o domínio 5 o mais próximo da superfície da célula e o domínio 1 o mais afastado da superfície da célula), um domínio é um domínio transmembrana e um outro domínio é citoplasmático (isto é está situado no interior da célula). No sentido de determinar qual o domínio que contribui para a capacidade de ICAM-1 de se ligar a
124
LFA-1, podem ser usados estudos de mapeação de epítopos. Para conduzir tais estudos, preparam-se diferentes mutantes de supressão e caracterizaram-se pela sua capaacidade para se ligarem a LFA-1. Em alternativa, os estudos podem ser realizados utilizando um anticorpo anti-ICAM-1 que se sabe interferir com a capacidade de ICAM-1 para se ligar a LFA-1. Exemplos de tais anticorpos adequados incluem Prl/1 (Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)). R6-5 (Springer, T.A. et al.,
U.S. pedido de Patente com o n°. de Série 07/250, 446), LB-2 (Clark, E.A. et al., In: Leukocyte Typing I (A. Bernard, et al., Eds.), Springer-Verlag pp 339-346 (1984)), ou CL203 (Stauton,
D.E. et al., Cell 56: 894-853 (1989)).
citoplasmático). domínios 1, 2
Podem ser criados mutantes de supressão de ICAM-1 por qualquer meio de entre vários. É contudo preferível produzir tais mutantes por meio de mutagénese dirigida a um local ou por outro meio de recombinação (tal como por construção de sequências de genes que expressam ICAM-1, nas quais foram suprimidas as sequências que codificam para regiões proteicas particulares. Os processos que podem ser adaptados para produzir tais mutantes são bem conhecidos na especialidade. Usando tais processos, prepararam-se três mutantes de supressão de ICAM-1. O primeiro mutante não tem os resíduos dos ácidos aminados F185 a P284 (isto é, supressão do domínio 3). O segundo mutante não tem os resíduos dos ácidos aminados P284 a R451 (isto é, supressão dos domínios 4 e 5). O terceiro mutante não tem os resíduos dos ácidos aminados depois de Y476 (isto é, supressão de domínio Os resultados de tais estudos indicam que os e 3 estão predominantemente implicados em interacções de ICAM-1 com anticorpos anti-ICAM-1 e LFA-1.
125
EXEMPLO 34
Efeitos de Mutações em ICAM-1 na Ligação de LFA-1
A capacidade de ICAM-1 para interactuar com e ligar-se a LFA-1 é mediada por resíduos de ácidos aminados de ICAM-1 que estão presentes no domínio 1 da molécula de ICAM-1 (Figuras 8, 9 e 10) . Estas interacções são auxiliadas, contudo, por contribuições dos ácidos aminados presentes nos domínios 2 e 3 de ICAM-1.Deste modo, entre os derivados funcionais da presente invenção estão os fragmentos solúveis da molécula de ICAM-1 que contêm os domínios 1, 2 e 3 de ICAM-1. De modo especialmente preferido, estão os fragmentos solúveis da molécula de ICAM-1 que contêm os domínios 1 e 2 de ICAM-1. De modo ainda mais especialmente preferido, ainda estão os fragmentos solúveis da molécula de ICAM-1 que contém o domínio 1 de ICAM-1. Alguns resíduos de ácidos aminados dentro do primeiro domínio de ICAM-1 estão implicados na interacçâo de ICAM-1 com LFA-1. As substituições destes ácidos aminados por outros ácidos aminados alteram a capacidade de ICAM-1 de se ligar a LFA-1. Estes resíduos de ácidos aminados e as substituições são apresentadas na Figura 25. A Figura 25 apresenta os efeitos de tais mutações na capacidade da molécula de ICAM-1 mutante resultante de se ligar a LFA-1. Nas Figuras 23 a 25, os resíduos são apresentados por meio do código de uma letra para ácidos aminados, seguido pela posição do resíduo na moléculaa de ICAM-1. Deste modo, por exemplo, E90 refere-se ao resíduo de ácido glutâmico na posição 90 de ICAM-1. Semelhantemente, E90V refere-se ao dipeptídeo composto pelo resíduo de ácido glutâmico na posição 90 e o resíduo de valina na posição 91. A sequência de substituição é indicada à direita da marca de barra (/) . Os resíduos V4, R13, Q27, Q58 e D60S61 de ICAM-1 estão implicados na ligação de LFA-1.
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A substituição destes ácidos aminados alterou a capacidade de ICAM-1 de se ligar a LFA-1. Por exemplo, a substituição de V4 por G tem como resultado a formação de uma molécula de ICAM-1 mutante que é menos capaz de se ligar a LFA-1 (Figura 25) . A substituição do resíduo R13 de ICAM-1 por E leva à formação de uma molécula com substancialmente menor capacidade de se ligar a LFA-1 (Figura 25). A substituição do resíduo Q58 de ICAM-1 por H leva à formação de uma molécula mutante que tem uma capacidade substancialmente normal de se ligar a LFA-1 (Figura 25) . A substituição dos resíduos D608 de ICAM-1 por KL leva à formação de uma molécula mutante que tem a capacidade substancialmente menor de se ligar a LFA-1 (Figura 25).
Os locais de glicosilação no segundo domínio estão também implicados na ligação de LFA-1 (Figura 23) . A substituição de N103 por K ou de A155N por SV tem como resultado a formação de um mutante que é substancialmente incapaz de ligação a LFA-1. Em contraste, a substituição do local de glicosilação N175 por A não parece afectar substancialmente a capacidade do mutante de ICAM-1 de se ligar a LFA-1.
As mutações no terceiro domínio de ICAM-1 não alteram apreciavelmente a ligação ICAM-1 - LFA-1 (Figura 24).
EXEMPLO 35
Formas Multiméricas de ICAM-1 com Aumento de Afinidade de SemiVida Biológica e de Capacidade de Eliminação
Construiram-se moléculas quiméricas nas quais os domínios 1 e 2 de ICAM-1 foram ligados à região charneira da cadeia pesada de imunoglobulina. As construções preferidas ligam a extremidade C-terminal do domínio 2 de ICAM-1 a um segmento do gene da
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cadeia pesada de imunoglobulina exactamente na extremidade Nterminal em relação à região charneira, permitindo a flexibilidade segmentai conferida pela região charneira. Os domínios 1 e 2 de ICAM-1 substituem deste modo o fragmento Fab de um anticorpo. A ligação a cadeias pesadas da classe de IgG e a produção de células animais têm como resultado a produção de uma molécula quimérica. A produção de moléculas que contêm cadeias pesadas derivadas de IgA ou de IgM tem como resultado a produção de moléculas de mais alta multimericidade que contém de 2 a 12 moléculas de ICAM-1. A co-expressão do gene da cadeia J nas células animais que produzem as moléculas quiméricas de cadeia pesada de ICAM-1 permitem a agregação característica dos multímeros de IgA e IgM dando como resultado predominantemente moléculas de IgA que contêm 4 a 6 moléculas de ICAM-1 e no caso de IgM que contêm aproximadamente 10 moléculas de ICAM-1. Estas moléculas quiméricas podem ter várias vantagens. Em primeiro lugar, as moléculas de Ig são projectadas para terem longa duração na circulação e este facto pode melhorar a semi-vida biológica.
Para além disso, a natureza multimérica destas moléculas manipuladas possibilita a sua interaeção com maior avidez com rinovírus bem como com LFA-1 da superfície celular, dependendo do contexto terapêutico, e deste modo diminui substancialmente a quaantidade de proteína recombinante que é necessário administrar para proporcionar uma dose efectiva. As imunoglobulinas IgA e IgM são moléculas altamente glicosiladas presentes normaimente em locais de mucosa como no nariz. A sua natureza altamente hidrofílica ajuda a manter as bactérias e os vírus a que se ligam afastados da mucosa, evitando a ligação às células e evitando o atravessamento da barreira da membrana das células epiteliais. Deste modo, podem ter uma eficácia terapêutica aumentada. As imunoglobulinas IgM e em particular IgA são estáveis no ambiente das mucosas e podem aumentar a
128 estabilidade das construções de ICAM-1. Se um tal derivado funcional de ICAM-1 é administrado na corrente sanguínea, pode também aumentar a semi-vida biológica. A imunoglobulina IgA não fixa o complemento e deste modo seria ideal para aplicações em que este seria prejudicial. Se se pretendem quimeras de cadeia H de IgG, será possível fazer mutações em regiões implicadas na ligação ao complemento bem como em interacções com receptores Fc.
EXEMPLO 36
Geração de Mutantes de ICAM-1
Mutagénese dirigida a oliginucleótidos
Subclonou-se a região de codificação do ADNc de ICAM-1 num fragmento Sall-Kpnl de 1,8 kb num vector de expressão CDMB (Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84: 3365-3369 (1987). Com base no método de Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82: 488-492 (1985)) e modificações de Stauton D. et al.
(Stauton, D.E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)), esta construção (pCD1.8) foi usada para gerar um molde de cadeia simples contendo uracilo para ser usado na mutagénese dirigida a oligonucleótido.
Em resumo, a estirpe E.coli XS127 foi transformada com pCDl.8. Cultivaram-se colónias isoladas em um ml de meio Luria Broth (LB) (Difco) com 13 pg/ml de ampicilina e 8 pg/ml de tetraciclina até perto da saturação. Infectaram-se 100 μΐ de cultura com fago auxiliar R408 (Strategene) numa multiplicidade de infecções (MOI) de 10 e adicionaram-se 10 ml de meio LB com ampicilina e tetraciclina a uma cultura de 16 horas a 37°C. A seguir a uma centrifugação a 10 000 rpm e filtração do
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sobrenadante por 0,22 μπι, usou-se a suspensão de fago para infectar E.coli BW313/P3 que foi então depositado em placas de agar LB (Difco) suplementadas com ampicilina e tetraciclina. As colónias foram repicadas, cultivadas em 1 ml de meio LB com ampicilina e tetraciclina próximo da saturação e infectadas com fago auxiliar a uma MOI de 10. O volume da cultura foi então aumentado até 250 ml e as células foram cultivadas durante toda a noite. Isolou-se o ADN de cadeia simples por extracção do fago de acordo com técnicas normais.
Os oligonucleótidos mutantes foram fosforilados e utilizados com o molde pCD1.8 numa reacção de síntese da segunda cadeia (Stauton, D.E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)).
Transfecção
Inocularam-se células COS em placas de cultura de tecidos de 10 cm tal modo que fossem confluentes a 50% em 16 a 24 horas. Lavaram-se então as células COS uma vez com TBS e incubaram-se durante 4 horas com 4 ml de RPMI contendo 10% de soro Nu (Collaborative), 5 μg/ml de cloroquina, 3 μg de plasmídeo mutante e 200 μg/ml de sulfato de DEAE-dextrano. As células foram então lavadas com DMSO/PBS a 10% seguido de PBS e foram incubadas durante 16 horas em meio de cultura. Substituiu-se o meio de cultura por meio fresco e 48 após a transfecção as células COS foram suspensas por tratamento com tripsina/EDTA (Gibco) e divididas por 2 placas de 10 cm bem como por placas de cultura de tecidos de 24 alvéolos para ligação de HRV. Ao fim de 72 horas as células foram recolhidas das placas de 10 cm com EDTA/HBSS 5 mM e processadas para adesão a plástico revestido de LFA-1 e imunofluorescência.
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Ligação de LFA-1 e HRV
Purificou-se LFA-1 a partir de lisados de SKW-3 por cromatografia de imunoafinidade em Sepharose mAb de LFA-1 de TS2/4 e eluiu-se até pH 11,5 na presença de MgCl2 2 mM e octilglucósido a 1%. Ligou-se LFA-1 (10 μς por 200 μΐ por placa de 6 cm) as placas de Petri bacteriológicas por diluição de octilglucósido a 0,1% em PBS (salina tamponizada com fosfato) com MgCl2 2 mM e incubação durante toda a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% (albumina de soro de bovino) e guardadas em PBS que continha MgCl2 2 mM, BSA a 0,2%, azida a 0,025% e gentamicina a 50 μg/ml.
Células de COS marcadas com 51Cr em PBS que continha FCS a 5% (soro de vitela fetal), MgCl2 2 mM e azida a 0,025% (tampão) foram incubadas com ou sem 5 μg/ml de Rrl/1 e R6.5 em placas de microtítulo revestidas de LFA-1 a 25°C durante 1 hora. As células não aderentes foram removidas por 3 lavagens com tampão. As células aderentes foram eluídas pela adição de EDTA a 10 mM e contagem gama.
RESULTADOS
Os anticorpos anti-ICAM-1 tais como RR1/1. R6.5, LB-2 ou CL203 foram identificados. Se estes anticorpos são capazes de inibir a função de ICAM-1, devem ser capazes de ligação a um local particular na molécula de ICAM-1 que é também importante para a função de ICAM-1. Deste modo, por preparação dos mutantes de supressão de ICAM-1 acima descritos e determinação do grau em que os anticorpos anti-ICAM-1 podem ligar-se à supressão, é possível determinar quais dos domínios de supressão são importantes para a função.
131
A ICAM-1 é uma proteína de membrana integral, cujo domínio extracelular se prevê ser composto por 5 domínios C semelhantes a de Ig. A fim de identificar os domínios implicados na ligação de LFA-1, efectuou-se a supressão do domínio 3 e dos domínios 4 e 5 (carboxilo-terminais) por mutagénese dirigida a oligonucleótidos e ensaiou-se funcionalmente seguindo-se a expressão em células COS. Adicionalmente, efectuou-se a supressão do domínio citoplasmático completo a fim de avaliar a sua influência potencial nas interacções de ICAM-1. Como esperado a supressão do domínio citoplasmático, Y476/* não demonstrou qualquer perda de rectividade de RR1/1, R6.5, LB-2 e CL203 enquanto que a supressão do domínio 3, F185-R451, teve como resultado uma diminuição e perda de reactividade de CL203, respectivamente (Figura 20) . Deste modo, o epítopo de CL203 parece estar localizado no domínio 4 enquanto que Rrl/1, R6.5 e LB-2 parecem estar localizados nos 2 domínios amino-terminais.
Todos os 3 mutantes de supressão apresentam níveis de tipo selvagem de aderência a LFA-1 (Figura 21). Foram também geradas e testadas funcionalmente seguindo a expressão em células COS as substituições de ácidos aminados em turnos β previstos nos domínios 1, 2 e 3. O epítopo R6.5 foi deste modo localizado para a sequência E111GGA no domínio 2 e pode também implicar E39 no domínio 1 enquanto RR1/1 e LB-2 são ambos dependentes de RI3 no domínio 1 (Figura 22). Para além disso, a ligação de RR1 diminui por mutações na sequência D71GOS. As mutações que eliminam os locais de glicosilação N-ligados em N103 e NI 65 têm como resultado uma diminuição da ligação de LFA-1 HRV a RR1/1, R6.5 e LB-2. Estas mutações parecem ter efeito sobre o processamento de modo que são gerados dímeros de ICAM-1.
Outras mutações nos domínios 2 ou 3 não tiveram como resultado uma alteração da adesão de LFA-1 (Figuras 23 e 24). Os
132 ácidos aminados no domínio 1, R13 e D60 estão ambos implicados com a ligação LFA-1 (Figura 25).
Deste modo, a ligação de LFA-1 e HRV parece ser uma função do domínio de ICAM-1 amino-terminal semelhante a Ig. A Figura 26 apresenta um alinhamento de domínios amino-terminais de ICAM-1.
Tendo a presente invenção sido descrita em relação com as suas formas específicas de concretização, deverá ser entendido que são possíveis modificações adicionais e que a sua aplicação pode incluir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, no geral, os princípios da invenção e incluindo as particularizações da presente apresentação relacionadas com a prática habitual na da especialidade a que a invenção pertence e como pode ser aplicada aos aspectos essenciais apresentados a seguir no âmbito das reivindicações em anexo.
Lisboa, 28 de Setembro de 1989.
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES1. Processo para a preparação de um derivado funcional solúvel de ICAM-1, que difere das ICAM-1 pelo menos pela ausência do domínio transmembrana das ICAM-1 naturais, sendo o referido derivado solúvel sob condições fisiológicas, caracterizado por compreender cultivar um microorganismo hospedeiro que foi transformado por um vector recombinante que codifica para um derivado funcional solúvel de ICAM-1 sob condições nas quais o referido derivado é expresso e segregado no meio de cultura, e em seguida isolar o derivado.
- 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o derivado funcional solúvel de ICAM-1 obtido conter pelo menos um resíduo de ácido aminado alterado da molécula de ICAM-1 suprimida ou por ser um derivado químico funcionaimente equivalente desta.
- 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por no derivado funcional solúvel de ICAM-1 obtido o domínio citoplasmático de ICAM-1 estar ausente.
- 4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por no derivado funcional solúvel de ICAM-1 obtido os resíduos de ácidos aminados a seguir ao domínio 1, ou a seguir aos domínios 1 e 2 ou a seguir aos domínios 1, 2 e 3 estarem ausentes.
- 5. Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar:a) um derivado funcional solúvel de ICAM-1 preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 eb) um veículo ou excipiente convencional.Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a composição farmacêutica se destinar a utilização no tratamento da inflamação provocada por uma resposta do sistema de defesa específico ou não específico.
- 7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5 ou 6 caracterizado por a composição farmacêutica se destinar a utilização na supressão das metáteses de uma célula de um tumor hematopoiético que requeira um membro funcional da família de LFA-1 para a migração.
- 8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7, caracterizado por o derivado funcional solúvel de ICAM-1 ser derivatizado por uma toxina, e a composição farmacêutica se destinar a utilização na supressão do crescimento de uma célula de um tumor que expresse LFA-1.
- 9. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se incorporar adicionalmente um fármaco imunossupressor seleccionado de preferência de dexametasona, azatioprina e ciclosporina A, e por a composição farmacêutica se destinar ao tratamento de uma inflamação provocada por uma resposta do sistema específico de defesa.
- 10. Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por se incorporar adicionalmente um segundo agente seleccionado de: um anticorpo capaz de ligação a LFA-1; um derivado funcional de um anticorpo, sendo o referido derivado funcional capaz de ligação a LFA-1; e um antagonista deLFA-1 que não seja uma imunoglobulina e por a composição farmacêutica se destinar ao tratamento de uma inflamação provocada por uma resposta do sistema específico de defesa.
- 11. Processo para a preparação de uma molécula de ADN recombinante capaz de expressar um derivado funcional solúvel de ICAM-1 idêntico ao obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por se analisar um banco de vectores lançadeiras de inserções de ADNc para se detectar a presença de uma inserção que contenha o gene que codifica para o referido derivado e por se clonar este gene.
- 12. Processo para determinar a presença e a localização de uma célula tumoral que expressa um membro da família de moléculas de LFA-1 num indivíduo que se suspeite de ser portador da referida célula, caracterizado por compreender:a) a incubação de uma amostra de tecido do referido indivíduo na presença de uma composição que contém um derivado funcional solúvel de ICAM-1 de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 marcado de modo a ser detectável eb) a detecção do referido ligando de ligação que esteja ligado a um membro da família de moléculas de LFA-1, presente na referida amostra de tecido.
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